BR112019018469A2 - composição de biomarcador para medir envelhecimento de pele, kit para medir o envelhecimento de pele, método para triar um agente de amenização de envelhecimento de pele, composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, composição cosmética para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, composição cosmética para amenizar rugas, alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele e alimento funcional de saúde para amenizar rugas - Google Patents

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Abstract

a presente revelação se refere à proteína hapln1 de um indivíduo envelhecido. a proteína hapln1 tem expressão reduzida durante o envelhecimento e tem um efeito excelente de amenizar e reverter o envelhecimento de pele, incluindo rugas, quando administrada. portanto, usando-se a diferença na expressão, são fornecidos: uma composição de biomarcador para medir o envelhecimento de pele, com capacidade para diagnosticar o envelhecimento de pele; um kit; e um método para triar os agentes de amenização de envelhecimento de pele que compreende uma etapa de detectar o nível de expressão de uma proteína hapln1 ou um gene hapln1. além disso, são fornecidos uma composição farmacêutica de prevenção ou amenização de envelhecimento de pele, composição cosmética, ou alimento funcional de saúde, e uma composição cosmética de amenização de rugas ou alimento funcional de saúde, todos os quais contêm quaisquer um ou mais selecionados dentre o grupo que consiste em uma proteína hapln1, um gene que codifica a mesma e um agente eficaz para promover a expressão da proteína ou gene hapln1 ou ativar as funções dos mesmos.

Description

COMPOSIÇÃO DE BIOMARCADOR PARA MEDIR ENVELHECIMENTO DE PELE, KIT PARA MEDIR O ENVELHECIMENTO DE PELE, MÉTODO PARA TRIAR UM AGENTE DE AMENIZAÇÃO DE ENVELHECIMENTO DE PELE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA PREVENIR OU AMENIZAR O ENVELHECIMENTO DE PELE, COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA PREVENIR OU AMENIZAR O ENVELHECIMENTO DE PELE, COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA AMENIZAR RUGAS, ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE PARA PREVENIR OU AMENIZAR O ENVELHECIMENTO DE PELE E ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE PARA AMENIZAR RUGAS
Campo da Técnica [001] A presente revelação refere-se a uma composição de biomarcador para medir o envelhecimento de pele com o uso de proteína de ligação de hialuronano e proteoglicano 1 (HAPLN1), e uma composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, composição cosmética, ou alimento funcional de saúde.
Antecedentes da Técnica [002] Um dos sintomas mais óbvios de envelhecimento de pele é uma diminuição na matriz extracelular dérmica, o que causa rugas. Uma matriz extracelular da camada dérmica inclui várias proteínas, como colágeno, elastina e glicoproteína, como componentes principais. Entre estas proteínas, o colágeno é responsável por mais do que 90% e cerca de 90% do colágeno é colágeno do tipo I. Cerca de 70% da redução na quantidade de colágeno do tipo I causada por envelhecimento foram identificados na matriz extracelular dérmica.
[003] Ácido hialurônico, o qual é um polissacarídeo que consiste em açúcares de amino e ácido urônico é distribuído em todos os tecidos do corpo vivo e
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2/24 cerca de 50% da quantidade total no corpo são distribuídos na pele. Ácido hialurônico pode ligar até 1.000 vezes sua massa em água e carrega a matriz extracelular de tecido dérmico. Além disso, o ácido hialurônico pode formar agregados de várias glicoproteinas e proteoglicanos para armazenar ou preservar vários fatores de crescimento nos mesmos. De acordo com resultados de teste clinico, o ácido hialurônico aumenta a proliferação de fibroblastos dérmicos, produção de colágeno, e secreção de fatores de crescimento, e sabe-se que os niveis de ácido hialurônico diminuem por mais do que 40% com a idade.
[004] O envelhecimento de pele ocorre de duas maneiras: envelhecimento intrínseco e envelhecimento extrinseco. O envelhecimento de pele extrinseco é principalmente causado por fatores ambientais externos, como luz ultravioleta (UV) e tabagismo, e o envelhecimento intrínseco de pele está associado à idade. Embora em presentes vários métodos, por exemplo, o uso de cosméticos de bloqueio UV tenha sido relatado para prevenir o envelhecimento extrinseco de pele, os métodos para prevenir o envelhecimento intrínseco ainda não foram desenvolvidos. Portanto, os esforços para prevenir ou amenizar o envelhecimento intrínseco de pele são necessários.
Descrição de Modalidades
Problema da Técnica [005] É fornecida uma composição de biomarcador para medir o envelhecimento de pele.
[006] É fornecido um kit para medir o envelhecimento de pele.
[007] É fornecido um método para triar um
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3/24 agente de amenização de envelhecimento de pele.
[008] É fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele.
[009] É fornecida uma composição cosmética para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele ou uma composição cosmética para amenizar rugas.
[0010] É fornecido um alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele ou um alimento funcional de saúde para amenizar rugas.
Solução para o Problema [0011] De acordo com um aspecto da presente revelação, uma composição de biomarcador para medir o envelhecimento de pele, a composição de biomarcador que inclui um agente para detectar proteína de ligação de hialuronano e proteoglicano 1 (HAPLN1) ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica é fornecido.
