CN113490500A - 包括hapln1的用于预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症状的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症状的组合物，其包括透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1：HAPLN1)作为有效成分。具体而言，本发明提供用于再生软骨的组合物、用于预防、改善或治疗骨关节炎的组合物或用于再生生长板软骨的组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。

Description

包括HAPLN1的用于预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症 状的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症状的组合物，其包括透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1：HAPLN1)作为有效成分。具体而言，本发明涉及一种用于再生软骨的组合物或用于预防、改善或治疗骨关节炎的组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。或者，本发明涉及一种用于增殖生长板软骨或用于促进骨长生长的组合物，或用于预防、改善或治疗矮小症(shortstature)的组合物。
背景技术
骨关节炎是一种变性关节疾病，其刺激患者的关节痛症、关节肿胀和减少的活动范围，并导致关节软骨和主要骨骼的破坏。已知在十个成年人中，至少一个患有骨关节炎(Lawrence,Felson等人，2008)，由于引起与关节运动有关的痛症，导致患者的生活质量大大降低。以前认为骨关节炎是老化的常见结果，但现在已知其是由许多因素的复杂相互作用引起的，这些因素包括关节完整性、遗传性矮小、局部炎症机械力以及细胞和生化过程。其致病特征包括下部软骨下骨肥大和骨赘(骨突起)的形成以及填充关节的关节软骨的细胞外基质(ECM)的退化。
膝关节中软骨的厚度约为2㎜，当该区域由于外伤或疾病而受损约1mm2至4mm2时，可以通过自然痊愈而再生，但当受损约20mm2时，难以通过自力进行再生，并且通常伴随着极大的痛症。另外，在由于诸如肿瘤和坏死等的各种原因导致关节软骨完全丧失的情况下，为了恢复关节功能，例如，进行诸如将人造关节嵌入相应位置的处理。然而，人造关节人造构成为某程度类似于关节功能，但对于活体来说，其为异物，因此难以维持生物相容性。此外，人造关节难以维持20年以上，因为在活体内严格的环境下需要进行复杂的动作，并且由于用作其材料的树脂或金属等的劣化或磨损粉末的产生，可能会导致功能下降或痛症，并且在耐久性方面，也不能说足够。因此，作为人工关节治疗的替代，期望用于再生关节软骨的技术。
另外，根据最近的研究发表，已经报道了通过在关节表面穿孔并在期望的部位设置含有骨形态发生蛋白(BMP：bone morphogentic protein)的胶原蛋白来进行关节软骨的再生。然而，再生的关节软骨没有与相邻的现有关节软骨连续形成，因此不能说这是一次完全的再生。另外，由于诸如牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy：BSE)和所谓的疯牛病之类的问题，胶原蛋白具有避免被施加到活体上的趋势。因此，需要开发一种仅使用经批准可应用于生物的材料来再生软骨的新组合物。
另一方面，身高生长需要增加骨长，而这种骨长生长涉及在软骨内骨化(endochondral ossification)。软骨内骨化是指形成软骨，并且在其中央出出现骨化中心以形成骨，该骨在骺板上升并与骨长生长有关。到目前为止，生长激素注射剂主要用作可促进身高生长的的药物。
然而，尽管生长激素直接促进生长板中的软骨细胞的增殖，但效果并不大。当生长激素应用于肝脏时分泌的胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1：IGF-1)是增殖软骨细胞的主要因子。因此，当在施用生长激素时血液中的IGF-1浓度增加时，则可以确定其应用正常，当生长激素或IGF-1应用于软骨细胞时，分泌出生长因子，从而使生长板增殖。另外，生长激素注射剂不适合正常分泌激素的儿童，使用时反而会引起甲状腺功能不全或脑垂下体功能亢进等副作用，并且存在成本高的问题。因此，迫切需要开发一种能够通过促进增殖生长板软骨来诱导身高生长的物质。
