CN102106821B - 一种载蛋白类药物的固体脂质纳米粒给药系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型蛋白类药物固体脂质纳米粒及其制备方法，该固体脂质纳米粒是由核壳两部分组成，其中，核心为生物表面活性剂形成胶束或聚集体后包载活性成分，或/和生物表面活性剂形成与活性成分形成协同聚集体；壳是采用固体脂质材料进行包封，将核心包裹于其中。该新型固体脂质纳米粒给药系统不仅具有极高的安全性，同时能有效的保护多肽、多肽类药物生物学活性，明显提高其制剂稳定性，并能通过注射及非注射等多途径施用，并达到较好的生物利用度。

Description

一种载蛋白类药物的固体脂质纳米粒给药系统

技术领域

本发明涉及一种载蛋白类药物的新型给药系统，特别是新型的载蛋白类药物的固体脂质纳米粒给药系统，属于生物药物制剂领域。 

背景技术

蛋白类药物被广泛应用于各种重大疾病的治疗中，但是由于其本身的某些特殊性质，使其在应用上受到很多限制，无法充分发挥作用。为此，近年来许多科学研究者开始研究和开发稳定，半衰期长，生物相容性好并且容易吸收的蛋白类药物新型给药体系。 

固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticle, SLN)是继乳剂、脂质体后，近年来研究十分活跃的靶向控释胶粒给药系统。它以固态的天然或合成的类脂将药物包裹于类脂核中制成粒径约为50～1000 nm的固态胶粒给药体系，在室温下通常呈现固态，既具有聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏少的优势，又兼有脂质体、乳剂毒性低、能大规模生产的优点，是一种有发展潜力的新型给药系统。最初主要适合于亲脂性药物，而亲水性药物可通过酯化等方法制成脂溶性强的前体药物后，再制备SLN。 

目前，已有SLN用于包裹蛋白类药物的报道，尽管处方设计和制备工艺不断改进，仍存在较多问题。 

例如，1999年S. Runge提出采用高压乳匀法制备环孢菌素SLN，但该法制备条件剧烈，且对温度有一定的要求，对于大多数蛋白类药物不适用。之后，Cortesi等和Morel 等采用基于W/O/W型纳米乳的溶剂乳化挥发法分别制得了色甘酸钠和胸腺五肽(Thymopentin)的SLN，包封率可达50%以上，但因蛋白类药物水溶性较好，药物很容易泄漏，使得包封率仍然不高。此后，进一步改进了固体脂质纳米粒的处方和制备技术，如2005年M. Garcia-Fuentes提出w/o/w法制备三棕榈酸甘油酯SLN，采用壳聚糖或PEG进行表面修饰包裹多肽类药物，该法将固体脂质纳米粒同高分子聚合物包衣技术结合，增加纳米粒在胃肠道中的稳定性，但由此又引入高分子聚合物给药的一系列问题，且不利于工业化大生产。 

中国专利文献200910052683.4披露了将降钙素与脂质材料如硬脂酸、单甘脂和（或）油酸按一定比例熔融或溶解后，分散于含有0.01%胆酸钠的水相中搅拌形成纳米混悬液得到鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒。此方法通过加入了液体脂质材料，提高了制剂的稳定性，但是在制备中将蛋白类药物采用高温熔融或者采用有机溶剂溶解，这将大大地造成药物失活或降解。该技术方案中虽然也使用了胆酸钠，但是其在降钙素与液体脂质材料形成微粒之后再加入的，作用是分散微粒，完全不同于本发明中胆酸钠的作用。同时，实施例中采用的有机溶剂为乙醇，但在制备以及后处理过程中均无专门除去乙醇的步骤，使其在安全性方面存在问题。 

还有技术人员通过纳米乳法，在内水相中加入明胶，以防止药物泄漏，提高包封率。但由于明胶自身具有很强的交联作用，在液体环境中可形成膨胀的、薄的坚韧而有弹性的水溶性膜，使微粒粒径增加和稳定性降低，不利于药物的吸收，特别是在口服吸收方面效果较差。 

胆酸盐是一类重要的生物表面活性剂，它能够加强胰脂肪酶的活性，促进胆汁中膦脂及胆固醇的代谢，并促进脂肪酸及一些脂溶性维生素的肠吸收，具有非常重要的生理作用；同时它作为甾族表面活性剂，具有刚性的碳氢骨架，在这些刚性骨架中含有不对称中心以及活泼的羟基，导致其在水溶液中的簇集行为以及簇集体性质的差异。 