[0012] Adicionalmente, de acordo com outro aspecto da presente revelação, um kit para medir o envelhecimento de pele, em que o kit inclui um agente para detectar a proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica é fornecido.
[0013] Adicionalmente, de acordo com outro aspecto da presente revelação, um método para triar um agente de amenização de envelhecimento de pele, em que o método inclui: incubar uma amostra biológica com um composto; detectar um nível de expressão de proteína HAPLN1 ou gene da amostra biológica; e comparar o nível de expressão com um nível de expressão da mesma proteína ou gene em um controle normal não incubado com o composto é fornecido.
[0014] Adicionalmente, de acordo com outro
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4/24 aspecto da presente revelação, uma composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, a composição farmacêutica inclui pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em proteína HAPLN1, um gene que codifica a proteína HAPLN1, e um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína ou gene HAPLN1, como um ingrediente ativo, é fornecido.
[0015] Adicionalmente, de acordo com outro aspecto da presente revelação, uma composição cosmética para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele ou uma composição cosmética para amenizar rugas, cada um incluindo proteína HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína HAPLN1, como um ingrediente ativo, é fornecido.
[0016] Adicionalmente, de acordo com outro aspecto da presente revelação, um alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele ou um alimento funcional de saúde para amenizar rugas, cada um incluindo proteína HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína HAPLN1, como um ingrediente ativo, é fornecido.
[0017] A composição farmacêutica, a composição cosmética, ou o alimento funcional de saúde podem incluir adicionalmente ácido hialurônico.
Efeitos Vantajosos da Revelação [0018] De acordo com a presente revelação, a proteína HAPLN1 tem expressão reduzida em um indivíduo envelhecido e tem um efeito excelente de amenizar e reverter o envelhecimento de pele incluindo rugas quando administrados. Portanto, a presente revelação pode fornecer
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5/24 de modo eficaz uma composição de biomarcador e um kit para medir o envelhecimento de pele, cada um com capacidade para diagnosticar o envelhecimento de pele e incluir um agente que detecta proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1, um método para triar um agente que previne ou ameniza o envelhecimento de pele, em que o método inclui detectar um nível de expressão de proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1, uma composição farmacêutica, composição cosmética, ou alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, e uma composição cosmética ou alimento funcional de saúde para amenizar rugas.
Breve Descrição de Desenhos [0019] As Figuras IA e 1B mostram os resultados de identificar a produção de colágeno em um par probiótico heterocrônico de um camundongo velho O e um camundongo jovem Y.
[0020] As Figuras 2A e 2B mostram os resultados para identificar níveis de ácido hialurônico (HA) do respectivo camundongo velho (YO-O) e do respectivo camundongo jovem (YO-Y) em um par parabiótico heterocrônico de um camundongo velho O e um camundongo jovem Y; nível de HA de camundongo jovem (YY-Y) em um par parabiótico heterocrônico de um camundongo jovem Y e um camundongo jovem Y; e nível de HA de camundongo velho (OO-O) em um par parabiótico heterocrônico de um camundongo velho 0 e um camundongo velho 0.
[0021] A Figura 3 mostra resultados que
confirmam que um fator intrínseco relacionado ao
envelhecimento de pele é HAPLN1 •
[0022] As Figuras 4Ά e 4B most ram os resultados
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6/24 de quantidades de comparação de mRNA de pró-colágeno e distribuições de pró-colágeno entre peles de camundongos velhos e camundongos jovens.
[0023] As Figuras 5A e 5B mostram resultados de concentrações e distribuições de comparação de ácido hialurônico entre peles de camundongos velhos e camundongos jovens.
[0024] As Figuras 6A e 6B mostram resultados de concentrações de comparação e distribuições de HAPLN1 entre peles de camundongos velhos e camundongos jovens.
[0025] As Figuras 7A e 7B mostram resultados de identificar aumentos em colágeno em camundongos velhos por administração de HAPLN1.
[0026] As Figuras 8A e 8B mostram resultados de identificar aumentos em ácido hialurônico em camundongos velhos por administração de HAPLN1.
[0027] A Figura 9 mostra resultados de
identificar aumentos em colágeno induzido por TGF-β em
células de fibroblasto dérmico humano normal (NHDF) por
tratamento HAPLN1.
[0028] As Figuras 10A a 10C mostram resultados de identificar aumentos de niveis de expressão de proteina de receptor II de TGF-β em vias de sinalização de sintese de colágeno em células de NHDF por tratamento de HAPLN1.
[0029] A Figura 11 mostra resultados para identificar um aumento em estabilidade de receptor II de TGFβ em células de NHDF por tratamento de HAPLN1.
[0030] A Figura 12 mostra resultados de identificar um aumento no nivel de expressão de proteina ácido hialurônico sintase 2 (HAS2) induzida por TGF-β em
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7/24 células de NHDF por tratamento de HAPLN1.
