BR112017026013B1

BR112017026013B1 - Sistema de distribuição oral de agentes bioativos e alimentação funcional para administração oral de agentes bioativos

Info

Publication number: BR112017026013B1
Application number: BR112017026013-1A
Authority: BR
Inventors: Simon Wadsworth; Goran Klaric; Suwan Nalin Jayasingh
Original assignee: Ewos Innovation As
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2023-12-05
Also published as: BR112017026013A2; CA2987932A1; US20180147147A1; US20220409541A1; CA2987932C; CN108076627A; WO2016195509A1; US11844863B2; EP3881835A1; MX2017015545A; EP3302445A1; ECSP18000069A; CN108076627B; CL2017003077A1

Abstract

SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL, ALGINATO DE ETILENODIAMÔNIO, GRÂNULOS DE ALGINATO DE ETILENODIAMÔNIO E ALIMENTAÇÃO FUNCIONAL. A presente invenção referese a uma alimentação funcional e a um sistema de distribuição oral para administração de macromoléculas bioativas. O sistema de distribuição oral compreende alginato de etilenodiamônio que é um veículo para distribuição de drogas macromoleculares. O sistema de distribuição oral, de acordo com a presente invenção, é particularmente adequado para utilização em combinação com alimentos funcionais em peixes.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção refere-se a um sistema de distribuição oral, ao alginato de etilenodiamônio para utilização como sistema de distribuição oral e a uma alimentação funcional tal como definida nas partes introdutórias das reivindicações independentes. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de partículas de alginato de etilenodiamônio e a métodos de produção de uma alimentação funcional em forma de pélete compreendendo pelo menos pelo menos um agente bioativo.

Fundamentos da invenção

[0002] Há uma grande necessidade por sistemas de distribuição oral de drogas, compostos e composições farmacologicamente ativos ou bioativos para terapia e propósitos profiláticos.

[0003] A administração ideal desses agentes bioativos é crucial para sua absorção posterior e eficácia no organismo. A maneira como esses agentes bioativos são administrados é, portanto, de grande importância. A distribuição oral de drogas é o método de engolir um composto farmacêutico com a intenção de liberá-lo no trato gastrointestinal de humanos e animais.

[0004] Nos últimos anos, o uso de ingredientes funcionais na indústria da aquicultura aumentou dramaticamente e uma grande variedade de alimentos funcionais agora está amplamente disponível para uso na piscicultura. Em relação a isso, há pesquisas em curso sobre o desenvolvimento de sistemas de distribuição oral para a distribuição de agentes bioativos sensíveis a peixe. O método mais conveniente e menos estressante de administração de drogas e outros agentes farmaceuticamente ativos para peixes cultivados é através da alimentação. absorvidos no intestino. Muitos dos agentes bioativos são termossensíveis e propensos à degradação ácida e proteolítica no trato gastrointestinal. Isto é, em particular, o caso das proteínas. Outro problema é a distribuição ao órgão alvo certo para absorção, bem como uma absorvência eficiente.

A percepção da fisiologia digestiva dos peixes é, portanto, muito importante para a distribuição de agentes bioativos como as proteínas terapêuticas por via oral. O Salmão do Atlântico (Salmo salar), que é uma espécie economicamente importante para a indústria da aquicultura, é um peixe gástrico com um sistema digestivo bastante curto. O trato digestivo do salmão sendo um peixe carnívoro pode ser subdividido em intestino anterior (boca, esôfago e estômago), um intestino médio (ceca pilórica ou intestino proximal e intestino médio) e um intestino posterior ou um intestino distal que termina no reto. A digestão é um processo catabólico de nutrientes solubilizantes e degradantes em componentes menores que são mais facilmente absorvidos em uma corrente sanguínea.

Os principais componentes digestivos segregados no estômago são o pepsinogênio e o ácido clorídrico (HCl) e a secreção de ambos é estimulada pela ingestão alimentar. Foi demonstrado que um pH gástrico médio de 2,7 aumenta para 4,9 quando a truta-arco-íris salmonídea (Oncorhynchus mykiss) vai do estado com fome ao estado alimentado (Bucking, C. e Wood, CM 2009. The effect of postprandial changes in pH along the gastrointestinal tract on the distribution of ions between the solid and fluid phases of the chyme in rainbow trout. Aquaculture Nutrition, Vol. 15, Edição 3, págs. 282-296). O pH aumentado é mantido durante oito horas após a alimentação.

A maioria das proteínas é degradada pela ação de HCl e pepsina no estômago. Após o processamento no estômago, a mistura de nutrientes dissolvidos e material de alimentação parcialmente digerido passa para o ceco pilórico. O ceco pilórico constitui um compartimento onde outras enzimas proteolíticas como tripsina, quimiotripsina e aminopeptidase estão completando a hidrólise do peptídeo. É bem sabido que a maioria das proteínas é absorvida na corrente sanguínea como aminoácidos livres e peptídeos curtos na região pilórica. Quando o quimoácido atinge o intestino proximal, torna-se rapidamente neutralizado por bicarbonato (HCO3-) em suco biliar e pancreático. Bucking and Wood (2009) observou um pH médio de 8,2 em toda a seção intestinal em peixe em jejum. Após a alimentação, o pH diminuiu para 7,5 no intestino proximal e médio, enquanto permaneceu quase inalterado na seção distal. No entanto, o pH aumentou novamente no período após a alimentação no intestino, atingindo seu maior valor após oito horas. Nesse ponto, o pH pode estar acima de 8,5 ao longo do trato intestinal com tendência crescente em direção à parte distal.

Apesar do ambiente proteolítico severo no intestino anterior e no intestino médio, algumas proteínas passam pelo intestino distal, onde podem ser absorvidas. O intestino distal é considerado o lugar mais importante de absorção de grandes peptídeos, incluindo antígenos utilizados em vacinas orais. Por conseguinte, é importante que os agentes macromoleculares, tais como as proteínas, que são administrados aos peixes, de fato atinjam a parte distal do intestino para a sua absorção eficiente. Para proteger as drogas bioativas macromoleculares da quebra no estômago, as mesmas são tipicamente associadas a sistemas de distribuição oral, por exemplo, por encapsulação em um polímero adequado.

Outro desafio para a distribuição de agentes é que o tempo de passagem do material de alimentação através de todo o sistema digestivo de peixes carnívoros pode ser muito curto. O tempo de trânsito depende do tamanho da refeição, da composição e da estrutura dos alimentos, e pode ser qualquer coisa de 5 a 35 horas após a ingestão alimentar.

A escolha certa de um agente de distribuição adequado é, portanto, de grande importância. Uma característica importante para a adequação de um sistema de distribuição oral é a dissolução adequada do agente de distribuição a fim de liberar a composição bioativa no momento e no local certo no sistema intestinal.

Os alginatos reticulados são polímeros que tipicamente foram usados em sistemas de distribuição oral. As propriedades de reticulação do alginato formam a base para várias técnicas de encapsulamento, incluindo processos de extrusão e emulsão. Os alginatos podem ser reticulados usando uma variedade de agentes de reticulação conhecidos. O agente de reticulação mais utilizado é Ca2+.

