KR20230066400A - 인테그린 표적화 리간드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

다양한 세포 유형에서 발현되는 수용체인 인테그린 αvβ6에 대한 친화도 및 혈청 안정성을 갖는 화학식 (I)의 합성 αvβ6 인테그린 리간드가 기재된다. 기재된 리간드는 인테그린 αvβ6을 발현하는 세포에 화물 분자, 예컨대 RNAi 작용제 또는 다른 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 전달하여, 이들 세포 내로의 화물 분자의 흡수를 용이하게 하는데 유용하다. αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물 및 사용 방법이 또한 기재된다.

Description

인테그린 표적화 리간드 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2020년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/077,245를 우선권 주장한다. 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 개시내용은 특정 세포에서 발현되는 유전자의 억제를 위해, 생체내에서 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예를 들어 이중-가닥 RNAi 작용제를 이들 세포 유형에 전달하기 위한, 인테그린 수용체에 결합하는 표적화 리간드에 관한 것이다.
αvβ6 인테그린은 전이에서 세포 침습 및 이동을 촉진하고, 아폽토시스를 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. αvβ6 인테그린은 또한 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)의 발현을 조절하고 TGF-β1을 활성화시킬 수 있다. 주로 시험관내 연구로부터, αvβ6 인테그린이 암종 진행을 촉진할 수 있음을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 따라서, 인테그린 αvβ6은 특히 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)의 발현 및 TGF-β1의 활성화에서의 그의 역할의 관점에서 종양 바이오마커 및 잠재적 치료 표적으로서 매력적이다.
치료상 유효한 화합물, 예컨대 약물 화합물의 목적하는 세포 및/또는 조직으로의 생체내 전달은 약물 제품의 개발을 위한 일반적인 도전과제가 되고 있다. 특정 세포 또는 조직으로의 화물 분자 (예를 들어, 치료 활성 화합물 또는 성분)의 표적화된 전달을 용이하게 하는데 사용될 수 있는, 세포 또는 조직을 선택적으로 표적화할 수 있는 안정하고 효과적인 표적화 리간드에 대한 필요가 지속적으로 존재한다. 실제로, 생체내에서 목적하는 세포 또는 조직으로의 화물 분자의 전달을 용이하게 하기 위해, 선택된 1종 이상의 화물 분자, 예컨대 1종 이상의 약물 제품 또는 다른 페이로드에 접합될 수 있는 표적화 리간드에 대한 일반적 필요가 존재한다. 또한, 생체내에서 인테그린 알파-v 베타-6을 발현하는 세포로 화물 분자를 전달하기 위해, 화물 분자에 접합되기에 적합하고 인테그린 알파-v 베타-6을 표적화하는 화합물에 대한 필요가 존재한다. 특정 화물 분자, 예컨대 치료 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제)과 관련하여, 인테그린 알파-v 베타-6을 발현하는 세포 및/또는 조직에 치료제를 전달하고 수용체-매개 세포내이입, 음세포작용을 통해, 또는 다른 수단에 의해 세포 내로의 치료제의 진입을 용이하게 하기 위해, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합될 수 있고 인테그린 알파-v 베타-6을 표적화할 수 있는 표적화 리간드에 대한 필요가 존재한다.
신규한 합성 αvβ6 인테그린 리간드 (본원에서 αvβ6 리간드로도 지칭됨)가 본원에 기재된다. 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 혈청에서 안정하고, αvβ6 인테그린에 대한 친화도를 가지며, 그에 특이적으로 결합할 수 있다. αvβ6 인테그린 리간드는 화물 분자에 접합되어, αvβ6 인테그린을 발현하는 목적하는 세포 또는 조직, 예컨대 골격근 세포로의 화물 분자의 전달을 용이하게 할 수 있다.
또한, 1종 이상의 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 화물 분자를 생체내 αvβ6 인테그린을 발현하는 조직 및/또는 세포에 전달하는 방법이 본원에 개시된다. αvβ6 인테그린을 발현하는 세포로의 치료 화물 분자 (예를 들어, 활성 제약 성분)의 전달로 대상체를 치료할 수 있는 질환, 증상 또는 장애를 갖는 대상체에게 1종 이상의 치료 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법이 추가로 개시된다.
일부 실시양태에서, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드-기반 치료제), 예컨대 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드의 유효량을 대상체에게 투여하는 것인, 대상체의 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 기재된다.
αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물이 본원에 추가로 기재된다. 본원에 기재된 조성물은 1종 이상의 치료 물질, 예컨대 RNAi 작용제 또는 다른 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제에 접합된 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법이 본원에 기재된다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 합성 αvβ6 인테그린 리간드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 화학식 I의 구조 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00001
여기서
R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
Figure pct00002
이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 화물 분자이거나, 또는 R1은 화물 분자이고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 화물 분자이고;
R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 화물 분자로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
X는 O, CR8R9, NR8이고;
여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함하고;
여기서 Q가 임의로 치환된 알킬렌이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬렌 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
Figure pct00003
이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30; 또는 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 25 또는 25 내지 30개)의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 초과의 αvβ6 인테그린 리간드 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 αvβ6 인테그린 리간드)는 1개의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 αvβ6 인테그린 리간드 중 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 생체내에서 세포에 전달될 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물(들), 예컨대 1종 이상의 RNAi 작용제(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제를 세포로 생체내 전달하기 위한 조성물이 본원에 기재되며, 여기서 RNAi 작용제는 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드에 연결된다.
1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물이 기재된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 1종 이상의 다른 제약 물질 또는 제약 활성 성분 또는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 의약이 본원에 기재된다.
1종 이상의 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 생체내 또는 시험관내에서 인테그린 αvβ6을 발현하는 세포로의 화물 분자의 전달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 골격근 세포, 제I형 및 제II형 폐포 상피 세포, 배상 세포, 분비 상피 세포, 섬모 상피 세포, 각막 및 결막 상피 세포, 피부 상피 세포, 담관세포, 장세포, 관 상피 세포, 선상 상피 세포 및 상피 종양 (암종)에 화물 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 생체내 또는 시험관내 전달할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드 및/또는 조성물의 용도를 포함하고, 원하는 경우에, 개시된 αvβ6 인테그린 리간드 및/또는 조성물을 제약 제품으로서의 투여에 적합한 형태로 만드는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 리간드 및 조성물, 예를 들어 의약의 제조 방법을 제공한다.
1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 피내, 경피, 경구, 설하, 국소 또는 종양내 투여를 포함한, 투여하고자 하는 화물 분자의 관점에서 이러한 투여에 적합한 것으로 관련 기술분야에 공지된 투여 경로를 사용하여 대상체에게 생체내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 전신 전달을 위해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 국부 전달을 위해, 예를 들어 건조 분말 흡입기 또는 네뷸라이저를 통한 흡입 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 조성물은 국소 투여에 의한 국부 전달을 위해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 골격근 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 유형 II 폐포 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 배상 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 분비 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 섬모 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 각막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 결막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 피부 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 담관세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 장세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 관 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 선상 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 목적하는 화물 분자에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1종 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 상피 종양 (암종)으로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 유형 I 폐포 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 유형 I 폐포 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유형 I 폐포 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 유형 II 폐포 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 유형 II 폐포 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유형 II 폐포 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 배상 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 배상 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 배상 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 분비 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 분비 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 분비 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 섬모 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 섬모 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬모 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 각막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 각막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 각막 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 결막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 결막 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 결막 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 피부 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 진피 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 담관세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 담관세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 담관세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 장세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 장세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 관 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 관 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 관 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 선상 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 선상 상피 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 선상 상피 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 상피 종양 (암종)으로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 상피 종양 (암종)으로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1종 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상피 종양 (암종)에서의 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 측면 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
αvβ6 인테그린 리간드.
인테그린 αvβ6에 대한 친화도 및 혈청 안정성을 갖는 합성 αvβ6 인테그린 리간드가 본원에 기재된다. αvβ6 인테그린 리간드는 시험관내, 계내, 생체외 및/또는 생체내에서 인테그린 αvβ6을 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 1종 이상의 화물 분자에 접합되어, 화물 분자를 시험관내, 계내, 생체외 및/또는 생체내에서 인테그린 αvβ6을 발현하는 세포에 우선적으로 향하고 그를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 화합물을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 화물 분자에 접합되어 화물 분자를 생체내 상피 세포로 향하게 한다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 합성 αvβ6 인테그린 리간드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 화학식 I의 구조 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00004
여기서
R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
Figure pct00005
이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 화물 분자이거나, 또는 R1은 화물 분자이고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 화물 분자이고;
R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 화물 분자로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
X는 O, CR8R9, NR8이고;
여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함하고;
여기서 Q가 임의로 치환된 알킬렌이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬렌 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
Figure pct00006
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물이다:
Figure pct00007
,
여기서 R18은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, -NR19R20으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R19 및 R20은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ib의 화합물이다:
Figure pct00008
.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ic의 화합물이다:
Figure pct00009
.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Id의 화합물이다:
Figure pct00010
,
여기서 R18은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, -NR19R20으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R19 및 R20은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이다.
화학식 I의 일부 실시양태에서, Q는
Figure pct00011
이고, 여기서 R13은 H, OH, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 및 임의로 치환된 아미노로 이루어진 군으로부터 선택된다. 화학식 I의 추가의 실시양태에서, Q는
Figure pct00012
이다. 다른 실시양태에서, Q는
Figure pct00013
이고, 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 H,
Figure pct00014
이고, 여기서 R17은 임의로 치환된 알킬 또는 임의로 치환된 알킬이고; n은 1 내지 10의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 4이다. 화학식 I의 추가 실시양태에서, Q는
Figure pct00015
이다. 화학식 I의 추가 실시양태에서, Q는
Figure pct00016
이다. 일부 실시양태에서, n은 4이다. 화학식 I의 다른 실시양태에서, Q는 C1-C10 알킬렌이다. 추가 실시양태에서, Q는 -(CH2)4-이다.
화학식 I의 일부 실시양태에서, R1은 화물 분자를 포함한다. 화학식 I의 추가 실시양태에서, R1은 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 단위 및 화물 분자를 포함한다. 화학식 I의 일부 실시양태에서, R1은 1 내지 10개의 PEG 단위를 포함한다. 추가 실시양태에서, R1은 5개의 PEG 단위를 포함한다.
화학식 I의 일부 실시양태에서, R6 및 R7은 둘 다 H이다. 화학식 I의 일부 실시양태에서, R3, R4, 및 R5는 모두 H이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30; 또는 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 25 또는 25 내지 30개)의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 초과의 αvβ6 인테그린 리간드 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 αvβ6 인테그린 리간드)는 1개의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 연결기, 예컨대 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기를 통해 1종 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 각각의 리간드에 대한 적어도 1개의 부착 지점 및 각각의 화물 분자에 대한 적어도 1개의 부착 지점을 포함하는 스캐폴드를 통해 1종 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린 리간드는 1종의 화물 분자를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린 리간드는 1종 초과의 화물 분자를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린 리간드는 화합물 41a, 41b, 42a, 42b, 43a, 43b, 44a, 44b, 45a, 45b, 46a, 46b, 47a, 47b, 48a, 48b, 49a, 49b, 50a, 50b, 51a, 51b, 52a, 52b, 53a, 53b, 54a, 54b, 55a, 55b, 56a, 56b, 57a, 57b, 58a, 58b, 59a, 59b, 60a 또는 60b를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 표적화 리간드:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 여기서
Figure pct00022
은 화물 분자에 대한 연결 지점을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식을 갖는 화합물:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하며, 여기서
Figure pct00029
은 화물 분자에 대한 연결 지점을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 Ip의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00030
여기서
R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
Figure pct00031
이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 연결 모이어티이거나, 또는 R1은 연결 모이어티이고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 연결 모이어티이고;
R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 연결 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
X는 O, CR8R9, NR8이고;
여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 연결 모이어티이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 연결 모이어티를 포함하고;
여기서 Q가 임의로 치환된 알킬이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
Figure pct00032
이다.
화학식 Ip의 일부 실시양태에서, 연결 모이어티는 아지드, 에스테르, 카르바메이트, 알켄, 알콜, 아민, 아미드, 카르보네이트 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기를 포함한다. 화학식 Ip의 일부 실시양태에서, 연결 모이어티는 아지드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I의 화합물에 대한 전구체일 수 있는 화합물을 제공한다. 이들 전구체의 화합물은 하기 화학식 또는 그의 허용되는 염을 갖는다:
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
.
본원에 개시된 임의의 αvβ6 인테그린 리간드는 화물 분자, 연결 모이어티 및/또는 보호된 연결 모이어티에 연결될 수 있다. 연결 모이어티는 화물 분자에 대한 αvβ6 인테그린 리간드의 접합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 αvβ6 인테그린 또는 αvβ6 인테그린을 발현하는 세포에 대한 화물 분자의 표적화를 증가시킬 수 있다. 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 화합물, 전구약물, 또는 공지된 치료 또는 진단 이익을 갖는 또 다른 물질일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제), 천연 또는 변형된 핵산, 펩티드, 압타머, 중합체, 폴리아민, 단백질, 독소, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 전구약물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분으로서 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분으로서 RNAi 작용제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 포화 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 예를 들어, "C1-C6 알킬"은 선형 또는 분지형 배열로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 갖는 알킬 기를 포함한다. 알킬 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, 이소-프로필, tert-부틸, n-헥실을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노알킬"은 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 1개 이상의 아미노 기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 아미노 기는 비치환, 일치환 또는 이치환될 수 있다. 아미노알킬 기의 비제한적 예는 아미노메틸, 디메틸아미노메틸 및 2-아미노프로프-1-일을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "시클로알킬"은 달리 명시되지 않는 한 3 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 고리 기를 의미한다. 시클로알킬 기의 비제한적 예는 시클로프로필, 메틸-시클로프로필, 2,2-디메틸-시클로부틸, 2-에틸-시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시클로알킬은 다중 스피로- 또는 융합된 고리를 포함할 수 있다. 시클로알킬 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "시클로알킬렌"은 본원에 기재된 바와 같은 시클로알킬 기의 2가 라디칼을 지칭한다. 시클로알킬렌은 시클로알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 치환 지점을 갖는 시클로알킬의 하위세트이다. 시클로알킬렌의 예는 시클로프로필렌,