Melhor Modo [0031]
Os presentes inventores constataram que os níveis de expressão de proteína de ligação de hialuronano e proteoglicano 1 (HAPLN1) diminuem nos camundongos velhos comparando-se os níveis de expressão de proteína entre camundongos velhos e camundongos jovens, assim completando a presente invenção. HAPLN1 é uma proteína que estabiliza ácido hialurônico ligando-se ácido hialurônico a proteoglicano e efeitos de HAPLN1 na amenização de envelhecimento de pele não foram relatados.
[0032]
A presente revelação fornece uma composição de biomarcador para medir o envelhecimento de pele, a composição de biomarcador incluindo um agente para detectar proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica.
[0033]
A proteína HAPLN1 pode ser HAPLN1 de camundongo (acesso NCBI: NP_038528.3, Gene ID:12950) ou
HAPLN1 humana (acesso NCBI: AAH57808.1, Gene ID: 1404), sem limitação a isso.
[0034]
O agente pode incluir mas sem limitação pelo menos um selecionado dentre um anticorpo, um RNA antissenso, um aptâmero, e um composto.
[0035]
O envelhecimento de pele pode incluir rugas causadas por uma diminuição em matriz extracelular dérmica da pele.
[0036]
A presente revelação também fornece um kit para medir o envelhecimento de pele, em que o kit inclui um agente para detectar proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica.
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8/24 [0037] O agente pode incluir, mas sem limitação, pelo menos um selecionado dentre um anticorpo, um RNA antissenso, um aptâmero, e um composto.
[0038] 0 anticorpo é um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal.
[0039] 0 anticorpo policlonal pode ser preparado injetando-se uma proteína expressada pelo gene ou um fragmento da mesma em um hospedeiro como um imunógeno de acordo com qualquer método conhecido na técnica. 0 hospedeiro pode incluir um mamífero, como um camundongo, um rato, um carneiro, ou um coelho. 0 imunógeno é injetado de modo intramuscular, intraperitoneal ou subcutâneo e usualmente administrado com um adjuvante para melhorar a antigenicidade. 0 soro pode ser periodicamente coletado do hospedeiro para obter soro que tem título aumentado e especificidade de antígeno e purificar um anticorpo a partir do mesmo.
[0040] O anticorpo monoclonal pode ser preparado por uma técnica para produzir linhagens celulares imortalizadas por meio de fusão bem conhecida na técnica. Por exemplo, um camundongo pode ser imunizado por uma proteína expressada pelo gene ou peptídeo sintético conjugado com albumina de soro bovino. Os linfócitos de produção de antígeno B isolados de um camundongo são fundidos com células de mieloma humano ou de camundongo para preparar células de hibridoma imortalizadas. A produção de um anticorpo monoclonal é identificada analisando-se as células de hibridoma com o uso de ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) indireto. Um clone positivo pode ser selecionado e cultivado e um anticorpo pode ser isolado do mesmo e purificado. Alternativamente, o clone positivo pode
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9/24 ser injetado de modo intraperitoneal em ratos e ascites pode ser obtido a partir do mesmo para obter um anticorpo monoclonal.
[0041] Em geral, o anticorpo monoclonal pode ser quantitativamente analisado por reação de cor com o uso de um anticorpo secundário conjugado com uma enzima, como alcalina fosfatase (AP) ou peroxidase de rábano silvestre (HRP) e um substrato do mesmo ou quantitativamente analisado com o uso da AP ou HRP diretamente conjugada com o anticorpo monoclonal da proteina.
[0042] A reação entre a proteina e o anticorpo pode ser identificado por experimentos de identificação de proteina, como western blotting, imunoprecipitação (IP), ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA), e imunohistoquimica (IHC), sem limitação a isso.
[0043] Um kit que inclui o anticorpo pode incluir geralmente um anticorpo liofilizado e um tampão, um estabilizador, uma proteina desativada, ou semelhantes, e o anticorpo pode ser identificado com um radionuclideo, um corante fluorescente, uma enzima, ou semelhantes.
[0044] A presente revelação também fornece um método para triar um agente de amenização de envelhecimento de pele, em que o método inclui: incubar uma amostra biológica com um composto; detectar um nivel de expressão de proteina HAPLN1 ou gene da amostra biológica; e comparar o nivel de expressão com um nivel de expressão da mesma proteina ou gene em um controle normal não incubado com o composto.
[0045] A amostra biológica pode incluir pelo menos um selecionado dentre tecido, células, sangue total,
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10/24 soro e plasma.
[0046] A presente revelação também fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, a composição farmacêutica inclui pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em proteína HAPLN1, um gene que codifica a proteína HAPLN1, e um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína ou gene HAPLN1, como um ingrediente ativo.
[0047] A composição farmacêutica pode incluir adicionalmente o ácido hialurônico (HA).
[0048] A composição farmacêutica pode ser fornecida em uma ou mais formulações selecionadas dentre o grupo que consiste em géis, emulsões, injeções, pós, grânulos, aerossóis, pastas, absorventes percutâneos, e emplastros de acordo com um método convencional, mas sem limitação a isso.
