KR20230171094A - 산성 환경에서 프로바이오틱스를 보호하는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 전달용 조성물 - Google Patents

산성 환경에서 프로바이오틱스를 보호하는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 전달용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체에 관한 것으로, 프로바이오틱스를 상기 복합체 내에 봉입함으로써 위액 환경에서도 하이드로겔 내부의 pH를 유지하여 위액에서의 프로바이오틱스 생존율을 높이고 대장으로의 전달률을 향상시킬 수 있다.

Description

산성 환경에서 프로바이오틱스를 보호하는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 전달용 조성물{Hydroxyapatite-Hydrogel Composite Protecting Probiotics in Acidic Environments, and Compositions for Delivering Probiotics Comprising the Same}
본 발명은 산성 환경에서 프로바이오틱스를 보호하는 프로바이오틱스 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 (Hydroxyapatite-Hydrogel Composite) 및 이들을 포함하는 프로바이오틱스 전달용 조성물을 제공한다.
프로바이오틱스는 살아있는 미생물로 적당량 복용 시 건강에 도움을 준다. 프로바이오틱스는 유산균인 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속과 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli ) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다.
프로바이오틱스의 생존은 프로바이오틱스에 의한 건강증진 효과에 주요하지만, 생산 및 보관, 섭취 후 상부 소화관에서의 환경적인 요인에 의해 프로바이오틱스의 생존률은 급격히 감소한다. 프로바이오틱스의 생존률에 영향을 주는 스트레스 요인에는 너무 높거나 낮은 온도, 동결, 탈수 내지 건조, 삼투압, 물리적 힘, 낮은 pH 등이 있다. 특히, 섭취 후 상부소화관을 지날 때, 위산에 의한 산성조건에서 대부분의 프로바이오틱스가 비활성화되거나 사멸한다.
어느 정도의 프로바이오틱스가 살아있는 상태로 장에 도달하여야 하는지에 대한 가이드라인은 없으나, 일반적으로 6 내지 7 log CFU/g 이상이 되어야 한다고 알려져 있다. 캡슐을 사용하여 프로바이오틱스를 봉입한 상용 제품의 경우, 산성조건에서 2시간동안 방치하였을 때 프로바이오틱스는 대부분 사멸한다고 보고된 바 있다.
이에, 외부환경에 대해 프로바이오틱스를 보호하기 위하여, 프로바이오틱스 전달 시스템연구가 주목을 받고 있다. 이상적인, 프로바이오틱스 전달 시스템은 1) 외부 스트레스 요인에 대해, 프로바이오틱스를 보호하고 2) 정확한 해부학적 위치 (anatomical site)에서 프로바이오틱스를 방출할 수 있어야 한다. 하지만, 프로바이오틱스는 식품 카테고리로 분류되고, 살아 있는 상태이기 때문에, 사용할 수 있는 물질과 방법이 상당히 제한된다. 그래서 프로바이오틱스 전달 시스템에 주로 쓰이는 방법은 식품 등급 (food grade)의 다당류를 사용한 하이드로겔 봉입 (hydrogel encapsulation)이 주로 사용된다.
그러나 하이드로겔의 특성인 다공성 구조 때문에 위산의 침투에 대한 보호효과는 미미한 수준이다. 이후, 추가적인 코팅을 수행하여, 위산이 전달 시스템 내로 투과하는 속도를 늦춤으로써 프로바이오틱스의 생존률을 높이고자 하였지만, 주로 양이온성 물질 (cationic material; 키토산, PLL 등)을 사용하는 바, 추가 공정에 높은 가격이 지불되어야 하고, 장기보관에 있어서 안정성을 담보할 수 없다는 문제가 존재하여, 여전히 연구가 필요한 실정이다.
1. 대한민국 등록특허 10-1840621호.
본 발명의 목적은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 (Hydroxyapatite-Hydrogel Composite) 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 (Hydroxyapatite-Hydrogel Composite)를 제공한다.
