BR112014029188B1

BR112014029188B1 - Veículo sensível ao ph e método de preparação do mesmo, e droga sensível ao ph e composição medicamentosa sensível ao ph contendo o veículo, e método de cultura usando o mesmo

Info

Publication number: BR112014029188B1
Application number: BR112014029188-8A
Authority: BR
Inventors: Naoki Sakaguchi
Original assignee: Terumo Kabushiki Kaisha
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2020-02-11
Also published as: JP6243331B2; AU2013268379A1; EP2857043A1; WO2013180253A1; US20130323320A1; IN2014DN09739A; US9248192B2; JPWO2013180253A1; US10765751B2; US20180104343A1; BR112014029188A2; RU2014152695A; CN104334194B; AU2017216525A1; RU2682249C2; CN104334194A; EP2857043B1; AU2013268379B2; CA2875208A1; EP2857043A4

Abstract

resumo patente de invenção: veículo sensível ao ph e método de preparação do mesmo, e droga sensível ao ph e composição medicamentosa sensível ao ph contendo o veículo, e método de cultura usando o mesmo. um veículo sensível ao ph podendo servir como um veículo para uma substância fisiologicamente ativa e é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas em resposta a um ambiente fracamente ácido e seu método de preparação, e também uma droga sensível ao ph e uma composição medicamentosa sensível ao ph, cada uma delas contendo o veículo, e um método de cultura usando a mesma. um veículo sensível ao ph incluindo pelo menos um composto sensível ao ph selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar c27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo consistindo-se em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e ??tocoferol, e que é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VEÍCULO SENSÍVEL AO PH E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO MESMO, E DROGA SENSÍVEL AO PH E COMPOSIÇÃO MEDICAMENTOSA SENSÍVEL AO PH CONTENDO O VEÍCULO, E MÉTODO DE CULTURA USANDO O MESMO.

Campo Técnico [001] Esta invenção refere-se a um veículo sensível ao pH e a um método de preparação do mesmo, e também a uma droga sensível ao pH e uma composição medicamentosa sensível ao pH cada uma delas contendo o veículo, e a um método de cultura usando o mesmo. Mais particularmente, a invenção refere-se a um veículo sensível ao pH que é útil para DDS (Sistema de Distribuição de Drogas (Drug Delivery System) e é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas em resposta a um ambiente fracamente ácido, e um método de preparação do mesmo, e também a uma droga sensível ao pH e uma composição medicamentosa sensível ao pH cada uma delas contendo o veículo, e a um método de cultura usando o mesmo. Antecedentes da Invenção [002] Nos últimos anos, extensos estudos foram feitos sobre veículos para DDS (veículos) para distribuir uma substância fisiologicamente ativa para um sítio desejado em uma quantidade requerida. Agora vem sendo dada atenção a um veículo responsivo a estímulos do ponto de vista de um aperfeiçoamento no acúmulo e na seleção do sítio de distribuição, e muitos pareceres foram dados sobre estudos referentes à estimulação externa com calor, um campo magnético e similares, e estimulação in vivo tal como de reconhecimento molecular, alteração do pH, reação enzimática, e similares. Entre eles, um veículo que é sensível em um pH fracamente ácido fora investido por muito tempo.

[003] Por exemplo, como um veículo sensível ao pH responsivo a

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2/86 um ambiente fracamente ácido, são conhecidos lipossomas sensíveis ao pH onde vários tipos de elementos sensíveis ao pH tais como PHC (Palmitoil Homocisteína), ácido oleico, CHEMS (Colesteril Hemissuccinato) e similares são acrescentados aos lipossomas contendo PE (Fosfatidiletanolamina) (S. Simoes et al., Adv. Drug Deli. Rev. 2004 56 947-965 e similares). Recentemente, surgiram alguns estudos, com a finalidade de melhorar uma função, sobre novos materiais sintéticos tais como PEAA (Ácido Poli(2-etilacrílico)), SucPG (Poli(glicidol) Succinilado) e similares, peptídios sintéticos tais como GALA, pHLIP (Peptídio de Inserção de Baixo pH) e similares, materiais biodegradáveis tais como PLGA (Ácido Poli(Láctico-co-glicólico)) e similares, e VLP (Partícula Semelhante a Vírus) e virossoma usando um componente viral sensível ao pH.

[004] Espera-se que veículo sensível ao pH distribua eficientemente uma substância fisiologicamente ativa para um sítio tal como de um tumor ou inflamação onde o pH baixa em um corpo vivo (Reshetnyak et al., PNAC 2007 vol. 104, 19, 7893-7898) ou que seja distribuído para o citosol utilizando a acidificação de vesículas de ser absorvido pelas células.

[005] Quanto à distribuição para o citosol usando a acidificação de vesículas, foi constatado que a migração de uma droga para o citosol é facilitada promovendo fusão de membrana de um veículo mediante a distribuição para endossomas, e um veículo para DDS de um derivado peptítico tendo sítio sensível ao pH cuja estrutura é alterada em resposta ao pH, um sítio de fusão de membrana e um sítio transmembrana já fora apresentado (Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública N° 2006-34211).

[006] Tal distribuição de uma substância fisiologicamente ativa para o citosol é utilizável em vários campos e é por conseguinte uma técnica que muito demanda aperfeiçoamentos. Por exemplo, a

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3/86 distribuição de RNA ou DNA para o citosol torna possível a terapia genética, e esperava-se que ela induzisse CTL (linfócitos T citotóxicos) pela distribuição de um antígeno para o citosol. Foi reportado que a distribuição citosólica de um agente anticâncer de baixo peso molecular tem um efeito melhorado sobre a atividade, e sua aplicação a um novo tipo de droga para uso como uma droga vetorizada intracelularmente foi considerado. A distribuição citosólica de uma substância fisiologicamente ativa é um grande problema a ser resolvido nesses campos e é, portanto, uma técnica essencial para o sucesso da mesma. [007] Tendo em vista o fato de que há um caso de sucesso de distribuição de pHLIP tendo sensibilidade em um pH de no máximo 6 para um sítio com acidose descrito por Reshetnyak et al., PNAC 2007 vol. 104, 19, 7893-7898 ou um pH chegando nos endossomas perto de 4 segundo descrito por S. Simoes et al., Adv. Drug Deli. Rev. 2004 56 947-965, é necessário que um veículo sensível ao pH tenha alta sensibilidade entre o pH neutro e um pH de 4. Isto já foi ressaltado em muitos documentos. É importante do ponto de vista de uso prático que o veículo seja feito de um material seguro.

Sumário da Invenção [008] M uitos dos lipossomas sensíveis ao pH e parte dos materiais biodegradáveis apresentam o problema de que eles exibem sensibilidade em um pH baixo demais ou têm apenas uma função inadequada. Além disso, em relação a um método para modificar diretamente um material sensível ao pH, há a preocupação de que a atividade de uma substância fisiologicamente ativa pode diminuir. Um novo tipo de material sintético ou um componente viral traria preocupações do ponto de vista da segurança.

[009] Assim sendo, a invenção foi criada com base nas circunstâncias mencionadas acima, e constitui um objetivo da invenção oferecer um veículo sensível ao pH que pode servir como um veículo

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4/86 para uma substância fisiologicamente ativa seja capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas em resposta a um ambiente fracamente ácido e seu método de preparação do mesmo, e também oferecer uma droga sensível ao pH e uma composição medicamentosa sensível ao pH cada uma delas contendo o veículo, e um método de cultura usando o mesmo.

[0010] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (1) um veículo sensível ao pH que inclui pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e α-tocoferol e que é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas.

[0011] Para atingir o objetivo acima, a invenção também oferece (2) o veículo sensível ao pH apresentado no item (1) acima, onde o composto sensível ao pH e a substância anfipática formam partículas micelares.

[0012] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (3) o veículo sensível ao pH apresentado no item (2) acima, onde o tamanho de partícula varia de 10 a 200 nm.

[0013] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (4) o veículo sensível ao pH apresentado em qualquer um dos itens (1) a (3) acima, onde o composto sensível ao pH está presente em uma quantidade de

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5/86 no mínimo 10 moles por 100 moles da substância anfipática.

[0014] Além disso, para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (5) o veículo sensível ao pH apresentado em qualquer um dos itens (1) a (4) acima, onde quando um vazamento do composto sensível ao pH isoladamente em um teste de vazamento é representado por La, um vazamento da substância anfipática isoladamente é representado por Lb, um vazamento do veículo sensível ao pH é representado por Lc, vazamentos em um pH de 7,4, respectivamente, são representados por Lc?,4, La?,4 e Lb?,4, e vazamentos em um pH de 5,0 or 4,5, respectivamente, são representados por Lcx, Lax e Lbx, Δ representado pela equação (1) a seguir não é menor que 5 e Δ' representado pela equação (2) a seguir não é menor que 5.

Fórmula Matemática 1

Equação (1) Δ = (Lcx - Lc?,4) - (Lax - La?,4)

Equação (2) Δ' = Lcx - (Lax + Lbx) [0015] Para atingir o objetivo acima, a invenção também oferece (6) uma droga sensível ao pH, onde o veículo sensível ao pH definido em qualquer um dos itens (1) a (5) acima supports uma substância fisiologicamente ativa.

[0016] Além disso, para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (7) a droga sensível ao pH mencionada no item (6) acima, onde a substância fisiologicamente ativa é feita de uma proteína ou de um peptídio.

[0017] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (8) uma composição medicamentosa sensível ao pH incluindo o veículo sensível ao pH e a substância fisiologicamente ativa, definida em qualquer um dos itens (1) a (5) acima.

[0018] Além disso, para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (9) a composição medicamentosa sensível ao pH mencionada no item (8) acima, onde a substância fisiologicamente ativa é uma proteína ou

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6/86 um peptídio.

[0019] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (10) um método para preparar um veículo sensível ao pH que é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas, o método incluindo uma etapa de associar pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e a-tocoferol.

[0020] Para atingir o objetivo acima, a invenção oferece (11) um método de cultura incluindo uma etapa de cultivar células em um meio contendo a droga sensível ao pH mencionada no item (6) ou (7) acima e/ou a composição medicamentosa sensível ao pH mencionada no item (8) ou (9) acima.

Breve Descrição dos Desenhos [0021] A FIG. 1A é uma vista esquemática de uma droga incluindo um veículo sensível ao pH da invenção e uma substância fisiologicamente ativa suportada pelo carrreador.

[0022] A FIG. 1B é uma vista esquemática mostrando a distribuição de uma substância fisiologicamente ativa suportada por um veículo sensível ao pH para o citosol como um resultado do desenvolvimento de um efeito promotor da função disruptiva de membranas do veículo sensível ao pH no caso em que uma droga sensível ao pH é usada.

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7/86 [0023] A FIG. 1C é uma vista esquemática mostrando a distribuição de uma substância fisiologicamente ativa misturada com um veículo sensível ao pH para o citosol como um resultado do desenvolvimento de um efeito promotor da função disruptiva de membranas do veículo sensível ao pH no caso em que uma composição medicamentosa sensível ao pH é usada.

[0024] A FIG. 2A é uma fotografia de dispersões de ácido desoxicólico e EYPC (fosfatidilcolina de gema de ovo) onde o ácido desoxicólico está contido em concentrações diferentes.

[0025] A FIG. 2B é uma fotografia de dispersões de ácido desoxicólico e DLPC (Dilauroil Fosfatidilcolina) onde o ácido desoxicólico está contido em concentrações diferentes.

[0026] A FIG. 2C é um gráfico mostrando uma transmitância de dispersões contendo EYPC e ácido desoxicólico.

[0027] A FIG. 2D é um gráfico mostrando uma transmitância de dispersões contendo DLPC e ácido desoxicólico.

[0028] A FIG. 3 é um gráfico mostrando um potencial zeta de uma dispersão contendo EYPC e ácido desoxicólico em relação à quantidade de ácido desoxicólico.

[0029] A FIG. 4 é um gráfico mostrando vazamentos de EYPC isoladamente, DLPC isoladamente, ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato a diferentes pHs.

[0030] (A) da FIG. 5 é um gráfico mostrando mostrando relação da intensidade fluorescente de EYPC isoladamente, DLPC isoladamente, ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato a diferentes pHs no caso de incubação de um lipossoma marcado com fluorescência dupla; e (B) da FIG. 5 é um gráfico mostrando taxas de fusão de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPCPetição 870190085949, de 02/09/2019, pág. 14/98

8/86 desoxicolato.

[0031] A FIG. 6 é um gráfico mostrando vazamentos de lipossoma de DOPE (Dioleoil Fosfatidiletanolamina)-Chems, lipossoma de DOPEácido oleico e complexo de DLPC-desoxicolato em relação ao pH.

[0032] (A) e (B) da FIG. 7 são, respectivamente, um gráfico mostrando taxas de fusão de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato em relação à quantidade de ácido desoxicólico.

[0033] (A) da FIG. 8 é um gráfico mostrando taxas de fusão de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de DSPC (Diestearoil Fosfatidilcolina)-desoxicolato, complexo de DPPC (Dipalmitoil

Fosfatidilcolina)-desoxicolato, complexo de DMPC (Dimiristoil

Fosfatidilcolina)-ácido desoxicólico, complexo de DLPC-desoxicolato e complexo de DDPC (Didecanoil Fosfatidilcolina)-desoxicolato; e (B) da FIG. 8 é um gráfico mostrando taxas de fusão de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de HSPC (Fosfatidilcolina de soja hidrogenada)-desoxicolato, complexo de DOPC (Dioleoil Fosfatidilcolina)-desoxicolato e complexo de POPC (1-Palmitoil 2-Oleoil Fosfatidilcolina)-desoxicolato.

[0034] (A) da FIG. 9 é um gráfico mostrando vazamentos de ácido desoxicólico isoladamente, DLPE (Dilauroil Fosfatidiletanolamina) isoladamente, DMPE (Dimiristoil Fosfatidiletanolamina) isoladamente, DSPE (Diestearoil Fosfatidiletanolamina) isoladamente e DOPE isoladamente; e (B) da FIG. 9 é um gráfico mostrando vazamentos de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de DLPE-desoxicolato, complexo de DMPE-desoxicolato, complexo de DSPE-desoxicolato e complexo de DOPE-desoxicolato.

[0035] A FIG. 10 é um gráfico mostrando vazamentos de complexos de ácido desoxicólico com materiais macromoleculares em um pH de 5,0.

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9/86 [0036] A FIG. 11 é um conjunto de gráficos mostrando vazamentos de complexos de EYPC, ácido desoxicólico e DLPC ou SPAN 85 em um pH de 7,4 em (A) e um pH de 5,0 em (B).

[0037] A FIG. 12 é um conjunto de gráficos mostrando vazamentos de complexos de DLPC e vários tipos de compostos candidatos em um pH de 7,4 em (A) e um pH de 5,0 em (B).

[0038] A FIG. 13 é um gráfico mostrando vazamentos de complexos de DLPC e vários tipos de compostos candidatos em relação ao pH.

[0039] A FIG. 14 é um conjunto de gráficos mostrando taxas de fusão de vários tipos de compostos sensíveis ao pH quando usados isoladamente em (A) e complexos de DLPC e vários tipos de compostos sensíveis ao pH em (B).

[0040] A FIG. 15 mostra microfotografias obtidas no caso em que um complexo de DLPC-desoxicolato marcado com fluorescência e células HeLa são incubados em um meio de um pH de 7,4 em (A) e um pH de 5,3 em (B), e mostra também a intensidade de fluorescência das células avaliada pelo uso de um medidor de sítio de fluxo em (C).

[0041] A FIG. 16 é um conjunto de gráficos mostrando vazamentos de veículos incorporando um peptídio em (A) e uma proteína em (B) em pHs de 7,4 e 5,0, respectivamente.

[0042] A FIG. 17 é um conjunto de gráficos mostrando taxas de fusão de complexos de DLPC-desoxicolato em (A) e complexos de DLPC-ursodesoxicolato em (B), ambos incorporados com um peptídio e uma proteína, respectivamente, em pHs de 7,4 e 5,0.

[0043] A FIG. 18 é uma fotografia de (A) uma solução de um peptídio marcado com fluorescência isoladamente, (B) uma solução de DLPC contendo um peptídio marcado com fluorescência isoladamente, (C) uma solução de um complexo de DLPC-desoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, e (D) uma solução de um complexo de DLPC-ursodesoxicolato contendo um peptídio marcado

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10/86 com fluorescência.

[0044] A FIG. 19 é um conjunto de microfotografias da fluorescência de células tratadas com um peptídio marcado com fluorescência isoladamente em (A), um DLPC contendo um peptídio marcado com fluorescência isoladamente em (B) e um complexo de DLPCdesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência em (C). [0045] A FIG. 20 mostra uma microfotografia em (A) e uma microfotografia da fluorescência em (B) de células tratadas com complexo de DLPC-desoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, e uma microfotografia em (C) e uma microfotografia da fluorescência em (D) de células tratadas com um complexto de DLPCursodesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, respectivamente.

[0046] A FIG. 21 mostra os resultados da avaliação da distribuição de β-gal para o citosol e particularmente, os resultados da avaliação em β-gal isoladamente em (A), complexo de DLPC-desoxicolato contendo β-gal em (B) e complexo de DLPC-ursodesoxicolato contendo β-gal em (C).

[0047] A FIG. 22A mostra os resultados de um teste de verificação da distribuição para o citosol quando os respectivos veículos sensíveis ao pH e as substâncias fisiologicamente ativas são usadas independentemente e são, respectivamente, imagens superpostos de microfotografias e microfotografias da fluorescência obtidas pelo uso, em um ambiente de cultura de células, de (A) peptídio-FITC marcado com fluorescência isoladamente, (B) OVA-FITC marcado com fluorescência isoladamente, (C) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de EYPC-desoxicolato, (D) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de EYPC-desoxicolato, (E) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-desoxicolato, (F) uma

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11/86 combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-desoxicolato, (G) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de SPAN 80-desoxicolato, (H) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de SPAN 80-desoxicolato, (I) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DDPC-desoxicolato, e (J) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DDPC-desoxicolato.

[0048] A FIG. 22B mostra os resultados de um teste de verificação da distribuição para o citosol quando os respectivos veículos sensíveis ao pH e as substâncias fisiologicamente ativas são usadas independentemente e são, respectivamente, imagens superpostos de microfotografias e microfotografias da fluorescência obtidas pelo uso, em um ambiente de cultura de células, de, (K) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de PEG-10 óleo de rícino-desoxicolato, (L) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de PEG-10 óleo de rícino-desoxicolato, (M) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de Tween 20-desoxicolato, (N) uma combinação de OVAFITC marcado com fluorescência e complexo de Tween 20desoxicolato, (O) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de Tween 80-desoxicolato, (P) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de Tween 80-desoxicolato, (Q) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de a-tocoferol-desoxicolato, (R) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de α-tocoferol- desoxicolato, (S) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPCursodesoxicolato, e (T) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-ursodesoxicolato.

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12/86 [0049] A FIG. 22C mostra os resultados de um teste de verificação da distribuição para o citosol quando os respectivos veículos sensíveis ao pH e as substâncias fisiologicamente ativas são usadas independentemente e são, respectivamente, imagens superpostos de microfotografias e microfotografias da fluorescência obtidas pelo uso, em um ambiente de cultura de células, de, (U) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-ácido glicirrízico, (V) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-ácido glicirrízico, (W) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-chenodesoxicolato, (X) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-chenodesoxicolato, (Y) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-hiodesoxicolato, (Z) uma combinação de OVA-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-hiodesoxicolato, (AA) uma combinação de peptídio-FITC marcado com fluorescência e complexo de DLPC-glicodesoxicolato, e (AB) uma combinação de OVAFITC marcado com fluorescência e complexo de DLPCglicodesoxicolato.

Modos de Realização da Invenção [0050] A invenção refere-se a um veículo sensível ao pH que inclui pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 to 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol

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13/86 diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e α-tocoferol e é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas. O veículo sensível ao pH pode às vezes ser simplesmente chamado, neste relatório, de veículo, produto associado ou complexo. Será observado que o número de átomos de carbono da substância anfipática do presente relatório significa o número de átomos de carbono de uma porção ácido graxo (grupo acila) que funciona como o sítio hidrofóbico da substância anfipática.

[0051] De acordo com a invenção, ofereceu-se um veículo sensível ao pH que é superior em termos de segurança e superior em termos de sensibilidade ao pH.