Figure pct00039
, 1,4-시클로헥실렌,
Figure pct00040
, 및 1,5-시클로옥실렌
Figure pct00041
을 포함한다. 시클로알킬렌 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다. 시클로알킬렌 기는 모노-, 디-, 또는 트리-시클릭일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "알케닐"은, 달리 명시되지 않는 한, 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지형 비-방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 이중 결합이 이러한 기에 존재할 수 있다. 예를 들어, "C2-C6" 알케닐은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼로서 정의된다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐 및 시클로헥세닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알케닐 기의 직쇄형, 분지형 또는 시클릭 부분은 이중 결합을 함유할 수 있고, 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다. 용어 "시클로알케닐"은 명시된 개수의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 모노시클릭 탄화수소 기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알키닐"은 달리 명시되지 않는 한 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하고 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "C2-C6 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 2-프로피닐 및 2-부티닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알키닐 기의 직쇄형 또는 분지형 부분은 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환될 수 있다.
본원에 사용된 "알콕실" 또는 "알콕시"는 나타낸 개수의 탄소 원자를 갖는 -O-알킬 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-6 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, 및 C6 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, C1-8 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 및 C8 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시, n-헵톡시 및 n-옥톡시를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "케토"는 카르보닐 가교를 통해 부착된, 본원에 정의된 바와 같은 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 또는 아릴 기를 지칭한다. 케토 기의 예는 알카노일 (예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 펜타노일 또는 헥사노일), 알케노일 (예를 들어, 아크릴로일), 알키노일 (예를 들어, 에티노일, 프로피노일, 부티노일, 펜티노일 또는 헥시노일), 아릴로일 (예를 들어, 벤조일), 헤테로아릴로일 (예를 들어, 피롤로일, 이미다졸로일, 퀴놀리노일 또는 피리디노일)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "알콕시카르보닐"은 카르보닐 가교를 통해 부착된 상기 정의된 바와 같은 임의의 알콕시 기 (즉, -C(O)O-알킬)를 지칭한다. 알콕시카르보닐 기의 예는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 이소-프로폭시카르보닐, n-프로폭시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 또는 n-펜톡시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교를 통해 부착된 본원에 정의된 바와 같은 임의의 아릴 기 (즉, -C(O)O-아릴)를 지칭한다. 아릴옥시카르보닐 기의 예는 페녹시카르보닐 및 나프틸옥시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "헤테로아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교를 통해 부착된 본원에 정의된 바와 같은 임의의 헤테로아릴 기 (즉, -C(O)O-헤테로아릴)를 지칭한다. 헤테로아릴옥시카르보닐 기의 예는 2-피리딜옥시카르보닐, 2-옥사졸릴옥시카르보닐, 4-티아졸릴옥시카르보닐 또는 피리미디닐옥시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴" 또는 "방향족"은 각각의 고리에 6개 이하의 원자를 갖는 임의의 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 탄소 고리를 의미하며, 여기서 적어도 1개의 고리는 방향족이다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 테트라히드로나프틸, 인다닐 및 비페닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아릴 치환기가 비시클릭이고 1개의 고리가 비-방향족인 경우에, 부착은 방향족 고리를 통한 것으로 이해된다. 아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "아릴렌"은 본원에 기재된 바와 같은 아릴 기의 2가 라디칼을 지칭한다. 아릴렌은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 치환 지점을 갖는 아릴의 하위세트이다. 아릴렌의 예는 2가 페닐 기를 지칭하는 페닐렌을 포함한다. 아릴렌 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "할로"는 할로겐 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, "할로"는 플루오린 (F), 염소 (Cl), 브로민 (Br), 또는 아이오딘 (I) 라디칼을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 각각의 고리에서 7개 이하의 원자의 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 나타내고, 여기서 적어도 1개의 고리는 방향족이고, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로아릴 기의 예는 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸로닐, 벤족사졸로닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 디히드로이소인돌로닐, 이미다조피리디닐, 이소인돌로닐, 인다졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이속사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴 및 테트라히드로퀴놀린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "헤테로아릴"은 또한 임의의 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥시드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 치환기가 비시클릭이고 1개의 고리가 비-방향족이거나 헤테로원자를 함유하지 않는 경우에, 부착은 방향족 고리를 통해 또는 헤테로원자 함유 고리를 통해 이루어지는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴렌"은 본원에 기재된 바와 같은 헤테로아릴 기의 2가 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴렌은 헤테로아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 치환 지점을 갖는 헤테로아릴의 하위세트이다. 헤테로아릴의 예는 피리디닐렌, 피리미디닐렌 및 피롤릴렌을 포함한다. 헤테로아릴렌 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클릴"은, 폴리시클릭 기 포함한, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3- 내지 14-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로시클릭"은 또한 용어 "헤테로사이클" 및 "헤테로시클릴"과 동의어인 것으로 간주되고, 또한 본원에 제시된 동일한 정의를 갖는 것으로 이해된다. "헤테로시클릴"은 상기 언급된 헤테로아릴, 뿐만 아니라 그의 디히드로 및 테트라히드로 유사체를 포함한다. 헤테로시클릴 기의 예는 아제티디닐, 벤조이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥소옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸린, 옥소피페라지닐, 옥소피롤리디닐, 옥소모르폴리닐, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리디노닐, 피리미딜, 피리미디노닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로벤조이미다졸릴, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로벤조티오페닐, 디히드로벤족사졸릴, 디히드로푸라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로인돌릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로퀴놀리닐, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디히드로아제티디닐, 디옥시도티오모르폴리닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로티에닐, 및 그의 N-옥시드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클릴 치환기의 부착은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 발생할 수 있다. 헤테로시클릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로시클로알킬"은, 폴리시클릭 기를 포함한, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3- 내지 14-원 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 헤테로시클릴 기의 예는 아제티디닐, 옥소피페라지닐, 옥소피롤리디닐, 옥소모르폴리닐, 옥세타닐, 피라닐, 피리디노닐, 피리미디노닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로푸라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디옥시도티오모르폴리닐 및 테트라히드로티에닐, 및 그의 N-옥시드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클로알킬 치환기의 부착은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 발생할 수 있다. 헤테로시클릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 본원에 기재된 바와 같은 헤테로시클로알킬 기의 2가 라디칼을 지칭한다. 헤테로시클로알킬렌은 헤테로시클로알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만 2개의 치환 지점을 갖는 헤테로시클로알킬의 하위세트이다. 헤테로시클로알킬렌의 예는 피페리디닐렌, 아제티디닐렌 및 테트라히드로푸라닐렌을 포함한다. 헤테로시클로알킬렌 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 완화 또는 경감을 제공하기 위해 수행되는 방법 또는 단계를 의미한다. 본원에 사용된 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 예방, 관리, 예방적 치료 및/또는 억제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포 내로 도입하는"은 RNAi 작용제를 지칭하는 경우에 RNAi 작용제를 세포 내로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적 전달"은 RNAi 작용제가 예상된 생물학적 활성, 예를 들어 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 갖는 것을 가능하게 하는 방식으로 RNAi 작용제를 세포에 전달하는 것을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
Figure pct00042
의 사용은 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따른 임의의 기 또는 기들이 연결될 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 그의 원자의 성질 또는 결합 순서 또는 공간에서의 그의 원자의 배열이 상이한 화합물을 지칭한다. 그의 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 지칭되고, 비-중첩가능한 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체" 또는 때때로 광학 이성질체로 지칭된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 지칭된다. 본원에 기재된 화합물이 올레핀계 이중 결합 또는 이성질체 구조가 구체적으로 정의되지 않은 다른 기하 비대칭 중심을 함유하는 경우에, 화합물은 E 및 Z 기하 이성질체 둘 다를 개별적으로 또는 혼합물로 포함할 수 있는 것으로 의도된다. 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 예를 들어 모든 가능한 이성질체, 뿐만 아니라 그의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 모든 호변이성질체 형태가 또한 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 연결기는 한 분자 또는 분자의 부분을 또 다른 분자 또는 분자의 제2 부분에 연결하는 1개 이상의 원자이다. 관련 기술분야에서, 용어 연결기 및 스페이서는 때때로 상호교환가능하게 사용된다. 유사하게, 관련 기술분야에 사용된 용어 스캐폴드는 때때로 연결기와 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 펩티드-절단가능한 연결기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 펩티드 페닐알라닌-시트룰린-페닐알라닌-프롤린을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결기는 PEG 기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개의 분자 사이의 연결을 지칭하는 경우에 2개의 분자가 공유 결합에 의해 연결되거나 또는 2개의 분자가 비공유 결합 (예를 들어, 수소 결합 또는 이온 결합)을 통해 회합되는 것을 의미한다. 일부 예에서, 용어 "연결된"이 비공유 결합을 통한 2개의 분자 사이의 회합을 지칭하는 경우에, 2개의 상이한 분자 사이의 회합은 생리학상 허용되는 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수) 중에서 1 x 10-4 M 미만 (예를 들어, 1 x 10-5 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 또는 1 x 10-7 M 미만)의 KD를 갖는다. 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 연결된은 임의의 개재 원자 또는 원자단을 갖거나 갖지 않는 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연결을 지칭할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 화합물 및 조성물이, 화합물 또는 조성물이 위치하는 환경에 따라, 특정 원자 (예를 들어, N, O, 또는 S 원자)를 양성자화 또는 탈양성자화 상태로 가질 수 있음을 용이하게 이해하고 인지할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대 예를 들어, OH, SH, 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있음을 고려한다. 본원의 개시내용은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 개시된 화합물 및 조성물을 환경의 pH에 기초한 그의 양성자화 상태와 무관하게 포괄하도록 의도된다.
구조는 원자가에 의해 허용되는 바와 같은 고리 상의 임의의 탄소 또는 헤테로원자에 대한 결합을 나타내기 위해 고리 구조 상에 "부유하는" 결합을 갖는 것으로 도시될 수 있다. 예를 들어, 구조
Figure pct00043
은 R이 고리 상의 5개의 이용가능한 위치 중 임의의 위치에서 임의의 수소 원자를 대체할 수 있음을 나타낸다. "부유" 결합은 또한 원자가에 의해 허용되는 바와 같이 비사이클의 어느 하나의 고리 상의 임의의 위치에 대한 결합을 나타내기 위해 비시클릭 구조에서 사용될 수 있다. 비사이클의 경우에, 결합은 둘 다의 고리 상에 "부유하는" 것으로 표시될 것이며, 예를 들어
Figure pct00044
은 R이 고리 상의 7개의 이용가능한 위치 중 임의의 것에서 임의의 수소 원자를 대체할 수 있음을 나타낸다.
본원의 청구범위에 사용된 어구 "이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구범위에 사용된 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다.
화물 분자를 αvβ6 인테그린을 발현하는 세포에 표적화하고 전달하기 위한 기재된 αvβ6 인테그린 리간드의 용도가 본원에 기재된다. 화물 분자는 시험관내, 계내, 생체외 또는 생체내에서 세포에 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30; 또는 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 25 또는 25 내지 30개)의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 초과의 αvβ6 인테그린 리간드 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 αvβ6 인테그린 리간드)는 1개의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화물 분자)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 연결기, 예컨대 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기를 통해 1종 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 각각의 리간드에 대한 적어도 1개의 부착 지점 및 각각의 화물 분자에 대한 적어도 1개의 부착 지점을 포함하는 스캐폴드를 통해 1종 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린 리간드는 1종의 화물 분자를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, αvβ6 인테그린 리간드는 1종 초과의 화물 분자를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
본원에 개시된 임의의 αvβ6 인테그린 리간드는 화물 분자, 연결 모이어티 및/또는 보호된 연결 모이어티에 연결될 수 있다. 연결 모이어티는 화물 분자에 대한 αvβ6 인테그린 리간드의 접합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 αvβ6 인테그린 또는 αvβ6 인테그린을 발현하는 세포에 대한 화물 분자의 표적화를 증가시킬 수 있다. 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 화합물, 전구약물, 또는 공지된 치료 이익을 갖는 또 다른 물질일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제), 천연 또는 변형된 핵산, 펩티드, 압타머, 중합체, 폴리아민, 단백질, 독소, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 전구약물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분으로서 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분으로서 RNAi 작용제를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 αvβ6 인테그린 리간드, 연결기 및 스캐폴드를 포함하는 구조체를 제공하며, 여기서 스캐폴드는 화물 분자에 결합된다. 일부 실시양태에서, 구조체는 한자리 형태의 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구조체는 두자리 형태의 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구조체는 세자리 형태의 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구조체는 네자리 형태의 리간드를 포함할 수 있다.
여러자리 αvβ6 인테그린 리간드 및 스캐폴드
본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 αvβ6 인테그린 리간드는 1개 이상의 화물 분자에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단지 1개의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "한자리" 또는 "1가" 리간드로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 2개의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "두자리" 또는 "2가" 리간드로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 3개의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "세자리" 또는 "3가" 리간드로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 4개의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "4자리" 또는 "4가" 리간드로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 4개 초과의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다.
단지 1개의 αvβ6 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합되는 일부 실시양태에서 (본원에서 "한자리" 리간드로 지칭됨), αvβ6 인테그린 리간드는 화물 분자에 직접 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 스캐폴드 또는 다른 링커 구조를 통해 화물 분자에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 1개 이상의 스캐폴드를 포함한다. 또한 때때로 관련 기술분야에서 연결기 또는 링커로 지칭되는 스캐폴드는 본원에 개시된 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드에 대한 1종 이상의 화물 분자의 연결을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 리간드와 상용성인 유용한 스캐폴드는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드와 함께 사용될 수 있는 스캐폴드의 비제한적 예는 중합체 및 폴리아미노산 (예를 들어, 비스-글루탐산, 폴리-L-리신 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 시스테인 링커 또는 기, DBCO-PEG1-24-NHS, 프로파르길-PEG1-24-NHS, 및/또는 여러자리 DBCO 및/또는 프로파르길 모이어티를 포함할 수 있다.
연결 모이어티 및 보호된 연결 모이어티.
연결 모이어티는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원에서 본 발명의 범주에 사용하기에 적합한 연결 모이어티는 아미노 기, 아미드 기, 카르복실산 기, 아지드, 알킨, 프로파르길 기, BCN (비시클로[6.1.0]노닌), DBCO (디벤조시클로옥틴) 티올, 말레이미드 기, 아미노옥시 기, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 또는 다른 활성화된 에스테르 (예를 들어, PNP, TFP, PFP), 브로모 기, 알데히드, 카르보네이트, 토실레이트, 테트라진, 트랜스-시클로옥텐 (TCO), 히드라지드, 히드록실 기, 디술피드 및 오르토피리딜 디술피드 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
연결 모이어티의 혼입은 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드의 화물 분자에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 접합 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원의 본 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 접합 반응은 아미드 커플링 반응, 마이클 첨가 반응, 히드라존 형성 반응 및 클릭 화학 고리화첨가 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 표적화 리간드는 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르로서 합성되며, 이는 반응성 아미노 기에 의해 대체되어 화물 분자를 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는, 예를 들어 클릭 화학 고리화첨가 반응을 통해 프로파르길 또는 DBCO 기에 접합되어 화물 분자를 부착시킬 수 있는 아지드로서 합성된다.
보호된 연결 모이어티가 또한 관련 기술분야에서 통상적으로 사용된다. 보호기는 비-보호된 기가 반응하는 조건 하에 반응하지 않는 기로의 연결 모이어티의 일시적인 화학적 변환을 제공하여, 예를 들어 후속 화학 반응에서 화학-선택성을 제공한다. 본원에서 본 발명의 범주에 사용하기에 적합한 보호된 연결 모이어티는 BOC 기 (t-부톡시카르보닐), Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐), 카르복시벤질 (CBZ) 기, 벤질 에스테르, 및 PBF (2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
화물 분자 (RNAi 작용제 포함)
