KR102515677B1

KR102515677B1 - 리토탐니온으로 코팅되어 장 건강 및 유해균 억제 능력이 향상된 유산균을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102515677B1
Application number: KR1020220152052A
Authority: KR
Inventors: 김민수; 허보혜; 김유일; 김우리; 박성엽; 권기철; 손성호; 김인수; 김병국; 신창훈
Original assignee: 주식회사 종근당바이오
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-03-31

Abstract

본 발명은 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성 또는 유해균의 장 부착능 저해 효능을 향상시킬 수 있는 천연 칼슘을 포함하는 동결보호 또는 코팅용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 이용하는 경우, 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성 또는 유해균의 장 부착능 저해 효능을 향상시킬 수 있다. 또한, 적용 대상이 프로바이오틱스 균주에 따라 유당불내증 완화 효능을 얻을 수 있다.

Description

리토탐니온으로 코팅되어 장 건강 및 유해균 억제 능력이 향상된 유산균을 포함하는 조성물 {Composition containing lactic acid bacteria coated with lithotamnion to improve intestinal health and ability to suppress harmful bacteria}

본 발명은 천연 칼슘을 활용한 안정성 및 유해세균 억제 능력이 향상된 프로바이오틱스 코팅 공법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성 또는 유해균의 장 부착능 저해 효능을 향상시킬 수 있는 천연 칼슘을 포함하는 동결보호 또는 코팅용 조성물에 관한 것이다.

유산균 (lactic acid bacteria)은 당 성분을 에너지원으로 사용하여 산을 생성하는 균으로 자연계에 널리 분포되어 인류가 오랜 기간 공생하고 있는 미생물이다. 이 유산균들 중 우리 몸을 공격하지 않으며 병원성이 없는 균을 프로바이오틱스(probiotics)라 하며 (Curr Pharm Des, 2003: 9, 175-191), 적정량을 투여했을 때 인체에 건강상의 이점을 주는 균으로 정의하고 있다 (Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014: 11, 506-514). 대표적인 프로바이오틱스로는 유산균 (Lactobacillus) 과 비피더스균 (Bifidobacterium)이 있다.

프로바이오틱스의 대표적인 효능으로는 항균활성, 항생제 관련 설사 개선, 유당불내증 경감, 항암 효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 헬리코박터 파이로리균 억제, 과민성 대장염, 크론병 및 궤양성 대장염 경감, 면역 기능 조절 등이 알려져 있다 (Int Dairy J, 2007: 17, 1262-1277). 이에 따라 프로바이오틱스는 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제 및 건강식품의 일종인 유산균 식품으로 구분할 수 있다.

이와 같은 유산균 식품을 제조하는데 배양, 회수, 동결건조, 분쇄 단계 과정에서 유산균은 다양한 물리· 화학적인 스트레스에 노출된다. 구체적으로 유산균은 균체 회수시 농축에 따른 삼투압의 영향을 받으며, 동결건조 과정에서는 얼음 결정 및 탈수 (dehydration) 현상으로 인하여 온도와 삼투압의 영향을 동시에 받게 되고, 분쇄 및 제품화 과정에서 고온, 고압에 노출될 수 있으며, 공기 중에 노출되어 세포막을 구성하고 있는 지질의 산화로 생존율이 감소한다 (Compr Rev Food Sci Food Saf, 2004: 3, 117-124; Curr Issues Intest Microbiol, 2004: 5, 1-8; Lett Appl Microbiol, 1996: 22, 3438). 또한, 유산균 생균제를 보관 및 유통하는 기간 동안 높은 온도와 습도 그리고 산소에 노출되어 프로바이오틱스의 생존과 성장이 감소하게 될 수 있으며 (J Funct Foods, 2014: 9, 225-241), 유산균 생균제를 섭취하여 유산균이 장에 도달하더라도 장내의 각종 유해성분과 활성산소 등에 의한 생육 저해를 받으면서 동시에 장내에 정착한 기존의 다양한 미생물들과 경쟁하면서 장 상피 세포에 부착되어야 한다 (Immunol Cell Biol, 2000: 78, 80-88; Am J Clin Nutr, 2001: 73, 393S-398S(suppl)).

따라서 유산균의 효과를 증대시키는 것이 중요한 과제이다. 유산균 혼합물에 코팅기를 사용하여 칼슘 이온 혹은 칼슘 염을 에탄올 수용액으로 제조한 코팅제를 분무 및 건조하여 유산균의 혼합물을 코팅하는 방법이 도입한 기술이 있으나 (대한민국 특허출원 제10-2022-0090733), 이 공정은 에탄올인 유기용매를 이용한 코팅 작업과 열풍에 의한 건조로 공정이 길고 복잡하며, 공정 중 사멸률이 증가하는 단점이 있다.

따라서, 그 공정이 간단하면서도 장내 프로바이오틱스의 생존성 및 활성을 유지할 수 있는 코팅 방법에 대한 개발이 시급한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허 제10-1605516호(공고일 2015.03.23)

본 발명자들은 장내 프로바이오틱스의 생존성 및 활성을 유지할 수 있는 코팅제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 천연 칼슘을 코팅제에 첨가하는 경우, 바람직하게는 해조 칼슘을 코팅제에 첨가하는 경우, 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성, 유해균의 장 부착능 저해 효능이 향상됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 천연 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 천연 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 천연 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 장내 프로바이오틱스의 생존성 및 활성을 유지할 수 있는 코팅제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 천연 칼슘을 코팅제에 첨가하는 경우, 바람직하게는 해조 칼슘을 코팅제에 첨가하는 경우, 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성, 유해균의 장 부착능 저해 효능이 향상됨을 규명하였다.

천연 칼슘은 합성 칼슘과 다르게 마그네슘 (Mg), 칼륨 (K), 망간 (Mn) 등과 같은 다양한 미네랄과 영양소를 함유하고 있다. 천연 칼슘의 종류에는 해조 칼슘, 우유 칼슘, 패각 칼슘, 어골 칼슘 등이 있다. 천연 칼슘은 천연물에서 유래한 칼슘을 포함하는 미네랄을 의미하며, , 상기 미네랄은 광물, 광석, 무기질을 주성분으로 하는 무기염류를 지칭하고 Ca, Mn, Fe, Cu, P, Zn, K, Na, Cl, Ma, Mo, Ge 등 및 이들을 주원소로 하여 다른 원소와 반응한 화합물을 의미한다. 천연 칼슘은 천연물 분말, 천연물 유래 미네랄, 천연 미네랄과 같은 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 프로바이오틱스 동결보호 또는 코팅용 조성물은 프롤린(proline), 트리할로오스(trehalose), 글리세린(glycerin), 키토산(chitosan), 말토덱스트린(malto-dextrin), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 잔탄검 (xanthan gum, XG), 구아검(guar gum, GG), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate), 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate) 또는 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate)를 추가적으로 포함할 수 있다. 다만 이에 한정되지는 않고, 당 업계에서 사용되는 프로바이오틱스의 동결보호제 또는 코팅제의 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서의 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"란 충분한 양을 섭취했을 때 건강에 이로운 효과를 줄 수 있는 살아 있는 미생물을 의미한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균(lactic acid bacteria)로, 장에 도달한 후 장내 음식물을 분해하고, 비타민을 합성하는 등 유익한 작용을 할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 천연 칼슘은 해조 칼슘, 우유 칼슘, 패각 칼슘 및 어골 칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 해조 칼슘은 해조에서 유래한 칼슘을 포함하는 미네랄을 의미하며, 상기 미네랄은 광물, 광석, 무기질을 주성분으로 하는 무기염류를 지칭하고 Ca, Mn, Fe, Cu, P, Zn, K, Na, Cl, Ma, Mo, Ge 등 및 이들을 주원소로 하여 다른 원소와 반응한 화합물을 의미한다. 해조 칼슘은 해조 분말, 해조 유래 미네랄, 해조 미네랄과 같은 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 해조는 녹조류, 갈조류 및 홍조류로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 홍조류는 산호초, 김, 우뭇가사리 및 리토탐니온(lithothamnion)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 해조 칼슘은 리토탐니온(lithothamnion) 이라고 불리는 산호초과의 홍조류에서 유래될 수 있다. 리토탐니온을 포함하는 홍조류는 성장하는 동안 주변환경의 칼슘, 마그네슘 및 다양한 미량 원소를 흡수하는 능력을 가지고 있다. 그래서 시간이 지남에 따라 석회화되어 퇴적물을 축적하게 되고, 화석화된 홍조류는 조수에 의해 해안 근처에 축적된다. 이렇게 축적된 홍조류를 확보 및 선별하고 건조한 뒤, 파쇄와 분쇄 (미세 과립화)를 통해 천연 해조 칼슘을 얻을 수 있다. 상기 해조의 건조, 파쇄 및 분쇄 과정을 거쳐 얻은 해조 칼슘은 분말의 형태 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 칼슘, 마그네슘 또는 이들의 조합을 포함하는 것이다. 다만 이에 한정되지는 않고 크롬(chromium), 구리(copper), 철(iron), 요오드(iodine), 셀레늄(selenium), 아연(zinc), 망간(manganese), 칼륨(potassium), 황(sulfur) 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 다음과 같은 군에서 선택되는 특성을 갖는 것이다:

(a) 20 중량% 내지 40 중량%의 칼슘을 함유하는 천연 칼슘을 포함하는 것이다;

(b) 1 중량% 내지 5 중량%의 마그네슘을 함유하는 천연 칼슘을 포함하는 것이다; 및

(c) (a) 및 (b) 조합의 특성을 갖는 것이다.

천연 칼슘이 포함하는 칼슘 함유량은 예를 들어, 20 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 38 중량%, 20 중량% 내지 36 중량%, 20 중량% 내지 34 중량%, 20 중량% 내지 32 중량%, 20 중량% 내지 30 중량%, 20 중량% 내지 28 중량%, 20 중량% 내지 26 중량%, 20 중량% 내지 24 중량%, 20 중량% 내지 22 중량%, 22 중량% 내지 40 중량%, 24 중량% 내지 40 중량%, 26 중량% 내지 40 중량%, 28 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 32 중량% 내지 40 중량%, 34 중량% 내지 40 중량%, 36 중량% 내지 40 중량%, 38 중량% 내지 40 중량%, 22 중량% 내지 38 중량%, 24 중량% 내지 36 중량%, 26 중량% 내지 34 중량% 또는 28 중량% 내지 34 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

천연 칼슘이 포함하는 마그네슘 함유량은 예를 들어, 1 중량% 내지 5 중량%, 1 중량% 내지 4.5 중량%, 1 중량% 내지 4.0 중량%, 1 중량% 내지 3.5 중량%, 1 중량% 내지 3.0 중량%, 1 중량% 내지 2.5 중량%, 1 중량% 내지 2.0 중량%, 1 중량% 내지 1.5 중량%, 1.5 중량% 내지 5 중량%, 2.0 중량% 내지 5 중량%, 2.5 중량% 내지 5 중량%, 3.0 중량% 내지 5 중량%, 3.5 중량% 내지 5 중량%, 4.0 중량% 내지 5 중량%, 4.5 중량% 내지 5 중량%, 1.5 중량% 내지 4 중량%, 1.5 중량% 내지 3 중량% 또는 1.5 중량% 내지 2.5 중량%일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 칼슘은 칼슘 이온(Ca²⁺) 또는 칼슘 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기

칼슘 염은 칼슘 카보네이트; 칼슘 수소 카보네이트; 칼슘 할라이드, 특히 칼슘 클로라이드 및 칼슘 요오드; 칼슘 포스페이트; 칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 1수소 포스페이트; 2칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 락테이트; 칼슘 락토네이트; 칼슘 숙시네이트; 칼슘 타르트레이트; 및 칼슘 글루코네이트로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 칼슘은 탄산칼슘(CaCO₃)의 형태인 것이다. 탄산칼슘은 방해석(calcite), 아라고나이트(aragonite) 또는 이들의 형태일 수 있다. 아라고나이트 형태의 방해석 형태의 비율은 예를 들어, 1:1 내지 1:9일 수 있다. 구체적으로, 1:1 내지 1:9, 1:1 내지 1:8.5, 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:7.5, 1:1 내지 1:7, 1:1 내지 1:6.5, 1:1 내지 1:6, 1:1 내지 1:5.5, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4.5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3.5, 1:1 내지 1:3, 1:1 내지 1:2.5, 1:1 내지 1:2, 1:1 내지 1:1.5, 1:1.5 내지 1:9, 1:2 내지 1:9, 1:2.5 내지 1:9, 1:3 내지 1:9, 1:3.5 내지 1:9, 1:4 내지 1:9, 1:4.5 내지 1:9, 1:5 내지 1:9, 1:5.5 내지 1:9, 1:6 내지 1:9, 1:6.5 내지 1:9, 1:7 내지 1:9, 1:7.5 내지 1:9, 1:8 내지 1:9, 1:8.5 내지 1:9, 1:2 내지 1:8, 또는 1:3 내지 1:7, 1:4 내지 1:6일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 천연 칼슘은 산에 의해 용해된 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 산은 황산(H₂SO₄), 염산(HCl), 질산(HNO₃), 인산(H₃PO₄), 초산(Acetic acid), 젖산(Latic acid), 주석산(Tartaric acid), 사과산(Maleic acid),　구연산(Citric acid), 호박산(Succinic acid), 술폼산(Sulfamic acid), 개미산(Formic acid), 옥살산(Oxalic acid), 옥살아세트산(Oxalacetic acid), 푸마르산(Fumaric acid), 말산(Malic acid), 부티르산(Butyric acid), 팔미트산(Palmitic acid), 타르타르산(Tartaric acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 요산(Uric acid), 술핀산(Sulfinic acid), 이소시트르산(Isocitric acid), 라우르산(Lauric acid), 올레산(Oleic acid), 리놀레산(Linoleic acid) 및 미리스트산(Myristic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 산의 pH는 2 내지 5인 것이다. 예를 들어, 상기 산의 pH는 2 내지 5, 2 내지 4.8, 2 내지 4.6, 2 내지 4.4, 2 내지 4.2, 2 내지 4, 2 내지 3.8, 2 내지 3.6, 2 내지 3.4, 2 내지 3.2, 2 내지 3, 2 내지 2.8, 2 내지 2.6, 2 내지 2.4, 2 내지 2.2, 2.2 내지 5, 2.4 내지 5, 2.6 내지 5, 2.8 내지 5, 3 내지 5, 3.2 내지 5, 3.4 내지 5, 3.6 내지 5, 3.8 내지 5, 4 내지 5, 4.2 내지 5, 4.4 내지 5, 4.6 내지 5, 4.8 내지 5, 2.2 내지 4.8, 2.4 내지 4.6, 2.6 내지 4.4, 2.8 내지 4.2, 3.0 내지 4.0, 3.0 내지 3.8, 3.0 내지 3.6 또는 3.0 내지 3.4일 수 있다.