Uma variedade de produtos (nutrientes, medicamentos e vacinas) podem ser incorporados em matrizes de alginato para evitar danos pelo baixo pH e pelas enzimas proteolíticas. Os alginatos são polissacarídeos isolados de algas marrons tais como Ascophyllum nodosum, Durvillaea sp., Ecklonia sp., Laminaria sp., Lessonia sp., Sargassum sp. e Macrocystis pyrifera encontrados em águas costeiras ao redor do globo. Os alginatos marinhos são compostos por duas formas de ácido urónico: manurónico (M) e gulurónico (G). Dois blocos de cadeias poliméricas adjacentes podem ser reticulados com cátions multivalentes (por exemplo, Ca2+ ou Ba2+) através de interações com os grupos carboxílicos no ácido urónico, o que leva à formação de uma rede de gel. O alginato reticulado resultante possui uma excelente biocompatibilidade nos tecidos do hospedeiro e é capaz de se biodegradar de forma controlada. Os agentes bioativos para administração oral são tipicamente encapsulados ou aprisionados no alginato durante o processo de reticulação, particularmente por encapsulação em pequenos grânulos de alginato. Os grânulos de alginato reticulado são tipicamente estáveis em baixo pH e se dissolvem em um pH mais elevado. Como resultado, uma liberação mais rápida de grânulos de alginato ocorre no intestino (condições alcalinas), depois que os grânulos passarem pelo ambiente proteolítico e ácido do estômago. Esses atributos tornam o alginato um composto efetivo para uso como sistema de distribuição oral em humanos e mamíferos.

A maioria dos estudos realizados até agora focados na dissolução de matrizes de alginato em condições relevantes para o sistema digestivo humano, como pH 1,1-2,0 e pH 6,8-7,4 a uma temperatura de 37°C. Como mencionado anteriormente, pode-se ver que pH > 2,7 é mais comum no estômago dos salmonídeos. Ao mesmo tempo, o pH > 7,5 é prevalente nas seções intestinais, embora pH > 8,5 também não seja uma condição incomum. Além disso, as taxas de passagem intestinal e as condições de temperatura nos processos digestivos são muito diferentes em animais poiquilotérmicos em comparação com o organismo homeotérmico, como os mamíferos. Por exemplo, a temperatura do inverno pode ser inferior a 4°C, enquanto a temperatura do verão pode ser mais extrema acima dos 18°C nas águas do mar norueguesas, onde os salmões do Atlântico são cultivados.

As matrizes de alginato comumente conhecidas não são adequadas ou eficientes para a administração de agentes bioativos ao trato gastrointestinal inferior de animais com intestino curto. A principal deficiência dos sistemas de distribuição oral comumente conhecidos, incluindo o alginato, é a dissolução incompleta ou insuficiente nos sistemas intestinais de comprimento limitado. Isso é especialmente o caso no peixe gástrico, carnívoro e omnívoro com preferência ao material animal que tipicamente tem um trato intestinal curto, como salmonídeos, baixos, bremas, bacalhau, alabote, rodovalho, solhas, pangasius e garoupa. Devido ao seu intestino curto, o tempo de retenção do material de alimentação, bem como a janela de tempo para liberação e absorção de ingredientes ativos, é bastante limitado.

Por conseguinte, o problema técnico objetivo da presente invenção é fornecer um veículo para distribuição oral de agentes biologicamente ativos, particularmente drogas macromoleculares e proteínas terapêuticas para o intestino de animais.

Especificamente, a presente invenção tem o objetivo de proporcionar um sistema de distribuição oral de dissolução rápida e independente da temperatura, em particular para espécies que vivem em água fria.

Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo proporcionar um sistema de distribuição oral para utilização em peixes, particularmente em peixes com estômago e trato intestinal curto.

Além disso, a presente invenção tem como objetivo fornecer um sistema de distribuição oral para uso em peixes gástricos, carnívoros e omnívoros e, em particular, para peixes de água fria, como salmonídeos.

Outro objetivo da presente invenção tem como objetivo proporcionar um sistema de distribuição oral que proteja os agentes bioativos da degradação ácida e proteolítica no estômago e depois libera-os na região intestinal com um pH alcalino.

3. RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um sistema de distribuição oral que compreende alginato de etilenodiamônio e pelo menos um agente bioativo para utilização em um tratamento terapêutico e/ou profilático. Esse sistema de distribuição oral, devido às suas propriedades de dissolução favoráveis, é particularmente adequado para uso em animais, especialmente em animais com trato intestinal curto, como peixes carnívoros e omnívoros com preferência a material animal. Em particular, o sistema de distribuição oral é muito adequado para a distribuição oral de substâncias bioativas para animais ectotérmicos que podem ter uma digestão a baixas temperaturas.

De preferência, o referido agente bioativo é encapsulado ou aprisionado em alginato de etilenodiamônio.

É ainda preferido que o agente bioativo a ser distribuído seja selecionado do grupo que consiste em proteínas, peptídeos, vacinas, anticorpos, antígenos, hormônios, enzimas, estimulantes imunológicos, drogas, probióticos, prebióticos, polinucleotídeos, nucleotídeos e aminoácidos.

Em uma modalidade preferida, o sistema de distribuição oral é para utilização num animal ectotérmico com um trato gastrointestinal compreendendo um intestino e um estômago, de preferência numa espécie de água fria, mais preferencialmente em peixe.

Em outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se a um sistema de distribuição oral para utilização em uma espécie de peixe selecionada do grupo que consiste em espécies omnívoras e carnívoras, de preferência, a partir de uma espécie de peixe de água fria.

Em particular, o sistema de distribuição oral é adequado para uso em peixes, de preferência em um peixe gástrico, mais preferencialmente para um peixe com um trato intestinal curto, mais preferencialmente em uma espécie selecionada de um grupo que consiste em salmonídeos, baixos, bremas, bacalhau, alabote, rodovalho, solhas, garoupa, atum, tilápia e pangasius.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se ao alginato de etilenodiamônio para utilização como sistema de distribuição oral em um tratamento terapêutico e/ou profilático. Um uso preferido é em peixes, mais preferencialmente em uma espécie omnívora ou carnívora. Ainda mais preferido é um uso em um peixe de água fria.

De preferência, a matriz de alginato está na forma de partículas, de preferência como grânulos, e mais preferencialmente na forma de grânulos esféricos. De preferência, os grânulos de alginato de etilenodiamônio têm um tamanho médio de partícula que variam de 1 μm a 10 mm, mais preferencialmente de 300 μm a 2000 μm. Em outra modalidade preferida da presente invenção, o tamanho médio de partícula não é superior a 300 μm, de preferência não é superior a 200 μm, mais preferencialmente não é superior a 100 μm e mais preferencialmente não é superior a 25 μm. Essa é uma vantagem ao se associar ao pélete de alimentação em um revestimento de vácuo. Embora o tamanho médio preferido para a adição pré-extrusão seja inferior a 300 μm, os tamanhos entre 300 μm e 2000 μm também são viáveis. Além disso, o tamanho médio preferido do grânulo de alginato para administração oral autônoma é superior a 100 μm e dependerá do tamanho do organismo e da dose alvo.

Num terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma alimentação funcional compreendendo pelo menos um agente bioativo encapsulado ou aprisionado em alginato de etilenodiamônio. A incorporação do agente bioativo encapsulado ao alginato em péletes de alimentação é uma operação essencial quando se trata de alimentos para animais, especialmente alimentação de peixes. A incorporação efetiva em um pélete de alimentação reduz a perda de ingredientes bioativos devido ao manuseio de alimentos e garante um fornecimento constante de doses prescritas.

De preferência, o alginato que compreende o agente bioativo na alimentação funcional está na forma de grânulos.

De preferência, o alginato de etilenodiamônio é moldado como partículas, de preferência como grânulos e mais preferencialmente na forma de grânulos esféricos. Em uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção, o tamanho médio de partícula dos grânulos de alginato não é superior a 2000 μm, de preferência não superior a 1000 μm, mais preferencialmente não superior a 300 μm, e mais preferencialmente não superior a 25 μm.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma alimentação funcional compreendendo pelo menos um agente bioativo encapsulado em alginato de etilenodiamônio para utilização em tratamento terapêutico e/ou profilático. Um uso preferido da alimentação funcional é no peixe.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao método de produção de partículas de alginato de etilenodiamônio que compreende pelo menos um agente bioativo por um processo de alginato de reticulação com etilenodiamônio através do qual a forma de alginato desejada é formada por meio de (i) um método de extrusão antes da cura em uma solução de etilenodiamônio ou (ii) um método de emulsão. No referido processo, a forma e o tamanho de alginato desejados são formados por meio do método de extrusão antes da cura em uma solução de etilenodiamônio ou pelo método de emulsão em combinação com o referido etilenodiamônio.