화물 분자는, 본원에 기재된 αvβ6 인테그린 리간드로부터 분리될 때, αvβ6 인테그린 수용체를 포함하는 세포에 대해 바람직한 효과를 가지는 임의의 분자이다. 화물 분자는 제약 성분, 약물 제품, 전구약물, 공지된 치료 이익을 갖는 물질, 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 중합체, 폴리아민, 단백질, 압타머, 독소, 비타민, PEG, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자 (예를 들어, 동일하거나 상이한 화물 분자)는 화물 분자를 αvβ6 인테그린을 발현하는 세포에 표적화하기 위해 1종 이상의 αvβ6 인테그린 리간드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자는 제약 성분 또는 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물이다. 본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드-기반 화합물"은 약 10-50개 (예를 들어, 10 내지 48, 10 내지 46, 10 내지 44, 10 내지 42, 10 내지 40, 10 내지 38, 10 내지 36, 10 내지 34, 10 내지 32, 10 내지 30, 10 내지 28, 10 내지 26, 10 내지 24, 10 내지 22, 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 14, 10 내지 12, 12 내지 50, 12 내지 48, 12 내지 46, 12 내지 44, 12 내지 42, 12 내지 40, 12 내지 38, 12 내지 36, 12 내지 34, 12 내지 32, 12 내지 30, 12 내지 28, 12 내지 26, 12 내지 24, 12 내지 22, 12 내지 20, 12 내지 18, 12 내지 16, 12 내지 14, 14 내지 50, 14 내지 48, 14 내지 46, 14 내지 44, 14 내지 42, 14 내지 40, 14 내지 38, 14 내지 36, 14 내지 34, 14 내지 32, 14 내지 30, 14 내지 28, 14 내지 26, 14 내지 24, 14 내지 22, 14 내지 20, 14 내지 18, 14 내지 16, 16 내지 50, 16 내지 48, 16 내지 46, 16 내지 44, 16 내지 42, 16 내지 40, 16 내지 38, 16 내지 36, 16 내지 34, 16 내지 32, 16 내지 30, 16 내지 28, 16 내지 26, 16 내지 24, 16 내지 22, 16 내지 20, 16 내지 18, 18 내지 50, 18 내지 48, 18 내지 46, 18 내지 44, 18 내지 42, 18 내지 40, 18 내지 38, 18 내지 36, 18 내지 34, 18 내지 32, 18 내지 30, 18 내지 28, 18 내지 26, 18 내지 24, 18 내지 22, 18 내지 20, 20 내지 50, 20 내지 48, 20 내지 46, 20 내지 44, 20 내지 42, 20 내지 40, 20 내지 38, 20 내지 36, 20 내지 34, 20 내지 32, 20 내지 30, 20 내지 28, 20 내지 26, 20 내지 24, 20 내지 22, 22 내지 50, 22 내지 48, 22 내지 46, 22 내지 44, 22 내지 42, 22 내지 40, 22 내지 38, 22 내지 36, 22 내지 34, 22 내지 32, 22 내지 30, 22 내지 28, 22 내지 26, 22 내지 24, 24 내지 50, 24 내지 48, 24 내지 46, 24 내지 44, 24 내지 42, 24 내지 40, 24 내지 38, 24 내지 36, 24 내지 34, 24 내지 32, 24 내지 30, 24 내지 28, 24 내지 26, 26 내지 50, 26 내지 48, 26 내지 46, 26 내지 44, 26 내지 42, 26 내지 40, 26 내지 38, 26 내지 36, 26 내지 34, 26 내지 32, 26 내지 30, 26 내지 28, 28 내지 50, 28 내지 48, 28 내지 46, 28 내지 44, 28 내지 42, 28 내지 40, 28 내지 38, 28 내지 36, 28 내지 34, 28 내지 32, 내지 28 내지 30, 30 내지 50, 30 내지 48, 30 내지 46, 30 내지 44, 30 내지 42, 30 내지 40, 30 내지 38, 30 내지 36, 30 내지 34, 30 내지 32, 32 내지 50, 32 내지 48, 32 내지 46, 32 내지 44, 32 내지 42, 32 내지 40, 32 내지 38, 32 내지 36, 32 내지 34, 34 내지 50, 34 내지 48, 34 내지 46, 34 내지 44, 34 내지 42, 34 내지 40, 34 내지 38, 34 내지 36, 36 내지 50, 36 내지 48, 36 내지 46, 36 내지 44, 36 내지 42, 36 내지 40, 36 내지 38, 38 내지 50, 38 내지 48, 38 내지 46, 38 내지 44, 38 내지 42, 38 내지 40, 40 내지 50, 40 내지 48, 40 내지 46, 40 내지 44, 40 내지 42, 42 내지 50, 42 내지 48, 42 내지 46, 42 내지 44, 44 내지 50, 44 내지 48, 44 내지 46, 46 내지 50, 46 내지 48, 또는 48 내지 50개)의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기 쌍을 함유하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 세포 내의 발현된 표적 핵산 또는 표적 유전자 내의 코딩 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵염기 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은, 유전자를 발현하는 세포에 전달 시, 기저 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 본원에서 "발현-억제 올리고뉴클레오티드-기반 화합물"로 지칭된다. 유전자 발현은 시험관내 또는 생체내에서 억제될 수 있다.
"올리고뉴클레오티드-기반 화합물"은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 리보자임, 간섭 RNA 분자 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 RNAi 작용제인 이중-가닥 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자는 "RNAi 작용제"이며, 이는 본원에 정의된 바와 같이 서열 특이적 방식으로 표적 메신저 RNA (mRNA)의 mRNA 전사체를 분해하거나 그의 번역을 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물이다. 본원에 사용된 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘 (즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도된 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함)을 통해, 또는 임의의 대안적 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제는, 그 용어가 본원에 사용된 바와 같이, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정한 경로 또는 작용 메카니즘에 의해 얽매이거나 또는 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은 (또는 작은) 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 다이서 기질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
전형적으로, RNAi 작용제는 적어도 제1 서열을 포함하는 센스 가닥 (패신저 가닥으로도 지칭됨), 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥 (가이드 가닥으로도 지칭됨)으로 구성될 수 있다. RNAi 작용제 센스 및 안티센스 가닥의 길이는 각각 16 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 19 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. RNAi 작용제는 표적 유전자 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 가닥 서열을 포함하고, 표적을 발현하는 세포로의 전달 시, RNAi 작용제는 생체내 또는 시험관내에서 1종 이상의 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
일반적으로 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 및 구체적으로 RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결로 구성될 수 있다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-변형된 뉴클레오티드, 3'-3' 연결 (역전된) 뉴클레오티드, 비-천연 염기-포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체), 잠금 뉴클레오티드, 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 시클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (5-원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드임)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오티드, 2'-아미노 뉴클레오티드 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비-표준 연결 또는 백본 (즉, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 변형된 백본)에 의해 연결될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결은 비-포스페이트-함유 공유 뉴클레오시드간 연결일 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 5'-포스포로티오에이트 기, 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'와 5'-3' 또는 2'-5'와 5'-2' 연결된 것인 역극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 하나 초과의 변형이 단일 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화물 분자는 미오스타틴 유전자 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다.
RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. RNAi 작용제에 관한 추가의 개시내용은, 예를 들어 변형의 개시내용에서 찾아볼 수 있고, 예를 들어 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/045446 (애로우헤드 파마슈티칼스, 인크.(Arrowhead Pharmaceuticals, Inc.))에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자(들)는 약동학적 및/또는 약역학적 (PK/PD) 조정제로서 작용할 수 있는 PEG 모이어티를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자는 약 20-900개의 에틸렌 옥시드 (CH2-CH2-O) 단위 (예를 들어, 20 내지 850, 20 내지 800, 20 내지 750, 20 내지 700, 20 내지 650, 20 내지 600, 20 내지 550, 20 내지 500, 20 내지 450, 20 내지 400, 20 내지 350, 20 내지 300, 20 내지 250, 20 내지 200, 20 내지 150, 20 내지 100, 20 내지 75, 20 내지 50, 100 내지 850, 100 내지 800, 100 내지 750, 100 내지 700, 100 내지 650, 100 내지 600, 100 내지 550, 100 내지 500, 100 내지 450, 100 내지 400, 100 내지 350, 100 내지 300, 100 내지 250, 100 내지 200, 100 내지 150, 200 내지 850, 200 내지 800, 200 내지 750, 200 내지 700, 200 내지 650, 200 내지 600, 200 내지 550, 200 내지 500, 200 내지 450, 200 내지 400, 200 내지 350, 200 내지 300, 200 내지 250, 250 내지 900, 250 내지 850, 250 내지 800, 250 내지 750, 250 내지 700, 250 내지 650, 250 내지 600, 250 내지 550, 250 내지 500, 250 내지 450, 250 내지 400, 250 내지 350, 250 내지 300, 300 내지 900, 300 내지 850, 300 내지 800, 300 내지 750, 300 내지 700, 300 내지 650, 300 내지 600, 300 내지 550, 300 내지 500, 300 내지 450, 300 내지 400, 300 내지 350, 350 내지 900, 350 내지 850, 350 내지 800, 350 내지 750, 350 내지 700, 350 내지 650, 350 내지 600, 350 내지 550, 350 내지 500, 350 내지 450, 350 내지 400, 400 내지 900, 400 내지 850, 400 내지 800, 400 내지 750, 400 내지 700, 400 내지 650, 400 내지 600, 400 내지 550, 400 내지 500, 400 내지 450, 450 내지 900, 450 내지 850, 450 내지 800, 450 내지 750, 450 내지 700, 450 내지 650, 450 내지 600, 450 내지 550, 450 내지 500, 500 내지 900, 500 내지 850, 500 내지 800, 500 내지 750, 500 내지 700, 500 내지 650, 500 내지 600, 500 내지 550, 550 내지 900, 550 내지 850, 550 내지 800, 550 내지 750, 550 내지 700, 550 내지 650, 550 내지 600, 600 내지 900, 600 내지 850, 600 내지 800, 600 내지 750, 600 내지 700, 600 내지 650, 650 내지 900, 650 내지 850, 650 내지 800, 650 내지 750, 650 내지 700, 700 내지 900, 700 내지 850, 700 내지 800, 700 내지 750, 750 내지 900, 750 내지 850, 750 내지 800, 800 내지 900, 850 내지 900 또는 850 내지 900개의 에틸렌 옥시드 단위)를 갖는 PEG 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자(들)는 대략 455개의 에틸렌 옥시드 단위 (약 20 킬로달톤 (kDa) 분자량)를 갖는 PEG 모이어티로 이루어진다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 2 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 20 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 40 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 본원에 기재된 PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. PEG 모이어티는 이산 (단분산) 또는 비-이산 (다분산)일 수 있다. PK 증진 화물 분자로서 사용하기 위한 PEG 모이어티는 상업적으로 구입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 화물 분자(들)는 PK/PD 조정제 또는 인핸서로서 작용할 수 있는 PEG 모이어티, 뿐만 아니라 상이한 화물 분자, 예컨대 제약 활성 성분 또는 화합물을 포함한다.
기재된 αvβ6 인테그린 리간드는 그의 염 또는 용매화물을 포함한다. αvβ6 인테그린 리간드의 용매화물은 그의 상호 인력으로 인해 형성되는 αvβ6 인테그린 리간드 상의 불활성 용매 분자의 부가물을 의미하는 것으로 여겨진다. 용매화물은, 예를 들어 1수화물 또는 2수화물, 또는 알콜, 예컨대 메탄올 또는 에탄올과의 부가 화합물이다.
유리 아미노 기 또는 유리 히드록실 기가 αvβ6 인테그린 리간드의 치환기로서 상응하는 보호기와 함께 제공될 수 있다.
αvβ6 인테그린 리간드는 또한, 예를 들어 유도체, 즉, 예를 들어 시험관내에서 또는 유기체에서 절단되는 알킬 또는 아실 기, 당 또는 올리고펩티드로 변형된 αvβ6 인테그린 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는, 리간드-매개 세포내이입, 음세포작용을 통해, 또는 다른 수단에 의해, 그의 표면 상에 αvβ6 인테그린을 제시하는 세포의 시토졸 내로 화물 분자의 전달을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 αvβ6 인테그린을 제시하는 세포의 형질 막으로 화물 분자의 전달을 용이하게 한다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드 중 하나 이상을 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 제약 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 "제약 조성물"은 약리학상 유효량의 활성 제약 성분 (API), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는 활성 제약 성분 (API, 치료 제품) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공을 보조하고/거나, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 허용성을 보호, 지지 또는 증진시키고/거나, c) 제품 식별을 보조하고/거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전반적인 안전성, 유효성 또는 전달의 임의의 다른 속성을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 또는 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 전달 중합체, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 장성 작용제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 성분은 제약 활성 물질이다. 제약 활성 물질은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등), 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 압타머 및/또는 백신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물은 또한 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 부취제, 삼투압의 변동을 위한 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 공지된 치료 이익을 갖는 다른 작용제를 함유할 수 있다.
제약 조성물은 국부 또는 전신 치료가 바람직한지 여부 및 치료될 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 임의의 방식, 예컨대 비제한적으로 국소 (예를 들어, 경피 패치에 의함), 폐 (예를 들어, 네뷸라이저, 기관내, 비강내에 의한 것을 포함한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의함), 표피, 경피, 경구 또는 비경구에 의해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통해), 두개내, 실질내, 척수강내 및 뇌실내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 제약 조성물은 경구로, 예를 들어 정제, 코팅된 정제, 당의정, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들어 좌제를 사용하여 직장으로; 예를 들어 연고, 크림, 겔 또는 용액을 사용하여 국부로 또는 경피로; 또는 예를 들어 주사가능한 용액을 사용하여 비경구로 수행될 수 있다.
주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수를 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정질 형태, 예를 들어 수성 미세결정질 현탁액 형태일 수 있는 본원에 기재된 임의의 리간드의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포솜 제제 또는 생분해성 중합체 시스템이 또한 관절내 및 안과적 투여 둘 다를 위한 본원에 기재된 임의의 리간드를 제공하는 데 사용될 수 있다.
활성 화합물은 신체로부터의 급속한 제거에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 리포솜 현탁액은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "약리학상 유효량", "치료 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 제약 활성제의 양을 지칭한다.
αvβ6 인테그린 리간드를 함유하는 의약이 또한 본 발명의 목적이며, αvβ6 인테그린 리간드를 함유하는 1종 이상의 화합물, 및 원하는 경우에, 공지된 치료 이익을 갖는 1종 이상의 다른 물질을 제약상 허용되는 형태로 만드는 것을 포함하는 이러한 의약의 제조 방법 또한 본 발명의 목적이다.
본원에 개시된 기재된 αvβ6 인테그린 리간드 및 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물은 키트, 용기, 팩 또는 분배기에 포장되거나 포함될 수 있다. αvβ6 인테그린 리간드 및 αvβ6 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물은 사전-충전된 시린지 또는 바이알에 포장될 수 있다.
세포, 조직 및 비-인간 유기체
본원에 기재된 αvβ6 인테그린 리간드 중 적어도 1종을 포함하는 세포, 조직 및 비-인간 유기체가 고려된다. 세포, 조직 또는 비-인간 유기체는 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수단에 의해 αvβ6 인테그린 리간드를 세포, 조직 또는 비-인간 유기체에 전달함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유동물 세포이다.
연결기, 약동학적 및/또는 약역학적 (PK/PD) 조정제, 및 전달 비히클
일부 실시양태에서, αvβ6 리간드는 연결기, 약동학적 및/또는 약역학적 (PK/PD) 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 기에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 화물 분자의 표적화, 전달 또는 부착을 증진시킬 수 있다. 표적화 기 및 연결기의 예가 표 6에 제공된다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 공유 연결될 수 있다. 화물 분자가 RNAi 작용제인 실시양태에서, RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 단부에 연결된다. αvβ6 리간드는 링커/연결기를 통해 화물 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, αvβ6 리간드는 불안정성, 절단성 또는 가역적 결합 또는 링커를 통해 화물 분자에 연결된다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착된 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 증진시킨다.
표적화 기 또는 표적화 모이어티는 이들이 부착되어 있는 화물 분자의 약동학적 또는 생체분포 특성을 증진시켜 화물 분자의 세포-특이적 (일부 경우에, 기관 특이적 포함) 분포 및 세포-특이적 (또는 기관 특이적) 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 본원에 기재된 바와 같은 αvβ6 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 PK/PD 조정제를 포함한다. 일부 실시양태에서, αvβ6 리간드는 링커, 예컨대 PEG 링커, 또는 일부 경우에 링커로서의 역할을 할 수 있는 1, 2 또는 3개의 무염기성 및/또는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기를 사용하여 화물 분자에 연결된다.
연결 모이어티, 예컨대 아미노 기 (본원에서 아민으로도 지칭됨)를 갖는 화물 분자가 합성될 수 있다. 화물 분자가 RNAi 작용제인 실시양태에서, 연결 모이어티는 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 연결될 수 있다. 연결 모이어티는 후속적으로 관련 기술분야에 전형적인 방법을 사용하여 αvβ6 리간드를 부착시키는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 NH2-C6 기를 갖는 RNAi 작용제가 합성된다. 후속적으로 말단 아미노 기를 반응시켜, 예를 들어 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에 1개 이상의 알킨 기를 갖는 RNAi 작용제가 합성된다. 후속적으로 말단 알킨 기(들)를 반응시켜, 예를 들어 αvβ6 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 연결기는 αvβ6 리간드에 접합된다. 연결기는 화물 분자, PK/PD 조정제, 전달 중합체 또는 전달 비히클에 대한 αvβ6 리간드의 공유 연결을 용이하게 한다. 연결기의 예는 Alk-SMPT-C6, Alk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-Alk-SS-C6, 및 C6-SS-Alk-Me, 연결 모이어티, 예컨대 1급 아민 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 잔기/뉴클레오티드, 아미노산, 트리-알킨 관능화 기, 리비톨, 및/또는 PEG 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
링커 또는 연결기는 하나의 화학적 기 (예컨대 RNAi 작용제) 또는 관심 절편을 또 다른 화학적 기 (예컨대 αvβ6 리간드, PK/PD 조정제, 또는 전달 중합체) 또는 관심 절편에 1개 이상의 공유 결합을 통해 연결하는 2개의 원자 사이의 연결이다. 불안정성 연결은 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 연결에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기 및 아르알키닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않으며; 이들 각각은 1개 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 상기 목록은 설명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, αvβ6 리간드는 추가의 링커의 사용 없이 화물 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, αvβ6 리간드는 화물 분자에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 쉽게 존재하는 링커를 갖도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2종 이상의 RNAi 작용제는 동일한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 RNAi 작용제가 조성물에 포함되는 경우에, 2종 이상의 RNAi 작용제는 상이한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결된다.
특정 연결기의 예가 표 A에 제공된다.
표 A. 다양한 연결기를 나타내는 구조
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
여기서
Figure pct00048
은 화물 분자에 대한 부착 지점을 나타낸다.
대안적으로, 관련 기술분야에 공지된 다른 연결기가 사용될 수 있다.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기 비제한적 실시예로 예시된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 특정 실시양태를 예시하며, 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1. αvβ6 인테그린 리간드의 합성
실시예의 합성의 하기 실험 세부사항에 사용된 약어 중 일부는 하기와 같이 정의된다: h 또는 hr = 시간; min = 분; mol = 몰; mmol = 밀리몰; M = 몰; μM = 마이크로몰; g = 그램; μg = 마이크로그램; rt 또는 RT = 실온; L= 리터; mL = 밀리리터; wt = 중량; Et2O = 디에틸 에테르; THF = 테트라히드로푸란; DMSO = 디메틸 술폭시드; EtOAc = 에틸 아세테이트; Et3N 또는 TEA = 트리에틸아민; i-Pr2NEt 또는 DIPEA 또는 DIEA = 디이소프로필에틸아민; CH2Cl2 또는 DCM = 메틸렌 클로라이드; CHCl3 = 클로로포름; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CCl4 = 사염화탄소; MeOH = 메탄올; EtOH = 에탄올; DMF = 디메틸포름아미드; BOC = t-부톡시카르보닐; CBZ = 벤질옥시카르보닐; TBS = t-부틸디메틸실릴; TBSCl 또는 TBDMSCl = t-부틸디메틸실릴 클로라이드; TFA = 트리플루오로아세트산; DMAP = 4-디메틸아미노피리딘; NaN3 = 아지드화나트륨; Na2SO4 = 황산나트륨; NaHCO3 = 중탄산나트륨; NaOH = 수산화나트륨; MgSO4 = 황산마그네슘; K2CO3 = 탄산칼륨; KOH = 수산화칼륨; NH4OH = 수산화암모늄; NH4Cl = 염화암모늄; SiO2 = 실리카; Pd-C = 탄소상 팔라듐; HCl = 염화수소 또는 염산; NMM = N-메틸모르폴린; H2 = 수소 기체; KF = 플루오린화칼륨; EDC-HCl = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드; MTBE = 메틸-tert-부틸 에테르; Ar = 아르곤; N2 = 질소; RT = 체류 시간.