상기 pH의 범위에서 해조 칼슘은 용해될 수 있다. 상기 pH 범위를 초과하는 경우 천연 칼슘이 용해되지 않아, 프로바이오틱스 코팅시 코팅이 성공적으로 일어나지 않을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 산은 1g/L 내지 10g/L 농도의 구연산인 것이다. 예를 들어 구연산의 농도는, 1g/L 내지 10g/L, 1g/L 내지 9g/L, 1g/L 내지 8g/L, 1g/L 내지 7g/L, 1g/L 내지 6g/L, 1g/L 내지 5g/L, 1g/L 내지 4g/L, 1g/L 내지 3g/L, 1g/L 내지 2g/L, 2g/L 내지 10g/L, 3g/L 내지 10g/L, 4g/L 내지 10g/L, 5g/L 내지 10g/L, 6g/L 내지 10g/L, 7g/L 내지 10g/L, 8g/L 내지 10g/L, 9g/L 내지 10g/L, 2g/L 내지 9g/L, 3g/L 내지 8g/L, 4g/L 내지 7g/L 또는 5g/L 내지 6g/L일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 천연 칼슘의 함량은 0.1 g/L 내지 10 g/L인 것이다. 예를 들어, 0.1 g/L 내지 10 g/L, 0.1 g/L 내지 9 g/L, 0.1 g/L 내지 8 g/L, 0.1 g/L 내지 7 g/L, 0.1 g/L 내지 6 g/L, 0.1 g/L 내지 5 g/L, 0.1 g/L 내지 4 g/L, 0.1 g/L 내지 3 g/L, 0.1 g/L 내지 2 g/L, 0.1 g/L 내지 1 g/L, 1 g/L 내지 10 g/L, 2 g/L 내지 10 g/L, 3 g/L 내지 10 g/L, 4 g/L 내지 10 g/L, 5 g/L 내지 10 g/L, 6 g/L 내지 10 g/L, 7 g/L 내지 10 g/L, 8 g/L 내지 10 g/L, 9 g/L 내지 10 g/L, 1 g/L 내지 9 g/L, 2 g/L 내지 8 g/L, 3 g/L 내지 7 g/L 또는는 4 g/L 내지 6 g/L 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 천연 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 천연물을 건조, 파쇄 및 분쇄하여 천연 칼슘을 획득하는 단계; 및

(b) 천연 칼슘을 산으로 처리하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 천연물은 해조, 우유, 패각 및 어골로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 산의 pH는 2 내지 5인 것이다. 예를 들어, 상기 산의 pH는 2 내지 5, 2 내지 4.8, 2 내지 4.6, 2 내지 4.4, 2 내지 4.2, 2 내지 4, 2 내지 3.8, 2 내지 3.6, 2 내지 3.4, 2 내지 3.2, 2 내지 3, 2 내지 2.8, 2 내지 2.6, 2 내지 2.4, 2 내지 2.2, 2.2 내지 5, 2.4 내지 5, 2.6 내지 5, 2.8 내지 5, 3 내지 5, 3.2 내지 5, 3.4 내지 5, 3.6 내지 5, 3.8 내지 5, 4 내지 5, 4.2 내지 5, 4.4 내지 5, 4.6 내지 5, 4.8 내지 5, 2.2 내지 4.8, 2.4 내지 4.6, 2.6 내지 4.4, 2.8 내지 4.2, 3.0 내지 4.0, 3.0 내지 3.8, 3.0 내지 3.6 또는 3.0 내지 3.4일 수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 천연 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 천연 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스의 천연 칼슘 함량은 유산균 원말을 기준으로 0.001g/L 내지 5g/L일 수 있다. 예를 들면, 0.001g/L 내지 4g/L, 0.001g/L 내지 3g/L, 0.001g/L 내지 2g/L, 0.001g/L 내지 1g/L, 0.01g/L 내지 5g/L, 0.1g/L 내지 5g/L, 1g/L 내지 5g/L, 2g/L 내지 5g/L, 3g/L 내지 5g/L 또는 4g/L 내지 5g/L 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 천연 칼슘은 해조 칼슘, 우유 칼슘, 패각 칼슘 및 어골칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

해조 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스의 해조 칼슘 함량은 유산균 원말을 기준으로 0.001g/L 내지 5g/L일 수 있다. 예를 들면, 0.001g/L 내지 4g/L, 0.001g/L 내지 3g/L, 0.001g/L 내지 2g/L, 0.001g/L 내지 1g/L, 0.01g/L 내지 5g/L, 0.1g/L 내지 5g/L, 1g/L 내지 5g/L, 2g/L 내지 5g/L, 3g/L 내지 5g/L 또는 4g/L 내지 5g/L 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 천연 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스는 유산균 배양 후 유산균 코팅 과정에서 천연 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 첨가하여 제작할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 약제학적 조성물 및 사료용 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균뿐만아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스 파르탐 등)를 사용할수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공 식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성, 유해균의 장 부착능 저해 효능 또는 이들의 조합이 향상된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 L-lactate를 D-lactate로 이성질화 시키지 않는 것, 항생제 내성을 갖지 않는 것 또는 이들의 조합 특성을 갖는 것이다. 프로바이오틱스가 L-lactate를 D-lactate로 이성질화 시키지 않거나, 항생제 내성을 갖지 않는다는 의미는 안전하게 섭취할 수 있는 프로바이오틱스 균주임을 나타낼 수 있다.

인체내에서 L-lactate는 대사가 가능하지만, D-lactate는 대사가 불가능하므로, 프로바이오틱스가 L-lactate는 D-lactate로 변환시킨다면 산독증을 유발할 수 있는 위험성이 있다. 프로바이오틱스가 L-lactate를 D-lactate로 이성질화 시키지 않는다는 의미는 D-lactate를 생성하지 않는다는 것일 수 있다. 이는 프로바이오틱스가 DL-lactate racemase를 가지고 있지 않거나, 그 활성을 억제할 수 있음을 나타낼 수 있다. 혹은 D-lactate의 생성량보다 사용량이 더 많음을 나타낼 수 있다. 프로바이오틱스가 D-lactate를 생산하지 않는다는 의미는, 배양 전 배지의 D-lactate의 함량보다 배양 후 배지의 D-lactate 함량이 적은 것을 의미할 수 있다.

프로바이오틱스가 항생제 내성 유전자를 가지고 있으면 체내 항생제 처리시 효과가 나타나지 않아 세균 감염에 취약해질 수 있는 위험성이 있다. 프로바이오틱스가 항생제 내성을 가지고 있지 않다는 의미는, 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA)의 항생제 내성 기준 보다 낮거나 같은 수준의 항생제 내성을 가진 것일 수 있다. 상기 항생제는 Ampicillin, Vancomycin, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin, Clindamycin, Tetracycline 또는 Chloramphenicol일 수 있다. 항생제 내성이 없는 프로바이오틱스는 다음과 같은 군에서 선택되는 특성을 갖는 것일 수 있다.

(a) Ampicillin에 대한 최소항생제억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)가 2mg/L이하인 것;

(b) Vancomycin에 대한 최소항생제억제농도가 2 mg/L이하인 것;

(c) Gentamicin에 대한 최소항생제억제농도가 64 mg/L이하인 것;

(d) Streptomycin에 대한 최소항생제억제농도가 128 mg/L 이하인 것;

(e) Erythromycin에 대한 최소항생제억제농도가 1 mg/L이하인 것;

(f) Clindamycin에 대한 최소항생제억제농도가 1 mg/L이하인 것;

(g) Tetracycline에 대한 최소항생제억제농도가 8 mg/L이하인 것; 및

(h) Chloramphenicol에 대한 최소항생제억제농도가 4 mg/L이하인 것.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 비피도 박테리움(Bifidobacterium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactocuccus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토 코커스(Streptococcus) 속 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 명세서의 "비피도박테리움(Bifidobacterium)"이란, 인간을 포함한 포유동물의 질과 입에 존재할 수 있는 그람 양성균을 의미한다. "비피더스균"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 포유동물의 위장관 미생물 총을 구성하는 주요 박테리아 중 하나이다. "락토바실러스(Lactobacillus)"란, 유제품 등 다양한 식품, 과일 등 식물체, 토양 등 자연환경, 그리고 인체나 동물의 구강, 소화기관 및 질 내부 등에 서식하며, 당류의 발효에 의해 생장하나 산소에 의해 저해되지 않는 통성혐기성(facultative　anaerobic) 세균이다. "스트렙토코커스(Streptococus)"는 조건부 혐기성을 갖는 그람양성균으로 포도당 및 다른 탄수화물을 발효 대사하여 젖산(lactic　acid)을 최종 대사 산물로 생성한다. "락토코커스(lactocuccus)"는 연쇄상구균과에 속하는　그람 양성 균속의 하나로, 구균으로　포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며,　요구르트와　치즈　등의 유산균 발효식품에 많이 포함되어 있다. "엔테로코커스(Enterococcus)"는 후벽균문에 속하는　유산균의 일종인　그람 양성　구균이다. 상기 비피도박테리움, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 락토코커스, 엔테로코커스는 프로바이오틱스에 포함되는 대표적인 균이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 비피도박테리움 속의 프로바이오틱스는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 비피도박테리움 속의 프로바이오틱스는 수탁번호 KCTC13893BP의 프로바이오틱스는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) CKDB002, 수탁번호 KCTC13671BP의 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) CKDB004, 수탁번호 KCTC13114BP의 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001, 수탁번호 KCTC13116BP의 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. 상기 프로바이오틱스는 신생아의 분변에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 유당불내증 완화 효과를 갖는 것이다.