[0049] De acordo com outra modalidade exemplificativa, a composição farmacêutica pode incluir adicionalmente pelo menos um aditivo selecionado dentre o grupo que consiste em carreadores, excipientes, desintegrastes, adoçantes, revestimentos, agentes de inchaço, lubrificantes, deslizantes, agentes aromatizantes, antioxidantes, tampões, bacteristáticos, diluentes, dispersantes, tensoativos, e ligantes adequados que são comumente usados na preparação de composições farmacêuticas.
[0050] Especificamente, os carreadores, excipientes, e diluentes podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, celulose de metila, celulose
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11/24 microcristalina, polivinil pirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. As formulações sólidas para administração oral podem incluir tabletes, pílulas, pós, grânulos, cápsulas e semelhantes, e as formulações sólidas podem ser preparadas misturando-se pelo menos um excipiente, como amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose, ou gelatina com a composição. Os lubrificantes, como estearato de magnésio e talco também podem ser usados além de um excipiente simples. A formulação líquida para administração oral pode ser suspensões, formulações para uso interno, emulsões, xaropes, ou semelhantes, e podem incluir vários excipientes, como umectantes, adoçantes, fragrâncias e conservantes além de diluentes comuns simples, como água e parafina líquida. As formulações para administração parenteral podem incluir soluções aquosas estéreis, solventes não aquosos, suspensões, emulsões, liofilizados, supositórios e semelhantes. As soluções e suspensões não líquidas podem ser propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como óleo de oliva, ésteres injetáveis, como oleato de etila, ou semelhantes. As bases para os supositórios podem incluir WITEPSOL, Macrogol, TWEEN 61, manteiga de cacau, manteiga de laurina, glicerogelatina ou semelhantes.
[0051] A dosagem da proteína HAPLN1 e o agente eficaz podem variar de acordo com condições e peso de um indivíduo, tipo e grau de envelhecimento, formulação de um fármaco, rota de administração, e duração de administração e podem ser apropriadamente ajustados por aqueles de habilidade comum na técnica.
[0052] Conforme usado no presente documento, o
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12/24 termo 'indivíduo' pode ser um mamífero que inclui um ser humano, sem limitação a isso.
[0053] A presente revelação também fornece uma composição cosmética para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele incluindo proteína HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína HAPLN1, como um ingrediente ativo.
[0054] A composição cosmética pode incluir adicionalmente ácido hialurônico.
[0055] A composição cosmética pode incluir adicionalmente adjuvantes comuns, como estabilizadores, solubilizantes, vitaminas, pigmentos, e fragrâncias e carreadores além da proteína HAPLN1 e o agente eficaz que são ingredientes ativos.
[0056] A composição cosmética pode ser preparada em qualquer formulação comumente preparada na técnica, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, pastas, géis, cremes, loções, pós, óleos, bases em pó, bases em emulsão, bases em cera, e aspersões, sem limitação aos mesmos. Mais particularmente, a composição cosmética pode ser formulada em protetores solares, loções emolientes, loções adstringentes, loções nutritivas, cremes nutritivos, cremes de massagem, essências, cremes para olhos, pacotes de máscaras, aspersões ou pós.
[0057] Quando a composição cosmética é formulada em pastas, cremes ou géis, o carreador pode ser óleo animal, óleo de planta, cera, parafina, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicol, silicone, bentonita, silica, talco, óxido de zinco, ou semelhantes.
[0058] Quando a composição cosmética é formulada
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13/24 em pós ou aspersões, o carreador pode ser lactose, talco, silica, hidróxido de alumínio, silicato de cálcio, ou pó de poliamida. Particularmente, na forma de aspersões, a composição cosmética pode incluir adicionalmente um propulsor, como clorofluoro-hidrocarboneto, propano/butano, ou éter dimetílico.
[0059] Quando a composição cosmética é formulada em soluções ou emulsões, o carreador pode ser um solvente, um solubilizador, ou um emulsificante, por exemplo, água, etanol, isopropanol, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, óleo de 1,3-butil glicol, éster alifático de glicerol, polietileno glicol, ou éster de ácido graxo de sorbitano.
[0060] Quando a composição cosmética é formulada em suspensões, o carreador pode ser um diluente líquido, como água, etanol, ou propileno glicol, um agente de suspensão, como álcool isoestearílico etoxilado, éster de polioxietileno sorbitol, e éster de polioxietileno sorbitano, microcristalina celulose, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar e tragacanto.
[0061] A presente revelação também fornece um alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele ou um alimento funcional de saúde para amenizar rugas, cada um incluindo proteína HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína HAPLN1, como um ingrediente ativo.
[0062] O alimento funcional de saúde pode incluir adicionalmente ácido hialurônico.
[0063] O alimento funcional de saúde pode ser fornecido na forma de pós, grânulos, tabletes, cápsulas,
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14/24 xaropes, ou bebidas, e o alimento funcional de saúde pode ser usado apropriadamente de acordo com qualquer método conhecido em combinação com qualquer outro alimento ou aditivos alimentares além da proteina HAPLN1 ou do agente eficaz de acordo com a presente revelação usada como os ingredientes ativos. A quantidade do ingrediente ativo a ser misturada com isso pode ser apropriadamente determinada de acordo com propósitos do mesmo, por exemplo, prevenção, saúde ou tratamento.