目前，很多学者研究了关于胆酸钠的胶束和聚集行为，如H. Danielsson早在1973年就提出胆酸钠在水溶液中临界胶束浓度范围为10～15mM，并指出在高于该浓度时，由于其疏水面的聚集，可以形成低聚集体。同时，还有大量关于胆酸钠与磷脂类物质形成混合胶束的报道，如2007年，Jie Liu首次利用胆酸钠与磷脂在乙酸乙酯中形成反相混合胶束包载胰岛素，用于肺部给药，提高了胰岛素生物利用度；2008年，Rebekah Baskin通过光散射技术研究了胆酸钠与磷脂形成混合胶束各种条件；更有Roche公司的Konakion采用胆盐—磷脂混合胶束作为生理赋形剂进一步提高药物溶解度、稳定性以及提高疗效，增加安全性和减少注射疼痛感等等。以上文献中均是胆酸钠与磷脂形成混合胶束之后再包裹活性药物，主要目的是提高活性药物的脂溶性，从而增加包封率，但这对于大多数水溶性极强的蛋白类药物并不适用。 

因此，纵观整个蛋白类固体脂质纳米粒给药系统的研究，虽然其处方设计和制备技术一直在不断的改进，并能从某一方面解决现有技术存在的缺陷，但又忽略了其他问题或引入其他新的问题，使得目前蛋白类固体脂质纳米给药系统仍存在如制备工艺条件剧烈、蛋白药物稳定性差、包封率低且泄漏严重、安全性差以及通过非注射途径给药后生物利用率低等诸多问题亟待解决。 

发明内容

本发明人由此提出通过胆酸钠与药物之间的物理作用，先形成胶束或聚集体包载活性药物，特别是蛋白类活性药物，以提高蛋白类药物的稳定性，有效的避免蛋白类药物在制剂制备过程活性的丧失以及药物的泄露问题；同时，还通过添加不同种类的脂质材料，形成稳定的混合固体脂质外壳，使结构更加稳定，不易被破坏，从而进一步有效防止活性成分的泄露，提高包封率，并且可以用于胃肠道以及非胃肠道途径给药，显著提高其生物利用度。 

本发明的目的之一是提供一种新型载蛋白类药物固体脂质纳米粒给系统，以解决目前固体脂质纳米粒给药系统在蛋白类药物中的应用缺陷，获得稳定性高，生物相容性良好，包封率和载药量好的新型蛋白类药物固体脂质纳米粒给系统，从而最大限度的保护蛋白类药物活性，提高其生物利用度。 

本发明所述的新型蛋白类药物固体脂质纳米粒，是一种典型的核壳结构，它主要是由两部分构成，其中核心主要是由含有活性成分和生物表面活性剂所形成，壳是主要由固体脂质材料所形成。 

所述的核心指的是生物表面活性剂形成胶束或聚集体后包载活性成分或（和）生物表面活性剂与活性成分相互作用形成协同聚集体所形成。 

本发明的目的之一是提供了一种新型蛋白类药物固体脂质纳米粒，其是一种典型的核壳结构，主要是由两部分构成，其中核心主要是由含有活性成分和生物表面活性剂所形成，壳是主要由固体脂质材料所形成；包含以下重量份的组分： 

生物表面活性剂	10～100份
		固体脂质材料	2～100份。

本发明的目的之一是提供了一种新型蛋白类药物固体脂质纳米粒，优选包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂	20～100份
		固体脂质材料	20～80份。

所述的生物表面活性剂选自甾族类生物表面活性剂中的一种或几种的组合；特别是指胆酸盐类，包括但不限于：牛胆酸钠、猪胆酸钠、鹅胆酸钠、猪脱氧胆酸钠、鹅胆酸钠等中一种或几种的组合。

所述的活性成分为蛋白类药物，所述蛋白类药物进一步是通过化学合成或采用基因重组技术或生物提取等方式获得，进一步优选水溶性蛋白类药物。 

更为优选地，所述蛋白类药物可选自奥曲肽、醋酸生长抑素、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胰岛素、胸腺五肽、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、鲑鱼降钙素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素中的至少一种。 

更优选地，所述的活性成分在内水相中的最大浓度为活性成分的饱和水溶液的浓度，最小浓度至少为0.0001mg/ml。 

本发明所指的壳结构，主要是由固体脂质材料所形成，固体脂质材料可以是天然或合成的，优选自脂肪酸、磷脂以及三酰甘油酯类中的一种或者几种的组合。 

具体地，所述脂肪酸是选自中长链脂肪酸，包括但不限于十二～二十二烷酸中的一种或几种，具体为十二烷酸（或称：月桂酸）、十三烷酸、十四烷酸（或称：肉豆蔻酸）、十五烷酸、十六烷酸（或称：硬脂酸）、十七烷酸（或称：珠光烷酸）、十八烷酸（或称：棕榈酸）、十九烷酸、二十烷酸、二十一烷酸、二十二烷酸（或称：山嵛酸）中的一种或几种所组成，最优选硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、三嵛酸中的一种或几种。 