"유당불내증"은 유당(젖당, lactose)을 분해, 소화하지 못하는 증상이다. 몽골, 중앙아시아, 북미, 유럽 일부 지역 정도를 제외하면 전세계에서 흔히 볼 수 있으며, 유당 분해 효소가 체내에서 생산되지 않는 경우 발생한다.

천연 칼슘으로 코팅된 프로바이오틱스를 포함하는 조성물이 갖는 유당불내증 완화 효과는 포함된 프로바이오틱스의 특성에 기인한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프로바이오틱스 균주는 유당(Lactose) 대사를 통해 에너지원으로 이용할 수 있는 것일 수 있다. 구체적으로, β-galactosidase 효소를 가지는 프로바이오틱스일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 해조 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 해조 칼슘을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법을 제공한다.

(c) 본 발명은 해조 칼슘이 코팅된 프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명의 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물을 이용하는 경우, 프로바이오틱스의 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성 또는 유해균의 장 부착능 저해 효능을 향상시킬 수 있다. 또한, 적용 대상 프로바이오틱스 균주에 따라 유당불내증 완화 효능을 얻을 수 있다.

도 1은 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 효소 활성능을 검증한 결과를 나타낸다.
도 2는 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 D-lactate 생성능을 검증한 결과를 나타낸다.
도 3은 해조 칼슘의 조성을 분석한 시험 성적서를 나타낸다.
도 4는 해조 칼슘을 이용하여 유산균 생균제를 제조하는 공정을 나타낸다.
도 5는 해조 칼슘을 이용하여 코팅한 유산균의 유해 세균 장 부착 억제능을 검증한 결과를 나타낸다.
도 6은 해조 칼슘을 이용하여 코팅한 Bifidobacterium 4종의 전자현미경 사진을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 실험재료 및 방법

1.1 프로바이오틱스 균주

본 실험에 사용된 프로바이오틱스는 ㈜종근당바이오 (CKDBiO, Korea) 균주로 신생아 분변을 통해 분리하였다. 분리된 4종의 Bifidobacterium 유산균주는 멸균된 액체 배지 (BL배지, Difco, MI, USA)에서 혐기조건으로 37 ℃에서, 18 내지 24 시간 배양한 후 원심분리 (3,500 rpm, 20 분, 4 ℃)하여 균체를 회수하여 사용하였다.

사용된 프로바이오틱스 균주는 표 1에 나타내었다.

사용된 프로바이오틱스 균주

균주명	수탁번호 (수탁일)	염기서열(DNA)
Bifidobacterium bifidum (BB) CKDB001	KCTC13114BP (2016.09.23)	CTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCTCCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGTTCCACATGATCGCATGTGATTGTGGGAAAGATTCTATCGGCGTGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTTGGGAGCAAGCCTTCGGGTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGCTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGACGCTGGATGTGGGGCACGTTCCACGTGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGACGCCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAGCGGGATGCGACATGGCGACATGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGGAGCCTGCAACCCGGCTCCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAAGTGAGGCTCGTGATTGGGACTAAGTC
Bifidobacterium lactis (BL)CKDB005	KCTC13116BP (2016.09.23)	TGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCTAAGGTGAGACTCGTGATTGGGACTAAGTCGTAC
Bifidobacterium longum (BLG) CKDB004	KCTC13671BP (2018.10.13)	GCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTCTAAAGTGAGGCTCGTGATTGGGACTA
Bifidobacterium breve (BBR)CKDB002	KCTC13893BP (2019.07.19)	GCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCAGGCAGCTTGCTGCCTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCATCACACCGCATGGTGTGTTGGGAAAGCCTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTAGGGAGCAAGGCACTTTGTGTTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACAGTGCGAGCTGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGCGGGAGGGAGCCGTCTAAGTGAGGCTCGTGATTGGGACTAAGTCGTAC

1.2 당 이용성 확인

신생아 분변으로부터 분리한 유산균 4종의 당 이용성을 확인하기 위해 API 50 CH kit (BioMerieux, France)를 이용하여 평가하였다. Glucose blood liver (BL, MB cell, Korea) 액체배지에서 37 ℃ 로 16 시간 동안 혐기 배양시킨 균주 배양액을 6,373ⅹg로 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 API CHL medium으로 각 균주를 1ⅹ10⁸ CFU/mL 와 동일한 농도로 균액을 제조하였다. 희석된 균액을 120 μL씩 각각 접종 후 37 ℃에서 24 내지 48 시간 동안 배양시켰다. 그 후 색의 변화를 육안으로 관찰하였다. 균주의 당 이용성 평가는 API web을 통하여 결과 판독하였으며, 각각의 당 이용성 여부에 따라 + (당 이용성 활발히 있음), w (당 이용성 약간 있음), - (당 이용성 없음)으로 표현하였다.

1.3 효소 활성 확인

신생아 분변으로부터 분리한 유산균 4종의 효소 활성능을 확인하기 위해 API ZYM kit (BioMerieux, France)를 이용하여 평가하였다. Glucose blood liver (BL, MB cell, Korea) 액체배지에서 37 ℃ 로 16 시간 동안 혐기 배양시킨 균주 배양액을 6,373ⅹg로 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 API suspension medium으로 희석하여 각 균주 농도를 2ⅹ10⁸ CFU/mL 와 동일한 농도로 균액을 제조하였다. 희석된 균액을 65 μL씩 각각 접종 후 37 ℃에서 4 시간 동안 배양시켰다. 그 후 ZYM A, B 시약을 순서대로 각각 한 방울씩 첨가하여 밝은 곳에서 5 분간 반응시키고 색의 변화를 육안으로 관찰하였다. 반응의 정도는 0 (반응 없음)에서 5 (활발히 반응)으로 표현하였다.

1.4 D-lactate 생성 확인

시험 유산균주를 BL 배지 37 °C에서 24 시간 배양 후 원심분리하여 상층액을 확보하였다. Kit (Megazyme, Ireland) 에 제공된 D-lactate를 기반으로 표준 샘플과 테스트 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플 50 μL 을 96 well plate 의 각 well 에 분주한 후 50 μL 의 reaction mix (D-lactate assay buffer 46 μL, D-lactate assay substrate 2 μL, D-lactate enzyme mix 2 μL) 를 각각 분주하고 상온에서 30 분간 배양하였다. 변화된 색깔을 450 nm에서 흡광도 측정 후 D-lactate 양을 측정하였다.

1.5 항생제 내성 확인

제조된 고형화된 한천배지에 멸균된 면봉으로 배지 전체에 도포하여 유산균주가 한천배지에 잘 스며들도록 혐기 조건에서 10 내지 20 분간 방치하였다. 시험하고자 하는 각 항생제 strip (Liofilchem, Italy)을 한천배지 위에 위치 적절한 거리를 유지하면서 배치시킨 후 37 °C의 혐기조건에서 약 48 시간 배양하였다. 유산균이 배양되지 않은 strip 부위의 가장 밑 부분을 최소억제농도 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 로 판정하였다. 각 항생제에 대해서 유럽식품안전청 (European Food Safety Authority, EFSA) 기준과 비교하여 수치가 미달이면 사용 가능하나, 기준보다 수치 초과 시 유전자 검사를 통해 획득 및 내재 내성을 추가로 판단하였다.