[0052] Conforme usado na prática da invenção, o termo função disruptiva de membranas significa um função que causa vazamento em um teste de lixiviação. O teste de lixiviação usado neste relatório é um teste onde lipossomas (dispersão) incluindo uma solução aquosa contendo uma substância de resfriamento brusco e uma substância fluorescente, e um veículo sensível ao pH ou uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um composto sensível ao pH isoladamente ou um composto anfipático isoladamente são adicionados a uma solução aquosa cujo pH é ajustado em um dado nível, seguido por incubação da solução aquosa a 37^OC por 90 minutos ou 30 minutos e medição da fluorescência da solução aquosa. De acordo com este método, uma substância fluorescente dissolvida ou lixiviada dos lipossomas pode ser medida, e a partir daí a função disruptiva da membrana de lipossomas do veículo sensível ao pH pode ser confirmada. Será observado que o teste de lixiviação será descrito mais detalhadamente nos exemplos que aparecem mais adiante.

[0053] O termo desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas significa satisfazer ambas as exigências (1) e (2): (1) no teste de lixiviação, um vazamento em um pH dado que é

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14/86 menor que o pH fisiológico aumenta em comparação com um vazamento no pH fisiológico e o aumento é maior que um aumento quando o composto sensível ao pH isoladamente é submetido ao teste; e (2) no teste de lixiviação em um pH dado menor que o pH fisiológico, um vazamento no momento em que um composto sensível ao pH e uma substância anfipática formam um complexo (veículo sensível ao pH) é maior que a soma de um vazamento do composto sensível ao pH isoladamente e um vazamento da substância anfipática isoladamente. Mais particularmente, desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas significa que em testes de lixiviação em um pH de 7,4 e em um pH de 5,0 ou 4,5, um vazamento Lc de um veículo sensível ao pH (a complexo de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática) satisfaz ambas as relações que se seguem com um vazamento La do composto sensível ao pH isoladamente e um vazamento Lb da substância anfipática isoladamente. Mais particularmente, o item (1) acima é representado pela fórmula (1) a seguir e o item (2) acima é representado pela fórmula (2) seguir. Devese observar nas fórmulas a seguir, os vazamentos em um pH de 7,4 são, respectivamente, denotados por Lc?,4, La?,4 e Lb?,4, e os vazamentos em um pH de 5,0 ou 4,5 são, respectivamente, denotados por Lcx, Lax e Lbx.

Fórmula Matemática 2

Fórmula (1) Δ = (Lcx - Lc?,4) - (Lax - La?,4) > 0

Fórmula (2) Δ = Lcx - (Lax + Lbx) > 0 [0054] Na fórmula (1) acima, Δ deve ser maior que 0 e de preferência não é menor que 5, mais preferivelmente não é menor que 10 e muito mais preferivelmente não é menor que 30. Na fórmula (2) acima, Δ' deve ser maior que 0 e de preferência não é menor que 5, mais preferivelmente não é menor que 10 e muito mais preferivelmente não é menor que 15.

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15/86 [0055] Um veículo sensível ao pH preferido é aquele cujos Δ e Δ’ são, respectivamente, no mínimo 5 nas fórmulas (1) e (2) acima e que contém um ácido biliar e um lipídio. Um outro veículo sensível ao pH preferido é aquele cujos Δ e Δ’ nas fórmulas (1) e (2) são, respectivamente, no mínimo 5 e que contém ácido glicirrízico ou ácido glicirretínico e um lipídio.

[0056] No presente relatório, o termo pH fisiológico significa um pH em um tecido normal ou um fluido corporal normal. O pH fisiológico geralmente é igual a 7,4 e pode diferir, mais ou menos (±0,10), dependendo do tecido normal ou do fluido corporal normal. O termo um dado pH menor que o pH fisiológico significa um pH menor que 7,4, preferivelmente um pH de no mínimo 3,0 a no máximo 7,4, mais preferivelmente um pH de no mínimo 4,0 a no máximo 7,3 e muito mais preferivelmente um pH de no mínimo 4,5 a no máximo 7,0.

[0057] Embora não esteja claro como o veículo sensível ao pH da invenção desenvolve um efeito promotor da função disruptiva de membranas, presumiu-se que isto ocorre da seguinte maneira. Deve ser observado que invenção não deve ser interpretada como limitada à seguinte hipótese.

[0058] Considerou-se que o veículo sensível ao pH da invenção é formado pela associação de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática em uma solução aquosa em um nível de pH de no mínimo igual ao pH fisiológico.

[0059] Na FIG. 1A, um veículo sensível ao pH e uma droga sensível ao pH da invenção onde o veículo sensível ao pH supports uma substância fisiologicamente ativa com o mesmo estão mostrados esquematicamente. Como mostrado na FIG. 1A, considera-se que o veículo sensível ao pH é formado pela associação de um composto sensível ao pH com uma substância anfipática em um sítio hidrofóbico da mesma. O veículo sensível ao pH da invenção pode incluir uma

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16/86 substância fisiologicamente ativa no mesmo. Será observado que a forma da associação do veículo sensível ao pH baseia-se em uma hipótese e, portanto, o veículo sensível ao pH da invenção não se limita a esta forma de associação. A forma de suporte do veículo sensível ao pH baseia-se em uma hipótese e, portanto, o veículo sensível ao pH da invenção não deve ser interpretado como limitado a esta forma de suporte.

[0060] Considerou-se que o veículo sensível ao pH tem um efeito promotor da função disruptiva de membranas como um resultado de que, se um ambiente atingir um pH menor que o pH fisiológico, o veículo sensível ao pH altera a forma de associação entre o composto sensível ao pH e a substância anfipática. Por exemplo, presuminos que se um pH atinge um valor menor que o pH fisiológico em um sistema no qual existem um veículo sensível ao pH e uma membrana biológica (por exemplo, uma membrana celular, uma membrana vesicular entre outras), a forma de associação do veículo sensível ao pH se altera. Depois do contato com a membrana biológica, a alteração estrutural da membrana biológica é causada pela alteração da forma de associação. Mais particularmente, o veículo sensível ao pH provoca a alteração estrutural da membrana biológica. Isto é visto da seguinte maneira: quando o pH se altera para acidez fraca, o composto sensível ao pH no veículo sensível ao pH fica instabilizado na estrutura do veículo, com o resultado de que o veículo sensível ao pH é rearranjado com a membrana biológica existente no sistema, dessa forma desenvolvendo o efeito promotor da função disruptiva de membranas. Em outras palavras, considerou-se que o composto sensível ao pH é uma molécula que age para alterar a solubilidade para a associação hidrofóbica através de protonação quando o pH fica fracamente ácido. Mais particularmente, a associação hidrofóbica envolvendo o composto sensível ao pH ocorre em resposta a um ambiente fracamente ácido e

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17/86 é capaz de desenvolver a função. Conforme usado neste relatório, o termo rompimento de membrana refere-se a uma alteração em tal estrutura membranosa e nem sempre envolve a separação ou decomposição de todos os componentes constituentes da membrana. Devido à ocorrência de tal rompimento de membrana, os componentes contidos dentro da membrana biológica (por exemplo, citosol) lixiviam para fora da membrana biológica.

[0061] O veículo sensível ao pH da invenção é preferivelmente um veículo cujo vazamento, determinado pelo teste de lixiviação, é menor que 20% em um pH de 7,4 e é maior que 20% em um pH de 4,0. Mais preferivelmente, o vazamento no teste de lixiviação é menor que 20% em um pH de 6,5 e maior que 20% em um pH de 4,0. Além disso, o vazamento em um pH de 7,4 ou 6,5 mais preferivelmente não é maior que 15% e muito mais preferivelmente não é maior que 10%. O vazamento em um pH de 4,0 mais preferivelmente não é menor que 40% e muito mais preferivelmente não é menor que 50%. Quando o vazamento do veículo sensível ao pH é estabelecido da maneira definida acima, o desenvolvimento do efeito promotor da função disruptiva de membranas em um pH fracamente ácido pode ser mostrado melhor.

[0062] O veículo sensível ao pH da invenção também é capaz de desenvolver um efeito promotor da função de fusão de membranas junto com o efeito promotor da função disruptiva de membranas.

[0063] Na prática da invenção, o termo função de fusão de membranas significa uma função que causa a fusão de membranas em um teste de fusão de membranas. O teste de fusão de membranas usado neste relatório é um teste no qual um lipossoma (dispersão) incorporando dois tipos de substâncias fluorescentes em uma membrana bimolecular, e um veículo sensível ao pH ou uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um composto sensível ao pH

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18/86 isoladamente, uma substância anfipática isoladamente são adicionados a uma solução aquosa ajustada em um dado pH, e a solução aquosa resultante é incubada a 37°C por 60 minutos, seguido pela medição da fluorescência da solução aquosa. De acordo com este método, variações na transferência de energia por ressonância dos dois tipos de substâncias fluorescentes incorporadas no lipossoma pode ser medida, confirmando assim a função de fusão de membranas do veículo sensível ao pH. Deve ser observado que o teste de fusão de membranas está descrito em detalhes nos exemplos dados mais adiante.

[0064] Conforme usado neste relatório, o termo desenvolver um efeito promotor da função de fusão de membranas significa satisfazer, no teste de fusão de membranas, uma taxa de fusão em um pH dado menor que um aumento no pH fisiológico em comparação com uma taxa de fusão no pH fisiológico e o aumento é maior que aquele comparado com quando um composto sensível ao pH isoladamente é usado para o teste. Mais particularmente, desenvolver o efeito promotor da função de fusão de membranas significa que nos testes de fusão de membranas em pHs de 7,4 e 5,0, uma taxa de fusão Rc (%) de um veículo sensível ao pH (a complexo de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática) e uma taxa de fusão Ra (%) do composto sensível ao pH isoladamente satisfazem a relação da fórmula (3) a seguir. Será observado que as taxas de fusão em um pH de 7,4 são, respectivamente, representadas por Rc?,4 e Ra?,4 e as taxas de fusão em um pH de 5,0 são, respectivamente, representadas por Rcx e Rax. Fórmula Matemática 3

Fórmula (3) AR = (Rcx - Rc?,4) - (Rax - Ra?,4) > 0 [0065] Na fórmula (3), AR deve ser maior que 0 e preferivelmente não é menor que 2, mais preferivelmente não é menor que 5 e muito mais preferivelmente não é menor que 10.

[0066] Um veículo sensível ao pH preferido é um veículo cujo AR na

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19/86 fórmula (3) acima não é menor que 2 e que contém um ácido biliar e um lipídio.

[0067] O veículo sensível ao pH da invenção desenvolve o efeito promotor da função de fusão de membranas em um pH fracamente ácido (a um pH dado menor que o pH fisiológico). Embora este mecanismo não seja totalmente compreendido, presumiu-se que o mecanismo estabelecido em relação ao efeito promotor da função disruptiva de membranas se aplica. Deve ser observado que a invenção não deve ser interpretada como limitada a esta hipótese.

[0068] Em particular, presumiu-se que o veículo sensível ao pH da invenção altera a forma de associação entre o composto sensível ao pH e a substância anfipática se o ambiente ficar com um pH menor que o pH fisiológico, de modo que a fusão de membranas ocorre devido ao rearranjo com uma membrana biológica existente no sistema. Nesta oportunidade, o rearranjo atribuído à fusão ocorre entre os próprios componentes de afinidade sem afinidade para a membrana biológica, ou componentes de baixa afinidade (por exemplo, uma substância fisiologicamente ativa) são excluídos ou liberados da membrana rearranjada.

[0069] Geralmente, uma molécula extracelular é envolvida por um endossoma que é um tipo de membrana biológica e fixada em uma célula. Em seguida, o pH no endossoma é diminuído pela ação de uma bomba de próton. Além disso, o endossoma funde-se com um lisossoma contendo uma hidrolase, de modo que a molécula extracelular é decomposta. Por isso, a maior das moléculas extracelulares não é distribuída para o citosol.

[0070] Em contraste, de acordo com a invenção, o veículo sensível ao pH (droga sensível ao pH ou composição medicamentosa sensível ao pH) é envolvido por um endossoma e fixado em uma célula como mostrado nas figuras 1B e 1C, dessa forma levando igualmente a um

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20/86 ambiente no qual o pH é mais baixo. Associado à diminuição (acidificação) do pH, o composto sensível ao pH faz com que o veículo sensível ao pH fique instável, de modo que ocorre um rearranjo de membranas entre o endossoma e o veículo sensível ao pH causando assim a função disruptiva de membranas (às vezes, a função disruptiva de membranas ocorre junto com a função de fusão de membranas em alguns casos) causada pelo veículo sensível ao pH.

[0071] Como exemplificado nas figuras 1B e 1C, o uso do veículo sensível ao pH da invenção permite que uma substância fisiologicamente ativa e similares seja distribuída para o citosol. Mais particularmente, quando uma droga sensível ao pH é usada, uma substância fisiologicamente ativa (FIG. 1B) incluída no veículo sensível ao pH, ou uma substância fisiologicamente ativa (FIG. 1C) usada junto com o veículo sensível ao pH no caso de ser usada uma composição medicamentosa sensível ao pHé envolvida por um endossoma junto o veículo sensível ao pH e fixada no endossoma. Quando o pH no interior do endossoma diminui, o composto sensível ao pH faz com que o veículo sensível ao pH fique instável causando assim o rearranjo das membranas entre o endossoma e o veículo sensível ao pH. Como uma consequência, ocorre o rompimento da membrana do endossoma com o veículo sensível ao pH. Dessa maneira, a substância fisiologicamente ativa é liberada para o citosol. Isto é, a distribuição para o citosol pode ser feita sem envolver a decomposição da substância fisiologicamente ativa.

[0072] O veículo sensível ao pH da invenção preferivelmente forma um complexo contendo um composto sensível ao pH e uma substância anfipática em um meio aquoso. A forma do complexo não é crítica, e o composto sensível ao pH e a substância anfipática podem formar uma membrana ou parte do composto sensível ou todo o composto sensível ao pH pode ser incorporado na estrutura formada da substância

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21/86 anfipática através de associação. No veículo sensível ao pH da invenção, embora seja preferido que o composto sensível ao pH e a substância anfipática formem partículas micelares, um veículo particulado tal como de lipossoma pode ser formado. Onde o efeito EPR (Permeação e Retenção Melhoradas) e a endocitose são levadas em consideração, as partículas micelares de preferência têm um tamanho de 10 a 200 nm. Mais preferivelmente, o tamanho varia de 10 a 100 nm. Será observado que partícula micelar conforme usado neste relatório significa uma partícula como resultado da associação de particulados entre o composto sensível ao pH e a substância anfipática pela interação hidrofóbica. Tipicamente, podem-se mencionar partículas de estrutura membranosa monomolecular, porém não incluindo aquelas que formam uma estrutura membranosa de lipídio bimolecular (por exemplo, lipossoma). O tamanho de partícula do veículo sensível ao pH indicado neste relatório pode ser medido de acordo com um método de espalhamento de luz dinâmico (Nano ZS 90, feito pela MALVERN Instruments Ltd).

[0073] Deve ser observado que na prática da invenção, é suficiente que um veículo sensível ao pH exista em uma solução aquosa contendo o veículo sensível ao pH mesmo que um composto sensível ao pH ou uma substância anfipática exista em estado livre sem formar uma associação.

[0074] Os respectivos componentes do veículo sensível ao pH da invenção serão agora descritos.

<Componentes constituentes do veículo sensível ao pH> (composto sensível ao pH) [0075] Como um composto sensível ao pH usado na invenção, podemos mencionar pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido

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22/86 biliar C27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos. Os sais do composto sensível ao pH não são críticos, e como exemplos podemos mencionar sais de metais alcalinos tais como lítio, sódio, e potássio e similares, sais de metais alcalinoterrosos tais como magnésio, cálcio, e bário e similares, e sais de amônio. Esses compostos sensíveis ao pH podem ser usados isoladamente ou em combinação de dois ou mais.

[0076] Compostos sensíveis ao pH preferidos incluem ácido desoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico ou sais dos mesmos, dos quais ácido desoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido glicirrízico ou sais dos mesmos são mais preferidos.

[0077] Ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27 e ácido glicodesoxicólico, que são convenientemente usados na invenção, são genericamente chamados de ácido biliar. O ácido biliar é conhecido como um derivado esteroide típico desde antes da década de 1920 e é utilizado no campo da bacteriologia. O ácido biliar forma complexos com colesterol, lipídios e vitaminas solúveis em gordura no corpo humano vivo e tem o papel de suplementar a absorção dos mesmos. Além disso, devido à capacidade de formar complexos com lipídios, proteínas e materiais hidrofóbicos tendo em vista as propriedades físico-químicas do ácido biliar, há muito ele é utilizado para o isolamento e a purificação de proteínas e também como um solubilizante ou emulsificante. Nos últimos anos, vem sendo dada atenção ao uso em um processo de preparação de vacina e também como um melhorador de absorção para drogas através de um transportador de ácido biliar. Especialmente, deoxicolato de sódio (também conhecido como desoxicolato de sódio) e ácido ursodeoxicólico (também conhecido como ácido ursodesoxicólico) esoxiácido cólico) já foram aprovados como um

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23/86 aditivo farmacêutico capaz de ser injetado em seres humanos, respectivamente, e seu desempenho de segurança superior já foi reconhecido. Por conseguinte, é mais preferido usar ácido desoxicólico, ácido ursodesoxicólico ou sais dos mesmos (por exemplo, sais sódicos) como o composto sensível ao pH da invenção.

[0078] O composto sensível ao pH está preferivelmente presente em uma quantidade de no mínimo 10 moles por 100 moles de substância anfipática. Mais preferivelmente, ele está presente em uma quantidade de 10 a 640 moles, mais preferivelmente em uma quantidade de 20 a 320 moles e ainda mais preferivelmente a uma quantidade de 20 a 160 moles por 100 moles de substância anfipática. (Substância Anfipática) [0079] A substância anfipática usada na invenção inclui pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e α-tocoferol. Essas substâncias anfipáticas podem ser usadas isoladamente ou em combinação de duas ou mais. Conforme usado neste relatório, o número de átomos de carbono de substância anfipática no presente relatório significa o número de átomos de carbono de uma porção ácido graxo (porção acila) que funciona como o sítio hidrofóbico da substância anfipática.

[0080] Como uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, uma diacilfosfatidilcolina tendo um grupo acil saturado é preferida, e como exemplos podem-se mencionar, por exemplo, didecanoilfosfatidilcolina (DDPC: 1,2-didecanoil-sn-glicero-3fosfatidilcolina) e dilauroilfosfatidilclorina (DLPC: 1,2-dilauroil-sn-glicero

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3-fosfatidilcolina). A fosfatidilcolina pode ser ou uma fosfatidilcolina derivada naturalmente ou uma fosfatidilcolina sintetizada obtida por processos conhecidos, ou fosfatidilcolinas comercialmente disponíveis também podem ser usadas.

[0081] Como um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, podem-se mencionar um éster de ácido monoláurico com polioxietileno sorbitano (polioxietileno sorbitano monolaurato), um éster de ácido mirístico com polioxietileno sorbitano (polioxietileno sorbitaon monomiristato), um éster de ácido monopalmítico com polioxietileno sorbitano (polioxietileno sorbitano palmitato), um éster de ácido monoesteárico com polioxietileno sorbitano (polioxietileno sorbitano monoestearato), um éster de ácido mono-oleico com polioxietileno sorbitano (polioxietileno sorbitano monooleato) e similares. Embora o grau de polimerização do polioxietileno não seja crítico, o grau de polimerização em relação ao total das cadeias de polietileno acrescentadas ao sorbitano varia preferivelmente de 10 a 200, mais preferivelmente 15 a 100 e muito mais preferivelmente 20 a 50. O éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano pode ser um éster sintetizado ou um produto comercial. Produtos comerciais do éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano incluem preferivelmente, por exemplo, aqueles comercializados sob as designações de Tween 20 (éster de ácido monoláurico com polioxietileno sorbitano), Tween 40 (éster de ácido monopalmítico com polioxietileno sorbitano), Tween 60 (éster de ácido monoesteárico polioxietileno sorbitano) e Tween 80 (éster de ácido mono-oleico com polioxietileno sorbitano). Destes, os ésteres de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano (Tween 40, Tween 60 e Tween 80) tendo 16 a 18 átomos de carbono são preferidos.