O método de extrusão (i) pode ser selecionado em um grupo que consiste em jato aerodinamicamente assistido, dissolução eletromagnética de jato laminar, impressão a jato de tinta, impressão 3D, pulverização eletrônica e gotejamento induzido por fluxo de ar coaxial e em que o método de emulsão (ii) pode ser um método selecionado do grupo consistindo em coacervação, gelificação interna e gelificação externa.

O método compreende as seguintes etapas: (i) preparar uma formulação de encapsulação dissolvendo alginato em uma solução compreendendo pelo menos um agente bioativo a ser distribuído, (ii) criar um jato de gotículas de alginato com ajuda da pressão do ar extrudando a solução de (i) através de um bocal de tamanho relevante situado numa câmara pressurizada equipada com um orifício de saída de tamanho de acordo com um referido bocal, (iii) focar o jato de gotículas de (ii) na solução de reticulação compreendendo dicloridrato de etilenodiamina, seguido por (iv) filtrar os grânulos de alginato obtidas.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma alimentação funcional que compreende pelo menos um agente bioativo em que o método compreende as seguintes etapas: (i) preparar uma suspensão de óleo compreendendo grânulos de alginato de etilenodiamônio nos quais um agente bioativo foi aprisionado ou encapsulado, (ii) misturar a suspensão de (i) com grânulos de alimentação em um revestidor a vácuo, (iii) evacuar o ar de um revestidor criando um ambiente com pressão reduzida, e (iv) recuperar gradualmente a pressão atmosférica deixando-se o ar voltar para o revestidor que empurra a suspensão de (i) para os poros vazios dos péletes de alimentação.

Além de uma inclusão pós-extrusão dos referidos agentes bioativos encapsulados na alimentação, é possível uma inclusão pré- extrusional dos referidos agentes bioativos encapsulados.

Ainda em outro aspecto da invenção refere-se ao método de produção de alimentação funcional caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um agente bioativo em que o método compreende as seguintes etapas: (i) preparar uma mistura seca misturando grânulos de alginato de etilenodiamônio contendo pelo menos um agente bioativo com uma farinha de alimentação compreendendo outros ingredientes não oleosos, (ii) preparar um extrudido mediante extrusão da mistura seca de (i) usando uma extrusora ou usando uma prensa de peletização, (iii) produzir grânulos de base por secagem do extrudado de (ii) em um secador, e (iv) produzir alimentação final por revestimento de óleo dos grânulos de base de (iii) em um processo de revestimento por infusão a vácuo.

As modalidades preferidas também são definidas nas reivindicações dependentes.

4. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

As modalidades da invenção serão agora descritas, a título de exemplos, com referência aos seguintes diagramas, em que

A Figura 1 mostra imagens de estereomicroscópio (SMZ) (Leica MZ10 F) de a) Grânulos de Ca-alginato carregados com dextrano azul (BD-Ca-alg; dmédio = 3,0 mm), b) grânulos de EDA-alginato carregadas com dextrano azul (BD-EDA-alg; dmédio = 3,7 mm);

A Figura 2 mostra perfis de dissolução como curvas da porcentagem média de liberação cumulativa de dextrano azul (BD) de grânulos de alginato ao longo do tempo. Testes de dissolução realizados em tampão de hidrogeno-ftalato de potássio/HCl (pH 3,0) durante 15 minutos seguido de tampão de fosfato (pH 8,0) durante os próximos 50 min. A liberação estava abaixo de LoQ (3,9 x 10-3 mg ml-1) no meio ácido, de modo que a figura representa apenas a liberação no meio de dissolução alcalina. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) com base em cinco amostras em cada ponto. BD-EDA-alg denomina grânulos de alginato de etilenodiamônio carregados com BD; BD-Ca-alg significa grânulos de alginato de cálcio carregados com BD;

A Figura 3 mostra a concentração de HRP em quatro compartimentos gastrointestinais (estômago, ceco pilórico, intestino médio e distal) de três grupos de Salmão do Atlântico (Ca-alginato, EDA-alginato e Controle). As barras de erro representam intervalos de confiança de 95%. O grupo de Ca-alginato recebeu HRP encapsulado de alginato de cálcio (HRP-Ca-alg). O grupo de EDA-alginato recebeu alginato de etilenodiamônio encapsulado HRP (HRP-EDA-alg). O grupo Controle não recebeu nenhum HRP.

A presente invenção fornece um novo sistema de distribuição oral para a distribuição de agentes bioativos ao intestino. Esse sistema de distribuição oral é particularmente adequado para uso em organismos com trato intestinal curto, como peixes carnívoros. Em particular, o sistema de distribuição oral é adequado para a distribuição oral de substâncias bioativas para animais ectotérmicos que podem ter uma digestão em baixas temperaturas.

Na presente invenção, o alginato de sódio é reticulado com dicloridrato de etilenodiamina para formar alginato de etilenodiamônio. A vantagem desse método é que nenhum outro produto químico está envolvido. Além disso, o método descrito para reticular o alginato com cloridrato de etilenodiamônio é mais rápido, mais fácil, menos dispendioso e não envolve produtos químicos perigosos em comparação com outros métodos conhecidos.

De acordo com a presente invenção, o alginato de etilenodiamônio é utilizado como um sistema de distribuição oral para agentes bioativos, em particular nos peixes. Os agentes são encapsulados ou aprisionados na matriz de alginato de etilenodiamônio durante o processo de alginato de reticulação com de dicátions de etilenodiamônio. De preferência, são produzidos pequenos microgrânulos de alginato durante esse processo de reticulação consistindo em duas etapas principais: 1) gerar as gotículas de alginato por dispositivos como spray ou cabeças de jato equipadas com bocais como os encontrados no jato aerodinamicamente auxiliado ou através de outros métodos conhecidos pelos versados na técnica para gerar gotículas de líquidos (por exemplo, jato aerodinamicamente auxiliado, dissipação de jato de tinta laminar eletromagnética, impressão a jato de tinta, impressão em 3D, pulverização eletrônica, gotejamento induzido por fluxo de ar coaxial etc.); 2) coletar as gotículas de alginato na solução de reticulação contendo etilenodiamônio. Alternativamente, um método de emulsão (por exemplo, coacervação, gelificação interna e externa, etc.) pode ser usado em combinação com etilenodiamônio.

A matriz de alginato de etilenodiamônio pode ter, tipicamente, o formato de qualquer forma geométrica de partícula para partículas, por exemplo, fibra, esfera, toroide, elipsoide e também fibras e flocos. De preferência, as partículas são de forma regular, embora a referida matriz de alginato também possa estar na forma de uma partícula de forma irregular. Em uma modalidade preferida, a referida matriz está na forma de grânulos, mais preferencialmente, na forma de grânulos esféricos.

Os grânulos de alginato resultantes compreendendo os agentes bioativos podem ser administrados enteralmente tanto na alimentação como exalimentação (de forma independente, sem considerar alimentação) para direcionar organismos. O tamanho médio de partícula preferido dos grânulos de alginato varia de 1 μm a 10 mm. Para associação a péletes de alimentação em um revestidor a vácuo, o tamanho médio de grânulos de alginato pode variar tipicamente de 300 μm e 2000 μm. Contudo, o tamanho médio preferido para a adição pré-extrusão é inferior a 300 μm. Os tamanhos de partículas preferidos são inferiores a 300 μm, mais preferivelmente inferiores a 100 μm e mais preferivelmente inferiores a 25 μm. O tamanho médio preferido dos grânulos de alginato para administração autônoma (sem cooperar em uma alimentação) é superior a 100 μm. Para esse uso, o tamanho preferido dos grânulos dependerá, tipicamente, de ambos, tamanho do animal e dose alvo, e pode ser ajustado de forma correspondente. No entanto, a via preferida de administração para peixe é a via oral com grânulos de alginato na alimentação.