1.6 해조 칼슘 적용 동결보호 코팅제 전처리

칼슘류는 기본적으로 물에 전혀 녹지 않고 산에 녹는 특징을 가지고 있기 때문에, 기본적인 동결보호 코팅제와 같이 혼합하여 사용할 수 없다. 따라서 본 연구에서는 염산, 질산, 사과산, 아세트산, 구연산, L-시스테인 등의 산 (acid) 용액을 통해 해조 칼슘을 완전히 용해하는 전처리 방법을 고안하여 0.01 ~ 10 g/L 농도를 대상으로 용해도 테스트를 진행하였고, 이를 바탕으로 최적 농도를 선정 후 트로할로스를 포함한 기본적인 동결보호제에 추가하여 코팅제로 사용하였다. 용해도 정도에 따라 + (용해성 높음), w (용해성 약간 있음), - (용해성 없음)으로 표현하였다. 무엇보다 구연산 같은 약산으로 칼슘을 용해하게 되면 흡수되는 칼슘이 증가한다는 보고 있어 (J Clin Pharmacol, 1999: 39, 1151-1154) 우선적으로 구연산을 통해 해조 칼슘을 용해하여 사용하였다.

1.7동결건조

각각의 유산균주는 5 L 발효조 (BIOCNS, Korea)에서 최적의 배양조건으로 배양한 후 원심분리기 (Supra R12, Hanil, Korea)를 이용하여 5,500 rpm, 4 ℃, 20 분간 원심분리를 수행하여 균체를 농축하였다. 회수한 균체의 생존율을 높이기 위하여 해조 칼슘을 첨가한 코팅제를 첨가하여 균질하게 혼합하여 코팅한 후 동결건조기를 (Freezone 12, LABCONCO, USA) 이용해 건조된 원말을 회수하여 유산균 원말을 제조하였다. 건조된 균체는 파쇄기를 이용하여 분쇄화시킨 다음 시료별로 알루미늄 파우치에 포장하여 각각 원말의 저장 안정성, 내열성, 내산성 및 내담즙산, 유해세균 억제 및 전자현미경 등 다양한 실험에 사용되었다.

1.8 위장관 환경 안정성 (내산성 및 내담즙성)

본 발명에서는 해조 칼슘 코팅 공법에 따른 유산균 생균제의 위장관 환경 안정성을 평가하기 위하여 각각 원말의 내산성과 내담즙성을 실험하였다. 내산성은 인공위액 조건으로, 내담즙성은 담즙산 조건으로 각각 노출시킨 후 생균수를 분석하였다.

인공위액 조건은 식품 붕해도 시험 상의 인공위액 조건 (염화나트륨 2.0 g, 묽은 염산 24.0 ㎖/L, pH 1.2)을 사용하여 최종적으로 pH 2.5로 맞춘 후, 생균제 분말을 10% 농도로 첨가하여 노출시켰다. 위의 수축 운동을 고려하여 Dancing machine ((주)BMS) 기기를 이용하여 위장관 환경과 유사한 조건에서 노출되도록 하였고, 노출 시간은 위를 통과하는 시간을 고려하여 2 시간으로 실시하였다. 한편, 담즙산 (Oxgall) 용해액을 여과하고 배지에 무균적으로 첨가하여 최종 Oxgall 0.3%의 농도가 되도록 제조하여 사용하였으며, 10% 농도로 생균제 분말을 첨가하여 내산성 실험과 동일한 방법으로 2 시간 동안 반응시킨 후 통상적인 방법에 따라 pH를 7.0으로 재조정한 후 생균수를 측정하였다.

1.9 해조 칼슘 코팅한 유산균의 열 안정성 평가

본 발명에 따른 해조 칼슘 코팅에 따른 유산균의 열 안정성을 평가하기 위해 유산균 환경에 취약한 온도 조건에서 열 안정성을 확인하였다. 먼저, 해조 칼슘 코팅된 유산균 원말을 0.85% 멸균 식염수에 현탁 후 미리 40℃로 승온된 항온수조 내에서 12 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 4 시간 간격으로 각각의 샘플 1 mL을 0.85% 멸균 식염수에 십진희석법으로 희석하였다. 그리고 BL 고체 배지에 pouring 방법으로 37℃에서 약 48 시간 동안 혐기조건으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였으며, 열 안정성은 아래의 식으로 나타내었다.

열 안정성(%) = n 시간 열처리 후 유산균 생균수 / 열처리 전 유산균 생균수 Х 100

1.10 동물 세포배양

인간 직장 결장 샘암종 (Human colorectal adenocarcinoma) HT-29 세포주로 유해 세균의 부착력 억제 효능을 평가하였다. HT-29 세포주는 Bustos 의 방법으로 10%의 fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich, USA)와 1%의 penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific, USA)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco, USA)를 사용하였으며, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다 (Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012: 60(36), 9082-9088).

1.11 유해세균 부착 억제

배양하여 준비된 HT-29 세포주를 well 당 5X10⁵ cells 이 되도록 6-well plate에 분주하여 24 시간 배양한 후, PBS 용액으로 2 회 세척하였다. 또한 Luria-Bertani (LB) broth (Kisan, Korea)에 배양된 장내 대표 유해세균인 Escherichia coli ATCC 8739는 원심분리한 후, PBS 용액으로 2 회 세척한 다음 1 mL PBS 용액에 다시 현탁하여 사용하였다. 유산균 시료액도 동일한 과정으로 제조하였다. E. coli ATCC 8739 및 유산균 시료액을 serum-free RPMI 1640에 1X10⁸ CFU/mL 농도로 희석하여 시료액 0.5 mL 씩 HT-29 monolayer가 형성된 각 well 에 처리하여 2 시간동안 반응시켰다. 부착된 E. coli ATCC 8739의 생균수 측정을 위해 1% Triton X-100을 반응시켜, HT-29 세포주에 부착된 E. coli ATCC 8739를 회수하여 Eosin Methylene blue (EMB) 고체 배지로 생균수를 측정하였다. E. coli ATCC 8739의 부착 억제율은 아래의 식으로 계산하였다.

1.12 가혹조건 저장 안정성 경시변화 측정

유산균의 생존율 향상을 위한 해조 칼슘 동결보호 코팅제 적용에 의한 생균수를 측정하였다. 보호제를 적용한 동결건조 샘플 1g을 취하여 펩톤식염완충액 (Buffered Peptone Water; 기산바이오, Korea)에 십진희석법으로 희석한 후, BL agar에 pouring 방법으로 37℃에서 약 2~3일 동안 배양하고, 평판배지에 콜로니 수를 측정하여 유산균 수를 CFU/g으로 표시하였다. 또한 저장기간에 따른 유산균 생균수를 파악하기 위해 일정 기간을 두고 유산균 생균수 변화를 파악하였다. 저장 안정성의 극대화 효과를 확인하기 위하여 유산균 환경에 취약한 가혹한 조건에서 유산균의 생존율을 확인하였다. 가혹 조건은 항온항습기를 30℃ 및 75% 상대습도 (Relative humidity, RH)의 조건으로 맞추고 알루미늄 파우치 포장된 샘플을 넣어 1 주부터 4 주까지의 유산균 생균수를 분석하였다. 생존율은 다음과 같은 식으로 계산하였다.

1.13 전자현미경 측정

해조 칼슘을 이용하여 각각의 유산균주를 코팅하여 동결건조를 통해 분말형태로 만든 후, 해조 칼슘의 코팅 현황을 정교하게 관찰하기 위하여 주사전자 현미경 (Scanning Electron Microscope; phemomXL, MA, USA)을 사용하였다.

1.14 통계처리

실험 결과에 대한 유의차 검정은 Mini Tab에서 평균값을 분산분석 (Anova: analysis of variance)한 후 p<0.05 수준에서 다중검증법에 따라 분석하였다.