[0082] Como um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono, podem-se mencionar ésteres de ácido monograxo

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25/86 com sorbitano tais como éster de ácido monopalmítico com sorbitano (sorbitano monopalmitato), éster de ácido monoesteárico com sorbitano (sorbitano monoestearato), éster de ácido mono-oleico com sorbitano (sorbitano mono-oleato) e similares, e ésteres de ácido trigraxo com sorbitano tais como éster de ácido tripalmítico com sorbitano (sorbitano tripalmitato), éster de ácido triesteárico com sorbitano (sorbitano triestearato), éster de ácido trioleico com sorbitano (sorbitano trioleato) e similares. O éster de ácido graxo com sorbitano pode ser um éster sintetizado ou um produto comercial. Como um produto comercial do éster de ácido graxo com sorbitano, podem ser preferivelmente usados, por exemplo, aqueles comercializados sob as designações de SPAN 40 (éster de ácido palmítico com sorbitano), SPAN 60 (éster de ácido esteárico com sorbitano), SPAN 80 (éster de ácido oleico com sorbitano), SPAN 65 (éster de ácido triesteárico com sorbitano), e SPAN 85 (éster de ácido trioleico com sorbitano). Destes, SPAN 80, SPAN 65 e SPAN 85 são mais preferidos.

[0083] O glicerol mono-oleato (gliceril mono-oleato), glicerol dilaurato (gliceril dilaurato), glicerol diestearato (gliceril diestearato) e glicerol dioleato (gliceril dioleato) usados na invenção são acil gliceróis onde uma ou duas moléculas de um ácido graxo são ligadas por éster ao glicerol contanto que os sítios aos quais o ácido graxo estiver ligado não sejam críticos. Por exemplo, com glicerol mono-oleato que é um monoacil glicerol, o ácido graxo pode ser ligado na posição C1 ou na posição C2 da glicerina. Com glicerol dilaurato, glicerol diestearato e glicerol dioleato que são, cada um deles, um diacil glicerol, o ácido graxo pode ser ligado nas posições C1 e C2 ou nas posições C1 e C3 da glicerina. Como um glicerol dilaurato, por exemplo, «,σ’-dilaurato que é substituído nas posições C1 e C3 é preferido. As glicerol diestearato ou glicerol dioleato, um diacil glicerol que é substituído nas posições C1 e C2 é preferido. Esses derivados de glicerol podem ser produtos

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26/86 sintetizados ou produtos comerciais, respectivamente.

[0084] Como um óleo de rícino com polioxietileno, podemos mencionar adutos de polioxietilenos para óleo de rícino. O grau de polimerização do polioxietileno não é crítico e varia preferivelmente de 3 a 200, mais preferivelmente de 5 a 100 e muito mais preferivelmente de 10 a 50. O óleo de rícino com polioxietileno pode ser um produto sintetizado ou um produto comercial.

[0085] Como α-tocoferol, podem ser usados aqueles derivados naturalmente ou aqueles preparados por processos conhecidos, e produtos comerciais também podem ser usados.

[0086] Como essas substâncias anfipáticas, fosfatidilcolinas tendo a 12 átomos de carbono são preferidos, dentre as quais dilauroilfosfatidilcolina (DLPC) tendo 12 átomos de carbono é a mais preferida.

(Combinação de composto sensível ao pH e substância anfipática) [0087] O veículo sensível ao pH da invenção é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas em um pH desejado pela combinação apropriada de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática. Nesta oportunidade, o pH no qual o veículo sensível ao pH começa a desenvolver o efeito promotor de rompimento de membranas difere dependendo da combinação de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática. Isto é levado em consideração pelos seguintes motivos: o pKa difere dependendo do tipo de composto sensível ao pH e a maneira de se associar a uma substância anfipática também difere dependendo da combinação de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática. Por conseguinte, quando uma combinação de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática é apropriadamente alterada, a escolha apropriado do pH no qual a função pode ser desenvolvida é possível, permitindo assim que a distribuição in vivo e a distribuição intracelular sejam

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27/86 desenhadas em detalhes.

[0088] No veículo sensível ao pH da invenção, combinações preferidas de compostos sensíveis ao pH e substâncias anfipáticas incluem ácido desoxicólico e DDPC, ácido desoxicólico e DLPC, ácido

desoxicólico	e	Tween	20,	ácido	desoxicólico	e	Tween	40,	ácido
desoxicólico	e	Tween	60,	ácido	desoxicólico	e	Tween	80,	ácido
desoxicólico	e	SPAN	40,	ácido	desoxicólico	e	SPAN	60,	ácido
desoxicólico	e	SPAN	80,	ácido	desoxicólico	e	SPAN	65,	ácido
desoxicólico	e	SPAN	85,	ácido	desoxicólico	e	a-tocoferol,	ácido
desoxicólico	e	glicerol	mono-oleato, ácido desoxicólico	e glicerol

diestearato, ácido desoxicólico e glicerol dioleato, ácido desoxicólico e glicerol dilaurato (a,a’-dilaurina), ácido desoxicólico e óleo de rícino com polioxietileno, ácido ursodesoxicólico e DDPC, ácido ursodesoxicólico e DLPC, ácido ursodesoxicólico e Tween 20, ácido ursodesoxicólico e Tween 40, ácido ursodesoxicólico e Tween 60, ácido ursodesoxicólico e Tween 80, ácido ursodesoxicólico e SPAN 40, ácido ursodesoxicólico e SPAN 60, ácido ursodesoxicólico e SPAN 80, ácido ursodesoxicólico e SPAN 65, ácido ursodesoxicólico e SPAN 85, ácido ursodesoxicólico e a-tocoferol, ácido ursodesoxicólico e glicerol mono-oleato, ácido ursodesoxicólico e glicerol diestearato, ácido ursodesoxicólico e glicerol dioleato, ácido ursodesoxicólico e glicerol dilaurato (a,a’-dilaurina), ácido ursodesoxicólico e óleo de rícino com polioxietileno, ácido glicirrízico e DDPC, ácido glicirrízico e DLPC, ácido glicirrízico e Tween 20, ácido glicirrízico e Tween 40, ácido glicirrízico e Tween 60, ácido glicirrízico e Tween 80, ácido glicirrízico e SPAN 40, ácido glicirrízico e SPAN 60, ácido glicirrízico e SPAN 80, ácido glicirrízico e SPAN 65, ácido glicirrízico e SPAN 85, ácido glicirrízico e a-tocoferol, ácido glicirrízico e glicerol mono-oleato, ácido glicirrízico e glicerol diestearato, ácido glicirrízico e glicerol dioleato, ácido glicirrízico e glicerol dilaurato (a,a’-dilaurina), e ácido glicirrízico e óleo de rícino com polioxietileno.

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28/86 [0089] Mais preferivelmente, podemos mencionar ácido desoxicólico e DDPC, ácido desoxicólico e DLPC, ácido desoxicólico e Tween 40, ácido desoxicólico e Tween 60, ácido desoxicólico e Tween 80, ácido desoxicólico e SPAN 40, ácido desoxicólico e SPAN 65, ácido desoxicólico e SPAN 85, ácido desoxicólico e a-tocoferol, ácido desoxicólico e mono-oleína, ácido desoxicólico e óleo de rícino com polioxietileno, ácido ursodesoxicólico e DDPC, ácido ursodesoxicólico e DLPC, ácido ursodesoxicólico e Tween 40, ácido ursodesoxicólico e Tween 60, ácido ursodesoxicólico e Tween 80, ácido ursodesoxicólico e SPAN 40, ácido ursodesoxicólico e SPAN 65, ácido ursodesoxicólico e SPAN 85, ácido ursodesoxicólico e a-tocoferol, ácido ursodesoxicólico e mono-oleína, ácido ursodesoxicólico e óleo de rícino com polioxietileno, ácido glicirrízico e DDPC, ácido glicirrízico e DLPC, ácido glicirrízico e Tween 40, ácido glicirrízico e Tween 60, ácido glicirrízico e Tween 80, ácido glicirrízico e SPAN 40, ácido glicirrízico e SPAN 65, ácido glicirrízico e SPAN 85, ácido glicirrízico e a-tocoferol, ácido glicirrízico e mono-oleína, e ácido glicirrízico e óleo de rícino com polioxietileno.

(Solvente aquoso) [0090] O veículo sensível ao pH da invenção pode estar contido em uma solução aquosa. Será observado que uma solução aquosa contendo um veículo sensível ao pH também pode ser doravamente denominada dispersão de veículo.

[0091] Como um solvente da solução aquosa contendo um veículo sensível ao pH da invenção, podemos mencionar preferivelmente uma solução aquosa contendo um tampão, NaCl ou um açúcar tal como glicose, sacarose, e similares.

[0092] Como o tampão, tampões conhecidos podem ser convenientemente usados na medida em que são capazes de manter o pH de uma solução aquosa contendo um veículo sensível ao pH em um

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29/86 nível no mínimo igual ao pH fisiológico e sem limitações específicas impostas no mesmo. Os tampões incluem, por exemplo, um tampão fosfato, um tampão citrato, um tampão citrato-fosfato, um tampão trishidroximetilaminometano-HCl (tampão Tris cloridrato), tampões de Good tais como um tampão MES (tampão 2-morfolinoetanossulfonato), um tampão TES (tampão N-tris(hidroximetil)metil-2aminoetanossulfonato), um tampão acetato, um tampão MOPS (tampão 3-morfolinopropanossulfonato), um tampão MOPS-NaOH, um tampão HEPES (tampão 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfonato), um tampão HEPES-NaOH e similares, tampões à base de aminoácidos tais como um tampão glicina-cloridrato, um tampão glicina-NaOH, um tampão glicilglicina-NaOH, um tampão glicilglicina-KOH e similares, tampões à base de boro tais como um tampão Tris-borato, um tampão borato-NaOH e um tampão borato, ou um tampão à base de imidazol. Destes, um tampão fosfato, um tampão citrato, um tampão citratofosfato, um tampão T ris-cloridrato, um tampão MES, um tampão acetato e um tampão HEPES-NaOH são preferidos. A concentração de um tampão não é crítica e varia preferivelmente de 0,1 a 200 mM, mais preferivelmente de 1 a 100 mM. Será observado que a concentração de um tampão usado na invenção significa uma concentração (mM) de um tampão contido em uma solução aquosa.

[0093] A concentração de NaCl ou um açúcar tal como glicose, sacorse e similares não é crítica e varia preferivelmente de 0,1 a 200 mM, mais preferivelmente de 1 a 150 mM.

[0094] A concentração do veículo sensível ao pH em uma solução aquosa não é crítica e é tal que uma concentração molar total de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática varia de preferivelmente 0,73 pmols/litro a 7,4 mmoles/litro, mais preferivelmente

7,3 pmoles/litro a 6,5 mmoles/litro e muito mais preferivelmente 8,0 pmoles/litro a 4,2 mmoles/litro.

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30/86 (Outros componentes) [0095] O veículo sensível ao pH da invenção pode conter ainda outros componentes, tais como um estabilizante, no veículo sensível ao pH ou solução aquosa contendo o veículo sensível ao pH. O teor desses componentes não é crítico a menos que o veículo sensível ao pH seja destruído e é preferivelmente no máximo 150 moles, mais preferivelmente no máximo 66,4 moles por 100 moles da substância anfipática.

[0096] O tipo de estabilizante não é crítico a menos que o veículo sensível ao pH seja destruído e estabilizantes conhecidos são úteis e incluem, por exemplo: álcoois saturados ou insaturados tendo 4 a 20 átomos de carbono tais como 1-octanol, 1-dodecanol, 1-hexadodecanol, 1-eicosanol e similares; ácidos graxos saturados ou insaturados tendo 12 a 18 átomos de carbono tais como ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico e similares; alquil (alquila tendo 1 a 3 átomos de carbono) ésteres de ácidos graxos saturados ou insaturados tendo 8 a 18 átomos de carbono tais como metil caprilato (metil octanoato), metil caprilato (etil octanoato), metil laurato, etil laurato, etil miristato, etil palmitato, etil estearato, metil oleato, etil oleato e similares; D(L)-aminoácidos tais como D(L)-alanina, alginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, glicina, histidina, leucina, isoleucina, lisina, methonina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, fenilalanina e similares; aminoácido triglicerídeos tais como tricaproína, tricaprilina e similares; ésteres de ácido trigraxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono (por exemplo, Tween 65, Tween 85) tais como éster de ácido tripalmítico com polioxietileno sorbitano, éster de ácido trioleico com polioxietileno sorbitano e similares; alquil ésteres de polioxietileno tendo 12 a 18 átomos de carbono (por exemplo, estearil éter de PEG-20, lauril éter de PEG-23) tais como éster de ácido láurico com polioxietileno,

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31/86 éster de ácido mirístico com polioxietileno, éster de ácido palmítico com polioxietileno, éster de ácido esteárico com polioxietileno e similares; óleos de rícino endurecidos com polioxialquileno (por exemplo, óleo de rícino endurecido com PEG-10, óleo de rícino endurecido com PEG-40 e óleo de rícino endurecido com PEG-60); glicerol ésteres de ácidos monograxos saturados ou insaturados tendo 8 a 18 átomos de carbono tais como caprilina (glicerol octenoato), glicerol monocaprilato, glicerol monolaurato, glicerol monomiristato, glicerol monopalmitato, glicerol monoestearato, glicerol mono-oleato e similares; glicerol ésteres de ácidos digraxos tendo 8 a 16 átomos de carbono tais como glicerol dioctanoato, glicerol dicaprilato, glicerol dilaurato, glicerol dimiristato, glicerol dipalmitato e similares; e éster acético de α-tocoferol, óleo de rícino, óleo de soja, colesterol, esqualeno, esqualano, lactose, ascorbil palmitato, benzil benzoato, metil paraoxibenzoato, etil paraoxibenzoato, propil paraoxibenzoato, butil paraoxibenzoato e similares. Conforme usado neste relatório, o número de átomos de carbono significa o número de átomos de carbono de uma porção ácido graxo (grupo acil) que funciona como o sítio hidrofóbico.

<Método para preparar um veículo sensível ao pH>

[0097] De acordo com a invenção, ofereceu-se um método para preparar um veículo sensível ao pH capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas, método este que incluir associar pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27, ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono, um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, um éster de ácido graxo com

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32/86 sorbitano tendo 16 to 18 átomos de carbono, glicerol mono-oleato, glicerol dilaurato, glicerol diestearato, glicerol dioleato, óleo de rícino com polioxietileno e a-tocoferol.

[0098] Para a associação do composto sensível ao pH e a substância anfipática, basta colocar o composto sensível ao pH e a substância anfipática em contato um com o outro em uma solução aquosa. Assim sendo, o veículo sensível ao pH da invenção pode ser colocando-se o composto sensível ao pH e a substância anfipática em contato mútuo em uma solução aquosa. Mais particularmente, uma solução aquosa contendo um composto sensível ao pH e uma substância anfipática é preparada e é subsequentemente submetida à dispersão com agitação vigorosa por meio de uma máquina de emulsificação, um misturador de vórtice, ondas ultrassônicas e similares meios, com o que é possível obter um veículo sensível ao pH na forma do composto sensível ao pH e da substância anfipática associados.

[0099] Para a preparação de uma solução aquosa contendo um composto sensível ao pH e uma substância anfipática, nenhuma limitação é imposta contanto que seja formado um produto associado do composto sensível ao pH e da substância anfipática. Por exemplo, podemos mencionar: (1) um método no qual uma solução aquosa contendo um composto sensível ao pH e uma solução aquosa contendo uma substância anfipática são preparadas separadamente, e estas soluções aquosas são misturadas, seguido por dispersão com agitação vigorosa pelo uso de uma máquina de emulsificação, um misturador de vórtice, ondas ultrassônicas ou outros meios para obter um veículo sensível ao pH; e (2) um método de preparação usando o método de Bangham conhecido como um método para preparar um lipossoma. Mais especificamente, de acordo com o método de Bangham, componentes constituentes do veículo sensível ao pH tais como um composto sensível ao pH e uma substância anfipática são dissolvidos

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33/86 em um solvente orgânico (por exemplo, metanol ou clorofórmio) em um recipiente de vidro e o solvente orgânico é removido tal como com um evaporador giratório para formar uma película fina sobre as paredes do recipiente de vidro. Em seguida, uma solução aquosa é acrescentada ao recipiente de vidro formado com a película fina, seguido por intumescimento da película fina a uma temperatura normal (5 a 35°C) e agitação do recipiente de vidro a uma temperatura normal (5 a 35°C). Nesta oportunidade, enquanto é vigorosamente agitado por meio de uma máquina de emulsificação, um misturador de vórtice ou ondas ultrassônicas, a película fina pode ser bem dispersada na solução aquosa. No método de preparação (1) acima, um composto sensível ao pH pode ser misturado em uma solução aquosa contendo uma substância anfipática. Será observado que um solvente para a solução aquosa pode ser um solvente como aquele usado para a solução aquosa mencionada mais acima.

[00100] T ambém será observado que para detalhes sobre o método de Bangham, podemos indicar métodos de preparação de lipossomas conhecidos como aqueles descritos em Liposomes (editado por Shoushichi Nojima, Jyunzou Sunamoto e Keizou Inoue, e publicado por Nankoudou) e Liposomes in Life Science (editado por Hiroshi Terada e Tetsuro Yoshimura, e publicado pela Springer-Verlag, Tóquio).

[00101] A forma de adição dos outros componentes tais como um estabilizante, que podem estar contidos em um veículo sensível ao pH ou em uma solução aquosa contendo o veículo sensível ao pH, não é limitada de forma crítica. Por exemplo, os componentes podem ser acrescentados a uma solução aquosa contendo um composto sensível ao pH ou uma solução aquosa contendo uma substância anfipática. Alternativamente, ao se preparar uma película fina, os componentes podem ser dissolvidos junto com os componentes constituentes do veículo sensível ao pH, e depois disso usando a película fina resultante

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34/86 contendo esses componentes, é possível obter uma solução aquosa contendo um veículo sensível ao pH.

[00102] O veículo sensível ao pH obtido da maneira apresentada acima é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas e pode ser convenientemente usado para DDS.

<Droga sensível ao pH e composição medicamentosa sensível ao pH> [00103] De acordo com uma modalidade da invenção, ofereceu-se uma droga sensível ao pH onde um veículo sensível ao pH suporta pelo menos uma substância fisiologicamente ativa com o mesmo.

[00104] Conforme usado neste relatório, o termo suporte usado na invenção significa uma forma de uma substância fisiologicamente ativa incluída em um veículo, a forma da substância inserida no veículo, ou uma forma da substância ligada diretamente ou via um meio à superfície do veículo. Conforme usado neste relatório, o termo ligado significa ou ligado quimicamente com uma ligação covalente ou uma ligação iônica ou ligado fisicamente com uma ligação de van der Waals ou uma ligação hidrofóbica. A substância fisiologicamente ativa pode ser uma substância hidrofílica ou uma substância hidrofóbica. Se a substância fisiologicamente ativa for feita de uma substância hidrofóbica, é preferível que a substância ativa seja suportada na forma de ser incluída em um veículo sensível ao pH ou ser inserida no veículo sensível ao pH. Quando a substância fisiologicamente ativa é de natureza hidrofílica, a substância é preferivelmente suportada na forma de ser ligada diretamente ou via um meio à superfície do veículo.

[00105] O veículo sensível ao pH da invenção é capaz de suportar uma substância fisiologicamente ativa. Quando o veículo sensível ao pH desenvolve o efeito promotor da função disruptiva de membranas em um ambiente com um pH menor que o pH fisiológico, a substância fisiologicamente ativa suportada pode ser distribuída para um sítio desejado. Embora não claramente conhecido, presume-se que o

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35/86 mecanismo para tanto é da seguinte maneira (vide FIG. 1B). Será observado que a invenção não deve ser interpretada como limitada à hipótese que segue.

[00106] A droga sensível ao pH onde o veículo sensível ao pH da invenção suporta uma substância fisiologicamente ativa é fixada nas células via endocitose formando assim um endossoma contendo a droga sensível ao pH. Em seguida, o interior do endossoma leva a um ambiente ácido. Nesta oportunidade, quando o ambiente da droga sensível ao pH da invenção chega a um pH menor que o pH fisiológico (por exemplo, um pH de 6,5), o efeito promotor da função disruptiva de membranas do veículo sensível ao pH se desenvolve. Mais particularmente, os componentes constituentes do veículo sensível ao pH e os componentes membranosos do endossoma são forçados a se rearranjarem, de modo que a substância fisiologicamente ativa suportada pelo veículo sensível ao pH existentes no endossoma migra para o citosol. Isto permite que a substância fisiológica seja distribuída diretamente para um citosol desejado e, portanto, considerou-se que tal efeito farmacológico elevado foi demonstrado.

[00107] De acordo com uma outra modalidade da invenção, também ofereceu-se uma composição medicamentosa sensível ao pH incluindo um veículo sensível ao pH e pelo menos uma substância fisiologicamente ativa. Nesta oportunidade, a substância fisiologicamente ativa está presente fora (separadamente) do veículo sensível ao pH ao contrário da droga sensível ao pH de acordo com a modalidade acima, e a substância fisiologicamente ativa e o veículo sensível ao pH não são ligados diretamente nem via um meio. Mais particularmente, a composição medicamentosa sensível ao pH de acordo com esta modalidade é formada por um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa sendo, respectivamente, independentemente misturados.