在软骨类型中，关节软骨(articular cartilage)和生长板软骨(growth platecartilage)对应于透明软骨(hyaline cartilage)。这些软骨组织的细胞外基质(extracellular matrix：ECM)以II型胶原蛋白(typeⅡcollagen)、聚蛋白多糖(aggrecan)、透明质酸(hyaluronan)、透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan andproteoglycan link protein 1：HAPLN1)等作为主要成分，其具有聚集体(aggregate)结构。在此，许多聚蛋白多糖被结合到透明质酸链上，并且已知HAPLN1通过更牢固地它们两者的结合而用于在物理和化学上稳定聚集体。但是，完全未知HAPLN1具有治疗、预防或改善与软骨相关的疾病或症状的效果。
另一方面，作为与软骨相关的疾病或症状有关的研究，美国专利公开公布第2016/0220699号公开了一种产生软骨细胞或软骨型细胞的方法，其包括将编码一种或多种用于治疗的多核苷酸的表达载体转递至个体的关节。另外，国际专利公开公布第2017/123951号公开了一种产生软骨细胞或与其类似的细胞的方法，其包括向患有退行性椎间盘疾病的患者提供源自髓核(nucleus pulposus)的成分。然而，上述文献中没有具体提及使用HAPLN1来预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症状。
【先前技术文献】
【专利文献】
(专利文献1)美国专利公开公布第2016/0220699号(2016.8.4.公开)
(专利文献2)国际专利公开公布第2017/123951号(2017.7.20.公开)
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供使用HAPLN1的用于预防、改善或治疗与软骨有关的疾病或症状的组合物。
具体而言，本发明的目的在于提供用于再生软骨的组合物或用于预防、改善或治疗骨关节炎的组合物。另外，本发明的目的在于提供一种用于增殖生长板软骨或用于促进骨长生长的组合物，或用于预防、改善或治疗矮小症(short stature)的组合物。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供一种用于再生软骨的药物组合物、用于再生软骨的食物组合物或用于再生软骨的动物饲料组合物，其包括透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1：HAPLN1)作为有效成分。
本发明提供一种用于预防、改善或治疗骨关节炎的药物组合物、食物组合物或动物饲料组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
本发明提供一种用于增殖生长板软骨或用于促进骨长生长的药物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。并且，本发明提供一种用于增殖生长板软骨和用于促进骨长生长的食物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。此外，本发明提供一种用于增殖生长板软骨和用于促进骨长生长的动物饲料组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
本发明提供一种用于治疗或预防骨长生长障碍的药物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。本发明的骨长生长障碍为矮小症、侏儒症、矮态症或性早熟症。
有益效果
根据本发明，HAPLN1蛋白具有促进软骨形成和再生关节软骨的能力，并增加软骨细胞中的TGF-β受体I蛋白的表达水平，从而增加具有软骨形成能力的细胞并诱导软骨组织的再生。因此，本发明的HAPLN1蛋白是调节TGF-β的信号转导的物质，并且可以有效地用作用于再生软骨的药物组合物、用于再生软骨的食物组合物或用于再生软骨的动物饲料组合物。
另外，根据本发明，可以提供通过使用HAPLN1蛋白能够预防、改善或治疗骨关节炎的有用的组合物。
并且，HAPLN1蛋白增殖生长板软骨并促进骨长生长，因此可以提供为身高生长治疗剂和佐剂，其与常规激素剂相比具有较小副作用且更好的效果。
附图说明
