BR112014024601B1 - Oligonucleotídeo modificado composto de funções tióis; substrato enxertado com oligonucleotídeo modificado; método e kit de detecção de ácido nucleico em uma amostra de oligonucleotídeo modificado; e o uso oligonucleotídeo modificado para a detecção de ácidos nucleicos - Google Patents
Oligonucleotídeo modificado composto de funções tióis; substrato enxertado com oligonucleotídeo modificado; método e kit de detecção de ácido nucleico em uma amostra de oligonucleotídeo modificado; e o uso oligonucleotídeo modificado para a detecção de ácidos nucleicos Download PDFInfo
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Abstract
OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS E O USO DESTES PARA A DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS. A presente invenção está relacionada a oligonucleotídeos modificados contendo duas ou mais funções tióis, que podem ser imobilizadas em uma superfície de ouro ou em uma superfície enxertada, especificamente em uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamídicas, preferencialmente funções de maleimida ou acrilamida. A invenção também está relacionada a um método para detectar um ácido nucleico em uma amostra biológica composta de um passo de detecção de hibridização entre um oligonucleotídeo modificado e um ácido nucleico alvo, amplificado a partir de uma amostra biológica. A invenção está relacionada mais especificamente a um método para detectar, genotipar ou sequenciar um organismo patogênico, preferencialmente um vírus.
Description
[001]-A presente invenção está relacionada à oligonucleotídeos modificados contendo duas ou mais funções tióis, que podem ser imobilizadas em uma superfície de ouro ou em uma superfície enxertada, especificamente em uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções halo acetamídicas, preferencialmente funções de maleimida ou acrilamida. A invenção também está relacionada a um método para detectar um ácido nucleico em uma amostra biológica composta de um passo de detecção de hibridização entre um oligonucleotídeo modificado e um ácido nucleico alvo amplificado a partir de uma amostra biológica. A invenção está relacionada mais especificamente a um método para detectar, genotipar ou sequenciar um organismo patogênico, preferencialmente um vírus.
[002]-Devido à sua estabilidade físico-química e à especificidade conferida pelos sucessivos arranjos dos diferentes nucleotídeos dos quais são compostos, os ácidos nucleicos são moléculas, extremamente bem adequadas, para utilizar em métodos para a específica detecção e identificação de organismos humanos, animais, vegetais, bacterianos ou virais.
[003]-Essas propriedades levaram ao desenvolvimento de biossensores confiáveis e sensíveis, compostos convencionalmente de um elemento de reconhecimento molecular e um transdutor. O elemento de reconhecimento molecular, chamado de "sensor", é geralmente imobilizado na superfície do transdutor e exibe alta especificidade e sensibilidade para uma molécula "alvo" de ácido nucleico. A função do transdutor é converter o evento de reconhecimento molecular, ou seja, a hibridização entre as sequências de nucleotídeos do sensor e do alvo, em um sinal que pode facilmente medido. Dessa maneira os biossensores exploram as capacidades para emparelhar duas sequências complementares de nucleotídeos contidas no sensor e no alvo, e gerar um sinal quando ocorre a hibridização das duas sequências.
[004]-Biossensores são caracterizados pelo método de transdução utilizado para revelar a hibridização das sequências do sensor e do alvo.
[005]-Biossensores com transdução direta possibilitam detectar a hibridização das sequências sem empregar uma rotulagem especial. Eles compreendem, por exemplo, sistemas eletroquímicos, no qual a transdução ocorre por reações de transferência de elétrons, como amperometria, com base na detecção de alterações na corrente em um potencial constante, condutometria, com base na detecção de alterações na condutividade entre dois eletrodos, ou potenciometria, com base na detecção de alterações no potencial, em uma corrente constante. Biossensores com transdução direta também compreendem sistemas gravimétricos, com base em tecnologias piezo-elétricas, por exemplo, explorando as propriedades de um cristal de quartzo, cuja frequência varia em resposta as mudanças que ocorrem em sua superfície. Biossensores com transdução direta são geralmente rápidos e específicos, porém têm sensibilidade limitada (10*9 a 10*12 m). Biossensores com transdução direta são bem adequados para produzir sistemas de diagnóstico baratos, descartáveis e portáteis
[006]-Por sua parte, biossensores com transdução indireta requerem a rotulagem das sequências do ácido nucleico alvo, e requerem que passos de lavagem sejam realizados antes da detecção. Biossensores com transdução indireta são construídos geralmente na forma de sistemas óticos, nos quais a detecção é realizada em um leitor acoplado a um microscópio confocal, baseado na emissão de luz por um ou mais marcadores fluorescentes em resposta à excitação induzida por laser. Biossensores com transdução indireta, portanto, requerem em geral instrumentos complexos, difíceis de operar, requerendo uma pessoa qualificada, porém têm alta sensibilidade de detecção (10* a 10* 15 M). Biossensores com transdução indireta constituem a tecnologia mais utilizada em campo para diagnósticos baseados em ácidos nucleicos.
[007]-Biossensores, com transdução direta ou indireta, permitem detectar milhares ou dezenas de milhares de hibridizações de sequências de ácido nucleico simultaneamente e estão dispostos em geral na forma de um arranjo organizado de sondas imobilizadas na forma de pontos em um suporte sólido Cada ponto contém cerca de 106 sondas idênticas tendo a mesma sequência nucleotídica, e a sequência nucleotídica das sondas difere de um ponto ao próximo ponto.
[008]-"Micromatrizes" são biossensores extremamente complexos, compostos de 1000 a 106 pontos com um tamanho de cerca de 20 a 50 μm. Elas são muito sofisticadas e caras e são destinadas principalmente para sequenciamento de DNA, para investigação de doenças genéticas e para analises de polimorfismos Este tipo de biossensor está sendo desenvolvido especificamente pelas empresas Affymetrix, Illumina e Agilent. Por sua parte, "macromatrizes" são biossensores de baixa complexidade, compostos de 1000 a 10000 pontos com tamanho maior ou igual a 200 μm.
[009]-As sondas podem ser imobilizadas em biossensores por acoplamento covaiente ou de forma não covaiente O acoplamento covaiente da sonda com o transdutor pode ser obtido, por exemplo, por fotolitografia ou por reação de um oligonucleotideo aminado com uma superfície revestida com um silano füncionalizado. A sonda pode ser imobilizada também em uma superfície metálica e, especificamente, sobre uma superfície de ouro, por exemplo, por meio de uma ligação entre um átomo de ouro e um átomo de enxofre Entretanto, a ligação Au-S apresenta resistência moderada, e uma única ligação ouro-enxofre não é suficiente para imobilizar uma sonda na superfície de ouro de uma forma muito estável. De fato, os métodos de detecção são compostos de passos, especificamente de lavagem, que geram fortes tensões mecânicas, que podem desestabilizar a ligação Au-S.
[010]-A sonda também pode ser acoplada ao transdutor de forma não covaiente, por exemplo, por adsorção eletrostática. O acoplamento não covaiente pode, por exemplo, resultar da interação entre os fosfatos negativamente carregados do DNA da sonda e a superfície do transdutor revestido com y-aminopropilsilano ou com uma camada de poli- L-lisina. As interações não covalentes entre a sonda e o transdutor oferecem pouca resistência aos passos de lavagem realizados durante os procedimentos de detecção, especialmente quando a detecção é realizada por transdução indireta, pois a detecção da hibridização requer, depois do próprio passo de hibridização, a remoção das sequências de nucleotideos-alvo rotulados que não ficaram ligados à sequência nucleotídica da sonda Adicionaimente, acoplamento não covalente não permite mudanças significativas nas condições de operação para aumentar a estringência dos passos de hibridização ou lavagem e, assim, tomá-los mais específicos.
[011]-0 Documento EP 0 523 978 divulga os compostos fosforamiditas ou tbsfbnados que podem ser utilizados para produzir oligonucleotídeos modificados por tiol. Entretanto, esses compostos podem ser introduzidos somente uma vez, e somente na extremidade 5' de um oligonucleotídeo.
[012]-O documento US 7,601,848 divulga um composto polifuncional formado por dois átomos de enxofre, destinado a ser incorporado em oligômeros para criar pelo menos duas ligações ouro-enxofre e, assim, estabilizar o oligonucleotídeo na superfície de ouro. Alguns desses compostos formam uma função fosforamidica Os compostos utilizados neste documento são, entretanto, fabricados a partir de compostos muito caros e o acoplamento do composto polifuncional nos oligonucleotídeos não tem um rendimento satisfatório devido ao impedimento estérico desse composto. DE acordo com este documento um agente aglutinante é necessário para ligar os compostos de tiol entre si e, assim, causar a múltipla introdução de compostos tióis em um oligonucleotídeo.
[013]-A finalidade da invenção é consequentemente desenvolver uma sonda formada a partir de um oligonucleotídeo tendo pelo menos duas funções tióis, com capacidade de ser enxertado de forma simples e eficiente em diversos suportes, composto de duas superfícies revestidas com metal (por exemplo, ouro) e superfícies enxertadas compostas de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções de maleimida ou acrilamida A sonda da invenção supera as desvantagens supramencionadas, pelo menos parcial mente, e toma possível aumentar a especificidade e a sensibilidade de detecção das sequências de nucleotídeos-alvo, independentemente do tipo de transdução (direta ou indireta) empregada durante a detecção.
[014]-A invenção também visa proporcionar um método para detectar, sequenciar e/ou genotipar ácidos nucleicos de organismos patogênicos ou infecciosos ou de genes responsáveis por doenças ou envolvidas com estas, que seja econômico, rápido, sensíveis, mais flexíveis e mais fáceis de automatizar do que os métodos atuais.
[015]-A invenção está relacionada em primeiro lugar à oligonucleotídeo modificado correspondente à fórmula (Xllb): (Xllb) Nt-N2-,..-Nn-rNn-CrbMMr.. -M^rM^-Crbjy ou à fórmula (XlIIb): (Xinb) (Ic'Mrbjyl-Ni-Nj-.. .-NI1.i-Nn-(I,b)y-(Mi-M2-...-Mm.i-Mm)p-(rb)y" no qual, Ni, . . ., Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, Mi, Mn, representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (I'b) representa um composto, definido pela fórmula:
(Ic1) representa um composto, definido pela fórmula:
n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, p representa 0 ou 1, y' é um número inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a l e y1 é igual a 0 se p tiver o valor igual a 0, y" é um número inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e, se p tiver o valor igual a 0, então y" tem o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y') ou (y + y' + y") estando compreendida entre 2 e 12, X é selecionado a partir de grupos alquila Cl-Cl 2 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila Cl-Cl 2, grupos alcóxi Cl-Cl 2, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, Y é selecionado a partir de grupos alquila C1-C12 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila Cl-Cl 2, grupos alcóxi Cl-Cl 2, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, Z é selecionado a partir de grupos alcóxi C1-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, grupos NCO-alquila Cl-Cl 2, grupos CON- alquila Cl-Cl 2, W é selecionado a partir dos grupos alcano triila C1-C12, dos grupos triila arila C6-C18 e dos grupos triila aralcano C6-C18, preferencialmente um grupo selecionado de CH, CCH3, CCH2CH3, um ciclohexano triil e benzeno triil, R é H ou é selecionado a partir de gnipos acil C1-C12, S-alquila C1-C12, S-aril C6-C12, S-2-piridina, S-heteroalquila Cl-Cl2 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, S- cicloalquila C3-C12, S-cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, e RI é selecionado a partir de grupos 2-cianoetil ou R'lR'jRSSiCHtCHa, nos quais R'i, R'2 e R’i podem ser idênticos ou diferentes e representam um grupo selecionado a partir de alquilas lineares ou ramificadas compostas de 1 a 12 átomos de carbono e as arilas C6- C12.
[016]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o oligonucleotídeo modificado da invenção corresponde à fórmula:
no qual n, y, Ni,..., Nn.i, X, Y, Z, WeR têm a mesma definição conforme acima, e Bn ■epresenta a base do enésimo nucleotideo
[017]-De acordo com outro exemplo de concretização da invenção, o oligonucleotídeo modificado corresponde à fórmula:
no qual n, y, N2>..Ns, X, Y. Z, W e R têm a mesma definição conforme acima, e B> representa a base do primeiro nucleotideo
[018]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima forma uma sequência nucleotídica Nn) e, opcional mente, uma sequência nucleotídica que sâo específicas de um vinis, uma bactéria ou um gene responsável por uma doença ou envolvidos com uma doença.
[019]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a sequência nucleotídica (Ni-Nr - -Nn.i-Nn) e, opcional mente, a sequência nucleotídica (MJ-MJ-. . são selecionadas a partir de: - sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 28, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35 ou NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36 específicas do vírus da hepatite C (HCV), - sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 40, específicas de flavivírus, - a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 18 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 41, específicas do vírus da dengue, ou - a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 19, específica do vírus da febre do Oeste do Nilo (WNV).
[020]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a sequência nucleotídica (Nl-N2-...-Nn.i-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (Mi-M?-. têm uma estrutura de anômero alfa, anômero beta, linear, ou do tipo estrutura em grampo ("hairpin loop")
[021]-A invenção está relacionada adicionalmente a um substrato enxertado com pelo menos um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima, tal substrato composto de pelo menos um zona receptora revestida com uma substância que tolera o enxerto de tal oligonucleotídeo modificado.
[022]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, tal zona receptora de tal substrato enxertado é revestida com uma película de ouro ou platina, e tal substrato é de metal, preferencialmente de cobre, ou tal zona receptora é composta em sua superfície pelo menos de uma ligação dupla carbono-carbono (função alquenil) ou uma ligação carbono-carbono tripla (função alquinil) ou funções haloacetamídicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, sendo tal substrato de plástico, preferencialmente de poliestireno De acordo com um exemplo de concretização da invenção, os substratos utilizados são polímeros não condutivos De acordo com outro exemplo de concretização da invenção, os substratos utilizados para realizar a invenção são condutivos.
[023]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o substrato enxertado é plano (parcial ou totalmente) ou curvo, e pode ser vantajosamente de formato esférico. De acordo com um exemplo de concretização, o substrato é não planar, por exemplo, na forma de micropartículas ou nanoparticulas e é preferencialmente magnético.
[024]-A invenção está relacionada ainda a um método para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica, composto de um passo de detecção de tal ácido nucleico alvo com pelo menos uma sonda de detecção formada por um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima.
[025]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o método de detecção da invenção é composto dos passos de: - obter pelo menos uma fonte de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica, - produzir um amplicon pela amplificação de tal ácido nucleico alvo a partir da fonte de ácido nucleico, e - detectar a hibridização de tal amplicon com pelo menos uma sonda de detecção formada por um oligonucleotídeo modificado, conforme descrito acima.
[026]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o método de detecção da invenção permite determinar o genótipo e/ou subtipo de um virus presente em uma amostra biológica, e é composto por. - gerar um amplicon pela amplificação de uma sequência nucleotidica alvo, correspondente à região genômica do vírus, contendo informações relacionadas ao genótipo e/ou subtipo viral, e - detectar a hibridização de tal amplicon com pelo menos uma sonda de detecção formada por um oligonucleotídeo modificado, conforme descrito acima, com uma sonda especifica para o genótipo e/ou subtipo virai.
[027]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o passo de produzir o amplicon do método de detecção da invenção é realizado com uma mistura de primers (sequências iniciadoras) de nucleotídeos, preferencial mente selecionada do par de sequências iniciadoras - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 9, quando o amplicon é gerado a partir de HCV, qualquer que seja o genótipo virai envolvido, este par de primers é genérico e permite a amplificação de um amplicon "longo" de 401 nt, começando a partir de qualquer genótipo de HCV; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 10 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, par que permite a geração de amplicons "curtos" de 191 nt específicos para o genótipo la/lb; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 29 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, par que permite a geração de amplicons "curtos" de 108 nt específicos para o genótipo 2; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 11, par que permite a geração de amplicons "curtos" de 143 nt, específicos para o genótipo 3; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 30, par que permite a geração de amplicons "curtos" de 175 nt, específicos para o genótipo 4a/4d; e - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 20 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21, e/ou - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 22 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21 quando o amplicon é gerado a partir de um flavivirus.
[028]-A invenção está relacionada ainda a um kit para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica, composto de: - pelo menos um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima e pelo menos um substrato composto de pelo menos um zona receptora revestida com uma substância que tolera o enxerto de tal oligonucleotídeo modificado, sendo tal zona receptora preferencial mente revestida com ouro, com platina ou formando pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções halo acetamídicas, preferencialmente funções de maieimida ou acrilamida, - pelo menos um substrato enxertado conforme descrito acima.
[029]-A invenção está relacionada ainda a um oligonucleotídeo tendo uma sequência nucleotidica selecionada a partir das sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 28, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 18, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 19, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 40 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 41
[030]-A invenção está relacionada ainda ao uso de um oligonucleotídeo ou de um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima ou de um substrato enxertado conforme descrito acima, para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica.
[031]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, tal uso permite o diagnóstico ou a genotipagera de cepas virais, preferencialmente dos virus de HCV, dengue ou da febre do Oeste do Nilo.
[032]-As vantagens da presente invenção são as seguintes: - o oligonucleotídeo modificado da invenção contendo as funções tióis é barato para produzir, - p oligonucleotídeo modificado da invenção pode ser imobilizado estavelmente em uma superfície de ouro, ou em uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamí dicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, - o uso do oligonucleotídeo modificado da invenção em métodos para detectar, sequenciar e/ou genotipar ácidos nucleicos possibilita detectar especifícamente sequências do nucleotídeo-alvo de diversas centenas de nucleotídeos, - a sequência nucleotídica do oligonucleotídeo modificado da invenção é vantajosamente mais curta que aqueles das sondas utilizadas em métodos de detecção e/ou de genotipagem conhecidos, tendo ao mesmo tempo melhor sensibilidade e especificidade de detecção.
