BR112018072579B1 - Composto fenólico, composição farmacêutica, combinação do composto de fórmula i, e, usos de composto de fórmula i e de combinação - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se à química, à farmácia, e, em particular, à produção de formulações a partir de derivados de compostos fenólicos ou de compostos polifenólicos e a partir de derivados de compostos fenólicos ou de compostos polifenólicos combinados com sistemas tricíclicos do tipo benzodiazepinas fundidas em derivados de 1,4-di-hidropiridinas com ação sobre os sistemas nervoso central e vascular. estas composições farmacêuticas apresentam ação gabaérgica, antiglutamatérgica, modulara dos canais de cálcio, mitoprotetora, antioxidante, anti-inflamatória e antiapoptótica, sendo utilizáveis no tratamento de distúrbios cardiovasculares, cerebrovasculares, neurodegenerativos, neuropsiquiátricos e neurológicos.

Description

DESCRIÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à química, à farmácia e, em particular, à preparação a partir de formulações de derivados de compostos fenólicos ou de compostos polifenólicos e de derivados de compostos fenólicos ou de compostos polifenólicos combinados com sistemas tricíclicos do tipo benzodiazepina fundido em derivados de 1,4-di-hidropiridinas com ação nos sistemas nervoso central e vascular.

[002] No caso de doenças de origem multifatorial como doenças cardiovasculares, cerebrovasculares, neurodegenerativas, neuropsiquiátricas, uma medicação única não é suficiente para tratá-las efetivamente, deste modo deve ser usada uma medicação múltipla. Há duas razões principais relativas à ausência de fármacos para o tratamento destas doenças: 1) fármacos que têm como alvo um mecanismo patológico único e 2) usos de doses altas o que aumenta o risco para reações adversas.

[003] A neurodegeneração é um tema comum de muitas doenças do sistema nervoso como demência, doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP). Estas doenças são devastadoras e o manejo delas é caro, enquanto que os tratamentos atuais são inadequados. À urgência deste problema adiciona-se o fato de que a incidência destas doenças relacionadas com a idade está aumentando rapidamente devido às alterações demográficas que estão ocorrendo.

[004] O envelhecimento progressivo das populações do mundo traz consigo a consequência indesejada de um aumento em doenças neurodegenerativas e demências senis.

[005] A DP é uma doença neurodegenerativa, com sintomas de disfunção motora: movimentos lentos, rigidez, tremor em repouso e alterações no equilíbrio. À medida que a doença progride, muitos pacientes desenvolvem sintomas não motores, incluindo ansiedade, depressão, constipação e demência.

[006] Estas características são atribuídas a uma grande redução no conteúdo estriatal de dopamina e a uma perda de neurônios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta (Gauthier, 1982). Sinais clínicos de DP aparecem após a morte neuronal dopaminérgica ultrapassar um limite de 70-80% e uma perda de terminais nervosos ultrapassando 50-60% (Agid, 1991).

[007] As investigações dos mecanismos desenvolvedores da DP têm indicado que a perda de neurônios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta está relacionada com o déficit em completo I mitocondrial (Jenner 1998).

[008] Embora haja fármacos que aliviam os sintomas da doença de Parkinson, o uso crônico destes fármacos não é efetivo na prevenção da progressão da DP e tem estado associado a efeitos colaterais debilitantes. Portanto, é de grande interesse o desenvolvimento de terapias neuroprotetoras que retardam ou mesmo interrompem a progressão degenerativa.

[009] No mundo inteiro, estima-se que 46,8 milhões de pessoas vivem com demência. Estima-se que o número aumenta quase o dobro a cada 20 anos; para 74,7 milhões em 2030 e para 131,5 milhões em 2050. A demência também tem um enorme impacto econômico. Hoje, estima-se que um custo total mundial da demência é de 818 bilhões de dólares norte- americanos, e será de um trilhão de dólares norte-americanos em 2018; com um imenso impacto sobre a qualidade de vida dos pacientes e de suas famílias e seus cuidadores (“Alzheimer's Disease International, World Alzheimer Report 2015”. “London: Alzheimer's Disease International, 2015”).

[0010] De todas elas, a DA é a mais prevalecente com cerca de 35 milhões de pessoas sofrendo da doença e estima-se que sua incidência aumentará nas próximas três décadas, juntamente com o aumento na idade média da população (Reitz , C. Brayne, C. Mayeux, R. “Epidemiology of Alzheimer's disease”, Nat. Rev. Neurol., 2011, 7, 137-152) (Reitz, C., Mayeux, R. “Alzheimer disease: Epidemiology, diagnostic criteria, Risk factors and biomarkers”, Biochem, Pharmacol., 2014, 88, 640-651).

[0011] A DA, é um distúrbio neurodegenerativo do cérebro que resulta na perda de memória e de funções cognitivas que progridem lentamente; com frequência acompanhada por alterações comportamentais como agressão e depressão (Querfurth, H.W., LaFerla, F.M. “Alzheimer's disease”, N. Engl. J. Med., 2010, 362, 329-344). Em seu último estádio ela deixa o paciente na cama, incontinente e dependente de cuidado e sob tutela, o que é muito caro para os familiares. A morte ocorre, em média, 9 anos após o diagnóstico (Citron M. (2004), “Strategies for disease modification in Alzheimer's disease”, Nat. Rev. Neurosci. 5 (9): 677-85). O grande número de pessoas sofrendo desta doença e requerendo cuidado constante e outros serviços afetará severamente os recursos médicos, monetários, e humanos (Suh YH e Checler F. (2002), “Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease”, Pharmacol. Rev. 54 (3): 469-525). “Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-15 synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease.” Pharmacol. Rev. 54 (3): 469-525). Portanto, é uma preocupação médica crescente.

[0012] A isquemia cerebral é uma das causas principais de morte e a primeira desabilitadora em adultos em muitos países (Mukherjee, D., Patil, CG, 2011. “Epidemiology and the global burden of stroke”, World Neurosurg.76, S85-S90). Atualmente apenas o ativador de plasminogênio tecidual é o fármaco que está aprovado para uso em terapia humana durante a fase aguda de isquemia cerebral (Howells, D.W., Donnan, G.A., 2010. “Where will the next generation of stroke treatments come from?” PLoS Med. 7, e1000224). Não obstante os resultados pré-clínicos auspiciosos obtidos, nenhum dos candidatos avaliados tem mostrado melhorias clínicas consistentes. Isto pode ser devido à multiplicidade de mecanismos envolvidos na cascata de dano neurológico após a isquemia cerebral, o que contrasta com a visão mais simplista dos neuroproterores propostos (Minnerup, J., Schabitz, WR., 2009. “Multifunctional actions of approved and candidate stroke drugs”, Neurotherapeutics 6, 43-52). A evidência pré-clínica acumulada indica que um ligante elevadamente seletivo para um dado alvo biológico nem sempre resulta em um fármaco clinicamente efetivo, particularmente naquelas patologias envolvendo fatores múltiplos, como a isquemia cerebral. Portanto, os fármacos atuantes em um único sítio na cascata isquêmica, como os bloqueadores de Ca2+, os antagonistas de glutamato, os agonistas de GABA, os antioxidantes / sequestradores de radicais livres, os precursores de fosfolipídios, e os agentes anti-inflamatórios têm, em geral, falhado em ser clinicamente efetivos (Ginsberg, MD, 2008. “Neuroprotection for ischemic stroke: past, present and future”, Neuropharmacology 55, 363-389).

[0013] As abordagens neuroprotetoras emergentes têm começado a considerar a disfunção bioenergética mitocondrial. Há evidência para sugerir que a mitocôndria desempenha uma função importantíssima no dano neuronal isquêmico pela ativação de sinais nocivos quer por dado estrutural e funcional quer por amplificação da cascata, o que enfim resulta em morte celular (Christophe, M., Nicolas, S., 2006. “Mitochondria: a target for neuroprotective interventions in cerebral ischemia-reperfusion.” Curr. Pharm. Des. 12,739-757) (Mazzeo, AT, Beat, A., Singh, A., Bullock , MR, 2009. “The role of mitochondrial transition pore and its modulation intraumatic brain injury and delayed neurodegeneration after TBI.” Exp. Neurol. 218,363-370) (Perez-Pinzon, MA, Stetler, RA, Fiskum, G., “Mitochondrial targets for neuroprotection”, J. Cereb. Blood Flow. Metab., 32, 1362-1376). Portanto, há um interesse crescente na identificação de classes novas de compostos que atuam simultaneamente sobre determinados processos tóxicos em neurônios isquêmicos, incluindo aqueles que atuam no nível mitocondrial.

[0014] Derivados fenólicos ou polifenólicos têm sido amplamente relatados na literatura para serem usados no tratamento de doenças do sistema nervoso central, entretanto a alta solubilidade deles em água (principalmente devido aos grupos hidroxila), faz com que estes compostos tenham dificuldade para atravessarem a barreira hematoencefálica e acessem o cérebro. Os inventores têm obtido o produto (5-[(3,4-di- hidroxifenil)metilideno]-2,2-dimetil-1,3-dioxano-4,6-diona) ou KM-34:

[0015] O ácido de Meldrum (2,2-dimetil-1,3-dioxano-4,6-diona) e seus derivados têm sido usados intensivamente como materiais de partida para a síntese de muitos heterociclos, em particular para avaliar sua atividade biológica potencial.