图1示出对通过使用ExpiTM 293细胞作为蛋白质表达系统而获得的重组人HAPLN1蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的结果。
图2为确认由于向老化小鼠的退化生长板反复腹膜内施用HAPLN1蛋白而引起的软骨形成能力的图，其中，图2(A)为通过番红O-固绿FCF(Safranin O/FastGreen FCF)染色法确认组织内的蛋白聚糖的图，图2(B)为通过免疫组化法(immunohistochemistry)确认具有软骨形成能力的软骨细胞的存在的图。
图3为通过免疫荧光(immunofluorescence)染色法确认对小鼠的受损的膝关节组织关节腔中施用的HAPLN1蛋白的软骨再生能力的图。
图4为确认HAPLN1蛋白对人类关节软骨细胞的促进软骨形成的能力的图，其中，图4(A)为通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction：PCR)确为软骨特异性基因SOX9和作为软骨基质的组成成分的聚蛋白多糖和II型胶原蛋白的基因表达水平的图，图4(B)为通过番红O-固绿染色法确认在细胞外基质中积累的蛋白聚糖的图。
图5为确认HAPLN1蛋白对小鼠关节软骨细胞的调节TGF-β信号转导的能力的图，其中，图5(A)为通过蛋白质印迹法(western blot)确认HAPLN1蛋白的调节TGF-β受体I的能力的图，图5(B)和5(C)为通过聚合酶链式反应和蛋白质印迹法确认HAPLN1蛋白的TGF-β受体I的稳定化的图，图5(D)为通过蛋白质印迹法确认由HAPLN1蛋白改善的细胞表面TGF-β受体I的提呈能力的图。
图6示出概述用于分析HAPLN1蛋白改善骨关节炎的能力的六只小鼠的实验组的示意图。
图7为确认HAPLN1蛋白改善骨关节炎诱导的小鼠的关节软骨组织形态的能力的图，其中，图7(A)为通过番红O-固绿FCF染色法确认各小鼠实验组的关节软骨组织形态的图，图7(B)为通过骨关节炎组织病理学评价方法(OARSI评分)定量HAPLN1蛋白的改善骨关节炎的能力的图。
最佳模式
本发明的发明人确认了HAPLN1蛋白在老化小鼠和具有关节软骨损伤的小鼠中的促进软骨形成和软骨再生的能力。另外，在软骨细胞中，确认了由HAPLN1蛋白引起的优异的促进软骨形成的能力和软骨再生能力。并且，通过确认HAPLN1蛋白选择性地和稳定地增加软骨细胞的TGF-β受体I蛋白来完成本发明。
本发明提供一种用于再生软骨的药物组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。优选地，所述HAPLN1蛋白可以促进软骨形成并保护关节软骨。更优选地，HAPLN1蛋白可以选择性地和稳定地增加TGF-β受体I蛋白，以增加具有软骨形成能力的细胞并诱导软骨组织的再生。
在一实施例中，本发明提供一种在受试者中再生软骨的方法，其包括对有此需要的受试者(subject)施用有效量的HAPLN1蛋白。如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类、绵羊、狗、牛和马等。
在另一实施例中，本发明提供HAPLN1蛋白在软骨再生中的用途。
本发明还提供一种用于再生软骨的食物或动物饲料组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。
本发明提供一种用于预防、改善或治疗骨关节炎的药物组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。
如本文所用，术语“骨关节炎”是通常被称为退行性关节炎的疾病，并且是其中围绕骨的关节表面的关节软骨被磨损导致软骨下方的骨露出，并且关节周围的滑膜发炎而引起痛症和变形的疾病，并被解释为本领域中通常理解和常用的含义。在外形方面，称为骨赘(osteophyte)的骨骼会在骨骼的边缘部分生长，从而导致关节突出和关节变形。目前，尚没有完全治愈骨关节炎的方法，作为药物疗法，止痛药仅用于缓解痛症，或非甾体(NSAID)抗炎药用于缓解炎症。
当使用本发明的HAPLN1蛋白时，其中患有成骨关节炎的关节软骨组织被改善为具有与正常软骨相似的形状。此外，当使用HAPLN1蛋白时，减少了关节表面的损伤程度，并且减少纤维化(fibrosis)和骨赘的数量，从而可以预防、抑制或改善骨关节炎的发展。
在一实施例中，本发明提供一种在对象中预防、改善或治疗骨关节炎的方法，其包括向有需要预防、改善或治疗骨关节炎的对象施用有效量的HAPLN1蛋白。
在另一实施例中，本发明提供HAPLN1蛋白在预防、改善或治疗骨关节炎中的用途。