구조 40p-60p에 대한 화학 명칭은 켐드로우(ChemDraw)® 소프트웨어를 사용하여 자동적으로 생성되었다.
화합물 40p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(3-((4,5-디히드로-1H-이미다졸-2-일)아미노)벤즈아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00049
HBTU (239 mg, 0.629 mmol)를 DMF (10 mL) 중 산 1 (160 mg, 0.523 mmol), 글리신 메틸 에스테르 히드로클로라이드 (79 mg, 0.639 mmol), HOBt 948 mg, 0.312 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (338 uL, 3 mmol)의 빙냉 용액에 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물 (1 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 고진공 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc와 물 (1:1, 50 mL) 사이에 분배하였다. EtOAc 층을 물로 2회 세척하였다. 수성 세척물을 EtOAc로 1회 역추출하고, 유기 상을 합하고, Na2SO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 생성물을 콤비플래쉬에 의해 시스템 DCM: DCM 중 20% MeOH, 구배 5-30%, 20분을 사용하여 정제하였다. 수율 192 mg (97%). NMR (DMSO-d6): 1.5 s (9H); 3.65 s (3H); 3.7 m (4H); 4.0 d (2H), 7.38 t (1H); 7.45 m (1H); 7.96 bs (1H); 8.3 s (1H); 8.88 t (1H); 9.44 bs (1H). 분자 질량 계산치: 376.17 실측치: MS (ES, pos): 377.30 [M+1]+, 277.33 [M+1 - Boc]+.
Figure pct00050
물 (3 mL) 중 LiOH (36 mg, 1.515 mmol)의 용액을 THF (5 mL) 중 에스테르 2의 교반 용액에 적가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 1 N HCl을 사용하여 pH=4.5로 산성화시켰다. 용매 부피의 약 1/2을 진공 하에 제거하고, 생성물을 EtOAc로 5회 추출하였다. 생성물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 114 mg (63%). 생성물을 후속 단계에서 직접 사용하였다. NMR (DMSO-d6): 1.51 s (9H); 3.59 m (2H); 3.95 d (2H); 4.05 m (2H); 7.09 m (2H); 7.9 m (2H); 8.92 t (1H); 9.35 bs (1H); 10.52 bs(1H), 12.6 bs (1H).
Figure pct00051
탄산세슘 (2.556 g, 7.845 mmol)을 DMF (100 mL) 중 3-(N-Boc-아미노)-3-[4-[4-히드록시나프틸]페닐]--프로피온산 4의 메틸 에스테르 (3 g, 7.132 mmol) 및 Tos-Peg5-N3 (3.275 g, 7.845 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 3시간, 및 이어서 실온에서 14시간 동안 교반하고, 0℃로 냉각시키고, NaHCO3의 차가운 포화 용액에 부었다. 생성물을 EtOAc 4 x 200 mL로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 진공 하에 농축시켰다. 잔류 DMF를 회전증발기 상에서 생성물로부터 톨루엔의 2회 공증발에 의해 제거하였다. 시스템 DCM: DCM 중 20% MeOH, 구배 = 0 - 20%를 사용하는 콤비플래쉬 정제. 수율 4.757 g (88%). NMR (DMSO-d6): 1.39 s (9H); 2.80 m(2H); 3.36 t (2H); 3.456 m (12H), 3.69 m (2H); 3.92 m (2H); 4.32 m (2H); 5.03 q (1H); 7.06 d (1H); 7.33 d (1H); 7.40 d (2H); 7.44 d (2H); 7.54 m (3H); 7.77 m (1H); 8.27 m (1H). 분자 질량 계산치: 666.33, 684.33 [M+ NH4]+ 실측치 MS (ES, pos): 684.54 [M+ NH4]+; 567.43 [M+1 - Boc]+.
Figure pct00052
화합물 5 (200 mg, 0.3 mmol)를 디옥산 중 4 M HCl의 빙냉 용액으로 처리하고, 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 생성물을 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 잔류 HCl을 디옥산의 공증발에 의해 제거하였다. MS (ES, pos): 567 [M+1]+. 수득된 유리 아민을 DMF (10 mL) 중에 용해시키고, 화합물 3 (108 mg, 0.3 mmol), HOBt (28 mg, 0.18 mmol), 4-메틸모르폴린 (200 uL, 1.8 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 빙조에서 냉각시켰다. HBTU (137 mg, 0.36 mmol)를 첨가하고, 냉각 조를 제거하고, 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 물 (0.5 mL)을 첨가하고, DMF를 고진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc와 물 (1:1, 50 mL) 사이에 분배하고, NaHCO3을 사용하여 pH=8로 염기성화시키고, 생성물을 EtOAc로 3회 추출하였다. EtOAc 용액을 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 농축 건조시켰다. 생성물을 콤비플래쉬® 상에서 시스템 DCM: DCM 중 20% MeOH, 구배 0-40%, 20분을 사용하여 정제하였다. 수율 132 mg (48%). NMR (DMSO-d6): 1.51 s (9H); 2.60 m (2H); 3.38 t (2H); 3.59 m (2H); 3.95 m 6H); 4.32 m (2H); 5.27 q (1H); 7.06 d (1H); 7.33 d (1H); 7.42 d (2H); 7.48 d (2H); 7.53 m (2H); 7.58 m (2H); 7.77 m (1H); 7.89 m (2H); 8.28 m (1H); 8.62 d (1H); 8.79 t (1H); 9.2 bs (1H). 분자 질량 계산치: 910.422 실측치 MS (ES, pos): 911.58 [M+1]+; 811.48 [M+1 - Boc]+.
Figure pct00053
화합물 6 (68.4 mg, 0.075 mmol)을 THF:물=1:1 (2 ml) 중 LiOH (11 mg, 0.224 mmol)의 용액과 함께 실온에서 2시간 동안 교반하였다. THF를 진공 하에 증발시키고, 수성 잔류물을 물로 10 mL로 희석하고, 1 N HCl을 사용하여 pH=4로 산성화시키고, 염수 (3 mL)를 첨가하고, 생성물을 EtOAc로 3회 추출하였다. MS (ES, pos): 897.90 [M+1]+; 797.61 [M+1 - Boc]+. 조 생성물을 디옥산 중 HCl의 빙냉 4 M HCl 용액으로 처리하고, 냉각 조를 제거하고, 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 잔류 HCl을 디옥산의 2회 공증발에 의해 제거하였다. 수율 59 mg (94%). 분자 질량 계산치: 796.35 실측치 MS (ES, pos): 797.43 [M+1]+.
화합물 41p, (3S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(3-히드록시-5-((5-히드록시-1,4,5,6-테트라히드로피리미딘-2-일)아미노)벤즈아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00054
교반 막대를 함유한 50-mL 둥근 바닥 플라스크에 화합물 1 1.5 g, DCM 4 mL 및 TFA 4 mL를 첨가하였다. 반응물을 주위 분위기 하에 실온에서 500 rpm에서 교반되도록 하였다.
2시간 후, 반응물은 LC-MS에 의해 완전 전환을 나타냈다. 반응물을 톨루엔과 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성물을 NaHCO3 및 EtOAc로 염기 추출하여 유리 아민을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 567.27 m/z, 관찰치 567.52 m/z.
Figure pct00055
DMF 중 화합물 1 (4.80 g)의 용액에 2 (2.29 g)를 고체-상 전달을 통해 N2(g)의 강한 유동 하에 첨가하고; 2가 중량 보트에 달라붙기 때문에 반응 혼합물을 사용하여 헹구고, 2의 내용물을 반응 플라스크로 옮겼다. 반응물을 주위 조건 하에 1-3시간 동안 교반하였다. LC-MS에 의해 완전한 반응 전환의 확인 시, 조 반응 혼합물을 후속 단계에 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 227.04 m/z, 관찰치 227.05 m/z.
Figure pct00056
DMF 중 화합물 1 (0.28 g)의 용액에 화합물 2 (2.967 mL)를 주위 조건 (1:15 pm) 하에 시린지 및 피하 바늘을 통해 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. LC-MS에 의해 완전한 반응 전환의 확인 시, 조 반응 혼합물을 후속 단계에 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 241.06 m/z, 관찰치 241.00 m/z.
Figure pct00057
0℃로 냉각시킨 DMF 중 화합물 1 (0.28 g)의 용액에 화합물 2 (4.60 g)를 주위 조건 하에 첨가하였다. 반응물을 90℃로 가열하고, 3시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (10 mL) 및 진한 HCl을 첨가하여 반응 pH를 5-6으로 조정하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. LC-MS에 의해 완전한 반응 전환의 확인 시, 반응 혼합물을 여과하고, EtOAc로 헹구어 필터 케이크 중 타우프 고체 생성물을 회수하였다. 여과물에서는 생성물이 관찰되지 않았다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 252.09 m/z, 관찰치 252.08 m/z. 단리된 생성물의 중량은 0.4287 g이었다. 4 단계에 걸친 수율: 5.0%.
Figure pct00058
DMF 중 화합물 1 (0.54 g) 및 2 (0.25 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.37 g), 및 이어서 DIPEA (0.50 mL)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL) 및 염수 (15 mL)로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-40%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 13% B에서 용리되었다. 생성물의 회수율: 0.50 g (71.9% 수율). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 724.35 m/z, 관찰치 724.69 m/z.
Figure pct00059
DCM 중 화합물 1 (0.50 g)의 용액에 TFA (1.59 mL)를 실온에서 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일 (0.28 g, 54.8%)을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30 m/z, 관찰치 624.50 m/z.
Figure pct00060
N2(g) 하에 1:1 DMF:DCM 중 화합물 1 (0.050 g) 및 2 (0.0211 g)의 용액에 DIC (0.015 mL)를 실온에서 첨가하였다. 반응물을 N2(g) 하에 실온에서 주말 동안 교반하였다. LC-MS에 의해, 관찰된 혼합물은 미반응 출발 물질 및 일부 우레아 중간체로 이루어졌다. 이어서, 2 당량의 DIPEA (0.028 mL)를 첨가하였다. 40분 후, 관찰된 혼합물은 또한 바람직하지 않은 부산물을 포함하였다. 5시간 후, 목적 생성물이 관찰되지 않았으므로, 반응물을 40℃로 가열하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 목적 생성물이 관찰되지 않으면서, DIC (0.1 mL) 및 HOBt (~10-20 mg)를 첨가하고, 생성물로의 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 40℃에서 1.5시간 동안 계속 교반되도록 하였다. 이어서, 조 반응 혼합물을 후속 단계에 계내 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 857.38 m/z, 관찰치 857.84 m/z.
Figure pct00061
에스테르 (0.069 g)의 계내 비누화를 수행하였다. 조 반응 혼합물에 정상 분위기 하에 실온에서 물 ~2 mL, 및 이어서 LiOH ~10 mg을 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 진공 하에 농축시키고, PhMe와 공비혼합하였다. 혼합물을 DMF 1 mL 및 물 1 mL 중에 재현탁시키고, 역상 HPLC를 통해 단리하였다. 화합물 41p의 회수: 0.029 g (2 단계에 걸쳐 43.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 843.36 m/z, 관찰치 843.35 m/z.
화합물 42p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-구아니디노펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00062
무수 DMF (10 mL) 중 화합물 1 (1300 mg, 7.42 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (2295 mg, 7.792 mmol, 1.05 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (3.878 mL, 22.262 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (2859 mg, 8.905 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (5 mL)으로 켄칭하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 415.08, 실측치 415.29. 수율: 0.19 g, 6.04%.
Figure pct00063
화합물 1 (3.20 g, 7.705 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (3.12 g, 11.558 mmol, 1.5 당량), XPhos Pd G2 (121 mg, 0.154 mmol, 0.02 당량), 및 K3PO4 (3.27 g, 15.411 mmol, 2.0 당량)를 둥근 바닥 플라스크에서 혼합하였다. 플라스크를 스크류 마개 격막으로 밀봉한 다음, 배기시키고, 질소로 재충전하였다 (이 과정을 총 3회 반복함). 이어서, THF (20 mL) 및 물 (4 mL)을 시린지를 통해 첨가하였다. 혼합물을 질소로 10분 동안 버블링하고, 반응물을 40℃에서 3시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (20 mL)으로 켄칭하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 20 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 화합물을 콤비플래쉬®로 분리하고, DCM 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다.
Figure pct00064
무수 DMF (10 mL) 중 화합물 1 (1.61 g, 3.364 mmol, 1.0 당량) 및 화합물 2 (1.75 g, 4.205 mmol, 1.25 당량)의 용액에 실온에서 탄산세슘 (2.19 g, 6.728 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 50℃에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 물 (20 mL)로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 724.35, 실측치 724.60.
Figure pct00065
무수 디옥산 (3 mL) 중 화합물 1 (1880 mg, 2.597 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 디옥산 중 HCl (3.25 mL, 12.986 mmol, 5.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 용매를 제거하고, 생성물을 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30, 실측치 624.41.
Figure pct00066
무수 메탄올 (10 mL) 중 화합물 1 (500 mg, 4.268 mmol, 1.0 당량) 및 화합물 2 (1.607 g, 5.335 mmol, 1.25 당량)의 용액에 실온에서 트리에틸아민 (1.786 mL, 12.804 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 유지하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 생성물을 콤비플래쉬로 분리하였다. 생성물을 디클로로메탄 중 2-3% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 360.21, 실측치 360.46.
Figure pct00067
무수 DMF (1 mL) 중 화합물 1 (66 mg, 0.183 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (127 mg, 0.192 mmol, 1.05 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.096 mL, 0.550 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (70 mg, 0.220 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (5 mL)으로 켄칭하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 965.49, 실측치 965.69.
Figure pct00068
THF (2 mL) 및 물 (2 mL) 중 화합물 1 (120 mg, 0.124 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (9 mg, 0.373 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 HCl (6.0 N)로 켄칭하고, pH를 4.0으로 조정하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 951.47, 실측치 951.47.
Figure pct00069
디클로로메탄 (1 mL) 중 화합물 1 (115 mg, 0.135 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (1 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 용매를 농축시키고, 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 751.37, 실측치 751.43.
화합물 43p, (S)-3-(2-((S)-2-아미노-5-구아니디노펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00070
무수 DMF (1 mL) 중 화합물 1 (72 mg, 0.151 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (105 mg, 0.159 mmol, 1.05 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.079 mL, 0.588 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (58 mg, 0.182 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (5 mL)으로 켄칭하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1080.55, 실측치 1080.57.
Figure pct00071
THF (2 mL) 및 물 (2 mL) 중 화합물 1 (100 mg, 0.926 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (7 mg, 0.277 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 HCl (6.0 N)로 켄칭하고, pH를 4.0으로 조정하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1066.54, 실측치 1067.01.
Figure pct00072
디클로로메탄 (1 mL) 중 화합물 1 (100 mg, 0.0938 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (1 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 용매를 농축시키고, 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 766.38, 실측치 766.55.
화합물 44p, (S)-3-(2-((S)-2-아세트아미도-5-구아니디노펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00073
무수 메탄올 (10 mL) 중 화합물 1 (500 mg, 2.870 mmol, 1.0 당량) 및 화합물 2 (1.081 g, 3.587 mmol, 1.25 당량)의 용액에 실온에서 트리에틸아민 (1.20 mL, 8.610 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 2시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 생성물을 콤비플래쉬로 분리하였다. 생성물을 디클로로메탄 중 4-6% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 417.23, 실측치 417.45.
Figure pct00074
무수 DMF (1 mL) 중 화합물 1 (66 mg, 0.158 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (109 mg, 0.166 mmol, 1.05 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.083 mL, 0.475 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (61 mg, 0.190 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액 (5 mL)으로 켄칭하고, 수성부를 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 2-4% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1022.51, 실측치 1022.36.
Figure pct00075
THF (2 mL) 및 물 (2 mL) 중 화합물 1 (125 mg, 0.122 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (9 mg, 0.366 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 HCl (6.0 N)로 켄칭하고, pH를 4.0으로 조정하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1008.50, 실측치 1008.79.
Figure pct00076
디클로로메탄 (1 mL) 중 화합물 1 (120 mg, 0.119 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (1 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 용매를 농축시키고, 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 808.39, 실측치 808.33.
화합물 45p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00077
실온에서 N2 (g) 하에 DMF 중 화합물 1 (0.50 g)의 용액에 Cs2CO3 (0.94 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.49 g)를 천천히 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 16% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 오일 (0.35 g, 45.0% 수율)을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 323.19 m/z, 관찰치 328.38 m/z.
Figure pct00078
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.35 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.078 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.32 g, 94.9% 수율)을 수득하였다. 단리가 필요하지 않았다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 309.17 m/z, 관찰치 309.24 m/z.
Figure pct00079
DMF 중 화합물 1 (0.10 g) 및 2 (0.049 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.058 g), 및 이어서 DIPEA (0.079 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 23% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.088 g, 수율 63.6%)을 수득하였다.
Figure pct00080
DCM 중 화합물 1 (0.088 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.22 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 오일 (0.10 g, 수율 113%)을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 814.41 m/z, 관찰치 814.63 m/z.
Figure pct00081
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.10 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0078 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 담황색 고체 (0.104 g, 수율 119%)를 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 800.39 m/z, 관찰치 800.76 m/z.
화합물 46p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-메톡시피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00082
실온에서 N2 (g) 하에 DMF 중 화합물 1 (0.500 g)의 용액에 Cs2CO3 (0.872 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.457 g)를 천천히 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 21% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 오일을 수득하였다. 수율 0.191 g (25.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 339.18 m/z, 관찰치 339.31 m/z.
Figure pct00083
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.191 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0406 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.176 g (96.1%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 325.17 m/z, 관찰치 325.27 m/z.
Figure pct00084
DMF 중 화합물 1 (0.100 g) 및 2 (0.0516 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0584 g), 및 이어서 DIPEA (0.0587 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-75%)의 구배로 정제하고, 생성물은 25% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.108 g (76.7%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 930.45 m/z, 관찰치 930.94 m/z.