Os pequenos grânulos de alginato compreendendo os agentes bioativos são de preferência incorporados em péletes de alimentação por um método adequado tal como revestimento de infusão a vácuo, antes de serem administrados oralmente a organismos alvo, tais como um peixe. Alternativamente, os grânulos podem ser misturados com outros ingredientes alimentares antes de peletização. Esses ingredientes podem, por exemplo, ser componentes de alimentação convencionais conhecidos por um versado na técnica. De preferência, os grânulos de alginato que compreendem um ou vários ingredientes bioativos são misturados com farinha inicial (mistura seca constituída por todos os ingredientes de alimentação, exceto pelo óleo) antes da extrusão ou qualquer outro meio de preparação de péletes de alimentação.

Uma descrição detalhada de um método preferido de acordo com a presente invenção para reticulação de alginato com dicloridrato de etilenodiamina, assim como um método preferido para a produção de pequenos grânulos de alginato de etilenodiamônio carregados com um ou mais agentes bioativos é fornecido na seção experimental a seguir. Além disso, é proporcionado um método preferido de acordo com a presente invenção para incorporar os grânulos de alginato aos péletes de alimentação na referida seção experimental.

Seção experimental:

A eficácia de alginato de etilenodiamônio (EDA-alginato) foi testada e provada em duas diferentes configurações experimentais in vitro e in vivo. Os resultados obtidos foram comparados com um sistema de distribuição oral comum baseado em alginato reticulado com Ca2+ (Ca- alginato).

Conforme descrito acima, as condições digestivas em peixes, sendo ectotérmicas e especialmente em peixes carnívoros com intestino curto, diferem de muitos outros organismos, especialmente de mamíferos e humanos. Por conseguinte, na presente invenção, o sistema de distribuição oral, de acordo com a presente invenção, foi testado tanto em um teste de dissolução padrão bem como em um teste que foi adaptado às condições digestivas que são representativas dos peixes salmonídeos ectotérmicos. Em primeiro lugar, foi avaliada a liberação de dextrano azul de Ca-alginato e EDA-alginato in vitro em um teste de dissolução padrão (pH 1,2 e pH 6,8 a 37°C). Em segundo lugar, a liberação dos mesmos alginatos foi testada em meios de dissolução alcalina de pH 8,0 e pH 8,6 a 18°C. Com base nos resultados dos testes anteriores, desenvolveu-se uma nova estratégia de teste de dissolução (pH 3,0 seguido de pH 8,6 a 4°C ou a 18°C).

Finalmente, foi avaliada a liberação de peroxidase de rábano (HRP) de ambos o Ca-alginato e EDA-alginato in vivo em um ensaio de alimentação para provar a adequação do alginato de etilenodiamônio como sistema de distribuição oral para macromoléculas em peixes.

4.1 Materiais utilizados nos experimentos

O alginato de sódio (Protanal LF 20/40) foi obtido junto a FMC BioPolymer AS (Noruega). A Peroxidase de Rábano (HRP, P/N 31491, Thermo Fisher Scientific) foi adquirida junto Perbio Science UK Ltd. A água desionizada (água DI, reagente analítico) foi adquirida da Fishe Chemical Ltd. (Reino Unido). Os seguintes reagentes foram adquiridos da VWR Ltd (Reino Unido): cloridrato de cálcio diidratado (AnalaR NORMAPUR®, reagente analítico ACS), bicarbonato de sódio (AnalaR NORMAPUR®, reagente analítico ACS), hidróxido de sódio (>98%, flocos, Alfa Aesar), hidrogenoftalato de potássio (>99%, Alfa Aesar) e ácido clorídrico (37%, AnalaR NORMAPUR®, reagente analítico). Os seguintes reagentes foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich Ltd. (Reino Unido): diidrato de etilenodiamina (98%, Aldrich), glicina (> 99%, ReagentPlus®), fosfato dissódico diidratado (> 99%, reagente analítico), fosfato monossódico di- hidratado (> 98%, reagente analítico), dextrano azul, BD (M.W. = 2.000.000; [azul reativo 2] = 0,10 a 0,12 mmol g-1 dextrano) e sistema de substrato líquido d 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina (TMB) (pronto para uso). EWOS Opal 200 granulado de base (BP, 5,8% de gordura) foi produzido no Technology Centre of EWOS Innovation AS em Dirdal (Noruega). O óleo de peixe (EWOS ID: 20180) foi adquirido junto a Egersund Sildoljefabrikk AS (Egersund, Noruega).

Soluções-mães:

A formulação de encapsulamento de dextrano azul (BD- EncForm) foi preparada por dissolução de alginato de sódio (2,0% p/v) em uma solução de BD (50,0 mg ml-1) à temperatura ambiente. Tampão pH 1,2: Preparou-se o tampão de cloreto de sódio/ácido clorídrico (NaCl/HCl, pH 1,2) misturando a solução de NaCl (250 ml, 23,38 gl-1, NaCl a 0,4 M) com solução de HCl a 0,4 M (425 ml). Antes de completar o volume para 1000 ml com água DI, o pH de solução tampão foi ajustado para 1,2. Tampão pH 3,0: solução de hidrogenoftalato de potássio (500 ml, 81,69 gl-1, KPH a 0,4 M) foi combinado com solução de HCl (223 ml, HCl a 0,4 M) para produzir uma solução-mãe do tampão KPH/HCl (pH 3,0). A solução tampão foi reabastecida com água DI até um volume total de 1000 ml. Tampão pH 6,8: Solução de diidrato de fosfato monossódico (255 ml, 62,40 g l-1, NaH2PO<2H2O a 0,4M) foi misturado com solução de diidrato de fosfato dissódico (245 ml, 71,20 g l-1, Na2HPO<2H2O a 0,4M) para formar tampão fosfato (pH 6,8). O tampão resultante foi ajustado para pH 6,8 antes de nivelar o volume para 1000 ml com água DI. Tampão pH 8,0: Tampão de fosfato (pH 8,0) foi preparado combinando solução de diidrato de fosfato monossódico (26,5 ml, 62,40 g l-1, NaH2PO<H2O a 0,4M) com solução de diidrato de fosfato dissódico (473,5 ml, 71,20 g l-1, Na2HPO<2H2O a 0,4M). A solução tampão resultante foi ajustada para pH 8,0 e depois diluída com água DI até um volume final de 1000 ml. Tampão pH 8,6: Solução de glicina (250 ml, 30,03 g l-1, Gly 0,4M) foi misturado com solução de hidróxido de sódio (20 ml, 16 g l-1, NaOH 0,4 M) para produzir o tampão Gly/NaOH. Depois de ajustar o pH para 8,6, a solução tampão gerada foi diluída para um volume de 1000 ml com água DI. Bicarbonato de sódio (150 g l-1NaHCO3) foi dissolvido em água DI para produzir uma solução de NaHCO3 saturado. Quaisquer cristais de NaHCO3 não dissolvidos foram filtrados antes da utilização.

A formulação de encapsulamento de Peroxidase de Rábano (HRP) (HRP-EncForm) foi preparada por dissolução de alginato de sódio (2,0% p/p) em uma solução de HRP (400 μg ml-1 de água DI) a 4°C.