所述磷脂包括但不限于：天然磷脂、氢化磷脂（或称为：半合成磷脂）、合成磷脂中一种或几种。 

所述天然磷脂，包括但不限于蛋黄卵磷脂、大豆磷脂等。 

所述半合成磷脂，包括但不限于氢化大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂等。 

合成磷脂，包括但不限于二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸等。 

所述的三酰甘油酯类优选自三硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯等中的一种或几种。 

进一步优选地，本发明所述的壳结构优选是由大豆磷脂、硬脂酸和三酰甘油酯类制成。更为重要地，由其混合形成的固体脂质纳米粒更加稳定，能极大的提高在胃肠道中的稳定性，抵挡各种酶的破坏，使蛋白类药物口服生物利用度比原料药至少提高33倍。 

本发明的目的之一是提供了一种新型载蛋白类药物的固体脂质纳米粒，其是一种典型的核壳结构，主要是由两部分构成，其中核心主要是由含有活性成分和生物表面活性剂所形成，壳是主要由固体脂质材料所形成；优选包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂	10～100份
		大豆磷脂	1～50份
硬脂酸	1～50份
		三酰甘油酯类	1～50份；

进一步，优选包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂	20～80份
		大豆磷脂	1～30份
硬脂酸	1～20份
		三酰甘油酯类	1～30份。

本发明的目的之一是提供了一种新型蛋白类药物固体脂质纳米粒制备方法，包括以下步骤：

（1）将活性成分与生物表面活性剂在一定条件形成胶束和（或）聚集体作为内水相；

（2）将上述内水相加入采用有机溶剂溶解的固体脂质材料形成的油相中，通过乳化形成W/O型乳剂；

（3）再加入含有（或不含）表面活性剂的水溶液再次乳化，形成纳米乳； 

（4）最后通过旋转蒸发挥去有机溶剂或直接冷冻干燥、喷雾干燥，即得。

其中，步骤（1）中由活性成分与生物表面活性剂在一定条件下形成胶束和（或）聚集体作为内水相，具体步骤为：将活性成分充分溶解后，加入一定量的生物表面活性剂充分溶解，再涡旋、振摇或搅拌一定时间，保证其形成胶束或聚集体。 

其中，步骤（2）中所述的有机溶剂为中等极性或非极性有机溶剂，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、己烷等。 

更优地，所述的中等极性或非极性的有机溶剂，特别指比水重的有机溶剂中等极性或非极性的有机溶剂，例如氯仿、二氯甲烷、己烷、四氯化碳，优选是二氯甲烷。 

其中，上述制备方法中的内水相：油相的体积比为3：10～1：1，优选为2：5～1：2。 

其中，步骤（3）中优选加入表面活性剂水溶液，乳化后形成的纳米乳比不含表面活性剂纳米乳更加稳定。 

所述表面活性剂包括非离子型表面活性剂；更优选地，所述非离子性表面活性剂包括吐温80、泊洛沙姆188，尤其是泊洛沙姆188。 

所述表面活性剂水溶液的浓度优选为0.05%～5%（g/100ml），最优选0.1%～5%（g/100ml）。 

本发明以脂质材料为载体材料将活性成分制成具有适宜粒径的固体脂质纳米粒，不仅增加药物的稳定性，提高药物在载体中的分散程度和生物利用度，而且可以改变药物的体内过程，增加靶向性。 

本发明目的之一是提供了一种可用于口服的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂及其制备方法。从而解决目前蛋白类药物仅注射给药，造成病人顺应性差的缺陷，避免了蛋白类药物在胃肠道内不稳定、易受胃肠道降解的问题，同时还提高蛋白类药物的口服给药生物利用度，获得了很好的治疗效果。 

选择口服给药，本发明的固体脂质纳米粒可以增强对肠道内皮细胞的亲和性并可通过细胞内吞、融合和派伊尔结转运等途径吸收，有效提高生物利用度。 

通过注射给药，本发明的固体脂质纳米粒可以提高血药浓度，延长药物在血液中的循环时间，且具有靶向性，能选择性到达病变部位、组织或细胞，从而提高药物的治疗指数，减少毒副作用。 

具体地，本发明提供了一种新型的可用于口服的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，主要是由本发明新型固体脂质纳米粒与药学上可以接受的辅料制备成片剂、胶囊等口服给药制剂。 

更为具体地，本发明所述的新型固体脂质纳米粒通过冷冻干燥技术冻干或喷雾干燥技术制备成干粉，加入适量的填充剂、润滑剂等药学上可以接受的辅料制粒填充胶囊或者制粒压片。 

其中，所述的胶囊为普通胶囊或者是肠溶性胶囊、结肠定位胶囊等中的一种或几种。 

本发明目的之一是提供了注射、吸入等多种胃肠外给药形式的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂及其制备方法。 

具体地，本发明提供了一种新型的吸入给药的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，主要是由本发明的新型固体脂质纳米粒与药学上可以接受的辅料制成喷雾剂或粉雾剂，装入适于吸入给药的装置，用于鼻喷或者肺部给药。 