[033]-Outras características e vantagens da invenção se tomarão aparentes pela leitura da descrição a seguir de um exemplo de concretização preferencial da invenção, dada como exemplo, referindo-se aos desenhos anexos. DESCRIÇÃO SUMÁRIA DOS DESENHOS a Figura 1 mostra um diagrama descrevendo um método de síntese de compostos (I) as figuras 2A e 2B mostrani, respectivamente, um diagrama descrevendo um método de síntese de um oligômero dos compostos da invenção, partindo dos compostos (Ia) e partindo dos compostos (Ib). a Figura 3 mostra um diagrama descrevendo um método de síntese de um oligonucleotídeo composto (XIIc) enxertado com um oligômero de (I) em sua extremidade 5'. a Figura 4 mostra um diagrama apresentando um método de síntese de um oligonucleotídeo composto (XHIc) enxertado com um oligômero de (I) em sua extremidade 3' a Figura 5 mostra um histograma do grau de enxerto de oligonucleotídeos modificados em uma superfície de ouro. a Figura 6 mostra um diagrama apresentando a estabilidade do enxerto de oligonucleotídeos modificados sobre uma superfície de ouro, em função do tempo, à 60°C. a Figura 7 mostra um diagrama apresentando a estabilidade do enxerto de oligonucleotídeos modificados sobre uma superfície de ouro, em função do tempo, à 80°C. as figuras 8 e 9 mostram diagramas esquemáticos dos resultados de análises ELOS A com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol de tipo 3a. a figura 10 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOS A com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol do tipo la/lb. a Figura 11 mostra um diagrama esquemático dos resultados de ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com sondas do tipo la/lb contendo 1, 2, 4, 6 ou 8 grupos tióis. a Figura 12 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda monotiol do tipo la/lb, em diversas densidades de enxerto. a Figura 13 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda ditiol do tipo la/lb, em diversas densidades de enxerto a Figura 14 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol do tipo la/lb, em diversas densidades de enxerto. a Figura 15 mostra os resultados de um ensaio de hibridização de sonda/alvo com uma sonda de tetratiol enxertada sobre a superfície de ouro a Figura 16a mostra as reações entre o oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção e a superfície enxertada com grupos alquenil ou alquinil ativados. a Figura 16b mostra as reações entre o oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção e a superfície enxertada com grupos alquenil ou alquinil, com ativação por luz (1= 265 nm). a Figura 17 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOS A com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda HCV tetratiol do tipo la/lb a Figura 18 mostra um diagrama esquemático dos resultados do ensaio ELOSA com detecção por fluorescência, realizada com uma mistura de duas sondas HCV tetratiol dos tipos 2a/2c e 2b. a Figura 19 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda HCV tetratiol do tipo 3a a Figura 20 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda HCV tetratiol do tipo 4a/4d. a Figura 21 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol que é genérica para flavivirus. a Figura 22 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol, específica para o serótipo 4 da dengue. a Figura 23 mostra um diagrama esquemático dos resultados dos ensaios ELOSA com detecção por fluorescência, realizados com uma sonda tetratiol, genérica para o vírus da febre do Oeste do Nilo.
[034]-A presente aplicação descreve a preparação de compostos de fosforamidita, estrutura H-fosfonato ou de compostos ligados a um suporte sólido tendo uma função tiol protegida. Esses compostos tióis são destinados a serem introduzidos em oligonucleotideos para formar os oligonucleotídeos modificados de acordo com a invenção. Os oligonucleotídeos modificados assim obtidos podem ter várias funções tióis
[035]-A presente invenção, portanto, está relacionada à oligonucleotídeos modificados que podem ser obtidos pelo método descrito abaixo e composto de 2 a 12 funções tióis A invenção está relacionada ainda ao uso desses oligonucleotídeos modificados para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica.
[036]-Os compostos tióis destinados a serem introduzidos nos oligonucleotídeos modificados da presente invenção correspondem à fórmula (I) a seguir:
no qual: T é um grupo selecionado a partir de -O-P(0RI)N(R2)2, -O-PH(O)O‘, -OC(0)JC(0)NH-, o Ri é selecionado a partir de grupos 2-cianoetil, R'lRaRSSiCHaCHs, e R‘i, R'2, RS, que podem ser idênticos ou diferentes e representam um grupo selecionado a partir de alquilas lineares ou ramificadas compostas de 1 a 12 átomos de carbono e as arilas C6-C12, o R2 é selecionado a partir de grupos alquila linear ou ramificada, compostos de 1 a 12 átomos de carbono, pirrolidina, o J é selecionado a partir de uma única ligação, um grupo -CH2-, -CH2CH2-, -CH2OCH2-, -CH2OPhOCH2, onde Ph é um benzil, o representa um suporte sólido, D é um grupo protetor dos álcoois, W é selecionado dos grupos alcano triila Cl-Cl2, dos grupos triila arila C6-C18 e dos grupos triila aralcano C6-C18, Z é selecionado a partir de grupos alcóxi Cl-Cl 2, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, grupos NCO-alquila Cl-Cl 2, grupos CON- alquila C1-C12, Y é selecionado a partir de grupos alquila Cl-Cl 2 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila C1-C12, grupos alcóxi C1-C12, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, X é selecionado a partir de grupos alquila Cl-Cl 2 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila Cl-Cl 2, grupos alcóxi Cl-Cl 2, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, R é selecionado a partir de grupos acil C1-C12, S-alquila C1-C12, S-aril C6-C12, S-2- piridina, S-heteroalquila Cl-Cl 2 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, S- cicloalquila C3-C12, S-cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio.
[037]-Dentro do significado da presente invenção, o termo “triil alcano” significa os triils alcanos lineares, ramificados ou cíclicos, opcionalmente substituídos por um ou mais grupos alquila. Entre os grupos aril triil que podem estar presentes no composto, de acordo com a invenção, pode ser mencionado o triil benzeno e o triil naftaleno. Entre os grupos aralcanos, pode ser mencionado o 1,3,5-trimetil-benzeno triil e o trimetil-naftaleno triil.
[038]-O composto (I) pode ser dividido em três sub-compostos (Ia), (Ib) e (Ic) correspondente às seguintes fórmulas (Ia), (Ib) e (Ic), nos quais os parâmetros X, Y, Z, R, Ri, RÍ e D têm a mesma definição conforme apresentado acima para a fórmula (I):
[039]-Preferencialmente, Rj é selecionado a partir dos grupos 2-cíanoetil e R'lR'jRSSiCHiCHj, e R'i, R'2, RS, que podem ser idênticos ou diferentes, representa um grupo selecionado dos grupos alquilas lineares ou ramificados compostos de 1 a 6 átomos de carbono, e fenil; preferencialmente Ri é selecionado a partir dos grupos 2-cianoetil e R’iR 2R3SÍCH2CH2, e R\, R'2, R'3, que podem ser idênticos ou diferentes, representa um grupo selecionado a partir de grupos alquila lineares ou ramificados, compostos de 1 a 3 átomos de carbono, e fenil; mesmo mais preferencialmente Ri é selecionado a partir dos grupos 2-cianoetil, 2-etil(trimetilsilil), 2-etil(trifenilsilil), 2-etil (difenilmetilsilil).
[040]-Preferencialmente, R2 é selecionado a partir de grupos alquila lineares ou ramificados compostos de 1 a 6 átomos de carbono. Preferencialmente, R? é um grupo isopropil (iPr).
[041]-Preferencialmente, o suporte sólido □ (sic) é selecionado a partir de resinas, especialmente de resinas baseadas em poliestireno, poliacrilamida, polietileno glicol, celulose, polietileno, poliéster, látex, poliamida, polidimetil acrilamida, polímeros hidrofilicos sintéticos ou naturais, pérolas de vidro, géis de sílica.
[042]-Preferencial mente, W é selecionada a partir dos grupos alcano triil Cl-Có, um grupo aril triil C6-C12, um grupo aialcano triil C6-C12, mais especificamente dos grupos CH, CCH3, CCH2CH3, os grupos ciclohexano triil e benzeno triil.
[043]-Preferencialmente, D é selecionado a partir dos grupos protetores de álcoois que permite a desproteção ortogonal em relação a outros grupos de compostos (I). Mais especificamente, D é selecionado a partir de 4,4'-dimetoxi-tritil (DMTr), 9-fenil xanteno- 9-il (pixil) ou fluorenil metoxicarbonil (Fmoc). O grupo protetor pixil é descrito especificamente no documento Chattopadhyaya e Reese, Chem. Soc. Chem. Comm 1978, 639-640. Outro grupo protetor possível dos álcoois é um grupo terc-butil-dimetil silil, e neste caso um suporte poliestireno será especialmente preferencial
[044]-Preferencialmente, Z é selecionado a partir de grupos aminoalquila C1-C6, alcóxi C1-C6, cicloheteroalquila C3-C6 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, NCO-alquila C1-C6, CON-alquila C1-C6,
[045]-Preferencialmente, Y é selecionado a partir dos grupos alquila C1-C6 lineares ou ramificados, aminoalquila C1-C6, alcóxi C1-C6, cicloalquila C3-C6, grupos cicloheteroalquila C3-C6 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio.
[046]-Preferencialmente, X é selecionado a partir dos grupos alquila C1-C6 lineares ou ramificados, aminoalquila C1-C6, alcóxi C1-C6, cicloalquila C3-C6, grupos cicloheteroalquila C3-C6 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio.Preferencialmente, R é selecionado a partir dos grupos acil Cl-Cl 2, S-alquila C1-C6, S- aril C6, S-heteroalquila C6 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, S-cicloalquila C6, S- cicloheteroalquila C6 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio.
[047]-De acordo com um exemplo de concretização, as alquilas lineares ou ramificadas sào selecionadas a partir de grupos metil, etil, propil, butil, pentil, hexil, heptil, octil, nonil, decil, undecil, dodecil, isopropil, isobutil, tórc-butil.
[048]-De acordo com um exemplo de concretização, as aminoalquilas são selecionadas a partir dos grupos aminometil, aminoetil, aminopropil, aminobutil, aminopentil, aminohexil, aminoheptil, aminooctil, aminononil, aminodecil, aminoundecil, aminododecil, aminoisopropil, aminoisobutil, amino-terc-butil composto de um ou mais átomos de nitrogênio.
[049]-De acordo com um exemplo de concretização, os alcóxis são selecionados a partir de grupos metóxi, etóxi, propilóxi, oxibutilóxi, pentilóxi, hexilóxi, heptilóxi, octilóxi, nonilóxi, decilóxi, undecilóxi, dodecilóxi, isopropilóxi, isobutilóxi, rerc-butilóxi compostos de um ou mais átomos de oxigênio.
[050]-De acordo com um exemplo de concretização, as cicloalquilas são selecionadas a partir dos anéis, opcional mente compostas de uma ou mais insaturações, composto de 3 a 12 átomos de carbono, preferencial mente com 6 átomos de carbono.
[051]-De acordo com um exemplo de concretização, as cicloheteroalquilas são selecionadas a partir dos anéis substituídos com um ou mais átomos de nitrogênio e/ou oxigênio, opcionalmente composto de uma ou mais insaturações e composto de 3 a 12 átomos de carbono, preferencialmente com 5 átomos de carbono e um átomo de nitrogênio ou oxigênio.
[052]-De acordo com um exemplo de concretização, as NCO-alquilas e CON-alquilas são grupos nos quais as alquilas podem ser alquilas lineares ou ramificadas selecionadas a partir de grupos metil, etil, propil, butil, pentil, hexil, heptil, octil, nonil, decil, undecil, dodecil, isopropil, isobutil, terc-butil.
[053]-De acordo com um exemplo de concretização, R? é um grupo isopropil (iPr) e/ou Ri é um grupo cianoetil
[054]-De acordo com um exemplo de concretização preferencial, o composto tiol (Ia) é um composto (VI) correspondente â seguinte fórmula:
no qual, n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencialmente entre 1 e 6, R, Ri, Rz e D têm a mesma definição conforme acima para (Ia). Preferencialmente, Rj é um grupo isopropil (iPr) e Ri é um grupo cianoetil. Preferencial mente, R é um grupo acetil. Preferencial mente, D é um 4,4’-dimetóxi-tritil.
[055]-De acordo com outro exemplo de concretização, o composto tiol (Ia) é um composto (VII) correspondente à seguinte fórmula:
no qual, n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencialmente entre 1 e 6, R, Ru R2 e D têm a mesma definição conforme acima para (Ia). Preferencial mente, R2 é um grupo isopropil (iPr) e Ri é um grupo cianoetil. Preferencialmente, R é um grupo acetil. Preferencial mente, D é um 4,4’-dimetóxi-tritil.
[056]-De acordo com um exemplo de concretização, o composto tiol (Ic) é um composto (VIII) correspondente à seguinte fórmula:
no qual, n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencial mente entre 1 e 6, R e □ (sic) têm a mesma definição conforme acima para (1c). Preferencial mente, R é um grupo acetíl. Preferencial mente, J é um grupo etil. Preferencialmente, D é um 4,4'-dimetóxi-tritil.
[057]-De acordo com um exemplo de concretização, o composto tiol (Ia) é um composto (IX) de fórmula:
no qual n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencial mente entre 1 e 6, R Ru R2 e D têm a mesma definição conforme acima para (Ia) Preferencialmente, R? é um grupo isopropil (iPr) e Rj é um grupo cianoetil. Preferencialmente, R e um grupo acetil. Preferencialmente, D é um 4.4'-dimetoxi-tntil
[058]-De acordo com um exemplo de concretização, o composto tiol (la) é um composto (X) de fórmula:
no qual, n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencialmente entre I e 6, R, Ri, R; e D têm a mesma definição conforme acima para (Ia). Preferencialmente, R2 é um grupo isopropil (iPr) e Ri é um grupo cianoetil. Preferencialmente, R é um grupo acetil. Preferencialmente, D é um 4,4‘-dimetóxi-tritil. Preferencialmente, R? é um grupo isopropil (iPr) e Ri é um grupo cianoetil.
[059]-De acordo com um exemplo de concretização, o composto tiol (Ia) é um composto (XI) de fórmula:
no qual, n é um número inteiro entre 1 e 12, preferencialmente entre 1 e 6, R, Ri, R? e D têm a mesma definição conforme acima para (Ia). Preferencialmente, R2 é um grupo isopropil (iPr) e Ri é um grupo cianoetil. Preferencialmente, R é um grupo acetil. Preferencialmente, D éum4,4'-dimetóxi-tritil.
[060]-O processo de fabricação dos compostos (Ia), (Ib) e (Ic) está representado no diagrama da Figura 1.
[061]-Os compostos (Ia), (Ib) e (Ic) são obtidos dos mesmos compostos (II), tendo a seguinte fórmula:
no qual D, X, W, Y, Z e R têm a mesma definição como no composto tiol (T).
[062]-O composto de fórmula (Ia) pode ser obtido pela reação representada no diagrama a seguir:
ou pela reação representada no diagrama a seguir, preferencialmente na presença do sal de diisopropilamina tetrazolida:
[063]-O composto de fórmula (Ib) pode ser obtido pela reação representada no diagrama a seguir:
no qual Q e Q' representam, independentemente urn do outro, um grupo benzeno substituto ou não substituto
[064]-A reação supracitada paia obter o composto (Ia) ou (Ib) é realizada partindo do composto (II), preferencialmente na presença de uma base, por exemplo, diisopropil etilamina, em um solvente anidro, como diclorometano anidro.
[065]-O composto da fórmula (Ic) é obtido também do composto (II), porém preferencialmente de acordo com o passo de reação representado no diagrama a seguir
[066]-A reação precedente para obter composto (Ic) é preferencial mente realizada em um solvente anidro, como piridina, na presença de uma base, como trietilamina.
[067]-Também é possível obter o composto (Ic) de acordo com o diagrama de a reação a
[068]-0 composto (II) da fórmula acima, no qual os grupos X, W, Z, Y e R têm a mesma definição como no composto (I), corresponde a um exemplo de concretização.O composto da fórmula (II) pode ser obtido do composto (IH) de acordo com o passo de reação descrito abaixo.
no qual G é um halógeno, preferencialmente bromo ou iodo. A reação descrita acima é realizada preferencialmente em um solvente anidro, como tolueno anidro e na presença de um éter coroa. Os compostos (Hl) podem ser obtidos do composto (IV), de acordo com o passo de reação descrito abaixo:
no qual, G e G' são átomos halógenos, que podem ser idênticos ou diferentes, preferencialmente G e G são átomos de bromo ou de iodo, Z' é um grupo aminoalquila C1-C12, alcóxi C1-C12, cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, NCO-alquila C1-C12, CON-alquila C1-C12, Z" é um grupo alquila linear ou ramificado C1-C12, aminoalquila C1-C12, alcóxi C1-C12, cicloalquila C3-C12, cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, NCO-alquila Cl-C12, CON-alquila Cl-Cl 2, o composto dihalogenado G-Z"-G' sendo destinado a reagir com o grupo Z' do composto (IV) para levar à formação do grupo Z-G do composto (Hl) O passo para obter o composto (UI) é preferencialmente realizado na presença de um hidreto álcali, como NaH. O composto (IV) pode ser obtido do composto comercial (V) pela proteção da função álcool, de acordo com o seguinte passo de reação:
[069]-Este passo de proteção da função álcool é realizado em condições bem conhecidas por uma pessoa capacitada na arte, dependendo da escolha de D
[070]-De acordo com um exemplo de concretização, o composto (IV) é obtido do composto (V) por reação com o 4,4'-dimetóxi-tritil cloreto (DMTr-CI) preferencialmente em um solvente, como piridina a fim de proteger a função álcool.
[071]-De acordo com outro exemplo de concretização, o composto (IV) é obtido do composto (V) partindo do 9-fenilxanteno-9-il cloreto (pixil-Cl) nas condições descritas no documento Chattopadhyaya e Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978, 639-640.
