CN115003293A - 细胞摄取 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括向所述人体或动物体施用治疗性化合物，其中：a.所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸，并且b.任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用，c.在所述方法中，所述胆汁酸或其盐和EDTA用于实现或增强所述治疗性化合物的细胞内摄取。

Description

细胞摄取
技术领域
本发明涉及将材料引入生物细胞，特别是肠细胞内部的方法。所述方法适用于将包括大分子如蛋白质在内的治疗性化合物递送到细胞中，并且可用于涉及使用治疗性化合物在进入细胞内环境后发挥治疗作用的疾病治疗中。
背景技术
以下对背景技术的论述仅旨在促进对本发明的理解。该论述并不是认为或承认所提及的任何材料截至申请的优先权日为止是或曾经是公知常识的一部分。
由于有着显而易见的医学应用，所以促进治疗性化合物摄取到细胞中一直是重大科学兴趣的焦点。已经考虑了各种不同的方法，但所涉及的挑战意味着仍然非常需要改进的方法来实现这一目标。
因此，生物细胞具有许多特定的机制来调节材料摄取到其内部，最常见的是通过嵌入其表面膜中的结构选择性受体的作用。然而，一般地说，细胞结构被设计成将亲水分子排除在细胞内部之外，因为包裹所有哺乳动物细胞的磷脂膜本质上是可防止水溶性分子通过的疏水屏障。对于大分子尤其如此，近年来很大一部分的药物研究致力于促进大分子进入细胞。
细胞内摄取显然可用于引入在细胞内发挥有益作用的治疗性化合物，如在例如基因疗法或酶替代疗法中。基因疗法提供了通过在细胞内产生治疗性蛋白质来治疗疾病的希望。因此，对于用于基因疗法中的核酸分子，靶位点大多位于细胞内、细胞质或细胞核中，因此分子必须穿过质膜才能到达它们。然而，大多数遗传分子既大又带电，这使得它们难以自行穿过质膜，因此，需要适当的基因递送系统来实现有效的细胞摄取。合成或非病毒的基因递送系统可以规避与病毒载体相关的一些问题，如非特异性炎症和意外的免疫反应。此外，非病毒载体具有使用简单和易于大规模生产的优势。然而，相对较低的效率是非病毒载体的主要缺点，并且正在努力解决这个问题。
在迄今已开发的旨在将材料引入生物细胞内部的各种方法中，其中一种方法涉及降低治疗性化合物的极性或亲水性的目的，例如通过将它与亲脂部分复合。因此，可以通过将DNA与阳离子脂质如lipofectin静电结合来增强DNA的摄取(Felgner PL(1991)Cationicliposome-mediated transfection with lipofectinTM reagent.Methods Mol Biol 7:81-9)。然而，这类方法效率低，并且在阳离子脂质的情况下，取决于细胞类型和试剂密度，会观察到高水平的细胞毒性，这使得这项技术不适合体内使用。还出现了稳定性和缺乏可重复性的问题。对于某些蛋白质分子，可以通过将蛋白质与长链烃化学缀合来实现类似的作用，不过这样的程序可能会导致相关蛋白质的免疫原性增强。
已考虑的另一种方法特别适用于当治疗性化合物是大分子时，所述方法将它包封在微粒载体如脂质体中，然后可以容易地被吞噬细胞吸收。这项技术用作治疗高雪氏病(Gaucher’s disease)(葡萄糖脑苷脂酶的遗传缺陷)的潜在方法取得了一些成功，其中这种酶被掺入脂质体中并递送到缺乏分解葡萄糖基神经酰胺能力的细胞中(Belchetz PE,Crawley JC,Braidman IP,Gregoriadis G(1977)Treatment of Gaucher's disease withliposome-entrapped glucocerebroside:beta-glucosidase.Lancet.16；2(8029):116-7)。最近，用β-半乳糖苷酶(Umezawa F,Eto Y,Tokoro T,Ito F,Maekawa K.Enzymereplacement with liposomes containing beta-galactosidase from Charonia lumpasin murine globoid cell leukodystrophy(twitcher)Biochem Biophys ResCommun.1985年3月15日；127(2):663-7)和转谷氨酰胺酶(Aufenvenne K,FernandoLarcher,Ingrid Hausser,Blanca Duarte,Vinzenz Oji,Heike Nikolenko,Marcela DelRio,Margitta Dathe and Heiko Traupe(2013)Topical Enzyme-Replacement TherapyRestores Transglutaminase 1Activity and Corrects Architecture ofTransglutaminase-1-Deficient Skin Grafts The American Journal of HumanGenetics 93,620-630,2013年10月3日)进行了类似的工作。这种方法最适合表现出显著的吞噬活性的细胞。对于其它细胞类型，可以通过将聚乙二醇脂质和靶特异性抗体掺入外膜中来促进特异性靶向。虽然这可以确保囊泡与膜的外表面结合，但不能保证内化。
当治疗性化合物是蛋白质时，另一种方法也适用，它是将感兴趣的蛋白质与配体缀合，该配体可以与受体分子特异性相互作用，从而促进肽的内化。这种方法的实例是免疫毒素，其中通过与靶向肿瘤特异性抗体的抗体分子连接来增强蓖麻毒素A链内化到肿瘤中(ML Grossbard,JG Gribben,AS Freedman,JM Lambert,J Kinsella,SN Rabinowe,LEliseo,JA Taylor,WA Blattler和CL Epstein(1993)Adjuvant Immunotoxin TherapyWith Anti-B4-Blocked Ricin After Autologous Bone Marrow Transplantation forPatients With B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma Blood 81 2263-2271；以及AntignaniA和FitzGerald D.(2013)Immunotoxins:The Role of the Toxin Toxins 5 1486-1502)。相思子毒素(Abrin)已出于相同的目的而用于免疫毒素中(Gadadhar S,Karande AA(2013)Abrin Immunotoxin:Targeted Cytotoxicity and Intracellular TraffickingPathway.PLoS ONE 8(3):e58304)。然而，这种方法只适用于效力非常高的剂，因为大分子与抗体的比率约为1:1。
至于其它可能的方法，一些方法已经从以下立场开始：已经描述了允许小分子(如通过蛋白水解形成的蛋白质的降解产物)以选择性方式穿过肠细胞的许多途径。因此，已经考虑了一些方法，其中治疗性化合物如大分子可以与这样的小分子缀合，然后这些小分子可以被相关受体识别，从而可以将缀合物整体拉过膜。这些利用细胞表面特定受体的途径包括如用于维生素B12或生物素(利用二肽基受体)的维生素摄取途径，以及涉及缀合胆汁盐受体的途径。
在二肽基受体的情况下，受体密度会受到环境条件的影响，并且以相对较低的速度起作用，因为这些维生素的总体每日需求量较低，因此，递送的材料量是有限的。
相比之下，对于胆汁盐受体，每天可以内化数十克的材料。因此，被开发作为递送机制的潜力是巨大的，并且已经描述了其中化合物(待递送的)连接到胆汁盐的方法，并且显示增强所得缀合物摄取到细胞中。通常，与胆汁酸连接的分子是小的低分子量的实体，尽管某些肽也声称取得了有限的成功(参见例如US7153930)。在这方面，一般的想法是胆汁盐需要呈单体形式(即，不与其它胆汁盐分子缔合)才能与相关受体结合，并且治疗性化合物必须与胆汁盐共价结合。实际上，鉴于胆汁盐与其受体之间的结合是通过非共价相互作用发生的，通常预期单个胆汁盐分子太小而不能通过非共价相互作用与治疗性化合物相互作用。
发明内容
本发明涉及一种促进化合物的细胞内摄取的新方法。本发明基于以下惊人的发现，即某些胆汁酸和/或其药学上可接受的盐(本文也称为“胆汁酸/胆汁盐”)可以与细胞表面上的受体相互作用(有趣的是，仅两种特定的未缀合的胆汁酸/胆汁盐(即，鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸以及它们盐)可见这种作用-缀合胆汁酸/胆汁盐或实际上其它未缀合的胆汁酸/胆汁盐未见这种作用)。在这方面，可以设想胆汁盐，特别是当呈胶束形式时，可以一次与多于一种受体相互作用，并且在膜表面上引起的受体聚集触发了膜内陷和内化(例如，尤其是受体和胶束)，即细胞内从细胞外摄取材料。本发明涉及利用这一新发现的途径来促进材料摄取到细胞中，特别是通过刺激囊泡形成的过程。
优选地，在本文所述的本发明的方法中，胆汁酸或胆汁盐受体介导的通过网格蛋白包被小窝的内化用于实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取。因此，胆汁酸/胆汁盐与细胞表面受体相互作用的机制可以触发内化过程，该过程可用于实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取，治疗性化合物甚至可以是大分子。关于这一点，在本发明的一个方面，治疗性化合物的细胞内摄取可以通过布置治疗性化合物与胆汁酸/胆汁盐同时足够靠近细胞表面来实现。因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，胆汁酸或胆汁盐受体介导的通过网格蛋白包被小窝的内化用于实现或增强位于细胞附近的一种或多种治疗性化合物的细胞内摄取(但不与胆汁酸/胆汁盐缀合)。该过程是依赖于浓度的，尽管胆汁酸或胆汁盐通常以相对较高的浓度使用，但在对细胞无毒的浓度下可以达到功效。荧光测试表明，胆汁酸或胆汁盐实现或增强甚至很大(大分子)的治疗性化合物的摄取，然后在细胞内的液泡中可见。测试还表明，包括网格蛋白抑制剂具有阻断胆汁酸或胆汁盐在细胞内的吸收增强作用的作用，这表明了胆汁酸或胆汁盐的作用机制是网格蛋白介导的内吞作用。
还发现EDTA对鹅脱氧胆酸盐刺激的蛋白质摄取具有额外的增强作用。出乎意料的是，虽然单独的EDTA在无毒浓度下对摄取没有影响，但它能够增强鹅脱氧胆酸盐的刺激作用，在某些情况下，即使在这两种剂以相同的浓度单独使用时没有观察到摄取，在那些剂联合使用时也观察到摄取。因此，EDTA似乎能够与鹅脱氧胆酸盐协同作用，增强肠细胞中蛋白质的摄取。这种现象似乎不太可能仅仅由螯合活性引起，因为已知其它剂，像EDTA一样，表现出螯合活性(例如DTPA、EGTA、邻菲咯啉)，但没有显示与EDTA相同的作用。本发明的另一个特征是包含鹅脱氧胆酸盐和EDTA的组合的制剂可用于增强肠细胞对蛋白质的摄取，并且这种组合可以提供比单独的鹅脱氧胆酸盐更有效的实现细胞摄取的方式。以这种方式，可影响由肠细胞屏障进行的摄取和通过肠细胞屏障，使得大分子引入体内，这是通过口服途径施用的结果。在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的EDTA的浓度范围可为0.1mg/ml至10mg/ml，优选0.2mg/ml至10mg/ml。
