CN1268346C - 生物多糖微胶囊及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种生物多糖微胶囊的制备方法，包括步骤：a)将0.8-3%生物多糖水溶液和20-1000mM金属盐水溶液分别加入溶有表面活性剂的有机溶剂中，加入矿物油，混合，直到油相与水相密度相同，分别形成生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液；b)对步骤a)得到的生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液在冰浴上分别用超声波分别乳化；c)混合形成反应混合物；d)离心分层，获得水相；e)脱水洗涤，得到生物多糖微胶囊。还公开了用该方法制得的生物多糖微胶囊以及该微胶囊作为药物载体用于制备血管内给药或口服给药或肌肉注射或皮下注射的药物或疫苗的用途。

Description

生物多糖微胶囊及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及材料学领域，更具体地涉及生物多糖微胶囊及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物工程研究的发展，将会不断有新型药物出现，为人类健康提供更多的疾病治疗手段。与此同时，生物药物和新型治疗方法的发展也向给药方式的发展提出了更高的要求。

常见的生物多糖有海藻酸钠、Gellan胶(结冷胶)、果胶、果胶酸、卡拉胶、琼脂和琼脂糖等，它们都具有由单糖连接所形成的链状结构。其中琼脂和琼脂糖是热溶胶(Thermal gel)，可以随着温度升高而溶化、随着温度降低而凝固；海藻酸钠、果胶、果胶酸和卡拉胶水溶液则具有弱多聚电解质性质，而且由于其特异结构，能与某些金属离子结合并凝固；取决于钠离子含量，Gellan胶可以分别具有以上两种特性。

海藻酸钠具有良好的生物相容性，因此作为生物移植材料已经使用多年，主要用于制备包埋有胰岛或细胞的微胶囊(Franklin Lim，US Patent Number 4,391,909，1983)。水化海藻酸钠在同二价金属离子如碱土金属离子反应后会交联从而固化。典型海藻酸盐胶囊制备方法包括液滴法、静电液滴法和雾化法，使海藻酸钠液滴进入CaCl₂溶液，分别形成直径1-2毫米(见Bing Q.Shen等，Calcium alginateimmobilized hybridomas grown using a fluidized-bed perfusion system with a protein-free medium，Cytotechnology 14：109-117，1994)、50-200微米(F.Lim和A.M.Sun，Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas，Science 210：908-910，1980)和几微米至1毫米的胶囊(见中国专利申请号00801292，用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物)。由于上述海藻酸盐胶囊的尺寸过大，不适合用作血管内药物载体，也不适合用作疫苗载体。尚未见到有关制备直径1微米以下生物多糖胶囊的报导。

因此，本领域迫切需要新的具有良好生物相容性，粒径小的微胶囊。

发明简述

因此，本发明的目的是提供一种生物相容性良好，粒径小的生物多糖微胶囊。

本发明的另一个目的是提供所述生物多糖微胶囊的制法和应用。

本发明的一个方面提供了一种生物多糖微胶囊的制备方法，包括下列步骤：

a)将0.8-3％生物多糖水溶液和20-1000mM金属盐水溶液分别加入溶有表面活性剂的有机溶剂中，加入矿物油，混合，直到油相与水相密度相同，形成生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液，其中所述生物多糖选自海藻酸盐(优选为海藻酸钠、海藻酸钾)、Gellan胶、果胶、果胶酸、卡拉胶；所述的金属盐选自以下金属离子形成的水溶性盐：K⁺、Ca⁺²、Ba⁺²、Sr⁺²、Cu⁺²、Fe⁺²、Fe⁺³、Al⁺³或其组合；

b)对步骤a)得到的生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液在冰浴上分别用超声波乳化，形成稳定的生物多糖水/油乳化液和金属盐水/油乳化液；

c)在4-35℃混合步骤b)得到的生物多糖乳化液和金属盐乳化液5-60分钟，形成反应混合物；

d)对步骤c)的反应混合物离心分层，获得水相；

e)反应产物脱水，然后洗涤除掉表面活性剂和油相物质，得到生物多糖微胶囊。

在本发明该方面的一个优选例中，如果生物多糖为海藻酸盐(优选为海藻酸钠、海藻酸钾)、Gellan胶、果胶、果胶酸，所述的金属盐选自：CaCl₂、BaCl₂、SrCl₂或其混合物。