[0016] A condensação de ácido de Meldrum com aldeídos aromáticos tem sido desenvolvida em uma solução etanólica-aquosa com a presença de catalisador por um processo fotoquímico elevadamente eficiente com o meio ambiente (Somnath Ghosh, Jhantu Das, Subhagata Chattopadhyay, “A novel light induced Knoevenagel condensation of Meldrum's acid with aromatic aldehydes in aqueous ethanol”, Tetrahedron Letters, Volume 52, Issue 22, 1 June 2011, Pages 2869-2872).

[0017] Estes derivados mostram atividade antimicrobiana. Outra série de análogos de arilideno de ácido de Meldrum (Sandhu HS et al. (2010) “Synthesis and biological evaluation of arylidene analogues of Meldrum's acid as a new class of antimalarial and antioxidant agents”, Bioorg. Med. Chem. 2010 Aug 1; 18 (15): 5626-33) foi avaliada in vitro mostrando atividades antimalárica e antioxidante, e, também, como inibidores de agregação de plaquetas (Abdelaziz El Maatougui, JhonnyAzuaje, Alberto Coelho, Ernesto Cano, Matilde Yanez, Carmen Lopez, Vicente Yaziji, Carlos Carbajales e Eddy Sotelo (4)) “Discovery and Preliminary SAR of 5- Arylidene-2,2-Dimethyl-1,3-Dioxane-4,6-Diones as Platelet Aggregation Inhibitors”, Pages 551-554 (4)).

[0018] Várias patentes protegem este tipo de compostos, e, também, o uso deles com propriedades terapêuticas. A patente ES2074770 mostra o procedimento para a preparação de derivados de 1,3-dioxano-4,6-diona.

[0019] Coinibidores de acil-CoA: colesterol-acil-transferase, baseados em 5-bis-aminometileno-1,3-dioxano-4,6-diona N,N',N'-trissubstituída, são, outrossim, mostrados na patente ES2077985 com a fórmula:

[0020] Esta invenção refere-se aos compostos químicos que apresentam um poder inibitório sobre Coenzima A: Colesterol-Acil-Transferase (ACAT). Os compostos deste tipo ajudam a reduzir a absorção de colesterol e, portanto, têm um efeito sobre aterosclerose.

[0021] JPH11180975 revela o composto de fórmula III, 2,2-dimetil-5-(4-metoxicarbonilmetiloxifenilaminometileno)-1,3-dioxano-4,6-diona, que tem uma excelente capacidade de absorção de ultravioleta, propriedades sobre a fissura da pele e baixa capacidade de absorção percutânea.

[0022] A patente US 5.217.174 protege 5-[(3,5-di-terc-butil-4- hidroxi-fenilamino)-metil-piridin-4-ilamino)-metileno]-2,2-dimetil-[3]dioxan- 4,6-diona.

[0023] Em WO200586661 são protegidos um composto, uma composição farmacêutica e o método de uso para o tratamento de distúrbios metabólicos. Neste caso é proposto o procedimento de obtenção de um produto que mostra atividade notável para o tratamento de diabetes tipo II, em cujo procedimento é obtido o intermediário de fórmula geral:

[0024] Há uma patente na literatura que se refere aos sistemas tricíclicos do tipo benzodiazepinas fundidas em derivados de 1,4-di- hidropiridina com ação sobre os sistemas nervoso central e vascular (CU2009/000172), mas esta invenção não compreende a combinação de tais derivados tricíclicos com derivados fenólicos ou polifenólicos, o que permitiria combinar ações GABAérgicas, antiglutamatérgicas, moduladoras de canal de cálcio, mitoprotetoras, antioxidantes (sequestrantes de radicais livres e quelantes de ferro), anti-inflamatórias e antiapoptóticas; que suportariam seu uso no tratamento de doenças cardiovasculares, cerebrovasculares, neurodegenerativas, neuropsiquiátricas e neurológicas, e, também, o uso de doses menores e, portanto, de efeitos colaterais mais baixos.

[0025] Como um aspecto adicional da presente invenção, o composto fenólico KM34 sob a forma livre ou sob a forma de seus sais, hidratos, formas cristalinas, metabólitos, pró-fármacos: e, também, a combinação do mesmo com um tipo tricíclico de benzodiazepina fundida em uma 1,4-di- hidropiridina: JM-20, podem funcionar como o(s) ingrediente(s) ativo(s) de formulações diferentes.

[0026] O(s) ingrediente(s) ativo(s) pode(m) ser administrado(s) misturado(s) com pelo menos um adjuvante, diluente e/ou carreador quimicamente inerte não tóxico, doravante reconhecido como excipientes incluídos nas composições farmacêuticas propostas.

[0027] As composições farmacêuticas contemplando qualquer composição líquida, sólida ou semissólida, podem ser administradas pelas rotas oral, bucofaringeana, sublingual, parenteral e.g. intramuscular, intravenosa, intradérmica ou subcutânea, tópica, transdérmica, traqueal, bronquial, nasal, pulmonar, retal ou por outras rotas de administração adequadas.

[0028] As composições farmacêuticas reveladas compreenderão os excipientes adequados para cada formulação. As formulações são preparadas em uma maneira convencional por métodos conhecidos no estado da técnica. Os excipientes são selecionados de acordo com a forma farmacêutica escolhida de acordo com a rota de administração.

[0029] O(s) ingrediente(s) ativo(s) para administração a humanos podem estar contidos em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, mas não limitadas a, tais formas de apresentação como: comprimidos (incluindo comprimidos sublinguais, revestidos e mastigáveis) cápsulas duras e moles (incluindo microcápsulas, nanopartículas e péletes), soluções (gotas orais, xaropes), soluções parenterais, emplastros transdérmicos, implantes, e outros sistemas de liberação retardada, pomadas (cremes e géis), borrifos nasais, mucoadesivos, supositórios, pós para adição ou reconstituição em alimentos, dentre outras formas de dosagem abrangidas por esta invenção.

[0030] Pela utilização de processos tecnológicos conhecidos no estado da técnica, o(s) ingrediente(s) ativo(s) pode(m) ser formulado(s) em formas de dosagem adequadas para administração por misturação dele(s) com excipientes como substâncias auxiliares líquidas, sólidas ou semissólidas, compostos orgânicos e inorgânicos, de origem natural ou sintética. Estes incluem: sólidos de enchimento, diluentes, aglutinantes, solventes, emulsificantes, lubrificantes, desintegrantes, agentes de fluidez, colorantes, pigmentos, adoçantes, intensificadores de absorção, intensificadores de penetração, tensoativos, cotensoativos, óleos especiais e/ou sistemas tamponantes, que fornecem os compostos ativos ou seus sais fisiologicamente aceitáveis com estabilidade física, química e/ou biológica.

[0031] Alguns excipientes usados na formulação das formas de dosagem contendo a(s) substância(s) ativa(s), diferentes do uso das outras substâncias auxiliares, são: amidos, lactose, celulose e seus derivados, sacarose, sorbitol, manitol e outros açúcares, talco, dióxido de silício coloidal, polivinilpirrolidona, povidonas, gelatina, lactoproteínas, citratos, tartaratos, alginatos, dextrana, etilcelulose, ciclodextrinas, elastômeros de silicone, polissorbatos, amilopectina, parabenos, óleos animais e vegetais, glicol propilênico, água estéril, álcoois mono-hídricos ou poli-hídricos como glicerol, estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearilfumarato de sódio, laurilsulfato de sódio, glicerina e ceras de poli(glicol etilênico), dentre outros.

[0032] As formas de dosagem sólidas orais, como comprimidos, microgrânulos, nanopartículas, péletes, pós para reconstituição ou cápsulas, contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) de acordo com a presente invenção podem ser de liberação imediata ou de liberação modificada.

[0033] Uma forma farmacêutica escolhida, de acordo com a presente invenção, é a dos comprimidos, contendo como o ingrediente farmacêutico ativo o(s) ingrediente(s) ativo(s), e prepara-se como uma mistura com celulose microcristalina, amido de milho, crospovidona, adiciona-se uma solução de polivinilpirrolidona e laurilsulfato de sódio para formar um granulado, este é secado para completar o processo em leito fluidizado e misturado com estearato de magnésio e talco, os comprimidos são subsequentemente preparados usando um sistema de perfuradores rotativos para a fabricação deles, finalmente os comprimidos são revestidos com uma suspensão de hidroxipropilmetilcelulose, poli(glicol etilênico) 4000, dióxido de titânio e colorante.

[0034] Pelo revestimento dos comprimidos é alcançada elegância na forma finalizada e é evitado sabor desagradável, isto é conseguido com um agente mascarador de sabor, como um copolímero de ácido metilacrílico, etilceluloses, metil-hidroxipropilcelulose ou outros polímeros. Os comprimidos podem ser obtidos quer pelo método de granulação úmida descrito acima quer pelo método de compressão direta usando excipientes para a compressão direta e diminuindo as etapas na etapa de obtenção dos comprimidos sempre que se trabalhe com doses baixas.

[0035] Os comprimidos podem ser de liberação modificada e podem conter o(s) ingrediente(s) ativo(s) em microgrânulos, nanopartículas ou sistemas matriciais, usando excipientes como: poli(óxido de etileno), hidroxipropilmetilcelulose 2910, estearato de magnésio, cloreto de sódio, óxido férrico vermelho, acetato de celulose, poli(glicol etilênico) 3350 e Opadry®.

[0036] As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem conter polímeros farmaceuticamente aceitáveis, permeáveis, biodegradáveis e insolúveis em água para controlar o perfil de liberação delas, pelo qual podem ser obtidas formas de dosagem de liberação modificada (imediata, retardada ou controlada). Estes polímeros podem ser usados no revestimento de comprimidos, microgrânulos, cápsulas, na preparação de nanopartículas, como matrizes de liberação em péletes, comprimidos,grânulos ou como mistura com outros excipientes incluídos em qualquer outra forma de dosagem mencionada na presente invenção.