실시예2: 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 당 이용성 분석

신생아 분변에서 분리된 B. breve CKDB002, B. longum CKDB004, B. bifidum CKDB001, B lactis CKDB005 4종 모두 API 50 CH kit에서의 당 이용성을 분석하였다.

결과는 표 2에 나타내었다.

Bifidobacterium 4종 모두 D-lactose 이용성을 확인할 수 있었다. Lactose는 영유아의 주요 섭취음식인 모유 및 분유에 풍부한 탄소원으로, β-galactosidase에 의해 포도당 (glucose) 및 갈락토스 (galactose) 로 분해되어 신생아 및 장내 미생물의 에너지원으로 이용된다. 따라서 선별된 B 계열 4종은 장내 유당 분해에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

실시예3: 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 효소 활성 평가

신생아 유래 Bifodobacterium 4종의 효소 활성 평가 결과는 도 1에 나타내었다.

신생아 분변에서 분리된 B. breve CKDB002, B. longum CKDB004, B. bifidum CKDB001, B lactis CKDB005 4종 모두 API ZYM kit 14번 큐플의 색 변화 정도가 5/5 로, 해당 효소 활성이 매우 높은 것으로 확인하였다. 14번 큐플은 β-galactosidase를 의미하며 β-galactosidase는 유당 (lactose)을 포도당 (glucose) 과 갈락토스 (galactose) 로 분해한다. 이러한 유당을 소화하는데 장애가 있는 사람을 유당불내증 환자라 부른다. 특히 신생아에게 유당은 필수적으로 섭취되어야 한다 (Asia Pac J Clin Nutr, 2015: 24, s21-s25). 따라서 선별된 B 계열 4종이 유당 분해에 도움을 줄 수 있을 뿐만 아니라 이로 인한 영양소 흡수에도 도움을 줄 수 있을 것으로 기대하고 있다.

실시예4: 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 D-lactate 생성 평가

Lactate의 대사적 특성으로 인체에서 L-lactate는 대사가 가능하지만, 이성질체인 D-lactate는 대사가 불가능하다. 프로바이오틱스의 경우 L-lactate를 D-lactate 로 변환하는 효소인 DL-lactate racemase를 가지고 있어 효소 활성이 강한 경우에는 신생아나 어린아이 및 선천성단장증후군 (short bowel syndrome) 환자에게 D-lactate가 축적되어 산독증 (acidosis)을 유발시킬 수 있다. 또한, 담즙염(Bile salt)의 경우 지방을 유화시켜 라이페이스(lipase)의 작용을 촉진하여 지방산 분해에 도움을 주며, 프로바이오틱스에 존재하는 bile salt hydrolase는 담즙염(bile salt)으로부터 프로바이오틱스를 보호하여 장내 정착을 늘리기도 하지만, 담즙염(bile salt)를 탈접합(deconjugation)시켜 담즙염(bile salt)의 유화기능을 없애기 때문에 지방산 분해를 어렵게 하며, 탈접합(deconjugation)된 담즙염(bile salt)의 경우 다른 장내 미생물의 대사에 의해 독성을 가진 2차 대사산물이 생성되며, 이는 잠재적으로 위험성을 가질 수 있다(식품의약품안전처, 2021).

이와 같이 D-lactate를 생성하는 프로바이오틱스 섭취 시, 영유아를 중심으로 인체에 유해한 영향을 줄 수 있기 때문에 신생아로부터 선별된 B 계열 4 종에 대한 D-lactate의 생성 유무를 확인하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

유산균을 배양하지 않은 배양액을 사용한 대조군보다 낮게 측정되어, B 계열 4 종 모두 D-lactate를 생성하지 않는 것으로 분석되었다. 이는 섭취 시, 영유아를 포함한 모든 연령대에서 안전한 유산균임을 나타낸다.

실시예5: 신생아 유래 Bifidobacterium 4종의 항생제 내성 평가

유산균주가 항생제 내성 유전자를 가지고 있으면 세균 감염 시 항생제의 효과가 나타나지 않을 수 있어 위험하고, 장 내에서는 항생제 내성유전자의 전이가 많이 일어날 수 있으므로 미생물이 가진 항생제 내성의 특성을 파악하는 것은 무엇보다 중요하다. 미국 질병통제예방센터 (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) 에서는 strip 기반의 항생제 내성 최소항생제억제농도 (MIC) test의 편리성과 결과 균일성에 strip을 이용한 TEST 방법을 추천하고 있다. 또한 MIC 확정 후 유럽식품안전청 (EFSA) 기준으로 미달일 경우에는 사용이 가능하나, 초과되는 경우에는 유전자 분석을 통해 획득성 또는 내재성 내성여부를 판단해야 한다 (식품의약품안전처, 2021).

선별된 B 계열 유산균주 4종을 대상으로, EFSA 항생제 내성 기준 테스트를 진행하였다. 테스트 항생제 종류는 Ampicillin, Vancomycin, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Erythromycin, Clindamycin, Tetracycline, Chloramphenicol으로 총 9가지가 있다. 이 중, Bifidobacterium 유산균주에서 Kanamycin 항목에 대한 항생제 내성은 확인할 필요가 없기 때문에 나머지 8종류의 항생제 내성을 확인하였다.

결과는 표 3에 나타내었다.

모든 균주에서 EFSA의 항생제 기준을 초과하는 균주는 없는 것으로 확인되었다. 이는 D-lactate 생성 결과와 마찬가지로 모든 연령대에서 안전하게 섭취할 수 있는 유산균주임을 확인하였다.

선별된 B 계열 유산균주 4종의 항생제 내성

항생제 종류	Ampicillin	Vancomycin	Gentamicin	Kanamycin	Streptomycin	Erythromycin	Clindamycin	Tetracycline	Chloramphenicol
EFSA 기준 (mg/L)	2	2	64	n.r.	128	1	1	8	4
B. breve CKDB002	0.125	0.125	6	-	48	0.25	1	4	0.5
B.longum CKDB004	0.38	0.19	1.5	-	48	1	0.094	0.75	0.5
B.bifidum CKDB001	0.047	0.19	32	-	16	0.19	0.25	1.5	0.38
B.lactis CKDB005	0.064	0.038	64	-	64	0.064	0.25	0.75	0.5

실시예 6: 동결보호 코팅제로의 칼슘 선정 칼슘의 종류는 크게 탄산칼슘이나 젖산칼슘과 같은 합성 칼슘과 조개 칼슘, 어골 칼슘, 해조 칼슘 등과 같은 천연 칼슘으로 구분될 수 있다. 천연 칼슘에는 마그네슘 (Mg), 망간 (Mn), 구리 (Cu) 등과 같은 미네랄을 포함하고 있다는 다수의 문헌자료가 있으며 (Food industry and Nutrition, 2005: 10, 40-45), 칼슘과 마그네슘 섭취는 밀접하게 상관 관계가 있기 때문에 (Am J Clin Nutr, 1997: 66, 1172-7), 효율적인 칼슘의 사용을 위해서 합성 칼슘보다는 천연 칼슘을 소재로 사용하였다.

천연 칼슘 중 해조 칼슘을 홍조류인 리토탐니온(lithothamnion)에서 획득하였다. 리토탐니온을 건조한 뒤 파쇄와 분쇄의 미세 과립화 공정을 통해 천연 해조 칼슘을 획득하였다. 획득한 해조 칼슘의 조성을 분석하였다.

분석 결과는 도 3에 나타내었다.

해조 칼슘의 조성 분석 결과 32.9%의 칼슘 및 2.07%의 마그네슘을 함유하는 것으로 확인되었으며, 90%의 입자가 32㎛ 미만의 크기를 가지며, 5% 미만의 수분 함량, 0.8 내지 1.0 g/ml의 밀도를 가진 것으로 확인되었다.

또한, 칼슘은 체내로의 적절한 흡수를 위해서는 산 (acid) 이 필요하다고 보고하고 있다. 어떤 형태로든 산이 체내에 존재하지 않으면 미네랄이 용해되지 않아 체내에서 필요에 따라 사용할 수 없기 때문에 조직이나 관절에 침전물로 축적되어 다양한 장애를 일으킬 수 있다 (Int j pharm biomed, 2013: 4, 659-668). 하지만 너무 낮은 pH는 유산균이 사멸될 수 있기 때문에 산에 대한 천연 칼슘의 용해도 조건을 확인하였다.