Figure pct00085
DCM 중 화합물 1 (0.180 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.3972 g)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율 0.121 g (110%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 830.40 m/z, 관찰치 830.65 m/z.
Figure pct00086
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.121 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0092 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 크림색 백색 고체를 수득하였다. 수율 0.122 g (117%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 816.39 m/z, 관찰치 816.52 m/z.
화합물 47p, (S)-3-(2-((S)-2-아미노-5-우레이도펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00087
DMF 중 화합물 1 (0.144 g) 및 2 (0.0601 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0840 g), 및 이어서 DIPEA (0.114 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-100%)의 구배로 정제하고, 생성물은 47% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율 0.149 g (77.7%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 881.43 m/z, 관찰치 881.61 m/z.
Figure pct00088
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.149 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0122 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 10 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.148 g (100%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 867.42 m/z, 관찰치 867.83 m/z.
Figure pct00089
DCM 중 화합물 1 (0.148 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.392 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다.
혼합물은 이전 단계에서의 불완전한 비누화로 인해 지저분한 것으로 밝혀졌으므로, 혼합물을 염기성 조건 (LiOH, THF/물, 실온)에 1시간 동안 재적용하였다. 완전 전환의 확인 시, 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 ~3의 pH로 산성화시키고, 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM으로 추출한 다음, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율 0.162 g (124%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 767.36 m/z, 관찰치 767.55 m/z.
화합물 48p, (S)-3-(2-((S)-2-아세트아미도-5-우레이도펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00090
DMF 중 화합물 1 (0.183 g) 및 2 (0.0602 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.107 g), 및 이어서 DIPEA (0.145 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 혼합물을 PhMe와 공비혼합하였다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-100%)의 구배로 정제하고, 생성물은 65% B에서 용리되었다. 불순물을 생성물로 용리시켰으므로, 잔류물을 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-80%)의 구배를 통해 재단리하였으며, 여기서 생성물은 0-70% B로부터 용리되었지만; 불순물은 단리될 수 없었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0378 g (16.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 823.39 m/z, 관찰치 823.27 m/z.
Figure pct00091
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0378 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0033)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 10 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 황색 고체를 수득하였다. 단리가 필요한 것으로 밝혀졌다. 혼합물을 DMF 1 mL 중에 용매화시키고, 생성물을 역상 HPLC를 통해 단리시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.088 g (237%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 809.38 m/z, 관찰치 809.68 m/z.
화합물 49p, (S)-3-(2-((S)-2-아미노-5-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00092
DCM 중 화합물 1 (0.620 g)의 용액에 N2(g) 하에 0℃에서 빙수조에서 CBr4 (0.680 g)를 첨가하고; 혼합물을 얼음 상에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, PPh3 (0.538 g)을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반한 후, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 완전 전환이 관찰되었고; 목적하는 pdt, O=PPh3, 및 다른 PPh3-기재 부산물의 깨끗한 혼합물이 관찰되었다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 DCM (3 x 10 mL)으로 추출한 다음, 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-30%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 8.5% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.597 g (81.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 410.11 m/z, 관찰치 410.43 m/z.
Figure pct00093
실온에서 DMF 중 화합물 1 (0.134 g) 및 2 (0.238 g)의 용액에 Cs2CO3 (0.315 g)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 DCM (3 x 15 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 헥산→EtOAc (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 15% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 오일을 수득하였다. 수율: 0.196 g (56.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 538.31 m/z, 관찰치 538.44 m/z.
Figure pct00094
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.196 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.262 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 낮은 전환율로 7시간 후, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 밤새 교반하였다. 완전 전환이 LC-MS에 의해 확인되면, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~5로 천천히 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.186 g (97.1%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 524.29 m/z, 관찰치 524.67 m/z.
Figure pct00095
DMF 중 화합물 1 (0.246 g) 및 2 (0.185 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.1436 g), 및 이어서 DIPEA (0.195 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-60%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 13-26% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 생성물은 목적 생성물 및 모노-Boc-탈보호된 생성물의 혼합물을 함유하는 것으로 보인다. 수율: 0.212 g (50.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1129.57 m/z, 관찰치 1130.02 m/z.
Figure pct00096
DCM 중 화합물 1 (0.0636 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.129 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 6시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 점착성 황색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.0686 g (129%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 829.42 m/z, 관찰치 829.57 m/z.
Figure pct00097
1:1 DMF/물 중 화합물 1 (0.0250 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0019 g)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안, 40℃에서 3-4시간 동안, 및 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 40℃에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~7로 산성화시켰다. 혼합물을 용액 2 mL로 농축시키고, 역상 HPLC를 통해 단리하였다. 이어서, 생성물을 농축시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율 0.0111 g (51.4%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 815.40 m/z, 관찰치 815.98 m/z.
화합물 50p, (S)-3-(2-((S)-2-아세트아미도-5-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)프로판산의 합성
Figure pct00098
DMF 중 화합물 1 (0.0350 g) 및 2 (0.0022 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0143 g), 및 이어서 DIPEA (0.019 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-80%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 47% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.0126 g (39.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 871.43 m/z, 관찰치 872.33 m/z.
Figure pct00099
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0126 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0010 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~4로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 10 mL)으로 추출하고, 물 (3 x 5 mL) 및 염수 (1 x 5 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 꿀색 잔류물을 수득하였다. 단리가 필요하지 않았다. 수율: 0.166 g (134%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 857.41 m/z, 관찰치 857.21 m/z.
화합물 51p, (S)-3-(4-(4-((17-아지도-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데실)카르바모일)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(4-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)부탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00100
DMF 중 화합물 1 (0.0250 g) 및 2 (0.0118 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0141 g), 및 이어서 DIPEA (0.019 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 15 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-80%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 36% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0233 g (65.5%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 971.48 m/z, 관찰치 971.99 m/z.
Figure pct00101
1:1 DMF/물 중 화합물 1 (0.0233 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0017 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~4로 산성화시키고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 및 염수 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 생성물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0281 g (123%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 957.46 m/z, 관찰치 957.86 m/z.
Figure pct00102
DCM 중 화합물 1 (0.0281 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.067 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 2시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.0415 (146%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 857.41 m/z, 관찰치 857.39 m/z.
화합물 52p, (S)-3-(4-(4-(((S)-1-아지도-22-메틸-19-옥소-3,6,9,12,15-펜타옥사-18-아자트리코산-20-일)카르바모일)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(4-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)부탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00103
DMF 중 화합물 1 (0.162 g) 및 2 (0.225 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.270 g), 및 이어서 DIPEA (0.366 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-100%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 100% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.245 g (67.4%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 520.33 m/z, 관찰치 520.61 m/z.
Figure pct00104
DCM 중 화합물 1 (0.245 g)의 용액에 실온에서 TFA (1.08 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, NaHCO3으로 염기 추출하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM으로 추출한 다음, 물 및 염수로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.224 (113%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 420.27 m/z, 관찰치 420.51 m/z.
Figure pct00105
DMF 중 화합물 1 (0.440 g) 및 2 (0.270 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0248 g), 및 이어서 DIPEA (0.034 mL)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 규모로 인해, 반응 혼합물을 농축시킨 다음, EtOAc 중에 재용해시키고, 단리를 위해 실리카 상에서 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-50%)의 구배로 정제하고, 생성물은 18% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0475 g (68.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1084.56 m/z, 관찰치 1085.17 m/z.
Figure pct00106
1:1 DMF/물 중 화합물 1 (0.0475 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0031 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~4로 산성화시키고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 및 염수 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 생성물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0312 g (66.5%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1070.55 m/z, 관찰치 1071.12 m/z.
Figure pct00107
DCM 중 화합물 1 (0.0312 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.067 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. 다음날, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.0545 g (172%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 970.50 m/z, 관찰치 970.38 m/z.
화합물 53p, (S)-3-(4-(4-(((20S,23S)-1-아지도-20-이소부틸-19,22-디옥소-3,6,9,12,15-펜타옥사-18,21-디아자펜타코산-23-일)카르바모일)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(4-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)부탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00108
DMF 중 화합물 1 (0.162 g) 및 2 (0.225 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.270 g), 및 이어서 DIPEA (0.366 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 헥산→EtOAc (0-100%)의 구배로 정제하고, 생성물은 100% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.245 g (67.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 520.33 m/z, 관찰치 520.61 m/z.
Figure pct00109
DCM 중 화합물 1 (0.245 g)의 용액에 실온에서 TFA (1.61 g)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, NaHCO3으로 염기 추출하였다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM으로 추출한 다음, 물 및 염수로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.224 g (113%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 420.27 m/z, 관찰치 420.51 m/z.
Figure pct00110
DMF 중 화합물 1 (0.610 g) 및 2 (0.126 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.116 g), 및 이어서 DIPEA (0.157 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 및 염수 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-45%)의 구배로 정제하고, 생성물은 17% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.110 g (60.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 605.38 m/z, 관찰치 605.52 m/z.
Figure pct00111
DCM 중 화합물 1 (0.110 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.418 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 2시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.148 g (132%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 505.33 m/z, 관찰치 505.67 m/z.
Figure pct00112
DMF 중 화합물 1 (0.0440 g) 및 2 (0.0399 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0248 g), 및 이어서 DIPEA (0.034 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 8 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-50%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 37% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0273 g (36.2%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1169.62 m/z, 관찰치 1170.59 m/z.
Figure pct00113
1:1 DMF/물 중 화합물 1 (0.0273 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0017 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~4로 산성화시키고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 및 염수 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 생성물을 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0286 g (106%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1155.60 m/z, 관찰치 1156.30 m/z.
Figure pct00114
DCM 중 화합물 1 (0.0286 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.0847 g)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. 다음날, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 담오렌지색-황색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0384 g (133%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1055.55 m/z, 관찰치 1056.08 m/z.
화합물 54p, (S)-3-(4-(4-(((S)-1-아지도-19-옥소-21-페닐-3,6,9,12,15-펜타옥사-18-아자헤니코산-20-일)카르바모일)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(4-((4-메틸피리딘-2-일)아미노)부탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00115
DMF 중 화합물 1 (0.140 g) 및 2 (0.170 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.203 g), 및 이어서 DIPEA (0.276 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→20% MeOH/DCM (0-40%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 14% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.261 g (89.5%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 554.31 m/z, 관찰치 554.76 m/z.
Figure pct00116
DCM 중 화합물 1 (0.261 g)의 용액에 실온에서 TFA (1.08 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.317 g (118%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 454.26 m/z, 관찰치 454.31 m/z.
Figure pct00117
DMF 중 화합물 1 (0.0400 g) 및 2 (0.0333 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0226 g), 및 이어서 DIPEA (0.031 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-50%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 30% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0386 g (58.9%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1118.55 m/z, 관찰치 1119.09 m/z.
Figure pct00118