在本发明之前，据信不知道胆汁酸/胆汁盐会有助于大分子治疗性化合物的细胞内摄取。相反，通常认为，除非胆汁盐呈与治疗性化合物共价键合的单体形式，否则不会发生摄取。还认为，不知道受体可以与两种特定胆汁盐鹅脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐中的任何一种结合并被其激活。因此，科学文献中的理解是，这种未缀合的胆汁盐主要通过跨越肠细胞的细胞膜的被动扩散从肠腔吸收到体内，参见例如Trauner等人(Physiol Rev,第83卷,2003年4月)；Stamp等人(An Overview of Bile-Acid Synthesis,Chemistry andFunction,Issues in Toxicology,Bile Acids:Toxicology and Bioactivity,RoyalSociety of Chemistry,2008)；Michael W King,PhD(Bile Acid Synthesis andUtilization,1996-2014
Figure BDA0003762611270000061
themedicalbiochemistrypage.org)和Dawson等人(J LipidRes.2009年12月；50(12):2340-2357)；Dawson和Karpen(Journal of Lipid Research,第56卷,2015,第1085-1099页-特别参见其中的图1，它表明似乎没有发生已知的小肠受体对未缀合形式的鹅脱氧胆酸盐的吸收)；Ferrebee等人(Acta Pharmaceutica Sinica B2015；5(2):129-134)；以及Ninomiya等人(Biochimica et Biophysica Acta 1634(2003)116-125)。相比之下，据说缀合的牛磺酸(tauro)-胆汁酸和胆汁盐或二醇(glycol)-胆汁酸和胆汁盐需要一种主动的转运机制-例如，缀合的胆汁酸/胆汁盐的摄取以前被描述为通过特定的受体起作用-并且有人提出，这些受体虽然能够识别未缀合的胆汁盐，但它们对缀合的胆汁盐的亲和力最大。因此，据信在本文所述的情况下，在文献中没有报道受体与两种特定的未缀合的胆汁酸/胆汁盐(鹅脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐)结合并被其激活，同时也不与(i)缀合的胆汁酸/胆汁盐，或(ii)其它未缀合的胆汁酸/胆汁盐结合和/或被其激活。
在这点上，作为与用于本发明的胆汁酸/胆汁盐有关的背景，胆汁酸作为一般类别属于广泛的不同类型的化合物，之前已讨论过这些化合物可用作有助于促进治疗性化合物跨越细胞屏障吸收的剂。举例来说，出于此目的描述的化合物类型包括螯合剂，如EDTA或EGTA；非离子表面活性剂，如聚氧乙烯醚、对叔辛基苯酚聚氧乙烯、壬基苯氧基-聚氧乙烯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；阴离子剂，如胆固醇衍生物(包括胆汁酸)；阳离子剂，如酰基肉碱、酰基胆碱、月桂酰胆碱、十六烷基氯化吡啶鎓和阳离子磷脂；加上其它剂，如α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶、癸酸钠、水杨酸钠、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、氯化N,N,N-三甲基壳聚糖(TMC)、环糊精和NO供体型化合物。
就胆汁盐作为吸收促进剂的用途而言，Moghimipour等人(Absorption-EnhancingEffects of Bile Salts,Molecules 2015,20,14451-14473)提出了最近的综述。从该论文中的表1可以明显看出，注意力集中在缀合的胆汁酸上，即在C-24位具有甘氨酸(glyco)或牛磺酸基团的胆汁酸(这可能部分是由于已经报道缀合的盐与未缀合的胆汁盐相比，具有优异的乳化特性)。例如，关于口服药物递送，描述了牛磺脱氧胆酸钠的一些混合结果以及甘氨胆酸钠的一些阳性结果(参见Moghimipour等人的第14457页和第14458页)。
关于已经提出的胆汁酸如何增强吸收的可能作用机制，这些作用机制包括破坏/打开上皮细胞之间的紧密连接以促进细胞旁转运(例如通过细胞间区域的Ca2+结合、半桥粒的破坏、与丝状肌动蛋白的相互作用和/或反胶束的形成)和蛋白酶抑制。一些关于肺部和口腔施用途径的论文指出，虽然胆汁盐可以以浓度依赖性方式增强细胞旁转运，但在某些情况下，某些缀合的胆汁盐的浓度特别高也促进一部分物质摄取到细胞中(Nicolazzo等人,Journal of Controlled Release 105(2005)1-15；Hoogstraate等人,Journal ofControlled Release 40(1996)211-221；Hussain等人,Journal of Controlled Release94(2004)15-24；以及Dodla等人,Asian J Pharm Clin Res,第6卷,第3期,2013,39-47)。然而，提出这是由于例如脂质的提取引起细胞膜的破坏/扰动引起的，这不是将治疗性化合物递送到细胞中的理想方法。因此，尽管对膜有潜在的有害影响(例如通过扰乱重要的细胞结构和/或功能)，并且在这些情况下相当一部分的化合物沿着细胞间途径而行，但以这种方式破坏膜可能会为可能位于被破坏区域附近的有毒或其它不良材料的向内渗透铺平了道路。此外，在相关程度上看到这种作用之前需要使用高浓度的缀合胆汁酸，从毒性的角度来看，这些高浓度在任何情况下通常都太高了。
如上所述，本发明基于意外的发现，即两种未缀合的胆汁酸/胆汁盐，即鹅脱氧胆酸和脱氧胆酸和它们的盐，能够通过与细胞膜上的受体相互作用来促进材料摄取到细胞中(而其它胆汁盐，包括更流行的缀合胆汁盐，则无法做到这一点)。根据本发明，胆汁酸/胆汁盐因此可用于诱导治疗性化合物如大分子的摄取，以帮助它们到达细胞的内部部分，如细胞质或细胞核。此外，作用是浓度依赖性的，但是虽然胆汁酸/胆汁盐通常以相对较高的浓度使用，但在对细胞无毒的浓度下已经实现功效。测试表明，胆汁酸/胆汁盐实现或增强甚至很大(大分子)的治疗性化合物的摄取，然后在细胞内的液泡中可见。测试还表明，包括网格蛋白抑制剂具有阻断胆汁酸/胆汁盐在细胞内的吸收增强作用的作用，这表明了作用机制是网格蛋白介导的内吞作用。
因此，本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括以下步骤：向人体或动物体施用治疗性化合物及胆汁酸，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸。
优选地，胆汁酸或其盐用于实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了一种治疗人体或动物体的方法，所述方法包括以下步骤：向人体或动物体施用治疗性化合物及胆汁酸，其中所述胆汁酸为鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸，其中胆汁酸或其药学上可接受的盐以足以实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取的量存在。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了治疗性化合物和胆汁酸或其盐在制备用于治疗需要该治疗性化合物的人体或动物体的方法中的药物中的用途。优选地，胆汁酸或其盐以实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取的量存在。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了一种药物或治疗性组合物，所述药物或治疗性组合物包含(a)胆汁酸或其药学上可接受的盐，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸；和(b)治疗性化合物。优选地，该组合物还包括一种或多种选自以下的其它化合物：融合脂质、细胞穿透肽、亲溶酶体剂、膜破坏肽、膜破坏聚合物、光化学内化剂和改变细胞内囊泡转运的剂，任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用，以达到这种作用。
理想地，在本发明的任何制剂中，胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物被包衣包封，该包衣(a)在pH 7.4的水性条件下限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，但在低于7.4的pH下不再限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。
如上所述，本文所述的本发明的治疗方法包括向人体或动物体施用治疗性化合物。在这方面，一般来说，当然意图所述治疗性化合物然后提供治疗作用，这是治疗方法的基础。
附图说明
在以下几个非限制性实施方案的描述中更全面地描述了本发明的其它特征。该描述仅出于举例说明本发明的目的而包括。这不应理解为对上述本发明的广泛概述、公开或描述的限制。现在将通过参考附图来进行描述，其中：
图1示出了Caco-2细胞与含有以下的培养基一起孵育后的显微照片：(i)单独的FITC-胰岛素(浓度100ug/ml)；(ii)FITC-胰岛素与鹅脱氧胆酸钠(1mg/ml)；和(iii)FITC-胰岛素与鹅脱氧胆酸钠(2mg/ml)。这些表明了用单独的胰岛素处理的细胞中很少发生摄取，但是这种摄取会因鹅脱氧胆酸盐的存在而以浓度依赖性方式增强。
图2示出了在以下情况下Caco-2细胞在不同时间点对荧光白蛋白的相对摄取：(i)不存在鹅脱氧胆酸盐和没食子酸丙酯；(ii)存在鹅脱氧胆酸盐但不存在没食子酸丙酯；以及(iii)存在低浓度、中浓度和高浓度的鹅脱氧胆酸盐和没食子酸丙酯(两者)。
图3示出了一系列胆汁盐对Caco-2细胞吸收荧光白蛋白的不同影响。
图4示出了FITC-BSA摄取的结果，表明了氯丙嗪(chlorpromazine)(高浓度和低浓度)抑制所有浓度的胆汁盐刺激粘附微板孔的细胞的摄取。
图5示出了FITC-BSA摄取的结果，表明了氯丙嗪(高浓度和低浓度)抑制所有浓度的胆汁盐刺激悬浮的细胞的摄取。
图6示出了当鹅脱氧胆酸盐和EDTA组合使用时，会显著增强摄取。
