BR112016024161B1

BR112016024161B1 - combinação de um ácido hialurônico e de um polissacarídeo sulfatado, composição dermatológica ou cosmética, e uso das mesmas

Info

Publication number: BR112016024161B1
Application number: BR112016024161-4A
Authority: BR
Inventors: Stéphane Poigny; Hélène Hernandez-Pigeon; Jean-Hilaire Saurat; Gürkan Kaya
Original assignee: Pierre Fabre Dermo-Cosmetique
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2021-03-02
Also published as: JP2017514825A; RU2016146372A; KR20160145788A; JP6625558B2; US20170049678A1; AU2015254602B2; AU2015254602A1; FR3020570B1; RU2683567C2; EP3137050A1; CN106255490B; CA2946943C; FR3020570A1; CA2946943A1; RU2016146372A3; US9993417B2; MX2016014050A; BR112016024161A2; CN106255490A; WO2015166063A1

Abstract

COMBINAÇÃO DE UM ÁCIDO HIALURÔNICO E DE UM POLISSACARÍDEO SULFATADO. A presente invenção refere-se a uma combinação compreendendo um ácido hialurônico ou um sal do mesmo e um polissacarídeo sulfatado do qual o peso molecular está entre 5 e 25 kDa, o qual é de uso, em particular, para combater os sinais de envelhecimento da pele ou para tratar e cicatrizar feridas na pele.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma nova combinação de ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de um polissacarídeo sulfatado de peso molecular baixo; e ao uso da dita combinação em áreas de anti-envelhecimento e cicatrização.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Ácido hialurônico (HA) é uma molécula com o papel mais im portante na pele. Isso de fato é o componente principal da matriz extrace- lular. O último refere-se ao conjunto das macromoléculas extracelulares do tecido conectivo. É principalmente feito de glicoproteínas, proteínas puras, bem como glicosaminoglicanos. O HA é um glicosaminoglicano não sulfatado linear composto de unidades de dissacarídeo de repetição das mesmas compostas de ácido D-glucurônico e N-acetil-D-glicosamina ligados com ligações glicosídicas β1-3 e β1-4 entre os dímeros (Tammi R., Agren U.M., Tuhkanen A.L., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry 29(2):1-81, 1994). Em sua forma natural, o HA é um polímero que tem um peso molecular muito alto entre 600.000 Da e 3 MDa (Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to peracellular cue. Nat Rev Cancer 2004, 4:538-539).

[003] Com a idade, o HA diminui na quantidade e no grau de po- limerização, resultando em menos água retida na matriz extracelular. A pele então passa por um processo de envelhecimento que leva ao aumento de fibrose e a uma queda no conteúdo de fibra elástica. Durante o processo de envelhecimento, uma modificação da estrutura da pele e das funções é observada. Esse envelhecimento é fisiológico por natureza, mas também pode ser fotoinduzido, isto é, devido à exposi- ção repetida da pele à luz solar, em particular, luz ultravioleta. Os si-naisclínicos principais de envelhecimento da pele são o aparecimento de linhas e rugas profundas, as quais obviamente aumentam com a idade. Os sulcos e rugas são marcados; a pele se torna oca e perde sua firmeza; na superfície, a pele perde seu brilho.

[004] Os polissacarídeos sulfatados compreendem, inter alia, fu- canos sulfatados e ulvanos sulfatados tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa.

[005] Esses polissacarídeos sulfatados de baixo peso molecular têm propriedades bioquímicas vantajosas: inibição de degradação de colágeno e elastina, restruturação, ação anti-inflamatória e indução de produção de HA.

[006] Durante o envelhecimento, os fibroblastos introduzem se- nescência e sua habilidade em proliferar diminui grandemente. Assim, o fato de ser capaz de estimular a proliferação dessas células de novo é um dos caminhos estudados para combater o envelhecimento da pele.

[007] Além disso, a cicatrização de feridas é um processo bioló gico complexo e dinâmico que põe em jogo a interação de vários fatores locais e sistêmicos no reparo do tecido normal. A cicatrização progride nas três fases interdependentes: homeostase e inflamação, proliferação e remodelagem (General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 Jun; 77(3):509-28.). A proliferação envolve três processos claramente observáveis: granulação, contração e re-epitelização.