1:1 DMF/물 중 화합물 1 (0.0386 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0025 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~4로 산성화시키고, EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (5 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 및 염수 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 이어서, 생성물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0665 g (174%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1104.53 m/z, 관찰치 1105.05 m/z.
Figure pct00119
DCM 중 화합물 1 (0.0665 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.138 mL)를 첨가하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 주위 조건 하에 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 회백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0911 g (135%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 1004.48 m/z, 관찰치 1005.55 m/z.
화합물 55p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-메틸피리미딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00120
DCM 중 화합물 1 (0.126 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.433 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 2시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.134 g (104%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 567.27 m/z, 관찰치 567.58 m/z.
Figure pct00121
DMF 중 화합물 1 (0.134 g) 및 2 (0.0344 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0757 g), 및 이어서 DIPEA (0.103 mL)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 8 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (1 x 8 mL)으로 추출한 다음, 염수 (1 x 8 mL), 및 이어서 물 (3 x 8 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-40%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 14% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 잔류물을 수득하였다. 수율: 0.0999 g (70.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 724.35 m/z, 관찰치 724.92 m/z.
Figure pct00122
DMF 중 화합물 1 (0.100 g)의 용액에 주위 조건 하에 Cs2CO3 (0.234 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.068 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL) 및 염수 (10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 29% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0993 g (64.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 324.18 m/z, 관찰치 324.41 m/z.
Figure pct00123
DCM 중 화합물 1 (0.0999 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.317 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 5시간 후, TLC를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.1168 g (115%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30 m/z, 관찰치 624.68 m/z.
Figure pct00124
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0993 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0221 g)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 5 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 5 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0876 g (92.2%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 310.17 m/z, 관찰치 310.49 m/z.
Figure pct00125
DMF 중 화합물 1 (0.113 g) 및 2 (0.0472 g)의 용액에 주위 조건 하에 DIPEA (0.080 mL), 및 이어서 TBTU (0.0588 g)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 5 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-70%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 34% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0712 g (51.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 915.45 m/z, 관찰치 915.85 m/z.
Figure pct00126
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0712 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0056 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 4시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 901.44 m/z, 관찰치 901.57 m/z.
Figure pct00127
DCM 중 화합물 1 (0.0640 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.163 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. 다음 날, 목적 생성물을 LC-MS를 통해 관찰하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0707 g (108%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 801.39 m/z, 관찰치 801.47 m/z.
화합물 56p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((6-메틸피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00128
DCM 중 화합물 1 (0.356 g)의 용액에 실온에서 TFA (1.227 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 2시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 짙은 꿀색 오일을 수득하였다. 수율: 0.364 g (100%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 567.27 m/z, 관찰치 567.58 m/z.
Figure pct00129
DMF 중 화합물 1 (0.0961 g)의 용액에 주위 조건 하에 Cs2CO3 (0.226 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.066 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-30%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 19% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0354 g (23.8%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 323.19 m/z, 관찰치 323.10 m/z.
Figure pct00130
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0354 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0079 g)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0625 g (184%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 309.17 m/z, 관찰치 309.42 m/z.
Figure pct00131
DMF 중 화합물 1 (0.364 g) 및 2 (0.0936 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.206 g), 및 이어서 DIPEA (0.279 mL)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL) 및 염수 (15 mL)로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (2 x 5 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 (5 x 8 mL) 및 염수 (1 x 5 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-25%)의 구배로 정제하고, 생성물을 5% B에서 용리시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.243 g (63.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 724.35 m/z, 관찰치 724.66 m/z.
Figure pct00132
DCM 중 화합물 1 (0.244 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.774 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.281 g (113%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30 m/z, 관찰치 624.56 m/z.
Figure pct00133
DMF 중 화합물 1 (0.115 g) 및 2 (0.0625 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0601 g), 및 이어서 DIPEA (0.081 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (2 x 5 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL) 및 염수 (8 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-30%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 20% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0450 g (31.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 914.46 m/z, 관찰치 914.79 m/z.
Figure pct00134
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.450 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0035 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0425 g (95.9%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 900.44 m/z, 관찰치 900.74 m/z.
Figure pct00135
DCM 중 화합물 1 (0.0425 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.108 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켜 담황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0468 g (108%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 800.39 m/z, 관찰치 800.73 m/z.
화합물 57p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((6-메톡시피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00136
DMF 중 화합물 1 (0.1035 g)의 용액에 주위 조건 하에 Cs2CO3 (0.226 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.066 mL)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략 50% 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 15 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-15%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 6% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0438 g (28.0%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 339.18 m/z, 관찰치 339.48 m/z.
Figure pct00137
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0438 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0093 g)를 첨가하였다. TLC에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0485 g (115%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 325.17 m/z, 관찰치 325.35 m/z.
Figure pct00138
DCM 중 화합물 1 (0.244 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.774 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.281 g (113%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30 m/z, 관찰치 624.56 m/z.
Figure pct00139
DMF 중 화합물 1 (0.0850 g) 및 2 (0.0486 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0444 g), 및 이어서 DIPEA (0.060 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (2 x 5 mL), 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL) 및 염수 (8 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-30%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 17% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0518 g (48.3%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 930.45 m/z, 관찰치 930.90 m/z.
Figure pct00140
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0518 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0040 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc, 및 이어서 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0493 g (96.6%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 916.44 m/z, 관찰치 916.95 m/z.
Figure pct00141
DCM 중 화합물 1 (0.0493 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.124 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 주위 조건 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켜 담황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0531 g (수율: 106%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 816.39 m/z, 관찰치 816.66 m/z.
화합물 58p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-클로로피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00142
DCM 중 화합물 1 (0.244 g)의 용액에 실온에서 TFA (1.15 g)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. 1시간 후, LC-MS를 통해 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.281 g (113%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 624.30 m/z, 관찰치 624.56 m/z.
Figure pct00143
DMF 중 화합물 1 (0.300 g)의 용액에 실온에서 Cs2CO3 (0.512 g)을 첨가하였다. 이어서, 화합물 2 (0.269 g)를 천천히 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, LC-MS에 의해 목적 생성물로의 대략적인 완전 전환을 확인하였다. 반응 혼합물을 NaHCO3 (10 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 8 mL)로 추출한 다음, 물 (3 x 8 mL) 및 염수 (8 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 hex→EtOAc (0-60%)의 구배로 정제하고, 여기서 생성물은 7.5% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.311 g (69.2%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 343.13 m/z, 관찰치 343.08 m/z.
Figure pct00144
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.311 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0652 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3으로 산성화시켰다. 생성물을 EtOAc (3 x 8 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.311 g (104%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 329.12 m/z, 관찰치 329.31 m/z.
Figure pct00145
EtOAc 중 화합물 1 (0.0700 g) 및 2 (0.0328 g)의 용액에 주위 조건 하에 TBTU (0.0366 g), 및 이어서 DIPEA (0.066 mL)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 NaHCO3 (8 mL)으로 켄칭하였다. 생성물을 EtOAc (3 x 5 mL) 및 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 5 mL)으로 추출한 다음, 물 (3 x 5 mL) 및 염수 (5 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬®에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM→DCM 중 20% MeOH (0-100%)의 구배로 정제하고, 생성물은 21% B에서 용리되었다. 생성물을 진공 하에 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0790 g (89.1%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 934.40 m/z, 관찰치 935.13 m/z.
Figure pct00146
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.0790 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0061 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3-4로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 투명한 무색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0776 g (99.7%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 920.39 m/z, 관찰치 921.00 m/z.
Figure pct00147
DCM 중 화합물 1 (0.0776 g)의 용액에 실온에서 TFA를 첨가하였다 (1:30 pm). 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0590 g (74.9%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 820.34 m/z, 관찰치 820.99 m/z.
화합물 59p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-((4-플루오로피리딘-2-일)아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00148
1:1 THF/물 중 화합물 1 (0.121 g)의 용액에 정상 분위기 하에 실온에서 LiOH (0.0095 g)를 첨가하였다. LC-MS에 의해 완전 전환이 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH ~3-4로 산성화시켰다. 생성물을 20% CF3CH2OH/DCM (3 x 8 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 크림색 백색 고체를 수득하였다. 수율: 0.0868 g (72.8%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 904.42 m/z, 관찰치 905.07 m/z.
Figure pct00149
DCM 중 화합물 1 (0.868 g)의 용액에 실온에서 TFA (0.220 mL)를 첨가하였다. 반응물을 주위 조건 하에 교반하였다. LC-MS를 통해 완전 전환이 확인될 때까지 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 PhMe와 공비혼합하고, 진공 하에 농축시켰다. 단리가 필요하지 않았다. 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 수율: 0.0380 g (43.1%). LC-MS: 계산치 [M+H]+ 804.37 m/z, 관찰치 804.78 m/z.
화합물 60p, (S)-3-(4-(4-((14-아지도-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)옥시)나프탈렌-1-일)페닐)-3-(2-(5-(피리딘-2-일아미노)펜탄아미도)아세트아미도)프로판산의 합성
Figure pct00150
무수 DMF (2 mL) 중 화합물 1 (211 mg, 1.086 mmol, 1.0 당량), 및 탄산세슘 (530 mg, 1.629 mmol, 1.5 당량)의 용액에 실온에서 화합물 2 (0.187 mL, 1.303 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 72시간 동안 유지하였다. 반응물을 물 (5 mL)로 켄칭하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬®에 의해 헥산 중 10-15% 에틸 아세테이트로 용리시키면서 정제하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 309.17, 실측치 309.42.
Figure pct00151
THF (5 mL) 및 물 (5 mL) 중 화합물 1 (348 mg, 1.128 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (81 mg, 3.385 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 유지하였다. 반응물을 HCl 용액으로 켄칭하고, pH를 3.0으로 조정하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 295.16, 실측치 295.38.
Figure pct00152
무수 DMF (1 mL) 중 화합물 1 (44 mg, 0.149 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (108 mg, 0.164 mmol, 1.1 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.078 mL, 0.448 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (57 mg, 0.179 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 (5 mL)으로 켄칭하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬®에 의해 디클로로메탄 중 3-5% 메탄올로 용리시키면서 정제하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 900.44, 실측치 901.19.
Figure pct00153
THF (3 mL) 및 물 (3 mL) 중 화합물 1 (110 mg, 0.122 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 수산화리튬 (9 mg, 0.366 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 반응물을 HCl 용액으로 켄칭하고, pH를 3.0으로 조정하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 886.43, 실측치 886.97.
Figure pct00154
디클로로메탄 (2 mL) 중 화합물 1 (108 mg, 0.121 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (2 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 용매를 제거하였다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+H]+ 786.37, 실측치 787.05.
실시예 2. RNAi 작용제의 합성 및 접합 반응
αvβ6 인테그린 리간드는 1종 이상의 표적화된 유전자의 발현을 억제하는데 유용한 1종 이상의 RNAi 작용제에 접합될 수 있다. αvβ6 인테그린 리간드는 표적화된 세포 및/또는 조직으로의 RNAi 작용제의 전달을 용이하게 한다. 상기 실시예 1은 본원에 개시된 특정 αvβ6 인테그린 리간드의 합성을 기재하였다. 하기는 본원에 제시된 비제한적 실시예에 예시된 특정 αvβ6 인테그린 리간드-RNAi 작용제 접합체의 합성을 위한 일반적 절차를 기재한다.