A solução-mãe HRP (5 mg ml-1) foi preparada por dissolução de pó de HRP (10,0 mg) em água DI (2,0 ml). As alíquotas dessa solução de HRP (20,0 μl) foram armazenadas a -20°C antes da construção das curvas padrão no ensaio enzimático.

As soluções de reticulação (CaCl2 sol. e EDA^2HCl sol.) foram preparadas por dissolução separadamente de cloreto de cálcio di-hidratado (36,8 gl-1, CaCl^2H2O a 0,25M) e dihidrocloreto de etilenodiamina (33,3 g l- 1, EDA-2HCl a 0,25M) em água DI.

4.2 Teste de dissolução in vitro de microgrânulos de alginato

O dextrano azul (BD) foi selecionado como um composto modelo para a liberação simulada de ingredientes farmacêuticos ativos (API) a partir de matrizes de alginato. Preparação de grânulos de alginato carregadas com dextrano azul BD-EncForm ([BD] = 50,0 mg ml-1) foi extrudido a partir de uma seringa de plástico de 60 ml (BD Plastipak™) através de uma agulha (i.d. = 2,0 mm) nas soluções de reticulação. A taxa de fluxo (50,00 ml h-1) foi mantida constante por uma bomba de seringa (Harvard PHD4400, Harvard Apparatus Ltd, Edenbridge, Reino Unido) trabalhando no modo de volume (volume alvo = 1,50 ml). Essa configuração foi utilizada para extrudar 80 lotes de BD-EncForm a 1,50 ml cada. As soluções de reticulação, CaCl2 sol. (40 x 10,0 ml) e EDA^2HCl sol. (40 x 10,0 ml) foram usados render grânulos de BD-Ca-alg (40 lotes) e BD-EDA-alg (40 lotes), respectivamente. Comum para cada lote foi que os grânulos de alginato foram separados da solução de reticulação 10 minutos após a última gota ser gerada. Posteriormente, os grânulos de alginato recuperadas carregadas com BD foram lavadas com água DI (3 x 5 ml). Foram utilizados grânulos de BD-Ca- alg (10 lotes) e BD-EDA-alg (10 lotes) para determinar a eficiência de 18 encapsulamento enquanto os demais lotes foram utilizados em testes de dissolução. A distribuição de tamanho de partícula e a forma foram determinadas por um microscópio estéreo (Leica MZ10 F, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).

Eficiência de encapsulamento de dextrano azul

Adicionaram-se grânulos BD-Ca-alg (10 lotes) e BD-EDA-alg (10 lotes) a solução de NaHCO3 saturada (20 x 9,0 ml, pH = 8,0). Como resultado, todos grânulos foram completamente dissolvidos após duas horas sob agitação. Para igualar todos os volumes da amostra, o nível das soluções resultantes foi ajustado para 10 ml com água DI. Essas soluções recém-criadas (n = 20) foram filtradas através de filtros de seringa (0,45 μm, VWR) antes da aplicação em uma placa de poliestireno de 96 poços (Nunc™, Sigma-Aldrich) para um ensaio de desfecho. A absorvância de BD foi medida usando um leitor de microplacas VERSAmax (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA) a 610 nm e 24°C. A concentração de BD das amostras foi determinada usando curva padrão no intervalo de 1,0 a 3,9 x 10-3 mg ml-1. As curvas padrão foram geradas traçando-se as concentrações de BD de nove diluições em série duplas da solução BD (1,0 mg ml-1) versus absorvência. A solução BD (1,0 mg ml-1) foi derivada de BD-EncForm ([BD] = 50,0 mg ml-1) usando solução de NaHCO3 saturada como diluente.

A. Teste de dissolução padrão

O testador de dissolução (Caleva 8ST, Caleva International Ltd, Reino Unido) equipado com vasos de dissolução (V = 1000 ml) e cestas rotativas de aço inoxidável (40 mesh) foi utilizado para avaliar a liberação de BD dos dois tipos diferentes de grânulos de alginato. Essa configuração estava de acordo com os requisitos padrão para o Aparelho 1 estabelecido por United States Pharmacopoeia (USP) e descrito no Capítulo Geral <711>.

Foi adicionado meio de dissolução (300 ml; tampão NaCl/HCl, pH 1,2 ou tampão fosfato, pH 6,8) em cada um dos vasos e depois foi deixado para temperar durante a noite a 37°C. O experimento de dissolução começou dentro de 2 h após a produção de grânulos de alginato de acordo com o método descrito acima. Os grânulos de alginato (BD-Ca- alg ou BD-EDA-alg) foram colocados em cestas rotativas (100 rpm) e submersas em vasos de dissolução. As seguintes experiências foram realizadas em quintuplicado a 37°C: Teste 1) BD-Ca-alg a pH 1,2, Teste 2) BD-EDA-alg a pH 1,2, Teste 3) BD-Ca-alg a pH 6,8 e Teste 4) BD-EDA-alg a pH 6,8.

As amostras (amostra de 1,0 ml-1) foram retiradas do recipiente em intervalos de cinco minutos por uma extensão de 50 minutos. Foi então adicionado um volume equivalente de meio de dissolução (1,0 ml, 37°C) para manter o nível de líquido constantes nos vasos. Todas as amostras foram filtradas através de um filtro de seringa (0,45 μm, VWR) antes de colocá-las em uma placa de poliestireno de 96 poços (Nunc™, Sigma- Aldrich) para um ensaio de desfecho. A leitura da placa foi realizada por um leitor de microplacas VERSAmax (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA) a 610 nm e 24°C. A quantidade de BD liberada foi determinada pela aplicação da abordagem de curva padrão. As curvas padrão foram geradas traçando-se as concentrações de BD de nove diluições em série duplas da solução BD (1,0 mg ml-1) versus absorvência no intervalo de 1,0 a 3,9 x io-3 mg ml-1. A solução BD (1,0 mg ml-1) foi derivada de BD-EncForm ([BD] = 50,0 mg ml-1) usando o tampão experimental como diluente.

B. Avaliação de meios de dissolução alcalina

Para selecionar um meio de dissolução alcalina, que é representativo do intestino do salmão em termos de temperatura e pH, foram realizados quatro testes de dissolução como descrito na seção anterior. Os seguintes experimentos foram realizados com cinco repetições, cada um, em meio de dissolução (tampão de fosfato, pH 8,0 e tampão de Gly/NaOH, pH 8,6) a 18°C: Teste 5) BD-Ca-alg a pH 8,0, Teste 6) BD-EDA -alg a pH 8,0, Teste 7) BD-Ca-alg a pH 8,6 e Teste 8) BD-EDA-alg a pH 8,6. A concentração de BD nas amostras foi determinada da mesma maneira que descrita anteriormente no teste de dissolução padrão.

C. Uma nova estratégia de teste de dissolução adaptada aos peixes

As condições aplicadas neste teste estavam de acordo com as condições em que as esferas de alginato tipicamente poderiam ser expostas durante a passagem pelo trato gastrointestinal de Salmão do Atlântico. Consequentemente, os grânulos de alginato foram primeiramente submersos em meio de dissolução ácida (tampão KPH/HCl, pH 3,0) durante 15 min e depois a solução de tampão ácida foi substituída por um meio de dissolução alcalina (tampão de fosfato, pH 8,0). Neste teste, o mesmo Aparelho UPS 1 como descrito anteriormente foi usado. A fim de replicar as condições naturais em que Salmão do Atlântico vivem o máximo possível, foram aplicadas duas temperaturas diferentes (4°C e 18°C) no teste. As temperaturas escolhidas geralmente correspondem às temperaturas da água durante o verão e o inverno na costa norueguesa. Por esta razão, os seguintes quatro testes de dissolução foram realizados em quintuplicado: Teste 9) BD-Ca-alg a pH 3,0 - 8,0 e 4°C, Teste 10) BD-EDA-alg a pH 3,0 - 8,0 e 4°C, Teste 11) BD-Ca-alg a pH 3,0 - 8,0 e 18°C, Teste 12) BD-EDA- alg a pH 3,0 - 8,0 e 18°C. A primeira amostra foi retirada após 15 min no tampão KPH/HCl (pH 3,0). A amostragem adicional, iniciada 5 min após a substituição do meio de dissolução, foi conduzida como descrito anteriormente no método padrão. Da mesma forma, o ensaio de desfecho foi realizado de acordo com o método descrito nas seções anteriores. A eficiência de encapsulamento de BD foi levada em consideração quando se calcula a liberação de porcentagem de grânulos de alginato.