또한, 본 발명은 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 하이드록시아파타이트를 하이드로겔 용액에 혼합하는 단계; b) 프로바이오틱스를 하이드록시아파타이트 및 하이드로겔 혼합 용액에 첨가하여 2차 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 c) 상기 2차 혼합 용액을 염화칼슘 (CaCl2) 용액에 떨어뜨려, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 형성하고 프로바이오틱스를 봉입시키는 단계를 포함하는, 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 제조방법을 제공한다.
본 발명은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 1) 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체; 2) 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 및 이의 제조방법; 및 3) 이들의 용도에 관한 것으로, 균체의 외부 노출 시간이 짧고, pH 조절능을 부여하기 위해 첨가된 물질이 균체와 반응하지 않으며, 물리적으로 H+ 이온을 막아 적정한 pH를 유지할 수 있어 전달되는 프로바이오틱스의 양을 극대화할 수 있다.
도 1는 알지네이트 (Alg), 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (H+A) 및 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 (HA)를 동결건조하고, SEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 알지네이트, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 및 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체에서 내산성 향상 여부를 실험한 결과를 나타낸다.
도 3은 인공위액에서 기존 알지네이트가 포함된 pH-조절성 시스템 (Alginate-CMC/glycine: ACG 및 Alginate-CMC/HEPES: ACH) 및 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체 (HA3)의 시간에 따른 pH 변화 비교 실험한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 및 하이드로아파타이트-하이드로겔 복합체 내에 프로바이오틱스를 봉입했을 때, 상부 소화관의 낮은 pH 환경에서 프로바이오틱스의 생존율이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 제공한다.
본 발명의 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체는 상기 하이드록시아파타이트 및 하이드로겔을 함께 사용함으로써 1) H+이온을 화학적으로 중화하여, 낮은 pH에 대해 높은 수준의 보호효과를 보이고, 2) 생산과정 중에 프로바이오틱스에 손상을 거의 입히지 않으며, 3) 제조공정이 간단하여 응용이 쉽다는 장점을 가진다. 또한, 4) 위산의 유입을 물리적으로 제한하여, 높은 수준의 생존율 보호효과를 보인다.
상기 하이드로겔은 알지네이트, 펙틴, 카라기난 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 일 수 있으며, 바람직하게 알지네이트 일 수 있다.
상기 "알지네이트"는 만누로산 (mannuronic acid) 및 굴루론산 (guluronic acid)으로 이루어진 음이온성 다당류로, 주로 갈조류 (brown algae)에서 분리될 수 있다. Ca2 +를 비롯한 2가 양이온이 있을 때 하이드로겔을 형성하는데, Ca-알지네이트 겔은 위산의 pH에서 줄어들고, 장의 pH에서 분해되는 pH-민감 행동 (sensitive behavior)을 보인다. 뿐만 아니라, 온화한 겔링 조건 (mild gelling condition), 생체적합성 (biocompatibility), 쉬운 겔화 특성 (easy gelation property)을 가지고 있기 때문에 프로바이오틱스의 봉입에 가장 많이 사용되는 물질 중 하나이다.
상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속, 락토코쿠스 속, 엔테로코쿠스 속, 스트렙토코쿠스 속 및 비피도박테리움 속의 균주로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체 내에 봉입된 형태로 존재할 수 있다. 보다 상세하게는 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei ), 락토바실러스 가세리 (Lactobacilus gasseri ), 락토바실러스 델브루에키 종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus ), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼 (Lactobacillus fermentum ), 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei ), 락토바실러스 플란타륨 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri ), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus ), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis ), 엔테로코쿠스 패시움 (Enterro coccus faecium ), 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis ), 스트렙토코쿠스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus ), 비피도박테리움 비피둠 (Bifidobacterium bifidum ), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve ), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 및 비피도박테리움 아니말리스 종 락티스 (Bifidobacterium animalis ssp. lactis) 중에 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 100 중량부에 대하여, 하이드록시아파타이트는 0.1 중량부 내지 5 중량부, 하이드로겔은 0.5 중량부 내지 5 중량부, 및 프로바이오틱스는 0.00001 중량부 내지 10 중량부로 포함될 수 있고, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔 및 프로바이오틱스의 중량비는 1 : 0.3 내지 3 : 0.0003 내지 5일 수 있으며, 이런 비율일 때, 프로바이오틱스의 장으로의 전달률이 극대화되므로 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 또는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 약학 조성물을 제공한다.