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36/86 [00108] A composição medicamentosa sensível ao pH da invenção onde um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa são, respectivamente, independentemente misturados pode distribuir a substância fisiologicamente ativa para um sítio desejado depois de o veículo sensível ao pH desenvolver o efeito promotor da função disruptiva de membranas em um ambiente cujo pH é menor que o pH fisiológico. Embora não claramente conhecido, presumiu-se que o mecanismo de desenvolvimento é semelhante ao caso da droga sensível ao pH onde o veículo sensível ao pH suporta uma substância fisiologicamente ativa (vide FIG. 1C). Deve ser observado que a invenção não está limitada pela hipótese que se segue.

[00109] Mais particularmente, a composição medicamentosa sensível ao pH de acordo com esta modalidade é fixada na célula pela endocitose do veículo sensível ao pH pela célula. A esta altura, junto com o veículo sensível ao pH, uma substância fisiologicamente ativa também é fixada na célula pela endocitose do veículo sensível ao pH pela célula. Como consequência, endossomas independentemente contendo o veículo sensível ao pH e a substância fisiologicamente ativa, são respectivamente formados. Em seguida, o interior dos endossomas é levado para um ambiente ácido e o ambiente atinge um pH menor que o pH fisiológico (por exemplo, um pH de 6,5), e com isso o efeito promotor da função disruptiva de membranas do veículo sensível ao pH se desenvolve. Ao fazer isso, a substância fisiologicamente ativa existente no interior dos endossomas migra para o citosol. Desta maneira, a substância fisiologicamente ativa pode ser distribuída diretamente para um citosol desejado.

[00110] A droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH da invenção são capazes de distribuir com eficiência uma substância fisiologicamente ativa para um sítio de um corpo vivo cujo pH diminui devido a um tumor ou a uma inflamação. Mais

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37/86 particularmente, a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH da invenção podem desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas em um sítio onde o pH diminui, de modo que a substância fisiologicamente ativa pode ser distribuída seletivamente para uma área de tratamento tal como uma área de inflamação.

[00111] O tipo da substância fisiologicamente ativa a ser suportada pelo o veículo sensível ao pH usado na droga sensível ao pH e na composição medicamentosa sensível ao pH não é crítico. Por exemplo, como uma substância fisiologicamente ativa, podemos mencionar um ácido nucleico, um composto de baixo peso molecular, uma proteína, e um peptídio.

[00112] O ácido nucleico inclui um ácido nucleico tendo um efeito de tratamento, tal como siRNA, ODN (oligodesoxinucleotídeo), DNA e similares.

[00113] Como um composto de baixo peso molecular, podemos mencionar: antineoplásicos tais como mitomicina, docetaxel, metotrexato e similares; pró-drogas tais como ácido 5-aminolevulínico, protoporfirina IX e similares; agentes anti-inflamatórios tais como ganciclovir, dexametasona, ribavirina, vidarabina e similares; agentes de contraste tais como DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclotetradecanoN,N’,N”,N”’-tetra-acético), DTPA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclodecanoN,N’,N”,N”’-tetra-acético) e similares; e neuroprotetores tais como edaravona e similares.

[00114] Como uma proteína, podemos mencionar oxidorredutases tais como SOD (superóxido dismutase), indofenoloxidase entre outras; citocinas tais como IL-10 entre outras, fatores de crescimento tais como b-FGF e similares, agentes trombolíticos tais como t-PA e similares, hormônios tais como eritropoietina e similares, e proteínas contra morte celular PSD (proteína de densidade pós-sináptica), FNK (fator contra

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38/86 morte celular) e similares; e anticorpos tais como Fab (Fragmento), IgG, IgE e similares.

[00115] Como um peptídio, podemos mencionar: drogas peptídicas tais como ciclosporina A, JIP-1 (proteína 1 interatuante com JNK) e similares.

[00116] Este tipo de conhecimento pode ser apropriadamente suportado pelo estado da técnica na época do depósito.

[00117] A quantidade da substância fisiologicamente ativa não é crítica e pode ser apropriadamente selecionada dependendo do tipo de substância fisiologicamente ativa.

[00118] Como o método para suportar uma substância fisiologicamente ativa no veículo sensível ao pH, pode-se usar qualquer um dos métodos conhecidos dependendo do tipo de substância fisiologicamente ativa. T ais métodos não são críticos. Como um método para obter uma forma de inclusão no veículo e uma forma de inserção no veículo, podemos mencionar um método no qual, depois da formação de um veículo sensível ao pH de acordo com o método de preparação de um veículo sensível ao pH mencionado acima, o veículo sensível ao pH é imerso em uma solução contendo uma substância fisiologicamente ativa para permitir que a substância fisiologicamente ativa seja fixada no veículo sensível ao pH e um método no qual uma solução contendo uma substância fisiologicamente ativa é carregada em um recipiente formado com uma película fina de acordo com o método de preparação de um veículo sensível ao pH mencionado acima fazendo assim com que a substância fisiologicamente ativa seja incluída no veículo. Como um método para obter uma forma de ligação direta ou via um meio à superfície do veículo, podemos mencionar um método no qual um composto sensível ao pH ou uma substância anfipática usada como um componente constituente do veículo sensível ao pH é introduzida com um grupo funcional capaz de reagir com um tipo

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39/86 desejado de substância fisiologicamente ativa e é subsequentemente reagido com a substância fisiologicamente ativa para obter um veículo sensível ao pH ligado com a substância fisiologicamente ativa. Será observado que a ligação com a substância fisiologicamente ativa pode ser feita seja antes da preparação do veículo sensível ao pH ou depois da preparação.

[00119] O veículo sensível ao pH e a substância fisiologicamente ativa podem ser misturados de acordo com qualquer um dos métodos conhecidos determinado dependendo do tipo de substância fisiologicamente ativa. T ais métodos não sãol críticos, e como exemplos podemos mencionar, por exemplo, um método no qual o veículo e uma substância fisiologicamente ativa são misturados com um meio tal como um solvente aquoso, um diluente e similares.

[00120] A droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH da invenção podem incluir ainda outros tipos de aditivos de droga. Embora a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH possam estar na forma de preparações sólidas incluindo comprimidos, pós, e cápsulas e similares, preparações líquidas tais como preparações injetáveis são preferidas. A preparação líquida pode ser apresentada na forma de um produto seco que pode ser regenerado com o uso de água ou outro diluente apropriado no momento de uso.

[00121] O comprimido e a cápsula devem ser preferivelmente submetidos a um revestimento entérico de acordo com um procedimento comum. O revestimento entérico pode ser um revestimento comumente empregado neste campo. A cápsula conter um sólido ou um líquido.

[00122] Quando a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH estão na forma de uma preparação líquida, os aditivos de droga podem incluir um solvente (por exemplo,

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40/86 uma solução salina fisiológica, água esterilizada, uma solução tampão e similares), um agente estabilizante de membrana (por exemplo, colesterol e similares), um agente tonificante (por exemplo, cloreto de sódio, glicose, glicerina e similares), um antioxidante (por exemplo, tocoferol, ácido ascórbico, glutationa e similares), um preservativo (por exemplo, clorbutanol, parabeno e similares) e similares. O solvente pode ser um solvente usado para a preparação da droga sensível ao pH e da composição medicamentosa sensível ao pH.

[00123] Quando a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH estão na forma de uma preparação sólida, os aditivos de droga podem incluir um excipiente (por exemplo, um açúcar tal como lactose, sacarose e similares, um amido tal como amido de milho, uma celulose tal como celulose cristalina, goma arábica, aluminato de metassilicato de magnésio, fosfato de cálcio e similares), um lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio, talco, polietileno glicol e similares), um aglutinante (por exemplo, manitol, um açúcar tal como sacarose, celulose cristalina, polivinilpirrolidona, hidroxipropil metilcelulose e similares), um desintegrante (por exemplo, um amido tal como amido de batata, uma celulose tal como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona reticulada e similares), um corante, um agente flavorizante e similares.

[00124] A droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH podem ser preparados por misturação com os aditivos de droga mencionados acima no estado em que se encontram ou depois de secagem por congelamento. Onde a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH são secados por congelamento, é preferível acrescentar um tipo apropriado de diluente antes da secagem por congelamento.

[00125] A forma de administração no caso em que a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH da invenção são

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41/86 usadas para tratar um indivíduo não é crítico, e podemos mencionar, por exemplo, a administração oral, e administração parenteral tal como injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção subcutânea, injeção intracutânea, injeção intramuscular, injeção intraespinhal, administração percutânea ou absorção percutânea. Por exemplo, onde um peptídio ou proteína é usado como uma substância fisiologicamente ativa, a administração por vias parenterais tais como injeção subcutânea, injeção intracutânea, injeção intramuscular e injeção intravenosa é preferida. Será observado que para a composição medicamentosa sensível ao pH onde um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa são, respectivamente, independentemente misturados, é preferível que a mesma seja administrada na forma de administração local, particularmente, injeção subcutânea, injeção intracutânea ou administração intramuscular.

[00126] Quando o ambiente externo da droga sensível ao pH e da composição medicamentosa sensível ao pH da invenção atinge um pH menor que o pH fisiológico (por exemplo, pH 6,5) depois de administrada a um indivíduo, o efeito promotor da função disruptiva de membranas, ou o efeito promotor da função disruptiva de membranas e o efeito promotor da função de fusão de membranas são desenvolvidos, possibilitando assim que uma substância fisiologicamente ativa seja liberada especificamente de maneira eficiente.

[00127] Portanto, de acordo com a invenção, ofereceu-se um método para tratar ou prevenir uma doença que inclui a administração oral ou peroral de uma quantidade eficaz da droga sensível ao pH ou composição medicamentosa sensível ao pH acima a um indivíduo que requer tratamento ou prevenção.

[00128] O indivíduo é preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano.

[00129] Como a doença, podemos mencionar, por exemplo,

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42/86 cânceres tais como câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de cérebro, câncer de mama e similares, doenças infecciosas tais como HIV (vírus da imunodeficiência humana), hepatite C, hepatite B entre outras, e doenças neurológicas centrais tais como mal de Alzheimer, mal de Parkinson entre outras.

[00130] Mais particularmente, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, ofereceu-se um método para tratar ou prevenir uma doença. Este tipo de conhecimento pode ser apropriadamente suportado pelo estado da técnica na época do depósito.

[00131] Em uma modalidade da invenção, a droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH podem permitir que uma substância fisiologicamente ativa seja diretamente transportada para as células por cultura. Isto é, de acordo com esta modalidade, ofereceu-se um método de cultura para transportar uma substância fisiologicamente ativa para as células.

[00132] O método de cultura inclui a etapa de cultivar células em um meio contendo uma droga sensível ao pH e/ou uma composição medicamentosa sensível ao pH.

[00133] A droga sensível ao pH e a composição medicamentosa sensível ao pH são, respectivamente, aquelas descritas acima. Mais particularmente, podemos mencionar uma droga sensível ao pH onde um veículo sensível ao pH suporta pelo menos uma substância fisiologicamente ativa e uma composição medicamentosa sensível ao pH que independentemente contém um veículo sensível ao pH e pelo menos uma substância fisiologicamente ativa. Estas podem ser usadas isoladamente ou em combinação.

[00134] O meio não é crítico e aqueles conhecidos na literatura podem ser usados. Em particular, podem-ses mencionar MEM, DMEM, RPMI e similares.

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43/86 [00135] A quantidade de uma droga sensível ao pH e/ou uma composição medicamentosa sensível ao pH no meio não crítica e a concentração molar total de uma composição sensível ao pH e uma substância anfipática varia preferivelmente de 0,73 pmoles/litro a 7,4 mmoles/litro, mais preferivelmente 7,3 pmoles/litro a 6,5 mmoles/litro e muito mais preferivelmente 8,0 pmoles/litro a 4,2 mmoles/litro.

[00136] O pH do meiopreferivelmente é de no mínimo 7,0, mais preferivelmente 7,2 a 7,8. Se o pH do meio não for no mínimo 7,0, é possível impedir vantajosamente que um composto sensível ao pH usado como um constituente do veículo sensível ao pH fique instável no meio.

[00137] Os tipos de células não são críticos e podemos mencionar células coletadas de um indivíduo, células cultivadas estabelecidas entre outras.

[00138] Nesta oportunidade, exemplos específicos de células coletadas de um indivíduo ou de células cultivadas estabelecidas incluem células dendríticas, células NK (exterminadoras naturais), células do tipo linfócito T, células do tipo linfócito B e células do tipo linfócito.

[00139] Das células acima, é preferível usar células coletadas de um indivíduo. Mais preferivelmente, células dendríticas, células NK, células T e células do tipo linfócito coletadas de um indivíduo são usadas.

[00140] Onde são usadas células coletadas de um indivíduo, as células do indivíduo podem ser obtidas através de coleta de sangue, biópsia, e similares meios. Por conseguinte, o método de cultura de acordo com esta modalidade pode incluir a etapa de coletar células de um indivíduo.

[00141] Será observado que as células cultivadas podem ser administradas a indivíduo. Com isso, a doença do indivíduo pode ser tratada ou prevenida. Assim sendo, de acordo com esta modalidade,

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44/86 ofereceu-se um método para tratar ou prevenir uma doença.

[00142] Em uma modalidade preferida, o método de tratamento ou prevenção inclui as etapas de coletar células de um indivíduo, cultivar as células coletadas em um meio contendo uma droga sensível ao pH e/ou uma composição medicamentosa sensível ao pH, e administrar as células cultivadas ao indivíduo.

[00143] Desta maneira, uma doença pode ser tratada ou prevenida. A doença é uma daquelas mencionadas mais acima.

EXEMPLOS [00144] A invenção será descrita de forma mais detalhada por meio de exemplos, que não devem ser interpretados como limitativos da invenção.

< Materiais de partida >

[00145] Nos exemplos, os compostos que se seguem foram usados. Onde o nome do reagente e o nome do produto são os mesmos, o nome do produto foi omitido.

[00146] EYPC (fosfatidilcolina de gema de ovo não hidrogenada: COATSOME NC-50, produzida pela NOF Corporation) [00147] HSPC (fosfatidilcolina de soja: COATSOME NC-21, produzida pela NOF Corporation) [00148] DDPC (1,2-decanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina:

COATSOME MC-1010, produzida pela NOF Corporation) [00149] DLPC (1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina:

COATSOME MC-1212, produzida pela NOF Corporation) [00150] DMPC (1,2-dimistiroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina:

COATSOME MC-4040, produzida pela NOF Corporation) [00151] DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina:

COATSOME MC-6060, produzida pela NOF Corporation) [00152] DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina:

COATSOME MC-8080, produzida pela NOF Corporation)

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45/86 [00153] DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina: COATSOME

MC 8181, produzida pela NOF Corporation) [00154] POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-fosfatidilcolina: COATSOME

MC 6081, produzida pela NOF Corporation) [00155] DLPE (1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina:

COATSOME ME 2020, produzida pela NOF Corporation) [00156] DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina:

COATSOME ME 4040, produzida pela NOF Corporation) [00157] DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina:

COATSOME ME 8080, produzida pela NOF Corporation) [00158] DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina:

COATSOME ME 8181, produzida pela NOF Corporation) [00159] Chems (Colesteril hemissuccinato: produzido pela Nacalai

Tesque Co., Ltd.) [00160] NBD-PE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amônio: produzido pela Avanti Polar

Lipids, Inc.

[00161] Rh-PE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina[00162] N-(lissamina rhodamina B sulfonil)amônio: Avanti Polar

Lipids, Inc.) [00163] Desoxicolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00164] Colato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00165] Ursodesoxicolato de sódio (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00166] Ácido chenodesoxicólico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00167] Ácido hiodesoxicólico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00168] Metil colato (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00169] Desidrocolato de sódio (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00170] Ácido litocólico (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00171] Glicocolato de sódio (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)

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46/86 [00172] Taurocolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00173] Glicodesoxicolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00174] Taurodesoxicolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00175] Glicoursodesoxicolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00176] Tauroursodesoxicolato de sódio (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00177] Ácido biliar C27 (ácido 3α, 7α, 12a-tri-hidroxicolestanoico: Avanti Polar Lipids, Inc.) [00178] Ácido 5p-colânico (Sigma-Aldrich Co., LLC) [00179] Glicirrizinato de monoamônio (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00180] Ácido glicirrízico (Nagara Science Co., Ltd.) [00181] Sacarina sódica (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00182] Metanol (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00183] Clorofórmio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00184] Ácido acético (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00185] Acetato de sódio (Kanto Chemical Co., Inc.) [00186] MES-Na (Merck & Co., Inc.) [00187] Hepes-Na (Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00188] Cloreto de sódio (Kanto Chemical Co., Inc.) [00189] Piranina (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00190] DPX (brometo de p-xileno-bis-piridínio: Molecular Probes

Inc.) [00191] PBS (sais tamponados com fosfato: PBS comprimidos, produzido pela Takara Bio Inc.) [00192] Ésteres de ácidos monograxos com polioxietileno sorbitano (Tween 20, 40, 60, 80, 65, 85: produzidos pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00193] PEG-20-estearil éter (polioxietileno 20-estearil éster:

produzido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00194] PEG-23-lauril éter (polioxietileno 23-lauril éster: produzido

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47/86 pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00195] Ésteres de ácidos graxos com sorbitano (SPAN 20: sorbitano monolaurato, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd., SPAN 40, 60: produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., SPAN 80: sorbitano mono-oleato, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd., [00196] 65: sorbitano triestearato, produzido pela Wako Pure

Chemical Industries, Ltd., SPAN 85: produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00197] Glicerol monocaprato (Monocaprin, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00198] Glicerol monocaprilato (Monocaprylin, produzido pela Tokyo

Chemical Industry Co., Ltd.) [00199] Glicerol monolaurato (Monolaurin, produzido pela Tokyo

Chemical Industry Co., Ltd.) [00200] Glicerol monomiristato (Monomyristin, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00201] Glicerol monopalmitato (Monopalmitin, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00202] Glicerol monoestearato (Monostearin, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00203] Glicerol mono-oleato (Mono-oleína, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00204] Glicerol dilaurato (á,á Dilaurin, produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) [00205] Glicerol diestearato (produzido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [00206] Glicerol dioleato (produzido pela Wako Pure Chemical

Industries, Ltd.) [00207] Óleo de rícino com polioxietileno (óleo de rícino com polioxietileno 10, produzido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

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[00208]

Óleo de rícino endurecido com polioxietileno (10: óleo de

rícino endurecido com polioxietileno 10, produzido pela Wako Pure

Chemical Industries, Ltd., 40: Uniox HC-40, produzido pela NOF

Corporation, 60: Uniox HC-60, produzido pela NOF Corporation)

[00209] [00210] [00211] Ltd.) [00212] [00213] Ltd.) [00214] [00215] [00216] [00217] Ltd.) [00218] [00219] [00220] [00221] [00222] Co., Ltd.) [00223] [00224]	1-Butanol (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) 1-Octanol (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) 1-Dodecanol (produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., 1-Hexadecanol (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) 1-Eicosanol (produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Ácido láurico (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Oleato de sódio (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Etil octenoato (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Etil laurato (produzido pela Tokyo Chemical Industry Co., Etil oleato (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Lactose (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) L-leucina (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) L-histidina (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Óleo de soja (óleo de soja, produzido pela Nacalai Tesque Esqualano (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Esqualeno (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.)
[00225] Co., Ltd.)	a-Tocoferol (DL-a-tocoferol, produzido pela Nacalai Tesque
[00226]	Acetato de tocoferol (acetato de DL-a-tocoferol, produzido

pela Nacalai Tesque Co., Ltd.)