具体地，本发明提供了一种新型的注射给药的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，主要是由本发明的新型固体脂质纳米粒与加入药学上可接受的辅料，制成注射剂，进一步制成冻干粉针。 

虽然，现有技术，例如Jie Liu的《Solid lipid nanoparticles loaded with insulin by sodium cholate-phosphatidylcholine-based mixed micelles: Preparation and characterization》中虽然描述了采用复乳法（W/O/W）制备Ins-SLNs的过程。但是本发明与其技术的技术特征具有明显的区别，并取得了预料不到技术效果，如下所示：

（1）本发明的胆酸钠的用量20-100mg；远远大于Jie Liu实验中胆酸钠的用量10mg，其作用是胆酸钠的用量在临界胶束浓度以上，更有利于形成胆酸钠胶束或者聚集体。

（2）本发明的胆酸钠是直接与活性成分形成了胶束或聚集体后包载活性成分或（和）与活性成分相互作用形成协同聚集体所构成，这将不仅能保持药物的稳定性，有效的保护其活性，更能有效的防止在制备和存储过程中药物的泄露，提高其包封率；Jie Liu实验中胆酸钠是与磷脂形成混合胶束，再由此混合胶束来包裹药物。 

（3）本发明还加入三酰甘油酯类脂质材料，与脂肪酸和磷脂形成更加紧密且坚固的固体脂质外壳，制备得到的SLN其稳定性远远高于Jie Liu实验中SLN，因此在口服的生物利用度方面有了显著的提高，从下文的对比实验就能证明。 

（4）本发明产品制备过程中，内水相和有机相体积比为1：2，而Jie Liu实验中内水相和有机相的体积比为1：5。固体脂质材料的油相的体积与活性成分和生物表面活性剂形成的内水相的体积之比对该体系的成形性、包封率、稳定性有很大的影响。本发明通过调节油相和内水相的比例，出乎预料地大大提高包封率并确保制剂能获得性状较好的固体脂质纳米粒。 

本发明的优点在于：

首先本发明采用与蛋白类药物具有极高亲和力的生物表面活性剂，通过生物表面活性剂自身构成的胶束或聚集体后包裹药物，或者与药物共同作用形成混合胶束或聚集体，这将不仅能保持药物的稳定性，有效的保护其活性，更能有效的防止在制备和存储过程中药物的泄露，提高其包封率，同时胆酸盐的存在还促进了蛋白类药物通过胃肠道细胞吸收、鼻粘膜细胞、肺上皮细胞吸收，进一步提高非注射途径给药安全性及药物生物利用度。

其次，本发明活性成分被生物表面活性剂包裹或形成聚集体，通过固体脂质材料包裹胶束，其中溶有固体脂质材料的油相的体积与活性成分和生物表面活性剂形成的内水相的体积之比对该体系的成形性、包封率、稳定性有很大的影响，通过调节油相和内水相的比例，能大大提高包封率并确保制剂能获得性状较好的固体脂质纳米粒。 

第三，本发明采用混合脂质材料，其多晶型转变现象不如单一脂质严重，采用混合固体脂质层包裹胶束后稳定性较好，进一步确保了该体系的稳定性，防止药物泄漏，提高包封率，特别是将加入磷脂、硬脂酸以及三酰甘油酯类三者混合形成的固体脂质纳米粒更加稳定，能极大的提高在胃肠道中的稳定性，抵挡各种酶的破坏，使蛋白类药物口服生物利用度比原料药提高33倍。 

第四，本发明在制备过程中广泛的筛选了有机溶剂的种类，惊奇的发现采用比水重，且极性较小的有机溶剂，能有效的保证乳剂的稳定性以及水溶性药物不易进入有机相，进一步提高了其包封率；同时因采用极性较小的有机溶剂有利于有机溶剂的去除，防止有机溶剂的残留，确保了该系统的安全性和稳定性。 

第五，本发明的给药系统能成功的包载不同工艺来源的水溶性蛋白类药物，如基因重组或化学合成的生物活性物质，并能有效的包载不同种类的药物，如奥曲肽、醋酸生长抑素、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胰岛素、胸腺五肽、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、牛血清白蛋白、鲑鱼降钙素、卵清蛋白、甲状旁腺素等。 

因此，本发明提供的新型载蛋白类药物的固体脂质纳米粒给药系统及其不同的制剂形式，其选择的各辅料生物相容性好，安全性高，且本发明采用生物表面活性剂与蛋白类药物形成胶束或聚集体，能有效的防止药物的泄露，提包包封率和增加稳定性；同时采用多种脂质材料混合，有效的保护蛋白类药物在制备和储存过程中不被破坏，保持活性，提高其口服、注射、鼻喷、肺部给药等不同给药方式的生物利用度，有效的避免了经胃肠道酶降解，或其他不同pH条件下所造成的药物不稳定，降解失活；本发明所提供的给药系统是一种优良的给药系统，制备工艺简单，重现性好，有利于工业化大生产。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中： 