[072]-De acordo com outro exemplo de concretização, o composto (IV) é obtido do composto (V) por reação com fluoronilmetóxi carbonil cloreto (Fmoc-Cl) em condições bem conhecidas por uma pessoa capacitada na arte.
[073]-Nas fórmulas acima (II) a (V), X, Y, W, Z, D, R, R], R? têm as mesmas definições conforme a definição do composto (I) dada acima
[074]-Preferencialmente, o composto de partida (V) é o I,l,I-tris(hidroxi-metil) etano ou 2,2-bi (hidroxy-metil) ácido propiònico ou l,3,5-tris(hidroxi-etóxi)benzeno ou 1,3,5-tri (hidroxi-metil)ciclohexano ou 2-amino-I,3-propanediol.
{075]-Um oligõmero pode ser formado a partir de compostos tióis da fórmula (I) descrita acima. O método de síntese desses oligômeros está descrito no diagrama da Figura 2A para a oligomerização dos compostos da fórmula (la) e no diagrama da Figura 2B para a oligomerização dos compostos de fórmula (lb).
[076]-Em um primeiro passo, a função álcool de composto (Ic) está desprotegida para levar ao composto (1c. 1). Este passo de desproteção é realizado por meios que são bem conhecidos por uma pessoa capacitada na arte, preferencialmente na presença de ácido diou tricloroacético para os grupos DMTr e Pixil e de piperidina para o grupo Fmoc
[077]-Em seguida, o composto (Ic.l) reage com o composto (Ia) ou (1b), levando respectivamente ao composto fosfrto tri-éster (XIV) 1 ou di-éster H-fosfonato (XV) 1
[078]-Em seguida, o composto (XIV)l é oxidado preferencialmente na presença de diiodo e, em seguida, sendo deslocado por água que fornece o átomo de oxigénio da ligação fosfato tri-éster, levando ao composto fosfotriéster (XIV) 1. Este passo de oxidação é realizado depois de cada passo de acoplamento entre um composto (XIV)i e
[079]-Em seguida, da mesma forma, o composto (XIV) 1 reage com (k-1) compostos (Ia), levando, após as (k-1) oxidações, ao composto (XIV^:
e o composto (XV) l é desprotegido em sua função álcool para dar (XV") 1, que reage com (k-1) compostos (lb), levando ao composto (XV'X:
[080]-Em seguida, o composto (XV X é oxidado, preferencialmente na presença de diiodo e água, levando ao composto fosfodiéster (XV)kO O
[081]-Concluindo, um último passo opcional consiste em desproteger compostos (XIV)k ou (XV)k, levando ao mesmo composto (IX
[082]-Preferencialmente, o oligômero resulta da oligomerização de 2 a 12 compostos (Ij),especialmente entre 2 a 8 compostos (I), ou seja, o oligômero pode ser composto de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 compostos (I). Preferencialmente, o oligômero tio! destinado a ser enxertado em uma superfície de ouro é composto de 3 a 8, de forma vantajosa entre 4 a 8 compostos (I) e o oligômero tiol destinado para união com uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamídicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, composto vantajosamente entre 2 e 6 compostos (1).
[083]-De acordo com um exemplo de concretização, o oligômero é produzido unicamente a partir de compostos da fórmula (Ia) ou de compostos da fórmula (Ib). A oligomerização é realizada por uma reação entre a função álcool desprotegida de um primeiro composto (I) e a função fosforamidita ou H-fosfonato de um segundo composto (1).
[084]-Também é possível contemplar a produção de um oligõmero partindo de uma mistura de compostos (Ia) e de compostos (Ib), sendo este exemplo de concretização de menor interesse.
[085]-Preferencialmente, o oligõmero é produzido utilizando-se quimica de fosforamidita, ou seja, por oligomerização de compostos do tipo (Ia).
[086]-A oligomerização pode ser realizada em um suporte sólido ou em solução. Preferencial mente, a oligomerização é realizada em um suporte sólido. De fato, a oligomerização em solução envolve passos de purificação por cromatografia, passos que não são economicamente viáveis, especialmente para as pequenas quantidades necessárias em aplicações de diagnóstico.
[087]-O suporte sólido enxertado com um oligõmero de um composto (la) ou de um composto (Ib) corresponde à fórmula a seguir (XVIX: (Ic)-(FX (XV1K no qual: k representa um número inteiro entre 1 e 11, (Ic) tem o mesmo significado conforme acima, (T) representa (Ta) ou (Tb), com:
[088]-O oligômero em um suporte sólido formado de um composto (Ic) e de compostos da fórmula (Ia) corresponde à fórmula a seguir (XIV)k:
no qual D, X, Y, W, Z, J, R e Ri têm a mesma definição conforme acima, e R pode adicional mente representar H; k é um número inteiro entre 1 e 11.
[089]-O oligômero em um suporte sólido formado a partir de um composto (Ic) e de compostos da fórmula (Ib) corresponde à fórmula a seguir (XV)k
no qual D, X, Y, W, Z, J e R têm a mesma definição conforme acima, e R pode adicionalmente representar H; k é um número inteiro entre 1 e 11.
[090]-No caso em que o oligômero é formado em um suporte sólido partindo de um composto (Ic) e de compostos (Ib), o composto obtido (XV)k corresponde à mesma fórmula do composto (X1VX, porém no qual Ri é um átomo de hidrogênio depois da oxidação de ligações de di éster H-fosfonato
[091]-Ao final da reação de oligomerização, a desproteção das funções tióis por métodos convencionais pode ser contemplada e, então, R representa R
[092]-Uma materia da presente invenção está relacionada a um olígonucleotideo modificado, composto de pelo menos dez nucleotídeos e de pelo menos dois compostos tióis (I) conforme descrito acima.
[093]-Na presente aplicação, o termo oligonucleotídeo indica uma cadeia composta de 4 a 100 nucleotídeos.
[094]-O composto tiol, de acordo com a invenção, é enxertado na posição 3', na cadeia ou na posição 5’ de um oligonucleotídeo.
[095]-O processo de preparação para tal oligonucleotídeo modificado é composto de pelo menos: um passo de enxerto de um composto (I) em um oligonucleotídeo para levar a um oligonucleotídeo 5'-tiol, ou um passo para enxertar um nucleotídeo em um oligômero de um composto (I) para levar a um oligonucleotídeo 3-tiol.
[096]-De acordo com um exemplo de concretização, o oligonucleotídeo enxertado corresponde à fórmula a seguir (Xlla): □ (sic) - N, - N2- ... - Nn- (I')y -(Mi - Mn,.,- Mm)p - (T)y XUa) no qual, Ni, ..Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, Mj, .. Ma representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (T) representa um composto de fórmula (l'a) ou (Tb), n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, p representa 0 ou 1, y‘ ê um número inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e y' é igual a 0 se p tiver o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y') não sendo maior que 12, □ (sic) representa um suporte sólido
[097]-O oligonucleotídeo modificado (Xlla) tem dois ou mais compostos tióis na posição 5' de um oligonucleotídeo N ou na cadeia de nucleotideos. Ele é obtido enxertando-se um composto (I) seguido por alongamento do oligõmero obtido a partir de (I) na posição 5' de um oligonucleotídeo Em seguida, no caso de p - 1, o alongamento da cadeia de nucleotideos continua. Em seguida, da mesma forma, o enxerto de um ou mais compostos adicionais (I) na posição 5' do oligonucleotídeo M pode ser contemplado.
[098]-Um diagrama para obter o composto (XUa) está descrito na Figura 3, no qual os compostos tióis são do tipo (Ia) e p é igual a 0. Os primeiros três passos na preparação do composto (XUa) permite a síntese de um oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo é sintetizado em um suporte sólido por um método convencional bem conhecido por uma pessoa capacitada na arte. No primeiro passo, um primeiro nucleotídeo é enxertado em um suporte sólido, então os outros nucleotideos são enxertados por métodos de síntese bem conhecidos por uma pessoa capacitada na arte. O composto a seguir é obtido: (XHal) □—
[099]-Em seguida outro nucleotídeo é enxertado por um método idêntico, levando ao composto da fórmula (XIla.2).
[100]-No próximo passo, um composto tiol conforme descrito acima, do tipo (Ia), é enxertado na posição 5' do oligonucleotídeo (XIIa.2), levando ao composto (XHa.3):- N| - Nr .NQ-J- Nn— (Ta) (XIla.3)
[101]-Neste passo, o enxerto é realizado convencional mente pela reação da função fosforamídica do composto (Ia) com a função álcool na posição 5' do nucleotídeo terminal do composto (XDa. 2).
[102]-No diagrama na Figura 3, um exemplo de síntese é descrito com a oligomerização do composto tiol do tipo (Ia); um método de síntese similar é utilizado para a síntese de oligonucleotídeos modificados com compostos tióis do tipo (Ib),
[103]-Em seguida, a oligomerização conforme descrito previamente, especificamente nas figuras 2A e 2B, ocorre partindo do composto (XIIa.3) acima, pela reação com um ou mais compostos (la) ou (Ib), levando ao composto (XUa.4) de fórmula: □ (sic)— N> - Ni-N».,- Nn- (ra)y ou conforme uma fórmula estrutural (no caso quando p - 0):
no qual, D, R, X, Y, W, Z, Ri têm a mesma definição que a do composto (I) e R, pode adicionalmente representar H, n, y e Ni, N2, .. .Nn-i têm a mesma definição que a do composto (Xlla), Bn representa uma base utilizada convencional mente em uma cadeia de nucleotideos.
[104]-No caso quando o alongamento do oligômero é realizado com compostos do tipo (Ib), o oligonucleotídeo modificado tem uma estrutura similar àquela do oligonucleotídeo modificado (XUa.4), porém no qual Ri representa H.
[105]-O enxerto subsequente de compostos de nucleotideos Mi, M2, .. Mnl e possível, em seguida, levando ao produto (Xlla) com p = 1. Nesses casos, o alongamento também ocorre em um suporte sólido.
[106]-Esse passo de enxerto é realizado convencionalmente por métodos conhecidos por uma pessoa capacitada na arte.
[107]-De acordo com outro exemplo de concretização, o oligonucleotídeo enxertado corresponde à fórmula a seguir (Xlla): (Ic)-(Dya-N, -N2-ISUi- Na - (Dy-P* -M2 - Mm.1 -Mm]P4I’k (XHIa) no qual, Ni,Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, Mj, ... Mm representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (I1) representa um composto de fórmula (Pa) ou (I'b), n é urn número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, y' é um número inteiro variando entre 2 a 12, p tem o valor de 0 ou 1 se y’ for diferente de 0, e se y' tiver o valor igual 0, então p tem o valor igual a 0, y“ é um inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e, se p tiver o valor igual a 0, então y" tem o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y'+y") não sendo maior que 12.
[108]-Um diagrama representando um método de síntese do composto (XEHc) está descrito na Figura 4 usando um oligômero formado a partir de um composto do tipo (Ic) onde J é um grupo etil, e compostos do tipo (Ib)
[109]-A síntese do composto de fórmula (XIlIc) é composta de um primeiro passo consistindo da oligomerização do composto tiol, de acordo com a invenção da fórmula (I), cujo método está descrito acima, levando ao composto de fórmula (Xllla 1): (M-ÍDy-i (xma.1) no qual, (Ic) tem a mesma definição anterior, (I*) representa um grupo do tipo (Ta) ou (I"b), onde
ou como uma fórmula estrutural no caso quando (!’) representa (I"b):
[110]-Em um segundo passo, um primeiro nucleotídeo Nj é enxertado no oligõmero de fórmula (XlHa 1), levando ao composto da fórmula a seguir (XIIIa.2):(fc)-(T)y.i-Ni (Xffla2)
[111]-Este passo de enxerto é realizado por reação entre a função álcool desprotegida ao final da cadeia do oligõmero de composto (XlIIa 1) e a função fosforamidita ou H- fosfonato do primeiro nucleotídeo Nt.
[112]-O oligonucleotídeo modificado é sintetizado, em seguida, por qualquer método conhecido por pessoa capacitada na arte, especial mente um método convencional bem conhecido por uma pessoa capacitada na arte por reação entre a função álcool na posição 5' do primeiro nucleotídeo presente no oligõmero do composto tiol e a função fosforamidita ou H-fosfonato na posição 3' de um segundo nucleotídeo. A sintese continua por passos sucessivos similares de alongamento da cadeia de nucleotideos, bem conhecidos por uma pessoa capacitada na arte, levando ao composto de fórmula (XlIIa).
[113]-Uma matéria da presente invenção está relacionada, portanto, aos compostos obtidos de compostos de fórmula (Xlla) e (XlIIa) acima, depois da quebra da ligação que prende o oligonucleotídeo modificado ao suporte sólido. A quebra da ligação ocorre no nivel da função éster.
[114]-Assim, de acordo com um exemplo de concretização da invenção, o oligonucleotídeo modificado sem suporte da invenção tem seguinte estrutura (XHb): Nj - Na- N0.r N„- (rb)y -(Mj NUr Mm)p - (Tb)y (xnb) no qual, Ni,..., ND representam, independentemente um do outro, um nucleotideo, Mj, - Mm representam, independentemente um do outro, um nucleotideo, (Tb) representa um composto de fórmula, conforme definido acima, n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é a número variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, p representa 0 ou 1, y1 é um número inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e y' é igual a 0 se p tiver o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y') não sendo maior que 12.
[115]-A extração do suporte é realizada em dois passos, em primeiro lugar com uma base forte não nucleofilica (piperidina ou DBU) a fim de eliminar os grupos cianoetil se estiverem presentes (no caso de fosforamiditas) e em segundo lugar por um método convencional conhecido por uma pessoa capacitada na arte, preferencialmente por tratamento do composto (Xlla) com hidróxido de amónio (NH4OH). é necessário remover os grupos cianoetil antes de desproteger os grupos tióis, pois eles formam acrilonitrila durante sua remoção, que reage fortemente com as funções tióis.
[116]-De acordo com outro exemplo de concretização da invenção, o oligonucleotídeo modificado sem suporte da invenção tem seguinte estrutura (XlIIb): (Ic')-(rb)y., - Nj - N2- ..Nn4- No - (rb)y-[Mj - M2 - Mn,.. - M^p-trbV (xnib) no qual, N|,Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, Mi, ... Mm representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (Ic') representa o composto obtido a partir de (Ic) por quebra da ligação de éster com o suporte sólido e, preferencial mente, tem a estrutura
(Tb) representa um composto de fórmula, conforme definido acima, n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, y' é um número inteiro variando entre 0 a 12, p tem o valor de 0 ou 1 se y' for diferente de 0, e se y' tiver o valor igual 0, então p tem o valor igual a 0, y" é um inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e, se p tiver o valor igual a 0, então y" tem o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y' + y") não sendo maior que 12.
[117]-A extração do suporte é realizada por um método convencional conhecido por uma pessoa capacitada na arte, preferencialmente por tratamento de composto (XlIIa) com hidróxido de amónio (NH4OH).
[118]-De acordo com um exemplo de concretização da presente invenção, no caso em que p=0, o oligonucleotídeo modificado corresponde à fórmula estrutural (Xllb):
no qual n, y, Nt,..., Nπ-i- X, Y, Z, W e R têm a mesma definição conforme acima, e Bo representa a base do enésimo nucleotídeo.
[119]-De acordo com outro exemplo de concretização da presente invenção, no caso em que p-0, o oligonucleotídeo modificado corresponde â fórmula estrutural (XILIb):
no qual n, y, N2,..., N& X, Y, Z, W e R têm a mesma definição conforme acima, e Bi representa a base do primeiro nucleotídeo.
[120]-A presente invenção está relacionada ainda aos oligonucleotídeos modificados XRc) e (XII lc) obtidos respectivamente partindo de compostos (XUa) e (XlIIa) por desproteção da função tiol e quebra da ligação que iiga o composto ao suporte sólido (figuras 3 e 4 respectivamente).
[121]-No caso qimdθ ° oligonucleotídeo é modificado com um ou mais compostos tióis do tipo (Ia), após a desproteção da função tiol e da função fosforamídica de composto (Xlla) por um tratamento conhecido por uma pessoa capacitada na arte, o composto de fórmula (XUc) é obtido: N1 - Na-No.,- ND- (I")y -(Mi - M».,- M^p - <T%- (Xllc) no qual, Ni, ..Nn representam, independentemente um do outro, um nucleolídeo, Mi, .. Mn representam, independentemente um do outro, um nucleotideo.
n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, p representa 0 ou 1, y* é um número inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1, e y' é igual a 0 se p tiver o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y') não sendo maior que 12, ou conforme uma fórmula estrutural no caso quando p = 0:
no qual, X, Y, W, Z, R) têm a mesma definição que a do composto (I), Nj, ...Nn, n, y têm a mesma definição que a do composto (Xlla), Bn representa uma base utilizada convencionalmente em uma cadeia de nucleotídeos.
[122]-No caso em que o oligonucleotídeo é modificado com um ou mais compostos tióis do tipo (Ib), após a desproteção da função tiol de composto (XTUa) por um tratamento conhecido por uma pessoa capacitada na arte, o composto de fórmula (Xnic) é obtido: (TcWy-j -N, - N3- Nn.j- Nn - (rjy-fM, - M2 .... -Mm-1 - (XDic) no qual, Ni, Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, Mi, ... Mmrepresentam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (Ic*) representa o composto obtido a partir de (Ic) por quebra da ligação de éster com o suporte sólido,
(T) = /°-X n é um número inteiro variando entre 4 a 100, m é um número inteiro variando entre 4 a 100, y é um número inteiro variando entre 2 a 12, y' é um número inteiro variando entre 2 a 12, p tem o valor de 0 ou 1 se y' for diferente de 0, e se y' tiver o valor igual 0, então p tem o valor igual a 0, y" é um inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e, se p tiver o valor igual a 0, então y" tem o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y1 + y") não sendo maior que 12; ou como uma fórmula estrutural no caso quando y' = p = 0. 
no qual, X, Y, W, Z têm a mesma definição que a do composto (I), N2, .. Nπ, n e y têm a mesma definição que a do composto (Xlla), Bn corresponde a uma base utilizada convencionalmente em uma cadeia de nucleotideos.