[0037] Para a administração oral, outras composições farmacêuticas adequadas são cápsulas duras, cápsulas moles e pós farmacêuticos, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser dosado(s) sob a forma de cápsulas duras de celulose ou de gelatina, por exemplo, contendo uma mistura do ingrediente farmacêutico ativo com excipientes comumente usados em formas sólidas como descritas para comprimidos, a dita mistura pode ser obtida por via seca, granulação úmida, extrusão, peletização, microencapsulação, ou por dosificação de microtabs. Dosificação em cápsulas moles de gelatina utilizará métodos convencionais de preparação e podem ser preparadas pela misturação do(s) ingrediente(s) ativo(s) com óleos vegetais, gorduras ou outros veículos similares adequados para formulação.

[0038] No caso de pós farmacêuticos, estes podem ser preparados por misturação simples dos ingredientes ativos fisiologicamente aceitáveis com enchimentos, agentes suspensores, adoçantes, flavorizantes e conservantes. Embora na presente invenção utiliza-se, também, na preparação de pós, a metodologia de secagem por atomização a uma temperatura de entrada entre 100°C e 150°C e a uma temperatura de saída entre 50°C e 90°C, usando excipientes como dextrana, poli(glicol etilênico) 4000 e laurilsulfato de sódio, dentre outros, para melhorar a solubilidade do ingrediente farmacêutico ativo como uma função de sua adequada incorporação no organismo em soluções, ou adicionando-o em alimentos como sucos.

[0039] Para a administração retal, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser dosado(s) sob a forma de supositórios, espumas ou solução retal em microenemas, que podem conter uma mistura dos compostos ativos com uma base de gordura sólida neutra (Witepsol 45) ou um outro carreador similar para formulação, também podem ser utilizados mono-oleato de sorbitano polissorbato 20, cera emulsificante, sílica coloidal anidra, metabissulfito de sódio, edetato de sódio, para- hidroxibenzoato de metila, fosfatos de sódio, macrogol 300, glicerol, água, propano, isobutano e n-butano.

[0040] Para administração oral líquida, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser formulado(s) como xaropes, elixires, gotas concentradas ou suspensões, tendo um carreador farmaceuticamente aceitável como uma mistura de etanol, água, glicerol, glicol propilênico e/ou poli(glicol etilênico), dentre outros, carboximetilcelulose ou outros agentes espessantes, podem conter colorantes, flavorizantes, adoçantes (sucralose, aspartame, ciclamato, stevia), conservantes (parabenos, benzoatos). Estas formas de dosagem líquidas podem ser preparadas a partir da reconstituição das composições farmacêuticas em pó com um solvente adequado antes do uso.

[0041] Para a administração parenteral, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser formulado(s) como soluções injetáveis. Tais soluções podem conter ingredientes estabilizantes, conservantes e/ou ingredientes tamponantes. Na presente invenção o ingrediente farmacêutico ativo está em uma solução de 96% de etanol, álcool benzílico, glicol propilênico, ácido benzoico, benzoato de sódio, hidróxido de sódio, água para injeção, outros excipientes como poli(glicol etilênico) 400, citrato de sódio e ácido cítrico. As soluções para a administração parenteral contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) também ser preparadas pela reconstituição de uma composição farmacêutica seca (liofilizada) com um solvente adequado antes do uso compreendendo a utilização de substâncias auxiliares como manitol, polissorbato 80, cloreto de sódio, dentre outras.

[0042] Para administração subdérmica, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser dosado(s) sob a forma de implantes usando auxiliares elastoméricos como silicone e sílica coloidal anidra, embora outros polímeros de uso farmacêutico podem ser utilizados para a preparação do pélete.

[0043] Para administração transdérmica, o(s) ingrediente(s) ativo(s) fisiologicamente aceitável(eis) pode(m) ser formulado(s) como emplastros, em cujo caso o ingrediente farmacêutico ativo está contido em um carreador consistindo em uma solução de copolímero acrílico, etanol, parafina líquida leve, palmitato de isopropila, poli(tereftalato de etileno), copolímero de etileno-acetato de vinila e uma camada de silicone sobre o lado interno da lâmina de liberação (com uma taxa de liberação nominal de 15 mg/dia, sobre uma superfície de 12,75 cm2).

EXEMPLOS Exemplo 1. Síntese de 5-(3,4-di-hidroxi-benzilideno)-2,2-dimetil-1,3- dioxan-4,6-diona

[0044] Quantidades equimolares de 3,4-di-hidroxibenzaldeído e de ácido de Meldrum são misturadas em um balão equipado com agitação magnética usando água desionizada como o solvente na proporção de 1-2 L por mol de reagentes. A mistura de reação é agitada durante cerca de 3-5 horas. Após este tempo é obtido um precipitado amarelo que é coletado por filtração, lavado três a cinco vezes com água e deixado em um dessecador. A reação é monitorada por cromatografia em camada fina (gel de sílica) usando n-hexano:acetato de etila (1:1) como a fase móvel. Tempo de reação (3-5h); Rendimento > 75%; Temperatura de fusão: 154-157°C (não corrigida).PREPARAÇÃO DE FÓRMULAS DIFERENTES (a partir de derivados de compostos fenólicos ou polifenólicos e a partir de derivados de compostos fenólicos ou polifenólicos combinados com sistemas tricíclicos do tipo benzodiazepinas fundidas em derivados de 1,4-di-hidropiridinas) PARA AVALIAÇÕES BIOLÓGICAS.

Exemplo 2. Preparação de uma formulação em forma de pó para suspensão contendo o KM-34 como o ingrediente farmacêutico ativo.

[0045] Cada colher de chá (5 mL) de pó de KM-34 para suspensão contém:

[0046] Descrição breve do processo tecnológico:• Passar por moinho de alta velocidade a sacarina sódica e a sacarose, passar por peneira de número de malhas “mesh” de 20 o ingrediente ativo, o pó de sabor de menta e o óxido de magnésio pesado, e passar por peneira de número de malhas “mesh” de 60 o pó de sabor de morango.

[0047] • Pesar as quantidades das matérias-primas de acordo com a formulação descrita.• Misturar durante 10 minutos no misturador Vanguard V-5.• Coletar o produto misturado em tanques com saco de náilon duplo.• Transferir o produto para a máquina enchedora-tampadora e envazar 5 gramas do produto em fracos âmbar de 60 mL.

Exemplo 3. Preparação de uma formulação de comprimido contendo o KM-34 como o ingrediente farmacêutico ativo.

[0048] Cada comprimido de 120,00 mg contém:

[0049] Descrição breve do processo tecnológico: 1. Peneirar o ingrediente ativo, o amido e a lactose em peneira de número de malhas “mesh” de 20.

[0050] 2. Pesar todos os componentes da formulação de acordo com as quantidades mencionadas na fórmula. 3. Para preparar a solução de aglutinante, derramar a mistura de água e álcool etílico de classe C em um tacho com uma camisa de vapor, adicionar a polivinilpirrolidona e agitar até dissolução completa. 4. Carregar o misturador com o ingrediente ativo, o amido e a lactose (componentes da fase interna). Misturar durante 15 min. 5. Adicionar lentamente a solução de aglutinante usando a bomba peristáltica, completar o grau requerido de umectação usando a água e o álcool etílico de classe C (1:1) se necessário. Granular em moinho à velocidade baixa. 6. Secar o granulado em um leito fluidizado. Aos 10 min retirar uma amostra representativa do granulado, desgranular e verificar o teor de umidade residual do mesmo. O valor do dito teor de umidade deve estar entre 0,8% e 1,2%. 7. Misturar os grânulos secos com os lubrificantes durante 10 min. 8. Comprimir em uma máquina rotativa de alta velocidade usando troquéis planos, biselados e ranhurados de 1/4 polegada (1/4 PBR) (0,64 cm), ajustando o cortador do troquel para obter comprimidos com os seguintes parâmetros: Massa: 120,0 mg ± 10%, Altura: 2,6 mm ± 0,10 mm, Dureza: 4,0 kgf ± 1 kgf, Friabilidade: menor que 1%.

Exemplo 4: Preparação de uma formulação na forma injetável contendo o KM-34 como o ingrediente farmacêutico ativo.

[0051] Cada bulbo (2 mL) de KM 32 contém:

[0052] Verificar se o reator está completamente seco após a esterilização, caso contrário, enxaguá-lo com álcool desidratado.

[0053] 1. Preparar uma solução de ácido clorídrico 1 N para ajuste do pH. 9. Adicionar uma porção de Cremofor ELP e de álcool desidratado ao reator. Misturar a 420 rpm. 10. Pesar o ingrediente ativo e adicionar as porções de álcool desidratado ao béquer contendo-o, dispersá-lo com o agitador de vidro e adicioná-lo ao reator, repetir esta operação até que todo o ingrediente ativo seja extraído e o álcool desidratado seja esgotado. 11. No reator manter a agitação durante 60 min a 420 rpm até que dissolução total do ingrediente ativo seja alcançada. 12. Adicionar o resto de Cremofor ELP arrastando o restante com álcool desidratado, agitando durante 10 min a 420 rpm. 13. Determinar o pH da solução e ajustar com solução de ácido clorídrico 1N para pH entre 5,0 e 6,0. 14. Completar o volume da solução pela adição de álcool desidratado. Agitar durante 5 minutos a 420 rpm. 15. Coletar 10 mL da solução e enviá-los para o laboratório para o controle de processo (titulação e pH). 16. Verificar a montagem apropriada dos sistemas de enchimento e de nitrogenação. 17. Realizar o teste de integridade do filtro Sartobran P MidiCaps, de porosidade de 0,45 μm ± 0,2 μm, com álcool desidratado. 18. Após o término do processo de controle, pressurizar o reator usando nitrogênio (0,7-1,0 bar, 70-100 kPa) para passar a solução através do filtro com cartucho Sartobran P de porosidade de 0,45 μm ± 0,2 μm. Encher os bulbos com 2,2 mL de solução e vedar os bulbos.