图1为生物表面活性剂的浓度对包封率和纳米粒径考察结果图。

图2 为内水相与油相的体积比对包封率和纳米粒径的考察图。 

图3为大鼠尾静脉注射鲑鱼降钙素原料药及固体脂质纳米粒药动学研究图。 

图4为大鼠十二指肠给鲑鱼降钙素原料药及固体脂质纳米粒药动学研究图。 

图5为大鼠十二指肠给鲑鱼降钙素原料药及固体脂质纳米粒药效学研究图。 

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 

实施例1  考察生物表面活性剂浓度对纳米粒包封率和粒径考察：

考察胆酸钠用量对_SCT-SLNs制备的影响。精密称取鲑鱼降钙素（_SCT）3.75mg溶解于0.5ml的0.01mol/ml Hcl水溶液中，溶解完全后加入适量胆酸钠，涡旋30min，然后加入到溶解有1mg硬脂酸、10mg三棕榈酸甘油酯和20mg大豆磷脂的1ml二氯甲烷溶液中。探头超声15s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL的0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳。将纳米乳用同样浓度的泊洛沙姆188稀释，旋蒸至二氯甲烷完全挥尽后，即得。

按照上述制备方法分别考察胆酸钠用量为0、10、20、30、50、100、150mg/ml时（基于内水相计），以粒径和包封率作为评价指标，其结果见说明书附图图1。从结果可以看出，当用量在20-30mg/ml时，其包封率逐渐增加，粒径逐渐减小；而当胆酸钠用量为30mg/ml-150mg/ml，其包封率和粒径无显著变化。胆酸钠用量低于20mg/ml时，无法成功制备出纳米粒，可能是因为超声使溶液内部温度升高，使胆酸钠的临界胶束浓度提高所造成；当胆酸钠用量为20mg/ml时，形成的胶束数目（聚集数）也相对较少，随着胆酸钠用量的增加，其胶束构型也变得复杂，可形成不同等级的聚集体，这将最大限度的包载药物或与药物形成更加稳定的混合胶束或聚集体，使包封率从53.9%提高到92.11%；当胆酸钠用量在30 mg/ml-150mg/ml，胆酸钠用量已经达到最佳，再继续增加胆酸钠用量，其溶液容易变成凝胶固化。因此胆酸钠用量应该在20-150mg/ml，最优选30-150 mg/ml。 

实施例2  考察有机溶剂的种类对纳米粒粒径和稳定性的考察：

考察不同有机溶剂对_SCT-SLNs粒径和稳定性影响，精密称取鲑鱼降钙素7.5mg溶解于0.5ml 0.01mol/ml HCl水溶液中，溶解完全后加入适量胆酸钠，然后加入溶解有1mg硬脂酸，大豆磷脂20mg的1ml有机溶剂中，探头超声15s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL的0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳。将纳米乳用同样浓度的泊洛沙姆188溶液稀释，旋蒸至有机溶剂完全挥尽后，即得SCT-SLNs分散液，考察粒径和稳定性变化情况，其中稳定性以‘好’、‘中’、‘差’、‘ / ’评价，其中‘好’代表放置24小时后，粒径大小无变化，溶液呈淡蓝色乳光的澄明溶液，‘中’代表放置24小时后，粒径变大，溶液有轻微的聚集，‘差’代表放置24小时后，粒径大于1000nm，溶液聚集或分层，‘ / ’代表制剂无法成形。其结果见如下表1:

表1：考察有机溶剂的种类对纳米粒径和稳定性的考察：

由表1可以看出采用二氯甲烷、四氯化碳、氯仿制备出的纳米粒性状较好。

实施例3  考察不同脂质材料混合对包封率和粒径以及稳定性的影响：

精密称取鲑鱼降钙素7.5mg溶解于0.5ml 0.01mol/ml HCl水溶液中，溶解完全后加入25mg胆酸钠，涡旋30min，然后加入到溶解有（按表2中SLN1、2、4-10号处方要求不同比例添加混合脂质材料）脂质材料的1ml二氯甲烷溶液中。探头超声15s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳。将纳米乳用同样浓度的泊洛沙姆188稀释，旋蒸至二氯甲烷完全挥尽后，即得。其各处方对包封率、粒径以及稳定性（放置24小时后的稳定性）的影响结果见如下表2：

表2：不同脂质材料混合对包封率和粒径的考察结果图表：

结果表明混合脂质材料对能显著提高包封率，特别采用大豆磷脂、硬脂酸、三酰甘油酯类三种脂质材料混合，其包封率均能达到90%以上，且稳定性较好。

实施例4  考察内水相与油相的体积比对包封率、载药量和纳米粒粒径的考察：

精密称取鲑鱼降钙素3mg溶解于适量的0.5ml 0.01mol/ml HCl溶液中，溶解完全后加入25mg胆酸钠，涡旋30min，然后加入到溶有1mg硬脂酸，、20mg大豆磷脂的1 mL的二氯甲烷溶液中，探头超声15s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL 0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳。将纳米乳用同样浓度的泊洛沙姆188溶液稀释，旋蒸至二氯甲烷完全挥尽后，即得SCT-SLNs分散液。