[123]-Durante a sintese do oligonucleotídeo, a função tiol é preferencialmente protegida.
[124]-De fàto, a função tiol pode reagir com a função fosforamidita de chegada.
[125]-O passo de desproteção das funções tióis e remoção do suporte sólido pode ser realizado em um passo único de tratamento do oligonucleotídeo modificado (Xlla) ou (Xma).
[126]-A remoção do suporte sólido também pode ser realizada em um primeiro passo, e a desproteção das funções tióis é realizada em seguida em um segundo passo.
[127]-O oligonucleotídeo final (XHc) (respectivamente o oligonucleotídeo final (XHIc) é obtido independentemente do composto tiol de partida, seja partindo do composto (Ia) ou do composto (Ib). De fato, independentemente de ser utilizado o monómero (Ia) ou (Ib), a unidade monômera tiol resultante da reação de oligomerização corresponde ao composto (I") descrito acima.
[128]-Os suportes enxertados das formulas (XVIX descritos acima permitem o início da síntese do oligonucleotídeo. A preparação industrial ou semi-industrial dos suportes sólidos enxertados com sequências de oligômeros que serão utilizados como sequência politiol na posição 3‘ de um oligonucleotídeo pode ser contemplada em especial.
[129]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a sequência nucleotídica (Ni-N2-...-Nn.i-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (M1-M2- .--Mm.1-Mm) do oligonucleotídeo modificado da invenção, conforme descrito acima, são especificas para um vírus, bactéria ou um gene responsável por uma doença ou envolvidos com uma doença.
[130]-Dentro do significado da presente aplicação, o termo "específico" significa que a sequência (N)-N2-...-Nu.i-Nn) e, opcionalmente a sequência (Mi-M2-...-Mm-i-Mm) são complementares ao todo ou parte de pelo menos uma sequência de ácido nucleico alvo composta de um gene ou no genoma de um vírus ou de uma bactéria, e característico deste último. Assim, entende-se que a hibridização da sequência (N|-N2-.. .-Nn.]-Nn) e opcionalmente da sequência (M]-M2-. . .-Mm.]-Mni) com parte ou toda a sequência alvo correspondente a ela leva a formação de um duplex de ácidos nucleicos tendo no máximo 2 despareamentos Em um exemplo de concretização da invenção, o termo "específico" significa que o duplex formado, é composto apenas de um ou dois despareamentos De forma vantajosa, o duplex formado não contém nenhum despareamento. O segmento de frase "sequência característica de um gene ou do genoma de um vírus ou de uma bactéria" significa uma região genômica, cromossômica ou plasmídica de um organismo, de um vírus ou de uma bactéria, tendo um arranjo de nucleotideos que não é encontrado em outros organismos, devido a variações genéticas exclusivas.
[131]-No contexto da invenção, os termos "oligonucleotídeo modificado" e "sonda" são utilizados como sinônimos e denotam um oligonucleotídeo com 4 a 100 nucleotideos, tendo pelo menos 2 funções tióis, conforme descrito acima. De forma vantajosa, quando ele é utilizado para genotipagem, o oligonucleotídeo modificado da invenção é composto de 13 a 20 nucleotideos, vantajosamente com 14 ou 15 nucleotideos. A sonda, portanto, tem a capacidade de enxertar em uma superfície adequada, como em uma superfície revestida com ouro ou com grupos maleimidas, e também tem a capacidade de hibridizar, via sua parte nucleotidea, para uma sequência nucleotidica-alvo
[132]-Preferencialmente, o oligonucleotídeo modificado da invenção é composto de 2 a 12 funções tióis, especifícamente entre 2 a 8 funções, ou seja, o oligonucleotídeo modificado pode ser composto de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 funções. Preferencial mente, o oligonucleotídeo modificado destinado a ser enxertado em uma superfície de ouro é composto de 3 a 8, vantajosamente entre 4 a 8 funções tióis. O oligonucleotídeo modificado destinado para conjugação com uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamídicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, é composto de forma vantajosa por 2 a 8 funções tióis, e preferencialmente por 4 funções tióis.
[133]-O termo "sequência-alvo", conforme utilizado no contexto da invenção, denota uma sequência que é complementar ou parcialmente complementar à sonda da invenção, e que é amplificada a partir de um gene ou do genoma de um vírus ou de uma bactéria, e preferencialmente de uma região característica deste último.
[134]-O termo "vírus" denota uma entidade biológica que requer uma célula hospedeira para se multiplicar e, no minimo é composta de um ácido nucleico e proteínas, além disso, o ácido nucleico pode ser um DNA e/ou RNA de fita simples ou fita dupla. Os virus são compostos daqueles com capacidade de paralisar os procariotos (por exemplo, os Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Microviridae e Inoviridaef aqueles com capacidade de parasitar plantas (fítovirus como o tobamovírus), insetos (por exemplo, os baculovírus), fungos, e humanos No contexto da invenção, os virus também compreendem os arbovirus. O grupo arbovirus, em conjunto vírus heterogêneos morfologicamente pertencentes a vários gêneros diferentes compostos mais especificamente do gênero Flavivírus (família Flaviviridae), Alfavirus ( família Togaviridaé), Coltivirus (família Reoviridae), Flebovirus { família Bunyaviridae). Mais amplamente, a família Flaviviridae em particular é composta do gênero Flavivírus (vírus da febre amarela, vírus da febre do Oeste do Nilo, vírus de encefalite por TBE, vírus da enceta)ite japonesa, vírus da encefalite Saint Louis, vírus usutu e vírus da dengue), Hepacivírus (vírus da hepatite C) e Pesíivírus, vírus da diarreia viral bovina (BVD), vírus da febre suína). A família Togaviridae em particular é composta do gênero Alphavirus (Sindbis vírus, Ross River virus, O'nyong'nyong virus, Chikungunya virus) e Rubivirus (virus da Rubéola). A família Reoviridae em particular é composta do vírus que afeta o sistema digestivo (como Rotavirus), ou o sistema respiratório. A família Bunyaviridae em particular é composta do gênero Hantavirus (síndrome pulmonar do Hantavirus, febre hemorrágica coreana), Nairovirus (vírus Dugbé), Orthobunyavirus (vírus Bunyamwera), Phlebovirus (febre do Rift Valley) e Tospovirus
[135]-No contexto da invenção, os vírus com capacidade de infectar humanos consistem de: Vesiculovirus (virus da estomatite vesicular, etc ), o Lyssavirus (vírus da raiva, vírus do morcego australiano); o Picornavirus {Rhinovirus, Poliovirus, vírus da hepatite A, etc ), o Herpesvirus (catapora, herpes, citomegalovírus CMV, vírus de Epstein Barr EBV, etc.), o Ortomixovirus (vírus da gripe, etc.), o Paramyxovirus (vírus da rubéola, vírus da caxumba, etc ), o Poxvirus (vírus da varíola, etc.), Coronavirus (SARS, Síndrome respiratória aguda grave, etc ), Filovirus (Ebola, etc.), o Hepadnavirus (HBV, Vírus da hepatite B) e o Retrovirus (HIV, HTLV, etc ).
[136]-O tenno "bactéria" denota qualquer organismo vivo procariótico caracterizado pela ausência de um núcleo e organelas, e providos de uma parede celular. Este termo abrange especificamente bactérias que podem ser patogênicas e podem provocar doenças e/ou infecções em humanos, como a Corynebacterium diphtheriae (difteria), Treponema pallidum (sífilis), Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), Mycobacterium leprae (lepra). Neisseria gonorrhoeae (gonorreia), a Rickettsia (tifo), Clostridium tetani (tétano), Vibrio cholerae (cólera), Pseudomonas aeruginosa e o Staphylococci (patógenos oportunistas) Este termo abrange bactérias implicadas em riscos de transfusão e em infecções hospitalares como, por exemplo, as bactérias grãs-negativa Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Enterobacter aerogenes, Acinetobacter baumannü, e Pseudomonas aeruginosa, ou bactérias grã-positivas Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus. Bacillus cercus. Streptococcus pyogenes, Propionibacterium acnes e Clostridium perfringens
(137]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a sequência nucleotídica (Nj-Nj-.-.-Nn-i-Na) e, opcional mente, a sequência nucleotídica são selecionadas a partir de: - sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1, NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 28, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36, específica do vírus da hepatite C (HCV), - sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 40, específicas de flavivírus, - a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 18 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 41, específicas do vírus da dengue, ou • a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 19, específica do vírus da febre do Oeste do Nilo (WNV)
[138]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a sequência nucleotídica iNi-Na--- -Nn-i-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (Mj-M?- -Ma-cMn) têm uma estrutura do anômero alfa, anômero beta, linear, ou do tipo "caracor. Quando a sequência nucleotídica tem urna estrutura do anômero tipo beta, o oligômero modificado da invenção (cujos tióis estão localizados em 5‘) hibridiza em uma forma antiparalela com a sequência alvo. Quando a sequência nucleotídica tem uma estrutura do anômero tipo alfa, o oligômero modificado da invenção (cujos tióis estão localizados em 3*) hibridiza em uma forma paralela com a sequência alvo Funcionalização da superfície
[139]-Os oligonucleotídeos modificados, de acordo com a invenção, podem ser depositados em um substrato a fim de funcionalizar a superfície desse substrato O substrato pode ser metálico ou feito de polímero, condutor ou não condutor Pode ser piano (parcial ou totalmenfe) ou curvo, e pode vantajosamente ser de formato esférico
[140]-De acordo com um exemplo de concretização, o substrato é não planar, por exemplo, na forma de micropartículas ou nanoparticulas. Os oligonucleotídeos modificados, de acordo com a invenção, podem ser enxertados em seguida nessas micropartículas ou nanoparticulas. Preferencialmente, essas partículas são magnéticas De fato, essas partículas magnéticas podem então ser facilmente trazidas para a superfície de um eletrodo ou para a parte inferior dos poços de uma microplaca, com a finalidade de um teste para detectar, genotipar ou sequenciar, pela aplicação de um imã. O uso de um suporte não planar do tipo micropartícula ou nanopartícula no contexto do método de detecção da invenção, toma-o possível de forma vantajosa para aumentar a área da superfície na qual os oligonucleotídeos modificados da invenção podem ser enxertados e, assim, tomar possível aumentar a proporção de hibridizações entre as sondas e as sequências-alvo.
[141]-De acordo com um exemplo de concretização, o substrato é metálico, por exemplo, de cobre ou titânio, e sua superfície é revestida parcialmente ou completamente com uma película de ouro ou platina, preferencialmente de ouro
[142]-De acordo com um exemplo de concretização, o substrato é de polímero, preferencial mente um polímero condutor.
[143]-De acordo com um exemplo de concretização, o substrato pode ser composto de zonas de recepção cobertas com uma película de ouro ou de platina ou coberto com alquenil, alquinil ou funções haloacetamídicas, como funções maleimida ou acrilamida, nas quais o oligonucleotídeo modificado é depositado
[144]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, os grupos compostos de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla são selecionados a partir de alquenos ativados por uma função carbonil na posição alfa, e os alquenos são preferencialmente selecionados a partir de grupos maleimida e acrilamida.
[145]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, os grupos de haloacetamidas são selecionados a partir de grupos bromoacetamidas e iodoacetamidas.
[146]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, os grupos composto de pelo menos uma ligação carbono-carbono tripla são selecionados a partir de alcinos ativados por uma função carbonil na posição alfa, e os alcinos são preferencialmente selecionados a partir de grupos 2-propinamida.
[147]-Como ilustrado na Figura 16a, na qual o composto gpt - SH representa o oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção, a função tiol reage com a ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ativada por uma função carbonil na posição alfa. De cima para baixo na Figura 13a a primeira reação de funcionalização corresponde à uma superfície enxertada com maleimida, a segunda reação corresponde à uma superfície enxertada com acrilamida, a terceira reação corresponde à uma superfície enxertada com iodoacetamida ou bromoacetamida e a quarta reação corresponde à uma superfície enxertada com 2-propenamida preparada no caso de um oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção, composto de dois compostos tióis.
[148]-No caso da Figura 16b, a superfície é enxertada com grupos alquenil não ativados (la. reação) e grupos alquinil (2a reação). A reação entre a função tiol do oligonucleotídeo modificado e os grupos superficiais é realizada usando ativação por luz (X = 265 nm). A primeira reação de funcionalização é realizada usando um oligonucleotídeo modificado por monotioL, representada esquematicamente por gpt - SH e a segunda reação é realizada usando um oligonucleotídeo modificado por ditiol
[149]-No caso quando o suporte é enxertado com funções alquinil, a funcionalização da superfície com um oligonucleotídeo modificado por politiol é muito interessante, pois gera uma estrutura cíclica devido às duas reações sucessivas entre a primeira função tiol e a função yn em um primeiro passo e, em seguida, entre uma segunda função tiol e a íúnção enésima resultante em um segundo passo (figuras 16a e 16b).
[150]-De acordo com um exemplo de concretização preferencial, o substrato é enxertado com grupos maleimidas ou acrilamidas
{151]-Assim, a invenção toma possível, por exemplo, foncionalizar uma superfície de ouro ao criar ligaçãofções) de ouro-enxofre entre a superfície do substrato e o oligonucleotídeo modificado ou para foncionalizar uma superfície enxertada com funções maleimida ou acrilamida, criando ligações tioéter
[152]-A fixação dos oligonucleotídeos modificados na superfície do substrato é realizada imergindo-se a superfície a ser tratada em uma solução composta do oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, conforme descrito acima. Um ou mais passos adicionais de lavagem e secagem são fornecidos em geral Em geral a solução de oligonucleotídeos modificados está em uma concentração compreendida entre 0,10 uM a 500 pM, preferencialmente entre 0,5 μM a 100 μM quando a superfície do substrato é de ouro e entre 50 nM e 200 nM. preferencialmente entre 75 nM e 150 nM quando a superfície do substrato é formada de maleimida A imersão é seguida por lavagem oara remover tudo que não tiver reagido
[153]-A presença de vários átomos de enxofre no oligonucleotídeo toma possível criar várias ligações ouro-enxofre ou várias ligações tioéter, que permitem que o oligonucleotídeo seja estabilizado na superfície.
{154]-Uma matéria da invenção, portanto, consiste de urn substrato enxertado com pelo menos um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima, sendo tal substrato composto de pelo menos uma zona receptora revestida com uma substância que tolera o enxerto de tal oligonucleotídeo modificado. De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o substrato está na forma de um eletrodo De acordo com outra modalidade da invenção, o substrato é formado na forma de uma microplaca com 96 poços ou mais.
[155]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o substrato enxertado de acordo com a invenção é de metaL preferenciai mente de cobre ou titânio, e e composto pelo menos uma zona receptora revestida com uma peiícula de ouro ou platina De acordo com outro exemplo de concretização da invenção, o substrato enxertado é de plástico, preferencialmente de poliestireno e a zona receptora é revestida com grupos maleimida e/ou é composto na sua superfície de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida.
[156]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, a densidade do enxerto do oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, obtido na zona receptora resulta do uso de soluções de enxerto de 10 nM por poço a 500 nM por poço, quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato De forma vantajosa, a densidade de enxerto do oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, a zona receptora do substrato é obtida utilizando-se uma solução de enxerto de 100 nM por poço quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato
[157]-Os oligômeros modificados da presente invenção também podem ser ligados por um ou mais pontos de ligação a marcadores ou ligantes, que podem ser, por exemplo, marcadores enzimáticos, cromogênicos, fluorogênicos, radioativos, ou quimioluminescentes, metais, ions de metais, hormônios, proteínas, peptideos, sacarideos, oligossacarídeos, agentes nucleofilicos ou proteolíticos, agentes de união, como uma biotina, uma antígeno, um hapteno, um anticorpo ou um receptor. De forma vantajosa, este marcador ou ligante possibilita detectar o evento de hibridização o oligonucleotídeo modificado da invenção e uma sequência-alvo representativa de um gene, de um virus ou de uma bactéria.
[158]-De acordo com outro exemplo de concretização da invenção, o marcador ou ligante une-se à sequência nucleotídica alvo representativa de um gene, de um vírus ou de uma bactéria, e toma possível detectar o evento de hibridização entre o oligonucleotídeo modificado da invenção e a sequência-alvo.
[159]-A presente invenção está relacionada ainda a um método para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica, composto de um passo de detecção de tal ácido nucleico alvo com pelo menos uma sonda de detecção formada por um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima.
[160]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o método de detecção é composto dos passos de: - obter pelo menos uma "fonte" de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica, - produzir um amplicon pela amplificação de um ácido nucleico alvo a partir do ácido nucleico fonte, e - detectar a hibridização entre o amplicon e pelo menos uma sonda de detecção formada por um oligonucleotídeo modificado, conforme descrito acima.
[161]-Por “amostra biológica" entende-se qualquer substância contendo ou suspeita de conter um ácido nucleico, como DNA ou RN A, e obtida de um humano, um anima], um vegetal ou de qualquer composição líquida ou sólida. A amostra biológica inclui, por exemplo, as amostras de tecidos ou fluidos isolados de um indivíduo ou de indivíduos, composta de, mas não limitada à pele, sangue, plasma, soro, fluido vertebral, fluido linfático, fluido sinovial, urina, lágrimas, células sanguíneas, medula óssea, órgãos, tumores, e também as amostras de constituintes de culturas de células m-vitro. A amostra biológica pode ser tratada vantajosaraente para destruir a estrutura dos tecidos ou células, para trazer seus constituintes intracelulares para a solução.