Análise estatística

Os perfis de dissolução de BD mostrados como curvas da porcentagem média de liberação cumulativa de BD com barras de erro (intervalos de confiança de 95%) ao longo do tempo foram gerados usando a análise de dados e as funções de gráfico Scatter no Microsoft Excel 2010. Resultados

A eficiência média de encapsulamento de BD em BD-Ca-alg e BD-EDA-alg foi de 90% (SD = 4%) e 70% (SD = 4%), respectivamente. O tamanho médio dos grânulos de Ca-alginato foi de 3,0 mm enquanto o tamanho médio do grânulo de EDA-alginato foi de 3,7 mm. A forma dos grânulos foi esférica para ambos os tipos de grânulos (Fig. 1).

A liberação de BD a partir dos grânulos de Ca-alginato e EDA- alginato estava abaixo do limite de quantificação (LoQ = 3,9 x 10-3 mg ml-1) do ensaio nos testes de dissolução padrão (Teste 1 e 2 realizados a pH 1,2 a 37°C; Ensaio 3 e 4 realizados a pH 6,8 a 37°C). De modo semelhante, a liberação de BD a partir de ambas os grânulos de alginato foi inferior a LoQ nos ensaios realizados no meio de dissolução alcalina (Teste 5 e Teste 6 realizados a pH 8,0 a 18°C; Teste 7 e Teste 8 realizados a pH 8,6 a 18°C). A partir do presente estudo in vitro pode ver-se que tanto a matriz de Ca-alginato como a matriz de EDA- alginato são pouco solúveis em tampões com pH 1,2 a 37°C, pH 6,8 a 37°C, pH 8,0 a 18°C e pH 8,6 a 18°C dentro de um prazo de 50 minutos. Nos testes de dissolução (Teste 9-12) adaptados às condições em que os peixes salmonídeos digeriram o alginato, observou-se liberação significativa de BD nos quatro experimentos. A liberação, que estava abaixo de LoQ a pH 3,0, foi bastante rápida após o aumento do pH de pH 3,0 para pH 8,0. A partir do Teste 12 a 18°C (Figura 2), pode-se observar que 50% de BD foi liberado de BD-EDA-alg após 23 minutos, enquanto que 85% de BD foram liberados após 40 min. Conforme observado no Teste 10 com os mesmos grânulos de BD-EDA-algalina realizados a 4°C, 50% e 85% de liberação foram registrados após 19 e 39 min, respectivamente. A taxa de dissolução de BD-Ca-alg (Teste 11) foi um pouco menor a 18°C do que a taxa de libertação de BD-EDA-alg a 4°C e 18°C. Como resultado, 50% de BD estava livre em solução após 26 min. Além disso, 85% de BD foram liberados dentro de 48 minutos. No entanto, com apenas 30% de BD dissolvidos após 49 minutos, a taxa de dissolução de BD-Ca-alg a 4°C (Teste 9) foi muito menor em comparação com os outros três testes. As estimativas anteriores das taxas de dissolução foram calculadas utilizando as aproximações de segunda ordem mostradas na Tabela 1. Tabela 1: Curvas de dissolução relacionadas à liberação da liberação de dextrano azul (BD) a partir de cálcio (BD-Ca-alg) e alginato de etilenodiamônio (BD-EDA-alg) a 4°C e 18°C. As aproximações de primeira e segunda ordem das curvas de dissolução são mostradas com coeficientes de determinação correspondentes (R2). Os dados se encaixam muito bem tanto na função linear quanto na não linear no intervalo de tempo de 0 a 50 minutos após a mudança do meio de dissolução. As drogas, que são encapsuladas em matrizes de alginato, são liberadas principalmente por dois mecanismos: 1) difusão da droga através dos poros da rede de polímeros e 2) degradação da rede de polímeros. Ao contrário das drogas de baixo peso molecular, o dextrano azul (M.W. = 2.000.000) é tão grande que não pode difundir através dos poros de uma matriz de alginato sem sua expansão adicional (Kim, C. and Lee, E., 1992. The controlled release of blue dextran from alginate beads. Int. J. Pharm. 79, 11-19). Portanto, a maior parte da liberação de BD das matrizes de alginato provavelmente ocorre devido à degradação da rede de polímeros. Em estudos anteriores, observou-se uma taxa de liberação muito baixa de isotiocianato de dextrano de fluoresceína (M.W. = 145.000) a pH 7,4 durante a primeira hora.

Prevê-se que uma pequena degradação de EDA-alginato ocorra a pH 3,5 - 7,0, uma vez que a maior parte da etilenodiamina (forma não carregada) existirá como etilenodiamônio (carregado positivamente) a pH < 7,0 e a maior parte do alginato (ácido algínico) será desprotonada (carregado negativamente) a pH > 3,5.

De acordo com os resultados experimentais apresentados na presente invenção, uma maneira eficaz de enfraquecer a estrutura reticulada de uma matriz de alginato é usar um meio de dissolução ácida (pH < 3,5) antes de aplicar um meio alcalino (pH > 7,0). Sem estar ligado à teoria, o seguinte mecanismo pode ser aplicado: a um pH abaixo de 3,5 (ácido algínico, pKa = 1,5-3,5), íons de hidrogênio (H+) aparentemente substituem o etilenodiamônio em redes de alginato produzindo uma estrutura desvinculada de ácido algínico. Embora o ácido algínico seja pouco solúvel em água, é facilmente conversível em uma forma solúvel em água (por exemplo, alginato de sódio) a um pH maior. Ao mesmo tempo, um pH alcalino crescente (pH > 7,0) reduz a força de reticulação do etilenodiamônio através da desprotonação dos seus grupos amina e a conversão em etilenodiamina, a forma não carregada. Como consequência, um tratamento anterior com meio ácido (pH < 3,5) pode dar uma taxa de liberação muito mais rápida do que o tratamento direto com um meio alcalino (pH > 7,0). Portanto, as condições padrão comumente aplicadas nos testes de dissolução (pH = 1,2 e 6,8 a 37°C) resultam muito frequentemente em taxas de dissolução muito lentas.