[0064] As doses eficazes da proteina HAPLN1 e do agente eficaz contido no alimento funcional de saúde podem ser ajustadas de acordo com a dose eficaz da composição farmacêutica. Entretanto, quando a ingestão prolongada é pretendida com o propósito de saúde e higiene, as doses eficazes podem estar abaixo da faixa acima. Além disso, visto que não há problema de segurança, o ingrediente ativo pode ser usado em uma quantidade acima da faixa.
[0065] Os tipos do alimento funcional de saúde não são particularmente limitados e os exemplos do alimento funcional de saúde pode incluir carnes, salsichas, pães, chocolates, doces, lanches, biscoitos, pizzas, ramens, outros macarrões instantâneos, gomas, laticínios, incluindo sorvetes, vários tipos de sopas, bebidas, chás, bebidas, bebida alcoólica, e complexos de vitamina.
Modo de Revelação [0066] Mais adiante no presente documento, a presente revelação será descrita em mais detalhes de acordo com os exemplos a seguir. Entretanto, os exemplos a seguir são meramente apresentados para exemplificar a presente revelação, e o escopo da presente revelação não é limitado a
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15/24 isso. 0 exemplo da presente revelação é fornecido para explicar mais completamente a presente revelação para aqueles com sabedoria média na técnica.
<Exemplo 1> Busca por Fator Intrínseco de Envelhecimento de Pele [0067] A parabiose heterocrônica é um experimento de conectar vasos sanguíneos de um camundongo velho e um camundongo jovem da mesma espécie para compartilhar sangue. Um modelo de experimento de parabiose heterocrônica é usado para buscar por e identificar um fator interno que causa envelhecimento de nervos, corações e músculos e organismos vivos.
[0068] Desse modo, para confirmar a presença do fator interno relacionado ao envelhecimento de pele em organismos vivos, um camundongo C57BL/6J velho com idade de 20 meses adquirido a partir do Korea Basic Science Institute e um camundongo C57BL/6J jovem com idade de 6 semanas adquirido a partir de Central Lab Animal Inc. foram anestesiados e as peles e músculos abdominais dos camundongos obtidos por incisão foram unidos por parabiose. No caso do camundongo jovem, a pele foi submetida à incisão de uma pata dianteira direita a um membro posterior direito por cerca de 5 cm e, então, os músculos abdominais direitos foram submetidos à incisão por cerca de 1 cm. No caso do camundongo velho, a pele foi submetida à incisão de uma pata dianteira esquerda para um membro posterior esquerdo por cerca de 5 cm e, então, os músculos abdominais esquerdos foram submetidos à incisão por cerca de 1 cm. Os músculos abdominais submetidos à incisão e peles foram unidos e suturados para parabiose. Após os camundongos terem sido mantidos por 3 semanas e
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16/24 submetidos à eutanásia, o plasma e o tecido de pele foram coletados dos camundongos de cada grupo. Uma quantidade total de sangue foi coletada por coleta de sangue orbital incubada em um tubo de coleta de sangue revestido por ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA) por cerca de 30 minutos e, então, centrifugada a uma taxa de 10.000 x g para separar o plasma. O plasma separado foi armazenado a -70 °C. Como tecido de pele, a pele cervical foi coletada a partir dos camundongos a um tamanho de 1 cm x 1 cm após a remoção de cabelo.
[0069] Para a imunofluorescência, o tecido de pele coletado foi fixado em 10% (v/v) de formalina para preparar uma seção de parafina. A placa preparada foi desparafinizada e re-hidratada e, então, manchada por imunof luorescência com o uso de IgG policlonal (Santa Cruz Biotechnology) do tipo I &2 pró-colágeno anticamundongo de cabra (COL1A2) e anticorpo Alexa Fluor 594 (Life technologies) de IgG anticabra de burro (H+L).
[0070] Para qRT-PCR, o tecido de pele separado foi cultivado de um dia para outro em 0,25% (p/v) e tripsina/EDTA a 4°C, e, então, a camada dérmica foi separada a partir disso e o mRNA total foi extraído com o uso de um reagente TRIzol. A partir do mRNA extraído, o cDNA foi sintetizado usando-se um kit de síntese de cDNA (Life technologies). Então, proCOLIAl, proCOLlA2, proCOL3Al, e GAPDH foram quantificados por qRT-PCR (reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa).
[0071] Como resultado, conforme mostrado nas
Figuras IA, IB, 2A, e 2B, foi confirmado que as produções de colágeno (Figuras IA e 1B) e ácido hialurônico (Figuras 2A e
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2B) foram aumentadas no tecido de pele do camundongo velho (Y0-0) no par parabiótico heterocrônico do camundongo velho 0 e o camundongo jovem Y, quando em comparação com aquela do camundongo velho (00-0) no par parabiótico isocrônico do camundongo velho 0 e do camundongo velho 0.
[0072] Desse modo, foi confirmado que pode haver
um fator intrínseco relacionado ao envelhecimento de pele em
organismos vivos.