상기 혼합체는 프로바이오틱스를 혼합체 내에 봉입된 형태로 함유할 수 있다.
상기 혼합체는 혼합체 100 중량부에 대하여, 하이드록시아파타이트는 0.1 중량부 내지 5 중량부, 하이드로겔은 0.5 중량부 내지 5 중량부, 및 프로바이오틱스는 0.00001 중량부 내지 10 중량부로 포함될 수 있고, 하이드록시아파타이트, 하이드로겔 및 프로바이오틱스의 중량비는 1 : 0.3 내지 3 : 0.0003 내지 5일 수 있으며, 이런 비율일 때, 프로바이오틱스의 장으로의 전달률이 극대화되므로 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 또는 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 유효성분은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 하이드록시아파타이트를 하이드로겔 용액에 혼합하는 단계; b) 프로바이오틱스를 하이드록시아파타이트 및 하이드로겔 혼합 용액에 첨가하여 2차 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 c) 상기 2차 혼합 용액을 염화칼슘 (CaCl2) 용액에 떨어뜨려, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 형성하고 프로바이오틱스를 봉입시키는 단계를 포함하는, 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 제조방법을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 제조방법은, 다른 유기 용매 등을 사용하지 않으면서도 각 성분의 혼합 후 겔화·결정화라는 단순한 원리를 이용하고 있는 바, 효율적으로 프로바이오틱스 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 제조할 수 있다.
상기 하이드록시아파타이트는 전구체인 제이인산암모늄 (Diammonium Hydrogen Phosphate; (NH4)2HPO4)을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[ 실시예 1] 하이드록시아파타이트 - 알지네이트 혼합체 또는 하이드록시아파타이트 -하이드로겔 복합체 기반의 프로바이오틱스 조성물 제조
하이드록시아파타이트-알지네이트의 혼합체 또는 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체를 제조하였다. 상기 혼합체의 경우, 만들어진 하이드록시아파타이트를 알지네이트 용액에 혼합하였다. 상기 복합체의 경우, 하이드록시아파타이트의 전구체인 제이인산암모늄 (Diammonium Hydrogen Phosphate, (NH4)2HPO4)을 알지네이트 용액에 혼합하였다. 상기 혼합체 및 복합체에 프로바이오틱스를 첨가하여 2차 혼합용액을 제조하였고, 상기 2차 혼합 용액을 염화칼슘 (CaCl2) 용액에 떨어뜨림으로써 하이드록시아파타이트-알지네이트 혼합체 또는 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체 내에 프로바이오틱스를 봉입하였다. 이러한 과정은 20분 내지 80분 동안 진행되었다. 이후, 염화칼슘 용액을 제거하고, 프로바이오틱스가 봉입된 하이드록시아파타이트-알지네이트 혼합체 또는 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체를 수득하였다.
상기 제조 방법대로 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체를 제조하되, 제이인산암모늄의 함량을 6.6, 13.2 및 19.8 mg/mL 로 하여, 비드 형태의 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체를 제조하였다 (이하, 제이인산암모늄의 함량별로 각각 HA1, HA2 및 HA3라함). 또한, 음성 대조군으로는 제이인산암모늄을 첨가시키지 않은 것을 사용하였다 (이하, Alg라 함). 하이드록시아파타이트-알지네이트 혼합체의 경우 (이하, H+A라 함), HA3 및 Alg를 각각 동결건조 한 후의 무게를 비교하여, 하이드록시아파타이트의 함량을 결정하였다.