按照上述制备方法分别考察内水相/油相体积比值：1、0.5、0.45、0.4、0.3、0.25、0.2、0.17、0.1。以粒径和包封率为评价指标，其结果见说明书附图图2。从图中可以看出，随着内水相与油相比例增大，其包封率增大，载药量增大，粒径减小；当两者比值为0.5时，包封率达到95.25%，载药量达到12.49%，粒径为133.7 nm，但继续增加其比例，其包封率、载药量变化不明显。因此选择内水相：油相的体积比为1：1-3：10，优选选择1：2-2：5 

实施例5  新型鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒制备

精密称取鲑鱼降钙素2.5mg溶解于1ml水溶液中，溶解完全后加入50mg胆酸钠，涡旋30min，然后加入到用二氯甲烷溶解的1mg硬脂酸，20mg大豆磷脂，7mg棕榈酸的混合脂质材料中。探头超声15s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳，旋蒸至二氯甲烷完全挥尽后，即得SCT-SLNs。

实施例6  新型牛血清白蛋白固体脂质纳米粒制备

精密称取牛血清白蛋白3.75mg溶解于0.5ml水溶液中，溶解完全后加入50mg胆酸钠，涡旋30min，然后加入到用己烷溶解的20mg大豆磷脂，20mg三棕榈酸甘油酯、3mg棕榈酸的混合脂质材料中。探头超声5s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL 5%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率80W，形成纳米乳，冷冻干燥除去二氯甲烷，即得SCT-SLNs。

实施例7  新型胰岛素固体脂质纳米粒制备

精密称取胰岛素5.5mg溶解于0.5ml，0.01M HCl 水溶液中，溶解完全后加入50mg胆酸钠，涡旋30min，然后加入到用二氯甲烷溶解的10mg大豆磷脂，20mg三嵛酸甘油酯的混合脂质材料中。探头超声15s，功率100W，形成初乳。将初乳加入到4mL 2 %的吐温80溶液中，探头超声35s，功率80W，形成纳米乳，即得。

实施例8  新型胰高血糖素样肽-1固体脂质纳米粒制备

精密称取胰高血糖素样肽-1 3mg溶解于0.8ML，0.08M Hcl水溶液中，溶解完全后加入30mg胆酸钠，涡旋15min，然后加入到用二氯甲烷溶解的20mg硬脂酸，30mg大豆磷脂，8mg三月桂酸甘油酯的混合脂质材料中。探头超声20s，功率40W，形成初乳。将初乳加入到4mL 0.1%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声25s，功率80W，形成纳米乳，旋蒸至二氯甲烷完全挥尽后，即得。

实施例9  新型艾塞那肽固体脂质纳米粒制备

精密称取艾塞那肽4mg溶解于0.5ML，0.02M Hcl水溶液中，溶解完全后加入20mg胆酸钠，振摇25min，然后加入到用氯仿溶解的1mg硬脂酸， 20mg大豆磷脂，10mg三棕榈酸甘油酯的混合脂质材料中，探头超声15s，功率100W，形成初乳。将初乳加入到4mL 0.05%的泊洛沙姆188溶液中，探头超声15s，功率200W，形成纳米乳，冷冻干燥除去二氯甲烷，即得。

实施例10  新型胰高血糖素样肽-1固体脂质纳米粒制备

精密称取胰高血糖素样肽-1 3mg溶解于0.8ML，0.02M Hcl水溶液中，溶解完全后加入20mg胆酸钠，搅拌25min ,然后加入到用氯仿溶解的1mg硬脂酸，20mg大豆磷脂中脂质材料中，探头超声55s，功率100W，形成初乳。将初乳加入到4mL的1%的tween80溶液中，探头超声15s，功率200W，形成纳米乳,冷冻干燥除去氯仿，即得胰高血糖素样肽-1固体脂质纳米粒。

实施例11  新型胸腺五肽固体脂质纳米粒制备

精密称取胸腺五肽1mg溶解于0.5ML，0.05M Hcl水溶液中，溶解完全后加入20mg胆酸钠，振摇1h，然后加入到用氯仿溶解的1mg硬脂酸， 20mg大豆磷脂中脂质材料中。探头超声25s，功率150W，形成初乳。将初乳加入到水溶液中，探头超声三次35s，功率200W，形成纳米乳，采用低温冻干燥技术，除去氯仿，获得胸腺五肽固体脂质纳米粒。

实施例12  新型鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒胶囊的制备

按实施例5制备鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒后，加入5%甘露醇，通过冷冻干燥技术制成冻干粉针后，加入微晶纤维素1.5g，微分硅胶0.1mg，充分混合后填充胶囊。