Exemplo 5. Preparação de uma formulação de comprimido contendo a combinação de KM-34 e JM-20 como os ingredientes farmacêuticos ativos.

[0054] Cada comprimido de 120,00 mg contém:

[0055] Descrição breve do processo tecnológico:1. Peneirar em peneira de número de malhas “mesh” de 20 os ingredientes ativos, o amido e a lactose.

[0056] 2. Pesar todos os componentes da formulação de acordo com as quantidades mencionadas na fórmula. 3. Para preparar a solução de aglutinante, derramar a mistura de água e álcool etílico de classe C em um tacho com uma camisa de vapor, adicionar a polivinilpirrolidona e agitar até dissolução completa. 4. Carregar a mistura com o ingrediente ativo, o amido e a lactose (componentes da fase interna). Misturar durante 15 min. 5. Adicionar lentamente a solução de aglutinante usando a bomba peristáltica, completar o grau requerido de umectação usando a água e o álcool etílico de classe C (1:1) se necessário. Granular em moinho à velocidade baixa. 6. Secar o granulado em um leito fluidizado. Aos 10 min retirar uma amostra representativa do granulado, desgranular e verificar o teor de umidade residual do mesmo. O valor do dito teor de umidade deve estar entre 0,8% e 1,2%. 7. Misturar os grânulos secos com os lubrificantes durante 10 min. 8. Comprimir em uma máquina rotativa de alta velocidade usando troquéis planos, biselados e ranhurados de 1/4 polegada (1/4 PBR) (0,64 cm), ajustando o cortador do troquel para obter comprimidos com os seguintes parâmetros: Massa: 120,0 mg ± 10%, Altura: 2,6 mm ± 0,10 mm, Dureza: 4,0 kgf ± 1 kgf, Friabilidade: menor que 1%.

Exemplo 6. Preparação de uma formulação na forma de gotas orais contendo a combinação de KM-34 e JM-20 como os ingredientes farmacêuticos ativos.

[0057] Cada mL (20 gotas) contém:

[0058] Descrição breve do processo tecnológico:1. Medir o pH e a condutividade da água purificada no momento da fabricação do produto.

[0059] 2. Derramar o glicol propilênico dentro do reator. 3. Em um vaso de aço inoxidável auxiliar apropriado, dissolver a sacarina sódica em água purificada. 4. Adicionar o Kollidon 25, aspergindo-o gradualmente, e agitar durante um tempo não menor que 30 minutos até dispersão total. 5. Agitar e aplicar calor à preparação, mantendo a temperatura entre 40°C e 50°C, durante 30 minutos. 6. Adicionar os ingredientes ativos à mistura resultante da etapa anterior, em porções pequenas, mantendo a agitação constante durante 30 minutos. 7. Remover o calor e esperar que a preparação alcance a temperatura ambiente, 30°C ± 2°C. 8. Dissolver o metilparabeno e o propilparabeno no álcool etílico classe C em um vaso de vidro ou de aço inoxidável auxiliar, agitando continuamente até dissolução completa. 9. Adicionar à mistura resultante da etapa prévia o líquido de sabor de morango solúvel e agitar até completamente homogêneo. 10. Adicionar a mistura resultante da etapa prévia ao tanque do reator, lentamente, com agitação forte e constante. 11. Em um recipiente de vidro ou de aço inoxidável de capacidade apropriada, dissolver ácido cítrico e citrato de sódio di-hidrato em água purificada, agitando cada adição até completamente dissolvido. 12. Adicionar a mistura resultante da etapa prévia ao tanque do reator, lentamente, com agitação forte e constante. 13. Em um vaso de vidro ou de aço inoxidável de capacidade adequada, dissolver o vermelho de ponceaux em água purificada, agitando até completamente dissolvido e adicionar à preparação. 14. Completar para o volume predeterminado com água purificada. Agitar para homogeneizar. 15. Verificar se o pH está mantido na faixa de 4,0-6,0. 16. Realizar a filtração final, verificar as características organolépticas. 17. Envazar a preparação final em frascos âmbar de 15 mL com 15,0 mL ± 1,0 mL da solução, vedá-los apropriadamente, usando tampas com redutores gotejadores para produto oleoso.

Exemplo 7. Preparação de uma formulação na forma injetável contendo a combinação de KM-34 e JM-20 como os ingredientes farmacêuticos ativos.

[0060] Cada bulbo (2 mL) contém:

[0061] Verificar se o reator está completamente seco após a esterilização, caso contrário, enxaguá-lo com álcool desidratado.

[0062] 1. Preparar uma solução de ácido clorídrico 1N para ajuste do pH. 2. Adicionar uma porção de Cremofor ELP e de álcool desidratado ao reator. Misturar a 420 rpm. 3. Pesar o ingrediente ativos e adicionar porções de álcool desidratado ao béquer contendo-os, dispersá-los com o agitador de vidro e adicionar a mistura ao reator, repetir esta operação até que todos os ingredientes ativos tenham sido drenados e todo o álcool desidratado tenha sido esgotado. 4. No reator manter a agitação a 60 min a 420 rpm até alcançar dissolução total dos ingredientes ativos. 5. Adicionar o resto do Cremofor ELP pelo arraste do restante com álcool desidratado, agitando durante 10 min a 420 rpm. 6. Determinar o pH da solução e ajustá-lo com a solução de ácido clorídrico 1N para pH entre 5,0 e 6,0. 7. Completar o volume da solução pela adição de álcool desidratado. Agitar durante 5 minutos a 420 rpm. 8. Coletar 10 mL da solução e enviá-los para o laboratório de controle de processo (titulação e pH) 9. Verificar a montagem apropriada dos sistemas de enchimento e de nitrogenação. 10. Realizar o teste de integridade do filtro Sartobran P MidiCaps, de porosidade de 0,45 μm ± 0,2 μm, com álcool desidratado. 11. Após o término do processo de controle, pressurizar o reator usando nitrogênio (0,7-1,0 bar, 70-100 kPa) para passar a solução através do filtro com cartucho Sartobran P de porosidade de 0,45 μm ± 0,2 μm. Encher os bulbos com 2,2 mL de solução e vedar os bulbos.

TESTES DE REALIZAÇÃO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA Exemplo 8. Atividade antioxidante do KM-34 Capacidade do KM-34 para reduzir radicais DPPH.

[0063] Um dos métodos mais comumente usados para estimar a atividade antioxidante é avaliar a capacidade de compostos diferentes para reduzir radicais DPPH (2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazyl, 2,2-difenil-1-picril- hidrazila), que pode ser determinada espectrofotometricamente (BrandWilliams et al., 1995). DPPH é um radical livre estável devido à deslocalização de elétrons e- disponíveis ao longo da molécula inteira, demonstrando que as moléculas não se dimerizam. A deslocalização de elétrons causa a coloração violeta intensa da forma radicalar DPPH quando ela é preparada em solução etanólica (Molyneux et al., 2004).

[0064] Os resultados do efeito de KM-34 (5-400 μM) sobre os radicais DPPH são mostrados na Figura 1. Na mesma pode ser observado que a redução % do radical é diretamente proporcional ao aumento das concentrações de KM-34; em concentrações maiores que 5 μM, e após 30 minutos de reação, a inibição % significativa (p <0,05) do radical DPPH foi observada com relação ao veículo. Em concentrações maiores que 50 μM, o alcançou sua resposta máxima. O valor de IC50 obtido para KM-34 foi aproximadamente 2,4 vezes mais baixo que aquele obtido para ácido ascórbico (AA) usado como o composto de referência.

[0065] Devido à sua natureza aromática, este composto di-hidroxilado (KM-34) comporta-se como um excelente doador de elétrons (Vermerris e Nicholson, 2006) por conjugação eletrônica (Merchán et al., 1981). O valor de IC50 do KM-34 (16,26μM) mais baixo do que o do AA (Ácido Ascórbico) (38,70μM) demonstra o poder antioxidante forte desta molécula. O fato de que a presença de grupos fenólicos concede propriedades antioxidantes (Fraga, 2007), permite representar o efeito deste polifenol (AH) na seguinte maneira:

[0066] A estabilidade do radical formado pela ação de KM-34 é uma condição essencial para a sua atividade antioxidante. A carga negativa está deslocalizada no sistema aromático, o que causa uma estabilidade iônica notável (Merchán et al., 1981).

Atividade do KM-34 como agente sequestrante de radicais (K- no teste com pirogalol.