[00227] [00228]

Benzil benzoato (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) Benzil paraoxibenzoato (produzido pela Tokyo Chemical

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Industry Co., Ltd.) [00229] Ascorbil palmitato (produzido pela LKT Laboratories, Inc.) [00230] Goma arábica (pó de goma arábica, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00231] Gelatina (pó purificado de gelatina, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00232] Ciclodextrina (produzido pela Nacalai Tesque Co.,Ltd.) [00233] Metilcelulose (produzido pela Nacalai Tesque Co.,Ltd.) [00234] Óleo mineral (produzido pela Nacalai Tesque Co.,Ltd.) [00235] Parafina (produzido pela Nacalai Tesque Co.,Ltd.) [00236] Solução aquosa de hidróxido de sódio (0,1 mol/litro:

produzida pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00237] Ácido clorídrico (0,1 mol/litro 1 mol/litro: produzido pela

Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00238] Triton-X100 (Triton X100, produzido pela Wako Pure

Chemical Industries, Ltd.) [00239] Peptídio modelo: OVA257-264 (SIINFEKL, preparado sob encomenda para PH Japan Co., Ltd.) [00240] Peptídio marcado com fluorescência: OVA257-264-Rh (preparado sob encomenda para PH Japan Co., Ltd.) [00241] Proteína modelo: OVA (Sigma-Aldrich Inc.) [00242] Trypsin (produzido pela Life Technologies Inc.) [00243] EDTA (tetra-acetato de etilenodiamina, produzida pela

Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00244] β-gal (β-D-galactosidase, produzida pela Wako Pure

Chemical Industries, Ltd.) [00245] FBS (soro bovino fetal: produzido pela Kokusan Chemical Co., Ltd.) [00246] MEM (Meio Essencial Mínimo: solução contendo MEM de Eagle e L-glutamina, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.)

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50/86 [00247] DMEM sem vermelho de fenol (solução de 4,5 g/l de Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM) sem glicose, L-glutamina, ácido pirúvico e vermelho de fenol) [00248] DMEN (meio de Eagle modificado da Dulbecco, produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00249] Difosfato de cloroquina (produzido pela Nacalai Tesque Co., Ltd.) [00250] IsoFlow (produzido pela Beckman Coulter Inc.) <Preparação das amostras>

(Preparação do veículo sensível ao pHs) [00251] 1000 nmol de uma substância anfipática dissolvida em metanol (ou clorofórmio) e um composto sensível ao pH ou composto candidato dissolvido em metanol (ou clorofórmio) foram misturados em um balão no formato de berinjela de 10 mL e convertidos em uma película fina por meio de um evaporador giratório (BuCHI). Será observado que a proporção entre a substância anfipática e o composto sensível ao pH ou composto candidato foi estabelecida de forma a proporção relações desejadas (relações molares de 100:10, 100:20, 100:640, etc.). Onde uma pluralidade de substância anfipática foi usada, as substâncias anfipáticas foram controladas em uma quantidade total de forma a ter o número de moles desejado (1000 nmol).

[00252] 1 mL de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH

7,4) foi adicionado à película fina resultante, seguido de dispersão por um minuto de irradiação com ondas ultrassônicas a uma temperatura normal pelo uso de um irradiador ultrassônico (USC-J) para obter uma solução aquosa de um veículo sensível ao pH (uma dispersão do veículo) desejado.

(Preparação de veículos para comparação) (EYPC isoladamente e DLPC isoladamente) [00148] 1000 nmol de EYPC ou DLPC dissolvido em

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51/86 clorofórmio foram colocados em um balão no formato de berinjela de 10 mL, seguido por conversão em uma película fina por meio de um evaporador giratório (BuCHI).

[00149] 1 mL de um tampão MES (MWS: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH

7,4) foi adicionado à película fina resultante, seguido de dispersão por um minuto de irradiação com ondas ultrassônicas a uma temperatura normal pelo uso de um irradiador ultrassônico (USC-J) para obter uma dispersão de EYPC isoladamente ou de DLPC isoladamente.

(Veículos contendo materiais macromoleculares) [00150] De maneira similar ao procedimento de preparação do veículo sensível ao pH, uma película fina de um composto sensível ao pH e um material macromolecular foi preparada para dar um veículo. O material macromolecular, tal como goma arábica, gelatina, metilcelulose, óleo mineral ou parafina, foi usado em quantidades 1/5, uma vez e cinco vezes o peso dos 1600 nmoles do composto sensível ao pH.

(Lipossomas sensíveis ao pH) [00151] De maneira similar ao procedimento de preparação do veículo sensível ao pH, uma película fina de DOPE e Chems ou ácido oleico foi preparada para dar um lipossoma. Será observado que o DOPE-Chems (DOPE:Chems = 3:2 (relação molar)) e o DOPE-ácido oleico (DOPE:ácido oleico = 7:3 (relação molar)), que eram, respectivamente, um lipossoma sensível ao pH, foram preparados usando-se 1000 nmol de DOPE, uma dada quantidade de Chems ou ácido oleico e 1 mL de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7,4).

(Preparação de um veículo contendo peptídio e de um veículo contendo proteína) [00152] 0 a 1536 pg de peptídio modelo OVA257-264 (SIINFEKL) ou uma proteína modelo OVA por 1000 nmol de uma substância anfipática

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52/86 foram pesados e dissolvidos em 1 mL de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7,4). Estas soluções foram usadas para preparar os respectivos veículos, a partir dos quais foi obtida uma dispersão contendo o peptídio ou a proteína.

[00153] No caso de usar um peptídio marcado com fluorescência OVA257-264-Rh, a preparação foi feita usando 140 pg do peptídio marcado com fluorescência por 1000 nmol da substância anfipática, e no caso de usar β-gal, 1,4 mg de β-gal por 1000 nmol da substância anfipática foram usados para a preparação.

<Método de medição >

(Medição da transmitência) [00154] 250 pL de uma dispersão de veículo foram adicionados 250 pL de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7,4) para dar uma solução para medição. Usando UV-2450, a transmitência a 500 nm foi medida a uma temperatura normal.

(Medição do potencial zeta e do tamanho de partícula) [00155] Para a medição do potencial zeta, 20 a 50 pL de uma dispersão de veículo foram adicionados a 1,0 mL de um tampão Hepes (Hepes: 1,0 mM) cujo pH foi ajustado em 7,4 para dar uma solução para a medição. A medição foi feita várias vezes usando Nano ZS 90 e a média aritmética dos valores resultantes do potencial zeta foi calculada para obter o potencial zeta das partículas de veículo.

(Medição do tamanho de partícula e do índice de polidispersidade) [00156] Para a medição do tamanho de partícula e do índice de polidispersidade (PDI: índice de polidispersidade), uma quantidade apropriada de uma dispersão de veículo foi adicionado a um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7,4) para dar uma solução para medição. A medição foi feita várias vezes usando Nano ZS 90 e a média aritmética dos valores de Z médio (raio) obtidos por medição do espalhamento de luz dinâmico foi calculada e o dobro do seu valor foi

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53/86 considerado como o diâmetro (diâmetro ou tamanho de partícula). O valor do PDI foi determinado pela média aritmética dos valores de PDI obtidos por várias medições.

(Teste de lixiviação: medição de um vazamento (taxa de lixiviação)) [00157] O vazamento (taxa de lixiviação) foi determinado de acordo com o método descrito por K. Kono et al., Bioconjugate Chem., 2008 19 1040-1048 e avaliado usando um lipossoma de EYPC incluindo piranina servindo de substância fluorescente DPX servindo de extintor.

[00158] 3000 nmol de EYPC dissolvido em clorofórmio foram medidos e colocados em um balão no formato de berinjela de 10 mL e convertidos em uma película fina por meio de um evaporador giratório (BuCHI). 500 pL de uma solução de piranina (piranina: 35 mM, DPX: 50 mM, MES: 25 mM, pH 7,4) foram acrescentados, seguido de dispersão com o uso de de um irradiador ultrassônico (USC-J) e passagem através de uma película de policarbonato tendo um tamanho de poro de 100 nm pelo uso de uma extrusora para obter um tamanho de partícula uniforme. Usando um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH

7,4) e uma coluna G100, uma camada de água externa foi substituída para obter uma dispersão de lipossomas de EYPC incluindo a substância fluorescente. A concentração do grupo colina do fosfolipídio foi determinada por meio do teste do fosfolipídio C Wako e foi ajustado por meio de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM, pH 7,4) de maneira a obter 1,0 mmol/L do fosfolipídio.

[00159] 20 pL da dispersão de lipossomas de EYPC cuja concentração fora ajustada, e 20 pL de uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um veículo ou um composto sensível ao pH isoladamente, uma substância anfipática isoladamente e similares foram carregados em 2960 pL dos respectivos tampões MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM) que foram preparados de forma a ter pHs diferentes. Depois de incubação a 37^OC por 30 minutos ou 90 minutos

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54/86 (nos exemplos, estão mostrados os resultados de 90 minutos, a menos que indicado em contrário), as fluorescências a Ex 416 e Em 512 nm foram observadas com a ajuda do espectrofotômetro FP-6500 para monitorar o vazamento. Os DOPE-Chems e DOPE-ácido oleico foram, respectivamente, medidos em um tampão ácido acético (ácido acético: 25 mM, NaCl: 125 mM). Quanto às outras amostras, a medição em um pH de 4,0 a 3,0 foi feita usando-se um tampão ácido acético.

[00160] Será observado que o vazamento foi calculado de tal forma que no caso em que foi usada a dispersão de lipossomas de EYPC isoladamente, ele foi fixado em 0% e um valor obtido no caso em que foram adicionados 30 pL de um Triton-X100 diluído 1 para 10 ele foi fixado em 100%.

[00161] Mais particularmente, o vazamento foi calculado de acordo com a equação a seguir. Na equação que se segue, uma intensidade de fluorescência medida é representada por L, uma intensidade de fluorescência de uma dispersão isoladamente de lipossomas de EYPC incluindo uma substância fluorescente é representada por L0, e uma intensidade de fluorescência no caso em que Triton-X100 foi adicionado é representada por L100.

Fórmula Matemática 4

Vazamento (%) = (L - L0)/(L100 - L0) x 100 (Teste de fusão: medição da fusão (fusão de membranas)) [00162] A fusão (fusão de membranas) foi efetuada de acordo com o método descrito por K. Kono et al., Biomaterials 2008 29 4029-4036 e avaliada por meio de FRET (transferência de energia de ressonância por fluorescência). Para a marcação fluorescente, foram usados NBDPE e Rh-PE.

[00163] Uma película fina de EYPC (1000 nmol of EYPC) contendo 0,6% em mol de NBD-PE e Rh-PR em relação EYPC foi preparada e adicionada a 1 mL de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM,

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55/86 pH 7,4), seguido por dispersão com o uso de um irradiador ultrassônico (USC-J) e passagem através de uma película de policarbonato tendo um tamanho de poro de 100 nm por uma extrusora para obter uma dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla. 20 μΙ_ da dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla e 20 μ_ de uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um veículo ou um composto sensível ao pH isoladamente, um composto anfipático isoladamente e similares foram carregados em 2960 μ_ de tampões MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM) que foram ajustados em diferentes pHs e incubados a 37°C por 60 minutos, seguido por medição dos espectros fluorescentes a 500 nm - 620 nm por meio de luz de excitação de 450 nm com a ajuda de um espectrofotômetro (EP-6500) para obter uma relação de intensidade fluorescente entre 520 nm e 580 nm.

[00164] A taxa de fusão foi calculada de modo que a relação de intensidade fluorescente no caso em que foram incubadas a dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla obtida acima e uma substância anfipática foi fixada em 0% e a relação no caso em que a dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla e uma dispersão de um veículo sensível ao pH ou uma substância anfipática foram submetidas a tratamento a metanol foi fixada em 100%. O tratamento com metanol foi feito de tal maneira que tanto a dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla quanto uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um veículo sensível ao pH ou um composto sensível ao pH isoladamente, um composto anfipático isoladamente e similares foram dissolvidas em metanol e convertidas em uma película fina por meio de um evaporador giratório (BuCHI), seguido por dispersão usando 3,0 m_ de um tampão MES (MES: 25 mM, NaCl: 125 mM) e um irradiador ultrassônico (USCJ).

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56/86 [00165] Mais particularmente, a taxa de fusão foi calculada de acordo com a esquação que se segue. Será observado que na equação a seguir, uma relação de intensidade de fluorescência obtida por medição é representada por R, uma relação de intensidade de fluorescência obtida onde a dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla e uma substância anfipática foram incubadas é representada por R0 e uma relação de intensidade de fluorescência obtida onde a dispersão de lipossomas de EYPC marcados com fluorescência dupla e uma dispersão de amostra de avaliação tal como de um veículo, ou um composto sensível ao pH isoladamente, um composto anfipático isoladamente e similares foram submetidas a tratamento com metanol é representada por R100.

Fórmula Matemática 5

Taxa de fusão (%) = (R - R0)/(Ri00 - R0) x 100 (Confirmação da fusão de membranas contra membrana celular) [00166] Foi confirmado pelo uso de células HeLa que um veículo sensível ao pH induziu a fusão de membrana com uma membrana celular efetiva.

[00167] No dia anterior à administração de um veículo sensível ao pH, células HeLa foram espalhadas sobre um prato de matsunami com fundo de vidro e cultivadas com DMEM contendo 10% de FBS. Nesta oportunidade, a cultura foi efetuada com a ajuda de uma incubadora (MCO20AIC) configurada a 5% CO2 e 37°C. Depois da incubação, as células foram lavadas com DMEM contendo 10% de FBS. Em seguida, 2,0 mL de DMEM cujo pH fora ajustado em 7,4 por meio de uma solução aquosa de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico e que continha 25 mM de Hepes e 50 pM de difosfato de cloroquina foram adicionados às células, seguido por uma hora de pré-incubação.

[00168] Será observado que no caso em que o teste foi realizado em um pH de 5,3, 2,0 mL de DMEM cujo pH fora ajustado em 5,3 por meio

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57/86 de uma solução aquosa de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico e que continha 25 mM de MES e 50 μM de difosfato de cloroquina foram adicionados às células, seguido por uma hora de pré-incubação. [00169] Depois da pré-incubação, 100 μΙ_ de uma dispersão a 0,6% em mol, em relação a uma substância anfipática, de um veículo sensível ao pH marcado com fluorescência de Rh-PE foram adicionados a um meio ajustado em um pH dado, seguido por duas horas de incubação. As células foram enxaguadas três vezes com DMEM livre de vermelho de fenol e foram observadas através de um microscópio de fluorescência (Axiovert 200M-soft: Axio vision 3.0-fonte de luz: Fluo Arc). Deve ser observado que a intensidade de fluorescência das células foi avaliada com a ajuda de um citômetro de fluxo (Cytomics FC500, soft: CXP versão 2) depois que as células enxaguadas foram recolhidas com PBS contendo 0,025% em peso de tripsina e 0,01% em peso de EDTA. (Avaliação da distribuição citosólica usando um peptídio marcado com fluorescência) [00170] OVA-257-264-Rh foi escolhido como o peptídio modelo. Uma solução de 140 μg/ml de peptídio marcado com fluorescência foi preparada usando-se PBS passado por um filtro de 0,22 μm e usada para a preparação de um veículo. As células usadas foram células RAW, e a cultura foi feita usando-se uma incuborada (MCO20AIC) configurada a 5% CO2 e 37°C. As células RAW foram espalhadas sobre um prato de matsunami com fundo de vidro no dia anterior à carga do veículo e cultivadas em um meio MEM contendo 10% de FBS. Depois de enxaguar as células com PBS, o meio foi substituído por 1900 μ_ de um meio MEM contendo 10% de FBS fresco, no qual 100 μ_ das respectivas amostras foram carregados. A incubação continuou por 16 a 20 horas e as células foram enxaguadas pelo menos três vezes com PBS. Depois disso, 2 m_ de um meio MEM contendo 10% de FBS fresco foram adicionados, seguidos por três horas de pós-incubação. As

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58/86 células foram enxaguadas com PBS, seguido por substituição por um meio de vermelho de fenol sem DMEM e observação das células através de microscópio de fluorescência (Axiovert 200M -soft: Axio vision 3.0-fonte de luz: Fluo Arc).

(Distribuição citosólica de β-gal) [00171] Com PBS passado por um filtro de 0,22 pm, foi preparada uma solução de β-gal a 1,4 mg/mL. Uma película fina mista constituída de 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de ácido desoxicólico ou ácido ursodesoxicólico foi dispersada na solução de β-gal preparada dessa maneira para preparar um veículo contendo β-gal. No dia anterior à carga, as células RAW foram espalhadas sobre um prato de matsunami com fundo de vidro e cultivadas, as células foram enxaguadas com PBS imediatamente antes da carga. A cultura foi feita com o uso de uma incubadora (MCO 20 AIC) configurada a 5% CO2 e 37°C e um meio MEM contendo 10% de FBS. Depois de substituído por 1900 pL de um meio MEM contendo 10% de FBS fresco, 100 pL das respectivas amostras foram carregados, seguido por 16 a 20 horas de incubação. As células foram enxaguadas pelo menos três vezes com PBS. Depois disso eafter, 2 mL de um meio MEM contendo 10% de FBS fresco foram adicionados, seguido por três de pós-incubação. As células foram enxaguadas com PBS, seguido por coloração das células usando um kit de coloração de β-Galactosidase (adquirido na Takara Bio Inc.), e observação das células através de um microscópio (Axiovert 200M-soft: Axio vision 3.0). A coloração foi feita de acordo com a recomendação do kit.

(Avaliação da distribuição citosólica no caso em que um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa foram, respectivamente, usados independentemente) [00172] No dia anterior, células RAW foram espalhadas sobre um prato de matsunami com fundo de vidro e cultivadas com M EM contendo

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10% de FBS. Depois de enxaguadas com PBS, MEM foi adicionado, seguido por uma hora de incubação. 1900 μL de MEM contendo peptídio-FITC marcado com fluorescência ou OVA-FITC marcado com fluorescência a uma concentração de 30 μg/mL foram preparados e substituídos no lugar do meio de cultura. Além disso, uma solução de 100 μL de um veículo sensível ao pH foi adicionada, seguido por 16 a 20 horas de incubação no meio de cultura em um estado em que ambos foram misturados. Já foi confirmado que cada dentre o peptídio-FITC marcado com fluorescência e o OVA-FITC marcado com fluorescência não estavam suportados pelo veículo sensível ao pH em um estado misturado com uma solução contendo veículo sensível ao pH. Depois de enxaguadas com PBS e pós-incubadas por três horas com 2 mL de MEM fresco, as células foram enxaguadas com PBS, seguido por substituição por DMEM livre de vermelho de fenol e observação através de um microscópio de fluorescência. A cultura foi feita com o uso de uma incubadora (MCO20AIC) configurada a 5% CO2 e 37°C e as células foram observadas através de um microscópio de fluorescência (Axiovert 200M- soft: Axio vision 3.0- fonte de luz: Fluo Arc).

(1) Complexação de ácido desoxicólico [00173] Inicialmente, a complexação de ácido desoxicólico e de substâncias anfipáticas foi avaliada.

[00174] De acordo com a preparação do veículo sensível ao pH acima, películas finas misturas de 1000 nmol de EYPC ou DLPC e diferentes quantidades (0 a 6400 nmol) de ácido desoxicólico foram preparadas, e às mesmas 1 mL de um tampão MES with um pH de 7,4 foi adicionado e irradiado com ondas ultrassônicas, preparando assim dispersões complexadas de desoxicolato. Uma fotografia das dispersões contendo EYPC e ácido desoxicólico nas quais o ácido desoxicólico estava contido em diferentes quantidades está mostrada na FIG. 2A e uma fotografia das dispersões contendo DLPC e ácido

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60/86 desoxicólico nas quais o ácido desoxicólico estava contido em diferentes quantidades está mostrada na FIG. 2B. Será observado que as FIGS. 2A e 2B, respectivamente, mostram dispersões de 1000 nmol dos lipídios contendo, visto da esquerda para a direita, 0 nmol, 50 nmol, 100 nmol, 200 nmol, 400 nmol, 800 nmol, 1600 nmol, 3200 nmol e 6400 nmol de ácido desoxicólico. No lipídio de EYPC ou de DLPC, uma dispersão do lipídio isoladamente ficou turva, ao passo que as soluções de desoxilato complexado mostraram-se mais transparentes dependendo da quantidade de ácido sendo complexado.

[00175] A transmitância das respectivas dispersões a 500 nm foi medida, resultando em uma tendência semelhante àquela obtido por observação visual. A FIG. 2C mostra os resultados de medição de uma transmitância de dispersões contendo EYPC e ácido desoxicólico e a FIG. 2D mostra os resultados de medição de uma transmitância de dispersões contendo DLPC e ácido desoxicólico. Estes resultados sugerem a formação de complexos (produtos associados) de ácido desoxicólico e os lipídios. O complexo de ácido desoxicólico e um lipídio pode às vezes ser doravante denominado complexo de lipídiodesoxicolato.

[00176] Em seguida, o potencial zeta dessas dispersões foi verificado. Na FIG. 3, estão mostrados os resultados da medição de um potencial zeta de uma dispersão contendo EYP e ácido desoxicólico (i.e., complexo de EYPC-desoxicolato na figura) e uma dispersão contendo DLPC e ácido desoxicólico (i.e., complexo de DLPCdesoxicolato na figura) em relação à quantidade de ácido desoxicólico. Será observado que os resultados da FIG. 3 mostram um valor médio de cinco medições diferentes e ± é SD.