实施例13  新型鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒片剂的制备

按实施例5制备鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒后，加入5%甘露醇，通过冷冻干燥技术制成冻干粉针后，过80目筛，然后加入已80目筛微晶纤维素1g，微分硅胶0.3mg，预交化淀粉1.5g充分混合后直接压片。

【药动学研究】

实验例1

1) 随机取已禁食12小时的雄性Wistar大鼠（200-300G）10只，随机分为两组，制剂组5只(处方为实施例3中SLN2)，原料组5只。尾静脉给予鲑鱼降钙素及鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒0.5mL（含SCT 10IU/Kg按预定的时间点（0min, 3min, 10min, 20min, 40min, 90min, 120min, 4h, 8h, 12h）取血0.3ML，加入已涂抹肝素的EP管内，40⁰C, 5000rpm，离心5min，取上清100UL，采用鲑鱼降钙素放免试剂盒测定给药大鼠不同时间血浆中的药物浓度，其C-T图见说明书附图图3，结果表明鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒组AUC为173694.927±43408.972，原料药AUC为503747.451±274686.831，制剂组相对于原料组AUC提高了三倍以上。

2) 随机取已禁食20小时的雄性Wistar大鼠（200-300G）10只，随机分为三组，制剂1组(处方为实施例3中SLN1)5只，制剂2组(处方为实施例3中SLN2)5只，制剂3组(SLN3是指除药物浓度为制剂2组的一半)组5只，原料组5只。口服给予鲑鱼降钙素及鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒0.5mL（含SCT 250IU/Kg按预定的时间点（0min, 3min, 10min, 20min, 40min, 90min, 120min, 4h, 8h, 12h）取血0.3ML，加入已涂抹肝素的EP管内，4℃, 5000rpm,离心5min,取上清100UL，采用鲑鱼降钙素放免试剂盒测定给药大鼠不同时间血浆中的药物浓度，其C-T图见说明书附图图4，结果表明制剂组绝对生物利用度均显著高于原料组，其原料组的绝对生物利用度为0.28%，制剂组1，2，3组绝对生物利用度的分别为2.26%、2.42%、9.26%，，其制剂组1，2，3的生物利用度分别为原料组8.07倍，8.64倍，33.07倍；同时从图中可以看出混合脂质材料的使用，特别是磷脂、硬脂酸、三酰甘油酯类三者混合其生物利用度显著的提高。 

实验例2

随机取已禁食35小时的雄性Wistar大鼠（200-300g）10只，随机分为七组，制剂组分为5组（处方为实施例3中SLN1，SLN2，SLN4，SLN5，以及药动学十二指肠给药中的SLN3（即实验例1中的SLN3）），每组分别为5只,原料组（s CT-alone）5只，生理盐水组(control)五只。分别十二指肠给予鲑鱼降钙素及鲑鱼降钙素固体脂质纳米粒0.5mL（含SCT 250IU/Kg），按预定的时间点（0min, 3min, 10min, 20min, 40min, 90min, 120min, 4h, 8h, 12h）取血0.3ML，加入已涂抹肝素的EP管内，4⁰C, 5000rpm，离心5min,取上清100UL，采用邻甲酚酞络合铜（OCPC）比色法测定大鼠血清钙离子浓度：用微量移液器吸取血清40ul，加入钙显色剂5ml混合，立即在570nm波长处测定其吸收度。经标准曲线换算得血清钙离子浓度，以给药前大鼠血清钙离子浓度作为100% ,各时间点降血钙百分率按下述公式计算：降血钙百分率F% = Ct /C0 ×100% (Ct和C0分别表示t时间点的大鼠血清钙离子浓度和给药前大鼠血清钙离子浓度)，以降血钙百分率F%对时间作曲线得降血钙百分率-时间曲线，结果见说明书附图图5，由图可见各制剂组降血钙效果明显好于原料组，显著性区别于生理盐水组。

实验例3 本发明与现有技术产品的口服生物利用度比较

对比例1根据Jie Liu的《Solid lipid nanoparticles loaded with insulin by sodium cholate-phosphatidylcholine-based mixed micelles: Preparation and characterization》制备。分别称取2mg棕榈酸和硬脂酸的混合物(1:1)，加至溶有大豆磷脂的乙酸乙酯溶液中，溶解形成有机相。精密量取胰岛素储备液0.2mL (25mg/mL 的Ins 0.01M的HCl溶液)，溶解10mg胆酸钠，然后加入到有机相中。探头超声3次（功率为40W），每次5s，形成初乳。将初乳加入到4mL0.1%的F68溶液中，探头超声三次（功率为80W），每次5s，形成复乳。将复乳用同样浓度的F68溶液稀释，旋蒸至乙酸乙酯完全挥尽后，用蒸馏水定容至10mL。按照药动学研究实验例1（2）进行口服生物利用度，研究发现Jie Liu处方口服生物利用度为0.59%。而本发明所得制剂组1-3生物利用度均高于Jie Liu处方，见下表。