在本发明该方面的另一个优选例中，如果生物多糖为卡拉胶，所述的金属盐金属离子为K⁺离子，浓度为40-500mM。

在本发明该方面的另一个实施例中，表面活性剂为Span 65，或表面活性剂为非离子性表面活性剂，且表面活性剂浓度为5-50mg/ml；所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷。

在本发明该方面的一个实施例中，步骤e)中的脱水用无水乙醇进行，洗涤是先用二氯甲烷洗涤，然后用无水乙醇洗涤。

在本发明该方面的一个实施例中，还包括步骤：

f)将步骤e)获得的生物多糖微胶囊放入pH4.5-6.2的缓冲液(优选为2-N吗啉代乙磺酸溶液)中，与含有水溶性二胺化合物(优选为乙二胺)、水溶性碳二亚胺(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐，EDAC，又称为EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的pH为4-6.9的溶液(优选为2-N-吗啉代乙磺酸溶液(MES))混合，其中生物多糖微胶囊干重与二胺化合物之比为1克∶0.1-0.6毫摩尔，在10-50℃下避光并混合10-30小时，然后用选自乙二胺四乙酸或柠檬酸的金属离子螯合剂溶液处理除去金属离子，从而获得金属离子含量低于5％，优选低于2％，最优选低于1％的生物多糖微胶囊。

本发明的另一个方面提供了用上述的方法制备的生物多糖微胶囊，该胶囊含50-90％重量的生物多糖，且胶囊的直径在50-1000，优选在50-900，更优选在50-800纳米之间。

在本发明该方面的一个实施例中，生物多糖选自海藻酸盐，优选为海藻酸钠，海藻酸钾，或Gellan胶、果胶、果胶酸、卡拉胶。

本发明的还有一个方面提供了上述的生物多糖微胶囊的用途，该微胶囊作为药物载体用于制备血管内给药、口服给药、肌肉注射或皮下注射的药物或疫苗。

本发明的还有一个方面提供了一种药物微颗粒，它包括上述生物多糖微胶囊以及包埋于、吸附于和/或偶联于所述生物多糖微胶囊的药物活性成分。其中本文所用的术语“药物活性成分”包括治疗性的活性成分，例如各种本领域已知的药物，例如血红蛋白、凝血因子、胰岛素等等，还包括预防性的活性成分，例如抗体、免疫原性组合物、疫苗等。

附图简述

图1显示了实施例1制备的海藻酸钙纳米微胶囊的直径分布。

图2显示了实施例5中清醒Sprague Dawley大鼠血液动力学应答实验结果。

图3显示了实施例5中清醒Sprague Dawley大鼠血液化学分析结果。左栏为试验组的结果，右栏为对照组的结果。其中“ALT(SGPT)”是指丙氨酸氨基转移酶(血清谷氨酸丙酮酸转氨酶)；“ALT(SGOT)”是指丙氨酸氨基转移酶(血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶)；“CPK(CK)”是指肌酸磷酸激酶(肌酸激酶)；“MG”指毫克，“DL”为百毫升，“GM”为克，“IU”为国际单位，“MEQ”为毫当量，“U”为单位。

图4显示了实施例5中清醒Sprague Dawley大鼠血细胞计数结果。其中“FL”是指液量盎司，“FG”是指液量克(Fluid gram)。

具体实施方式

本发明人通过改进超声和乳化技术，首次实现了生物多糖微胶囊的纳米化。

本发明的步骤(a)中的有机溶剂可采用极性溶剂，例如二氯甲烷、三氯甲烷等。矿物油可以是石油醚或液态烃类，加入混合，直到油相和水相密度相同，即不会形成分层。步骤b)中可用常规超声发生装置，例如Misonic超声发生器等。超声的强度和时间可由本领域一般技术人员视情况而定，只要形成“稳定”的乳化液。“稳定”的乳化液是指得到的乳液中没有明显的团聚，也不会在放置后产生沉淀或团聚。