결과는 표 4에 나타내었다.

산에 대한 칼슘의 용해도를 확인한 결과, 합성 칼슘보다는 천연 칼슘이 더 높은 pH에서 용해되었다. 이는 유산균 동결보호제 코팅제로 적용시 높은 안정성을 유지하는데 영향을 줄 수 있을 가능성이 있다. 천연 칼슘 중에서는 해조 칼슘의 용해도가 pH 3.2 수준에서 용해되어 유산균 동결보호 코팅제로 선정하였다.

천연 칼슘과 합성 칼슘 용해도

No.	종류	원료명	용해pH (1g/L)
1	천연 칼슘	해조칼슘	3.2
2		밀크칼슘	2.9
3		패각칼슘	2.2
4		어골칼슘	2.5
5	합성 칼슘	탄산칼슘	2.0
6		젖산칼슘	2.3
7		구연산칼슘	2.4
8		황산칼슘	2.1
9		아스코브산칼슘	2.2

실시예7: 코팅제 적용을 위한 해조 칼슘 전처리 및 유산균 원말 확보

해조 칼슘은 기본적으로 물에 녹지 않으나, 염산, 아세트산, 구연산 등 산에서는 용해되는 특징을 가지고 있다. 하지만, 생산 제조 현장에서는 기계 설비의 부식 문제뿐만 아니라 작업자의 안전 위험으로 염산과 같은 강산이나 가열 공정을 추가 적용하는 데에는 비용과 안전 문제 등 많은 제약이 발생한다. 따라서 본 연구에서는 염산 외에 약산 종류인 구연산, 아세트산, L-시스테인, 아스코르브산 성분 등을 이용하여 칼슘 원료를 용해할 수 있음을 확인하였다. 이 중, 특히 구연산을 이용하여 용해된 해조 칼슘이 동결보호 코팅제로 적용 가능한 최적의 조합임을 실험을 통해 검토하였다. 구연산 이외의 약산인 아세트산 등의 용해도 또한 전반적으로 구연산과 비슷한 효과를 확인하였지만, 이미, 이취, 변색 등의 영향이 있기 때문에 이러한 영향이 없는 구연산 적용을 우선으로 하였다. 약산 성분인 구연산을 이용하여 칼슘의 용해도를 평가한 결과, 칼슘 원료 대비 약 10 배 농도에 대한 구연산 원료를 적용하였을 시 완전한 용해가 가능하여 동결보호 코팅제로 사용 가능함을 확인하였다.

본 연구에서는 해조 칼슘의 용해 목적으로 사용되는 구연산이 적용됨에 따라 동결보호 코팅제 전체의 pH가 낮아지는 문제점을 보완하기 위하여 칼슘의 효능을 나타낼 수 있는 최적의 농도를 확인하였다.

결과는 표 5 및 표 6에 나타내었다.

구연산 1 내지 10 g/L 와 해조 칼슘 0.1 내지 1 g/L를 첨가한 공정에서 제품의 동결건조 후 생존율이 개선되었다. 하지만 구연산 100 g/L를 첨가한 경우에는 pH가 매우 낮아 동결건조 후 생존율이 구연산과 해조 칼슘을 넣지 않은 실험군보다도 더 낮은 결과를 확인하였다. 용해가 되지 않는 해조 칼슘은 동결보호 코팅제로써 평가를 진행하지 않았다.

구연산 농도에 따른 해조 칼슘의 용해도

구연산(g/L)	0.1 (pH 7.5)				1 (pH 3.2)				10 (pH 2.3)				100 (pH 1.6)
해조칼슘 (g/L)	0.01	0.1	1	10	0.01	0.1	1	10	0.01	0.1	1	10	0.01	0.1	1	10
용해도	+	w	w	-	+	+	+	w	+	+	+	w	+	+	+	+

+는 용해도가 뛰어남을, w는 용해도가 약간 있음을, -는 용해도가 매우 낮거나 없음을 나타냄.

균종별 구연산 및 해조칼슘 처리 조건에 따른 동결건조 생존율(%)

구연산(g/L)	해조 칼슘 (g/L)	동결건조 생존율 (%)
구연산(g/L)	해조 칼슘 (g/L)	*B. breve* CKDB002	*B. longum* CKDB004	*B. bifidum* CKDB001	*B lactis* CKDB005
-	-	58	50	45	78
0.1 (pH 7.5)	0.01	57	45	43	80
1 (pH 3.2)	0.01	50	41	38	72
	0.1	61	52	50	79
	1	62	53	55	81
	10	60	48	50	80
10 (pH 2.3)	0.01	45	43	35	65
	0.1	65	60	50	72
	1	71	63	55	88
	10	66	58	48	75
100 (pH 1.6)	0.01	30	22	19	40
	0.1	33	28	25	45
	1	48	40	33	55
	10	55	44	40	56

상기 결과에 따라, 해조 칼슘이 0.1 g 내지 10 g/L 가 함유된 유산균 동결보호 코팅제를 제조하였고, 이를 각각 유산균 B. breve CKDB002, B. longum CKDB004, B. bifidum CKDB001, B lactis CKDB005 균체에 코팅한 후 동결건조하여 원말을 제조하였다. 제조 과정은 도 4에 나타내었다.

실시예 8: 위장관 환경 안정성 검증

해조 칼슘 코팅 공법에 따른 유산균 생균제의 위장관 환경 안정성을 검증하였다.

결과는 표 7에 나타내었다.

실험 결과 해조 칼슘으로 코팅된 B. breve CKDB002는 내산성과 내담즙성이 각각 11%, B. longum CKDB004는 17% 와 12%, B. bifidum CKDB001는 17% 와7%, B lactis CKDB005는 22% 와 8% 씩 위장관 환경 안정성이 향상됨을 확인하였다. 특히 내산성의 경우, 해조 칼슘 코팅을 통하여 생존율이 큰 폭으로 향상된 결과를 보였으며 이는 칼슘 성분의 완충(buffering) 역할에 의한 효과인 것으로 예측된다. 이로써 해조 칼슘을 코팅제로 적용함으로써 열악한 위장관 환경 속에서 유산균의 생존율을 높일 수 있는 효과를 확인하였다.

해조 칼슘을 이용하여 코팅한 유산균의 위장관 환경 안정성

균주		*B. breve* CKDB002		*B. longum* CKDB004		*B. bifidum* CKDB001		*B. lactis* CKDB005
장관 환경 안정성		내산성 (%)	내담즙성(%)	내산성 (%)	내담즙성(%)	내산성 (%)	내담즙성(%)	내산성 (%)	내담즙성(%)
코팅 공정	비코팅	68	35	48	28	55	48	64	65
코팅 공정	해조칼슘 코팅	79	46	65	40	72	55	86	73

실시예 9: 열 안정성 평가

해조 칼슘 코팅 전후에 따른 프로바이오틱스의 열 안정성을 검증하였다.

결과는 표 8에 나타냈었다. 그 결과, 해조 칼슘으로 코팅된 B. breve CKDB002는 10%, B. longum CKDB004는 11%, B. bifidum CKDB001는 14%, B lactis CKDB005는 12% 로4종 모두 반응 12시간째에 대조군 대비 약 10% 이상 향상된 열 안정성을 보였다. 따라서 저장 안정성, 위장관 환경 안정성, 열 안정성이 모두 향상됨을 보아 천연 칼슘인 해조 칼슘 코팅을 통해 외부 환경으로부터 유산균을 보호한다는 것을 알 수 있었다.