表3：Jie Liu处方与本发明制剂组1、2、3绝对生物利用度比较表： 

实验例4 本发明与现有技术产品的生物利用度比较

对比例2根据CN101569608A制备，具体为将4.0mg/ml鲑鱼降钙素水溶液与硬脂酸、单甘脂按0.0045/1一同溶解于乙醇中，65⁰C下加热溶解澄清，然后将其导入冰的0.01%胆酸钠水溶液中，搅拌5-10min，形成纳米粒混悬液，然后在-70⁰C下冷冻10小时，室温融化，高速离心分离获得纳米沉淀，然后用含0.01%胆酸钠水溶液分散，得到口服纳米粒溶液，然后按照药动学研究实验例1（2）进行口服生物利用度，研究发现CN101569608A处方口服生物利用度为0.97%。而本发明所得制剂组1-3生物利用度均高于该处方，见下表。

表4：CN101569608A处方与本发明制剂组1、2、3绝对生物利用度比较表： 

Claims (19)

1.一种蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于其为核壳结构，主要由两部分构成：

（1）核心主要是由活性成分与生物表面活性剂所制成；

（2）壳主要是由天然或合成的固体脂质材料所制成；

其中，蛋白类药物固体脂质纳米粒包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂    10～100份

固体脂质材料      2～100份；

所述的蛋白类药物选自水溶性蛋白类药物；

所述的生物表面活性剂选自牛胆酸钠、猪胆酸钠、鹅胆酸钠、猪脱氧胆酸钠、鹅胆酸钠中一种或几种的组合；

所述的固体脂质材料选自脂肪酸、磷脂以及三酰甘油酯类中的一种或者几种的组合。

2.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂    20～100份

固体脂质材料      20～80份。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的蛋白类药物选自奥曲肽、醋酸生长抑素、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胰岛素、胸腺五肽、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、鲑鱼降钙素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的脂肪酸是选自中长链脂肪酸。

5.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的脂肪酸是选自十二～二十二烷酸中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的脂肪酸是选自月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、硬脂酸、十七烷酸、棕榈酸、十九烷酸、二十烷酸、二十一烷酸、山嵛酸中的一种或几种所组成。

7.根据权利要求7所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的脂肪酸是选自硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、三嵛酸中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂中一种或几种。

9.根据权利要求8所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的天然磷脂选自蛋黄卵磷脂、大豆磷脂。

10.根据权利要求8所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的半合成磷脂选自氢化大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂。

11.根据权利要求8所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的合成磷脂选自二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸。

12.根据权利要求1所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于所述的三酰甘油酯类选自三硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯中的一种或几种。

13.一种蛋白类药物的固体脂质纳米粒，其特征在于其为核壳结构，主要由两部分构成：

（1）核心主要是由活性成分与生物表面活性剂所制成；

（2）壳主要是由天然或合成的固体脂质材料所制成；

包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂    10～100份

大豆磷脂          1～50份

硬脂酸            1～50份

三酰甘油酯类      1～50份。

14.根据权利要求13所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒，其特征在于包含以下重量份的组分：

生物表面活性剂    20～80份

大豆磷脂          1～30份

硬脂酸            1～20份

三酰甘油酯类      1～30份。

15.一种根据上述权利要求任一项所述的蛋白类药物固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将活性成分与生物表面活性剂形成胶束和/或聚集体作为内水相；

（2）将上述内水相加入采用有机溶剂溶解的固体脂质材料形成的油相中，通过乳化形成W/O型乳剂；

（3）再加入含有或不含表面活性剂的水溶液再次乳化，形成纳米乳；

（4）最后通过旋转蒸发挥去有机溶剂或直接冷冻干燥、喷雾干燥，即得。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，

其中步骤（1）中由活性成分与生物表面活性剂形成胶束和/或聚集体作为内水相，具体步骤为：将活性成分充分溶解后，加入一定量的生物表面活性剂充分溶解，再涡旋、振摇或搅拌一定时间，保证其形成胶束或聚集体；

其中，步骤（2）中所述的有机溶剂为中等极性或非极性有机溶剂；

其中，步骤（3）中加入的表面活性剂包括非离子型表面活性剂。

17.一种用于口服的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，其特征在于主要是由上述权利要求1-14任一项所述的固体脂质纳米粒与药学上可以接受的辅料制备成口服给药制剂。

18.一种吸入给药的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，其特征在于主要是由上述权利要求1-14任一项所述的固体脂质纳米粒与药学上可以接受的辅料制成喷雾剂或粉雾剂，装入适于吸入给药的装置，用于鼻喷或者肺部给药。

19.一种注射给药的蛋白类药物固体脂质纳米粒制剂，其特征在于主要是由上述权利要求1-14任一项所述的固体脂质纳米粒与加入药学上可接受的辅料，制成注射剂或制成冻干粉针。

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