步骤c)中在室温下反应后，产生相变，原来的水相中出现固态物质，从而可进行离心分离，而不会重新象液滴一样融合。

本发明的生物多糖选自海藻酸钠、果胶、果胶酸和卡拉胶等。这些生物多糖的特点是沿其糖链具有多个游离的羧基，在遇到金属离子时，多糖链能够通过离子键互相靠拢、形成凝胶。本发明形成的生物多糖胶囊的粒径是纳米级的，比目前使用的微胶囊要小得多。因此它可以作为血管内的药物载体，而不会由于粒径过大而产生堵塞毛细血管或产生凝聚的现象而对人体造成危害，可以用作疫苗的载体。另外，由于使用生物多糖制备，与人体具有良好的相容性，是无毒无害的。本发明中优选使用的非离子表面活性剂是Span 65。该表面活性剂可以溶于二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂。其它非离子表面活性剂也可使用，例如Span 85。

本发明的微胶囊可在酒精溶液中永久保存，也可悬浮在溶液中在4℃进行保存，时间可长达1年，仍保持稳定，而不出现絮凝或分解现象。该溶液可用常规的生理盐水溶液，其中可添加2mM CaCl₂和10mM HEPES(pH 7.2-7.4)，以保持离子平衡和酸碱平衡。

本发明的金属离子多糖胶囊可以方便的与有机交联试剂反应，例如用二胺化合物(最佳为乙二胺)替换金属离子与羧基结合。所用介导氨基与羧基耦联的化合物优选为水溶性碳二亚胺，最优选为1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC或称EDC)。这些水溶性碳二亚胺化合物是本领域技术人员已知的，也可以从商品来源得到，例如Sigma公司等。该得到的胶囊也具有粒径小，无毒无害的优点，可作为给药载体。

本文所述的给药可用于多种途径，例如口服、血管内注射、肌肉注射、皮下注射等。

本发明的生物多糖微胶囊的粒径首次达到了1000纳米，优选900，800纳米以下甚至达到200纳米。这样的微胶囊不会堵塞血管，具有更好的传递药物活性成分的性质，也可以被免疫细胞(例如巨嗜细胞)吞噬。在操作中，生物多糖微胶囊与活性成分的混合比可以由本领域技术人员根据实际使用情况确定，其混合比通常为1∶99-99∶1。

下文提供了实施例进一步说明了本发明。这些例子不是为了限制本发明的范围。

实施例1：海藻酸钙微胶囊的制备

(1)取两支50毫升聚丙烯离心管，各称400毫克非离子性表面活性剂Span65，分别溶于16.6毫升二氯甲烷中。分别加入2毫升溶于10mM HEPES缓冲液(pH7.4)的海藻酸钠溶液和2毫升120mM CaCl₂溶液(含10mM HEPES，pH 7.4)，再加入矿物油，轻轻混合，直到油相与水相密度相同；

(2)将离心管放到冰浴上，利用超声波(Misonic，1/4英寸)将海藻酸钠溶液和CaCl₂溶液分别乳化4分钟；

(3)将海藻酸钠乳化液与CaCl₂乳化液在烧杯中搅拌混合、反应5分钟，完成相变；

(4)反应完成后，将反应物平均转移到4支50毫升聚丙烯离心管，再分别加入二氯甲烷至50毫升，混合，然后转速1700RPM离心5分钟，将水相从顶部移出，并入50毫升聚丙烯离心管；

(5)加入无水乙醇，利用超声波将胶囊分散，离心，除去乙醇；

(6)加入16毫升二氯甲烷，利用超声波将胶囊分散，再加入32毫升二氯甲烷，混合然后1700RPM离心5分钟，除去二氯甲烷；

(7)重复(6)；

(8)加入16毫升无水乙醇，利用超声波将胶囊分散，再加入32毫升无水乙醇，混合然后1700RPM离心5分钟，除去乙醇；

(9)加入10毫升2mM CaCl₂溶液，利用超声波将胶囊分散，再加入40毫升120mM CaCl₂溶液，混合然后1700RPM离心5分钟，除去上清液；

(10)将胶囊重新悬浮于25毫升pH 7.4142mM NaCl溶液(含2mM CaCl₂和10mM HEPES)，做颗粒分析和显微镜观察。颗粒分析采用Particle Sizing Systems公司的NICOMP系统，分析结果如图1所示，所有胶囊直径在1000纳米以下，平均直径约250纳米。