[008] Durante a granulação, alguém observa a proliferação e mi gração em direção ao leito de cicatrização de células que intervirá no resto do processo de reparo. Assim, os macrófagos, fibroblastos e células endoteliais são encontrados lá. Os macrófagos constantemente liberam fatores quimiotáticos e fatores de crescimento. Os fibroblastos constroem a nova matriz celular necessária para o crescimento da célula na base da ferida. Essa armação suporta a migração da célula. Por último, as células endoteliais acionam a formação de brotos vasculares que constituirão novos capilares, que restaurarão a perfusão e garantem o fornecimento de oxigênio e de nutrientes essenciais para a atividade metabólica das células na ferida.

[009] A contração da ferida é um mecanismo de redução do ta manho da ferida, e os fibroblastos desempenham um papel determinante nessa contração.

[0010] A re-epitelização consiste na regeneração de uma epider me que cobre uma ferida para formar uma barreira eficaz contra o ambiente externo, capaz de se tornar pigmentado e de recuperar suas funções sensoriais e imunológicas. Assim, ele envolve os processos celulares de migração e proliferação de queratinócito, mas também a diferenciação desse neoepitélio e da restauração de uma membrana basal que conecta a derme e a epiderme. Quando a migração de células basais na direção do centro da ferida permite que as duas bordas da ferida se encontrem, uma onda de mitose de célula ocorre para preencher os espaços deixados pela migração e para fornecer as células do tecido epitelial em regeneração tridimensional.

[0011] Os estágios de proliferação de células de queratinócitos, fi- broblastos ou células endoteliais podem ser relacionados como um dos fenômenos funcionais que mostram a atividade de cicatrização de um agente ativo. A proliferação de fibroblasto aumentada participaria na cica- trização de uma ferida profunda (alcançando a derme), enquanto a proliferação de queratinócito aumentada participaria na re-epitelização.

[0012] Permanece uma necessidade de propor novas composi ções cosméticas para combate dos sinais de envelhecimento da pele.

[0013] O depositante mostrou a existência de sinergia entre o áci dohialurônico e um polissacarídeo sulfatado de baixo peso molecular na proliferação do fibroblasto. Essa atividade é particularmente vantajosa no campo de antienvelhecimento, mas também na regeneração de tecido e na cicatrização de lesões na pele.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0014] A presente invenção tem como um objetivo uma combina ção compreendendo um ácido hialurônico ou um sal do mesmo e um polissacarídeo sulfatado tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa.

[0015] No contexto da presente invenção, os termos “ácido hialu- rônico”, “fragmentos de ácido hialurônico”, “HA” e “hialuronano” são usados alternadamente para se referir ao ácido hialurônico. Quando o ácido hialurônico está na forma de sal, ele é referido como hialuronato.

[0016] Em uma modalidade particular da invenção, a combinação compreende um ácido hialurônico ou um sal do mesmo, o peso molecular médio ponderal (Mw) do qual estará entre 50.000 e 750.000 Da.

[0017] Em uma modalidade particular da invenção, o fragmento de HA ou um sal do mesmo é caracterizado por um peso molecular médio ponderal entre 60 e 120 kDa, o dito peso molecular sendo medido por um método analítico que combina cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um fotômetro de espalhamento de luz de múltiplos ângulos (MALS) acoplado com um viscosímetro (VIS) e um refratômetro diferencial (RI).

[0018] Em uma modalidade particular, será um hialuronato de sódio.

[0019] O peso molecular do HA ou um sal do mesmo pode ser medido usando o método da Farmacopeia Europeia que mede a viscosidade intrínseca com um viscosímetro capilar Ubbelohde (veja Farmacopeia Europeia 7.6, monografia de hialuronato de sódio ref.: 01/2011:1472). Esse valor de viscosidade é então relacionado ao peso molecular médio pela reação Mark-. Esse método é longo e requer reprodutibilidade perfeita.

[0020] No contexto da presente invenção, o peso molecular médio ponderai do HA ou de um sal do mesmo é medido pelo método SEC- MALS-VIS-RI, que é um método analítico que combina cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um fotômetro de espalhamento de luz de múltiplos ângulos (MALS) acoplado com um viscosímetro (VIS) e um refratômetro diferencial. Essa técnica torna possível obter o peso molecular médio ponderal (Mw).