Por aplicação subsequente de meio com pH = 3,0 seguido de pH = 8,0, as altas taxas de liberação mostradas na Figura 2 foram alcançadas. Conforme mencionado acima, colocar grânulos de alginato em um tampão ácido (pH = 3,0) por um curto período de tempo parece converter parte do EDA-alginato em ácido algínico. Consequentemente, o ácido algínico e qualquer EDA-alginato remanescente serão facilmente dissolvidos quando o tampão ácido for substituído por um tampão alcalino (pH = 8,0), enquanto EDA ficará menos carregado. Do mesmo modo, a taxa de desintegração da matriz de Ca-alginato está acelerando com o aumento do pH do meio de dissolução. Ao mesmo tempo, a atração de sódio carregado (Na+) para grupos carboxílicos de alginato está aumentando quando o pH for superior a 8 (Oberyukhtina, I., Bogolitsyn, K., Popova, N., 2001. Physicochemical properties of solutions of sodium alginate extracted from brown algae Laminaria digitata. Russ. J. Appl., 74, 1645-1649). Por outro lado, o fosfato de cálcio pode já começar a precipitar a partir de um sistema que contém Ca2+ e tampão fosfato a pH > 6,7 (Feenstra, T.P., De Bruyn, P.L., 1979. Formation of calcium phosphates in moderately supersaturated solutions. J. Phys. Chem. 83, 475-479). Através da presente invenção e a nova estratégia de teste de dissolução desenvolvida, pode-se mostrar que o EDA-alginato tem uma alta eficiência e potencial como sistema de distribuição oral em condições normalmente encontradas em peixes, onde o pH gástrico é de 2,7 a 4,9 e o pH intestinal é de 7,5 a 8,5. Sabe-se geralmente que a dissolução dos alginatos reticulados é dependente do pH e dependente da temperatura. A partir da Figura 2, pode-se concluir que a dissolução de EDA-alginato é dependente do pH, mas surpreendentemente não é afetada pela temperatura na faixa de 4 a 18°C. Em contraste, a taxa de liberação de BD a partir da matriz de Ca- alginato foi significativamente menor do que a taxa de liberação tanto de EDA-alginato a 4°C como de Ca-alginato a 18°C. Isso está de acordo com os resultados do teste in vivo que foi realizado a 5°C (ver abaixo). Assim, através da presente invenção, pode-se comprovar que o alginato de etilenodiamônio é particularmente adequado como um sistema de distribuição oral em organismos poiquilotérmicos tal como peixe.

4.3 Teste de dissolução in vivo de microgrânulos de alginato

O desempenho de alginato de etilenodiamônio como um sistema de distribuição oral de acordo com a presente invenção foi testado adicionalmente em um experimento in vivo com salmão do Atlântico (Salmo salar).

Preparação de microgrânulos de alginato carregados com HRP:

Os microgrânulos de alginato de cálcio (HRP-Ca-alg) e o alginato de etilenodiamônio (HRP-EDA-alg) carregados com HRP foram produzidas em um processo de encapsulamento referido como jato aerodinamicamente auxiliado. No processo de jato aerodinamicamente auxiliado, o jato de gotículas de alginato foi gerado pela extrusão de HRP- EncForm (2 x 240,0 g) através de uma cabeça de jato por meio da pressão do ar. A cabeça de jato foi equipada com um bocal (0 = 500 μm) e um orifício de saída (0 = 500 μm) do mesmo tamanho. O jato criado foi direcionado para a superfície de uma solução de reticulação a uma distância de 100 mm. As soluções de reticulação, CaCl2 sol. (500 ml, 4°C) e EDA^2HCl sol. (500 ml, 4°C) foram utilizadas para produzir microgrânulos HRP-Ca-alg (240,0 g) e HRP-EDA-alg (240,0 g), respectivamente. A taxa de fluxo (100 ml h-1) da solução de alginato foi controlada por uma bomba de seringa de alta precisão (PHD 4400, Harvard Apparatus Ltd, Edenbridge, Reino Unido). A pressão do ar no processo foi mantida a 3,00 bar por um regulador de precisão (IR1000, SMC Corporation, Tóquio, Japão). Os microgrânulos resultantes foram filtrados mediante filtração por sucção e lavadas com água DI (3 x 20 ml) antes de armazenar a -20°C. A massa obtida de microgrânulos HRP-Ca-alg e HRP-EDA-alg foi de 81,54 g e 78,29 g, respectivamente. O sistema de difração a laser (HELOS BR CUVETTE, CUV-50ML/US, módulo óptico R5, Sympatec GmbH, Clausthal-Zellerfeld, Alemanha) foi utilizado para medir o tamanho dos grânulos de alginato gerados no comprimento de onda À = 632,8 nm. O diâmetro médio das microgrânulos foi de 25-26 μm.

Se os grânulos obtidos tiverem de ser incorporados em um pelete de alimentação através da superfície, o diâmetro dos microgrânulos deve corresponder ao tamanho de poro do pelete. Isso é conseguido através do método descrito acima.

Preparação dos alimentos experimentais

Foram produzidos dois alimentos experimentais compreendendo HRP (5,0 kg por lote) que incluíram aplicando-se microgrânulos de HRP-alg (dmediana = 25 - 26 μm) suspenso em óleo de peixe (1210,0 g) para o pelete de base de EWOS Opal 200 (BP) em um processo de revestimento por infusão a vácuo (Tabela 2). Tabela 2: Composição dos alimentos experimentais HRP-Ca- alimento, HRP-EDA-alimento e Ctrl-alimento HRP na matriz de Ca-alginato iiHRP-EDA-alg - produto produzido pelo encapsulamento da solução de HRP em matriz de EDA-alginato iiiBP - pelete de base é um produto semi-acabado para alimentação de peixe, extrudado seco sem mistura de óleo O HRP-Ca-alimento foi preparado por revestimento de BP (3708,46 g) com suspensão de óleo contendo HRP-Ca-alg (81,54 g) enquanto HRP-EDA-alimento foi preparado através da aplicação de suspensão de óleo contendo HRP-EDA-alg (78,29 g) para BP (3711,71 g) em um revestidor a vácuo. O alimento de controle (Ctrl-alimentação) sem HRP foi produzido mediante revestimento de BP (3790,00 g) apenas com óleo de peixe (1210,00 g).

Ensaio de peixe

O Salmão do Atlântico Salmo salar(Número total: n = 495, mmédia = 394 g) foram distribuídos aleatoriamente entre nove tanques de água de mar circular (d = 1 m, V = 0,5 m3, tágua = 5°C) em EWOS Innovation AS (Dirdal, Noruega) nove semanas antes do início do teste. Os tanques foram divididos aleatoriamente em três grupos (Ca-alginato, EDA-alginato e Controle), sendo três tanques atribuídos a cada grupo. Após um estágio de aclimatação de nove semanas de duração, o grupo de alginato de Ca- alginato e EDA-alginato foi tratado com HRP-Ca-alimento e HRP-EDA- alimento, respectivamente. O grupo de controle foi alimentado com Ctrl- alimento. O tratamento durou duas semanas após o qual seguiu uma amostragem. O estado de saúde de peixe foi muito bom durante o período de 11 semanas do teste.

Amostragem

Antes da amostragem, peixes (n = 15 peixes por tanque) foram anestesiados com Finquel® (100 mg l-1). O peso de peixes individuais foi registrado para cada peixe amostrado. As seguintes amostras foram coletadas 1) Estômago, 2) Ceco Pilórico, 3) Intestino Médio e 4) Intestino Distal. Cada um dos compartimentos gastrointestinais amostrados foi aberto por incisão longitudinal e colocado em um recipiente com água DI (10,0 ml, t = 4°C). Após agitação vigorosa, o conteúdo sólido foi separado da fase líquida por meio de filtração por gravidade. O filtrado resultante (2 ml) de cada recipiente foi transferido para um tubo de Eppendorf e armazenado a -20°C até o ensaio.

Análise de amostra

As amostras foram descongeladas e centrifugadas a 4000 rpm por quatro minutos antes da utilização. As amostras de ceco pilórico de estômago foram aplicadas sem diluir, enquanto as amostras de intestino médio e distal foram diluídas 1:200 com água DI (4°C) antes do ensaio. Para amostras de intestino médio e distal diluídas (1:200) abaixo do limite de quantificação (0,391 ng ml-1), diluições mais baixas como 1:10 e 1:100 ou nenhuma diluição foram utilizadas para aumentar a sensibilidade. O ensaio cinético foi realizado por pipetagem de alíquotas de amostras (50 μl) em placas de poliestireno de 96 poços (Nunc™, Sigma-Aldrich). A reação foi iniciada pela adição de substrato líquido 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina (TMB) (50 μl, 37°C). As medidas de absorção foram feitas usando um leitor de microplacas VERSAmax (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA) a 655 nm. As taxas cinéticas foram registradas a cada 20 segundos durante um total de 10 minutos a 37°C. A concentração de HRP das amostras foi determinada usando a curva padrão como uma ferramenta de quantificação na faixa de 0,391 a 200 ng ml-1. Uma curva padrão foi gerada ao traçar as concentrações de HRP de 10 diluições em série duplas da solução de HRP (200 ng ml-1) contra suas taxas cinéticas (inclinação das curvas de absorção versus tempo).