实施例2：海藻酸钡微胶囊的制备

(1)取两支50毫升聚丙烯离心管，各称400毫克非离子性表面活性剂Span65，分别溶于16.6毫升二氯甲烷中。分别加入2毫升溶于l0mM HEPES缓冲液(pH7.4)的海藻酸钠溶液和2毫升100mM BaCl₂溶液(含10mM HEPES，pH 7.4)，再加入矿物油，轻轻混合，直到油相与水相密度相同；

(2)将离心管放到冰上，利用超声波(Misonic，1/4英寸)将海藻酸钠溶液和BaCl₂溶液分别乳化4分钟；

(3)将海藻酸钠乳化液与BaCl₂乳化液在烧杯中搅拌混合、反应5分钟，完成相变；

(4)反应完成后，平均转移至4支50毫升聚丙烯离心管，再加入二氯甲烷至50毫升，混合然后1700RPM离心5分钟，将水相从顶部移出，并入50毫升聚丙烯离心管；

(5)加入16毫升无水乙醇，利用超声波将胶囊分散，再加入32毫升无水乙醇，混合然后1700RPM离心5分钟，除去无水乙醇；

(6)加入16毫升二氯甲烷，利用超声波将胶囊分散，再加入32毫升二氯甲烷，混合然后1700RPM离心5分钟，除去二氯甲烷；

(7)重复(6)；

(8)加入16毫升无水乙醇，利用超声波将胶囊分散，再加入32毫升无水乙醇，混合然后1700RPM离心5分钟，除去乙醇；

(9)加入10毫升2mM CaCl₂溶液，利用超声波将胶囊分散，再加入40毫升100mM BaCl₂溶液，混合然后1700RPM离心5分钟，除去上清液；

(10)将胶囊重新悬浮于25毫升的142mM NaCl溶液(含2mM CaCl₂和10mMHEPES，pH 7.4)，显微镜观察，可见胶囊呈分散状态，没有团聚或交联。

实施例3：乙二胺交联海藻酸盐微胶囊的制备

使用二胺化合物将碱土金属离子交联海藻酸盐微胶囊有机交联，再使用螯合剂将已经结合的离子去除。

(1)将200毫克(干重)海藻酸钙微胶囊放入50毫升聚丙烯离心管中，离心，除去上清液；

(2)加入45毫升pH 6.5的25mM MES(2-N-吗啉代乙磺酸)缓冲液(含有20mM CaCl₂和108mM NaCl)，利用超声波将胶囊分散，离心，除去上清液；