[162]-Por "amplicon" entende-se uma molécula de ácido nucleico gerada durante um procedimento para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo característica do gene, vírus ou bactéria contido na amostra biológica. De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o amplicon é gerado pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) O amplicon utilizado no método de detecção da invenção, de forma vantajosa, tem um tamanho variando entre 75 bp a cerca de 500 bp Especificamente, parece que uma das vantagens do método da invenção é a possibilidade de usar amplicons tendo um comprimento de uma ou mais centenas de nucleotideos, que comprovadamente é impossível nos métodos de detecção conhecidos na arte anterior. O método de detecção da invenção toma possível assim selecionar e amplificar sequências-alvo maiores em genes, vírus ou bactérias.
[163]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o método de detecção toma possível determinar o genótipo e/ou subtipo de um vírus presente em uma amostra biológica. O amplicon é gerado mais especifícamente pela amplificação de uma sequência nucleotídica alvo, correspondente a uma região genômica do vírus contendo informações relativas ao genótipo virai e/ou subtipo, e a detecção é realizada com uma sonda especifica para um genótipo virai e/ou subtipo específico. O método da invenção toma possível, assim, para efeito de detecção baseada em sequências-alvo contendo mais informações sobre o tipo virai ou bacteriano, ou o subtipo. Esta vantagem resulta diretamente do oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção, seu método e capacidade para se fixar na zona de fixação do substrato. Vantajosamente, não é mais, portanto, essencial definir os primers para amplificar uma sequência-alvo que seja tão curta quanto possível do genoma virai ou bacteriano. O método da presente invenção toma possível, por outro lado, selecionar primers localizados em regiões conservadas nas famílias de vírus ou de bactérias em questão, e amplificar sequência-alvo mais longas Isto resulta em significativa economia e maior facilidade de uso, uma vez que os mesmos primers podem ser utilizados para amplificar uma zona genômica encontrada em diversos tipos e/ou subtipos virais ou bacterianos, sem medo de ver os resultados da hibridização falseados pelo tamanho do amplicon utilizado.
[164]-De acordo com um exemplo de concretização da invenção, o passo de produzir o amplicon do método de detecção da invenção é realizado com uma mistura de primers ísequências iniciadoras) de nucleotideos, preferencialmente selecionada dos pares de primers: - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, quando o amplicon é gerado a partir de HCV, qualquer que seja o genótipo virai envolvido este par de primers é genérico e permite a amplificação de um amplicon "longo" de 401 nt, começando a partir de qualquer genótipo de HCV; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 10 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, um par que permite a geração de amplicons "curtos" de 191 nt específicos para o genótipo la/lb; - NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 29 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, um par que permite a geração de amplicons "curtos" de 108 nt específicos para o genótipo 2; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 11, um par que permite a geração de amplicons "curtos" de 143 nt específicos para o genótipo 3a, - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 30, um par que permite a geração de amplicons "curtos" de 175 nt específicos para o genótipo 4a/4d; e - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 20 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21, e/ou - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 22 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 21 quando o amplicon é gerado a partir de um flavivírus.
[165]-De acordo com um exemplo de concretização, o oligonucleotídeo modificado de acordo com a invenção é utilizado no método de detecção em uma densidade resultante ao contactar uma solução enxerto variando entre 10 nM a 500 nM com um poço, quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato. De forma vantajosa, a solução enxerto do oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, é de 100 nM, quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato Quando o oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, é composto de 2 funções tióis, a solução enxerto utilizada tem uma concentração de oligonucleotídeo modificado de pelo menos 10 nM (quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato) e a concentração do amplicon utilizada no método de detecção é de pelo menos 100 pM. Quando o oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, é composto de 4 funções tióis, a solução enxerto utilizada tem uma concentração de oligonucleotídeo modificado de pelo menos 10 nM por poço e a concentração do amplicon utilizada no método de detecção é de pelo menos 10 pM por poço, quando uma placa de 96 poços é utilizada como substrato.
[166]-O método de detecção, de acordo com a invenção, oferece uma vantagem especifica para a genotipagem de HCV, porque permite especifícamente que os genótipos e subtipos conhecidos de HCV sejam distinguidos, usando um teste de detecção molecular simples,
[167]-Infecções associadas ao vírus da hepatite C de fato representam um problema de saúde extremamente importante, pelo fato de que os indivíduos infectados correm o risco de desenvolver doenças do fígado, cirroses, e carcinomas hepáticos primários, e pelo fato de que eles também constituem um reservatório de infecção Estudos epidemiológicos preveem a triplicação do número anual de mortes resultantes do HCV ao longo dos próximos 10 anos se novos sistemas de diagnóstico e terapêuticos não forem desenvolvidos.
[168]-Caracterizado por sua considerável variabilidade genética, o HCV está classificado em 6 genótipos principais, compostos de mais de 80 subtipos. A determinação precisa do genótipo e/ou subtipo infeccioso é fundamental para as estratégias terapêuticas, e toma possível prever a eficácia da resposta antiviral e definir a duração da terapia, assim como o tipo de tratamento e a dosagem. A identificação da classificação precisa dos HCVs encontrados em indivíduos infectados também é importante para o monitoramento epidemiológico, com o objetivo de monitorar a distribuição das cepas virais e para identificar os fatores de transmissão.
[169]-Muitos dos testes disponíveis comercialmente para detectar e/ou quantificar RN A de HCV são baseados em sequências encontradas na região não codificadora 5' (5'NCR), que constitui uma das regiões mais conservadas e melhor caracterizadas do HCV. A egião 5’NCR é selecionada, portanto, como o alvo em diversos métodos de genotipagem conhecidos, distribuídos comercial mente, como o teste ÍNNO LiPA HCV (II), da Bayer, o kit Trugene HCV 5’NCR da Bayer/Siemens Healthcare (W02007/076493), baseado em análise de sequência e no teste de mobilidade duplex ou um sistema para detectar hibridização» composto de uma diversidade de tipagem de HCVs projetados na região 5NCR ou na região NS5 desenvolvida pela Roche Molecular Sistemas (US 2007/014160).
[170]-Entretanto, a presença de mutações na região 5NCR leva a classificação deficiente dos genótipos HCV em 5 a 8% dos casos, levando a graves consequências para os resultados do tratamento. A região 5'NCR não parece mais apresentar um grau suficiente de confiabilidade para identificar os genótipos 2 e 4 do vírus.
[171]-0 método de referência para realizar a genotipagem do HCV reside, além disso, no sequenciamento de regiões específicas do HCV e, especificamente, da região NS5b do vinis, codificando para polimerase RNA dependente de RNA. Entretanto, o sequenciamento é comprovadamente caro e demorado, e requer equipamentos especializados e operadores treinados. Portanto, não é adequado para conduzir estudos clínicos de larga escala.
[172]-Existe, portanto, uma necessidade de melhores métodos para detectar e/ou genotipar HCV para distinguir os diversos genótipos e subtipos conhecidos de HCV, usando um teste molecular simples, como este da invenção.
[173]-A presente invenção está relacionada ainda a um oligonucleotídeo tendo uma sequência nucleotídica selecionada a partir das sequências com NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 28, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 18, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 19, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA; 36, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 40 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 41 De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1 corresponde a uma sequência nucleotídica encontrada especificamente no HCV de tipo la/lb e toma possivel detectar o segundo tipo especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima. De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 27 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no HC V do tipo 2 e toma possivel detectar este último especificamente no contexto de um método de ietecção, conforme descrito acima De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no HCV de tipo 2a/2c e toma possível detectar este ultimo especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima. De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE DENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 36 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no HCV de tipo 2b e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUENCIA: 4 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no HCV de tipo 3a e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 28 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no HCV de tipo 4a/4d e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima. De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUENCIA 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 40 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no flavovírus e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima. De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 18 corresponde a uma sequência nucleotidica encontrada especificamente no vírus da dengue e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima. De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 41 corresponde a uma sequência nucleotídica encontrada especificamente no vírus da dengue de serótipo 4 e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima De forma vantajosa, o oligonucleotídeo de sequência com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 19 corresponde a uma sequência nucleotídica encontrada especificamente no virus da febre do Oeste do Nilo e toma possível detectar este último especificamente no contexto de um método de detecção, conforme descrito acima.
[174]-Outro assunto da invenção consiste de um kit de detecção e/ou de diagnóstico composto de pelo menos um suporte composto de pelo menos uma zona receptora, na qual pelo menos um oligonucleotídeo modificado, de acordo com a invenção, é colocado.
[175]-Assim, o kit de detecção pode ser utilizado para fazer a triagem de moléculas ativas biologicamente ou para diagnóstico ou testes de sequenciamento. Pode ser contemplado que o kit de diagnóstico consiste de várias zonas de recepção separadas, nas quais um suporte sólido enxertado com oligonucleotídeos idênticos ou diferentes é depositado. Por exemplo, suportes sólidos enxertados com oligonucleotídeos modificados idênticos ou diferentes podem ser colocados em zonas de recepção separadas de um substrato cobertas com uma película de ouro ou de um substrato enxertado com funções compostas de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, para formar um suporte deteste e/ou de diagnóstico
[176]-O suporte pode ser especificamente um eletrodo de ouro. O kit de teste pode consistir vantajosamente de uma célula eletroquímica composta de um eletrodo de trabalho, um contra-eletrodo e um eletrodo de referência. O eletrodo de trabalho pode ser de ouro, o contra-eletrodo de platina e o eletrodo de referência de prata. A investigação da interação de um oligonucleotídeo modificado com uma molécula a ser testada pode compreender um passo de medição por voltametria cíclica.
[177]-Enxerto com uma superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono (função alquenil) ou uma ligação carbono-carbono tripla (função alquinil) ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, podem, por exemplo, ser utilizadas para aplicações no campo de diagnóstico, no formato de microplaca e/ou para realizar testes do tipo ELOSA (sigla do inglês "Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay" - ensaio de oligosorvente ligado por enzima). No curso deste tipo de teste, a superfície dos poços é enxertada com alquenil, alquinil ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida 1 Em seguida, a superfície é colocada em contato com oligonucleotídeos modificados de acordo com a invenção. Assim, uma ou mais ligações tioéter se formam devido á presença de uma ou mais funções tióis nos oligonucleotídeos de acordo com a invenção. Em seguida, o teste consiste em contactar uma amostra de teste composta de uma sequência nucleotídica alvo com os poços assim fúncionalizados, especifícamente para medir a hibridização dos oligonucleotídeos. A medição pode, por exemplo, ser baseada em fluorescência por rotulagem das cadeias de oligonucleotídeos.
[178]-A invenção também está relacionada ao uso de um oligonucleotídeo modificado conforme descrito acima e composto de pelo menos duas funções tióis para enxerto de superfície composto de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida. De acordo com um exemplo de concretização, o composto pode consistir de três ou quatro funções tióis. O oligonucleotídeo modificado imobilizado na superfície composta de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções haloacetamidicas, preferencialmente funções maleimida ou acrilamida, por meio de pelo menos duas funções tióis, apresentam estabilidade muito boa para uso em um teste de diagnóstico, como o teste do tipo ELOSA, assim como melhor disponibilidade em relação aos alvos. Quando o número de funções tióis no composto aumenta, o número de hibridizações na totalidade do suporte enxertado durante o teste de detecção aumenta. Assim, um oligonucleotídeo modificado tendo quatro funções tióis toma possível obter uma hibridização mais efetiva do alvo.
[179]-Nos exemplos, o termo "sonda" significa uma cadeia oligonucleotídea composta de pelo menos um composto de tiol de acordo com a invenção, destinado a ser imobilizado em uma superfície.
[180]-O termo "alvo" significa uma cadeia oligonucleotídea destinada a hibridizar com a sonda, por exemplo, durante um teste de diagnóstico Exemplo 1: Síntese de um oligõmero Síntese do composto l-(9-(4,4l-dimetóxi-tritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2- rnetilpropano-l,3-diol 4
[181]-0 composto 3 é obtido do composto 1 seguindo o protocolo descrito no artigo de Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J , e Morvan, F , no Journal of Organic Chemistry 74, de 2009, 1218-1222.
[182]-Éter coroa 18-6 (70 mg, 0,26 mmol) é adicionado à uma solução de l-(9-(4,4'- dimetóxi-tritil)-2-(6-bromohexil oximetil)-2-metil-l,3-propanodiol 3 (556 mg,0,95 mmol) e de tioacetato de potássio (162 mg, 1,42 mmol) em tolueno anidro (10 mL).
[183]-A mistura é submetida à agitação magnética por 2 horas à 50 °C. Após diluição com diclorometano (150 mL), a mistura é filtrada e a fase orgânica é lavada com água (2 x 50 mL) e, em seguida, seca sobre NasSC^. Após a evaporação, o produto impuro da reação é purificado por cromatografia em sílica (0 a 30% de acetato de etila em ciciohexano), produzindo o produto desejado na forma de um óleo sem cor (413 mg, 75%). Síntese de 1 -i9-(4,4'-dimetóxi-tritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metil-3-Q-(2- cianoetil-N.N'-diisopropil fosforamidita)-propano-L3-diol 5
2-Cianoetil-N,N'-diisopropilcloro fosforamidita (190 μL, 0,85 mmol) é adicionado a uma solução de 1 -6>-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metilpropano-1,3- diol 4 (413 mg, 0,71 mmol) e diisopropil etilamina (186 μL, 1,06 mmol) em diclorometano anidro (10 mL). A mistura é submetida à agitação magnética por uma hora à temperatura ambiente. O reagente em excesso é neutralizado, adicionando-se 500 μL de água e, em seguida, a mistura é diluída com diclorometano (150 mL). A fase orgânica é lavada com uma solução aquosa de NaHCO? (100 mL) saturada e, em seguida, é seca sobre Na2SO4. Após a evaporação o produto impuro da reação é purificado por cromatografia sílica (0 a 30% de acetato de etila em ciciohexano contendo 4% de trietilamina) produzindo o composto desejado 5 na forma de um óleo sem cor (400 mg, 72%).Síntese do suporte sólido tiol 6
[184]-Em um tubo de vidro retificado, l-O-(4,4’-dimetóxi-tritil)~2-(6-S- acetiltiohexiloximetil)-2-metil-],3-propanodiol 4 (178 mg, 0,3 mmol) e dimetilaminopiridina (DMAP 36 mg, 0,3 mmoi) são coevaporados com 3 mL de piridina anidra. Em seguida, são adicionados uma cadeia longa sucinil alquilamina - CPG (sigla para Controlled Pore Glass - vidro com porosidade controlada) (1 g), piridina anidra (5 mL), trietilamina anidra (160 mL, 1,2 mmol) e etildimetilaminopropil carbodiimida (EDC, 280 mg, 2,0 mmol). Depois ele é enxaguado com 1 mL de piridina anidra A mistura é agitada por uma noite.
[185]-A mistura é filtrada e lavada com CH2C12 (10 mL) e, em seguida, seca em um dessecador. O composto tiol em suporte sólido é tratado com uma solução de anidrido acético, N-metilimidazola, 2,6-lutidina em THF por 3 horas com agitação. A mistura é filtrada e lavada com CH2C12 (10 mL) e, em seguida, seca em um dessecador para produzir o suporte sólido de tiol 6 (940 mg) com uma funcionalização de 29 μmol/g.
[186]-Três oligonucleotídeos compostos de um grupo ferrocene na posição 5' e um maior número de compostos tióis de tipo (Ia) de acordo com a invenção (1, 2 e 4 compostos tióis) foram sintetizados em um sintetizador de DNA. O grupo ferrocene foi utilizado para visualizar a imobilização do oligonucleotídeo na superficie de ouro por voltametria cíclica. Um, dois ou quatro grupos tióis foram introduzidos em um suporte sólido do tipo propanediol e a sequência de DNA conforme NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 7 foi enxertada. Concluindo, uma fosforamidita alfa timidina contendo um grupo ferrocene foi introduzida na posição 5' do oligonucleotídeo modificado A desproteção que segue é realizada em dois passos. Em primeiro lugar, o meio é tratado com 10% de piperidina em acetonitrila por 10 minutos para remover o grupo cianoetil por beta-remoção e a acrilonitrila resultante é removida do meio por lavagem com acetonitrila. Em seguida o tratamento com hidróxido de amónio concentrado toma possível remover os grupos protetores acil nas nucleobases e nas funções tióis e toma possível fazer a hidrólise da união sucinil (suporte sólido). Este protocolo toma possível evitar a adição Michael entre as funções tióis desprotegidas e a acrilonitrila. Após a evaporação, o oligonucleotídeo modificado sem suporte é purificado por cromatografia HPLC de fase reversa em uma coluna C18. Tetratiol (oligonucleotídeo modificado com 4 compostos tióis)
Ditiol (oligonucleotídeo modificado com 2 compostos tióis)
Monotiol (oligonucleotideo modificado com 1 composto tiol)
[187]-Para este estudo, foi utilizado um potenciostato multicanal biológico VMP3 (da Biologic Science Instalments, Pont de Claix), Os resultados foram registrados usando o software EC-Lab da Biologic Science Instruments
[188]-A célula eletroquímica consiste de um eletrodo de ouro com área superficial de 0,28 cm2, um contra-eletrodo de platina e um eletrodo de referência de Ag/AgCl Passo 1: Redução dos grupos tióis 4 nmol de ODN-tiol (oligonucleotídeos modificados com um ou mais compostos tióis) é reduzido em uma solução de Tris(2-carboxietil)fosfino hidrocloreto (TCEP,HCL, da Sigma-Aldrich) (160 mM) ou seja, uma concentração de 20 mM de TCEP, HC1 na solução, à 20 °C, por 2 horas em atmosfera de argônio.
[189]-O ODN é purificado por duas diluições/centrifugações sucessivas com uma solução de TCEP, HCI a 20 mM desgasada em filtros amicon YM3000 (da Millipore) por 15 minutos à 14000 rcf (sigla rcf do inglês Relative Centrifugal Force — força centrífuga relativa). Após a diluição em 450 μL de solução tampão de fosfato à 100 mM desgasada, o meio é centrifugado novamente em filtros amicon de YM3000, por 30 minutos, à 14000 rcf.