图7示出了鹅脱氧胆酸盐以剂量依赖性方式增强细胞对hGH的摄取，类似于其它蛋白质如胰岛素、BSA和酪蛋白的摄取下所看见的。
图8示出了以与关于Caco-2细胞所见类似的方式，鹅脱氧胆酸盐的存在增强了IEC6细胞中蛋白质的摄取，这证实了这是肠细胞普遍常见的现象。
图9示出了在IEC6细胞中，EDTA以剂量依赖性方式加强了鹅脱氧胆酸盐对BSA摄取的增强。
实施方案描述
为了方便起见，以下部分概述了此处使用的术语的各种含义。在该论述之后，论述了关于本发明的组合物、药物的用途和方法的一般方面，随后是展示本发明的各种实施方案的性质以及如何使用它们的具体实施例。
定义
下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语和短语的含义。如果本领域术语的使用与本文提供的定义之间存在明显的差异，则以说明书中提供的定义为准。
本领域的技术人员将理解，这里描述的本发明易于进行除具体描述的那些之外的变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或集体地提及或指示的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及这些步骤或特征的任何和所有组合或其中的任两个或更多个。
本文中引用的每篇文献、参考文献、专利申请或专利均以引用的方式明确地整体并入本文中，这意味着读者应将其作为本文的一部分阅读和考虑。本文中引用的文献、参考文献、专利申请或专利在本文中不重复仅仅是为了简洁。然而，所引用的材料或该材料中所含的信息均不应被理解为公知常识。
此处提及的或以引用的方式并入本文中的任何文献中的任何产品的制造商说明书、描述、产品规格和产品表均以引用的方式并入本文中，并且可以在本发明的实践中使用。
本发明的范围不受此处描述的任何特定实施方案的限制。这些实施方案仅用于示例的目的。功能等效的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明范围内。
除了操作实施例中，或者另有指示，在此使用的所有表示成分量或反应条件的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可以意指±1％。
在此描述的本发明可以包括一个或多个值范围(例如尺寸、浓度等)。应了解，值范围包括该范围内的所有值，包括界定该范围的值，以及产生的结果与紧邻界定范围边界的值的值相同或基本相同的与该范围相邻的值。例如，本领域技术人员将理解，范围的上限或下限的10％的变化可能是完全合适的并且被本发明所涵盖。更具体地，范围的上限或下限的变化将是5％，或如本领域通常公认的那样，以较大者为准。
在本申请中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解成意味着包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其它整数或整数的组。
术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”或“抑制”在本文中均一般用于意指统计学显著量的降低。然而，为避免疑义，“减少的”、“减少”或“降低”或“抑制”意指与参考水平，例如在不存在剂的情况下相比降低至少10％，例如降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％)，或至少约60％＞，或至少约70％，或至少约80％。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文中均用于一般意指静态(statically)显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平，例如在不存在剂的情况下相比增加至少10％，例如增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％)，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或与参考水平相比，至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍或至少约10倍，或2倍与10倍或更大倍数之间的任何增加。
如本文所用，术语“施用”是指通过使组合物至少部分定位在所需部位从而产生所需作用的方法或途径将组合物放在受试者体内。本文所述的化合物或组合物可通过本领域已知的任何适当途径施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、肺、鼻、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在某些实施方案中，化合物通过肠胃外施用或允许递送到靶部位的其它方法施用。
本文使用的选定术语的其它定义可在本发明的详细描述中找到并且通篇适用。除非另有定义，否则本文中所使用的所有其它科学和技术术语均具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。
现在将参考以下非限制性描述和实施例来论述本发明的特征。
实施方案
因此，本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括以下步骤：向人体或动物体施用治疗性化合物及胆汁酸，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸。
在这点上，胆汁酸优选是鹅脱氧胆酸。此外，优选使用盐形式的胆汁酸。因此，优选地，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐或脱氧胆酸盐，更优选是鹅脱氧胆酸盐。
胆汁酸的药学上可接受的盐通常是与药学上可接受的碱形成的盐。药学上可接受的碱包括碱金属(例如钠或钾)、碱土金属(例如钙或镁)、氢氧化物和有机碱，如烷基胺、芳烷基胺和杂环胺。优选碱金属，特别是钠。因此，最优选地，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸钠。
可存在多于一种的上述胆汁酸和/或胆汁盐，例如可存在两种、三种或更多种，优选两种或三种，更优选两种。但是，通常只存在一种。
用于本发明的胆汁酸或其盐优选包含在药物组合物中。
根据本发明使用的治疗性化合物可以是在人体或动物体内，包括在人体或动物体内的一个或多个细胞内具有治疗作用的任何化合物。在这点上，一般在本文中，提及根据本发明使用的一种(或该)治疗性化合物意图还涵盖使用多于一种治疗性化合物，如2种、3种或更多种治疗性化合物的可能性。然而，通常，提及一种(或该)治疗性化合物优选仅指一种治疗性化合物。
如上所述，本发明所基于的作用足够强大，甚至可以实现大分子的细胞内摄取。鉴于实现和/或增强这种物理上大分子摄取到细胞可能是困难的，本发明的有效性在这种情况下特别有用。因此，优选地，根据本发明使用的治疗性化合物是大分子。在这点上，治疗性化合物优选具有约1000Da或更大如2000Da或更大、或3000Da或更大的分子量。
治疗性化合物优选但不必需是肽，更优选多肽，更优选蛋白质。合适的治疗性化合物的实例包括但不限于胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，如激肽原(kinogen)、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子IX的因子VIII；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板衍生生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽(exendin)；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白细胞介素，包括IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；分泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是那些结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的蛋白质，如胆固醇酯转移蛋白、磷脂转移蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白(dystrophin)或微小肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白质；信号传导分子，如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单结构域抗体；可溶形式的受体，如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。这些和其它蛋白质可以来源于人、植物、动物、细菌或真菌来源，并且可以从天然来源中提取，通过发酵制备为重组体，或化学合成。在一个优选的方面，治疗性化合物是选自以下的肽：胰岛素、降钙素、生长激素、生长激素释放因子、甘丙肽、甲状旁腺激素、肽YY、胃泌酸调节素、促红细胞生成素、集落刺激因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、GLP-1、GLP-2、GIP、胰高血糖素、艾塞那肽、瘦素、神经营养因子、胰岛素样生长因子、软骨诱导因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、干扰素-γ、干扰素-la、干扰素α和上述任一者的缀合物、包括上述任一者的融合蛋白以及上述任一者的组合。
用于本发明的治疗性化合物优选包含在药物组合物中。
胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物(和/或，如果存在的话，用于所述方法的任何另外的剂)可以分开施用。然而，优选地，本发明的所述方法包括施用包含胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物(两者)的组合物。此外，如果在所述方法中将一种或多种另外的剂与胆汁酸/胆汁盐组合使用，则所述组合物优选还包含所述一种或多种另外的剂中的一种或多种，并且通常包含全部所述一种或多种另外的剂。
在本发明的方法中，细胞(要实现或增强治疗性化合物在其中的摄取)表面处所需的胆汁酸/胆汁盐浓度的上限可以由胆汁酸/胆汁盐在体内对(靶)细胞类型和/或周围的细胞无毒的水平决定。因此，在本发明的方法中，在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处的胆汁酸/胆汁盐的浓度应低于其对(靶)细胞类型和/或周围的细胞有毒的水平。