[0073] Além disso, o plasma foi isolado dos
camundongos de cada experimento e o fator intrínseco foi identificado por SomaScan proteomics (SomaLogic, Inc.). Como resultado, HAPLN1 foi identificado como uma proteína relacionada ao envelhecimento, conforme mostrado na Figura 3.
<Exemplo____2> Identificação de Diminuição
Quantitativa de HAPLN1 por Envelhecimento de Pele
1 . Diminuição em Produção de Colágeno por
Envelhecimento de Pele
[0074] 0 tecido de pele cervical foi coletado a partir de um camundongo C57BL/6J macho velho com idade de 20 meses e um camundongo C57BL/6J macho jovem com idade de 6 meses para um tamanho de 1 cm x 1 cm e o mRNA total foi extraído a partir disso da mesma maneira que no Exemplo 1. A partir do mRNA extraído, cDNA foi sintetizado usando-se um kit de síntese de cDNA e, então, quantidades de mRNA de prócolágeno tipo I (proCOLIAl e proC0LlA2) e tipo III (proC0L3Al) foram quantificados por qRT-PCR.
[0075] Como resultado, conforme mostrado na Figura 4A, os níveis de mRNA de proCOLIAl, proCOLlA2 e proCOL3Al no camundongo velho diminuíram para 1/4,3, 1/4,2, e 1/5,6, respectivamente, quando em comparação com aqueles do
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18/24 camundongo jovem.
[0076] Além disso, uma seção de parafina foi preparada com o uso do tecido de pele cervical coletado a partir do camundongo velho e do camundongo jovem e manchada por imunofluorescência da mesma maneira que no Exemplo 1. Como resultado de observação com o uso de um microscópio confocal, foi confirmado que a distribuição do pró-colágeno do tipo I diminuiu na pele do camundongo velho, conforme mostrado na Figura 4B.
2. Diminuição em Quantidade de Ácido Hialurônico por Envelhecimento de Pele [0077] O tecido de pele cervical foi coletado a partir de um camundongo C57BL/6J macho velho com idade de 20 meses e um camundongo C57BL/6J macho jovem com idade de 6 meses a um tamanho de 1 cm x 1 cm da mesma maneira que no Exemplo 1 e submetido ao ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). Primeiro, a gordura subcutânea foi removida do tecido de pele separado com o uso de uma lâmina e o tecido de pele foi homogeneizado em uma solução salina de tampão fosfato (PBS) suplementada com um inibidor de protease IX. O ácido hialurônico foi quantificado de acordo com as instruções do fabricante com o uso de um kit ELISA de ácido hialurônico (CUSABIO).
[0078] Como resultado, a concentração de ácido hialurônico no camundongo velho diminuiu a cerca de 1/4,2 daquela no camundongo jovem, conforme mostrado na Figura 5A.
[0079] Os cortes de tecido de pele do camundongo velho e do camundongo jovem foram manchados por imunofluorescência da mesma maneira que no Exemplo 1. Neste caso, o anticorpo policlonal antiácido hialurônico de
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19/24 carneiro (Abeam) e IgG anticarneiro de burro H&L Alexa Fluor 488 (Abeam) foram usados como anticorpos antiácido hialurônico. Como resultado de observação com o uso de um microscópio confocal, foi confirmado que a distribuição de ácido hialurônico diminuiu na pele do camundongo velho, conforme mostrado na Figura 5B.
3. Diminuição em Nível de Expressão de HAPLN1 por Envelhecimento de Pele [0080] O tecido de pele Cervical foi coletado a partir de um camundongo C57BL/6J macho velho com idade de 20 meses e um camundongo C57BL/6J macho jovem com idade de 6 meses e homogeneizado em uma solução de PBS da mesma maneira que no Exemplo 2-2 descrito acima, e então, a concentração de HAPLN1 foi medida com o uso de um kit ELISA de HAPLN1 de camundongo (CUSABIO).
[0081] Como resultado de medição, a concentração de HAPLN1 diminuiu no camundongo velho para 1/4,2 daquela no camundongo jovem conforme mostrado na Figura 6A.
[0082] Adicionalmente, os cortes de tecido de pele do camundongo velho e do camundongo jovem foram manchados por imunofluorescência da mesma maneira que no Exemplo 1. Nesse caso, a IgG policlonal anti-HAPLNl de cabra (Santa Cruz Biotechnology) e Alexa Fluor 594 (Life technologies) de IgG(H+L) anticabra de burro foram usados.
[0083] Como resultado de observação com o uso de um microscópio confocal, foi confirmado que a distribuição de HAPLN1 diminuiu na pele do camundongo velho, conforme mostrado na Figura 6B.
<Exemplo___3> Identificação de Efeitos de Administração de HAPLN1 na Amenização de Envelhecimento de
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Pele [0084] HAPLN1 de camundongo recombinante (adquirido a partir de Cusabio Biotech Co) foi dissolvida em PBS e administrada a um camundongo C57BL/6J macho velho com idade de 20 meses por meio de uma via intraperitoneal a uma dose de 0,1 mg/kg uma vez por dia durante 14 dias. A mesma quantidade de PBS foi administrada a um camundongo velho e um camundongo jovem (com idade de 6 meses) para preparar grupos de controle para comparação entre os mesmos.