[190]-Uma solução de enxerto contendo 4 nmol de ODN, 90 mM de fosfato de sódio, 2 mM de TCEP,HC1 é obtida.
[191]-0 eletrodo de trabalho de ouro é limpo por uma primeira lavagem em acetona por 10 minutos com ultrassom. Assim que estiver seca, a superfície é imersa em uma solução "piranha" (0,7 mL H2SO4, 0,3 mL de H2O2) por 1 minuto para remover qualquer resíduo orgânico da superfície.
[192]-Concluindo, a ativação básica do elétrodo consiste de limpeza da superfície do ouro por geração de hidrogênio no eletrodo por hidrólise de água em 0,5M de soda em potenciais negativos (-1,4 V vs Ag/AgCl) durante vários ciclos.
[193]-Após o enxágue, a solução enxerto contendo o oligonucleotídeo tiol é colocada em contato com o eletrodo de ouro ativado, durante três dias em uma atmosfera inerte.
[194]-Após o enxágue, a célula eletroquimica é abastecida com o eletrólito de análise (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 10 mM de fosfato de potássio monobásico, 250 mM de perclorato de sódio, pH 6,5).
[195]-A superfície é passivada com uma solução de 1 mM de mercapto propanol por 30 minutos e, depois do enxágue, a célula é colocada no eletrólito de análise por 2 horas para estabilizar a camada enxertada.
[196]-As analises são realizadas por voltametria cíclica (CV) à 50 mV/s, entre -0,1 V e 0,45 V, Estudos da estabilidade da camada enxertada são realizados depois da estabilização do sinal eletroquímico por 2 horas, fazendo a ciclagem a cada 30 minutos.
[197]-A célula é abastecida com água destilada desgassada à 60 °C ou 80 °C por 1 ou 5 minutos, e depois do enxágue, a célula é abastecida com 1,5 mL de eletrólito de análise fosfato (20 mM) perclorado (250 mM). Após a estabilização por 30 minutos a medição é feita por CV.
[198]-Foi realizada uma comparação do grau de enxerto dos 3 oligonucleotídeos modificados com compostos tióis (tetratiol, ditiol e monotiol). O grau de enxerto foi determinado por integração do pico de oxidação do ferroceno. De fato, a carga de elétron transferida está diretamente relacionada ao número de ferrocenes presentes na superfície do eletrodo e, portanto, ao número de sondas enxertadas no ouro
[199]-Os resultados dados abaixo correspondem ao valor médio dos graus de enxerto dos 3 diferentes enxertos de cada sonda
[200]-Um histograma dos resultados é mostrado na Figura 5.
[201]-Os graus de enxerto do monotiol e do ditiol são razoavelmente comparáveis, e um nível inferior de enxerto do tetratiol é observado, provavelmente devido à maior dificuldade, em manter o número de articulações tióis. A despeito dessa diferença, o grau de enxerto do tetratiol ainda é considerável e é bem repetível.
[202]-(Jm teste de estabilidade nos 3 oligonucleotídeos modificados com compostos tióis em relação à temperatura foi realizado em água destilada desgassada A evolução da resposta eletroquímica foi monitorada por voltametria cíclica. A redução porcentual na intensidade da oxidação do ferroceno é calculada em relação ao sinal obtido apos a estabilização
[203]-Essas reduções em função do tempo estão apresentadas nas figuras 6 e 7.A molécula de tetratiol é muito estável em relação aos sucessivos tratamentos em água à 60 °C (Figura 6). De fato, depois de 5 vezes desse tratamento por um minuto, 97% do sinal de partida permanece, em contraste ao monotiol (70% do sinal de partida) e do ditiol (62% do sinal de partida).
[204]-A 80 °C, a perda de sinal é maior (Figura 7). Após cinco tratamentos sucessivos de um minuto, 83% do sinal de partida é quantificável novamente para o tetratiol. Assim, a estabilidade do tetratiol está bem acima da do monotiol (45% do sinal residual) e do ditiol (18% do sinal residual)
[205]-Esse estudo mostra o ganho notável na estabilidade do enxerto de tiol em ouro utilizando um oligonucleotídeo modificado com 4 compostos tióis (tetratiol), em comparação com o enxerto de um monotiol ou de um ditiol A falta de estabilidade deste último ditiol mencionado pode ser devido à possível concorrência entre o enxerto em ouro e o fechamento do anel para reformar a ponte de dissulfito intramolecular, Isso parece, portanto, preferível a manter um número de quatro tióis na união de enxerto para assegurar boa estabilidade em relação à temperatura
[206]-Amostras de plasma de doadores de sangue, testados como positivo quanto a presença de HCV na escala nacional, são analisados por sequenciamento. O genótipo e o subtipo viral do HCV que infectam cada doador são determinados
[207]-Amplicons "HCV (+)" de 401 bp são produzidos a partir da região viral NS5b do HCV, por RT-PCR de cada uma das amostras do plasma descritas acima O RNA é extraído de 200 μL de plasma humano usando o kit Ácido Nucleico Viral de Alta Pureza (da Roche) de acordo com as recomendações do fabricante. O RNA é eluído em 50 μL de água estéril (isenta de DNase/RNase). Para o passo de transcrição reversa (à TA), 11 μL de RNA é desnaturado a 72 °C por 10 minutos e transcrito de forma reversa na presença de 4 μL de 5 vezes da solução tampão (First Strand Buffer da Invitrogen), 2 μL de I OX mistura Hexanucleotidea (da Roche), 2 μL de mistura de dNTP 10 mM (Invitrogen) e 200U de Transcriptase Reversa SuperScript® (II) (da Invitrogen). As condições da transcrição reversa são as seguintes: 10 minutos à 23 °C, 45 minutos à 37 °C, e 10 minutos à 95 °C
[208]-Cinco microiitros de cDNA são amplificados, em seguida, por PCR (reação de cadeia de polimerase) usando os primers: - "Senso HCV bionitilado" (de sequência: [Btn]- TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC GCT GCT TTG A (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8)) e - "HCV antissenso" (de sequência GGC GGA ATT CCT GGT CAT AGC CTC CGT GAA (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9)) (ver Tamalet C. et al. 2003, Journal of Medical Virology 71: 391-398).
[209]-A reação de amplificação é realizada em 50 μL de mistura de reação composta de: IX de solução tampão PCR sem MgCh (da Invitrogen), 0,2 μM de cada primer, 1,5 mM de MgCh (da Invitrogen), 0,2 mM de mistura dNTP (Invitrogen) e 1,3U de Polimerase de Taq (Invitrogen). As condições da PCR são as seguintes: 5 minutos à 95 °C, 40 ciclos (desnaturação: 40 s, à 95 °C; hibridização: 40 s, á 56 °C; alongamento: 50 s, à 72 °C), e a extensão final de 10 minutos à 72 °C.
[210]-Os amplicons HCV obtidos são analisados por eletroforese em gel de agarose, alíquotas são extraídas e armazenadas à -20 °C antes do uso Esses amplicons, cujos genótipos virais originais são conhecidos, são armazenados na forma de uma biblioteca.
[211]-Um exemplo de um amplicon com um comprimento de 401 bp obtido a partir de uma cepa viral la/lb, com referência No. PTR6719 tem a sequência: 5’- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACGGTCACTGAGAATGAC ATCCGTGTTGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACCTAGCCCCCGAAGCCAG ACAGGCCATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTACATCGGGGGTCCCCTGACT AATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGCTATCGCCGGTGCCGCGCGAGCGGTGTGC TGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCC TGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACC TTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACG AGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3*. (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 12).
[212]-Um exemplo de um amplicon com um comprimento de 401 bp obtido a partir de uma cepa virai 2, com referência No. PTR7761 tem a sequência: 5'- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACTGTCACTGAGAGAGAC ATCAGAACCGAGGAGTCCATATACCAGGCCTGCTCCCTAACCGAGGAGGCTC GCACCGCCATACACTCGCTGACTGAGAGGCTATACGTGGGAGGGCCCATGCT CAATAGCAAAGGCCAGACCTGCGGGTACAGGCGTTGCCGCGCCAGCGGGGTG CTCACCACTAGCATGGGAAACACCATTACGTGCTATGTGAAAGCTCTAGCGG CATGCAAGGCCGCAGGGATAGTAGCGCCCACGATGCTGGTATGCGGOGACGA CCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTGAGGAGGACGAGCGGAACCTG AGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 31).
[213]-Um exemplo de um amplicon com um comprimento de 401 bp obtido a partir de uma cepa viral 3a, com referência No PTR9058 tem a sequência: 5'- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGAT ATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCA GGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGCGGGGGTCCTATGTTC AACAGCAAAGGGGCCCAGTGTGGTTATCGCCGTTGCCGTGCTAGTGGAGTTC TACCTACCAGCTTCGGCAATACAATCACTTGCTACATCAAGGCCACAGCGGCT GCAAGGGCCGCAGGCCTCCGGAACCCGGACTTTCTTGTCTGCGGAGACGATC TAGTCGTGGTGGCTGAGAGTGACGGCGTCGACGAGGATGGGGCGGCCCTGAG AGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3* (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 14).
[214]-Um exemplo de um amplicon com um comprimento de 401 bp obtido a partir de uma cepa viral 4a/4d, com referência No PTR4162 tem a sequência. 5’- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGAC ATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCC GCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTA CAACAGCAGGGGAGACCTTTGCGGAACTCGACGGTGCCGTGCAAGCGGCGTA TTCACCACCAGCTTTGGGAACACACTGACGTGCTATCTTAAGGCCAGCGCGGC CATCAGGGCTGCAGGCCTAAAGGACTGCACCATGCTGGTCTGTGGCGACGAC TT AGTCGTT ATCGCTG AAAGCGATGGCGTGG AGG AGGAC A ACCGTGCGCTC A GAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 32).
[215]-Para complementar esses amplicons longos, outros primers foram projetados para gerar amplicons mais curtos partindo de cada uma das amostras de plasma descritas acima. O mesmo protocolo geral é seguido para gerar os amplicons "curtos", e apenas os primers utilizados foram mudados. Os primers utilizados são selecionados de acordo com o genótipo e/ou subtipo de HCV que infectaram os pacientes
[216]-Amplicons específicos dos HCVs de subtipo la/lb, com tamanho de 191 nucleotideos são amplificados com os seguintes primers: - Primer senso biotinilado "senso la/lb", de sequência 5'-[Btn]-TGA-CRA-CYA-GCT- GYG-GTA-AYA-CCC-T- 3' (ou [Btn] - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 10) e - Primer antissenso "antissenso de HCV" de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9 (ver acima),
[217]-Um exemplo de um amplicon curto 191 nucleotideos obtidos a partir de uma cepa viral la/lb, com referência No. PTR6719 tem a sequência: 5'- TGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCC TGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACC TTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACG AGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC -3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 13)
[218]-Amplicons específicos dos HCVs do subtipo 2, com um tamanho de 108 nucleotideos são amplificados com os seguintes primers: - Primer senso biotinilado "senso HCV 2 biotinilado", de sequência 5'-[Btn]-ATG-YTG- GTR-TGC-GGC-GAC-GAC- 3’ (ou [Btn] - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 29) e - Primer antissenso "antissenso de HCV" de NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9 (ver acima)
[219]-Um exemplo de um amplicon curto de 108 nucleotideos obtidos a partir de uma cepa virai 2, com referência No. PTR7761 tem a sequência: 5'- ATGCTGGTATGCGGCGACGACCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTG AGGAGGACGAGCGGAACCTGAGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTC CGCC -3’ (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 33).
[220]-Amplicons específicos dos HCVs do subtipo 3a, com um tamanho de 143 nucleotídeos são amplificados com os seguintes primers: - Primer senso biotinilado "Senso HCV", NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 (ver acima), e - Primer antissenso "3a rev" de sequência: 5-GCA-GTA-AAG-CCG-YTC-CGT-GAG-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 11)
[221]-Um exemplo de um amplicon curto de 143 nucleotídeos obtidos a partir de uma cepa viral 3a, com referência No. PTR9058 tem a sequência: 5’- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGAT ATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCA GGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 15).
[222]-Amplicons específicos dos HCVs de subtipo 4a/4d, com tamanho de 175 nucleotídeos são amplificados com os seguintes primers. - Primer senso biotinilado "senso HCV", NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 (ver acima), e - Primer antissenso "antissenso HCV 4 rev" de sequência 5-AGG-TCT-CCC-YTG- CTG-TTG-TRC-AT-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 30).
[223]-Um exemplo de um amplicon curto de 175 nucleotídeos obtidos a partir de uma cepa viral 4a/4d, com referência No PTR4162 tem a sequência: 5'- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGAC ATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCC GCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTA C.AAC.AGCAGGGGAGACCT -3’ (- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 34).
[224]-Como mencionado antes, os amplicons HCV "curtos" obtidos com 191, 108, 175 e 143 nucleotideos são analisados por eletroforese em gel agarose, alíquotas são colhidas e armazenadas à -20 °C antes do uso. Esses amplicons, cujos genótipos virais originais são conhecidos, são armazenados na forma de uma biblioteca
[225]-Foram sintetizados oligonucleotídeos sintético de 15 monômeros ou 105 monômeros biotinilados na extremidade 5'.
[226]-Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros são estritamente complementares às sondas HCV selecionadas (ver abaixo), e têm as seguintes sequências. - Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros, específicos para o subtipo la/lb têm a sequência: 5' [Btn]- GCT SCC GGA ACT GCA C -3’ (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 2); - Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros, específicos do subtipo 3a têm a sequência. [Btn]-CTT GAA CCG GAG GCC-3* (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 5) e - Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros, específicos do subtipo 4a/4d têm a sequência: 5’ [Btn]-CTA YGT GGG CGG YCC -3' (ou [Btn] - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 39).
[227]-01igonucleotídeos mais longos compostos de sequência complementar das sondas HCV apresentadas abaixo, enquadrados em cada lado por sequências de 45 nucleotideos, ou 105 nucleotideos no total, e biotinilado na extremidade 5', foram também sintetizados para desenvolver os testes de hibridização de sonda/alvo.
[228]-Os oligonucleotídeos sintéticos de 105 monômeros utilizados têm as seguintes sequências: - Os oligonucleotídeos sintéticos de 105 monômeros, específicos para o subtipo la/lb têm a sequência: 5‘ [Btn]- CCT CAC TTG CTA CAT CAA GGC CCA GGC AGC CTG TCG AGC CGC AGG - GCT CCR GGA ACT GCA C - CAT GCT CGT GTG TGG CGA CGA CTT AGT CGT TAT CTG TGA AAG TGC-3' (ou [Btn]-NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 3); e - Os oligonucleotídeos sintéticos de 105 monômeros, específicos do subtipo 3a têm a sequência: 5' [Btn]- GAA CAG GAC ATC AGG GTG GAA GAG GAG ATA TAC CAA TGC TGT AAC - CTT GAA CCG GAG GCC - AGG AAA GTG ATC TCC TCC CTC ACG GAG CGG CTT TAC TGC GGG GGC -3’ (ou [Btn]-NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 6) Projeto de sondas de oligonucleotídeo para reconhecimento de sequências de HCV
[229]-A região NS5b codificando a polimerase RNA do HCV foi destinada para projetar as sondas de oligonucleotídeo da invenção.
[230]-As sequências de genoma do HCV amplificadas na região NS5b (banco representativo de 800 amostras) foram determinadas e analisadas usando o software de alinhamento clustalW2 e o software de filogenia Mega5 para identificar as zones mais conservadas de cada genótipo e/ou subtipo de HCV. Foram selecionadas regiões separadas que permitem o reconhecimento genérico das sequências virais de um genótipo e opcionalmente de um determinado subtipo. Uma região altamente conservada permitindo detecção específica de todos os HCVs do genótipo virai la/lb foi assim identificada e selecionada. Da mesma forma, foi identificada e selecionada uma região que permite a detecção específico dos HCVs de genótipo viral 2, 2a/2c, 2b, 3a e 4a/4d. Oligonucleotídeos de 15 monômeros complementares de cada uma das regiões selecionadas foram projetadas e oligonucleotídeos multi-tióis foram sintetizados em seguida com base nas sequências selecionadas para o reconhecimento específico dos subtipos la/lb, 2, 2a/2c, 2b, 3a e 4a/4d.
[231]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda la/lb é: 5-GTG-CAG- TCC-YGG-AGC (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1). Esta sonda é específica para as cepas de subtipo la e 1b.
[232]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda 2 é: 5-TGG-CTY-TCT- GAG-ATG (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27). Esta sonda é especifica para as cepas de subtipo 2.
[233]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda 2a/2c é: 5-GGA-CTC- CTC-RGT-TCT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 35). Esta sonda é específica para as cepas de subtipo 2a e 2c.
[234]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda 2b é: 5-TAT-GGA-TTC- TTC-TGT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36). Esta sonda é específica para as cepas de subtipo 2b.
[235]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda 3a é: 5-GGC-CTC- CGG-TTC-AAG (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 4). Esta sonda é específica para as cepas de subtipo 3a.
[236]-A sequência de oligonucleotídeo retida para gerar a sonda 4a/4d é: 5'- GGR-CCG-CCC-ACR-TAG (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 28). Esta sonda é especifica para as cepas dos subtipos 4a e 4d.
[237]-O enxerto de qualquer tipo de sondas de tiol (sondas de oligonucleotídeos anômero alfa ou anômero beta, lineares ou com estrutura em grampo {'hairpin loop"), etc.) pode ser realizado de acordo com o seguinte protocolo otimizado Os poços de microplaca ativados por maleimida (Pierce) são lavados com solução tampão WB1 (O,1M de Na2HPO4, 0,15M de NaCl, 0,05% de Tween 20 (p/v), pH 7,2). A funcional ização dos poços é realizada com sondas multi-tiol de 100 nM (conforme descrito acima) em solução tampão BB (0,lM de Na2HPÜ4, 0,15M de NaCl, 10 mM de EDTA, pH 7,2) por 2 horas à temperatura ambiente (TA) Os poços são lavados em seguida três vezes com WB1 saturada com 10 pg.mL de solução de 1 cisteina-HCl em BB (Pierce) por 1 hora na temperatura ambiente, e lavados novamente três vezes com WB1.