在本发明的方法中，细胞(要实现或增强治疗性化合物在其中的摄取)表面处所需的胆汁酸/胆汁盐浓度的下限可优选对应于临界胶束浓度(CMC)，即高于胆汁酸/胆汁盐形成胶束的浓度。确切的CMC可尤其根据温度、压力以及其它剂(特别是表面活性物质和电解质)的存在和浓度而变化，并且可以通过实验确定。因此，在本发明的方法中，在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处的胆汁酸/胆汁盐浓度优选高于胆汁酸/胆汁盐的CMC(在该特定环境中)。
通常，在本发明的方法中，在细胞(要实现或增强治疗性化合物在其中的摄取)表面处达到的胆汁酸/胆汁盐的浓度优选范围为0.1mg/ml至500mg/ml，优选0.5mg/ml至100mg/ml，更优选1mg/ml至50mg/ml，更优选2mg/ml至40mg/ml，如5mg/ml至20mg/ml。
优选选择包括在用于施用于患者的药物组合物中的胆汁酸/胆汁盐的量，以便在需要摄取的细胞附近达到这样的浓度。这可能因例如施用方式以及靶部位的性质和大小而异。本领域技术人员将能够相应地调整浓度。
一方面，胆汁酸/胆汁盐的量可以为每立方厘米靶细胞(例如肿瘤细胞)0.1mg至500mg，优选0.5mg至100mg，更优选1mg至50mg，更优选2mg至40mg，如5mg至20mg。这些量特别适用于胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物包含在一种组合物中的情况，该组合物用于以将在体内的特定位置(例如在肿瘤细胞的酸性环境中)释放胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的形式，例如静脉内施用于血流中。
在另一方面，组合物中的胆汁酸/胆汁盐的量可以是至少0.1mg，优选至少1mg，更优选至少10mg，更优选至少20或至少50mg。组合物中胆汁酸/胆汁盐的量可最高1g，优选最高500mg，更优选最高200mg，更优选最高100mg。典型的量是50至100mg，如60至80mg，或大约70mg。这些量特别适用于胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物包含在用于实现治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐摄取到肠细胞中(例如通过具有肠溶衣来避免内容物在胃中释放)的口服组合物中的情况，因为当组合物的内容物在肠中释放时，通常会使它们主要分散在几毫升，例如最多约5ml的局部水体积中。
根据本发明使用的治疗性化合物的量可能取决于潜在的疾病或疾患、靶细胞群体的性质和大小、疾病的类型和严重程度、治疗性化合物、患者的年龄、体重和状况、以及施用方式和频率。熟练的医生将能够选择合适的量，但治疗性化合物的典型剂量水平为0.01至100mg/kg，如0.1至10mg/kg。
根据本发明组合施用的胆汁酸/胆汁盐:治疗性化合物的重量比优选为100:1至1:1，更优选70:1至3:2，更优选50:1至2:1，更优选30:1至4:1，最优选20:1至5:1，如15:1至10:1。
如上所提及，本发明的方法包括使用胆汁酸/胆汁盐来实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取，并且优选地，胆汁酸或胆汁盐受体介导的通过网格蛋白包被小窝的内化用于实现或增强所述细胞内摄取。关于这一点，在一个方面，细胞内摄取可以通过布置治疗性化合物与胆汁酸/胆汁盐同时足够靠近细胞表面来实现。然而，在第二(不是相互排斥的)方面，内化可以通过将治疗性化合物与胆汁酸/胆汁盐(例如以胶束的形式)通过非共价相互作用直接缔合来实现。以下实施方案与这两个方面相关，尽管在一些情况下，给定实施方案显然与本发明这两个方面中的第二个方面特别相关。
因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，胆汁酸/胆汁盐与一种或多种另外的剂组合使用。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的剂包括一种或多种如下的剂，其：
a)稳定胆汁酸或其盐的胶束形式(防止解离)；和/或
b)实现或增强胆汁酸或其盐的胶束形式的形成。
用于这方面的合适的剂包括是或包含疏水实体的剂。疏水实体可以掺入胶束中，从而产生胶束分解在水性环境中在能量上不利的情况，因为它会导致疏水实体暴露于水。在一个实施方案中，治疗性化合物本身至少在一定程度上可用于稳定和/或实现或增强胶束形式的形成，例如如果治疗性化合物含有疏水部分(如由长链烃构成的脂质尾)。在这个实施方案中，可能不需要包括另外的剂。
然而，不管怎样，通常有利的是包括一种或多种另外的(单独的)剂，其稳定胶束形式和/或实现或增强它的形成，因为这有助于促进内化过程。在这方面可以使用的剂通常包括具有疏水部分的任何剂，如长的(例如C4或更多、C5或更多、或C6或更多，并且最多例如C30、C20或C12)烃基链。实例包括脂肪酸，或类固醇如胆固醇(即，食物中脂质结构分解的结果)，以及疏水性抗氧化剂如芳香醇，包括没食子酸丙酯和丁基羟基苯甲醚。特别优选没食子酸丙酯。
在这方面，在胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物包含在单一组合物中并且所述组合物是固体的本发明的实施方案中，稳定胶束形式和/或实现或增强它的形成的所述一种或多种另外的(单独的)剂(优选没食子酸丙酯)如果存在的话，优选为至少1mg，如至少10mg或至少20mg。该量可以最多150mg，如最多100mg或最多50mg。典型的量是20至50mg，如30至40mg。
关于胶束的大小，没有特别限制，但胶束的聚集大小为至少2个分子，优选至少3个分子，更优选4个分子。聚集大小通常为30个分子或更小，优选20个分子或更小，更优选10个分子或更小，并且通常8个分子或更小。约5至7个分子(例如约6个分子)的平均聚集大小是特别优选的。
在一些实施方案中，用于本发明的所述一种或多种另外的剂可以包括pH调节剂，如碳酸盐或碳酸氢盐。这可以帮助提高胆汁酸/其盐的溶解度，例如通过将pH提高到7.5至9。
根据本发明，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物组合使用。对胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物的施用方式没有特别限制，只要它们的施用引起它们同时存在并且在需要摄取的细胞附近以足够高的浓度存在的情况即可。胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物可以分开、同时或作为单一组合物的一部分施用。如上所述，优选地，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物在施用前组合成单一组合物。在这方面，胆汁酸/胆汁盐可以简单地与治疗性化合物混合。
在本发明的方法中，据信细胞内摄取是通过网格蛋白介导的内吞作用-换言之，通过网格蛋白包被小窝的形成而发生的。因此，如以下实施例中所报道的，已发现氯丙嗪(网格蛋白包被小窝形成的抑制剂)抑制摄取，但制霉菌素(小窝蛋白)或阿米洛利(amiloride)(巨胞饮)不抑制。据信小窝的形成是受体介导的过程，其中胆汁酸/胆汁盐与细胞表面受体特异性结合。
因此，本发明通常适用于任何需要细胞内递送治疗性化合物的治疗方法。胆汁酸/胆汁盐的这种新作用的发现因此开辟了新的疗法，例如用于以前在实际和/或经济上无法实现将给定的治疗性化合物有效地在细胞内递送到患者中的靶细胞群体的治疗。
关于在本发明的方法中使用的施用模式，应该选择这样的模式，使得治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐在接触任何其它细胞之前被递送到靶细胞群体。实现这一点的一种方式是直接将胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物施用于相关位置。因此，如果位置是皮肤，那么这可以通过局部制剂来实现，或者如果位置是鼻腔或肺，那么这可以使用喷雾剂或吸入器来完成。可以通过注射或锁孔型递送/释放到达体内的位置。
然而，靶细胞群体不一定存在于施用部位。因此，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物可以配制在一种或多种组合物中，延迟它们与周围细胞的接触，直到组合物到达靶细胞群体。这使得能够在靶细胞表面处获得高浓度的胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物，同时还避免了身体其它部位的浓度升高。
在这点上，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物可以例如肠胃外施用，如通过静脉内注射。这种施用模式优选的一种情况是，对于本发明的实施方案，其中胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物被包衣包封，该包衣(a)在pH 7.4(pH 7.4是生理pH)的水性条件下限制胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物的溶解，但在低于7.4的pH下不再限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。包衣可以设计成例如在特定环境中，例如在特定pH范围内变得可渗透或分解。所述方法可用于例如治疗癌症，通过将治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐包封在包衣中，该包衣将在肿瘤组织的酸性微环境中，例如在低于7.4的pH下释放其载物。例如，包衣可以设计成在大约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3，或者实际上在5.0至7.3范围内或基于上面给出的中间数字的任何子范围内的任一处的pH下释放治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐。精确的pH会因肿瘤而异。宜在治疗前测试肿瘤细胞环境中的pH，以检查哪种制剂是最理想的。可用于这方面的可能的制剂包括含有包衣的微粉化小丸，该包衣(a)限制小丸的溶解，但可配制成在此类酸性微环境中溶解，和/或(b)含有能够与靶细胞群体，例如癌细胞中存在的受体结合的一种或多种分子或部分(在这方面，如果当分子到达靶部位并且相关部分与预期的受体结合时，可触发/促进包衣内的组合物的释放也是有利的)。一方面，可以通过使用胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物与DOPE和PEG组合来靶向癌细胞。在这种情况下，酸敏感性PEG在酸性肿瘤环境中分解，使胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物暴露于靶细胞。
胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物也可以口服施用。例如，如果治疗性化合物的细胞内摄取的目标部位是小肠细胞，那么可以通过将它们包封在肠溶胶囊、片剂或在胃中发现的低pH下抵抗溶解，但在较高的pH下崩解以将化合物释放到小肠，例如十二指肠、空肠或回肠的其它装置中来安全通过胃。这防止胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物的溶解(浓度太低以至于细胞内无法有效摄取)和/或防止一种或多种组分(特别是治疗性化合物)在胃中分解。在这方面根据本发明使用的药物组合物优选具有肠溶衣，其在3至7、更优选4至6.5、最优选5至6的pH下变得可渗透。合适的肠溶衣在本领域中是已知的。
细胞内摄取后治疗性化合物的命运可能取决于如下因素，当然包括化合物本身的性质、任何其它也一起被细胞摄取的化合物以及发生摄取的细胞的性质。例如，一些细胞具有将囊泡中摄取的物质转运穿过细胞以便随后离开的内在功能(如，屏障细胞，例如血脑屏障中的内皮细胞)。在一些情况下，这当然可以提供有用的功能。然而，在治疗性化合物意图在该细胞内具有治疗作用的情况下，这说明了采取额外措施以帮助促进该作用可能特别有利的那种情况。
因此，如上所述，在本发明的方法中，胆汁酸或其盐可以优选地与一种或多种另外的剂组合使用。在这点上，在一个优选的实施方案中，所述一种或多种另外的剂包括一种或多种剂，其作用是增加治疗性化合物通过一种或多种以下机制在细胞(发生摄取)中成功发挥其治疗作用的可能性：
a)抑制治疗性化合物在被吸收后随后从细胞中离开，
b)保护治疗性化合物免受内体/溶酶体的酸性pH影响，
c)保护治疗性化合物免受溶酶体的一种或多种消化酶影响，
d)促进内体屏障的穿透(促进内体逃逸)，
e)增加治疗性化合物在细胞液中的稳定性，
f)促进核膜的穿透(如果预期的作用部位是细胞核，例如用于质粒DNA递送)，以及
g)改变细胞内囊泡转运。
例如，所述一种或多种另外的剂可以包括一种或多种选自以下的剂：
a)融合脂质，例如阳离子脂质体和/或中性辅助脂质。当治疗性化合物是核酸时，宜使用阳离子脂质体，以与核酸形成复合物，这可以促进基因转染。至于中性辅助脂质，宜使用如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)的剂。DOPE可以介导内吞作用后脂质体与内体膜之间的融合，因此可以用于例如增强复合基因的表达。当中性辅助脂质为DOPE时，优选地，DOPE呈(或采用)反向六角相。还可以通过降低pH来刺激DOPE原位形成反向六角相。在一些方面，这可以通过包括适当的pH调节剂来实现。阴离子脂质如磷脂酸或胆固醇半琥珀酸酯也可用作融合脂质，任选地与中性辅助脂质如DOPE组合，特别是在治疗性化合物带有正电荷的情况下。在这方面，也可以使用细胞穿透肽。
b)细胞穿透肽，优选地具有2至12个氨基酸，如八精氨酸、九精氨酸或八赖氨酸，和/或为富含精氨酸的细胞穿透肽。这些可以有利地与选自本文所述的所述一种或多种其它化合物的其它剂组合使用，特别是与融合脂质如DOPE组合使用。
c)亲溶酶体剂，例如氯喹(chloroquine)。
d)膜破坏肽，例如肽INF7、H5WYG、43E(由三个LAEL氨基酸序列单元组成)和组氨酸10。
e)膜破坏聚合物，例如聚乙烯亚胺。
f)光化学内化剂，例如荧光标记如异硫氰酸荧光素，或包含它的化合物。
g)改变细胞内囊泡转运的剂，例如通过靶向介导转运囊泡形成的因子(介导转运囊泡形成的因子包括鸟嘌呤核苷酸交换因子GBF1，它通过将COPI外壳蛋白募集到在高尔基体膜中发现的载物结合的受体蛋白中来介导转运囊泡的形成；抑制GBF1活性诱导分泌蛋白从高尔基体逆行到ER；高尔基体塌陷到ER触发了未折叠蛋白反应的激活并最终导致细胞凋亡)。这种剂的一个实例是布雷非德菌素A(Brefeldin A)。
所述一种或多种其它剂如果存在的话，应当与胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物组合施用-这可以分开、同时或作为单一组合物的一部分进行。优选地，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物以及所述一种或多种其它剂都作为相同组合物的一部分施用。在一个实施方案中，所述一种或多种其它剂(或其活性部分)可以化学连接到治疗性化合物(例如共价缀合，或可替代地非共价缀合)。这可以帮助确保将所述一种或多种其它剂(或其活性部分)与治疗性化合物一起适当地掺入细胞，即在其打算发挥其作用的地方。如果正在使用光化学内化来提高功效，则这种方法是特别优选的。
此外，值得注意的是，尽管细胞穿透肽作为所述一种或多种其它剂的可能选项在上面列出，但之前也已经描述了这类肽试剂用于增强化合物摄取到细胞中。由于胆汁酸或胆汁盐已经在本发明中发挥了该功能，因此通常不需要单独为了此目的而包括细胞穿透肽，因此在一些方面优选不存在这种肽试剂。尽管如此，可能存在这样的情况，其中可以有利地包括细胞穿透肽以便一旦治疗性化合物已经被吸收到细胞中就提供有效作用和/或进一步增强治疗性化合物摄取到细胞中。
通常仅使用以上提及的一种或多种另外的剂中的一种，但在一些方面可能优选包括两种、三种、四种或甚至更多种。
就如何根据本发明施用胆汁酸/胆汁盐和/或治疗性化合物而言，它们(各自)通常被配制用于与药学上可接受的载体或稀释剂一起施用。胆汁酸/胆汁盐和/或治疗性化合物可以呈多种剂型施用。因此，它们可以口服施用，例如作为片剂、锭剂、含片、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂。它们也可以肠胃外施用，无论是皮下、静脉内、肌内、胸骨内、透皮或通过输注技术。它们也可以作为栓剂施用。它们也可以呈气溶胶喷雾剂或滴剂，经颊、舌下、直肠、局部、口服、经鼻或经肺途径施用。
例如，固体口服剂型可以含有以下与活性化合物一起：稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；粘液溶解剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸盐；并且，一般来说，药物制剂中使用的无毒和无药理活性物质。这类药物制剂可以用已知方式制造，例如，通过混合、制粒、压片、包糖衣或薄膜包衣工艺。
该组合物可以是液体。可能的液体组合物包括溶液、悬浮液和分散体。用于口服施用的液体制剂可以是糖浆、乳液和悬浮液。糖浆可以含有例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。
悬浮液和乳液可以含有例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以含有药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇如丙二醇与活性化合物一起，如果需要，还可以含有适量的盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)。
用于注射或输注的溶液可以含有例如无菌水作为载体，或者优选地，它们可以呈无菌、水性、等渗盐水溶液的形式。
在本发明的一个优选实施方案中，胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物呈用于将治疗性化合物(优选大分子)引入细胞中的组合物形式提供，其中治疗性化合物在溶液中与胆汁盐，优选鹅脱氧胆酸盐，如鹅脱氧胆酸钠混合，并且任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用以达到此作用。
在本发明的另一个优选实施方案中，胆汁酸/胆汁盐、EDTA和治疗性化合物以含有组分混合物的固体干粉形式提供，其在施用后将在体液中形成溶液。因此，在该实施方案中，本发明提供了一种用于将治疗性化合物(优选大分子)引入细胞中的(干)固体组合物，其包含治疗性化合物和胆汁盐(优选鹅脱氧胆酸盐，如鹅脱氧胆酸钠)，被配制成胶囊或小丸，并且任选地，其中所述胆汁盐与EDTA联合使用以达到此作用。干燥固体可以例如通过将各个组分以适当的比例以干粉形式混合在一起来制备，或者通过首先将制剂的所有组分共溶解在液体介质中，然后通过任何已知的方法如蒸发、真空干燥或冻干对溶液进行干燥来制备。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用于将治疗性化合物(通常是大分子)引入细胞中的组合物，其中治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐呈例如糊剂、软膏或凝胶的形式组合用于局部涂覆，并且任选地，其中所述胆汁盐与EDTA联合使用以达到此作用。
上述组合物中可以包括另外的赋形剂，如一种或多种抗氧化剂、防腐剂、溶解助剂、pH调节剂和/或(在口服或经鼻施用的情况下)掩味剂。
当治疗性化合物和胆汁酸/胆汁盐以固体形式存在时，用于本发明组合物中的优选的剂是(i)气相二氧化硅(气溶胶)，其用量可以为例如0.01至100mg，优选0.1mg至10mg，通常为0.5至5mg；(ii)羟基乙酸淀粉钠，其用量可为例如0.1至500mg，优选1至100mg，通常为5至50mg；(iii)一种或多种助流剂，和/或(iv)一种或多种崩解剂。
优选地，胆汁酸或其盐用于实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了一种治疗人体或动物体的方法，所述方法包括以下步骤：向人体或动物体施用治疗性化合物及胆汁酸，其中所述胆汁酸为鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸，其中胆汁酸或其药学上可接受的盐以足以实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取的量存在。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了治疗性化合物和胆汁酸或其盐在制备用于治疗需要该治疗性化合物的人体或动物体的方法中的药物中的用途。优选地，胆汁酸或其盐以实现或增强治疗性化合物的细胞内摄取的量存在。任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用。
本发明还提供了一种药物或治疗性组合物，所述药物或治疗性组合物包含(a)胆汁酸或其药学上可接受的盐，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸；和(b)治疗性化合物。优选地，该组合物还包括一种或多种选自以下的其它化合物：融合脂质、细胞穿透肽、亲溶酶体剂、膜破坏肽、膜破坏聚合物、光化学内化剂和改变细胞内囊泡转运的剂，任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用，以达到这种作用。