[0067] Um sistema não enzimático gerador destes radicais foi usado para avaliar a atividade do KM-34 como agente sequestrante de Of-, que catalisa a auto-oxidação de pirogalol, formando um composto colorido que absorve a 420 nm (Marklund, 1985). Conforme mostrado na Figura 2, as concentrações de KM-34 maiores que 5 μM significativamente inibiram (para p <0,05) a formação da forma oxidada de pirogalol com relação ao veículo, o valor de IC50 foi de 11,04 μM. A partir de 50 μM, a oxidação de pirogalol foi totalmente inibida. Os resultados deste teste confirmam o fato de que o KM- 34 é um potente agente sequestrante de radicais O2", responsáveis pelas reações de propagação que aceleram a formação da forma oxidada de pirogalol. Sob condições fisiológicas de superprodução e depleção de seus agentes sequestrantes, O2‘ pode interagir com os grupos sulfidrila de proteínas e de enzimas vizinhas causando a inativação delas e iniciando uma cascata de eventos oxidativos, principalmente mediante a reação de Fenton- Habber-Weiss. Também pode mobilizar o ferro das reservas de ferritina intracelular (Brent e Rumack, 1993). Este di-hidroxifenol (KM-34) poderia evitar o dano causado por O2« e a formação de «OH, mais reativo.

Efeito protetor do KM-34 sobre a degradação de 2-desoxi-D-ribose.

[0068] Para avaliar a ação protetora do KM-34 sobre a degradação oxidativa de DR (produto do efeito dos radicais •OH), foram considerados os resultados mostrados nos gráficos (A e B) correspondendo às concentrações de DR de 2,8 mM e de 28 mM respectivamente. Em ambos os casos, os resultados significativos (*P <0,05 com relação ao controle negativo) são observados em concentrações de KM-34 maiores que 10 μM.

[0069] O processo de formação de radicais •OH, e, também, o dano causado em DR, ocorrem mediante as seguintes reações (Pardo et al., 2006): Fe3+-EDTA + ascorbato → Fe2+-EDTA + ascorbila (1)

[0070] Fe2+-EDTA + O2↔ Fe3+-EDTA + O2•- (2) 2O2 + 2H + Fe2+-EDTA → H2O2 + O2 (3) H2O2 + Fe3+-EDTA → OH- + •OH (4) •OH + 2-DR → produto de degradação (MDA) (5).

[0071] Nesta maneira, podemos entender os níveis nos quais o KM-34 poderia atuar, que demonstraram a inibição da formação do produto principal de degradação da DR, o MDA (MalonDiAldeído) (espectrofotometricamente monitorado a 532 nm) em valores entre 10 μM e 100 μM independentemente das concentrações de DR usadas. Embora os estudos prévios demonstrassem a capacidade de redução do KM-34 sobre os radicais DPPH e O2«-, que poderia, também, ser previsto para o radical •OH, este ensaio sugere que naqueles sistemas nos quais a produção de ROS (Reactive Oxygen Species) é mediada por ferro, a atividade antioxidante do KN-34 poderia estar dirigida principalmente para a prevenção da formação destas espécies por coordenação do metal, sem descartar o sequestro direto das mesmas (Pardo et al., 2006). Este composto apresenta em sua estrutura um grupo catecol, grupos cetônicos e insaturações que podem contribuir para a atividade antioxidante pela ligação ao ferro (Perron e Brumaghim, 2009). Entretanto, por um lado, a alta constante de formação do complexo de Fe3+-EDTA (logK = 25,5) pode, em alguma extensão, prevenir que o KM-34 se desloque para este último, a constante de formação do complexo de Fe2+-EDTA é aproximadamente a metade da constante de formação do complexo de Fe3+- EDTA e pode ser suficiente para permitir que o KM-34 estimule a auto- oxidação de Fe2+ (Pardo et al., 2006), evitando que este metal participe nas reações de Fenton-Habber-Weiss. Por outro lado, testes experimentais realizados no LSO demonstram a interação do KM-34 com H2O2, resultando na formação de epóxidos estáveis (resultados não publicados). Isto pode explicar outro modo de inibição da reação de Fenton pelo KM-34.

Evidência espectrofotométrica de interações entre KM-34 e Fe2+.

[0072] Com a finalidade de verificar a existência de possíveis interações entre KM-34 e Fe2+ (mediante modificações em seus espectros), os seguintes resultados foram obtidos: Nos resultados experimentais mostrados pelo gráfico (Figura 4), pode ser visto que a absorbância do KM-34 na absorção máxima predeterminada a 262 nm, 345 nm e 472 nm, respectivamente, é modificada quando aumenta a concentração do íon ferroso. Isto poderia indicar possíveis interações entre Fe2+ e KM-34 onde o íon é estabilizado no estado de Fe3+ pelos ligantes insaturados devido à estabilização do campo cristalino maior a partir de uma configuração eletrônica d6 (Fe2+) para uma configuração eletrônica d5 (Fe3+) (Hider et al., 1981, Hider et al., 1983). Isto justifica a resposta obtida no teste de degradação oxidativa de DR onde foi observado que o KM-34 nestas condições parece atuar como um ligante coordenador de Fe2+ do que como um sequestrante de •OH. Este resultado seria muito bom se considerássemos que o Fe2+ participa ativamente no processo que produz ERO (Espécies Reativas de Oxigênio) como a reação de Fenton-Habber-Weiss (Pardo, 2007), se o KM-34 pudesse manter controlado o íon por sua quelação, o risco para a formação de ROS (Reactive Oxygen Species) seria menor.

Efeitos do KM-34 sobre a POL espontânea ou induzida por Fe3+/AA em homogeneizado de cérebro de rato.

[0073] O homogeneizado de cérebro é rico em fosfolipídios, que experimentam auto-oxidação espontânea ou induzida pela presença de FeCl3 e AA, onde o último é oxidado na presença do metal que é reduzido e, por conseguinte, o íon está disponível para catalisar a reação de Fenton-Habber- Weiss (Hiroi et al., 2005; Kooncumchoo, 2005). Os efeitos do KM-34 sobre estes processos são mostrados na Figura 5. O composto significativamente inibiu (p<0,05) a POL (PerOxidação Lipídica) espontânea e induzida pela mistura de Fe3+/AA em concentrações mais altas que 0,1 μM e 10 μM respectivamente com relação à reação não inibida.

[0074] A POL tem sido reconhecida, nas últimas 3 décadas, como um evento de grande importância, do ponto de vista tanto fisiológico quanto patofisiológico. O aumento da POL é considerado como uma causa importante e essencial da iniciação de EO relacionado com o dano em vários tecidos, morte celular e a progressão adicional de muitas doenças agudas e crônicas. O MDA (MalonDiAldeído), em concentrações altas, considerado como tóxico e mutagênico e os hidroxialquinos (HAL) são produtos terminais e marcadores da POL (Leon, 2010). Os resultados previamente relatados indicam que o KM-34 é capaz de inibir este processo oxidativo espontâneo evitando a formação de MDA em concentrações mais altas que 0,1μM. Isto é, de fato, o que é previsto, um aspecto que é adicionalmente reforçado quando a capacidade potente deste polifenol para sequestrar RL (Radicais Livres) como o DPPH e o O2* tem sido demonstrada e leva-nos a acreditar que o KM-34 poderia capturar outro RL gerado usando a POL como as lipoperoxilas (LOO*) e as alcoxilas (LO*), comportando-se como um antioxidante quebrador de cadeias. Para o caso da POL catalisada pela mistura de Fe3+/AA (100 mM), embora a inibição possa parecer menos notável (a partir de 10 μM de KM-34), também são resultados significativos se se considera que o processo oxidativo é maior. O AA reduz Fe3+ para Fe2+, um estado no qual ele pode participar na formação de radicais •OH mediante a reação química de Fenton-Habber-Weiss. Estes radicais são capazes de remover um átomo de hidrogênio de um ácido graxo poli-insaturado (LH) e iniciar o dano oxidativo (Hiroi et al., 2005; Kooncumchoo, 2005). Os resultados neste caso sugerem que em adição ao sequestro direto de RL formado, poderia haver a interação entre o KM-34 e o ferro, prevenindo, assim, que este participe nos estágios de iniciação e propagação de peroxidação, mantendo-o complexado sob uma forma inativa a partir do ponto de vista redox.

Efeitos protetores do KM-34 contra a ação de L-glutamato.

[0075] O processo de excitotoxicidade é definido como o dano neuronal causado pela ativação excessiva de receptores glutamatérgicos. A entrada de altos níveis de Ca2+ após a ativação dos receptores estimula a ativação de enzimas como Óxido-Nítrico-Sintase (NOS, Nitric Oxide Synthase), que gera ERN/ERO (Espécies Reativas de Nitrogênio)/(Espécies Reativas de Oxigênio) em concentrações altas resultando em morte celular (Nakamura e Lipton, 2010; Yang et al. [Links] [Texto em Espanhol] Torregrosa G, et al., 2009). Os níveis altos de glutamato ou de outros aminoácidos excitatórios estão envolvidos na captação de cisteína (essencial para a síntese de antioxidantes como a SOD (SuperÓxido-Dismutase), o que decresce as defesas antioxidantes de neurônios contra os processos oxidativos (Emerit et al., 2004).

[0076] Os resultados obtidos em modelos múltiplos de excitotoxicidade indicam que o glutamato significativamente inibe (P <0,01) a viabilidade celular, a identificação de alterações (microscópicas) morfológicas celulares na presença deste NT (Yang et al., 2010). Neste sentido, a Figura 6 mostra os resultados obtidos do experimento desenvolvido com 50 mM de L-glutamato para demonstrar o efeito citoprotetor do KM-34. Este composto, em concentrações maiores que 0,01 μM e na presença de L- glutamato, inibe significativamente (P <0,01) o dano celular com relação ao controle negativo. Em valores acima de 1 μM de KM-34, a resposta de citoproteção é maior que 80%.