[238]-Os testes de hibridização são realizados com alvos sintéticos curtos de 15 monômeros ou 105 monômeros ou com amplicons de HCV reais: longo (401 nt) ou mais curto (191 nt ou 143 nt) Os alvos sintéticos e os amplicons são diluídos em 150 μL de solução tampão de hibridização (HB: 0,9M de NaCl, 60 mM de NaH2PO4, 6 mM de EDTA, pH 7,4, Denhardt 5(X) antes de ser depositado nos poços. Um passo de desnaturação adicional de 10 minutos à 95 °C é realizado nos amplicons antes de transferir para os micropoços. A hibridização é realizada durante a noite à 37 °C. Os poços são lavados com solução tampão WB2 (0,75M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, 5 mM de EDTA, pH 7,4, SDS à 0,1% três vezes durante 2 minutos na temperatura ambiente e uma vez por 30 minutos à 50 °C,
[239]-O passo de detecção é realizado após incubação por 30 minutos à temperatura mibiente dos poços na presença de 100 pL/poço de Streptavidin-Europium (da Perkin Elmer) diluído em 100 pL de solução tampão para análise ("Assay Buffer", da Perkin Elmer). Os poços são finalmente lavados seis vezes com solução tampão WB3 (WB1X, da Perkin Elmer), e 200 pL de solução tampão de desenvolvimento de sinal ( "Enhancement Buffer", da Perkin Elmer) é adicionado em cada poço por 5 minutos na temperatura ambiente. A fluorescência resolvida no domínio do tempo é medida em um detector Victor/’1 1420 de multi-rotulagem ("multilabel counter", da Perkin Elmer) de acordo com o protocolo do fabricante (excitação em 340 nm e emissão em 615 nm).
[240]-Sondas lineares beta-anoméricas 3a com 4 funções tióis são enxertadas, em uma densidade de 100 nM, em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima Os resultados obtidos com as sondas 3a são apresentados nas figuras 8, e 9.
[241]-0s testes ELOSA são realizados, variando-se a natureza e a concentração do alvo utilizados (alvos sintéticos curtos de 15 monômeros e 105 monômeros, amplicons curtos de 143 nt ou 191 nt, amplicons longos de 401 nt), para verificar a especificidade das sondas retidas
[242]-Os resultados apresentados na Figura 8 correspondem a um teste ELOSA realizado com amplicons longos, específicos do HCV genótipo 3a, em diluições de 1/10, 1/100 e 1/1000 e com amplicons longos não específicos (correspondentes ao HCV genótipo la/lb) em diluições de 1/10, 1/100 e 1/1000. O controle positivo da hibridização é realizado com um alvo sintético (15 monômeros) específico do genótipo 3 a em concentrações de lOOOpM e 5pM Os controles negativos de hibridização são realizados com um alvo sintético (15 monômeros) que não é específico (correspondente à sequência- alvo la/lb) em uma concentração de lOOOpM, ou com HB (solução tampão de hibridização) apenas, não consistindo em um alvo.
[243]-Para a sonda 3a ser considerada como "específico" para o subtipo 3a, é necessário, portanto, para os resultados obtidos com alvos "3 a", ultrapassar o ruído de fundo obtido com os controles negativos, de modo que a hibridização da sonda/alvo possa ser quantificada
[244]-Os resultados apresentados na Figura 9 correspondem a um teste ELOSA realizado com os seguintes alvos: - 15 monômeros ou 105 monômeros específicos de alvo sintético 3a, em uma concentração de lOpM, lOOpM ou de lOOOpM, - 15 monômeros ou 105 monômeros alvo sintético la/lb não especifico (controle negativo), em uma concentração de lOpM, lOOpM ou de lOOOpM, - amplicon longo específico de 3a, em diluição de 1/100, - amplicon longo la/lb não específico, em diluição de 1/100, - amplicon curto específico de 3a (143 nt), em diluições de 1/100 e 1/1000, - amplicon curto especifico de la/lb (191 nt), em diluições de 1/100 e 1/1000, - HB apenas, não consistindo em um alvo.
[245]-Os resultados obtidos nas figuras 8 e 9 mostram que a sonda "3a", de acordo com a presente invenção, não é apenas capaz de hibridizar para alvos sintéticos específicos 3a, de 15 monômeros (alvo tendo uma concentração de 5pM) ou 105 monômeros (alvo tendo uma concentração de 10pM), mas também para amplicons longos de 401 nt ou amplicons curtos de 143 nt obtidos de plasmas genotipados 3a e, portanto, específicos para o genótipo 3a (em uma diluição de 1/1000). Esses resultados também mostram que os alvos la/lb, não específicos para a sonda 3a, não hibridizam de forma detectável com este último, independentemente de sua forma (alvo sintético de 15 monômeros ou 105 monômeros, amplicon curto de 191 nt ou amplicon longo de 401 nt), ou de sua concentração (lOOOpM para os alvos sintéticos ou diluição de 1/10 para os amplicons).
[246]-Os resultados apresentados na Figura 10 correspondem a um teste ELOSA realizado com sondas lineares la/lb (ver acima), beta-anomérica, tendo 4 fonções tióis, que são enxertadas em uma densidade de lOOnM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima.
[247]-Os resultados da Figura 10 são obtidos a partir dos seguintes alvos. - alvo sintético específico la/lb de 15 monômeros ou 105 monômeros, em uma concentração de lOpM, lOOpM ou de lOOOpM, - alvo sintético não especifico 3a de 15 monômeros ou 105 monômeros (controle negativo), em uma concentração de 10pM, lOOpM ou de lOOOpM, - amplicon longo específico do genótipo HCV la/lb, na diluição de 1/100, - amplicon longo não especifico 3a, em diluição de 1/100, - amplicon curto específico la/lb (191 nt), em diluições de 1/100 e 1/1000, - amplicon curto não especifico 3a (143 nt), em diluições de 1/100 e 1/1000, - HB apenas, não consistindo em um alvo
[248]-Os resultados obtidos na Figura 10 mostram que a sonda la/lb, de acordo com a presente invenção, não é apenas capaz de hibridizar alvos sintéticos com 15 monômeros ou 105 monômeros específicos para la/lb (o alvo tendo uma concentração de lOpM), mas também para amplicons curtos de 191 nt obtidos de plasmas genotipados la/lb e, portanto, específicos para um genótipo la/lb (em diluição de 1/1000), e para amplicons longos de 401 nt, específicos para o genótipo la/lb (em diluição de 1/100).
[249]-Esses resultados também mostram que os alvos 3a, não específicos para sonda la/lb, não hibridizam de forma detectável para este último, independentemente de sua forma (alvo sintético com 15 monômeros ou 105 monômeros, amplicon curto de 143 nt ou amplicon longo de 401 nt), ou sua concentração (lOOOpM para os alvos sintéticos ou diluição de 1/10 para os amplicons).
[250]-Os resultados apresentados na Figura 17 correspondem a um teste ELOSA realizado com uma sonda la/lb linear beta anomérica tendo 4 funções tióis, que são enxertadas em uma densidade de lOOnM em um suporte coberto com grupos maleimida, cie acordo com o protocolo descrito acima.
[251]-Os resultados da Figura 17 são obtidos a partir dos seguintes alvos: - alvo sintético especifico la/lb de 15 monômeros em uma concentração de lOpM, ou lOOOpM, - alvo sintético não específico 2a/2c, 2b, 3a ou 4a/4d com 15 monômeros (controle negativo), em uma concentração de 10pM ou lOOOpM, - amplicon longo específico do genótipo HCV la/lb, na diluição de 1/100, - amplicon longo não especifico 2a/2c, 2b, 3a ou 4a/4d em diluição de 1/100, - HB apenas, não consistindo em um alvo
[252]-Os resultados apresentados na Figura 18 correspondem a um teste ELOSA realizado com uma mistura de duas sondas lineares beta-anoméricas (2a/2c de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35 e 2b de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36) tendo 4 funções tióis, que são enxertadas em uma densidade de 50nM cada, em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima.
[253]-Os resultados da Figura 18 são obtidos a partir dos seguintes alvos: - alvos sintéticos específicos 2a/2c e 2b de 15 monômeros em uma concentração de lOpM, ou lOOOpM, - alvo sintético não específico la/lb, 3a ou 4a/4d com 15 monômeros (controle negativo), em uma concentração de lOpM ou lOOOpM, - amplicon longo especifico do genótipo HCV 2a/2b/2c, em diluição de 1/100, - amplicon longo não especifico la/lb, 3a ou 4a/4d em diluição de 1/100, - HB apenas, não consistindo em um alvo.
[254]-Os resultados apresentados na Figura 19 correspondem a um teste ELOSA realizado com uma sonda linear beta anomérica 3a tendo 4 funções tióis, que são enxertadas em uma densidade de lOOnM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima.
[255]-Os resultados da Figura 19 são obtidos a partir dos seguintes alvos: - alvo sintético específico 3a com 15 monômeros, em uma concentração de 10pM ou lOOOpM, - alvo sintético não específico la/lb, 2a/2b/2c ou 4a/4d com 15 monômeros (controle negativo), em uma concentração de 10pM ou lOOOpM, - amplicon longo específico do genótipo HCV 3a, em diluição de 1/100, - amplicon longo não específico la/lb, 2a/2b/2c ou 4a/4d em diluição de 1/100, - HB apenas, não consistindo em um alvo.
[256]-Os resultados apresentados na Figura 20 correspondem a um teste ELOSA realizado com uma sonda linear beta anomérica 4a/4d tendo 4 funções tióis, que são enxertadas em uma densidade de 100nM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima.
[257]-Os resultados da Figura 20 são obtidos a partir dos seguintes alvos: - alvo sintético específico 4a/4d com 15 monômeros, em uma concentração de lOpM ou lOOOpM, - alvo sintético não específico la/lb, 2a/2b/2c ou 3a com 15 monômeros (controle negativo), em uma concentração de 10pM ou lOOOpM, - amplicon longo específico do genótipo HCV 4a/4d, em diluição de 1/100, - amplicon longo não específico la/lb, 2a/2b/2c ou 3a em diluição de 1/100, - HB (solução tampão de hibridização) apenas, não consistindo em um alvo.
[258]-Para os testes realizados usando amplicons, os resultados de 3 ensaios independentes realizados partindo de cepas virais de diferentes origens, mas do mesmo subtipo, são apresentados nas figuras 17 a 20.
[259]-Os resultados apresentados nas figuras 17 a 20 mostram que cada uma das sondas la/lb, 2a/2c, 2b, 3a ou 4a/4d, de acordo com a presente invenção, não é apenas capaz de hibridizar com alvos sintéticos de 15 monômeros que são específicos para a sonda (o alvo tendo uma concentração de lOpM), mas também com amplicons específicos do mesmo genótipo (em uma diluição de 1/100). Esses resultados também mostram que alvos não específicos não hibridizam de forma detectáveí.
[260]-Os testes ELOSA também são realizados variando-se o número de funções tióis na sonda utilizada e testando-se diferentes tipos e concentrações de alvos (alvo sintético curto com 15 monômeros ou 105 monômeros, amplicons curtos de 143 nt ou 191 nt, amplicons longos de 401 nt).
[261]-Os resultados apresentados na Figura 11 correspondem a um teste ELOSA realizado com sondas lineares la/lb (ver acima) tendo 1, 2, 4, 6 ou 8 funções tióis, que são enxertadas em uma densidade de lOOnM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima. Os resultados da Figura 11 são obtidos a partir dos seguintes alvos: - alvo sintético específico la/lb com 15 monômeros ou 105 monômeros, em uma concentração de lOpM, lOOpM ou lOOOpM, - alvo sintético não específico 3a de 15 monômeros ou 105 monômeros (controle negativo), em uma concentração de lOpM, lOOpM ou de lOOOpM, - HB apenas, não consistindo em um alvo.
[262]-Cada condição de hibridização de sonda/alvo é testada em triplicata em uma microplaca. Os testes são reproduzidos três vezes, completamente do passo de enxerto das sondas à detecção de hibridização (nas 3 microplacas diferentes) Os resultados apresentados na aplicação, portanto, correspondem a um valor médio de 9 medições
[263]-Os resultados obtidos na Figura 11 mostram que a hibridização de um alvo sintético específico la/lb de 15 monômeros com a sonda la/lb é detectável partindo do 10pM do alvo, assim que um tiol estiver presente. A detecção do alvo sintético específico la/lb com 105 monômeros requer por sua vez uma concentração de alvo de lOOpM quando a sonda é composta de 2 funções tióis ou de 10pM quando a sonda é composta de 4, 6 ou 8 funções tióis. Nenhuma hibridização detectável é observada na presença dos alvos 3a, não específico para a sonda la/lb, independentemente do seu tamanho (15 monômeros ou 105 monômeros) ou sua concentração (máxima concentração testada: lOOOpM). Os resultados, assim, mostram que adicionar funções tióis para a sonda oligonucleotídeo enxertado melhora o desempenho de detecção dos alvos em questão. A presença de 4 funções tióis na sonda utilizada toma possível detectar todos os alvos sintéticos (15 monômeros ou 105 monômeros) em uma concentração de lOpM.
[264]-Os resultados apresentados nas figuras 12, 13 e 14 correspondem aos testes ELOSA realizados com sondas lineares beta-anoméricas la/lb (ver acima), tendo 1, 2 ou 4 rünções tióis, que são enxertadas em densidades de 1, 10, 25, 50 ou lOOnM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima. A Figura 12 ilustra os resultados obtidos para a sonda monotiol, ou seja, composto de um ünico composto tiol, de acordo com a invenção A Figura 13 ilustra os resultados obtidos para a sonda ditiol, ou seja, composto de dois compostos tióis de acordo com a invenção, e a Figura 14 ilustra os resultados obtidos para a sonda tetratiol, ou seja, composto de quatro compostos tióis, de acordo com a invenção.
[265]-Em cada caso, os testes de hibridização são realizados com os seguintes alvos: - alvo sintético específico la/lb com 15 monômeros ou 105 monômeros, em uma concentração de lOOOpM, lOOpM ou de lOpM, - alvo sintético não específico 3a com 15 monômeros ou 105 monômeros (controle negativo), em uma concentração de lOOOpM, de lOOpM ou lOpM, - HB apenas, não consistindo em um alvo.
[266]-Os resultados apresentados nas figuras 12, 13 e 14 confirmam a especificidade de hibridização das sondas la/lb com alvos la/lb, uma vez que a hibridização detectável não é observada na presença de alvos 3a, independentemente da concentração deste último.
[267]-Esses resultados confirmam (1) que a presença de um único tiol na sonda utilizada não permite que os alvos sejam detectados tendo um tamanho de 105 nt, (2) que, partindo de 2 funções tióis, torna-se possivel detectar a hibridização entre a sonda e o alvo de 105 nt (especificamente partindo de alvos de lOOpM), (3) que os melhores resultados são obtidos com a sonda tetratiol.
[268]-Por outro lado, parece que a densidade de enxerto da sonda monotiol não tem muita influência nos sinais de hibridização qualquer que seja os alvos (15 monômeros e 105 monômeros), ao passo que a hibridização depende da dose da densidade do enxerto no caso de sondas ditiol e tetratiol. Os melhores sinais de hibridização sonda/alvo (15 monômeros e 105 monômeros) são obtidos com a sonda tetratiol enxertada em lOOnM A valiação das hibridizações de sonda/atvo em um eletrodo com superfície de ouro
[269]-Um teste de hibridização foi realizado enxertando-se uma sequência de sonda especifica la/lb em um eletrodo com superfície de ouro
[270]-Uma sonda tetratiol contendo um oligonucleotídeo de sequência - NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1 foi enxertado no eletrodo de trabalho com uma superfície de ouro de uma célula. A hibridização de alvos específicos la/lb de 105 monômeros (de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 3) foi avaliada, para 3 diferentes concentrações de alvos: IpM, 10pM e lOOpM. Um controle negativo é realizado com um alvo específico 3a de 105 monômeros com NUMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 6 (controle negativo).
[271]-A reação de hibridização é monitorada por voltametria de pulso diferencial Os resultados obtidos são apresentados na Figura 15.
[272]-Os valores no eixo Y correspondem aos valores normalizados da variação na corrente.
[273]-Os resultados obtidos mostram que o teste de hibridização por eletroquímica é sensível e específico em uma concentração de alvos de 1 pM. A variação no sinal também parece ser maior que em IpM do que quando o teste é realizado em lOOpM. Em uma concentração mais elevada de alvos, um efeito de adsorção não específica dos alvos na superfície do eletrodo reduz a eficácia da reação de reconhecimento. O método eletroquímico nao permite monitoramento quantitativo da reação de hibridização. Em todo o caso, ele proporciona uma resposta específica sim/não, com sensibilidade muito elevada.
[274]-Sequências conhecidas do vírus da dengue (serótipos 1, 2, 3 e 4) e do vírus da febre do Oeste do Nilo foram extraídas da base de dados GenBank e analisados. A Tabela 1 lista os números de acesso ao GenBank das sequências do vírus da dengue e da febre do Oeste do Nilo utilizados para fazer os alinhamentos:Tabela 1
[275]-Comparações de alinhamentos e sequências realizadas usando o software clustalW2 e Mega5 permitiram que 4 regiões fossem definidas, das quais: - 2 são conservadas entre todas as cepas dos vírus da dengue e da febre do Oeste do Nilo, assim como entre outros flavivírus como o vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite por TBE, vírus da febre amarela e vírus usutu (lista não exaustiva), - 1 está conservado entre os vírus da dengue, - 1 está conservado entre os vírus da febre do Oeste do Nilo.