本发明提供用于预防或改善骨关节炎的食物或动物饲料组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。
本发明提供一种用于增殖生长板软骨或用于促进骨长生长的药物组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。
本发明的HAPLN1蛋白促进生长板中软骨的形成，从而增强生长板活性，并强化生长板。因此，HAPLN1蛋白可用于治疗或预防骨长生长障碍。在这种情况下，所述骨长生长障碍包括矮小症、侏儒症、矮态症或性早熟症，但不限于此。
在一实施例中，本发明提供在对象中增殖生长板软骨或促进骨长生长的方法，其包括向有需要增殖生长板软骨或促进骨长生长的对象施用有效量的HAPLN1蛋白。本发明提供在对象中治疗或预防骨长生长障碍的方法，其包括对有需要治疗或预防骨长生长障碍的对象施用有效量的HAPLN1蛋白。
在另一实施例中，本发明提供HAPLN1蛋白在增殖生长板软骨或促进骨长生长中的用途。本发明还提供HAPLN1蛋白在治疗或预防骨长生长障碍中的用途。
本发明还提供一种用于增殖生长板软骨和用于促进骨长生长的食物或动物饲料组合物，其包括HAPLN1蛋白作为有效成分。
本发明提供通过在软骨细胞处理HAPLN1来再生软骨组织的方法。具体而言，本发明提供使用HAPLN1在体外再生软骨组织的方法，其包括：从对象分离软骨细胞；以及在软骨细胞中处理HAPLN1。
当本发明的组合物是药物组合物时，为了施用，除了上述有效成分之外，还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
当本发明的组合物是食物组合物时，可以含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、诸如合成调味剂和天然调味剂的调味剂、着色剂和增稠剂(奶酪和巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和碳酸饮料中使用的碳酸盐等。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
制造例：HAPLN1蛋白的制造
为了促进蛋白的纯化，合成了结合有10个组氨酸的重组人HAPLN1基因，然后将其插入质粒pcDNA3.4-TOPO中，并使用蛋白质表达系统转染到ExpiTM 293细胞中。培养3天后，收集细胞培养液，使其通过作为纯化蛋白的螯合柱的HisTrap柱，然后通过使用含有0.5M的NaCl的咪唑PBS缓冲溶液来以20mM至500mM盐梯度洗脱，从而进行了纯化。之后，为了除去结合的组氨酸，进行TEV蛋白酶处理，然后再次使用DynaBeads去除添加的TEV蛋白酶。将生成的HAPLN1蛋白上样到SDS-PAGE上，以确认纯化的蛋白(图1)。然后，确认纯化度来获得纯度为98％或更高的蛋白，并且其用于体外(in vitro)细胞试验或体内(in vivo)效能试验。
实施例1：分析HAPLN1蛋白在体内(in vivo)退化的软骨组织中的软骨再生能力
1-1.通过重复腹膜内施用HAPLN1蛋白来促进退化的生长板中的软骨形成
将6周龄的雄性C57BL/6小鼠分类为年轻(Young)组，并将20个月龄的C57BL/6小鼠分类为老化(Old)组，在老化组中，将HAPLN1蛋白稀释在磷酸缓冲盐水(phosphatebuffered saline：PBS)中，并以0.1mg/kg的用量以腹腔内施用2周，对照组以相同的方法腹腔内施用PBS。
取每组的小鼠大腿骨和膝关节，并用中性缓冲10％福尔马林(neutral buffered10％formalin：NBF)固定48小时，然后依次使用10％乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid：EDTA)溶液进行7天的脱钙处理。随后，将每个试料包埋(embedding)在石蜡(paraffin)中以制备石蜡块，并在矢状(sagittal)方向上制备厚度为5μm的组织切片载玻片。为了进行组织学评估，通过对每个组织切片载玻片的软骨组织进行番红O-固绿FCF(Safranin O/Fast Green FCF)染色法可视化软骨组织。使用Ni-U(尼康)显微镜和DS-Ri1(尼康)数码相机拍摄染色的组织切片来进行观察，其结果示出于图2(A)(比例尺＝1mm)。
如图2(A)所示，与年轻对照组(Young Control)相比，老化对照组(Old Control)的生长板退化，因此仅能确认到软骨组织的痕迹，而反复腹腔内施用HAPLN1蛋白的老化组(Old HAPLN1)中可以确认到软骨形成在退化的生长板中(箭头)。