[00177] Os dois tipos de dispersões tiveram os valores negativamente diminuídos em associação com a complexação de ácido desoxicólico. Isto significa a complexação de ácido desoxicólico tendo

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61/86 uma carga negativa com o lipídio e indica a formação de um complexo misto de ácido desoxicólico e lipídio. No caso em qualquer um dos lipídios foi usado, o potencial zeta mostrou um valor de cerca de -30 mV em uma quantidade de 1600 nmol de ácido desoxicólico sendo complexado e o valor do potencial zeta não diminuiu significativamente em quantidades maiores usadas para a complexação. Assim sendo, considerou-se que ácido desoxicólico é complexado de maneira a cobrir substancialmente a superfície do complexo resultante com o mesmo na quantidade indicada acima.

(2) Estrutura dos complexos [00178] De acordo com a preparação do veículo sensível ao pH, um teste de retenção da substância fluorescente (um teste de dispersão de uma película fina usando uma solução de piranina) do complexo preparado a partir de 1600 nmol de ácido desoxicólico em relação a 1000 nmol de DLPC foi realizado, revelando que a substância fluorescente não ficou retida no complexo. Como o complexo não conseguir reter a substância fluorescente, foi sugerido que o complexo não tinha uma estrutura oca, mas que tinha uma forma micelar (dados não mostrados).

[00179] Em seguida, o tamanho de partícula de diferentes tipos de complexos obtidos de acordo com a preparação do veículo sensível ao pH foi medido. Os resultados da medição do tamanho de partícula pelo método de espalhamento de luz dinâmico revelou que o tamanho de partícula (diâmetro) do complexo de EYPC-desoxicolato (EYPC:ácido desoxicólico = 1000 nmol:1600 nmol) era cerca de 73 nm e o tamanho de partícula (diâmetro) do complexo de DLPC-desoxicolato (DLPC:ácido desoxicólico = 1000 nmol:1600 nmol) era cerca de 43 nm (Tabela 1). Os índices de polidispersidade (PDI) desses complexos apresentaram, respectivamente, valores tão baixos quanto 0,26 e 0,07, demonstrando que os complexos de ácido desoxicólico e os lipídios

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62/86 estavam na forma de partículas uniformes e pequenas, respectivamente.

Tabela 1. Tamanho de partícula e PDIs

	Diâmetro (nm)	PDI
EYPC apenas	411 ± 10,6	0,48 ± 0,03
DLPC apenas	306 ± 5,6	0,47 ± 0,03
EYPC-desoxicolato	73,1 ± 0,5	0,26 ± 0,01
DLPC-desoxicolato	43,1 ± 0,5	0,07 ± 0,01

Cada um dos valores é o valor médio de cinco medições diferentes, e ± indica SD.

EYPC apenas: EYPC isoladamente DLPC apenas: DLPC isoladamente EYPC-desoxicolato: Complexo de EYPC-desoxicolato DLPC-ácido desoxicólico: complexo de DLPC-desoxicolato [0157] (3) Sensibilidade ao pH (T este de lixiviação) [00180] As sensibilidades ao pH do EYPC isoladamente, DLPC isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPCácido de desoxicolato foram verificadas. O teste foi realizado de tal maneira que um complexo foi preparado de acordo com o método de preparação de veículo acima usando 1000 nmol de um lipídio (EYPC ou DLPC) e 1600 nmol de ácido desoxicólico, seguido por incubação com lipossoma de EYPC que é um modelo de membrana biológica de acordo com o método acima para o teste de lixiviação (a menos que indicado em contrário, o teste de lixiviação foi um teste resultante de 90 minutos de incubação neste caso e sempre que aparecer daqui em diante). A FIG. 4 mostra os resultados de medição de the vazamentos de EYPC isoladamente, DLPC isoladamente, ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato em

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63/86 pHs de 7,4, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 e 4,5. Os gráficos na FIG. 4 são, respectivamente, um valor médio de três medições diferentes, e ± é SD. [00181] EYPC isoladamente, DLPC isoladamente e o complexo de

EYPC-desoxicolato não provocaram o vazamento da substância fluorescente em nenhum dos pHs de 7,4 a 4,5 e, portanto, não apresentaram sensibilidade ao pH, ao passo que o complexo de DLPCdesoxicolato causou um grau de vazamento maior que o ácido desoxicólico isoladamente em um pH de no máximo 6,5. Portanto, ficou claro que o complexo de DLPC-desoxicolato desenvolveu um efeito promotor da função disruptiva de membranas sensível ao pH.

[00182] De acordo com este teste, foi revelado que seria possível obter complexos obtidos a partir das combinações de ácido desoxicólico e tipos apropriados de substância anfipáticas e capazes de desenvolver a função em resposta a um ambiente fracamente ácido. O pH para o desenvolvimento do efeito foi no máximo 6,5 e estava em uma faixa de pH suficiente para uso prático. Como não foi causada qualquer vazamento em um pH no ambiente fisiológico, a sensibilidade ao pH era tal que a função ficou bem controlada de forma on-off.

(T este de fusão de membranas) [00183] Para distribuir uma substância fisiologicamente ativa para o citosol, é desejável que se tenha a função de fusão de membranas em um ambiente fracamente ácido. De acordo com o método para o teste de fusão de membranas acima, uma lipossoma de EYPC marcado com fluorescência dupla e o veículo (complexo) preparado usando 1000 nmol de um lipídio (EYPC ou DLPC) e 1600 nmol de ácido desoxicólico foram submetidos a 60 minutos de incubação a 37°C em diferentes pHs para verificar a fusão de ambos. (A) da FIG. 5 é um gráfico mostrando relações de intensidade de fluorescência de EYPC isoladamente, DLPC isoladamente, ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPCdesoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato em pHs de 7,4, 6,5, 6,0,

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5,5, 5,0 e 4,5. (B) da FIG. 5 é um gráfico mostrando, nos mesmos pHs indicados acima, taxas de fusão de ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato. A taxa de fusão de 0% é uma relação de intensidade de fluorescência no caso em que DLPC isoladamente ou EYPC isoladamente foi adicionado ao lipossoma marcado com fluorescência dupla e 100% indica um valor obtido submetendo-se as respectivas amostras a tratamento com metanol. O valor de ácido desoxicólico isoladamente foi calculado usando um valor do lipossoma marcado com fluorescência dupla fixado em 0% e um valor de EYPC-ácido desoxicólico tratado com metanol fixado em 100%. Será observado que os gráficos em (A) e (B) da FIG. 5 são, cada um deles, um valor médio de três medições diferentes, e ± é SD.

[00184] Pelos resultados de (A) da FIG. 5, podemos ver que o complexo de DLPC-desoxicolato aumentou a relação de intensidade de fluorescência associada à diminuição do pH e causou a fusão com o lipossoma de EYPC marcado com fluorescência dupla. A avaliação dessas taxas de fusão revelou que o complexo de DLPC-desoxicolato desenvolveu de um efeito promotor da função de fusão de membranas em um ambiente fracamente ácido ((B) da FIG. 5). O complexo de DLPC-desoxicolato desenvolveu tanto o efeito promotor da função disruptiva de membranas quanto o efeito promotor da função de fusão de membranas. Com isto em mente, considerou-se que ambos os efeitos são derivados do mesmo fenômeno, com a possibilidade de que um veículo capaz de desenvolver o efeito promotor da função disruptiva de membranas também desenvolve o efeito promotor da função de fusão de membranas.

[00185] Será observado que a relação de intensidade de fluorescência em um pH de 5,0 indicou um valor de cerca de 80% da amostra submetida a tratamento com metanol ((A) da FIG. 5). A amostra

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65/86 tratada com metanol está em um estado de fusão completa entre o lipossoma de EYPC marcado com fluorescência dupla e o veículo, sugerindo que o lipossoma de EYPC do modelo de membrana biológica e o veículo preparado foram fundidos com alta eficiência. Dessa forma, podemos esperar a distribuição altamente eficiente de uma substância fisiologicamente ativa.

(4) Comparção com lipossomas sensíveis ao pH comuns [00186] Para confirmar o grau de sensibilidade ao pH e a resistência à lixiviação, em comparação com lipossomas de DOPE-Chems (DOPE:Chems = 3:2 (relação molar)) e lipossomas de DOPE-ácido oleico (DOPE:ácido oleico = 7:3 (relação molar)), ambos sendo bastante conhecidos como um lipossoma sensível ao pH, foi feito o teste de lixiviação. Uma dispersão contendo um lipossoma de DOPE-Chems ou um lipossoma de DOPE-ácido oleico em uma quantidade correspondente a 20 nmol de DOPE foi usada para medição. A FIG. 6 é um gráfico mostrando os vazamentos do lipossoma de DOPE-Chems, lipossoma de DOPE-ácido oleico e complexo de DLPC-desoxicolato em diferentes pHs. Os gráficos da FIG. 6 são, cada uma deles, uma média de três medições e ± é SD.

[00187] Quanto ao lipossoma de DOPE-Chems liposome e o lipossoma de DOPE-ácido oleico, o vazamento começou a ocorrer em um não maior que 6,0 e um vazamento de 20 a 30%, que foi o valor máximo, foi indicado em um pH de 3,5. Por outro lado, o veículo sensível ao pH (complexo de DLPC-desoxicolato) começou a induzir vazamento a partir de um pH de 6,5 e foi obtido um vazamento de mais de 60%.

[00188] O vazamento do complexo de DLPC-desoxicolato foi maior que aqueles dos lipossomas sensíveis ao pH existentes, revelando que o veículo sensível ao pH (complexo de DLPC-desoxicolato) da invenção tem um forte efeito de instabilizar e romper a membrana. Foi mostrado que o pH no qual o efeito é desenvolvido está mais próximo do pH neutro

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66/86 e, portanto, o veículo é altamente sensível a um ambiente fracamente ácido.

(5) Investigação da quantidade complexante de ácido desoxicólico [00189] Para verificar a quantidade complexante de ácido desoxicólico necessária para o desenvolvimento do efeito, diferentes quantidades de ácido desoxicólico foram usadas para a preparação dos veículos sensíveis ao pH para avaliar o desenvolvimento do efeito promotor da função de fusão de membranas de acordo com o teste de fusão de membranas. A medição foi repetida três vezes para calcular o valor médio e o SD. O valor do ácido desoxicólico isoladamente foi calculado usando um valor de um complexo de EYPC-desoxicolato tratado com metanol.

[00190] (A) e (B) da FIG. 7, respectivamente, mostram uma taxa de fusão de cada um dentre ácido desoxicólico isoladamente, complexo de EYPC-desoxicolato e complexo de DLPC-desoxicolato em relação à quantidade de ácido desoxicólico.

[00191] A partir de (A) e (B) da FIG. 7, foi revelado que os veículos preparados exibem um valor mais alto que o ácido desoxicólico isoladamente em uma quantidade complexante de no mínimo 100 nmol e são capazes desenvolver o efeito promotor da função de fusão de membranas. Foi também revelado que o desenvolvimento do efeito promotor da função de fusão de membranas pode ser obtido por complexação de 100 a 6400 nmol de ácido desoxicólico com 1000 nmol do lipídio.

[00192] Será observado que a taxa de fusão do complexo de EYPCdesoxicolato tem substancialmente o mesmo valor que aquele com ácido desoxicólico isoladamente, mostrando assim que o complexo de EPYC-desoxicolato nunca adquiriu o efeito promotor da função de fusão de membranas como resultado da complexação com o composto sensível ao pH.

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67/86 (6) Influência da estrutura do lipídio [00193] Pela investigação acima, ficou claro que quando ácido desoxicólico e um tipo apropriado de lipídio (substância anfipática) são combinados, é possível obter um veículo que é capaz de desenvolver o efeito promotor da função disruptiva de membranas e o efeito promotor da função de fusão de membranas em um ambiente fracamente ácido. Com o propósito de esclarecer qual o tipo de lipídio capaz de produzir essas propriedades, inúmeros veículos foram preparados usando lipídios tendo diversas estruturas e submetidos ao teste de lixiviação ou ao teste de fusão de membranas.

[00194] Quanto à estrutura do lipídio, as influências de (A) o comprimento do grupo acila (10 a 18 átomos de carbono) das diacilfosfatidilcolinas e (B) a ligação insaturado do grupo acil das diacilfosfatidilcolinas foram verificados. Os respectivos veículos foram preparados usando 1000 nmol de lipídios e 1600 nmol de ácido desoxicólico. A medição foi repetida três vezes, e o valor médio e o SD foram, respectivamente, calculados. Será observado que o número de átomos de carbono de substância anfipática significa o número de átomos de carbono de uma porção ácido graxo (grupo acil) que funciona como o sítio hidrofóbico da substância anfipática.

[00195] (A) da FIG. 8 mostra uma taxa de fusão de cada um dentre ácido desoxicólico isoladamente, complexo de DSPC-desoxicolato, complexo de DPPC-desoxicolato, complexo de DMPC-desoxicolato, complexo de DLPC-desoxicolato e complexo de DDPC-desoxicolato. (B) da FIG. 8 mostra uma taxa de fusão de cada um dentre ácido desoxicólico isoladamente, complexo de HSPC-desoxicolato, complexo de DOPC-desoxicolato e complexo de POPC-desoxicolato.

[00196] A partir de (A) da FIG. 8, podemos ver que os veículos usando DSPC, DPPC e DMPC têm valores similares ao ácido desoxicólico isoladamente e nenhum efeito foi mostrado, ao passo que

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DLPC e DDPC mostraram o efeito. Considerou-se que o comprimento de carbonos dos lipídios usados tem influência e o desenvolvimento do efeito é obtido quando usam-se lipídios tendo um comprimento de carbonos pequeno. É provável que um lipídio tendo comprimento de carbonos pequeno gere um flip flop, isto é, o movimento de inversão da molécula na membrana, e considerou-se que esta natureza influencia o desenvolvimento.

[00197] Quanto à influência da ligação insaturada, os veículos usando POPC tendo uma ligação insaturada e DOPC tendo duas ligações insaturadas na cadeia com 18 átomos de carbono não desenvolveram qualquer efeito ((B) da FIG. 8). Assim sendo, foi mostrado que a ligação insaturada não apresenta influência considerável sobre o desenvolvimento do efeito.

[00198] Em seguida, a influência da estrutura da cabeça do lipídio sobre o desenvolvimento do efeito foi verificada. Veículos foram preparados usando 1000 nmol de lipídios e 1600 nmol de ácido desoxicólico, respectivamente. A medição foi repetida três vezes, e a partir daí foram calculados o valor médio e o SD, respectivamente.

[00199] (A) da FIG. 9 é um gráfico mostrando o vazamento de cada um dentre ácido desoxicólico isoladamente, DLPE isoladamente, DMPE isoladamente, DSPE isoladamente e DOPE isoladamente, e (B) da FIG. 9 é um gráfico mostrando o vazamento de cada um dentre ácido desoxicólico isoladamente, complexo de DLPE-desoxicolato, complexo de DMPE-desoxicolato, complexo de DSPE-desoxicolato e complexo de DOPE-desoxicolato.

[00200] Nenhum dos lipídios tendo PE resultou no desenvolvimento do efeito, revelando que o grupo colina é preferido como a estrutura da cabeça ((A) e (B) da FIG. 9).

[00201] Pelos resultados acima, ficou demonstrado que para uma substância anfipática capaz de produzir o desenvolvimento do efeito, é

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69/86 preferível usar lipídios insaturados ou saturados tendo um grupo colina como a estrutura da cabeça e tendo uma cadeia de 10 a 12 átomos de carbono.

(7) Investigação de outros tipos de substância anfipáticas [00202] Substâncias diferentes de lipídios foram utilizadas para a distribuição da substância fisiologicamente ativa. Além disso, sabemos que o ácido desoxicólico forma complexos com substâncias hidrofóbicas diferentes de lipídios, com a possibilidade de obter veículos com funções quando associados com uma variedade de substâncias. Para tanto, diversas substâncias e ácido desoxicólico foram complexados para preparar veículos, que foram avaliados pelo teste de lixiviação. Como o ácido desoxicólico isoladamente provoca um vazamento crescente pela ação de sua atividade superficial, o rastreamento foi realizado de tal maneira que uma substância que é capaz de produzir o desenvolvimento do efeito é definida de forma a satisfazer ambas as exigências: (1) no teste de lixiviação, um vazamento em um pH dado inferior ao pH fisiológico aumenta em relação a um vazamento no pH fisiológico e o incremento de aumento é maior que o incremento de aumento obtido no caso em que um composto sensível ao pH isoladamente é usado para o teste; e (2) em um teste de lixiviação em um pH dado inferior ao pH fisiológico, o vazamento no momento em que um complexo (veículo sensível ao pH) é formado a partir de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática é maior que a soma do vazamento do composto sensível ao pH isoladamente e do vazamento da substância anfipática isoladamente.

[00203] Será observado que satisfazer os itens (1) e (2) acima significa satisfazer as duas relações a seguir de vazamento Lc de um veículo sensível ao pH (complexo de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática), La do composto sensível ao pH

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70/86 isoladamente e Lb da substância anfipática. Mais particularmente, (1) acima é representado pela fórmula (1) a seguir, e (2) acima é representado pela fórmula (2) a seguir. Nas fórmulas que se seguem, os vazamentos em um pH de 7,4 estão, respectivamente, representados por Lc7,4, La7,4 e Lb7,4, e os vazamentos em um pH de 5,0 ou 4,5 estão, respectivamente, representados por Lcx, Lax e Lbx.

[Fórmula Matemática 6]

Fórmula (1) Δ = (Lcx - Lc7,4) - (Lax - La7,4) > 0

Fórmula (2) Δ = Lcx - (Lax + Lbx) > 0 [00204] Os resultados estão mostrados nas Tabelas 2 a 7. Será observado que os valores respectivos indicados nas Tabelas 2 a 7 são um valor médio de três medições e ± é SD.

[00205] Além disso, 1600 nmol (663 pg) de ácido desoxicólico e diferentes pesos de materiais macromoleculares foram usasdos para preparar partículas, seguido por avaliação da ocorrência de vazamento em um pH de 5,0. Na FIG. 10, estão mostrados os resultados do vazamento dos complexos de ácido desoxicólico e materiais macromoleculares em um pH de 5,0. Será observado que os valores na FIG. 10 são os valores de uma medição, respectivamente.