理想地，在本发明的任何制剂中，胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物被包衣包封，该包衣(a)在pH 7.4的水性条件下限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，但在低于7.4的pH下不再限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。
在第一个进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括向人体或动物体施用治疗性化合物，其中：
a)所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐，优选鹅脱氧胆酸钠，
b)所述胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物包含在相同的药物组合物中
c)所述组合物被包衣包封，该包衣(a)在pH 7.4的水性条件下限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，但在低于7.4的pH下不再限制胆汁酸或胆汁盐和治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。
d)所述组合物优选为液体形式，更优选为适合静脉内施用的形式。
在上述第一个进一步优选的实施方案的一个特别优选的方面，胆汁酸/胆汁盐与DOPE和PEG组合配制在组合物中，使得DOPE和/或PEG在暴露于小于7.4、优选小于7.0、更优选小于6.5的pH时分解，从而释放治疗性化合物。
在第二个进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括向人体或动物体施用治疗性化合物，其中：
a)所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐，优选鹅脱氧胆酸钠，并且任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用，
b)在所述方法中，胆汁酸或其盐用于实现或增强肠道中、通常小肠中治疗性化合物的细胞内摄取(其中优选地，胆汁酸/胆汁盐受体介导的内化通过网格蛋白包被小窝发生)，
c)所述治疗性化合物是蛋白质，例如包含疏水部分的蛋白质(当呈胶束形式时，其能够与鹅脱氧胆酸盐非共价缀合)，并且
d)其中所述方法包括口服施用包含胆汁盐、蛋白质和没食子酸丙酯的药物组合物。
用于该实施方案的合适蛋白质包括上面列出的和/或用于实施例中的那些蛋白质。
同样对于该第二个进一步优选的实施方案，优选将组合物配制在装置(优选肠溶包衣制剂，如肠溶胶囊)中，该装置在胃中发现的pH下抵抗溶解，但在小肠中发现的pH下崩解。例如，该组合物可以配制在肠溶胶囊内，该肠溶胶囊在5至6范围内的pH下变得可渗透。
在第三个进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括向人体或动物体施用治疗性化合物，其中：
a)所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐，优选鹅脱氧胆酸钠，并且任选地，所述胆汁盐与EDTA联合使用，
b)所述胆汁酸/胆汁盐和治疗性化合物包含在相同的药物组合物中，
c)所述药物组合物适用于局部施用，并且
d)所述方法涉及将组合物施加于皮肤。
通常，本发明涉及人的治疗，尽管在一方面本发明涉及非人动物的治疗。因此，本发明可用于的受试者包括例如：人、哺乳动物、伴侣动物和鸟类(人类是最优选的)。
以下实施例说明了本发明。然而，它们不以任何方式限制本发明。
以下实施例用以说明本发明，不应理解为限制。
实施例
实施例1
将Caco-2细胞(第51代)在DMEM(补充10％FBS)中以1×106个细胞/毫升的密度在24孔簇板中1ml孔底部的塑料盖玻片上培养三天。从每个孔中取出0.5ml培养基，并替换为含有以下的培养基：(i)单独的FITC-胰岛素(浓度100ug/ml)；(ii)FITC-胰岛素与鹅脱氧胆酸钠(1mg/ml)；或(iii)FITC-胰岛素与鹅脱氧胆酸钠(2mg/ml)。将细胞在5％CO2中37℃下孵育半小时。然后去除上清液，替换为0.5ml 4％多聚甲醛溶液，并在室温下孵育15分钟。然后去除多聚甲醛，用磷酸盐缓冲盐水洗涤孔3次，然后用封固剂处理盖玻片并在共聚焦显微镜下观察。图像在图1中示出。从显微照片中可以看出，用单独的胰岛素处理的细胞几乎没有摄取，而鹅脱氧胆酸盐的存在以浓度依赖性方式增强摄取，在较高浓度的胆汁盐下，荧光材料在细胞内的液泡中清晰可见。
实施例2
将Caco-2细胞(第51代)在DMEM(补充10％FBS)中以2×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为含有以下的培养基：(i)A行中单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)；(ii)B行中100ug/ml FITC-白蛋白与鹅脱氧胆酸钠(高浓度：1.33mg/ml)；(iii)C行中100ug/ml FITC-白蛋白与鹅脱氧胆酸钠/没食子酸丙酯溶液(分别为0.66和0.33mg/ml–总固体1mg/ml)；(iv)D行中100ug/ml FITC-白蛋白与鹅脱氧胆酸钠/没食子酸丙酯溶液(分别为1.0和0.5mg/ml-总固体1.5mg/ml)；以及(v)E行中100ug/ml FITC-白蛋白与鹅脱氧胆酸钠/没食子酸丙酯溶液(分别为1.33和0.66mg/ml-总固体2mg/ml)。将细胞在5％CO2中37℃下孵育十分钟，然后将上清液从第1列、第2列和第3列中取出，并用磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤3次。在Spectramax荧光读板器(激发波长494nm，截止波长515nm，发射波长515nm)中快速读取板。然后将板在5％CO2中37℃下再孵育十分钟，并从孔4、5和6中取出上清液并用PBS洗涤，然后像先前一样在读板器中读取。将板再孵育十分钟，然后从孔7、8和9中取出上清液，洗涤孔并像先前一样读取。图2中示出了指示每个时间点每组细胞吸收的荧光材料量的读数，其中‘低’、‘中’和‘高’分别是指0.66、1.0和0.33mg/ml的鹅脱氧胆酸盐浓度。结果在图2中示出。可以看出，单独的鹅脱氧胆酸盐的存在增强了细胞对荧光白蛋白的摄取，不过当没食子酸丙酯与胆汁盐一起包括时，摄取速度更快，并更快地达到最大值(10分钟，相比之下，单独的鹅脱氧胆酸盐为30分钟)。
实施例3
将Caco-2细胞(第52代)在DMEM(补充10％FBS)中以2×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为含有单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或100ug/ml FITC-白蛋白与浓度为2ug/ml的各种胆汁盐的培养基。将细胞在5％CO2中37℃下孵育三十分钟，然后从孔中取出上清液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml PBS。在Spectramax荧光读板器(激发波长494nm，截止波长515nm，发射波长515nm)中读取板。所测试的胆汁盐均为钠盐形式，是鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、甘氨胆酸盐(glucocholate)、牛磺胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。图3中示出了在减去由在单独的培养基中孵育的细胞组成的背景后获得的荧光读数。在这个和重复实验中，在显微镜下目测细胞，证实了在观察到超过背景的荧光的情况下，此位于细胞内，通常在离散的液泡中。与鹅脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐一起孵育后，细胞中的摄取很明显，而胆酸盐和牛磺胆酸盐都不会诱导摄取。随后的实验证明，在低于和高于毒性限度的浓度下，在任何天然缀合的胆汁盐(即，牛磺酸或甘氨酸衍生物)下都没有看到标记蛋白质的摄取。
实施例4
将Caco-2细胞(第56代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul缺乏FBS且含有不同浓度氯丙嗪的培养基。继续孵育十分钟，然后添加50ul培养基(不含FBS)，该培养基含有单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度200ug/ml)或200ug/ml FITC-白蛋白与不同浓度的鹅脱氧胆酸盐。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(又不含FBS)。在荧光显微镜下通过目测评估细胞中FITC-白蛋白摄取与否，并根据荧光强度评分。在下表中，根据显微镜图像列出了荧光评分，从中可见，在与氯丙嗪(网格蛋白包被小窝形成的抑制剂)一起预孵育时，观察到了浓度依赖性的摄取抑制。这与和阿米洛利(巨胞饮抑制剂)或制霉菌素(小窝蛋白抑制剂)一起预孵育的类似实验的结果形成对比，在这些类似实验中没有看到摄取减少。
Figure BDA0003762611270000321
图例
+++ 高水平荧光
++ 中等水平荧光
+ 低水平荧光
□ 非常低/零星的水平荧光
– 无荧光
实施例5
将Caco-2细胞(第57代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul含有不同浓度熊脱氧胆酸钠的培养基(缺乏FBS)。继续孵育十分钟，然后添加50ul培养基(-FBS)，该培养基含有单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或含有100ug/mlFITC-白蛋白与不同浓度的鹅脱氧胆酸盐。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(减去FBS)。在荧光显微镜下通过目测评估细胞中FITC-白蛋白摄取与否，并根据荧光强度使用与实施例4中相同的分级方案评分。从下表中可见，在与熊脱氧胆酸盐一起预孵育后观察到摄取的浓度依赖性抑制。
Figure BDA0003762611270000322
Figure BDA0003762611270000331
实施例6
将Caco-2细胞(第59代和第60代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul培养基(不含FBS)，该培养基含有单独的FITC-白蛋白(牛)或FITC-酪蛋白(浓度100ug/ml)，添加了不同浓度的鹅脱氧胆酸盐。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(又不含FBS)。在荧光显微镜下通过目测评估细胞中FITC-白蛋白摄取与否，并根据荧光强度使用与实施例4中相同的分级方案评分。在不同天在两个不同的场合重复该实验。从下表中可见，BSA和酪蛋白的摄取程度相似，表明吸收不是特定蛋白质所特有的。