[0021] Essa técnica torna possível caracterizar os pesos molecula res de HAs em uma maneira precisa e reproduzível (Stepan Podzimek & al. Solution of Hialuronic Acid and Comparison of SEC-MALS-VIS Data with Off-line Capillary Viscometry. Journal of Applied Polymer Science. 2009).

[0022] O acoplamento da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um detector MALS torna possível, após injeção de uma solução polimérica em um sistema cromatográfico, separar esses polímeros por tamanho na coluna cromatográfica, para medir esse tamanho por espalhamento de luz e para quantifica-los usando um refratô- metro ou um espectrômetro de UV. • Ácido hialurónico ou um sal do mesmo é solubilizado em solução aquosa de NaCl a 0,1 M então eluído em uma coluna preenchida com esferas de poliestireno-divinilbenzeno tendo um tamanho de poro calibrado. As cadeias grandes de polímero não passam em todos os poros e, assim, eluídos antes das cadeias pequenas. • O detector MALS mede o espalhamento da luz incidente em vários ângulos. Esses ângulos tornam possível, por extrapolação, medir R0, que é o espalhamento no ângulo 0. R0 é diretamente proporcional ao tamanho molecular. • A resposta Si do refratômetro diferencial à massa total Ci do polímero tendo grau de polimerização i de acordo com a equação a seguir (1): Si = K'-dn/dc-Ci onde: Sié, dessa maneira, a resposta do refratômetro diferencial, K‘ é uma constante ligada ao aparelho, e Ci é a massa total (peso) do polímero que tem grau de polime- rização i (C = Ni x Mi), Ni sendo o número de cadelas de massa molar Mi.

[0023] O aumento do índice refrativo dn/dc está além de um valor específico do polímero em estudo.

[0024] Essa razão de dn/dc pode ser medida de acordo com o pro tocolo a seguir exemplificado com hialuronato de sódio.

a/ Aparelho e preparação de soluções:

[0025] Medições são tiradas em um refratômetro tal como o mode loBrice-Phoenix tendo como fonte de luz incidente um laser de hélio- neon (X = 633 nm).

[0026] Várias concentrações de polímero a serem estudadas são preparadas independentemente por pesagem (duração em solução = 24 horas). Os índices refrativos respectivos (dn) são então medidos usando o refratômetro.

b/ Resultado

[0027] Os resultados são apresentados na forma de um gráfico dn = f(concentração) (veja Figura 1). Uma regressão linear do tipo Y = A + B*X é então determinada.

[0028] No caso de hialuronato de sódio, os valores A e B determi nados são respectivamente A = -2,030 e B = 14927,911.

[0029] A razão de dn/dc assim corresponde a k x B onde k é a constante do aparelho que é igual a 0,97^10-5 nesse exemplo.

[0030] Para hialuronato de sódio, dn/dc é assim avaliado em 0,97^10-5 x 14927,911 = 0,145 ml/g.

[0031] A fórmula a seguir dá o relacionamento entre todos os pa râmetros medidos: Ro = K.CrMi onde: R0 é a razão de Rayleigh no ângulo de espalhamento 0, K é a constante do aparelho, Cié a massa total do polímero tendo grau de polimerização i [calculado de acordo com a equação (1)] da solução injetada, e Mié a massa molar da cadeia de polímero procurada.

[0032] O peso molecular médio ponderal Mw pode então ser cal culado de acordo com a fórmula: Mw = ∑CiMi/∑Ci.

[0033] Todos os pesos moleculares são expressos em daltons.

[0034] O ácido hialurônico ou um sal do mesmo, objeto da presen te invenção, pode ser obtido de acordo com um dos processos conhecidos de pessoas com habilidade na técnica, tais como aquelas mencionadas no documento EP1987153.

[0035] O HA é obtido principalmente, em uma maneira industrial, por fermentação bacteriana: filamentos de ácido hialurônico são sintetizados por bactérias.

[0036] Assim, em uma modalidade particular da invenção, um HA natural tendo um alto peso molecular variando geralmente de 1 MDa a 2 MDa é obtido por fermentação bacteriana usando uma cepa bacteri- ana selecionada.

[0037] O polímero obtido pode então ser separado da bactéria. A solução é então purificada e então hidrolisada por hidrólise ácida controladaaté o peso molecular desejado ser obtido.