이때 각 성분 및 함량은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
Alg H+A HA1 HA2 HA3
Alginate (mg/mL) 15 15 15 15 15
Hydroxyapatite (mg/mL) - 9.7 - - -
(NH4)2HPO4 (mg/mL) - - 6.6 13.2 19.8
각 그룹 (대조군; Alg, 하이드록시아파타이트-알지네이트 혼합체; H+A, 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체; HA1, HA2, HA3)을 제조 후, 동결건조 하고, SEM으로 확인하였다. 그 결과, 도 1에 따를 때, H+A의 경우, 20 ㎛이하의 크기로 형성된 하이드록시아파타이트 크리스탈을 알지네이트 용액과 혼합 후, 겔화 하였기 때문에, 특별한 구조 변화 없이, 하이드록시아파타이트 크리스탈이 하이드로겔 내에 존재하는 것을 관찰 할 수 있었고, H+A는 하이드록시아파타이트 크리스탈 때문에 오돌토돌한 비드 외부와 비드 내 빈 공간을 채운 비드 내부를 확인할 수 있었다. 반면, HA1, HA2 및 HA3의 경우, 하이드록시아파타이트의 전구체인 제이인산암모늄의 양이 증가함에 따라, 하이드록시아파타이트-알지네이트의 결정화된 표면 구조가 보다 확실히 드러나는 것을 비드 외부 확대 이미지에서 관찰 가능했다. 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체에서 형성된 조밀한 단면 구조는, HA3의 비드 내부 확대 사진을 통해 관찰 할 수 있었고, Alg와 H+A과 비교하여 볼 때 보다 확실히 드러나는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 볼 때, 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체들은 Alg 또는 H+A와 달리 조밀한 특이 구조를 형성하였고, 이는 비드 외부에서 유입되는 위산의 유입을 늦출 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 2] 하이드록시아파타이트 - 알지네이트의 혼합체 또는 하이드록시아파타이트 -알지네이트 복합체에서의 내산성 향상 효과 확인
상기 실시예 1의 방법대로 제조한 H+A, HA1, HA2 및 HA3을 pH 2인 인공 위액에 2시간 동안 방치 후, 락토바실러스의 생존율을 측정하였다. 실험은 세 번에 걸쳐 진행하였다. 구체적으로, 모델 프로바이오틱스 (락토바실러스 람노수스 GG[Lactobacillus rhamnosus GG], KCTC5033)를 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체에 봉입하였고, 1 g의 제조된 복합체를 20 mL의 인공 위액 (0.2 % NaCl, 1M HCl을 이용해 pH 2로 조정됨)에 2시간동안 방치 (37 ℃, 99 rpm)하였다. 그 후, 생존률 (CFU: colony forming unit)을 플레이팅 카운팅을 사용하여 측정하였다.
이때, 실험조건은 표 2에 나타난 바와 같다.
Alg H+A HA1 HA2 HA3
인공위액 처리 전 pH 2 - - - - -
처리 후 + + + + +
그 결과, 도 2에 따를 때, Alg를 H+A와 비교 시, 하이드록시아파타이트를 알지네이트에 혼합한 경우가 더 내산성 효과가 나타나는 하는 것을 확인하였고, 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체로 만들 경우에는 그 효과가 더 향상되는 것을 확인하였다. 이때, 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체의 경우, 전구체인 제이인산암모늄의 함량이 증가할수록 낮은 pH에 대한 보호 효과가 더 좋아지는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 동일한 양의 하이드록시아파타이트를 포함하는 H+A에 비해 HA3가 100배 가량 (~2 log CFU/g) 생균수가 향상되는 것을 확인할 수 있었는데, H+A가 pH-buffering 효과로 화학적인 배리어만 제공하는 반면, HA3의 경우 도 1에서 제시한 바와 같이, 조밀한 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합구조를 통해, 물리적인 배리어를 추가적으로 제공하여서, 유입되는 위산을 효과적으로 지연할 뿐만 아니라 내부로 유입된 위산을 중화한 것을 확인했다.