A. RNAi 작용제의 합성. RNAi 작용제는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 본원에 제시된 실시예에 예시된 RNAi 작용제의 합성을 위해, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥을 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. 규모에 따라, 머메이드(MerMade)96E® (바이오오토메이션(Bioautomation)), 머메이드12® (바이오오토메이션), 또는 OP 파일럿(OP Pilot) 100 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하였다. 제어된 세공 유리 (CPG, 500 Å 또는 600Å, 프라임 신테시스(Prime Synthesis, 미국 펜실베니아주 아스톤)로부터 입수)로 제조된 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, 미국 위스콘신주 밀워키)으로부터 구입하였다. 구체적으로, 하기 2'-O-메틸 포스포르아미다이트를 사용하였다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유하였다. 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-이노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 글렌 리서치 (버지니아)로부터 구입하였다. 역전된 무염기성 (3'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시리보스-5'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 켐진스(ChemGenes) (미국 매사추세츠주 윌밍톤)로부터 구입하였다. 하기 UNA 포스포르아미다이트를 사용하였다: 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-2',3'-세코-아데노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-아세틸-2',3'-세코-시토신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-이소부티릴-2',3'-세코-구아노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 및 5'-(4,4'-디메톡시-트리틸)-2',3'-세코-우리딘, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트는 또한 상업적으로 구입하였다 (써모피셔).
일부 예에서, 본원에 개시된 αvβ6 인테그린 리간드는 성분을 트리-알킨 기를 포함하는 스캐폴드에 연결시킴으로써 RNAi 작용제에 접합된다. 일부 예에서, 트리-알킨 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단 단부에 부가될 수 있는 트리-알킨-함유 포스포르아미다이트를 사용함으로써 부가된다.
본원의 특정 실시예에 제시된 RNAi 작용제와 관련하여 사용되는 경우에, 트리-알킨-함유 포스포르아미다이트를 무수 디클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시킨 한편, 모든 다른 아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 폴리오르그, 인크.(PolyOrg, Inc., 미국 매사추세츠주 레오민스터)로부터 입수)의 100 mM 용액을 사용하였다.
대안적으로, αvβ6 인테그린 리간드가 트리-알킨 스캐폴드를 통해 RNAi 작용제에 접합되는 경우에, 포스포르아미다이트 접근법을 사용하는 대신에, 트리-알킨-함유 화합물이 합성 후에 도입될 수 있다 (예를 들어, 하기 섹션 E 참조). 본원에 제시된 특정 실시예에 제시된 RNAi 작용제와 관련하여 사용되는 경우에, 합성후에 트리-알킨 기를 센스 가닥의 5' 말단에 부착시키는 경우, 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드는 트리-알킨-함유 스캐폴드에 대한 부착을 용이하게 하기 위해 5' 말단에 1급 아민을 포함하는 뉴클레오티드로 관능화하였다. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 폴리오르그, 인크.(PolyOrg, Inc., 미국 매사추세츠주 레오민스터)로부터 입수)의 100 mM 용액을 사용하였다.
B. 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호. 고체상 합성의 종료 후에, 건조된 고체 지지체를 물 중 40 중량% 메틸아민의 1:1 부피 용액 및 28% 내지 31% 수산화암모늄 용액 (알드리치(Aldrich))으로 1.5시간 동안 30℃에서 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에 재구성하였다 (하기 참조).
C. 정제. 조 올리고머를 TSK겔 슈퍼Q-5PW(TSKgel SuperQ-5PW) 13 μm 칼럼 및 시마즈(Shimadzu) LC-8 시스템을 사용하여 음이온 교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 20 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH 9.0이고, 20% 아세토니트릴을 함유하였고, 완충제 B는 1.5 M 염화나트륨이 첨가되고 완충제 A와 동일하였다. 260 nm에서의 UV 트레이스를 기록하였다. 적절한 분획을 풀링한 다음, 크기 배제 HPLC 상에서 세파덱스(Sephadex) G-25 파인이 패킹된 지이 헬스케어(GE Healthcare) XK 16/40 칼럼을 사용하여 100mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴 또는 여과수의 구동 완충제로 실행하였다.
D. 어닐링. 1x PBS (포스페이트-완충 염수, 1x, 코닝(Corning), 셀그로(Cellgro)) 중 등몰 RNA 용액 (센스 및 안티센스)을 조합함으로써 상보적 가닥들을 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 저장하였다. 듀플렉스 농도는 1x PBS 중 UV-Vis 분광계 상에서 용액 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 이어서 260 nm에서의 용액 흡광도에 전환 인자 및 희석 인자를 곱하여 듀플렉스 농도를 결정하였다. 사용된 전환 인자는 0.037 mg/(mL·cm)이거나, 또는 대안적으로 일부 실험에 대해, 전환 인자는 실험적으로 결정된 흡광 계수로부터 계산되었다.
E. 트리거-리간드 링커의 접합. 하기 화학식을 갖는 DBCO 링커:
Figure pct00155
를 하기 실시예 4-7 각각에 대해 본원에 기재된 αvβ6 리간드를 접합시키는데 사용하였다. 센스 가닥의 5' 말단에서 유리 아민을 연결하는 아미드화 반응을 사용하고, 및 구리 클릭 반응을 사용하여 화학식 40p-60p의 각각의 아지드-함유 리간드를 접합시켰다. 구리 클릭 반응에 대한 예시 조건은 하기 실시예 2G에 제공된다.
활성화된 에스테르, 예컨대 DBCO 링커를 RNAi 작용제의 5' 아민 또는 3' 아민 관능화된 센스 가닥에 접합시키기 위해, 합성 및 어닐링된 RNAi 작용제를 먼저 DMSO 및 10% 물 (v/v%) 중에 25 mg/mL로 용해시켰다. 이어서 50-100 당량의 TEA 및 3 당량의 활성화된 에스테르 링커를 혼합물에 첨가하였다. 용액을 1-2시간 동안 반응하도록 하면서, RP-HPLC-MS (이동상 A 100 mM HFIP, 14 mM TEA; 이동상 B: 아세토니트릴, 엑스브리지 C18 칼럼, 워터스 코포레이션)에 의해 모니터링하였다.
이어서 12 mL 아세토니트릴 및 0.4 mL PBS를 첨가하여 생성물을 침전시키고, 고체를 펠릿으로 원심분리하였다. 이어서 펠릿을 0.4 mL의 1XPBS 및 12 mL의 아세토니트릴 중에 재용해시켰다. 생성된 펠릿을 고진공 하에 1시간 동안 건조시켰다.
F. αvβ6 인테그린 리간드의 접합.
i. 프로파르길 링커. 어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 세자리 알킨 관능화된 센스 가닥을 αvβ6 인테그린 리간드에 접합시킨다. 하기 실시예는 어닐링된 듀플렉스에 대한 αvβ6 인테그린 리간드의 접합을 기재한다: 0.5M 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 0.5M의 Cu(II) 술페이트 5수화물 (Cu(II)SO4·5H2O) 및 아스코르브산나트륨의 2M 용액의 원액을 탈이온수 중에서 제조하였다. DMSO 중 αvβ6 인테그린 리간드의 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 트리-알킨 관능화 듀플렉스 (3 mg, 75 μL, 탈이온수 중 40 mg/mL, ~15,000 g/mol)를 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브에, 25 μL의 1M Hepes pH 8.5 완충제를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, DMSO 35 μL를 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. αvβ6 인테그린 리간드를 반응물에 첨가하고 (6 당량/듀플렉스, 2 당량/알킨, ~15 μL), 용액을 볼텍싱하였다. pH 시험지를 사용하여, pH를 체크하였으며, pH ~8인 것으로 확인하였다. 별도의 1.5 mL 원심분리 튜브에서, 0.5M THPTA 50 μL를 0.5M Cu(II)SO4·5H2O 10uL와 혼합하고, 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후, THPTA/Cu 용액 (7.2 μL, 6 당량 5:1 THPTA:Cu)을 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 그 직후에, 2M 아스코르베이트 (5 μL, 듀플렉스당 50 당량, 알킨당 16.7)를 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 반응물을 비-변성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다.
ii. DBCO 링커. 펠릿을 50/50 DMSO/물 중에 50 mg/mL로 용해시켰다. 이어서 DBCO 링커당 1.5 당량의 리간드를 첨가하였다. 반응을 30-60분 동안 진행되도록 하였다. 반응을 RP-HPLC-MS (이동상 A 100 mM HFIP, 14 mM TEA; 이동상 B: 아세토니트릴, 엑스브리지 C18 칼럼, 워터스 코포레이션)에 의해 모니터링하였다. 12 mL 아세토니트릴, 0.4mL PBS를 첨가하여 생성물을 침전시키고, 고체를 펠릿으로 원심분리하였다. 펠릿을 0.4mL 1XPBS 중에 재용해시킨 다음, 12mL의 아세토니트릴을 첨가하였다. 펠릿을 고진공 하에 건조시켰다.
G. PK/PD 조정제
하기 일부 예에서, αvβ6 인테그린 수용체 표적화 리간드 이외에 약동학적 및/또는 약역학적 (PK/PD) 조정제를 RNAi 작용제에 부착시켰다. 추가의 실시예에서 사용된 PK/PD 조정제의 예를 하기 표에 나타내었다 (PK/PD 조정제는 명시된 상업적 공급업체로부터 구입하였다):
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
PEG95+C22의 합성
Figure pct00162
무수 DMF (3 mL) 중 화합물 1 (60 mg, 0.0419 mmol, 1.0 당량), 화합물 2 (52 mg, 0.0419 mmol, 1.0 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.022 mL, 0.125 mmol, 3.0 당량)의 용액에 실온에서 TBTU (16 mg, 0.0503 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬(CombiFlash)®에 의해 정제하고, 디클로로메탄 중 6-8% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+4H]+/4 656.66, 실측치 656.17. 수율: 0.063 g (57.3%)
Figure pct00163
무수 1,4-디옥산 (0.5 mL) 중 화합물 1 (60 mg, 0.0229 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 디옥산 중 HCl 용액 (0.286 mL, 1.143 mmol, 50 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 유지하고, 용매를 농축시켰다. 생성물을 추가 정제 없이 직접 사용하였다. LC-MS: 계산치 [M+3H]+/3 841.88, 실측치 841.48, 계산치 [M+4H]+/4 631.66, 실측치 632.41.
Figure pct00164
무수 DMF (2 mL) 중 화합물 1 (55 mg, 0.0214 mmol, 1.0 당량) 및 화합물 2 (54.7 mg, 0.0214 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 트리에틸아민 (0.009 mL, 0.0641 mmol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 유지하고, 용매를 농축시켰다. 생성물을 콤비플래쉬에 의해 분리하고, 디클로로메탄 중 15-20% 메탄올로 용리시켰다. LC-MS: 계산치 [M+5H]+/5 986.80, 실측치 987.19, 계산치 [M+6H]+/6 822.50, 실측치 822.64.
H. PK/PD 조정제의 접합. 어닐링 전 또는 후 및 하나 이상의 표적화 리간드의 접합 전 또는 후에, 하나 이상의 PK 인핸서가 RNAi 작용제에 연결될 수 있다. 하기는 PK 인핸서를 본원에 도시된 실시예에 제시된 구축물에 연결하는데 사용되는 일반적 접합 과정을 기재한다. 하기는 디술피드의 디티오트레이톨 환원에 이어서 각각의 PK 인핸서의 티올-마이클 첨가를 수행함으로써, RNAi 작용제의 (C6-SS-C6) 또는 (6-SS-6) 관능화된 센스 가닥에 말레이미드-관능화된 PK 인핸서를 연결하는데 사용되는 일반적 과정을 기재한다: 관능화된 센스 가닥을 함유하는 바이알에서 0.1M Hepes pH 8.5 완충제 중에 75mg/mL로 용해시키고, 25 당량의 디티오트레이톨을 첨가하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:40 비)의 용매계에 3회 침전시키고, 건조시켰다. 이어서 DMSO 중 말레이미드 관능화된 PK 인핸서의 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 디술피드-환원된 (즉, 3' C6-SH, 5' HS-C6, 또는 3' 6-SH 관능화된) 센스 가닥을 탈이온수 중에 100mg/mL로 용해시키고, 3 당량의 말레이미드-관능화된 PK 인핸서를 첨가하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 1시간-3시간 내에 완결됨), 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:40 비)의 용매계에 침전시키고, 건조시켰다.
I. αvβ6 펩티드 1의 합성
Figure pct00165
상기 기재된 바와 같이 Fmoc-Peg5-CO2H 사전로딩된 2-Cl-Trt 수지 (0.79 mmol/g)를 이용하여 4.1 mmol 규모로 CS 바이오 펩티드 합성기(CS Bio peptide synthesizer) 상에서 일반적 Fmoc 펩티드 화학을 사용하여 수득한 Arg-Gly-Asp(tBu)-Leu-Ala-Abu-Leu-Cit-Aib-Leu-Peg5-CO2-2-Cl-Trt 수지 1의 변형에 의해 펩티드 1을 제조하였다. 수지로부터의 절단 후, 펩티드 6-2를 테트라플루오로페닐 에스테르 6-3으로 전환시키고, 조 생성물을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
조 펩티드 6-3을 탈보호 칵테일 TFA/TIS/H2O= 90:5:5 (80 mL)로 1.5시간 동안 처리하여 최종 탈보호를 수행하였다. 반응 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (700 mL)에 적가하고, 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하였다. 펠릿을 추가의 메틸 tert-부틸 에테르 (500 mL)로 세척하였다. 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 250 x 50 mm, 10 마이크로미터, 60 mL/분, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 30-45% ACN 구배, 실행당 조 물질 대략 1 그램)에 의해 정제하여 순수한 펩티드 6-4 4.25 g을 수득하였다.
J. αvβ6 펩티드 1의 접합
하기 절차를 사용하여 활성화된 에스테르-관능화된 표적화 리간드, 예컨대 αvβ6 펩티드 1을 상기 표 A에 제시된 바와 같은 아민, 예컨대 C6-NH2, NH2-C6 또는 (NH2-C6)s를 포함하는 아민 관능화된 RNAi 작용제에 접합시킬 수 있다.
어닐링되고 동결건조된 RNAi 작용제를 DMSO 및 10% 물 (v/v%) 중에 25 mg/mL로 용해시켰다. 이어서 50-100 당량 TEA 및 3 당량의 활성화된 에스테르 표적화 리간드를 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 1-2시간 동안 교반되도록 하면서 RP-HPLC-MS (이동상 A: 100 mM HFIP, 14 mM TEA; 이동상 B: 아세토니트릴; 칼럼: 엑스브리지 C18)에 의해 모니터링하였다. 반응이 완결된 후, 아세토니트릴 12 mL에 이어서 PBS 0.4 mL를 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리하였다. 고체 펠릿을 수집하고, 1xPBS 0.4 mL 중에 용해시킨 다음, 아세토니트릴 12 mL를 첨가하였다. 생성된 펠릿을 수집하고, 고진공 하에 1시간 동안 건조시켰다.
실시예 3. 마우스에서 αvβ6 인테그린 리간드에 접합된 미오스타틴 표적화 RNAi 작용제의 생체내 정맥내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 미오스타틴 유전자에 적어도 부분적으로 상보적인 핵염기 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함하였다. 미오스타틴 RNAi 작용제는 서열 특이적 방식으로 미오스타틴의 메신저 RNA (mRNA) 전사체를 분해하거나 그의 번역을 억제함으로써 미오스타틴 유전자의 발현을 억제할 수 있도록 설계되었다. 본 실시예에서 사용된 RNAi 작용제 (AD06326)는 변형된 뉴클레오티드 및 1개 초과의 비-포스포디에스테르 연결로 구성되었고, 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하였다:
센스 가닥 서열 (5' → 3'):
(NH2-C6)s(invAb)sggccaugaUfCfUfugcuguaacas(invAb)(C6-SS-C6)dT (서열식별번호: 1)
안티센스 가닥 서열 (5' → 3')
usGfsusUfaCfagcaaGfaUfcAfuGfgCfsc (서열식별번호: 2),
여기서 (invAb)는 역전된 (3'-3' 연결된) 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 및 우리딘을 나타내고; (C6-SS-C6)는 직쇄 헥실 디티올을 나타내고 (표 A 참조), (NH2-C6)는 목적하는 바와 같은 표적화 리간드 접합을 용이하게 하는 C6 말단 아민을 나타낸다 (예를 들어, 표 A 참조).
관련 기술분야의 통상의 기술자가 명백하게 이해할 바와 같이, 뉴클레오티드 단량체는 본원에 개시된 변형된 뉴클레오티드 서열에 제시된 바와 같은 포스포로티오에이트 연결의 포함이 올리고뉴클레오티드에 전형적으로 존재하는 포스포디에스테르 연결을 대체하는 경우를 제외하고는 표준 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된다.
하기 실시예에서, 다양한 RNAi 작용제가 αvβ6 인테그린을 통한 관심 세포로의 화물 분자의 전달을 시험하기 위한 화물 분자로서 사용된다.
연구 제1일에, 암컷 C57BL6 마우스에게 하기 투여 군에 따라 200 마이크로리터를 정맥내 ("IV") 투여를 통해 투여하였다:
표 1. 실시예 3에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00166
미오스타틴 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였으며, 이는 DBCO 링커에 대한 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. RNAi 작용제를 또한 3' 말단 단부에 (C6-SS-C6)dT를 갖도록 합성하였으며, 이를 사용하여 40K PEG (2x2 아암) PK/PD 조정제를 접합시켰다. 이어서 각각의 αvβ6 인테그린 리간드를 상기 실시예 2G.ii.에 기재된 바와 같이 DBCO 클릭 반응을 통해 RNAi 작용제에 접합시켰다. 실시예 4의 RNAi 작용제-αvβ6 인테그린 리간드 접합체의 경우에, RNAi 작용제 뿐만 아니라 링커 구조는 각각의 군 2-10에 대해 동일하였다. 따라서, 군 2 내지 10에 대한 유일한 변수는 사용된 구체적인 αvβ6 인테그린 리간드였다.
각각의 군에서 4마리의 마우스에 투여하였다 (n=4). 마우스를 약물 투여 전 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 채혈하고, 혈청을 단리하였다. 혈청 샘플에 대해 ELISA 검정을 수행하여 혈청 중 마우스 미오스타틴의 양을 결정하였다. 혈청 샘플 중 평균 미오스타틴은 하기 표 2에 제시된다.
표 2. 실시예 3에서의 제8일, 제15일 및 제22일의 평균 상대 미오스타틴 mRNA 발현.
Figure pct00167
상기 표 2에 제시된 바와 같이, 다수의 미오스타틴 RNAi 작용제가 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 4. 마우스에서 αvβ6 인테그린 리간드에 접합된 미오스타틴 표적화 RNAi 작용제의 생체내 정맥내 투여.
연구 제1일에, 암컷 C57BL6 마우스에게 하기 투여 군에 따라 200 마이크로리터를 정맥내 ("IV") 투여를 통해 투여하였다:
표 3. 실시예 4에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00168
미오스타틴 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였으며, 이는 DBCO 링커에 대한 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. RNAi 작용제를 또한 3' 말단 단부에 (C6-SS-C6)dT를 갖도록 합성하였으며, 이를 사용하여 40K PEG (XY-4 아암) PK/PD 조정제를 접합시켰다. 이어서 각각의 αvβ6 인테그린 리간드를 실시예 2G에 기재된 바와 같이 구리 클릭 반응을 통해 RNAi 작용제에 접합시켰다. 실시예 4의 RNAi 작용제-αvβ6 인테그린 리간드 접합체의 경우에, RNAi 작용제 뿐만 아니라 링커 구조는 각각의 군 2-10에 대해 동일하였다. 따라서, 군 2 내지 10에 대한 유일한 변수는 사용된 구체적인 αvβ6 인테그린 리간드였다.
각각의 군에서 4마리의 마우스에 투여하였다 (n=4). 마우스를 약물 투여 전 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 채혈하고, 혈청을 단리하였다. 혈청 샘플 상에서 ELISA 검정을 수행하여 혈청 중 마우스 미오스타틴의 양을 결정하였다. 혈청 샘플 중 평균 미오스타틴은 하기 표 6에 제시된다.
표 4 실시예 4에서의 제8일, 제15일 및 제22일의 평균 상대 미오스타틴 mRNA 발현.
Figure pct00169
상기 표 4에 제시된 바와 같이, 다수의 미오스타틴 RNAi 작용제가 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 5. 마우스에서 αvβ6 인테그린 리간드에 접합된 미오스타틴 표적화 RNAi 작용제의 생체내 정맥내 투여.
연구 제1일에, 암컷 C57BL6 마우스에게 하기 투여 군에 따라 200 마이크로리터를 정맥내 ("IV") 투여를 통해 투여하였다:
표 5. 실시예 5에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00170
군 3에서 사용된 바와 같은 화합물 6.1에 대한 구조는
Figure pct00171
이고, 이는 본원에 기재된 바와 유사한 방법을 사용하여 RNAi 작용제에 접합되었다.
미오스타틴 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였으며, 이는 DBCO 링커에 대한 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. RNAi 작용제를 또한 3' 말단 단부에 (C6-SS-C6)dT를 갖도록 합성하였으며, 이를 사용하여 40K PEG (4-아암) PK/PD 조정제 또는 PEG95+C22 PK/PD 조정제를 접합시켰다. 이어서 각각의 αvβ6 인테그린 리간드를 실시예 2G에 기재된 바와 같이 구리 클릭 반응을 통해 RNAi 작용제에 접합시켰다.
각각의 군에서 4마리의 마우스에 투여하였다 (n=4). 마우스를 약물 투여 전 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 채혈하고, 혈청을 단리하였다. 혈청 샘플에 대해 ELISA 검정을 수행하여 혈청 중 마우스 미오스타틴의 양을 결정하였다. 혈청 샘플 중 평균 미오스타틴은 하기 표 6에 제시된다.
표 6. 실시예 5에서의 제8일, 제15일 및 제22일의 평균 상대 미오스타틴 mRNA 발현.
Figure pct00172
상기 표 6에 제시된 바와 같이, 다수의 미오스타틴 RNAi 작용제가 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 6. 마우스에서 αvβ6 인테그린 리간드에 접합된 미오스타틴 표적화 RNAi 작용제의 생체내 정맥내 투여.
연구 제1일에, 암컷 C57BL6 마우스에게 하기 투여 군에 따라 200 마이크로리터를 정맥내 ("IV") 투여를 통해 투여하였다:
표 7. 실시예 6에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00173
미오스타틴 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였으며, 이는 DBCO 링커에 대한 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. RNAi 작용제를 또한 3' 말단 단부에 (C6-SS-C6)dT를 갖도록 합성하였으며, 이를 사용하여 40K PEG (4-아암) PK/PD 조정제를 접합시켰다. 이어서 각각의 αvβ6 인테그린 리간드를 실시예 2G에 기재된 바와 같이 구리 클릭 반응을 통해 RNAi 작용제에 접합시켰다. 실시예 4의 RNAi 작용제-αvβ6 인테그린 리간드 접합체의 경우에, RNAi 작용제 뿐만 아니라 링커 구조는 각각의 군 2 및 6-10에 대해 동일하였다.
각각의 군에서 4마리의 마우스에 투여하였다 (n=4). 마우스를 약물 투여 전 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 채혈하고, 혈청을 단리하였다. 혈청 샘플에 대해 ELISA 검정을 수행하여 혈청 중 마우스 미오스타틴의 양을 결정하였다. 혈청 샘플 중 평균 미오스타틴은 하기 표 8에 제시된다.
표 8. 실시예 6에서의 제8일, 제15일 및 제22일의 평균 상대 미오스타틴 mRNA 발현.
Figure pct00174
상기 표 8에 제시된 바와 같이, 다수의 미오스타틴 RNAi 작용제가 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Arrowhead Pharmaceuticals Inc. <120> INTEGRIN TARGETING LIGANDS AND USES THEREOF <130> 30695-WO <150> 63/077,245 <151> 2020-09-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD06326 Antisense Strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> phosphorothioate linked nucleoside <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (7)..(11) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> phosphorothioate linked nucleoside <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <400> 1 uguuacagca agaucauggc c 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD06326 Sense Strand <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> inverted abasic deoxyribose residue <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 5' end (NH2-C6) modification with phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linked nucleoside <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> modified_base <222> (2)..(9) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (10)..(12) <223> 2'-fluoro corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (13)..(21) <223> 2'-O-methyl corresponding nucleoside <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> phosphorothioate linked nucleoside <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> inverted abasic deoxyribose residue <220> <221> modified_base <222> (23)..(24) <223> C6-SS-C6 linked nucleoside <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-deoxythymidine-3'-phosphate <400> 2 nggccaugau cuugcuguaa cant 24