[0038] No caso de preparação de hialuronato de sódio, alguém procederá a uma etapa de neutralização pela adição de NaOH.

[0039] O sal de ácido hialurônico será preferencialmente hialuro- nato de sódio.

[0040] No contexto da presente invenção, os polissacarídeos sul fatados de baixo peso molecular podem ser selecionado de fucanos sulfatados e ulvanos sulfatados tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa.

[0041] Os fucanos sulfatados são polissacarídeos que compreen dem L-fucose sulfatada. Esses polissacarídeos podem ser extraídos, em particular, de algas marrons, por exemplo, da ordem de Fucales ou Laminariales.

[0042] Os ulvanos sulfatados são polissacarídeos aniônicos sulfa tados compreendendo ácidos urônicos (por exemplo, ácido glucurôni- co, ácido idurônico) e açúcares capazes de ser sulfatados (por exemplo, 3-sulfato ramnose, galactose, xilose, glicose) distribuídos nos motivos repetidos. Os motivos principais são: - 3-sulfato de ácido ulvanobiurônico tipo A consistindo em 3-sulfato α-L-ramnose ligado com ácido β-D-glucuronico por uma ligação do tipo 1^4, e - 3-sulfato de ácido ulvanobiurônico tipo B consistindo em 3-sulfato α-L-ramnose ligado com ácido a-L-idurônico por uma ligação do tipo 1^4.

[0043] Os ulvanos podem ser extraídos, em particular, de algas verdes do tipo ulva ou enteromorfa (Ulva sp. e Enteromorpha sp.).

[0044] De acordo com uma modalidade particular, o fucano sulfa tado de baixo peso molecular é conforme descrito em WO 2010/086197.

[0045] Pode ser feita menção do produto comercial proprietário As- cophyscient® (Algues et Mer) extraído da alga Ascophyllum nodosum.

[0046] De acordo com outra modalidade particular, o ulvano sulfa tado de baixo peso molecular é conforme descrito em WO 2013/150253.

[0047] Também pode ser feita menção da fração QT40® comercia lizada por Green Tech com base em um oligossacarídeo particular da alga Ulva lactuca: um sulfo-oligorhamnoglucuronano.

[0048] De acordo com uma modalidade particular da invenção, a razão em massa de ácido hialurônico para polissacarídeo está entre 0,1 e 10.

[0049] De acordo com outra modalidade particular da invenção, a razão em massa de ácido hialurônico para polissacarídeo está entre 0,5 e 5, e preferencialmente entre 0,5 e 2.

[0050] A presente invenção também se refere a uma combinação de ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de um polissacarídeo sulfatado de baixo peso molecular de acordo com a invenção (isto é, tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa) para uso para promover proliferação de fibroblasto.

[0051] A presente invenção também se refere a uma composição cosmética compreendendo, como um ingrediente ativo antienvelheci- mento, uma combinação de um ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de um polissacarídeo sulfatado tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa e ainda compreendendo pelo menos um excipiente cosmeti- camente aceitável.

[0052] De preferência, os excipientes cosmeticamente aceitáveis são adequados para administração tópica.

[0053] Os excipientes aceitáveis tornam possível garantir a boa estabilidade de uma textura e sensação agradáveis. Eles também podem ser, por exemplo, agentes ou aditivos de formulação de uso conhecido e convencional em cosméticos: pode ser feita menção de ten- soativos, colorantes, conservantes, fragrâncias, agentes de formação de filme, espessantes, etc.

[0054] As composições antienvelhecimento podem estar nas for mas comumente conhecidas para administração tópica na pele, isto é, em particular, cremes, emulsões, loções, soros, máscaras, preenche- dores de rugas, delineadores, etc.

[0055] O objetivo da presente invenção é direcionado no uso cos- mético da combinação de acordo com a presente invenção ou dessa composição cosmética de acordo com a invenção para combater os sinais de envelhecimento da pele. O uso cosmético da combinação de acordo com a presente invenção ou da composição cosmética de acordo com a invenção é mais particularmente destinado a restaurar a matéria da pele, para fortalecer a firmeza da mesma e visivelmente reduzir as rugas marcadas e sulcos profundos.

[0056] A presente invenção também se refere a um método para combater os sinais de envelhecimento da pele compreendendo a ad-ministração, de preferência topicamente, de uma quantidade eficaz de uma combinação de acordo com a invenção ou de uma composição cosmética de acordo com a invenção para uma pessoa com essa necessidade.