[ 실시예 3] 기존 pH- 조절성 시스템과 하이드록시아파타이트 - 알지네이트 복합체의 인공 위액에서의 내부 pH 감소에 따른 pH 지시약의 색 변화 관찰
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 HA3에 브로모페놀블루 (bromophenol blue)을 0.5 % 함량으로 첨가하였다. 대조군으로는 기존 pH-조절성 시스템인 알지네이트 하이드로겔 제제인 Alginate-CMC/glycine (이하, ACG라함) 및 Alginate-CMC/HEPES (이하, ACH라함)을 사용하였다. 기존 pH-조절성 시스템에 대해상세하게는, 하이드로겔로서 알지네이트를 사용하였고, 프로바이오틱스는 락토바실러스 람노서스 GG (KCTC, 5033)를 사용하였다. 진탕배양기 (37 ℃, 220 rpm)에서 24 내지 48시간동안 배양한 후, 생균를 회수하고, 상기 락토바실러스 생균과 쯔비터 이온성 버퍼인 HEPES를 알지네이트 용액에 첨가하였고, 혼합된 알지네이트 용액을 주사기에 넣어 염화칼슘 (CaCl2) 용액이 담긴 비커에 한 방울씩 떨어뜨림으로써 비드 형태의 하이드로겔 제제를 제조하였다. 이때 각 성분 및 함량은 표 3에 나타난 바와 같다.
(mg/mL) Alg ACG ACH HA3
Alg 15 15 15 15
CMC - 5 5 -
Gly - 75 - -
HEPES - - 75 -
(NH4)2HPO4 - - - 19.8
이후 인공 위액에서 인큐베이션 후, 표기된 시간에서 수거하여 관찰하였다(0, 5, 10, 20, 40 및 60분). pH 지시약인 브로모페놀 블루는 pH 3 이하에서 노란색, pH 4.6 이상에서 청자색을 띄기 때문에 각 시스템의 pH를 비교 관찰할 수 있었다.
그 결과, 도 3에 따를 때, 60분 간 HA3의 pH는 4.6 이상으로 유지된 반면, 기존 pH-조절성 시스템인 ACG 및 ACH는 5 내지 10분 후에 pH가 급격히 떨어진 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), 하이드로겔 (Hydrogel) 및 프로바이오틱스 (Probiotics)를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 제이인산암모늄 (Diammonium Hydrogen Phosphate; (NH4)2HPO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 알지네이트, 펙틴, 카라기난, 잔탄검, 구아검 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 락토바실러스 속, 락토코쿠스 속, 엔테로코쿠스 속, 스트렙토코쿠스 속, 사카로마이세스 속, 대장균 속 및 비피도박테리움 속의 균주로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 하이드록시아파타이트-알지네이트 복합체 내에 봉입된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 100 중량부에 대하여, 하이드록시아파타이트는 0.1 중량부 내지 5 중량부, 하이드로겔은 0.5 중량부 내지 5 중량부, 및 프로바이오틱스는 0.00001 중량부 내지 10 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트, 하이드로겔 및 프로바이오틱스의 중량비는 1 : 0.3 내지 3 : 0.0003 내지 5 인 것을 특징으로 하는, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체.
  8. 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 청구항 1의 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 혼합체는 프로바이오틱스를 혼합체 내에 봉입된 형태로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 하이드록시아파타이트-하이드로겔 혼합체 (Hydroxyapatite mixed hydrogel) 또는 청구항 1의 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 유효성분으로 포함하는 산성 환경에서 프로바이오틱스 보호 및 전달용 건강기능식품 조성물.
  11. a) 하이드록시아파타이트를 하이드로겔 용액에 혼합하는 단계;
    b) 프로바이오틱스를 하이드록시아파타이트 및 하이드로겔 혼합 용액에 첨가하여 2차 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
    c) 상기 2차 혼합 용액을 염화칼슘 (CaCl2) 용액에 떨어뜨려, 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체를 형성하고 프로바이오틱스를 봉입시키는 단계를 포함하는, 청구항 1의 하이드록시아파타이트-하이드로겔 복합체 제조방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 제이인산암모늄 (Diammonium Hydrogen Phosphate; (NH4)2HPO4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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