(3)重复(2)；

(4)加入62.5微升1M溶于MES的乙二胺(2HCl，pH调到6.5)，混合；

(5)分别称800毫克EDAC和NHS，迅速溶于5毫升20mM MES溶液，再与海藻酸胶囊混合，在室温条件下混合反应183小时；

(6)加入5毫升2mM CaCl₂溶液和20毫升120mM CaCl₂溶液，混合，离心，除去上清液；

(7)加入5毫升2mM CaCl₂溶液，利用超声波将胶囊分散，加入40毫升无水乙醇，混合，离心，除去上清液；

(8)重复(7)；

(9)加入柠檬酸或EDTA溶液，除去Ca⁺²。

实施例4：血红蛋白与海藻酸盐微胶囊的化学偶联物

(1)将200毫克(干重)海藻酸钙微胶囊放入50毫升聚丙烯离心管中，离心，除去上清液；

(2)加入45毫升pH 6.5 25mM MES缓冲液(含20mM CaCl₂和108mMNaCl)，利用超声波将胶囊分散，离心，除去上清液；

(3)重复(2)；

(4)加入62.5微升3％溶于MFS的人血红蛋白(pH 6.5)，混合；

(5)分别称800毫克EDAC和NHS，迅速溶于5毫升20mM MES溶液，再与海藻酸钙胶囊混合，在室温条件下混合反应18小时；

(6)将反应物转移至10万MWCO透析袋中，在4℃磷酸缓冲液中透析，去除游离血红蛋白。

实施例5：海藻酸钙微胶囊在清醒大鼠中的血液动力学应答实验

取平均体重80克Sprague Dawley大鼠6只。将海藻酸钙微胶囊在142mMNaCl溶液(含2mM CaCl₂和10mM HEPES，pH 7.4)中稀释至每毫升12毫克(干重)，对4只实验大鼠分别静脉注射5毫升(60毫克干重)，对2只对照大鼠分别静脉注射5毫升142mM NaCl溶液(含2mM CaCl₂和10mM HEPES，pH 7.4)，并实时监测动脉压(Arterial pressure)、心输出量(Cardiac output)、心率(Heartrate)、总外周阻力(Total peripheral resistance)(如图2所示)。并对血样进行生化分析(如图3和图4所示)。实验结果证明，试验大鼠与对照大鼠之间在血液动力学、血液化学和血细胞方面无明显差异。经检测，呼吸频率、体温和体重也无明显差异。

实施例6血红蛋白偶联的海藻酸微胶囊在清醒大鼠中的血液动力学应答实验

用实施例4所获得的血红蛋白偶联的海藻酸微胶囊替代实施例5中的海藻酸微胶囊，用单独的血红蛋白缓冲液溶液作为对照，按照实施例5的方法进行给药，并实时监测动脉压(Arterial pressure)、心输出量(Cardiac output)、心率(Heartrate)、总外周阻力(Total peripheral resistance)。实验结果证明，试验大鼠相对于对照大鼠，在心输出量、体温和体重上都有明显上升，其活力增加。因此，用生物多糖微胶囊作为载体运输血红蛋白确实比常规的方法起到了显著更好的作用。

Claims (10)

1、一种生物多糖微胶囊的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

a)将0.8-3％生物多糖水溶液和20-1000mM金属盐水溶液分别加入溶有表面活性剂的有机溶剂中，加入矿物油，混合，直到油相与水相密度相同，分别形成生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液，其中所述生物多糖选自海藻酸盐、Gellan胶、果胶、果胶酸、卡拉胶；所述的金属盐选自以下金属离子形成的水溶性盐：K⁺、Ca⁺²、Ba⁺²、Sr⁺²、Cu⁺²、Fe⁺²、Fe⁺³、Al⁺³或其组合；

b)对步骤a)得到的生物多糖水/油混悬液和金属盐水/油混悬液在冰浴上分别用超声波乳化，形成稳定的生物多糖水/油乳化液和金属盐水/油乳化液；

c)在4-35℃混合步骤b)得到的生物多糖乳化液和金属盐乳化液5-60分钟，形成反应混合物；

d)对步骤c)的反应混合物离心分层，获得水相反应产物；

e)反应产物脱水，然后洗涤除掉表面活性剂和油相物质，得到生物多糖微胶囊。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，如果生物多糖为海藻酸盐、Gellan胶、果胶、果胶酸，所述的金属盐选自：CaCl₂、BaCl₂、SrCl₂或其混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，如果生物多糖为卡拉胶，所述的金属盐金属离子为K⁺离子，浓度为40-500mM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为Span 65，或表面活性剂为非离子性表面活性剂，且表面活性剂浓度为5-50mg/ml；所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中的脱水用无水乙醇进行，洗涤是先用二氯甲烷洗涤，然后用无水乙醇洗涤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

f)将步骤e)获得的生物多糖微胶囊放入pH4.5-6.2的缓冲液中，与含有水溶性二胺化合物、水溶性碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的pH为4-6.9的缓冲液混合，其中生物多糖微胶囊干重与二胺化合物之比为1克∶0.1-0.6毫摩尔，在10-50℃下避光并混合10-30小时，然后用选自乙二胺四乙酸或柠檬酸的金属离子螫合剂溶液处理除去金属离子。

7.用权利要求1所述的方法制备的生物多糖微胶囊，其特征在于，该胶囊含50-90％重量的生物多糖，且胶囊的直径在50-1000纳米之间。

8.如权利要求7所述的微胶囊，其特征在于，所述生物多糖选自海藻酸盐、Gellan胶、果胶、果胶酸、卡拉胶。

9.如权利要求7所述的生物多糖微胶囊的用途，其特征在于，该微胶囊作为药物载体用于制备血管内给药、口服给药、肌肉注射或皮下注射的药物或疫苗。

10.一种药物微颗粒，其特征在于，它包括权利要求7所述的生物多糖微胶囊以及包埋于、吸附于和/或偶联于所述生物多糖微胶囊的药物活性成分。

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