1-2.反复腹腔施用HAPLN1蛋白引起形成和增加具有软骨形成能力的软骨细胞
从上述实施例1-1中，为了确认在通过反复腹腔内施用HAPLN1蛋白而诱导的软骨形成部位中是否存在具有软骨形成能力的细胞，通过免疫组化法(immunohistochemistry：IHC)对相应部位染色作为软骨特异性转录因子(cartilage-specific transcriptionfactor)的SOX9。使用Ni-U(尼康)显微镜和DS-Ri1(尼康)数码相机拍摄染色的组织切片来进行观察，其结果示出于图2(B)(比例尺＝1mm)。
如图2(B)所示，在年轻对照组(Young Control)中，表达SOX9的细胞全面地保留在软骨组织中，相反，在老化对照组(Old Control)中，根本没有发现表达SOX9的细胞。然而，确认了在重复腹腔内施用HAPLN1蛋白的老化组(Old HAPLN1)的软骨形成刺激部位中发现了许多表达SOX9的细胞(箭头)。
因此，可以看出，HAPLN1蛋白增殖或再生生长板软骨，从而促进生长板的强化和骨长的生长。
实施例2：分析HAPLN1蛋白在体内受损的软骨组织中的软骨再生能力
将七周龄的雄性C57BL/6小鼠分为以下三组。正常对照组(假手术对照组)是有关内侧半月板失稳(destabilization of medial meniscus：DMM)施术的模拟施术组(shamoperation)，施术后将它们在现有条件下饲养4周。在媒介物(Vehicle)治疗组(DMM对照组)中，在DMM施术后在现有条件下饲养8周，并在最后4周内每周一次关节内施用PBS。在HAPLN1治疗组(DMM HAPLN1组)中，在DMM施术后在现有条件下饲养8周，并在最后4周内每周一次将HAPLN1蛋白在PBS中以1μg/mL的浓度稀释并进行关节内施用。
饲养结束时，将要进行施术和治疗的膝盖组织取出并用NBF固定48小时，然后依次使用10％EDTA溶液进行7天的脱钙处理。随后，将每个试料包埋在石蜡中以制备石蜡块，并制备在矢状方向上具有5μm的厚度的组织切片载玻片。使用免疫荧光染色法(immunofluorescence；IF)将II型胶原蛋白(typeⅡcollagen：Col2)染成绿色荧光，并使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将细胞核染成蓝色荧光。使用Ni-U(尼康)显微镜和DS-Ri1(尼康)数码相机拍摄染色的组织切片来进行观察，其结果示出于图3(比例尺＝200μm)。
如图3所示，确认在正常对照组(假手术对照组对照组)发现的表达Ⅱ型胶原的细胞数量在媒介物治疗组(DMM对照组)中显着减少，而在HAPLN1治疗组(DMM HAPLN1组)中，表达II型胶原的细胞数量显着增加(箭头)。
因此，可以看出HAPLN1蛋白对软骨再生具有优异的效果。
实施例3：分析HAPLN1蛋白在体外促进软骨形成的能力
3-1.HAPLN1蛋白增加人关节软骨细胞的软骨形成能力
人关节软骨细胞(human articular chondrocyte：HAC)在包含10％的胎牛血清(fetal bovine serum；FBS；Gibco)、1％的青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin；Gibco)和1％的非必需氨基酸(non-essential amino acid；NEAA；Gibco)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培养基和F12以1：1混合(DMEM/F12；Gibco)的培养基中在37℃和5％CO2的条件下进行培养。
作为试验HAC的软骨形成能力的模型，使用了将细胞包埋在藻酸盐珠(alginatebead)中的三维培养系统。将HAC均匀混合在1.25％藻酸盐溶液中，每珠含有30,000个细胞。它们通过在生长培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸2-磷酸酯(L-ascorbic acid 2-phosphate)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS；Gibco)和10ng/mL TGF-β1来进行培养，而在HAPLN1治疗组进一步添加了50ng/m
Figure BDA0003231565130000101