Tabela 2. Avaliação funcional de partículas Tabela 3. Avaliação funcional de partículas preparadas preparadas usando uma variedade de substâncias usando uma variedade de substâncias anfipáticas anfipáticas

Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)	Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)
Desoxicolato apenas pH			Oleo de rícino
7,4	1,0 ± 0,2		pH 7,4	2,2 ± 0,4	4,4 ± 0,6
pH 5,0	14,6 ± 0,6		pH 5,0	14,5 ± 0,2	7,3 ± 0,3
Tween 20 pH 7,4	61,5 ± 2,1	59,5 ± 1,8	PEG 10- óleo de rícino pH 7,4
pH 5,0	80,2 ± 3,4	61,9 ± 0,5	pH 5,0	2,3 ± 0,3	1,2 ± 0,7
				26,0 ± 0,4	3,4 ± 0,6
Tween 40 pH 7,4	8,9 ± 0,2	7,9 ± 0,5	PEG 10- óleo de rícino
pH 5,0	40,0 ± 0,3	9,8 ± 0,7	endurecido
			pH 7,4
Tween 60 pH 7,4	2,9 ± 0,1	2,4 ± 0,2	pH 5,0	0,7 ± 0,4	0,3 ± 0,2
pH 5,0	29,6 ± 0,5	6,3 ± 0,2		14,6 ± 1,1	2,9 ± 0,2
			PEG40- óleo de rícino
Tween 80 pH 7,4	7,0 ± 0,8	7,3 ± 0,1	endurecido pH 7,4
pH 5,0	35,7 ± 1,0	10,8 ± 0,4	pH 5,0	0,1 ± 0,1	0,6 ± 0,3
				6,0 ± 0,5	3,1 ± 0,5
Tween 65 pH 7,4	7,5 ± 0,4	7,1 ± 0,7	PEG60- óleo de rícino
pH 5,0	16,4 ± 0,6	8,3 ± 0,7	endurecido

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Tween 85 pH 7,4	5,8 ± 0,2	5,1 ± 0,7
pH 5,0	15,1 ± 0,6	6,3 ± 0,2
PEG 20 estearil éter pH 7,4
pH 5,0	69,5 ± 3,8	70,3 ± 2,2
	78,3 ± 0,7	72,0 ± 3,1
PEG 23 lauril éter pH 7,4
pH 5,0
	2,9 ± 0,2	2,0 ± 0,1
	13,3 ± 0,4	4,7 ± 0,6

pH 7,4
pH 5,0	1,0 ± 0,6	0,7 ± 0,6
	5,3 ± 0,8	2,5 ± 0,6
SPAN 20 pH 7,4
pH 5,0	4,9 ± 0,3	5,7 ± 0,7
	21,0 ± 0,6	10,1 ± 0,4
SPAN 40 pH 7,4 pH 5,0	24,0 ± 1,9	14,9 ± 0,8
	50,4 ± 3,7	20,8 ± 1,4
SPAN 60 pH 7,4
pH 5,0	5,1 ± 0,4	7,9 ± 0,3
	36,0 ± 1,4	17,5 ± 0,4
SPAN 80 pH 7,4
pH 5,0	3,9 ± 0,1	5,1 ± 0,5
	27,8 ± 0,7	10,0 ± 0,7

Tabela 4. Avaliação funcional de partículas preparadas usando uma variedade de substâncias anfipáticas

Tabela 5. Avaliação funcional de partículas preparadas usando uma variedade de substâncias anfipáticas

Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)	Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)
Etil oleato pH 7,4	4,6 ± 0,3	7,9 ± 0,2	SPAN 65 pH 7,4	3,0 ± 0,2	4,2 ± 0,4
pH 5,0	22,1 ± 0,1	11,2 ± 1,3	pH 5,0	46,6 ± 1,5	13,0 ± 0,3
Etil octanoato pH 7,4	3,0 ± 0,3	9,0 ± 1,0	SPAN 85 pH 7,4	7,0 ± 0,6	5,2 ± 0,4
pH 5,0	19,3 ± 1,2	11,1 ± 1,1	pH 5,0	78,7 ± 1,2	17,7 ± 1,2
Etil laurato pH 7,4	5,0 ± 0,5	8,7 ± 0,9	1-Butanol pH 7,4	2,7 ± 0,7	8,8 ± 0,1
pH 5,0	23,2 ± 5,5	11,9 ± 1,2	pH 5,0	18,6 ± 0,7	11,1 ± 0,5
L-fenil- pH 7,4	3,4 ± 0,5	7,9 ± 0,5	1-Octanol pH 7,4	3,0 ± 0,7	9,0 ± 0,3
alanina pH 5,0	18,8 ± 1,0	10,7 ± 0,4	pH 5,0	19,2 ± 1,2	11,7 ± 0,1
L-Leucina pH 7,4	1,2 ± 0,8	7,3 ± 0,2	1-Dodecanol pH 7,4	2,7 ± 0,7	7,9 ± 0,2
pH 5,0	17,6 ± 0,5	13,2 ± 3,7	pH 5,0	14,1 ± 0,6	9,1 ± 0,8
L-Histidina pH 7,4	0,5 ± 0,1	6,7 ± 0,4	1-Hexa- dodecanol pH 7,4	6,9 ± 0,3	9,0 ± 0,9
pH 5,0	15,2 ± 0,9	8,9 ± 0,5	pH 5,0	24,0 ± 1,0	11,0 ± 0,5
Óleo de soja pH 7,4	2,1 ± 0,3	7,2 ± 0,1	1-Eicosanol pH 7,4	2,8 ± 0,3	7,6 ± 0,4
pH 5,0	17,6 ± 0,3	9,3 ± 0,2	pH 5,0	20,8 ± 2,1	8,6 ± 0,5
Tricaproína pH 7,4	3,0 ± 0,9	6,9 ± 0,9	Ácido láurico pH 7,4	1,8 ± 0,2	6,2 ± 0,4
pH 5,0	17,6 ± 3,4	8,4 ± 0,9	pH 5,0	17,0 ± 1,0	14,2 ± 0,4
Tricaprilina pH 7,4	1,6 ± 0,4	6,8 ± 0,9	Ácido oleico pH 7,4	4,0 ± 0,5	2,2 ± 0,1
pH 5,0	16,4 ± 1,9	9,0 ± 1,1	pH 5,0	87,2 ± 5,9	76,0 ± 2,3

Tabela 6. Avaliação funcional de partículas preparadas usando uma variedade de substâncias

Tabela 7. Avaliação funcional de partículas preparadas usando uma variedade de anfipáticas substâncias anfipáticas

Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)	Material hidrofóbico	Partícula complexada com desoxicolato Vazamento (%)	Material hidrofóbico apenas Vazamento (%)
Benzil benzoato pH 7,4	0,6 ± 0,1	7,3 ± 2,0	Monocaprina pH 7,4	1,2 ± 0,6	4,0 ± 2,6
pH 5,0	11,8 ± 1,0	9,7 ± 0,5	pH 5,0	13,9 ± 0,8	8,1 ± 0,2
Propil para- oxibenzoato pH 7,4			Monocaprilina pH 7,4	0,8 ± 0,5	4,9 ± 1,8
pH 5,0	0,5 ± 0,1	5,4 ± 0,2	pH 5,0	14,6 ± 0,7	8,5 ± 0,4
	14,0 ± 0,4	7,9 ± 0,1
Ascorbil palmitato			Monolaurina pH 7,4	3,1 ± 0,5	3,6 ± 0,3
pH 7,4			pH 5,0	14,3 ± 0,6	5,6 ± 0,4
pH 5,0	0,5 ± 0,4	1,7 ± 0,1
	11,7 ± 0,7	9,9 ± 1,0	Monomiristina pH 7,4	4,0 ± 0,6	3,8 ± 0,3
Ciclo- dextrina			pH 5,0	13,5 ± 0,4	5,4 ± 0,1

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pH 7,4
pH 5,0	1,6 ± 0,2	6,3 ± 0,6	Monopalmitina pH 7,4	6,9 ± 0,6	7,8 ± 2,5
	16,4 ± 0,9	9,0 ± 0,7	pH 5,0	19,3 ± 0,4	8,1 ± 0,7
Colesterol pH 7,4
pH 5,0	1,9 ± 0,2	4,8 ± 0,1	Monoestearina pH 7,4	7,0 ± 0,6	7,9 ± 1,0
	15,0 ± 0,2	7,6 ± 0,5	pH 5,0	23,8 ± 0,8	9,6 ± 0,6
Lactose pH 7,4
pH 5,0	1,3 ± 0,1	6,1 ± 0,2	Mono-oleína pH 7,4	38,4 ± 3,0	6,3 ± 0,4
	18,3 ± 0,4	8,9 ± 0,2	pH 5,0	71,3 ± 2,1	8,3 ± 0,4
Esqualeno pH 7,4
pH 5,0	1,3 ± 0,2	5,4 ± 0,4	Glicerol diestearato pH 7,4	6,2 ± 0,3	8,0 ± 0,2
	18,6 ± 1,4	9,0 ± 0,5	pH 5,0	28,4 ± 1,6	11,0 ± 1,4
Esqualano pH 7,4
pH 5,0	0,9 ± 0,2	7,8 ± 0,6	Glicerol dioleato pH 7,4	8,0 ± 0,4	7,2 ± 0,5
	20,9 ± 0,7	9,4 ± 0,5	pH 5,0	24,1 ± 0,7	7,4 ± 0,6
α-Tocoferol pH 7,4
pH 5,0	5,7 ± 0,8	5,4 ± 0,2	α,α-Dilaurina pH 7,4	11,0 ± 1,6	7,6 ± 1,0
	39,5 ± 6,4	8,8 ± 0,6	pH 5,0	25,3 ± 1,1	7,4 ± 0,6
Acetato de α-Tocoferol pH 7,4
pH 5,0
	1,0 ± 0,3	5,9 ± 0,2
	18,0 ± 1,0	7,0 ± 2,1

[00206] Pela investigação acima, ficou demonstrado que as substâncias apropriadas são aquelas incluindo: Tween 20, Tween 40, Tween 60 e Tween 80, que são ésteres de ácidos monograxos com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono; SPAN 40, SPAN 60, SPAN 80, SPAN 65 e SPAN 85, que são ésteres de ácidos graxos com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono; derivados de glicerol tais como glicol mono-oleato (mono-oleína na tabela), glicerol diestearato, glicerol dioleato e glicerol dilaurato (α,α-ilaurina); PEG-10óleo de rícino que é óleo de rícino com polioxietileno; e «-tocoferol. Será observado que o número de átomos de carbono de substância anfipática significa o número de átomos de carbono de uma porção ácido graxo (grupo acila) que funciona como o sítio hidrofóbico da substância anfipática.

(8) Investigação da proporção de substância anfipática [00207] A investigação do item (7) acima revelou substâncias anfipáticas que são capazes de provocar o desenvolvimento do efeito e substâncias que não capazes disso. Em seguida, foi verificado qual a proporção de uma tal capaz de provocar o desenvolvimento do efeito seria necessária para realizar o desenvolvimento do efeito. EYPC foi escolhido como uma substância que não provoca o desenvolvimento do efeito e DLPC ou SPAN 85 foi misturado com EYPC em diferentes

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73/86 proporções para perfazer um total de 1000 nmol e veículos feitos de uma pluralidade de substâncias anfipáticas foram preparados.

[00208] DLPC ou SPAN 85 foi misturado com EYPC em diferentes proporções para perfazer um total de 1000 nmol, seguido por complexação com 1600 nmol de ácido desoxicólico para preparar veículos. Os respectivos veículos foram submetidos a um teste de lixiviação em pHs de 7,4 e 5,0 para verificar o desenvolvimento do efeito. [00209] A FIG. 11 mostra o vazamento de cada um dos complexos de EYPC, ácido desoxicólico e DLPC ou SPAN 85 em um pH de 7,4 em (A) e em um pH de 5,0 em (B). Os respectivos valores em (A) e (B) da FIG. 11 são o valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

[00210] Quando a proporção de DLPC ou SPAN 85:EYPC (mol:mol) variou dentro da faixa de 100:150 a 100:0, o vazamento sensível ao pH foi confirmado ((A) e (B) da FIG. 11). Foi, portanto, revelado que para obter um veículo sensível ao pH capaz de desenvolver o efeito em um ambiente fracamente ácido como resultado de complexação com ácido desoxicólico, era necessário que a proporção de um tipo apropriado de substância anfipática estivesse dentro da faixa indicada acima.

(9) Busca de compostos sensíveis ao pH que não ácido desoxicólico [00211] Pelos resultados acima, constata-se que o ácido desoxicólico afetou o estado da associação hidrofóbica em um ambiente fracamente ácido. Assim sendo, esperam-se que moléculas tendo estruturas análogas àquela do ácido desoxicólico likewise também proporcionem um veículo sensível ao pH. Então, seleciona-se, como uma molécula análoga ao ácido desoxicólico, vários ácidos biliares, ácido glicirrízico e ácido glicirretínico, seguido pela realização de um teste de lixiviação e de um teste de fusão de membranas dos complexos dos ácidos acima e DLPC para verificar se eles poderiam ser utilizados como um composto sensível ao pH.

[00212] 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de vários ácidos (doravante

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74/86 denominados compostos candidatos) foram usados para preparar veículos.

[00213] A FIG. 12 mostra vazamentos de complexos de DLPC e uma variedade de compostos candidatos em um pH de 7,4 em (A) e um pH de 5,0 em (B). Os respectivos valores na FIG. 12 são o valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

[00214] Na FIG. 13, encontra-se um gráfico mostrando vazamentos de complexos de DLPC e uma variedade de compostos candidatos em diferentes pHs. Os respectivos valores na FIG. 13 são o valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

[00215] A FIG. 14 mostra as taxas de fusão de (A) uma variedade de compostos sensíveis ao pH isoladamente e (B) complexos de DLPC e uma variedade de compostos sensíveis ao pH em um pH de 7,4 e um pH de 5,0. Os respectivos valores são o valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

[00216] Os veículos preparados a partir de todos os compostos candidatos não causaram vazamento em um pH de 7,4, ao passo que em um pH de 5,0, os veículos preparados usando ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido biliar C27 (ácido tri-hidroxicolestanoico), ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico e ácido glicirretínico causaram um vazamento significativamente maior que aquele com os casos nos quais foram adicionados os compostos candidatos isoladamente, dessa forma mostrando um efeito promotor da função disruptiva de membranas ((A) e (B) da FIG. 12). Ficou confirmado que esses veículos também têm um efeito de promover a função de fusão de membranas sensíveis ao pH ((A) e (B) da FIG. 14). Tendo em vista os resultados mostrados em (A) e (B) da FIG. 5, foi mostrado que os veículos da invenção desenvolveram o efeito de promover a função de fusão junto com o efeito promotor da função disruptiva de membranas.

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75/86 [00217] Quando verifica-se o perfil do pH desses veículos, constatase que o pH no qual o vazamento começou diferia dependendo do tipo de molécula usada (FIG. 13). A hipótese é que o pKa difere e a maneira de formar associação com uma substância anfipática difere, ambos dependendo do tipo de molécula. Esses resultados revelam que é possível selecionar em detalhes um pH no qual o efeito se desenvolve. Por conseguinte, espera-se que seja possível definir em detalhes a distribuição in vivo e a distribuição intracelular. De acordo com este teste, ficou claro que esses veículos sensíveis ao pH tinham seus efeitos em um pH de 7 a 3.

(10) Investigação das combinações de compostos sensíveis ao pH e substâncias anfipáticas [00217] A presença ou ausência do desenvolvimento do efeito foi confirmada e verificada para muitas combinações dos compostos (compostos sensíveis ao pH) tendo estruturas análogas àquela do ácido desoxicólico e determinadas em (A) e (B) da FIG. 12, FIG. 13, e (A) e (B) da FIG. 14 para produzir o desenvolvimento do efeito e as substância anfipáticas determinadas pelo rastreamento mostrados nas Tabelas 2 a 7 e na FIG. 10 para produzir o desenvolvimento do efeito.

[00218] Veículos foram preparados usando 1000 nmol de uma substância anfipática e 100 nmol de um composto sensível ao pH, ou 1000 nmol de uma substância anfipática e 6400 nmol de um composto sensível ao pH. Nas Tabelas 8 e 9, estão mostrados os resultados do teste de lixiviação de uma variedade de complexos de compostos sensíveis ao pH e substâncias anfipáticas.

Tabela 8. Avaliação de veículos funcionais obtidos por combinações de compostos sensíveis ao pH (100 nmol) e substâncias anfipáticas (1000 nmol) (teste de lixiviação) (n = 1 no teste)

Ácido	Ácido	Ácido	Ácido	Ácido	Ácido	Ácido
desoxicólic	cólico	ursodesoxi	chenoxicóli	hiodesoxic	glicodesoxi	glicirrízico
o		cólico	co	ólico	cólico

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	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’
DLPC	1,3	3,1	1,4	2,8	1,2	2,3	3,6	3,8	0,9	1,1	1,0	0,1	4,9	3,9
DDPC	49,4	45,9	12,8	7,7	9,4	5,3	51,2	47,7	27,8	23,8	12,6	8,7	58,6	42,9
Tween 20	1,3	13,8	2,9	14,4	2,8	21,5	5,2	20,7	5,3	13,5	2,0	7,6	12,8	17,5
Tween 40	1,3	10,8	3,0	10,0	2,1	8,0	1,8	8,0	1,3	4,4	0,6	5,4	5,0	7,9
Tween 60	2,1	4,9	2,2	4,3	2,5	4,0	2,4	4,3	0,6	2,5	1,2	3,4	6,9	4,9
Tween 80	1,0	6,4	1,7	6,8	2,3	1,7	2,1	3,5	1,2	1,9	1,2	4,2	11,7	5,5
PEG 10 óleo de rícino	1,0	3,4	2,9	2,9	3,7	4,4	2,2	5,4	1,5	2,3	0,9	2,0	3,6	11,0
SPAN 40	7,5	16,7	7,5	18,7	6,4	16,9	7,8	17,3	3,8	7,2	7,3	12,3	3,0	6,8
SPAN 60	12,6	15,8	18,4	15,5	11,9	15,2	14,1	13,4	10,4	11,4	13,6	13,5	3,7	8,1
SPAN 80	8,8	13,1	6,0	5,6	1,5	3,4	3,0	5,5	2,8	3,3	18,6	22,9	3,9	10,0
SPAN 65	3,3	3,1	4,4	3,9	16,2	13,6	6,7	6,3	12,8	11,0	4,4	1,5	2,4	0,8
SPAN 85	10,4	10,4	6,4	6,2	4,2	5,1	5,6	7,0	2,9	3,6	1,3	2,9	1,5	2,8
a-Tocofero l	10,4	23,5	4,0	20,2	3,1	4,5	3,3	6,3	1,7	4,3	1,7	5,1	2,1	4,8
Monooleína	4,0	4,6	2,8	3,7	1,8	3,3	2,4	3,4	0,4	2,0	11,6	17,0	3,5	2,8
Glicerol diestearato	2,5	4,6	2,4	4,1	3,2	4,7	2,9	4,8	3,2	3,9	4,2	3,0	1,8	2,6
Glicerol dioleato	5,0	4,9	3,0	4,4	2,1	3,5	3,4	3,5	2,6	1,5	3,8	3,0	3,7	2,6
a,a- dilaurina	4,1	10,2	3,6	5,9	1,5	3,2	2,3	3,1	1,2	0,6	3,8	4,8	2,0	1,4

Δ - (Lc4,5 — Lc7,4) — (La4,5 — La?,4)

Δ’ - Lc4,5 — (La4,5 + Lb4,5)

LCpH: um vazamento da complexo de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática em um pH dado

LapH: um vazamento de um composto sensível ao pH isoladamente em um pH dado

LbpH: um vazamento de uma substância anfipática em um pH dado

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Tabela 9. Avaliação de veículos funcionais obtidos por combinações de compostos sensíveis ao pH (6400 nmol) e substâncias anfipáticas (1000 nmol) (teste de lixiviação) (n = 1 no teste)

	Ácido desoxicólic o	Ácido cólico	Ácido ursodesoxi cólico	Ácido Chenoxicól ico	Ácido hiodesoxic ólico	Ácido glicodesoxi cólico	Ácido glicirrízico
	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’	Δ	Δ’
DLPC	71,5	80,4	44,3	49,3	64,2	57,8	46,2	62,0	8,0	11,7	49,9	52,2	62,5	61,0
DDPC	25,2	54,4	34,1	67,1	35,5	60,9	*5,3	9,9	34,3	63,9	41,7	64,7	43,4	66,6
Tween 20	2,5	21,6	7,2	14,2	16,8	22,6	*3,7	17,6	16,9	32,8	9,0	28,0	15,0	26,8
Tween 40	47,8	51,9	16,3	27,3	46,5	45,3	14,7	57,8	70,4	78,0	5,5	16,6	31,9	36,6
Tween 60	65,2	67,6	3,0	7,2	46,9	43,2	31,2	59,2	85,1	90,8	4,3	7,8	55,2	57,1
Tween 80	58,0	63,4	10,6	16,9	50,6	43,3	22,9	52,4	77,2	83,5	8,6	15,0	49,4	49,6
PEG 10 óleo de rícino	74,1	77,3	4,5	12,8	12,6	7,4	36,3	56,5	57,5	61,6	4,9	7,6	24,7	24,0
SPAN 40	75,1	70,2	13,5	40,2	8,6	3,5	38,9	52,3	2,2	13,9	16,7	11,0	4,4	6,7
SPAN 60	74,9	70,0	34,1	39,9	16,5	6,3	33,8	47,5	7,5	10,5	13,1	8,0	8,3	3,1
SPAN 80	72,8	71,7	31,2	60,2	9,2	2,4	32,0	47,0	25,9	27,2	6,2	2,0	6,6	4,0
SPAN 65	72,6	66,1	33,8	35,7	38,0	24,6	27,3	49,2	6,7	4,3	12,5	6,3	17,4	8,3
SPAN 85	73,8	70,9	48,2	56,6	13,1	4,5	31,9	43,4	33,0	33,5	6,6	2,9	22,8	16,9
a-Tocofero l	69,8	69,0	7,9	27,2	5,0	1,1	6,2	16,0	22,4	22,7	5,7	2,2	7,1	7,0
Monooleína	40,7	59,0	31,0	39,5	9,7	2,4	16,9	42,8	34,7	37,4	2,0	11,3	8,2	36,7
Glicerol diestearato	78,1	73,3	10,9	18,2	22,0	14,0	32,3	57,5	3,9	7,4	6,2	1,4	49,0	42,2
Glicerol dioleato	75,6	72,4	8,4	28,6	11,8	2,0	31,3	41,0	29,7	30,0	10,5	6,0	6,5	1,3
a,a- dilaurina	61,7	61,0	15,9	42,7	12,7	2,3	29,5	43,3	38,8	44,2	16,7	18,9	50,6	57,9

Δ = (Lc4,5 — Lc7,4) — (La4,5 — La?,4)

Δ’ - Lc4,5 — (La4,5 + Lb4,5)

LcpH: um vazamento de um complexo de um composto sensível ao pH e uma substância anfipática em um pH dado

LapH: um vazamento de um composto sensível ao pH isoladamente em um pH dado

LbpH: um vazamento de uma substância anfipática em um pH dado

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Para as combinações assinaladas com *, estão mostrados os resultados do teste baseado em 30 minutos de incubação.