Figure BDA0003762611270000332
实施例7
将Caco-2细胞(第60代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul培养基(不含FBS)，该培养基含有单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或添加了不同浓度的单独的鹅脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐:没食子酸丙酯(2:1wt:wt)、单独的牛磺胆酸盐或牛磺胆酸盐:没食子酸丙酯(2:1wt:wt)的200ug/ml FITC-白蛋白。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(又不含FBS)。在荧光显微镜下通过目测评估细胞中FITC-白蛋白摄取与否，并根据荧光强度使用与实施例4中相同的分级方案评分(nd＝未进行/测试)。从下表中可见，没食子酸丙酯的存在似乎增强了鹅脱氧胆酸盐介导的摄取，因为在1.0mg/ml的胆汁盐浓度下，看到在鹅脱氧胆酸盐/PG组合下的摄取水平高于单独的鹅脱氧胆酸盐下。相反，在存在或不存在PG的情况下，都没有看到牛磺胆酸盐的摄取。PG的作用是促进和加强胆汁盐胶束的形成。鹅脱氧胆酸盐具有低CMC，在此处测试的低浓度下会形成胶束。然而，正如预期的那样，加强胶束会增加蛋白质的摄取，这与受体介导的过程识别胶束形式的胆汁盐的吸收机制一致。然而，单独的胆汁盐胶束形成条件不足以发生这种摄取，因为即使在PG存在的情况下，在牛磺胆酸盐的存在下也没有观察到摄取。
Figure BDA0003762611270000341
实施例8
将Caco-2细胞(第60代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul培养基(不含FBS)，该培养基含有添加了单独或与浓度为5mg/ml的EDTA钠或邻菲咯啉组合的浓度为0.5mg/ml的鹅脱氧胆酸盐的FITC-白蛋白(牛)。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十五分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(又不含FBS)。在荧光显微镜下通过目测评估细胞中FITC-白蛋白摄取与否，并根据荧光强度使用与实施例4中相同的分级方案评分。从下表中可见，在所采用的浓度下，鹅脱氧胆酸盐和EDTA都不能单独增强蛋白质的摄取。然而，组合起来，观察到显著的摄取，表明EDTA能够与鹅脱氧胆酸盐协同刺激肠细胞对蛋白质的摄取。然而，另一种螯合剂邻菲咯啉没有这种作用。
Figure BDA0003762611270000351
实施例9
如实施例8所述重复该实验，不同之处在于鹅脱氧胆酸盐的浓度为0、0.5和1mg/ml，并且使用浓度为1mg/ml的EDTA、DTPA和EGTA。孵育时间为30分钟。如下表中可见，当添加了EDTA时见到的摄取的增强超越和超过了单独的鹅脱氧胆酸盐下所见到的摄取的增强，但DTPA或EGTA下没有见到。当先添加鹅脱氧胆酸盐，孵育20分钟，然后替换为EDTA孵育10分钟时，也进行了类似的观察。
Figure BDA0003762611270000352
Figure BDA0003762611270000361
实施例10
将Caco-2细胞(第61代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在96孔簇板中0.2ml孔底部培养四天，必要时进行补料。从每个孔中取出0.2ml培养基，并替换为50ul含有不同浓度氯丙嗪的培养基(不含FBS)。20分钟后，添加100ul单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或含有不同浓度鹅脱氧胆酸盐的FITC-白蛋白。将细胞在5％CO2中37℃下再孵育二十分钟，然后从孔中取出上清液，用不含FBS的培养基轻轻洗涤三次，然后填充0.2ml培养基(又不含FBS)。在TECAM读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-白蛋白的摄取与否。图4中的图表中显示的FITC-BSA摄取结果表明，氯丙嗪(高浓度和低浓度)抑制所有浓度的胆汁盐刺激的摄取。这证实了实施例4中描述的实验结果，即，在与氯丙嗪(网格蛋白包被小窝形成的抑制剂)一起预孵育时观察到浓度依赖性的摄取抑制。
实施例11
将Caco-2细胞(第61代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在培养瓶中培养四天，必要时进行补料。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并且通过离心，在不含FBS的培养基中悬浮和洗涤，得到细胞最终浓度为1.3×106个细胞/毫升的悬浮液。将0.4ml悬浮液分配到十一个1.5ml塑料埃彭道夫小瓶中的每一个中，每个小瓶添加40ul含有不同浓度氯丙嗪的培养基(不含FBS)，然后在37℃下孵育20分钟。然后添加400ul单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或含有不同浓度鹅脱氧胆酸盐的FITC-白蛋白。将悬浮液在37℃下再培养二十分钟，然后通过离心，用不含FBS的培养基轻轻洗涤细胞三次。然后将团块重新悬浮在600ul培养基(又不含FBS)中，并将200ul转移到黑色98孔微板的三个孔中的每一个中。在Spectramax Gemini荧光读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-白蛋白的摄取与否。图5中的图表中显示的FITC-BSA摄取结果表明，氯丙嗪(高浓度和低浓度)抑制所有浓度的胆汁盐刺激的摄取。这证实了实验10中所示的发现，并证明悬浮细胞摄取的测量给出的结果与用粘附在塑料表面的细胞进行的实验非常相似。
实施例12
将Caco-2细胞(第61代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在培养瓶中培养四天，必要时进行补料。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并且通过在不含FBS的培养基中离心进行悬浮和洗涤，得到细胞最终浓度为1×106个细胞/毫升的悬浮液。将1ml悬浮液分配到1.5ml塑料埃彭道夫小瓶中，将细胞在培养基(不含FBS)中离心并重新悬浮于100ul体积中。然后添加1ml单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或含有单独或组合的浓度为1mg/ml的鹅脱氧胆酸盐和EDTA的FITC-白蛋白。将悬浮液在37℃下再孵育15分钟，然后通过离心，用不含FBS的培养基轻轻洗涤细胞三次。然后将团块重新悬浮在600ul培养基(又不含FBS)中，并将200ul转移到黑色98孔微板的三个孔中的每一个中。在Spectramax Gemini荧光读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-白蛋白的摄取与否。在该实验中，两种剂(鹅脱氧胆酸盐和EDTA)单独时的浓度太低，无法在测试的时间范围内增强蛋白质的摄取。然而，图6中显示的结果表明，当这两种剂组合时，极其显著地增强摄取。
实施例13
将Caco-2细胞(第61代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在培养瓶中培养四天，必要时进行补料。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并且通过在不含FBS的培养基中离心进行悬浮和洗涤，得到细胞最终浓度为1×106个细胞/毫升的悬浮液。将1ml悬浮液分配到1.5ml塑料埃彭道夫小瓶中，将细胞在培养基(不含FBS)中离心并重新悬浮于100ul体积中。然后添加1ml单独的FITC-hGH(浓度100ug/ml)或含有不同浓度鹅脱氧胆酸盐的FITC-hGH。将悬浮液在37℃下再孵育15分钟，然后通过离心，用不含FBS的培养基轻轻洗涤细胞三次。然后将团块重新悬浮在600ul培养基(又不含FBS)中，并将200ul转移到黑色98孔微板的三个孔中的每一个中。在Spectramax Gemini荧光读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-hGH的摄取与否。图7中显示的资料表明，鹅脱氧胆酸盐以剂量依赖性方式增强细胞中hGH的摄取，类似于其它蛋白质如胰岛素、BSA和酪蛋白的摄取下所看见的。
实施例14
将人肠IEC6细胞系细胞(第48代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在培养瓶中培养四天，必要时进行补料。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并且通过在不含FBS的培养基中离心进行悬浮和洗涤，得到细胞最终浓度为1×106个细胞/毫升的悬浮液。将1ml悬浮液分配到1.5ml塑料埃彭道夫小瓶中，将细胞在培养基(不含FBS)中离心并重新悬浮于100ul体积中。然后添加1ml单独的FITC-白蛋白(浓度100ug/ml)或含有单独或不同浓度鹅脱氧胆酸盐的FITC-白蛋白。将悬浮液在37℃下再孵育15分钟，然后通过离心，用不含FBS的培养基轻轻洗涤细胞三次。然后将团块重新悬浮在600ul培养基(又不含FBS)中，并将200ul转移到黑色98孔微板的三个孔中的每一个中。在Spectramax Gemini荧光读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-白蛋白的摄取与否。图8中显示的资料表明，以与关于Caco-2细胞所见类似的方式，鹅脱氧胆酸盐的存在增强了IEC6细胞中蛋白质的摄取，这证实了这是肠细胞普遍常见的现象。
实施例15
将人肠IEC6细胞系细胞(第48代)在DMEM(补充10％FBS)中以0.5×105个细胞/毫升的密度在培养瓶中培养四天，必要时进行补料。然后将细胞用胰蛋白酶消化，并且通过在不含FBS的培养基中离心进行悬浮和洗涤，得到细胞最终浓度为1×106个细胞/毫升的悬浮液。将1ml悬浮液分配到1.5ml塑料埃彭道夫小瓶中，将细胞在培养基(不含FBS)中离心并重新悬浮于100ul体积中。然后添加1ml单独的FITC-白蛋白(牛)(浓度100ug/ml)或含有浓度为0.5mg/ml的鹅脱氧胆酸盐的FITC-白蛋白，然后添加不同浓度的EDTA。将悬浮液在37℃下再孵育15分钟，然后通过离心，用不含FBS的培养基轻轻洗涤细胞三次。然后将团块重新悬浮在600ul培养基(又不含FBS)中，并将200ul转移到黑色98孔微板的三个孔中的每一个中。在Spectramax Gemini荧光读板器(激发波长492nm，发射波长525nm)中测量细胞中FITC-白蛋白的摄取与否。图9中显示的结果表明，在IEC6细胞中，EDTA以剂量依赖性方式加强了鹅脱氧胆酸盐对BSA摄取的增强。