在37℃和5％CO2的条件下继续培养7至28天。
培养结束时，为了回收包埋在藻酸盐珠中的HAC，将藻酸盐溶解在55mM EDTA溶液中，然后以500xg离心(centrifugation)3分钟。用离心后所获得的细胞进行RNA提取和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction：PCR)，以比较和分析基因表达模式，具体过程如下。
根据制造商的说明，使用TRIzol(赛默科技)溶液提取RNA。使用oligo-dT20引物(primer)和SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis Supermix(Invitrogen)从0.1μg获得的RNA中合成第一链(first-strand)cDNA。使用iQ SYBR Green Supermix(伯乐)针对每个感兴趣的基因，使用200nM引物对获得的cDNA进行PCR。作为反应条件，将最初的5分钟保持在95℃后，在以下条件重复进行三阶段处理45次：在95℃保持10秒、在62℃保持15秒、在72℃保持20秒。使用CFX Connect(伯乐)实时测量增幅信号，并计算感兴趣基因的表达水平，作为相对于各自GAPDH表达水平的相对值。结果示于图4(A)，PCR中使用的每个人基因的引物序列如下。
【表1】
Figure BDA0003231565130000111
如图4(A)所示，可以确认HAPLN1蛋白使HAC增加SOX9基因的表达，同时，聚蛋白多糖(aggrecan：ACAN)和II型胶原(type II collagen：COL2A1)的基因表达也增加。
3-2.HAPLN1蛋白增加人关节软骨细胞的细胞外基质中蛋白聚糖的积累
从上述实施例3-1，为了评估HAPLN1的添加引起的软骨基质的细胞外积累，将培养第28天的藻酸盐珠用NBF固定15分钟，并在OCT化合物(Sakura)中用液氮冻结。由此，获得厚度为5μm的冻结切片，用丙酮(acetone)固定，然后通过番红O-固绿FCF染色使可视化。使用Ni-U(尼康)显微镜和DS-Ri1(尼康)数码相机拍摄染色的组织切片来进行观察，其结果示出于图4(B)(比例尺＝250μm)。
如图4(B)所示，确认了在含有HAPLN1蛋白的培养基中培养的HAC藻酸盐珠中，与对照组相比，由番红O染色的蛋白聚糖的积累显着增加。
实施例4:分析HAPLN1蛋白调节TGF-β信号传导的能力
4-1.HAPLN1蛋白增加小鼠关节软骨细胞中TGF-β受体I(TβR1)的蛋白质含量
从5天龄的ICR小鼠的两只腿的关节软骨中分离出未成熟的小鼠关节软骨细胞(immature murine articular chondrocyte：iMAC)。在37℃，5％CO2条件下，将所得的iMAC置于含有10％FBS(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Gibco)和1％NEAA(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)培养基中进行培养。
在平板底部以高密度培养的iMAC中处理100ng/mL的HAPLN13至72小时后，收集细胞，并在放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液中提取蛋白质。然后，进行蛋白质印迹法(westernblot)以确认TGF-β受体I(TβR1)、激活素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1：ALK1)、TGF-β受体II(TβR2)和Gapdh的蛋白表达水平，结果示于图5(A)。
如图5(A)所示，确认通过HAPLN1蛋白增加iMAC的TGF-β受体I(TβR1)的蛋白表达水平。另一方面，确认ALK1和TGF-β受体II的表达水平没有改变。
4-2.HAPLN1蛋白增加小鼠关节软骨细胞中TGF-β受体I(TβR1)的稳定性
为了验证实施例4-1中显示的HAPLN1蛋白增加的TGF-β受体I(TβR1)蛋白水平是稳定性提高的结果，从在相同试验条件下分别培养24小时和72小时的细胞中，比较和分析了比较过蛋白质水平的三个基因的表达模式，同时，验证在从蛋白质生合成受到限制的环境中，HAPLN1增加TGF-β受体I(TβR1)蛋白的水平。
为此的RNA提取和PCR步骤如下。