[00219] A partir das Tabelas 8 e 9, constata-se que para qualquer uma das combinações, Δ e Δ’, que são índices para ter um efeito significativo, proporcionam valores positivos, respectivamente, os veículos obtidos a partir das combinações das Tabelas 8 e 9 têm uma função sensível ao pH.

(11) Confirmação da fusão de membranas contra membrana celular [00220] Pelos resultados dos itens (3), (5), (6), (9) acima e similares, ficou mostrado que o veículo sensível ao pH da invenção desenvolve o efeito promotor da função disruptiva de membranas e o efeito promotor da função de fusão de membranas em um ambiente fracamente ácido. A fusão entre um veículo sensível ao pH e uma membrana celular foi efetivamente confirmada. Mais detalhadamente, um veículo sensível ao pH marcado com fluorescência e células HeLa foram submetidos a uma incubação de curto prazo em meios com o pH ajustado em pHs de 7,4 e 5,3, respectivamente, e coloração de uma membrana da superfície celular foi observada confirmando assim a fusão entre o veículo sensível ao pH e a membrana celular.

[00221] Como resultado, a fluorescência foi observada como um ponto de origem ou em uma região próxima ao núcleo em um pH de 7,4 ((A) da FIG. 15). Isto indica que o veículo sensível ao pH é absorvido pelas células e existe no endossoma e no lisossoma. Será observada uma imagem similar àquela observada no caso de uma substância anfipática marcada com fluorescência isoladamente (dados não mostrados).

[00222] Por outro lado, foi observada uma imagem na qual o formato da fluorescência e o formato da célula coincidiam um com outro em todo o campo visual em um pH de 5,3 ((B) da FIG. 15). A hipótese é que o veículo sensível ao pH marcado com fluorescência sofreu fusão de

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79/86 membrana com a membrana celular sobre a superfície celular, para o qual a fluorescência espalhou-se na forma de células.

[00223] Pelos resutlados acima, foi revelado que o veículo sensível ao pH desenvolve um efeito promotor da função de fusão de membranas em um ambiente fracamente ácido no meio e sofre fusão de membrana com a membrana celular sobre a superfície celular.

[00224] Quando a intensidade de fluorescência da célula foi avaliada por meio de um citômetro de fluxo, as células incubadas mostraram uma grande intensidade de fluorescência em um pH de 5,3 ((C) da FIG. 15). Considerou-se que os resultados dependem do veículo sensível ao pH marcado com fluorescência que sofre fusão de membrana em grandes quantidades. Assim sendo, foi mostrado que o veículo sensível ao pH é capaz de sofrer fusão de membrana com uma membrana celular verdadeira de maneira eficiente.

(12) Influência da incorporação de um peptídio e uma proteína sobre o desenvolvimento do efeito [00225] Foi investigada a incorporação de um peptídio ou de uma proteína tendo atividade biológica através de associação hidrofóbica para uso como DDS. Este parece ser um método promissor do presente veículo. Por conseguinte, as influências da incorporação de substâncias fisiologiacamente ativas sobre o desenvolvimento do efeito do veículo foram verificadas usando OVA 257-264 (SIINFEKL, adquirida na PH Japan) como um peptídio modelo e OVA (adquirida na Sigma-Aldrich Co. LLC.) como uma proteína modelo.

[00226] Inicialmente, para avaliar a incorporação da substância fisiologicamente ativa, o tamanho de partícula e o índice de polidispersidade (PDI) de um veículo onde o peptídio ou a proteína (192 pg) fora incorporado em um complexo de DLPC-desoxicolato (1000 nmol:1600 nmol) foram medidos (Tabela 10).

[00227] Em seguida, os vazamentos dos veículos incorporados com

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80/86 diferentes quantidades de peptídio (A) ou proteína (B) em relação a 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de ácido de desoxicolato foram determinados. Na FIG. 16, os resultados dos vazamentos dos veículos contendo (A) peptídio e (B) proteína em pHs de 7,4 e 5,0 estão mostrados. Os valores na FIG. 16 são cada um deles um valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

[00228] Além disso, a taxa de fusão de cada um dos veículos incorporados com 768 pg do peptídio ou da proteína em relação a 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de (A) ácido desoxicólico ou (B) ácido ursodesoxicólico foi verificada. Na FIG. 17, estão mostrados os resultados das taxas de fusão de (A) ácido desoxicólico e (B) ácido ursodesoxicólico em pHs de 7,4 e 5,0. Os valores em (A) e (B) da FIG. 17 são cada um deles um valor médio de três medições diferentes e ± é SD.

Tabela 10. Tamanho de partícula e PDIs.

	Diâmetro (nm)	PDI
DLPC-deóxi
Micelle apenas	43,3 ± 0,3	0,09 ± 0,01
Peptídio	56,0 ± 0,9	0,21 ± 0,01
OVA-proteína	71,6 ± 0,5	0,04 ± 0,02

O valor é uma média do resultado de cinco medições e ± é SD. Micela apenas: complexo de DLPC-desoxicolato isoladamente Peptídio: complexo de DLPC-desoxicolato contendo peptídio

Proteína OVA: complexo de DLPC-desoxicolato contendo OVA [00229] A incorporação do peptídio ou proteína no veículo teve a tendência de aumentar ligeiramente o tamanho de partícula do veículo (Tabela 10). Por conseguinte, foi sugerido que essas substâncias fossem incorporadas no veículo. Por outro lado, quanto ao vazamento sendo causado, os valores foram os mesmos que aqueles obtidos sem a incorporação em qualquer quantidade que fosse do peptídio ou

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81/86 proteína ((A) e (B) da FIG. 16) e foi mostrando que não foi causado qualquer redução do efeito do veículo devido à incorporação do peptídio ou proteína.

[00230] Com relação aos resultados do teste de fusão, resultados similares foram obtidos ((A) e (B) da FIG. 17). A partir desses resultados, foi revelado que a incorporação de uma substância fisiologicamente ativa não afeta consideravelmente o desenvolvimento do efeito do veículo.

(13) Distribuição para o citosol 1 [00231] Muitos relatos foram feitos sobre veículos, os quais possuem as propriedades de promover a fusão de membranas e o rompimento de membranas em um ambiente fracamente ácido e o que permite que uma substância incluída ou incorporada seja distribuída via um endossoma para um citosol. Fez-se uma tentativa de distribuir uma substância fisiologicamente ativa para o citosol usando um veículo sensível ao pH formulado.

[00232] Um veículo foi preparado usando 140 pg/mL de umpeptídio marcado com fluorescência solution em relação 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de ácido desoxicólico ou ácido ursodesoxicólico. Para controle, um veículo foi preparado usando 140 pg/mL de uma solução de peptídio marcado com fluorescência em relação a 1000 nmol de DLPC.

[00233] Na FIG. 18, mostram-se uma fotografia de (A) uma solução de um peptídio marcado com fluorescência isoladamente, (B) uma solução de DLPC isoladamente contendo um peptídio marcado com fluorescência, (C) uma solução de um complexo de DLPC-desoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, e (D) uma solução de um complexo de DLPC-ursodesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência.

[00234] A solução (B) do DLPC contendo um peptídio marcado com

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82/86 fluorescência, a solução (C) do complexo de DLPC-desoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, e a solução (D) do complexo de DLPC-ursodesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência ficaram fracamente fluorescentes em relação à solução (A) do peptídio marcado com fluorescência isoladamente. Isto de deve ao fato de o peptídio marcado com fluorescência ser fixado aos domínios hidrofóbicos do veículo, sugerindo assim que o peptídio marcado com fluorescência é incorporado no veículo.

[00235] Em seguida, tenta-se a distribuição de um peptídio marcado com fluorescência para o citosol. Mais particularmente, 100 pL de cada uma das amostras contendo um peptídio marcado com fluorescência (A) a (D) acima (14 pg do peptídio marcado com fluorescência/poço) foram administrados a células RAW cultivadas em 1900 pL de um meio MEM contendo 10% a FBS e absorvidos por uma noite. As células foram enxaguadas e submetidas a três horas de pós-incubação, seguido por observação das células em um microscópio de fluorescência.

[00236] Na FIG. 19, mostram-se microfotografias da fluorescência de (A) o peptídio marcado com fluorescência isoladamente, (B) o DLPC isoladamente contendo um peptídio marcado com fluorescência, e (C) o complexo de DLPC-desoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência. Na FIG. 20, mostram-se (A) uma microfotografia e (B) uma microfotografia da fluorescência do complexo de DLPCdesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência, e (C) a microfotografia e (D) uma microfotografia da fluorescência do complexo de DLPC-ursodesoxicolato contendo um peptídio marcado com fluorescência.

[00237] No caso do peptídio marcado com fluorescência isoladamente (A) ou do DLPC isoladamente contendo um peptídio marcado com fluorescência, a maior parte da fluorescência pode ser vista como um ponto de origem, indicado que o peptídio marcado com

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83/86 fluorescência ficou no endossoma ((A) e (B) da FIG. 19).

[00238] Por outro lado, no caso do complexo de DLPC-desoxicolato (C) incorporado com um peptídio marcado com fluorescência, a fluorescência foi confirmada em substancialmente todas as células em todo o citosol, indicando que o peptídio marcado com fluorescência escapou do endossoma e migrou para o citosol ((C) da FIG. 19). Como o veículo estava carregado negativamente e a pós-incubação foi feita por três horas, foi difícil considerar que esta fluorescência é uma imagem obtida por adsorção do veículo em toda a superfície da célula, mas considerou-se que o peptídio marcado com fluorescência é distribuído para o citosol via o endossoma.

[00239] Para o veículo preparado usando ácido ursodesoxicólico, a fluorescência foi observada em todo o citosol como no caso do ácido desoxicólico, e uma distribuição citosólica eficiente foi confirmada ((C) e (D) da FIG. 20).

[00240] Pelo acima exposto, foi mostrado que os veículos sensíveis ao pH da invenção possibilitam uma distribuição citosólica eficiente de uma substância fisiologicamente ativa.

(14) Distribuição para o citosol 2 [00241] Subsequentemente, tenta-se distribuir uma proteína para um citosol. β-gal foi escolhida como a proteína modelo e incorporada em um veículo sensível ao pH. A distribuição para o citosol foi avaliada por visualização da atividade enzimática depois da aplicação a células RAW e comparação das atividades.

[00242] Veículos foram preparados usando 1,4 mg/mL de uma solução de β-gal em relação a 1000 nmol de DLPC e 1600 nmol de ácido desoxicólico ou ácido ursodesoxicólico.

[00243] Na FIG. 21, mostramse microfotografias de (A) β-gal isoladamente, (B) um complexo de DLPC-desoxicolato contendo β-gal e (C) um contendo complexo de DLPC-ursodesoxicolato β-gal.

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84/86 [00244] As células às quais β—gal isoladamente fora acrescentada não ficaram coloridas ((A) da FIG. 21). Isto deve-se ao fato de a β—gal ser decomposta no endossoma, indicando que não ocorre migração para o citosol. Por outro lado, no caso da incorporação nos veículos sensíveis ao pH, uma coloração azul com β—gal foi confirmada ((B) e (C) da FIG. 21), indicando que a β—gal escapou do endossoma e migrou para o citosol mantendo a atividade enzimática. Segundo Vincent M. Rotello et al., J. Am. Chem. Soc. 2010 132(8) 2642-2645, uma experiência semelhante foi conduzida com a finalidade de observar a distribuição citosólica da β—gal e resultados similares aos da literatura acima foram obtidos, suportando assim a discussão acima.

(15) Distribuição para o citosol 3 [00245] Nos itens (13) e (14) acima, a distribuição de uma substância fisiologicamente ativa suportada por um veículo sensível ao pH para o citosol foi confirmada. Em seguida, fez-se uma tentativa de distribuição para o citosol quando um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa foram, respectivamente, usados independentemente. Onde um veículo sensível ao pH e uma substância fisiologicamente ativa foram fixados no mesmo endossoma, o endossoma sofreu rompimento de membrana pelo efeito promotor da função disruptiva de membranas do veículo sensível ao pH. Nesta oportunidade, considerou-se que a substância fisiologicamente ativa misturada no endossoma é lixiviada para fora do endossoma e pode ser distribuída para o citosol.

[00246] No caso em que o peptídio-FITC marcado com fluorescência foi acrescentado a células RAW e também no caso em que OVA-FITC marcado com fluorescência foi acrescentado a células RAW, a fluorescência na célula foi confirmada como um ponto de origem, indicado que o peptídio-FITC marcado com fluorescência e o OVA-FITC marcado com fluorescência, respectivamente, continuam no

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85/86 endossoma ((A) e (B) da FIG. 22A).

[00247] Em seguida, o complexo de EYPC-desoxicolato, no qual a função promotora de rompimento de membranas e a função promotora de fusão de membranas não foram observadas nos itens (3) e (5) acima, foi usado em combinação com o peptídio-FITC marcado com fluorescência ou com o OVA-FITC marcado com fluorescência. Mais particularmente, uma solução de complexo de EYPC-desoxicolato foi ainda adicionada a uma solução de cultura de células RAW contendo o peptídio-FITC marcado com fluorescência. Separadamente, uma solução de complexo de EYPC-desoxicolato foi ainda adicionada a uma solução de cultura de células RAW contendo o OVA-FITC marcado com fluorescência. Nestes casos, a fluorescência nas células foi confirmada como um ponto de origem como no caso acima, indicado que o peptídioFITC marcado com fluorescência e o OVA-FITC marcado com fluorescência, respectivamente, continuavam no endossoma ((C) e (D) da FIG. 22A).

[00248] Em seguida, um veículo sensível ao pH foi usado em combinação com o peptídio-FITC marcado com fluorescência ou o OVAFITC marcado com fluorescência. Mais particularmente, uma solução de um veículo sensível ao pH tendo um efeito promotor da função disruptiva de membranas foi ainda adicionada a uma solução de cultura de células RAW contendo o peptídio-FITC marcado com fluorescência. Além disso, uma solução de um veículo sensível ao pH tendo um efeito promotor da função disruptiva de membranas foi ainda adicionada a uma solução de cultura de células RAW contendo o OVA-FITC marcado com fluorescência. Para o veículo sensível ao pH, foram usados complexo de DLPC-desoxicolato, complexo de SPAN 80-desoxicolato, complexo de DDPC-desoxicolato, complexo de óleo de rícino com polioxietileno (PEG-10 óleo de rícino)-desoxicolato, complexo de Tween 20-desoxicolato, complexo de Tween 80-desoxicolato, complexo

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86/86 de α-tocoferol-desoxicolato, complexo de DLPC-ursodesoxicolato, complexo de DLPC-ácido glicirrízico, complexo de DLPCchenodesoxicolato, complexo de DLPC-hiodesoxicolato, e complexo de DLPC-glicodesoxicolato. Os respectivos veículos sensíveis ao pH foram preparados usando 160 nmol de um composto sensível ao pH e 100 nmol de uma substância anfipática. Nestes casos, a fluorescência foi percebida em todo o citosol ((E) a (J) da FIG. 22A, (K) a (T) da FIG. 22B, e (U) a (AB) da FIG. 22C). Assim sendo, mostra-se que mesmo quando uma substância fisiologicamente ativa foi usada independentemente dos veículos sensíveis ao pH tendo um efeito promotor da função disruptiva de membranas (não suportados), a distribuição para o citosol foi possível.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Veículo sensível ao pH que é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas, caracterizado por compreender:

pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido trihidroxicolestanóico (ácido biliar C27), ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos; e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste:

- em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono no grupo acila, selecionada de didecanoilfosfatidilcolina e dilauroilfosfatidilcolina;

- um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, em que o referido número de carbonos significa um o número de átomos de carbono de uma porção de ácido graxo;

- um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono no grupo acila, selecionados de éster de [acido monopalmítico sorbitano (monopalmitato sorbitano), éster de ácido monoesterárico sorbitano (monoestearato sorbitano), éster de ácido monooleico sorbitano (monooleato de sorbitano), éster de ácido tripalmítico sorbitano (tripalmitato sorbitano), éster de ácido triesteárico sorbitano (triesterato sorbitano) e éster de ácido trioleico sorbitano (trioleato sorbitano);

- glicerol mono-oleat-o;

- glicerol dilaurato;

- glicerol diestearato;

- glicerol dioleato;

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2/4

- óleo de rícino com polioxietileno; e

- α-tocoferol;

em que o composto sent[ivel a pH está presente em uma quantidade de não menos uqe 10 moles por 100 moles da substância anfipática.

2. Veículo sensível ao pH de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto sensível ao pH e a substância anfipática formam partículas micelares.
3. Veículo sensível ao pH de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tamanho de partícula varia de 10 a 200 nm.
4. Veículo sensível ao pH de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que um vazamento do composto sensível ao pH isoladamente em um teste de vazamento é representado por La, um vazamento da substância anfipática isoladamente é representado por Lb, um vazamento do veículo sensível ao pH é representado por Lc, vazamentos em um pH de 7,4, respectivamente, são representados por Lc?,4, La?,4 e Lb?,4, e vazamentos em um pH de 5,0 ou 4,5, respectivamente, são representados por Lcx, Lax e Lbx, Δ representado pela fórmula (1) a seguir não é menor que 5 e Δ' representado pela fórmula (2) a seguir não é menor que 5.

Fórmula Matemática 1

Equação (1) Δ = (Lcx - Lc?,4) - (Lax - La?,4)

Equação (2) Δ' = Lcx - (Lax + Lbx)
5. Droga sensível ao pH, caracterizada pelo fato de que o veículo sensível ao pH como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, suporta uma substância fisiologiacamente ativa com o mesmo.
6. Droga sensível ao pH de acordo com a reivindicação 5,

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3/4 caracterizada pelo fato de que substância fisiologicamente ativa é feita de uma proteína ou de um peptídio.
7. Composição medicamentosa sensível ao pH caracterizado por compreender:

o veículo sensível ao pH como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e uma substância fisiologicamente ativa, em que o veículo sensível ao pH e a substância fisiologicamente ativa são respectivamente misturadas independentemente.
8. Composição medicamentosa sensível ao pH de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida substância fisiologicamente ativa é feita de uma proteína ou de um peptídio.
9. Método para preparar um veículo sensível ao pH que é capaz de desenvolver um efeito promotor da função disruptiva de membranas, caracterizado por compreender uma etapa de associar pelo menos um composto sensível ao pH selecionado do grupo que consiste em ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico, ácido trihidroxicolestanóico (ácido biliar C27), ácido glicodesoxicólico, ácido glicirrízico, ácido glicirretínico e sais dos mesmos, e pelo menos uma substância anfipática selecionada do grupo que consiste em:

- em uma fosfatidilcolina tendo 10 a 12 átomos de carbono no grupo acila, selecionada de didecanoilfosfatidilcolina e dilauroilfosfatidilcolina;

- um éster de ácido monograxo com polioxietileno sorbitano tendo 12 a 18 átomos de carbono, em que o referido número de

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4/4 carbonos significa um o número de átomos de carbono de uma porção de ácido graxo;

- um éster de ácido graxo com sorbitano tendo 16 a 18 átomos de carbono no grupo acila, selecionados de éster de [acido monopalmítico sorbitano (monopalmitato sorbitano), éster de ácido monoesterárico sorbitano (monoestearato sorbitano), éster de ácido monooleico sorbitano (monooleato de sorbitano), éster de ácido tripalmítico sorbitano (tripalmitato sorbitano), éster de ácido triesteárico sorbitano (triesterato sorbitano) e éster de ácido trioleico sorbitano (trioleato sorbitano);

- glicerol mono-oleat-o;

- glicerol dilaurato;

- glicerol diestearato;

- glicerol dioleato;

- óleo de rícino com polioxietileno; e

- a-tocoferol;

em que o composto sent[ivel a pH está presente em uma quantidade de não menos uqe 10 moles por 100 moles da substância anfipática.
10. Método de cultura caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultivar células em um meio contendoa droga sensível ao pH como definido na reivindicação 5 ou 6, e/ou a composição medicamentosa sensível ao pH como definido na reivindicação 7 ou 8.