[0077] A produção alta de ERN/ERO é um dos mecanismos que medeia o processo de excitoxicidade celular realizado pelas concentrações altas de glutamato (Yang et al., 2010). Estudos prévios demonstraram a capacidade do KM-34 para capturar RL, os resultados obtidos neste teste sendo outro exemplo disto, onde o KM-34 poderia capturar ERN/ERO evitando os danos que estes causam durante a excitotoxicidade. Outros mecanismos propostos para responder à alta capacidade citoprotetora mostrada pelo KM-34 e que têm sido descritos para outros tipos de polifenóis são a possível ativação de enzimas antioxidantes e, outrossim, a inibição de NADPH-oxidase, que fortemente favorece os processos oxidativos (Kovacsova et al., 2010).

Efeito citoprotetor do KM-34 contra o dano produzido por H2O2.

[0078] O H2O2 é formado in vivo espontânea ou enzimaticamente. Em concentrações baixas este pode ser muito pouco reativo, entretanto, em concentrações altas pode interagir com, e gerar inativação dos sistemas geradores de energia das células. Além disso, o H2O2 é capaz de oxidar os grupos -SH de proteínas e causar ruptura das fitas de DNA. O seu efeito mais danoso é a formação de metais de transição catalisador pela reação de Fenton- Habber-Weiss (Martinez, 2005). Esta é baseada no uso de H2O2 neste teste, que almeja observar se o KM-34 é capaz de reverter os danos causados pelo agente químico. A Figura 7 mostra os resultados obtidos, mostrando que em concentrações de KM-34 maiores que 5 μM obtiveram-se efeitos significativos de sobrevivência celular, alcançando valores de resposta maiores que 50% a partir de 25 μM de KM-34.

[0079] Vários resultados experimentais indicam claramente que o H2O2 é um mediador de múltiplos eventos fisiológicos e seu excesso resultaria em múltiplas condições patológicas (Leon, 2010). Esta espécie química pode estar envolvida na formação de outras ROS, aumentando, por conseguinte, seu efeito nocivo, fazendo com que compostos antioxidantes como KM-34 desempenhem uma função muito importante no controle de danos. Os resultados obtidos durante este teste demonstram isto, visto que em concentrações mais altas que 5 μM o KM-34 aumentou a viabilidade celular das células PC12 expostas a 150 μM de H2O2. Em concentrações mais altas que 50 μM, a sobrevivência celular % está próxima de 90%.

[0080] A captação de RL pode ser o mecanismo fundamental pelo qual KM-34 exerce seu efeito protetor neste modelo, demonstrando, uma vez mais, que o KM-34 é potencial redutor contra espécies radicais como Of- geradas a partir de H2O2. Considerando-se a interação entre KM-34 e H2O2 (resultado discutido no teste de DR), a inibição da reação de Fenton-Habber- Weiss pelo KM-34 poderia ser explicada, adicionalmente aos danos causados pelo próprio H2O2.

Efeito protetor do KM-34 contra o dano induzido por FeSO4/AA.

[0081] O sistema FeSO4/AA é um catalisador forte de reações oxidativas em células como as células PC12 acarretando a morte delas (Hiroi et al., 2005; Núnez et al., 2011). O KM-34 na presença deste sistema pró- oxidante mostrou efeito citoprotetores em concentrações maiores que 0,001 μM. Em concentrações maiores que 1 μM, a sobrevivência celular % foi maior que 90% (Figura 8).

[0082] Estes resultados demonstram a capacidade protetora potente do KM-34, que em concentrações entre 0,01 μM e 10 μM alcança a sobrevivência de 90 das 100 células sob condições oxidantes. Estes resultados confirmam que o KM-34 poderia atuar por vários mecanismos que reforçam suas propriedades antioxidantes. Estas podem ser captação de RL e quelação de ferro, já mencionadas várias vezes e com base nas características estruturais (grupos cromóforos) presentes no KM-34. Por um lado, este composto poderia reduzir os RL gerados na reação de Fenton-Habber-Weiss, porque os compostos fenólicos comportam-se como excelentes doadores de elétrons (Vermerris e Nicholson, 2006). Por outro lado, a quelação de metais como ferro mediante os grupos catecol e as insaturações presentes na molécula (Perron e Brumaghim, 2009) adicionalmente à inativação de H2O2, poderia evitar a catálise da reação mencionada. Se, após a coordenação do metal, este permanecesse cataliticamente ativo, o radical formar-se-ia na vizinhança do polifenol e seria imediatamente sequestrado. Um número crescente de estudos mostra que a interação catecólica de metal-polifenol aumenta a capacidade antioxidante e citoprotetoras do último (polifenol), principalmente porque um novo centro redox imita as enzimas antioxidantes como a SOD (Pardo, 2007; Núnez et al., 2011).

[0083] O fato de que o KM-34 oferece efeitos citoprotetores em concentrações tão baixas quanto o, e mesmo próximas do, valor de proteção total, sugere que este composto poderia, também, atuar por outros mecanismos moleculares mais eficientes como a modulação da expressão gênica proposta para outros agentes quelantes com propriedades antioxidantes como DFO (DesFerriOxamina), que inibe a ativação de NF-KB (Nuclear factor-KB, fator nuclear kappa-B) e estabiliza a HIF-1α (proteína Hipóxia- 1alfa), intensificando, assim, as respostas de sobrevivência celular (Kooncumchoo, 2005; Harten et al., 2010). Se este último mecanismo pudesse ser apropriadamente comprovado para o KM-34, seria de grande relevância para a utilização deste polifenol em sistemas in vivo, considerando que o efeito antioxidante baseado apenas no sequestro de espécies reativas, poderia não ser suficiente para prevenir o dano oxidativo em concentrações altas de biomoléculas celulares (Halliwell et al., 1991). Os níveis de ferro com capacidade catalítica na formação de ERO (ligada a citrato, ATP e outras moléculas de massa molecular baixa), mesmo em situações de acúmulos anormais de ferro, dificilmente ultrapassaria 1-2 μM, concentrações nas quais o ferro pode ser quelável pelos polifenóis (Halliwell et al., 1991).

[0084] Considerando os resultados obtidos, não seria utópico pensar em estudos mais aprofundados com a finalidade da implementação futura deste composto na terapia de processos patológicos relacionados à sobrecarga de ferro e ao estresse oxidativo como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica, a isquemia, dentre outras.

EXEMPLO 9. ATIVIDADE ANTIPARKINSONIANA DO KM-34

[0085] Com o propósito de realizar a desnervação dopaminérgica unilateral do corpo estriado (hemisfério direito), os ratos foram anestesiados com Cloral Hidrato [0,4 g/kg de peso corporal, ip, Merck (Darmstadt, Alemanha)] e posicionados em uma mesa cirúrgica projetada para cirurgia estereotáxica (Stoelting Instruments, EUA), injetando a neurotoxina 6- OHDA-HBr (6-Hidroxidopamina-HBr) (8 μg/3 μL de solução salina para dentro da substância nigra pars compacta direita), que também continha 0,2 mg/mL de ácido ascórbico como antioxidante). As coordenadas foram calculadas usando o ponto de referência de Bregma de acordo com o atlas de Paxinos e Watson: AP: -4,4 mm; ML: 1,2 mm; DV: 7,8 mm e Barra Incisiva: -2,4 mm abaixo da linha interaural. Logo que no lugar, a neurotoxina foi injetada lentamente, em uma taxa de fluxo de 1 μL/min, com uma seringa Hamilton (5 μL), que havia sido mantida in situ durante 5 min após a injeção ter sido completada.

IV. Testes comportamentais A. Teste do cilindro

[0086] Neste teste o rato é posicionado dentro de um cilindro acrílico transparente de 20 cm de diâmetro e 30 cm de altura, que não permite que o animal alcance a borda. O formato cilíndrico favorece a conduta inata de exploração vertical da parece com os membros anteriores pelo posicionamento do rato em um local desconhecido para ele. Após o posicionamento do animal, é quantificada a quantidade de toques realizados pelo animal com ambas as patas frontais, direita ou esquerda, até um total de 20 toques por animal sobre a parede do recipiente. Os animais unilateralmente danificados com 6-OHDA tendem a usar menos a pata contralateral ao dano, em nosso caso a pata esquerda. A % de assimetria apresentada por cada animal é quantificada mediante a seguinte fórmula:

B. Atividade exploratória

[0087] Com o propósito de avaliar a atividade exploratória vertical dos animais, foi usado teste de atividade exploratória, o animal foi posicionado dentro de uma caixa de atividade cúbica, de Plexiglas® [poli(metacrilato de metila)], transparente, com as dimensões de 41 cm x 41 cm x 33 (h) cm, (UGO BASILE, “Multiple Activity Cage”, n° de catálogo 47420). A caixa de atividade cúbica apoia-se sobre uma base rígida de Plexiglas® preto, munido com quatro barras de aço verticais com entalhes de aço de modo que os sistemas de detecção horizontal/vertical sejam corretamente fixados. Os sensores são sistemas de emissão de luz infravermelha capazes de registrar os movimentos dos animais em uma maneira, i.e., exploração vertical. Os dados são monitorados em um computador. O animal é posicionado no centro da caixa, de modo que ele explore a mesma. A caixa é deixada posicionada em uma sala isolada do investigador e de ruídos ambientais, e sob pouca iluminação, durante um período de 5 min. O investigador registra o número de vezes que o animal explora verticalmente as paredes da caixa, sendo interrompido pelos feixes de luz do sensor da caixa.