1. Identificação de Aumento em Colágeno em Camundongo Velho por Administração de HAPLN1 [0085] Após a conclusão da administração, a camada dérmica foi separada do tecido de pele de cada um dentre o grupo experimental e os grupos de controle da mesma maneira que no Exemplo 1 e o RNA foi extraído a partir disso para quantificar o pró-colágeno do tipo I (proCOLIAl e proCOLlA2) e tipo III (proCOL3Al) por qRT-PCR.
[0086] Como resultado, conforme mostrado na Figura 7A, foi confirmado que os níveis de mRNA do proCOLIAl, proCOLlA2 e proCOL3Al aumentaram por 2,6 vezes, 2,5 vezes, e 2,8 vezes, respectivamente, no grupo administrado por HAPLN1, quando em comparação com o grupo de não administração, o que indica a restauração a um nível similar àquele do camundongo jovem. Além disso, os cortes de tecido de pele foram coloridos por anticorpo do tipo I anti-pró-colágeno e observados com o uso de um microscópio confocal da mesma maneira que no Exemplo 2-1. Como resultado, foi confirmado que a distribuição do pró-colágeno do tipo I no grupo administrado com HAPLN1 aumentou a um nível similar àquele do camundongo jovem conforme mostrado na Figura 7B.
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2. Identificação de Aumento em Ácido Hialurônico em
Camundongo Velho por Administração de HAPLN1 [0087] Após a conclusão da administração, o tecido de pele cervical foi coletado a partir de cada grupo experimental e os grupos de controle e homogeneizados em uma solução de PBS da mesma maneira que no Exemplo 2-2, e, então, o ácido hialurônico foi quantificado com o uso de um kit ELISA de ácido hialurônico (CUSABIO) de acordo com as instruções do fabricante.
[0088] Como resultado, conforme mostrado na Figura 8A, foi confirmado que a quantidade de ácido hialurônico aumentou no grupo administrado com HAPLN1 por 1,5 vezes, em comparação com o grupo de não administração, o que indica a restauração a um nivel similar àquele do camundongo jovem.
[0089] Além disso, o ácido hialurônico nos cortes de tecido de pele foi manchado por imunofluorescência da mesma maneira que no Exemplo 2-2 e observado com o uso de um microscópio confocal. Como resultado, foi confirmado que a distribuição de ácido hialurônico aumentou no grupo administrado de HAPLN1 a um nivel similar àquele do camundongo jovem, quando em comparação com o grupo de não administração, conforme mostrado na Figura 8B.
<Exemplo 4> Identificação de Aumento em receptor II de TGF-βΙ, Produção de Colágeno Induzida por TGF-βΙ, e Enzima de Sintese de Ácido Hialurônico (HAS2) por Tratamento com HAPLN1
1. Identificação de Aumento em Produção de Colágeno
Induzida por TGF-βΙ em célula de NHDF por Tratamento de
HAPLN1
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22/24 [0090] As linhagens celulares de fibroblasto dérmico humano normal (NHDF) foram submetidos ao ensaio de western blotting para identificar a possibilidade de HAPLN1 afetar a produção de proCOLla2 induzida por TGF-βΙ. TGF-β é um fator que induz a produção de colágeno. Em 30 minutos após as linhagens celulares de NHDF serem tratadas com concentrações diferentes de HAPLN1 humano recombinante (rhHAPLNl) (0, 25, 50, e 100 ng/ml), as linhagens celulares de NHDF foram tratadas com 1 ng/ml de TGF-βΙ humano recombinante por 24 horas.
[0091] Como resultado, foi confirmado que a produção de proCOLla2 induzida por TGF-βΙ aumentou por tratamento de HAPLN1 conforme mostrado na Figura 9.
2. Identificação de Aumento no receptor II de TGF-β em Célula de NHDF por Tratamento de HAPLN1 [0092] Para identificar a possibilidade de HAPLN1 afetar sinalização de TGF-β, as linhagens celulares de NHDF foram tratadas com concentrações diferentes de HAPLN1 humano recombinante (rhHAPLNl) (0, 25, 50, e 100 ng/ml). Após 24 horas, os niveis de expressão de proteina de receptores de TGF-β foram medidos por western blotting.
[0093] Como resultado, foi confirmado que o nivel de expressão de proteina do receptor II de TGF-β entre os dois tipos de receptores conforme mostrado na Figura 10A aumentou de maneira dependente de concentração por tratamento de HAPLN1. Como resultado de medição de niveis de expressão de mRNA dos receptores de TGF-β por qRT-PCR sob as mesmas condições, foi confirmado que não houve diferença por tratamento de HAPLN1 conforme mostrado nas Figuras 10B e 10C.
[0094] Desse modo, para identificar a
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23/24 possibilidade de HAPLN1 aumentar a quantidade do receptor II de TGF-β por regulação de estabilidade em vez de regulação de transcrição, as células, as quais foram pré-tratadas com ciclo-heximida como um inibidor de síntese de proteína a uma concentração de 10 μΜ por 1 hora, foram tratadas com rhHAPLNl 100 ng/ml por 6 horas ou 24 horas, e os níveis de expressão de proteína do receptor II de TGF-β foram identificados por western blotting.