[0057] Outro objetivo da presente invenção refere-se a uma com posição dermatológica destinada a acelerar o reparo da pele a fim de restaurar a integridade e a qualidade da pele, compreendendo como ingrediente ativo dermatológico ou cosmético a combinação de um ácido hialurônico ou de um sal do mesmo de um polissacarídeo sulfatado, cujo peso molecular está entre 5 e 25 kDa mencionado acima e ainda compreendendo pelo menos um excipiente dermatológica ou cosmeticamente aceitável.

[0058] Em uma modalidade preferida da invenção, a composição é destinada para aplicação tópica.

[0059] Os excipientes dermatológica (farmacêutica) ou cosmeti- camente compatíveis podem ser qualquer excipiente dentre aqueles conhecidos das pessoas com habilidade na técnica para obter uma composição para aplicação tópica na forma de um leite, creme, um bálsamo, um óleo, uma loção, um gel, um gel espumante, uma pomada, um spray, etc.

[0060] Em uma modalidade preferida, a composição estará na forma de um creme ou uma pomade.

[0061] Em uma modalidade particular, as composições dermatoló gicas e cosméticas de acordo com a invenção compreendem pelo menos outro ingrediente ativo.

[0062] Esse outro ingrediente ativo poderia, em particular, ser se lecionado do grupo compreendendo agentes antienvelhecimento, agentes de cicatrização, agentes calmantes, agentes antipruríticos, antioxidantes, agentes antirradicais, agentes anti-UV, agentes que estimulam a síntese de macromoléculas dérmicas ou metabolismo de energia, agentes hidratantes, agentes de despigmentação, antibacteri- anos, antifúngicos, anti-inflamatórios ou anestésicos.

[0063] De acordo com uma modalidade particular, as composições de acordo com a invenção, de preferência cosméticas, compreendem, ainda, retinaldeído. Esse agente ativo antienvelhecimento suplementar é um precursor direto de ácido retinoico para um efeito reativador de metabolismo celular imediato. O retinaldeído aumenta a expressão de receptores de HA, CD44, e induz a síntese de HA.

[0064] A composição de acordo com a invenção então compreen de uma combinação de ácido hialurônico ou um sal do mesmo, de po- lissacarídeo sulfatado de baixo peso molecular e de retinaldeído. Tal combinação tem um efeito de restruturação e redensificação na junção dermo-epidérmica e a derme papilar.

[0065] De acordo com outra modalidade da invenção, a composi ção compreenderá, ainda, um derivado de tocoferol incluindo delta- tocoferil-glucopiranosídeo: seus efeitos antioxidantes potentes protegem a pele e preservam o brilho do mesmo.

[0066] A composição de acordo com a invenção então compreen de uma combinação de ácido hialurônico ou um sal do mesmo, de po- lissacarídeo sulfatado de baixo peso molecular e de delta-tocoferil- glucopiranosídeo.

[0067] De acordo com outra modalidade particular, o outro ingredi ente ativo será selecionado de agentes de cicatrização, agentes calmantes e misturas dos mesmos. Tal ingrediente ativo será usado, de preferência, em composições dermatológicas.

[0068] Por último, outro objetivo da presente invenção é direciona do em uma combinação de ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de polissacarídeo sulfatado de baixo peso molecular ou uma composição dermatológica contendo o mesmo de acordo com a invenção para uso como um medicamento (mais particularmente, um medicamento dermatológico), destinado, em particular, para tratar e cicatrizar as lesões da pele.

[0069] A presente invenção também se refere ao uso de uma combinação de um ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de um po- lissacarídeo sulfatado tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa para a preparação de um medicamento (mais particularmente, um medica-mentodermatológico), destinado, em particular, para tratar e cicatrizar as lesões da pele.

[0070] A presente invenção também se refere a um método para tratar e cicatrizar lesões da pele que compreende a administração, preferencialmente tópica, de uma quantidade eficaz de uma combinação de um ácido hialurônico ou um sal do mesmo e de um polissacarí- deo sulfatado tendo um peso molecular entre 5 e 25 kDa ou uma composição dermatológica contendo o mesmo de acordo com a invenção para uma pessoa com essa necessidade.