Resultados: Efeito neuroprotetor do KM-34 no modelo IN VIVO de doença de Parkinson induzida pela neurotoxina 6-OHDA

[0088] Os animais tratados com as doses de 2 mg de KM-34/kg e de 1 mg de KM-34/kg tiveram uma % de assimetria igual àquela dos animais tratados com veículo (animais saudáveis), quando foram avaliados no teste do cilindro, portanto, os animais não foram tratados com a dose de 0,5 mg de KM-34/kg. Os animais do grupo de controle (6-OHDA) que não receberam o tratamento com KM-34, quando avaliados no teste do cilindro, não foram capazes de usar a perna contralateral ao dano induzido por 6-OHDA, causando uma grande desnervação das células dopaminérgicas presentes na substância nigra, por conseguinte apresentaram uma % de assimetria muito alta. À medida que a dose do composto é aumentada, os animais recuperam-se de o dano até alcançarem um efeito neuroprotetor máximo no grupo tratado com 2 mg de KM-34/kg, que é estatisticamente significativo com relação ao dano dos animais do grupo de controle (sem tratamento com KM-34). Os animais tratados com 0,5 mg de KM-34/kg não mostraram diferença estatisticamente significativa com relação ao grupo de animais danificados sem tratamento com KM-34, embora fosse observada uma determinada tendência para decréscimo do dano. Os animais no grupo de animais recebendo veículo não apresentaram nenhuns danos (Figura 9).

[0089] Por outro lado, o comportamento exploratório vertical na caixa exploratória não mostrou diferenças estatisticamente significativas das doses de 0,5 mg de KM-34 e de 1 mg de KM-34 com relação aos animais danificados, mas este não foi o caso dos animais tratados com a dose máxima os quais mostraram diferenças estatisticamente significativas com relação aos animais danificados e não mostraram diferenças com relação ao grupo de animais tratados com veículo. Houve uma tendência para aumentar a exploração vertical nas três doses avaliadas à medida que a dose de KM-34 aumenta, sendo máxima para a dose de 2mg de KM-34/kg, Figura 10.

EXEMPLO 10: ATIVIDADE DE ANTIDEMÊNCIA DO KM-34

[0090] O modelo de demência induzida por escopolamina tem sido amplamente relatado para a pesquisa de compostos efetivos no tratamento de tipos diferentes de demência, incluindo doença de Alzheimer. Os resultados da avaliação com KM-34 neste modelo demonstram as propriedades neuroprotetoras desta molécula no tratamento de demências.

Planejamento experimental

[0091] Em modelos in vivo, o KM-34 foi administrado oralmente (p.o) a uma taxa de 4 mL/kg de peso corporal. Doses de 2, 4 e 8 mg/kg foram avaliadas como administração aguda 90 minutos antes do início dos testes comportamentais. Para a administração, o composto foi suspenso em carboximetilcelulose (CMC) 0,05%. Brometo de escopolamina foi dissolvido em solução salina 0,9% e administrado intraperitonealmente como uma dose única (1 mg/kg, 4 mL/kg de peso corporal) 30 minutos antes do início dos testes comportamentais. Os animais foram aleatoriamente selecionados e divididos em 5 grupos experimentais com tratamentos diferentes (n = 7, por grupo): grupo de controle (CMC e solução salina), grupo com veículo (CMC e escopolamina a 1 mg/kg), grupo com KM-34 (KM-34 a 4 mg/kg e escopolamina a 1 mg/kg) e (KM-34 a 8 mg/kg e escopolamina a 1 mg/kg).

Estudos comportamentais Labirinto em T. Alternação espontânea.

[0092] A avaliação do comportamento de alternação espontânea no labirinto em T foi realizada seguindo a metodologia proposta por Capurro et al. (Capurro et al., 2013). Este ensaio consistiu em uma única sessão que começou com uma entrada de seleção forçada, seguida por 14 entradas de seleção livre para qualquer um dos braços esquerdo ou direito do labirinto. Na primeira entrada, o acesso ao braço direito do labirinto estava fechado, forçando o animal a abrir o braço (esquerdo). Subsequentemente, o animal foi permitido livremente explorar o labirinto e selecionar em qual braço entrar, direito ou esquerdo, em 14 oportunidades. Entre cada seleção o animal foi retornado para a posição inicial (extremidade do braço longo do labirinto em T), onde ele permaneceu confinado durante 5 segundos. A série de entradas em cada braço foi registrada e a percentagem de alternação foi calculada como: (Número de alternações realizadas / Total de alternações possíveis) x 100. Este teste foi realizado 90 minutos e 30 minutos após a administração de JM-20 e de escopolamina, respectivamente.

Reconhecimento de objetos

[0093] Este teste foi conduzido conforme proposto por Capurro et al. (Capurro et al., 2013), em um campo aberto, durante dois dias consecutivos. No primeiro dia, os animais foram adaptados para serem examinados durante 3 minutos em 2 sessões. No segundo dia, treinamento e avaliação de aprendizado foram realizados em dois estágios de 5 minutos cada, Teste 1 (P1) e Teste 2 (P2), respectivamente. Antes do início de P1, os animais foram administrados com JM-20 e escopolamina, 90 minutos e 30 minutos antes, respectivamente. Em P1 os ratos foram apresentados a dois objetos idênticos, chamados de objetos familiares (F). Após 30 minutos, P2 foi iniciado e os ratos foram expostos a dois objetos diferentes: o objeto familiar F e um objeto novo (N). Estes testes foram gravados em vídeo para análise da exploração dos objetos, definido pelo tempo de exploração que o animal demora com cada objeto. As taxas de discriminação entre os objetos F e N foram calculada como: ID = (N-F) / (N + F).

Análise estatística

[0094] O programa GraphPad Prism 5.0 foi usado para a análise estatística dos resultados obtidos. A normalidade e a homocedasticidade dos dados experimentais foram checadas. Uma ANOVA (Analysis of Variance, de acordo com a terminologia inglesa; Análise de Variância) e o teste de comparações múltiplas de Tukey foram realizados para comparar entre os diferentes grupos experimentais.

Resultados

[0095] No labirinto em T, foi avaliado o efeito dos tratamentos diferentes sobre a memória espacial de curto prazo. A percentagem de alternações correlaciona-se positivamente com a capacidade cognitiva e a memória normal dos animais. Foi observado que a administração de 2, 4 e 8 mg de KM-34/kg (p.o), 1 hora antes da indução de um déficit cognitivo por escopolamina, protegeu significativamente (p <0,01) contra o dano da memória espacial com respeito aos animais não tratados com KM-34 (Figura 11).

[0096] O efeito do KM-34 sobre a memória episódica de reconhecimento de objetos foi avaliado em um planejamento de curto prazo. Neste teste o tempo de reconhecimento de objetos familiar (F) e novo (N) durante a fase de avaliação foi quantificado, e um índice de discriminação (ID) foi calculado entre ambos os objetos. Um índice positivo alto reflete uma boa memória de reconhecimento do objeto N em relação ao objeto F, conforme observado nos grupos de controle (Figura 12). Um índice com valores próximos de zero ou negativos significa que os animais discriminam entre os objetos F e N ou uma exploração maior do objeto F do que o objeto N. Nestes testes, foi observado que as doses de 4 mg de KM-34/kg e de 8 mg de KM-34/kg (p.o) foram capazes de reverter a afetação sobre o aprendizado e a memória de reconhecimento de prazo induzida pela escopolamina. Os animais tratados com KM-34 foram capazes de discriminar entre o objeto previamente conhecido e o objeto novo em uma maneira similar àquela dos animais de controle do experimento, e significativamente (p <0,01) mais alto do que os animais tratados com escopolamina sozinha (Figura 11). Estes resultados predizem um possível efeito antiamnésico do KM-34. As potencialidades estruturais do KM-34 e o conjunto de evidências farmacológicas obtidas justificam a possibilidade de que o KM-34 tem efeitos neuroprotetores no tratamento de tipos diferentes de demência, incluindo a doença de Alzheimer.

EXEMPLO 11. ATIVIDADE ANTI-ISQUÊMICA DO KM-34

[0097] Os animais foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos (n = 8 por grupo): (1) grupo de controle com isquemia/reperfusão (I/R) tratado com veículo, (2) grupo com I/R tratado com KM-34 a 0,1 mg/kg, (3) grupo com I/R tratado com KM-34 a 0,5 mg/kg, (4) grupo com I/R tratado com KM-34 a 1 mg/kg, (5) grupo simuladamente operado tratado com veículo (6) grupo simuladamente operado tratado com KM-34 a 1 mg/kg. Em todos os casos o tratamento foi administrado oralmente (com uma cânula intragástrica). Para as doses diferentes, as concentrações foram ajustadas com o objetivo de administrar um volume constante de 10 mL/kg. Imediatamente antes do uso, o KM-34 foi suspenso em carboximetilcelulose (CMC) 0,05%.