根据制造商的说明，使用TRIzol(赛默科技)溶液提取RNA。使用oligo-dT20引物和SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix(Invitrogen)从0.1μg获得的RNA中合成第一链(first-strand)cDNA。使用iQ SYBR Green Supermix(伯乐)针对每个感兴趣的基因，使用200nM引物对获得的cDNA进行PCR。作为反应条件，将最初的5分钟保持在95℃后，在以下条件重复进行三阶段处理45次：在95℃保持10秒、在61℃保持15秒、在72℃保持20秒。使用CFX Connect(伯乐)实时测量增幅信号，并计算感兴趣基因的表达水平，作为相对于各自Gapdh表达水平的相对值。结果示于图5(B)，PCR中使用的每个小鼠基因的引物序列如下。
【表2】
Figure BDA0003231565130000131
此外，在平板底部以高密度培养的iMAC中处理10μM的环己酰亚胺(CHX)以露出时，从在处理环己酰亚胺的0.5小时前(pre)或0.5小时后(post)处理200ng/mL的HAPLN1。在处理环己酰亚胺24小时后，用PBS洗涤在附接有细胞的状态的平板，收集细胞以在RIPA缓冲液中提取蛋白质。用提取的裂解物(细胞裂解物)进行蛋白质印迹法(western blot)以确认TGF-β受体I(TβR1)、ALK1、TGF-β受体II(TβR2)和Gapdh的蛋白表达水平，结果示于图5(C)。
如图5(B)和图5(C)所示，确认通过HAPLN1蛋白没有诱导或抑制iMAC的TGF-β受体I(TβR1)、ALK1和TGF-β受体I I(TβR2)中的任何一个的基因表达。一方面，可以确认，与蛋白表达水平没有改变的ALK1和TGF-β受体II(TβR2)不同，HAPLN1蛋白可提高TGF-β受体I(TβR1)的表达水平。这表明HAPLN1蛋白不会诱导TGF-β受体I(TβR1)基因转录，并延长了蛋白的半衰期，并表明iMAC保有的TGF-β受体I(TβR1)蛋白的稳定性得到了提高。
4-3.HAPLN1蛋白增加小鼠关节软骨细胞中TGF-β受体I(TβR1)的细胞表面提呈量
在平板底部以高密度培养的iMAC中处理10μM的环己酰亚胺(CHX)以露出时，从在处理环己酰亚胺的0.5小时前(pre)或0.5小时后(post)处理200ng/mL的HAPLN1。指环己酰亚胺(Cycloheximide：CHX)处理24小时后，用PBS洗涤在附接有细胞的状态的平板，然后通过与EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(赛默科技)反应2小时，细胞表面蛋白被生物素(biotin)标记。用0.1M甘氨酸溶液终止反应后，收集细胞，并在NP-40裂解缓冲液(Bioworld)中提取蛋白质。使用生物素抗体和磁珠(magnetic bead)通过免疫沉淀法从提取的裂解物中仅选择性提取生物素标记的细胞表面蛋白，用所得分馏物进行蛋白质印迹法，从而确定TGF-β受体I(TβR1)、ALK1、TGF-β受体II(TβR2)和Gapdh的蛋白表达水平，结果如图5(D)所示。
如图5(D)所示，可以确认HAPLN1蛋白提高iMAC细胞表面上存在的TGF-β受体I(TβR1)蛋白的表达水平，与此同时，确认ALK1和TGF-β受体II(TβR2)的表达没有改变。
因此，可以看出HAPLN1蛋白选择性地和稳定地增加了TGF-β受体I(TβR1)蛋白。
实施例5：分析体内施用的HAPLN1蛋白改善关节炎的能力
5-1.HAPLN1蛋白在骨关节炎诱导的小鼠中改善关节软骨组织形态的能力
为了分析HAPLN1蛋白改善骨关节炎的能力，使用DMM(destabilization ofmedial meniscus)施术的骨关节炎模型作为疾病模型，该模型通过切除小鼠膝关节内侧的半月板韧带(medial meniscotibial ligament)引起骨关节炎。
将七周龄的雄性C57BL/6小鼠分为六个实验组，并进行如下处理。
-非施术正常组(非手术对照组，NC-4W)分配有6只小鼠(n＝6)，并且未进行任何治疗下饲养4周。
-模拟施术正常组(假手术组对照组，SC-4W)分配有6只小鼠(n＝6)，并且在进行模拟施术后饲养4周。
-轻度骨关节炎组(DMM 4周对照组DC-4W，)分配有6只小鼠(n＝6)，并且在DMM施术后饲养4周。
-中度骨关节炎组(DMM 8周对照组，DC-8W)分配有9只小鼠(n＝9)，在DMM施术后饲养4周，然后每周关节内(intra-articular)注射(5μL)一次PBS。