Claims (39)

1.一种胆汁酸或其药学上可接受的盐，所述胆汁酸或其药学上可接受的盐用于治疗人体或动物体的方法中，所述方法包括向所述人体或动物体施用治疗性化合物，其中：
a)所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸，并且
b)所述方法所述胆汁酸或胆汁盐用于实现或增强所述治疗性化合物的细胞内摄取。
2.根据权利要求1所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求1中所限定的方法中，其中所述胆汁盐与EDTA联合使用。
3.根据权利要求1或2所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求1或2中所限定的方法中，其中所述治疗性化合物是大分子。
4.根据权利要求1或2所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求1或2中所限定的方法中，其中所述治疗性化合物是蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求1至4中的任一项所限定的方法中，其中所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐，优选鹅脱氧胆酸钠。
6.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的所述胆汁酸或胆汁盐的浓度为2mg/ml至40mg/ml。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求2.6中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的所述EDTA的浓度为0.1mg/ml至10mg/ml。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求2.6中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的所述EDTA的浓度为0.2mg/ml至10mg/ml。
9.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，胆汁酸或胆汁盐受体介导的通过网格蛋白包被小窝的内化用于实现或增强所述治疗性化合物的细胞内摄取。
10.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述胆汁酸或胆汁盐的所述用途中，所述胆汁酸或胆汁盐为胶束形式。
11.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，所述胆汁酸或其盐与一种或多种另外的剂组合使用。
12.根据权利要求11所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求11中所限定的方法中，其中在所述胆汁酸或胆汁盐的所述用途中，所述胆汁酸或胆汁盐为胶束形式，并且所述一种或多种另外的剂包括一种或多种如下的剂：
a)稳定所述胆汁酸或其盐的所述胶束形式；和/或
b)实现或增强所述胶束形式的形成。
13.根据权利要求11或12所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求11或12中所限定的方法中，其中所述一种或多种剂包括没食子酸丙酯。
14.根据权利要求11、12或13所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求11、12或13中所限定的方法中，其中所述一种或多种另外的剂包括一种或多种选自以下的剂：
a)融合脂质，优选选自阳离子脂质体、中性辅助脂质如DOPE和阴离子脂质如磷脂酸；
b)细胞穿透肽，优选为具有2至12个氨基酸的细胞穿透肽，如八精氨酸、九精氨酸和八赖氨酸；
c)亲溶酶体剂，优选为氯喹；
d)膜破坏肽，优选为INF7、H5WYG、43E或组氨酸10；
e)膜破坏聚合物，优选为聚乙烯亚胺；
f)光化学内化剂，优选为异硫氰酸荧光素或包含它的化合物；和/或
g)改变细胞内囊泡转运的剂，优选为布雷非德菌素A。
15.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中所述治疗性化合物是核酸聚合物并且所述治疗方法是基因治疗方法。
16.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中所述治疗性化合物包含疏水部分。
17.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，所述胆汁酸或其盐以与所述治疗性化合物非共价缀合的胶束形式使用，以实现或增强所述治疗性化合物的细胞内摄取。
18.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法中，其中在所述方法中，所述胆汁酸或其盐用于实现或增强一种或多种位于细胞附近的治疗性化合物的细胞内摄取。
19.根据前述权利要求中任一项所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如前述权利要求中的任一项所限定的方法，其中所述方法包括施用包含所述胆汁酸或其盐和所述治疗性化合物的组合物，并且，如果在所述方法中将一种或多种另外的剂与所述胆汁酸或其盐组合使用，则还优选使用所述一种或多种另外的剂中的一种或多种。
20.根据权利要求19所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求16中所限定的方法中，其中所述组合物中所述胆汁酸或胆汁盐:所述治疗性化合物的重量比为20:1至5:1。
21.根据权利要求19或20所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求19或20中所限定的方法中，其中所述组合物为溶液、悬浮液或分散体的形式。
22.根据权利要求19或20所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求19或20中所限定的方法中，其中所述组合物为粉末形式，所述粉末包含在胶囊或小丸中。
23.根据权利要求19或20所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求19或20中所限定的方法中，其中所述组合物为糊剂、软膏或凝胶的形式。
24.根据权利要求21所述的胆汁酸或胆汁盐，所述胆汁酸或胆汁盐用于如权利要求21中所限定的方法中，其中所述组合物是用于静脉内施用的组合物，并且所述组合物中的所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物被限制所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物溶解的包衣包封，其中所述包衣(a)在低于7.4的pH下不再限制所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。
25.如权利要求1至24中的任一项所限定的治疗性化合物，所述治疗性化合物用于如权利要求1至24中的任一项所限定的方法中。
26.如权利要求1至24中的任一项所限定的胆汁酸或胆汁盐在制备用于如权利要求1至24中的任一项所限定的方法中的药物中的用途。
27.如权利要求1至24中的任一项所限定的治疗性化合物在制备用于如权利要求1至24中的任一项所限定的方法中的药物中的用途。
28.一种治疗人体或动物体的方法，所述方法如权利要求1至24中的任一项所限定。
29.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)胆汁酸或其药学上可接受的盐，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸；
b)治疗性化合物；和
c)一种或多种选自以下的其它化合物：融合脂质、细胞穿透肽、亲溶酶体剂、膜破坏肽、膜破坏聚合物、光化学内化剂和改变细胞内囊泡转运的剂。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述胆汁盐与EDTA联合使用。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)胆汁酸或其药学上可接受的盐，其中所述胆汁酸是鹅脱氧胆酸或脱氧胆酸；和
b)治疗性化合物；
c)其中所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物被包衣包封，所述包衣(a)在pH 7.4的水性条件下限制所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物的溶解，但在低于7.4的pH下不再限制所述胆汁酸或胆汁盐和所述治疗性化合物的溶解，和/或(b)含有一种或多种能够与体内的靶细胞群体结合的部分。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述胆汁盐与EDTA联合使用。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种如权利要求11至13中的任一项所限定的另外的剂。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的组合物，其中所述胆汁酸或其药学上可接受的盐是鹅脱氧胆酸盐，优选鹅脱氧胆酸钠。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的组合物，其中所述治疗性化合物是大分子。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述治疗性化合物是蛋白质。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的组合物，其中所述胆汁酸或胆汁盐与所述治疗性化合物的比率为20:1至5:1。
38.根据权利要求29至37中任一项所述的组合物，其中在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的所述EDTA的浓度为0.1mg/ml至10mg/ml。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的组合物，其中在要实现或增强细胞内摄取的细胞表面处所达到的所述EDTA的浓度为0.2mg/ml至10mg/ml。
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