Claims (38)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00175

    여기서
    R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
    Figure pct00176
    이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 화물 분자이거나, 또는 R1은 화물 분자이고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 화물 분자이고;
    R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 화물 분자로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    X는 O, CR8R9, NR8이고;
    여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함하고;
    여기서 Q가 임의로 치환된 알킬이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
    Figure pct00177
    이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia의 화합물인 화합물:
    Figure pct00178

    여기서 R18은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, -NR19R20으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R19 및 R20은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ib의 화합물인 화합물:
    Figure pct00179
    .
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ic의 화합물인 화합물:
    Figure pct00180
    .
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Id의 화합물인 화합물:
    Figure pct00181

    여기서 R18은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, -NR19R20으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R19 및 R20은 각각 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Q가
    Figure pct00182
    이고, 여기서 R13은 H, OH, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 및 임의로 치환된 아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, Q가
    Figure pct00183
    인 화합물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Q가
    Figure pct00184
    이고, 여기서 R15 및 R16은 각각 독립적으로 H,
    Figure pct00185
    이고, 여기서 R17은 임의로 치환된 알킬 또는 임의로 치환된 알킬이고; n은 1 내지 10의 정수인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, n이 4인 화합물.
  10. 제8항에 있어서, Q가
    Figure pct00186
    인 화합물.
  11. 제8항에 있어서, Q가
    Figure pct00187
    인 화합물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, n이 4인 화합물.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Q가 C1-C10 알킬렌인 화합물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Q가 -(CH2)4-인 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 화물 분자를 포함하는 것인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, R1이 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 단위를 포함하는 것인 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 H인 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R6 및 R7이 둘 다 H인 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R3, R4 및 R5가 모두 H인 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 1 내지 10개의 PEG 단위를 포함하는 것인 화합물.
  21. 제20항에 있어서, R1이 5개의 PEG 단위를 포함하는 것인 화합물.
  22. 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00188

    Figure pct00189

    Figure pct00190

    Figure pct00191

    Figure pct00192

    여기서
    Figure pct00193
    은 화물 분자에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  23. 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00194

    Figure pct00195

    Figure pct00196

    Figure pct00197

    Figure pct00198

    여기서
    Figure pct00199
    은 화물 분자에 대한 연결 지점을 나타낸다.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 화물 분자가 RNAi 작용제를 포함하는 것인 화합물.
  25. 제23항에 있어서, RNAi 작용제가 이중 가닥인 화합물.
  26. 제24항에 있어서, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 단부에 결합되는 화합물.
  27. 하기 화학식 Ip의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00200

    여기서
    R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
    Figure pct00201
    이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 연결 모이어티이거나, 또는 R1은 연결 모이어티이고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 모이어티이고;
    R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 연결 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    X는 O, CR8R9, NR8이고;
    여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 연결 모이어티를 포함하고;
    여기서 Q가 임의로 치환된 알킬이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
    Figure pct00202
    이다.
  28. 제27항에 있어서, 연결 모이어티가 아지드, 에스테르, 카르바메이트, 알켄, 알콜, 아민, 아미드, 카르보네이트 및 알킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기를 포함하는 것인 화합물.
  29. 제27항에 있어서, 연결 모이어티가 아지드를 포함하는 것인 화합물.
  30. 하기 화학식을 갖는 화합물 또는 그의 허용되는 염:
    Figure pct00203

    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

    Figure pct00207
    .
  31. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법이며:
    Figure pct00208

    여기서
    R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
    Figure pct00209
    이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 화물 분자이거나, 또는 R1은 화물 분자이고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 화물 분자이고;
    R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 화물 분자로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    X는 O, CR8R9, NR8이고;
    여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함하고;
    여기서 Q는 임의로 치환된 알킬이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
    Figure pct00210
    이고,
    하기 화학식 Ip의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 반응성 모이어티를 포함하는 화물 분자와 반응시키는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00211

    여기서
    R1은 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 또는
    Figure pct00212
    이고, 여기서 R11 및 R12는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬 또는 연결 모이어티이거나, 또는 R1은 연결 모이어티이고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬, 또는 연결 모이어티이고;
    R3은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R5는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R6은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알콕시, 할로, 임의로 치환된 아미노, 또는 연결 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Q는 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    X는 O, CR8R9, NR8이고;
    여기서 R8은 H, 임의로 치환된 알킬로부터 선택되거나, 또는 R8은 Rx 또는 Ry와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-원 고리를 형성하고, R9는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 H, 임의로 치환된 알킬, 화물 분자이거나, 또는 Rx 및 Ry는 함께 R10과 이중 결합을 형성할 수 있고, 여기서 R10은 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R10은 X 및 그가 부착되어 있는 원자와 함께 4-, 5-, 6-, 7-, 8, 또는 9-원 고리를 형성할 수 있고;
    여기서 R1, R2, R6, R11, R12, Rx 및 Ry 중 적어도 1개는 연결 모이어티를 포함하고;
    여기서 Q가 임의로 치환된 알킬이고 Q에 의해 나타내어진 임의로 치환된 알킬 쇄의 길이가 3개의 탄소인 경우에, R1은
    Figure pct00213
    임.
  32. 제31항에 있어서, 화물 분자가 RNAi 작용제인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 연결 모이어티가 아지드를 포함하고, 반응성 모이어티가 알킨인 방법.
  34. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 화물 분자가 골격근 세포에 위치하는 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제인 조성물.
  36. 제35항에 있어서, RNAi 작용제가 미오스타틴 mRNA에 상보적인 것인 조성물.
  37. 골격근 세포에서 유전자 발현을 녹다운시킴으로써 치료 또는 호전될 수 있는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 질환 또는 장애가 근육 이영양증인 방법.
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