해조 칼슘을 이용하여 코팅한 유산균의 열 안정성

균주	*B. breve* CKDB002		*B. longum* CKDB004		*B. bifidum* CKDB001		*B. lactis* CKDB005
코팅	비코팅	해조칼슘코팅	비코팅	해조칼슘코팅	비코팅	해조칼슘코팅	비코팅	해조칼슘코팅
0시간	1.3E+09	1.2E+09	1.2E+09	1.1E+09	1.1E+09	1.2E+09	1.2E+09	1.2E+09
4시간	3.7E+08	4.9E+08	4.3E+08	4.6E+08	8.6E+08	9.8E+08	1.0E+09	1.1E+09
8시간	1.6E+08	2.8E+08	2.7E+08	3.3E+08	5.1E+08	6.7E+08	7.5E+08	8.1E+08
12시간	1.1E+08	2.2E+08	1.6E+08	2.6E+08	2.9E+08	4.8E+08	6.2E+08	7.2E+08
12시간생존율	8%	18%	14%	25%	26%	40%	51%	63%

실시예 10: 유해세균 부착 억제능 평가

해조 칼슘 코팅 전후에 따른 장내 대표 유해세균인 Escherichia coli의 장 상피세포 부착 억제능을 검증하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

해조 칼슘으로 코팅된 B. breve CKDB002, B. longum CKDB004, B. bifidum CKDB001, B lactis CKDB005 4종 모두 E. coli에 대한 장 부착 억제능을 확인하였다. 특히, B lactis CKDB005는 30.9%의 가장 높은 억제능을 보여주었고, B. breve CKDB002는 17.3%, B. longum CKDB004는 16.1%, B. bifidum CKDB001는 6%의 억제능을 확인하였다.

따라서 해조 칼슘의 코팅제 적용은 산, 담즙산과 같은 장관 환경과 온도 및 습도와 같은 외부환경 노출로부터 유산균을 보호할 뿐 아니라, 장 내 유해세균의 장 부착능을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 11: 가혹 조건 저장 안정성 평가

제조된 유산균 원말 제품의 유통기간은 보통 18개월에서 최대 36개월동안 일정한 수 이상의 생균이 유지 및 보존되어야 한다. 일반적으로 비피도박테리움속 유산균주들의 경우, 절대 혐기성의 균종으로 다른 유산균주들에 비해 안정성이 현저히 감소하는 경향을 보여주고 있다. 본 발명에서는 저장 안정성의 극대화 효과를 확인하기 위하여 유산균 환경에 취약한 30℃의 고온과 상대습도 75%의 가혹한 조건에서 4주간 유산균의 생존율을 확인하였다.

결과는 표 9에 나타내었다,

표 9에 나타낸 바와 같이, B. lactis CKDB005는 해조 칼슘 적용시, 4 주차에서 82%의 가장 높은 저장 안정성을 확인할 수 있었고, B. breve CKDB002 와 B. bifidum CKDB001는 해조 칼슘의 동결보호 코팅제 적용으로 가혹조건 4주차에서 약 20% 차이의 높은 저장 안정성 효과를 확인할 수 있었다. B. longum CKDB004 또한 기본 코팅에 비해 소폭 향상된 해조 칼슘 동결보호 코팅제의 저장 안정성 효과를 확인하였다.

유산균 코팅 방법에 따른 저장 안정성 (%)

균주		*B. breve* CKDB002		*B. longum* CKDB004		*B. bifidum* CKDB001		*B. lactis* CKDB005
가혹 저장 안정성		1주차 (%)	4주차 (%)	1주차 (%)	4주차 (%)	1주차 (%)	4주차 (%)	1주차 (%)	4주차 (%)
코팅 공정	비코팅	58	30	48	21	58	39	86	69
코팅 공정	해조칼슘 코팅	100	51	54	32	70	58	87	82

실시예 12: 전자현미경을 통한 코팅 확인

해조 칼슘을 적용한 유산균의 동결보호 코팅 형태를 확인하기 위하여 주사전자 현미경 (SEM; Scanning Electron Microscope)을 사용하였다 유산균 샘플은 해조 칼슘 1 g/L 적용 후, 동결건조가 완료된 샘플에 파쇄기를 이용하여 원말 형태로 사용하였다. 전자현미경으로 확인한 균주는 B. breve CKDB002, B. longum CKDB004, B. bifidum CKDB001, B lactis CKDB005 이며, 10,000 배의 배율로 촬영하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

해조 칼슘을 적용한 결과, 유산균끼리의 구조가 조밀해지면서 더욱 단단해지는 현상을 관찰할 수 있어 이로 인해 내열성, 내산성 및 내담즙성 뿐만이 아니라 저장 안정성에도 영향을 주었을 것으로 판단하고 있다. 따라서, 천연 칼슘인 해조 칼슘을 동결보호 코팅제에 적용함으로써 유산균을 효과적으로 보호하면서 유해세균을 억제하는 칼슘의 기능도 나타내고 있음을 시사한다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC13893BP

20190719

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC13116BP

20160923

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC13671BP

20181023

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC13114BP

20160923

Claims

산을 처리한 리토탐니온(lithothamnion) 분말을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리토탐니온 분말은 칼슘, 마그네슘 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리토탐니온 분말은 다음과 같은 군에서 선택되는 특성을 갖는 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물:
(a) 20 중량% 내지 40 중량%의 칼슘을 함유하는 것;
(b) 1 중량% 내지 5 중량%의 마그네슘을 함유하는 것; 및
(c) (a) 및 (b)의 조합.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 칼슘은 탄산 칼슘의 형태인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산은 황산(H₂SO₄), 염산(HCl), 질산(HNO₃), 인산(H₃PO₄), 초산(Acetic acid), 젖산(Latic acid), 주석산(Tartaric acid), 사과산(Maleic acid),　구연산(Citric acid), 호박산(Succinic acid), 술폼산(Sulfamic acid), 개미산(Formic acid), 옥살산(Oxalic acid), 옥살아세트산(Oxalacetic acid), 푸마르산(Fumaric acid), 말산(Malic acid), 부티르산(Butyric acid), 팔미트산(Palmitic acid), 타르타르산(Tartaric acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 요산(Uric acid), 술핀산(Sulfinic acid), 이소시트르산(Isocitric acid), 라우르산(Lauric acid), 올레산(Oleic acid), 리놀레산(Linoleic acid) 및 미리스트산(Myristic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산의 pH는 2 내지 5인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산은 1 g/L 내지 10 g/L 농도의 구연산인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물의 칼슘의 함량은 0.1 g/L 내지 10 g/L인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물.
다음 단계를 포함하는 산을 처리한 리토탐니온 분말을 포함하는 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법:
(a) 리토탐니온을 건조, 파쇄 및 분쇄하여 리토탐니온 분말을 획득하는 단계; 및
(b) 리토탐니온 분말을 산으로 처리하는 단계.
제9항에 있어서, 상기 산의 pH는 2 내지 5인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 산은 1 g/L 내지 10 g/L 농도의 구연산인 것인, 프로바이오틱스의 동결보호 또는 코팅용 조성물의 제조방법.
산을 처리한 리토탐니온 분말이 코팅된 프로바이오틱스를 포함하는 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 약제학적 조성물 및 사료용 조성물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 내산성, 내담즙성, 열안정성, 보관 안정성, 유해균의 장 부착능 저해 효능 또는 이들의 조합이 향상된 것인, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 L-lactate를 D-lactate로 이성질화 시키지 않는 것, 항생제 내성을 갖지 않는 것 또는 이들의 조합 특성을 갖는 것인, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 비피도 박테리움(Bifidobacterium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactocuccus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토 코커스(Streptococcus) 속 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제16항에 있어서, 상기 비피도박테리움 속의 프로바이오틱스는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제16항에 있어서, 상기 비피도박테리움 속의 프로바이오틱스는 수탁번호 KCTC13893BP의 프로바이오틱스는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) CKDB002, 수탁번호 KCTC13671BP의 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) CKDB004, 수탁번호 KCTC13114BP의 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001, 수탁번호 KCTC13116BP의 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제18항에 있어서, 상기 조성물은 유당불내증 완화 효과를 갖는 것인, 조성물.
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