Indução de isquemia cerebral focal transiente em ratos

[0098] A isquemia cerebral focal transiente foi realizada pela OACM (Oclusão da Artéria Cerebral Média), usando um método do filamento intraluminal. Resumidamente, os animais foram anestesiados com cetamina (75 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg). A artéria carótida comum direita foi exposta pela realização de uma incisão longitudinal na linha média ventral do pescoço e as artérias carótidas comum e esquerda foram ligadas com uma sutura de seda 3-0. Subsequentemente, um monofilamento de náilon 4-0 (Somerville, Brasil) foi introduzido com a ponta arredondada e revestido com poli(L- lisina) (44), até 18-20 mm em comprimento através da ACI (Artéria Carótida Interna), com o objetivo de obstruir a origem da Artéria Cerebral Média (ACM). Após 90 min de oclusão, o filamento foi removido para permitir a reperfusão. A temperatura corporal foi mantida entre 36,5°C e 37,5°C com uma manta de aquecimento. Uma hora mais tarde os ratos receberam uma dose oral única de KM-34 (0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg ou 1 mg/kg). Os animais do grupo de operação simulada (falsamente operados) submeteram-se ao mesmo procedimento cirúrgico mas sem a inserção do monofilamento. Após 23 horas de reperfusão, o déficit neurológico foi avaliado e os animais foram mortos para determinar o volume do infarto e realizar as avaliações comportamentais. Avaliação do déficit neurológico

[0099] O déficit neurológico foi avaliado de acordo com uma escala de seis pontos: 0 = sem déficit neurológico observado; 1 = sem extensão da pata frontal esquerda; 2 = deslocamentos em círculos para a esquerda se o animal é suspenso pela cauda; 3 = deslocamentos espontâneos em círculos para a esquerda; 4 = sem atividade motora espontânea com nível decrescido de consciência; 5 = morte.

Medição do infarto cerebral

[00100] O infarto cerebral foi determinado pela coloração com TTC (2,3,5-TriphenylTetrazolium Chloride, cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio), um composto incolor em solução, mas que, quando reduzido por desidrogenases de mitocôndrias funcionais, forma um sal de formazano vermelho-tijolo. Nesta maneira o tecido que está danificado por isquemia permanece não colorido e pode ser macroscopicamente reconhecido.

[00101] Os animais foram anestesiados de novo após a avaliação neurológica e foram perfundidos transcardiacamente com 20 mL de solução salina a 4°C. Os cérebros foram extraídos e deixados a 0°C durante 30 minutos. Seções coronais de 2 mm de espessura foram então realizadas e incubadas em uma solução de TTC 2% a 37°C durante 30 min. As seções coradas foram fixadas em uma solução de formaldeído 4% tamponada com fosfato e digitalizadas para a determinação do tamanho do infarto com um sistema de análise de imagem (ImageJ 1.41, National Institute of Health, EUA). O índice de edema (volume do hemisfério ipsilateral para a OACM / volume do hemisfério contralateral) e o volume do infarto corrigido (volume da lesão / índice de edema) foram calculados para evitar superestimação do volume do infarto pelo edema cerebral. O volume do infarto foi expressado como uma percentagem do hemisfério contralateral.

Análise estatística

[00102] A análise estatística foi realizada usando o programa de computador GraphPadPrism 5.0 (GraphPad Software Inc., EUA). Os dados foram expressados como a média ± EPM (Erro Padrão da Média). Comparações entre os grupos diferentes foram realizadas utilizando análise de variância (ANOVA) de classificação simples, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Newman-Keuls. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises foram realizadas por um investigador que desconhecia as atribuições dos grupos experimentais. RESULTADOS

[00103] O tratamento com KM-34 reduziu o volume do infarto e o déficit neurológico pela oclusão da artéria cerebral média em ratos.

[00104] O modelo de oclusão da artéria cerebral média em ratos, um modelo confiável e reproduzível que causa um déficit sensório-motor e cognitivo amplamente caracterizado. O composto foi administrado oralmente (usando uma cânula intragástrica) em doses de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1 mg/kg, 1 hora após a reperfusão. A coloração com TTC demonstrou que o KM-34 reduziu enormemente o tamanho do infarto (Figura 13A). A análise quantitativa destes dados revelou que o volume total do infarto (expressado como uma percentagem do hemisfério contralateral) nos ratos tratados com 0,5 mg de KM-34/kg e 1 mg de KM-34/kg, decresceu significativamente (p <0,05) O grupo tratado com veículo (27,5% no grupo tratado com veículo a 15,7% e 5,3%, respectivamente) (Figura 13B). Este efeito total é um resultado da redução dos tamanhos de infarto cerebral em áreas corticais como subcortical.

[00105] Na avaliação neurológica, não foram observadas afetações comportamentais significativas no grupo simuladamente operado (resultados não mostrados), enquanto que no grupo não tratado com o KM-34 e submetido à OACM foi observado o déficit neurológico severo (Figura 13C). Os ratos neste grupo mostraram movimentos em círculos, flexão da pata dianteira contralateral ao dano e movimentos espontâneos decrescidos. O tratamento com KM-34 (0,5 mg/kg e 1 mg/kg) significativamente melhorou (p <0,05) o déficit neurológico, o que é refletido no decréscimo do escore neurológico. Em ambos os casos, as anormalidades no movimento e na postura dos ratos foram menores, sugerindo que o decréscimo no tamanho do infarto devido ao tratamento teve um efeito positivo sobre o déficit neurológico pós-isquêmico. Por outro lado, a administração deste composto não produziu sinal de dano tecidual ou de alterações comportamentais no grupo simuladamente operado, indicando que o composto não tem efeito sobre estes parâmetros sob condições basais (sem OACM).

EXEMPLO 15: ATIVIDADE BIOLÓGICA DE DERIVADOS TRICÍCLICOS DOS TIPOS BENZODIAZEPINAS, PIRIDODIAZEPINAS E PIRIMIDODIAZEPINAS FUSIONADAS EM DERIVADOS DE 1,4-DI-HIDROPIRIDINAS COMBINADOS COM DERIVADOS FENÓLICOS OU POLIFENÓLICOS

[00106] Para demonstrar a superioridade da combinação de derivados tricíclicos e tetracíclicos dos tipos benzodiazepinas, piridodiazepinas e pirimidodiazepinas fundidos em derivados de 1,4-di-hidropiridina com derivados fenólicos ou polifenólicos, com relação a cada um destes sistemas separadamente, foram utilizadas culturas de células PC12 expostas ao dano causado por glutamato e ao dano causado por peróxido de hidrogênio.

[00107] O dano causado por peróxido de hidrogênio (dano radicalar) e o dano causado por glutamato (excitotóxico), são representativos da maioria dos distúrbios vasculares e nervosos. Em ambos os gráficos é observado como os grupos tratados com JM-20 + KM-34 apresentaram uma percentagem de sobrevivência mais alta do que cada um dos grupos tratados com JM-20 e com KM-34 separadamente. Isto indica que a mistura de ambos os compostos é superior em termos de efetividade terapêutica do que quando usados separados, também prediz que os efeitos colaterais (responsáveis pela abstinência de muitos fármacos da prática clínica) serão menores quando a combinação de derivados tricíclicos e tetracíclicos dos tipos benzodiazepinas, piridodiazepinas e pirimidodiazepinas combinados com derivados de 1,4-di- hidropiridinas com derivados fenólicos ou polifenólicos, devido à necessidade do uso de doses mais baixas para se alcançar um efeito farmacológico superior.

[00108] Como um modelo de demência vascular, os animais (camundongos albinos machos suíços) submeteram-se à oclusão transiente das artérias carótidas comuns durante 20 minutos e o enfraquecimento cognitivo foi avaliado mediante o ensaio com o labirinto aquático de Morris. Os resultados mostram que os animais administrados com 4 mg de JM-20/kg (p.o), 1 hora após o início da reperfusão e durante todos os dias do teste, diminuíram significativamente (p<0,05) o tempo de latência de escape em relação aos animais sem o tratamento. A combinação de JM-20 (4 mg/kg) + KM-34 (2 mg/kg) mostrou uma melhoria na demência vascular maior que com Tacrina a 8 mg/kg.

[00109] Como um modelo de isquemia cortical permanente, foi induzida termocoagulação das artérias da pia-máter e foi quantificada a percentagem de assimetria.

[00110] A Figura 14 mostra como a combinação de JM-20 (4 mg/kg) + KM-34 (2 mg/kg) decresce a assimetria dos animais lesionados mais potentemente do que cada um dos compostos separadamente.

[00111] Para demência e doença de Parkinson, a combinação de JM-20 + KM-34 também potencializou significativamente o poder neuroprotetor de cada uma destas moléculas separadamente. Isto permite o uso de doses mais baixas para se alcançar um efeito superior e decrescer o risco para reações adversas.

Claims (14)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende como um ingrediente farmaceuticamente ativo o composto de fórmula I:na forma livre, como um sal, hidrato ou na forma cristalina, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. Combinação de composto de fórmula I como definido na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de estar na forma livre, como um sal, hidrato ou na forma cristalina com um derivado tricíclico do tipo benzodiazepina fundida em derivados de 1,4-di-hidropiridina.

3. Combinação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o derivado de benzodiazepina fundido em 1,4-di-hidropiridina é 3-etoxicarbonil-2-metil-4-(2-nitrofenil)-4,11-di- hidro-1H-pirido[2,3-b][1,5]benzodiazepina.

4. Combinação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o derivado de benzodiazepina fundido em 1,4-di-hidropiridina está pelo menos sob a forma de um racemato ou sob a forma de seu enantiômero dextrorrotatório ou levorrotatório.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende como um ingrediente farmaceuticamente ativo a combinação como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de doenças dos sistemas nervoso central e vascular.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento de isquemia cerebral, doença de Parkinson e tipos diferentes de demência.

8. Uso de composto de fórmula I como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças dos sistemas nervoso central e vascular.

9. Uso de combinação como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças dos sistemas nervoso central e vascular.

10. Uso de combinação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença dos sistemas nervoso central e vascular é isquemia cerebral.

11. Uso de combinação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença dos sistemas nervoso central e vascular é doença de Parkinson.

12. Uso de combinação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença dos sistemas nervoso central e vascular está relacionada com tipos diferentes de demências.

13. Uso de combinação de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a demência é doença de Alzheimer.

14. Uso de combinação de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a demência é demência vascular.