[0095] Como resultado, foi confirmado que a quantidade de receptor II de TGF-β aumentou por tratamento de rhHAPLNl até mesmo na presença de ciclo-heximida, conforme mostrado na Figura 11. Desse modo, pode ser visto que HAPLN1 aumenta a estabilidade do receptor II de TGF-β.
3. Identificação de aumento de Expressão de Ácido Hialurônico Sintase (HAS2) induzida por TGF-βΙ em Célula de NHDF por Tratamento com HAPLN1 [0096] Em fibroblastos dérmicos, a ácido hialurônico sintase 2 HAS2 existe principalmente entre três tipos de ácido hialurônico sintases, HAS1, HAS2 e HAS3. Para identificar a possibilidade de HAPLN1 afetar a expressão de HAS2 induzida por TGF-βΙ em linhagens celulares de NHDF, em 30 minutos após as linhagens celulares de NHDF serem tratadas com concentrações diferentes de HAPLN1 humano recombinante (rhHAPLNl) (0, 25, 50, e 100 ng/ml), as linhagens celulares de NHDF foram tratadas com 1 ng/ml de TGF-βΙ humano recombinante por 24 horas e a os níveis de expressão de proteína de HAS2 foram identificados por western blotting.
[0097] Como resultado, foi confirmado que o nível de expressão de HAS2 induzida por TGF-βΙ aumentou por tratamento de HAPLN1 conforme mostrado na Figura 12.
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24/24 [0098] A descrição acima da revelação é fornecida com o propósito de ilustração, e seria entendido por aqueles versados técnica que as modalidades da revelação descritas acima são ilustrativas em todos os aspectos e não limitam a revelação. Portanto, o escopo da revelação é definido pelas reivindicações a seguir e seus equivalentes em vez de sua descrição detalhada das modalidades ilustrativas.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. COMPOSIÇÃO DE BIOMARCADOR PARA MEDIR
    ENVELHECIMENTO DE PELE, caracterizada por compreender:
    um agente para detectar proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica.
  2. 2. COMPOSIÇÃO DE BIOMARCADOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo agente ser um selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo, um RNA antissenso, um aptâmero e um composto.
  3. 3. COMPOSIÇÃO DE BIOMARCADOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo envelhecimento de pele ser uma formação de rugas causada por uma diminuição na matriz extracelular dérmica.
  4. 4. KIT PARA MEDIR 0 ENVELHECIMENTO DE PELE, caracterizado por compreender:
    um agente para detectar proteína HAPLN1 ou gene HAPLN1 de uma amostra biológica.
  5. 5. KIT, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo agente ser um selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo, um RNA antissenso, um aptâmero e um composto.
  6. 6. MÉTODO PARA TRIAR UM AGENTE DE AMENIZAÇÃO DE ENVELHECIMENTO DE PELE, sendo que o método é caracterizado por compreender:
    incubar uma amostra biológica com um composto; detectar um nível de expressão de proteína HAPLN1 ou gene da amostra biológica; e comparar o nível de expressão com um nível de expressão da mesma proteína ou gene em um controle normal não incubado com o composto.
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  7. 7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA PREVENIR OU AMENIZAR O ENVELHECIMENTO DE PELE, caracterizada por compreender:
    pelo menos um selecionado dentre o grupo que consiste em proteina HAPLN1, um gene que codifica a proteina HAPLN1 e um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteina ou gene HAPLN1, como um ingrediente ativo.
  8. 8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender adicionalmente ácido hialurônico.
  9. 9. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA PREVENIR OU AMENIZAR 0 ENVELHECIMENTO DE PELE, caracterizada por compreender:
    proteina HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteina HAPLN1, como um ingrediente ativo.
  10. 10. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por compreender adicionalmente ácido hialurônico.
  11. 11. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA AMENIZAR RUGAS, caracterizada por compreender:
    proteina HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteina HAPLN1, como um ingrediente ativo.
  12. 12. ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE PARA PREVENIR OU AMENIZAR O ENVELHECIMENTO DE PELE, caracterizado por compreender:
    proteina HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteina HAPLN1, como um ingrediente ativo.
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  13. 13. ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender adicionalmente ácido hialurônico.
  14. 14. ALIMENTO FUNCIONAL DE SAÚDE PARA AMENIZAR RUGAS, caracterizado por compreender:
    proteína HAPLN1 ou um agente eficaz para promover a expressão ou ativar as funções de proteína HAPLN1, como um ingrediente ativo.
BR112019018469A 2017-03-06 2017-03-06 composição de biomarcador para medir envelhecimento de pele, kit para medir o envelhecimento de pele, método para triar um agente de amenização de envelhecimento de pele, composição farmacêutica para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, composição cosmética para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele, composição cosmética para amenizar rugas, alimento funcional de saúde para prevenir ou amenizar o envelhecimento de pele e alimento funcional de saúde para amenizar rugas BR112019018469A2 (pt)

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