[276]-Essas regiões foram utilizadas para projetar sondas de acordo com a presente invenção, com o objetivo de permitir a detecção genérica dos flavivírus, ou detecção específica dos vírus da dengue, dos vírus da dengue subtipo 4 ou da febre do Oeste do Nilo, em uma amostra biológica.
[277]-As sondas 1 a 3 apresentadas na Tabela 2 abaixo permitem assim geralmente a detecção do flavivírus (inclusive os flavivírus da dengue e da febre do Oeste do Nilo). A sonda 4 é específica para o vírus da dengue, independentemente do serótipo. A sonda 5 é específica para o serótipo 4 do vírus da dengue A sonda 6 é específica para o vírus da febre do Oeste do Nilo.Tabela 2
[278]-Amplicons, cada um incluindo as 6 regiões identificadas, são preparados realizando-se uma PCR simples, partindo das sequências mencionadas na Tabela 1, usando os primers e o protocolo previamente descrito por Scaramozzino e outros, (Scaramozzino N. e outros. Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. 2001. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927).
[279]-A amplificação primária por PCR é realizada, portanto, com: - o primer senso MAMD [Btn]-5'-AAC-ATG-ATG-GGR-AAR-AGR-GAR-AA-3' (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 20), e - o primer antisenso cFD2 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21): 5'- GTG-TCC-CAG-CCG-GCG-GTG-TCA-TCA-GC -3'.
[280]-Esta amplificação leva à obtenção de um amplicon primário de 263 bp.
[281]-Quando a carga virai é muito baixa, uma PCR secundária é realizada usando os produtos da amplificação resultantes da primeira PCR como matriz. Esta PCR "hemi- nested" apresenta vantajosamente um ganho significativo de sensibilidade.
[282]-Um exemplo de um amplicon de 263 bp obtido após a amplificação partindo da cepa do virus da dengue com o número de referência de FJ882517 tem a sequência. 5'- AACATGATGGGGAAGAGAGAGAAAAAACTAGGAGAGTTCGGAAAGGCAAAA GGAAGTCGTGCAATATGGTACATGTGGCTGGGAGCACGCTTTCTAGAGTTCG AAGCTCTTGGTTTCATGAACGAAGATCACTGGTTCAGCAGAGAGAATTCACTC AGCGGAGTGGAAGGAGAAGGACTCCACAAACTTGGATATATACTCAGAGAC ATATCAAAGATTCCAGGGGGAAACATGTATGCAGATGACACAGCCGGATGGG ACAC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 23).
[283]-Um exemplo de um amplicon de 263 bp obtido após a amplificação partindo da cepa do vírus da febre do Oeste do Nilo com o número de referência de EF429200/H442 tem a sequência: 5'-AACATGATGGGAAAGAGAGAGAAGAAGCCTGGAGAGTTCGGCAAGGCTAAA GGCAGCAGAGCCATCTGGTTCATGTGGCTGGGGGCTCGTTTCCTGGAGTTTGA AGCTCTCGGATTCCTCAATGAAGACCACTGGCTGGGTAGGAAGAACTCAGGA GGAGGAGTTGAAGGCTTAGGACTGCAGAAGCTTGGGTACATCTTGAAGGAAG TTGGGACAAAGCCTGGAGGAAAGATTTACGCCGATGATACCGCAGGCTGGGA CAC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 25).
[284]-Uma amplificação secundária por PCR pode então ser realizada opcionalmente de acordo com os protocolo publicados por Scaramozzino e outros, usando os amplicons primários acima como matriz, com: - o primer senso FS778 [Btn] 5’- AAR-GGH-AGY-MCD-GCH-ATH-TGG-T- 3' (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 22), e - o primer antisenso cFD2 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21): 5'- GTG-TCC-CAG-CCG-GCG-GTG-TCA-TCA-GC -3'. Esta amplificação leva à obtenção de um amplicon secundário de 215 bp
[285]-Um exemplo de um amplicon de 215 bp obtido após a amplificação partindo da cepa do vírus da dengue com o número de referência de FJ882517 tem a sequência: 5'- AAAGGAAGTCGTGCAATATGGTACATGTGGCTGGGAGCACGCTTTCTAGAGT TCGAAGCTCTTGGTTTCATGAACGAAGATCACTGGTTCAGCAGAGAGAATTC ACTCAGCGGAGTGGAAGGAGAAGGACTCCACAAACTTGGATATATACTCAGA GACATATCAAAGATTCCAGGGGGAAACATGTATGCAGATGACACAGCCGGAT GGGACAC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA 24)
[286]-Um exemplo de um amplicon de 215 bp obtido após a amplificação partindo da cepa do vírus da febre do Oeste do Nilo com o número de referência EF429200/H442 tem a sequência: 5'- AAAGGCAGCAGAGCCATCTGGTTCATGTGGCTGGGGGCTCGTTTCCTGGAGTT TGAAGCTCTCGGATTCCTCAATGAAGACCACTGGCTGGGTAGGAAGAACTCA GGAGGAGGAGTTGAAGGCTTAGGACTGCAGAAGCTTGGGTACATCTTGAAGG AAGTTGGGACAAAGCCTGGAGGAAAGATTTACGCCGATGATACCGCAGGCTG GGACAC-3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA. 26)
[287]-Em outro exemplo de concretização, os amplicons são preparados a partir de RN As virais de flavivírus, da dengue ou do vírus da febre do Oeste do Nilo por RT-PCR assimétrica. RNAs virais são extraídos do vírus da dengue (1-4) e do vírus da febre do Oeste do Nilo (de origem americana NY ou Africana Af) produzidas in vitro. Amplicons de 263 bp são produzidos a partir da região viral NS5 dos flavivírus, por RT-PCR partindo de cada uma das amostras de RNA descritas acima. Para realizar o passo de transcrição reversa (ã TA), 5 μL de RNA é desnaturado à 72 °C por 10 minutos e transcrito de forma reversa na presença de 4 μL de 5X da solução tampão (First Strand Buffer da Invitrogen), 2 μL de 10X Mistura Hexanucleotidea (da Roche), 2 μL de mistura dNTP a lOmM (Invitrogen) e 200U de Transcriptase Reversa SuperScript® (II) (da Invitrogen) em um volume total de 20 μL. As condições da transcrição reversa são as seguintes. 10 minutos à 25 °C, 60 minutos à 42 °C, e 10 minutos à 95 °C. Cinco microlitros de cDNA são amplificados, em seguida, por PCR (reação de cadeia de polimerase) usando os primers: - Flavivírus senso "MAMD" biotinilado (de sequência: [Btn]- AAC ATG ATG GGR AAR AGR GAR AA (ou [Btn] -NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 20)) e - flavivirus antisenso "cFD2" (de sequência GTG TCC CAG CCG GCG GTG TCA TCA GC (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21)) (ver Scaramozzino N. e outros. 2001, Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927).
[288]-A reação de amplificação assimétrica é realizada em 50 μL da mistura de reação, composta de: IX solução tampão PCR sem MgCL (Invitrogen), 0,2 μM de MAMD, 0,02 μM de cFD2, 1,5 mM de MgCh (da Invitrogen), 0,2 mM de mistura dNTP (da Invitrogen) e 1,5U de Polimerase Taq (Invitrogen). As condições da PCR são as seguintes: 5 minutos à 95 °C, 40 ciclos (desnaturação: 40 segundos, à 94 °C; hibridização: 40 segundos, à 53 °C; alongamento: 50 segundos, à 72 °C), e uma extensão final de 10 minutos à 72 °C. Os amplicons obtidos são analisados por eletroforese em gel agarose; alíquotas são colhidas e armazenadas ã -20 °C antes do uso. Esses amplicons, cujos genótipos virais originais são conhecidos, são armazenados na forma de uma biblioteca.
[289]-Oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros biotinilados na extremidade 5' foram sintetizados. Esses oligonucleotídeos são estritamente complementares para as sondas selecionadas acima, ou seja, para a sonda genérica 3 para detectar flavivírus, para a sonda genérica para detectar o vírus da febre do Oeste do Nilo e para a sonda especifica para o serótipo 4 do vírus da dengue. Esses oligonucleotídeos sintéticos têm as seguintes sequências: Os oligonucleotídeos sintéticos de 14 monômeros, específicos para flavivirus têm a sequência: 5' [Btn]- TGG TWC ATG TGG CT-3* (ou [Btn]-NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 43); Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros, específicos para o vírus da febre do Oeste do Nilo têm a sequência: 5' [Btn]- AGA AYT CAG GAG GMG -3' (ou [Btn]-NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 42) e Os oligonucleotídeos sintéticos de 15 monômeros, específico para o serótipo 4 do vírus da dengue têm a sequência: 5' [Btn]- TCA TGG AGT GGA GTG -3' (ou [Btn]- NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 44).
[290]-Testes de hibridização são realizados com sonda 3 genericamente reconhecendo os flavivírus (ver Figura 21), a sonda 5 reconhecendo especificamente o serótipo 4 da dengue (ver Figura 22) e a sonda 6 reconhecendo o vírus da febre do Oeste do Nilo (ver Figura 23). As sondas tendo 4 funções tióis são enxertadas, em uma densidade de 200 nM em um suporte coberto com grupos maleimida, de acordo com o protocolo descrito acima Testes ELOSA são realizados em seguida usando amplicons preparados a partir dos serótipos 1, 2, 3 ou 4 da dengue, do vírus da febre do Oeste do Nilo de origem americana (NY) ou de origem africana (Af), ou do vírus da hepatite C (amplicon 3a longo), em uma diluição de 1/10 para a sonda 3 e de 1/50 para as sondas 5 e 6 para verificar a especificidade das sondas retidas. Nos diagramas das figuras 21, 22 e 23, o valor "amostras/ruído de fundo" é obtido calculando-se a razão da quantidade de contagens medidas em cada amostra em relação ao número de contagens medidas para o controle (HB), correspondente à solução tampão de hibridização sozinha, não consistindo em um alvo. Os amplicons do vírus da dengue e do vírus da febre do Oeste do Nilo utilizados nesses testes foram obtidos pelo método de RT-PCR assimétrico, descrito acima
[291]-Os resultados apresentados nas figuras 21, 22 e 23 mostram que a sonda genérica para flavivírus, a sonda específico para dengue 4 e a sonda genérica para o vírus da febre do Oeste do Nilo única hibridizam significativamente para os amplicons que correspondem ao vírus em questão
Claims (17)
1. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, correspondente à fórmula (XIIb): (XIIb) N1-N2-... -Nn-1-Nn-(I'b)y-(M1-... -Mm-1-Mm)p-(I'b)y' ou à fórmula (XIIIb): (XIIIb) (Ic')-(I'b)y-1-N1-N2-.-Nn-1-Nn-(I'b)y'-(M1-M2-.-Mm-1-Mm)p-(I'b)y'' caracterizado pelo fato de, N1, ., Nn representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, M1, ., Mm representam, independentemente um do outro, um nucleotídeo, (I'b) representa um composto, definido pela fórmula:
(Ic') representa um composto, definido pela fórmula:
n é um inteiro variando entre 4 a 100, m é um inteiro variando entre 4 a 100, y é um inteiro variando entre 2 a 12, p representa 0 ou 1, y' é um inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e y' é igual a 0 se p tiver o valor igual a 0, y'' é um inteiro variando entre 0 a 12 se p tiver o valor igual a 1 e, se p tiver o valor igual a 0, então y" tem o valor igual a 0, a soma dos inteiros (y + y') ou (y + y' + y'') não é maior que 12, X é selecionado a partir de grupos alquila C1-C12 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila C1-C12, grupos alcóxi C1-C12, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, Y é selecionado a partir de grupos alquila C1-C12 lineares ou ramificados, grupos aminoalquila C1-C12, grupos alcóxi C1-C12, grupos cicloalquila C3-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, Z é selecionado a partir de grupos alcóxi C1-C12, grupos cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, grupos NCO-alquila C1-C12, grupos CON- alquila C1-C12, W é selecionado dos grupos alcano triila C1-C12, dos grupos triila arila C6-C18 e dos grupos triila aralcano C6-C18, R é H ou é selecionado a partir de grupos acil C1-C12, S-alquila C1-C12, S-aril C6-C12, S-2-piridina, S-heteroalquila C1-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio, S- cicloalquila C3-C12, S-cicloheteroalquila C3-C12 contendo oxigênio ou contendo nitrogênio.
2. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, de acordo com a reivindicação 1, correspondente à fórmula:
caracterizada pelo fato de: n, y, Ni,..., Nn-1, X, Y, Z, W e R tem a mesma definição como na reivindicação 1, e Bn representa a base do enésimo nucleotídeo.
3. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, de acordo com a reivindicação 1, correspondente à fórmula:
caracterizado pelo fato de: n, y, N2,..., Nn, X, Y, Z, W e R tem a mesma definição como na reivindicação 1, e B1 representa a base do primeiro nucleotídeo.
4. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de a sequência nucleotídica (N1-N2-.-Nn-1-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (M1-M2-.- Mm-1-Mm) são específicas de um vírus, uma bactéria ou um gene responsável por uma doença ou relacionado a uma doença.
5. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a sequência nucleotídica (N1- N2-.-Nn-1-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (M1-M2-.-Mm-1-Mm) são selecionadas a partir de: sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 27, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 28, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 35 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 36 específicas do vírus da hepatite C (HCV), sequências com NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 16, NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 40, específicas de flavivírus, a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 18 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 41, específica dos vírus da dengue, ou a sequência de NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 19, específica do vírus da febre do Oeste do Nilo (WNV).
6. “OLIGONUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS COMPOSTOS DE FUNÇÕES TIÓIS”, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de a sequência nucleotídica (N1-N2-...-Nn-1-Nn) e, opcionalmente, a sequência nucleotídica (M1-M2-...- Mm-1-Mm) tem uma estrutura do tipo anômero alfa, anômero beta, linear, ou do tipo "caracol".
7. “SUBSTRATO ENXERTADO COM OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, com pelo menos um oligonucleotídeo modificado definido nas reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de tal substrato ser composto de pelo menos uma zona receptora revestida com uma substância que tolera o enxerto de tal oligonucleotídeo modificado.
8. “SUBSTRATO ENXERTADO COM OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de: - tal zona receptora é revestida com uma película de ouro ou de platina, e tal substrato seja de metal, preferencialmente de cobre ou titânio, ou - tal zona receptora é composta em sua superfície de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono-carbono tripla ou funções halo acetamídicas, preferencialmente funções de maleimida ou acrilamida, e tal substrato seja de plástico, preferencialmente de poliestireno.
9. “SUBSTRATO ENXERTADO COM OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de tal substrato não é planar, e é preferencialmente uma micropartícula ou uma nanopartícula.
10. “MÉTODO DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, onde o método para detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de detectar tal ácido nucleico alvo com, pelo menos, um sensor de detecção formado por um oligonucleotídeo modificado do tipo definido em uma das reivindicações de 1 a 6.
11. “MÉTODO DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: - obter pelo menos uma fonte de ácido nucleico de tal amostra biológica, - produzir um amplicon pela amplificação de tal ácido nucleico alvo a partir da fonte de ácido nucleico, e - detectar a hibridização de tal amplicon com pelo menos um sensor de detecção formado por um oligonucleotídeo modificado do tipo definido em uma das reivindicações de 1 a 6.
12. “MÉTODO DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, de acordo com a reivindicação 11, para determinar o genótipo e/ou o subtipo de um vírus presente em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de : - o amplicon é gerado pela amplificação de uma sequência nucleotídica alvo, correspondente à região genômica do vírus, contendo informações relacionadas ao genótipo e/ou subtipo viral, e - a detecção é realizada com um sensor específico do genótipo e/ou subtipo viral.
13. “MÉTODO DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO UTILIZANDO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o passo de produção do amplicon é realizado amplificando-se uma sequência nucleotídica alvo correspondente à região genômica do vírus contendo informações relativas ao genótipo e/ou subtipo viral, com uma mistura de primers (sequencias iniciadoras) de nucleotídeos, preferencialmente selecionada do par de sequência iniciadora: - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, quando o amplicon é gerado a partir de qualquer genótipo de HCV; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 10 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, quando o amplicon é gerado a partir de um HCV de genótipo 1a/1b; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 29 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9, quando o amplicon é gerado a partir de um HCV de genótipo 2; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 11, quando o amplicon é gerado a partir de um HCV de genótipo 3a; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 30, quando o amplicon é gerado a partir de um HCV de genótipo 4a/4b; - NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 20 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21 ou NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 22 e NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21 quando o amplicon é gerado a partir de um flavivírus.
14. “KIT DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO EM UMA AMOSTRA DE OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO”, caracterizado pelo fato de ser composto de: pelo menos um oligonucleotídeo modificado do tipo definido em uma das reivindicações de 1 a 6 e de pelo menos um substrato composto por pelo menos um zona receptora revestida com uma substância que tolera o enxerto de tal oligonucleotídeo modificado, sendo tal zona receptora preferencialmente revestida com ouro, com platina ou composta em sua superfície de pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação carbono- carbono tripla ou funções halo acetamídicas, preferencialmente funções de maleimida ou acrilamida, ou de pelo menos um substrato enxertado do tipo definido em uma das reivindicações de 7 a 9.
15. “USO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO PARA A DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS”, onde o oligonucleotídeo modificado é do tipo definido em uma das reivindicações de 1 a 6, e o substrato enxertado é do tipo definido em uma das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de detectar pelo menos um ácido nucleico alvo em uma amostra biológica.
16. “USO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO PARA A DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS”, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser utilizado para fins de diagnóstico, genotipagem ou sequenciamento de cepas virais, preferencialmente dos vírus da hepatite, ou de arbovírus, preferencialmente o Flaviviridae, o Togaviridae ou o Bunhyaviridae.
17. “USO OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO PARA A DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS”, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser utilizado para fins de diagnóstico, genotipagem ou sequenciamento de HCV, HBV, vírus da dengue ou vírus da febre do Oeste do Nilo.
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