[0071] As composições dermatológicas e cosméticas de acordo com a invenção são destinadas, em particular, para cuidar da pele lesionada: • após procedimentos/tratamentos invasivos: procedimentos cirúrgicos (exerése, barbear) com ou sem sutura, crioterapia, ablação a laser, descamação moderada ou pesada, mesoterapia, curetagem, • pós-traumaticamente com cortes ou queimaduras superficiais, • após procedimentos superficiais (não invasivos) que requerem um produto de cicatrização que acelera a recuperação da pele, para uso a longo prazo (até reparo completo da pele), • após dano externo brando: abrasões superficiais, queimadura de sol.

[0072] O tratamento das lesões da pele e das membranas de mu cosa de acordo com a invenção pode, em particular, compreender o tratamento de cortes, suturas, abrasões, riscos, arranhões, cicatrizes após cirurgia ou após um procedimento dermatológico estético, queimaduras superficiais, queimadura de sol.

[0073] A presente invenção refere-se, ainda, ao uso de uma com posição cosmética de acordo com a invenção destinada a melhorar a cicatrização e reparo da pele.

[0074] A invenção será mais bem compreendida mediante a leitura dos resultados abaixo que ilustram a invenção sem limitar o seu escopo. FIGURAS

[0075] A Figura 1 mostra índice refrativo dn como uma função de concentração c para hialuronato de sódio.

[0076] A Figura 2 mostra o efeito de HA de acordo com a invenção (HAF120) a 100 e 1000 μg/ml e de Ascophyscient® a 10 e 100 μg/ml na proliferação do fibroblasto. *: p < 0,05 e **: p < 0,01. Experimento representativo de três experimentos independentes.

[0077] A Figura 3 mostra o efeito de HA de acordo com a invenção (HAF120) a 100 μg/ml, Ascophyscient® a 10 μg/ml e uma combinação do mesmo na proliferação do fibroblasto. *: p < 0,05. Experimento representativo de três experimentos independentes.

[0078] A Figura 4 mostra o efeito de HA de acordo com a invenção (HAF120) a 1000 μg/ml, Ascophyscient® a 10 μg/ml e uma combinação do mesmo na proliferação do fibroblasto. *: p < 0,05 and **: p < 0,01. Experimento representativo de três experimentos independentes.

EXEMPLOS AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA da combinação de um fragmento de hialuronato de sódio tendo um peso molecular médio ponderai entre 60 e 120 kDa (HAF120) e de um fucano sulfatado tendo um baixo peso molecular (5 a 25 kDa) na proliferação do fibroblasto PROTOCOLO:

[0079] A técnica usada é aquela de incorporação de um nucleotí- deo, 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), um análogo de timidina, no DNA de células de fase S, a 37°C. Essa técnica torna possível quantificar as células das quais o avanço no ciclo de célula é característica de uma célula de proliferação (fase S ou fase de síntese de DNA).

[0080] Os fibroblastos humanos normais (NHF), isolados de pele residual cirúrgica, são usualmente cultivados em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FCS). Nessas condições experimentais, as diluições dos produtos a serem testados são preparadas em DMEM com 3% de FCS.

[0081] As células são, primeiro, privadas de FCS por 24 horas pa ra interromper a multiplicação da célula antes de incubá-las na presença das moléculas a serem avaliadas por 44 horas a 37°C, em uma atmosfera de CO2 a 5%.

[0082] A incorporação de BrdU, proporcional à taxa de proliferação de célula, é avaliada por um sistema de anticorpo anti-BrdU (Roche Applied Science). A absorvência correspondente (OD) é medida a 450 nm. Esse dado é assim proporcional à taxa de proliferação da célula.

[0083] Os agentes ativos avaliados são da seguinte maneira: - Controle positivo: fator de crescimento epidérmico (EGF) a 10 ng/ml - Produto comercial proprietário Ascophyscient® (Algues et Mer): 10 e 100 μg/ml (correspondendo a 0,001% e 0,01%, respectivamente) - 60 a120 kDa de hialuronato de sódio de acordo com o Exemplo 1: 100 e 1000 μg/ml (correspondendo a 0,01 e 0,1%, respectivamente) - Combinação compreendendo Ascophyscient®respectivamente e 60 a 120 kDa de hialuronato de sódio nas seguintes concentrações respectivas: - 10 μg/ml + 100 μg/ml, - 10 μg/ml + 1000 μg/ml. ANÁLISE DOS RESULTADOS: - expresso como OD (proporcional à incorporação de BrdU e assim à taxa de proliferação da célula) - expresso como estimulação de porcentagem:

- expresso como erro padrão do meio: SEM = desvio padrão (SD)/^n

ANÁLISES ESTATÍSTICAS:

[0084] As análises estatísticas usando teste T de Student bilateral não pareado foram realizadas nos valores brutos de OD.