-低用量HAPLN1施用组(DMM低剂量HAPLN1，DL-8W))分配有9只小鼠(n＝9)，在DMM施术后饲养4周，然后每周关节内注射(5μL)一次稀释于PBS的0.1μg/mL的HAPLN1蛋白，维持4周。
-高用量HAPLN1施用组(DMM高剂量HAPLN1，DL-8W))分配有9只小鼠(n＝9)，在DMM施术后饲养4周，然后每周关节内注射(5μL)一次稀释于PBS的1.0μg/mL的HAPLN1蛋白，维持4周。
上述实验组的总结示于表3和图6中。
【表3】
Figure BDA0003231565130000161
饲养结束时，将要进行施术和治疗的膝盖组织取出，并用中性缓冲10％福尔马林固定(fixation)48小时然后用10％EDTA溶液进行7天的脱钙处理。随后，将每个试料包埋在石蜡中以制备石蜡块，并制备厚度为5μm的矢状切片载玻片。
为了进行关节软骨组织的形态学评估，通过番红O-固绿FCF染色法将每个组织切片载玻片可视化。使用Ni-U(尼康)显微镜和DS-Ri1(尼康)数码相机拍摄染色的组织切片来进行观察，其结果示出于图7(A)。
如图7(A)所示，已确认非施术正常组(NC-4W)和模拟施术正常组(SC-4W)的关节软骨完好无损，相反，轻度骨关节炎组(DC-4W)和中度骨关节炎组(DC-8W)中发生了关节表面的损失。另一方面，确认在低用量HAPLN1施用组(DL-8W)和高用量HAPLN1施用组(DH-8W)中，具有与正常对照组相似的关节软骨形态，并且高用量HAPLN1施用组(DH-8W)与正常对照组几乎相同。
5-2.定量评估HAPLN1蛋白改善骨关节炎的能力
为了数值化HAPLN1蛋白改善骨关节炎的能力，通过国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International：OARSI)提供的骨关节炎组织病理学评估方法(OARSI评分)对从实施例5-1获得的组织染色的载玻片进行评估。这种评估方法为数值化关节表面损伤程度、纤维化(fibrosis)和骨赘(osteophyte)的存在与否的方法，评分越高，骨关节炎的病理进展越快。
如图7(B)所示，非施术正常组(NC-4W)和模拟正常组(SC-4W)没有显示出骨关节炎的征兆，相反，确认随着从轻度骨关节炎组(DC-4W)到中度骨关节炎组(DC-8W)，骨关节炎与施术后的饲养期成比例地发展。
另一方面，确认与作为阴性对照组的中度骨关节炎组(DC-8W)相比，低用量HAPLN1施用组(DL-8W)和高用量HAPLN1施用组(DH-8W)可以抑制骨关节炎的进展或改善骨关节炎。另外，确认这种进展抑制和改善能力使中度骨关节炎组(DC-8W)的状态恢复到与轻度骨关节炎组(DC-4W)相同的水平。
因此，可以看出HAPLN1蛋白在预防、改善或治疗骨关节炎方面是有效的。

Claims (10)

1.一种用于再生软骨的药物组合物，其包括透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1：HAPLN1)作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的用于再生软骨的药物组合物，其中，所述HAPLN1促进软骨形成并保护关节软骨。
3.根据权利要求1所述的用于再生软骨的药物组合物，其中，所述HAPLN1增加TGF-β受体I蛋白来增加具有软骨形成能力的细胞并诱导软骨组织再生。
4.一种用于再生软骨的食物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
5.一种用于再生软骨的动物饲料组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
6.一种用于预防或治疗骨关节炎的药物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
7.一种用于增殖生长板软骨或用于促进骨长生长的药物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
8.一种用于治疗或预防骨长生长障碍的药物组合物，其包括HAPLN1作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述骨长生长障碍为矮小症、侏儒症、矮态症或性早熟症。
10.一种使用HAPLN1的再生软骨组织的方法，其包括：
从受试者分离软骨细胞；以及
在软骨细胞中处理HAPLN1。
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