Análise estatística

As concentrações médias de HRP com barras de erro (intervalos de confiança de 95%) encontradas em diferentes compartimentos do trato gastrointestinal foram calculadas e representadas em um gráfico usando o IBM SPSS Statistics for Windows, versão 22.0.

Resultados

No ensaio atual, um peixe consumiu 12-13 g de alimentação, em média, durante o tratamento com alimentos contendo alginato de HRP encapsulado. Como resultado, o peixe tratado (mmédia = 490 - 500 g) recebeu entre 230 e 240 μg de HRP no período (Tabela 3). Tabela 3: Dose de HRP relacionada ao tamanho de peixe na unidade de massa e o consumo semanal de ração (FI) por peixe. A dose é mostrada como uma dose semanal de HRP por peixe (μg de peixe-1 semana-1) e uma dose semanal de HRP por unidade de massa de peixe (μg de peixe-1 semana-1). Alimentos utilizados: sem HRP (Ctrl-alimento), com HRP encapsulado com alginato de cálcio (HRP-Ca-alimento), HRP encapsulado de alginato de etilenodiamônio (HRP-EDA-alimento). iDose de HRP é teórica e assume uma perda muito pequena devido ao processamento.

O grupo de peixe (Ca-alginato) alimentado com HRP-Ca- alimento apresentou uma concentração significativamente maior de HRP no intestino distal em comparação aos outros compartimentos gastrointestinais (GI) (Fig. 3). Por outro lado, o peixe alimentado com HRP-EDA-alimento apresentou uma concentração significativamente maior de HRP no intestino médio do que nas outras seções GI. Além disso, esse grupo também apresentou uma concentração de HRP significativamente maior no intestino distal. Em contraste com os grupos tratados com HRP, a atividade de peroxidase era bastante baixa no grupo controle.

A partir da Figura 3, pode-se observar que a liberação de HRP é significativamente mais rápida a partir de alginato de EDA do que de grânulos de Ca-alginato. De acordo com os resultados do presente experimento, não se espera que a liberação de droga do EDA-alginato seja afetada por mudanças sazonais de temperatura no habitat de Salmão do Atlântico. Esses atributos demonstrados no presente estudo tornam surpreendentemente um sistema de distribuição oral baseado em EDA- alginato muito eficiente em relação a peixes como Salmão do Atlântico.

Em conclusão, por meio da presente invenção, não foi apenas mostrado que existem diferenças entre matrizes de alginato reticuladas de forma diferente, mas também um novo sistema de distribuição oral mais eficiente poderia ser identificado. As diferenças entre o EDA-alginato e o Ca-alginato são particularmente evidentes em relação às taxas de dissolução a baixas temperaturas. Isso é altamente relevante para os organismos ectotérmicos que vivem a baixas temperaturas, como o salmão do Atlântico. Para reconhecer essas características de grânulos de alginato, a nova estratégia de teste de dissolução acima mencionada foi desenvolvida. Essa nova estratégia torna o teste de dissolução altamente representativo das condições gastrointestinais encontradas nos peixes com estômago. Como consequência, os resultados gerados pelo teste de dissolução redesenhado estão em forte correlação com os resultados obtidos a partir do presente estudo in vivo. No geral, o EDA-alginato é um excelente sistema de distribuição de medicamentos macromoleculares para animais ectotérmicos como o salmão. Além disso, existem evidências convincentes de que esse sistema de distribuição é surpreendentemente independente da temperatura dentro da faixa de temperatura do habitat da vida do salmão. A implicação prática dos resultados do presente estudo é que a quantidade de drogas entregue é independente da temperatura ambiental ao usar este novo sistema de distribuição oral.

A vantagem dos microgrânulos de alginato de etilenodiamônio como sistema de distribuição oral quando incorporada na alimentação de peixe e administrada por via oral a peixes, é que os grânulos se dissolvem eficientemente no intestino do peixe e distribuem o conteúdo no lugar certo para absorvência nas condições digestivas, como normalmente é encontrado em peixe. No entanto, a presente invenção, embora seja constatada como particularmente adequada para utilização em peixes, não se restringe a esse grupo de organismos e pode também ser utilizada como sistemas de distribuição oral para macromoléculas em mamíferos incluindo humanos, anfíbios, répteis, aves, crustáceos, moluscos, etc.

Agente bioativo de acordo com a presente invenção inclui qualquer droga, substância, composto, composição ou mistura destes, que são eficazes em terapia ou tratamento profilático em organismos e que são adequados para encapsulação no alginato e após a administração oral. Isso inclui agentes como proteínas, peptídeos, vacinas, anticorpos, antígenos, hormônios, drogas, particularmente medicamentos macromoleculares, aminoácidos, nucleotídeos, polinucleotídeos, enzimas, qualquer substância fisiologicamente ativa, nutrientes, prebióticos, probióticos, estimulantes imunológicos e similares.

No contexto da presente invenção, pelo termo "organismo de água fria" entende-se qualquer animal ectotérmico que normalmente vive em temperatura ambiental média de cerca de 20°C ou inferior. Do mesmo modo, um "peixe de água fria"é um peixe que vive em temperaturas médias da água de cerca de 20°C ou inferior. Exemplos típicos de peixes de água fria são peixes marinhos de água fria, como bacalhau e salmonídeos.

Pelo termo "trato intestinal curto" ou "intestino curto" em relação a um peixe significa que o comprimento total do intestino não é mais do que cerca de 2,5 vezes o comprimento corporal do referido peixe.

Será apreciado que as características da invenção descritas acima podem ser modificadas sem se afastar do escopo da invenção conforme definido nas reivindicações anexas.

Claims

1. SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL DE AGENTES BIOATIVOS caracterizado pelo fato de que compreende alginato de etilenodiamônio e pelo menos um agente bioativo para utilização em um tratamento terapêutico e/ou profilático em peixes de água fria, em que o agente bioativo é encapsulado ou aprisionado no alginato de etilenodiamônio, em que o alginato de etilenodiamônio está na forma de grânulos, e em que os grânulos de alginato de etilenodiamônio têm uma tamanho médio de partícula na faixa de 25 μm a 300 μm.

2. SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente bioativo é selecionado do grupo que consiste em proteínas, peptídeos, vacinas, anticorpos, antígenos, hormônios, enzimas, estimulantes imunológicos, drogas, probióticos, prebióticos, polinucleotídeos, nucleotídeos e aminoácidos.

3. SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peixe de água fria é um peixe que vive em temperaturas médias da água de 20°C ou inferior.

4. SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o peixe de água fria é de uma espécie selecionada de um grupo que consiste em salmonídeosou bacalhau.

5. SISTEMA DE DISTRIBUIÇÃO ORAL, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que os grânulos estão na forma de grânulos esféricos.

6. ALIMENTAÇÃO FUNCIONALPARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE AGENTES BIOATIVOS caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um agente bioativo encapsulado ou aprisionado em alginato de etilenodiamônio para uso em tratamento terapêutico e/ou profilático de peixes de água fria, em que o alginato de etilenodiamônio está na forma de grânulos, e em que os grânulos de alginato de etilenodiamônio têm uma tamanho médio de partícula na faixa de 25 μm a 300 μm.