[0085] Esse teste então dá valores p que caracterizam a signifi- cância dos resultados obtidos para as várias condições. O grau de significância é estabelecido da seguinte maneira: significativo para p < 0,05 (*) muito significativo para p < 0,01 (**) altamente significativo para p < 0,001 (***) não significativo para p > 0,05

RESULTADOS:

[0086] Nessas condições experimentais, - Ascophyscient® induziu proliferação de fibroblasto em uma maneira muito reproduzível e estatisticamente significativa, especial- mente a 100 μg/ml (Figura 2). - Hialuronato de sódio sozinho tem um efeito moderado na proliferação do fibroblasto (Figura 2). - A combinação desses dois compostos induziu a proliferação do fibroblasto em uma maneira sinérgica (Figuras 3 e 4).

CONCLUSÕES:

[0087] Nessas condições experimentais, Ascophyscient® induziu a proliferação do fibroblasto em uma maneira muito reproduzível e estatis-ticamente significativa. A combinação de Ascophyscient® com HAF120 induziu a proliferação de fibroblasto em uma maneira sinérgica.

[0088] Ao induzir a proliferação de fibroblasto, Ascophyscient® e a combinação do mesmo com o fragmento de hialuronato de sódio de 60 a 120 kDa restaura o metabolismo celular e participa no reparo dérmi- co e no combate ao envelhecimento. COMPOSIÇÕES EXEMPLARES Exemplo 1:

Exemplo 2:

Claims

1. Combinação, caracterizada pelo fato de que comprende um ácido hialurônico ou um sal do mesmo apresentando um peso molecular de 60 a 120 kDa e um polissacarídeo sulfatado apresentando um peso molecular de 5 a 25 kDa selecionado de fucanos sulfatados.

2. Combinação, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo fato de que a razão em massa de ácido hialurônico para po- lissacarídeo está entre 0,1 e 10.

3. Combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que é para uso tópico destinado a promover proliferação de fibroblasto.

4. Combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que é para uso tópico destinado a tratar lesões da pele.

5. Combinação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que é para uso tópico destinado a melhorar a cicatrização e reparo da pele.

6. Uso de uma combinação, como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medi-camento para promover proliferação de fibroblasto ou tratar lesões da pele ou melhorar a cicatrização e reparo da pele, em particular, através da administração tópica.

7. Uso cosmético não-terapêutico tópico de uma combinação, como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para combater os sinais de envelhecimento da pele.

8. Composição dermatológica ou cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende como ingrediente ativo uma combinação, como definida na reivindicação 1 ou 2, com pelo menos um excipiente dermatologicamente ou cosmeticamente aceitável.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda outro ingrediente ativo.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o outro ingrediente ativo é selecionado dentre os agentes antienvelhecimento, agentes de cicatrização, agentes calmantes, agentes antiprurítico, agentes antirradicais, agentes anti-UV, agentes que estimulam a síntese de macromoléculas dérmicas ou metabolismo de energia, agentes hidratantes, agentes de despigmentação, anti- bacterianos, anti-inflamatórios, anestésicos e misturas respectivas.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o outro ingrediente ativo é retinaldeído.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o outro ingrediente ativo é delta-tocoferil- glucopiranosídeo.

13. Uso cosmético da composição cosmética, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que é para combater os sinais de envelhecimento da pele.

14. Composição dermatológica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de cortes, suturas, abrasões, riscos, arranhões, cicatrizes após cirurgia ou após um procedimento dermatológico estético, queimaduras superficiais, queimadura de sol.

15. Uso de uma composição dermatológica, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar cortes, suturas, abrasões, riscos, arranhões, cicatrizes após cirurgia ou após um procedimento dermatológico estético, queimaduras superficiais, queimadura de sol.