ES2624993T3 - Oligonucleótidos modificados que comprenden funciones tiol y su uso para la detección de ácidos nucleicos - Google Patents

Oligonucleótidos modificados que comprenden funciones tiol y su uso para la detección de ácidos nucleicos Download PDF

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Myriam LEREAU
Jean-François CANTALOUBE
Jean-Jacques Vasseur
François MORVAN
Albert Meyer
Julie MAYEN
Carole Chaix
Carole FARRE
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Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Universite de Montpellier I
Francais du Sang Ets
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Abstract

Oligonucleótido modificado que corresponde a una de las fórmulas:**Fórmulas** o en las que: N1, ..., Nn representan independientemente entre sí, un nucleótido, n es un número entero que varía de 4 a 100, y es un número entero que varía de 2 a 12, X se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C12, aminoalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, Y se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C12, aminoalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, Z se selecciona entre los grupos alcoxi C1-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, NCO-alquilo C1-C12, CON-alquilo C1-C12, W se selecciona entre los grupos alcano tri-ilo C1-C12, los grupos arilo tri-ilo C6-C18 y los grupos aralcano tri-ilo C6-C18, y R es H o se selecciona entre los grupos acilo C1-C12, S-alquilo C1-C12, S-arilo C6-C12, S-2-piridina, S20 heteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C1-C12, S-cicloalquilo C3-C12, S-cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12. Bn representa la base del enésimo nucleótido, B1 representa la base del 1er nucleótido.

Description

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oligómero de los compuestos de la invención a partir de compuestos (Ia) y a partir de compuestos (Ib). La figura 3 representa un esquema que describe un procedimiento de síntesis de un compuesto (XIIc) oligonucleotídico injertado con un oligómero de (I) en su extremo 5'. La figura 4 representa un esquema que expone un procedimiento de síntesis de un compuesto (XIIIc) oligonucleotídico injertado con un oligómero de (I) en su extremo 3'. La figura 5 representa un histograma de la tasa de injerto de oligonucleótidos modificados en una superficie de oro. La figura 6 representa un esquema que expone la estabilidad del injerto de oligonucleótidos modificados en una superficie de oro en función del tiempo a 60 ºC. La figura 7 representa un esquema que expone la estabilidad del injerto de oligonucleótidos modificados en una superficie de oro en función del tiempo a 80 ºC. Las figuras 8 y 9 representan diagramas que esquematizan los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda tetratiol de tipo 3a. La figura 10 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda tetratiol de tipo 1a/1b. La figura 11 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con sondas de tipo 1a/1b que portan 1, 2, 4, 6 u 8 grupos tiol. La figura 12 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda de tipo 1a/1b monotiol con diferentes densidades de injerto. La figura 13 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda de tipo 1a/1b ditiol con diferentes densidades de injerto. La figura 14 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda de tipo 1a/1b tetratiol con diferentes densidades de injerto. La figura 15 representa los resultados de un ensayo de hibridación sonda/diana con una sonda tetratiol injertada en una superficie de oro. La figura 16a representa las reacciones entre el oligonucleótido modificado según la invención y la superficie injertada con grupos alquenilo o alquinilo activados. La figura 16b representa las reacciones entre el oligonucleótido modificado según la invención y la superficie injertada con grupos alquenilo o alquinilo con activación luminosa (λ = 265 nm). La figura 17 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda VHC tetratiol de tipo 1a/1b. La figura 18 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una mezcla de dos sondas VHC tetratiol de tipos 2a/2c y /2b. La figura 19 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda VHC tetratiol de tipo 3a. La figura 20 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda VHC tetratiol de tipo 4a/4d. La figura 21 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda tetratiol genérica para los flavivirus. La figura 22 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda tetratiol específica del serotipo 4 del dengue. La figura 23 representa un diagrama que esquematiza los resultados de los ensayos ELOSA con detección por fluorescencia, realizados con una sonda tetratiol genérica para el virus del Nilo Occidental.
Exposición de los modos de realización de la invención
La presente solicitud describe la preparación de compuestos con estructura fosforamidita, H-fosfonato o compuestos unidos a un soporte sólido que presenta una función tiol protegida. Estos compuestos tiol tienen por objeto introducirse en los oligonucleótidos para formar los oligonucleótidos modificados según la invención. Los oligonucleótidos modificados así obtenidos pueden presentar varias funciones tiol.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a oligonucleótidos modificados que pueden obtenerse por el procedimiento descrito anteriormente y que comprenden 2 a 12 funciones tiol. Otro objeto de la invención se refiere al uso de tales oligonucleótidos modificados para detectar al menos un ácido nucleico diana en una muestra biológica.
Compuesto tiol
Los compuestos tiol que tienen por objeto introducirse en los oligonucleótidos modificados de la presente invención corresponden a la siguiente fórmula (I):
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en la que:
T es un grupo seleccionado entre -O-P(OR1)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)J C(O)NH-,
o R1 se selecciona entre los grupos 2-cianoetilo, R'1R'2R'3SiCH2CH2, y Rʹ1 R'2, R'3, idénticos o diferentes, representan un grupo seleccionado entre alquilo lineal o ramificado que comprende 1 a 12 átomos de carbono y arilo C6-C12,
o R2 se selecciona en los grupos alquilo lineal o ramificado que comprenden 1 a 12 átomos de carbono, pirrolidina,
o J se selecciona entre un enlace sencillo, un grupo -CH 2-, -CH2CH2-, -CH2OCH2-, -CH2OPhOCH2-en el que Ph es un bencilo,
◦ representa un soporte sólido,
D es un grupo protector de alcoholes, W se selecciona entre el grupo alcano tri-ilo C1-C12, el grupo arilo tri-ilo C6-C18 y el grupo aralcano tri-ilo C6-C18, Z se selecciona entre los grupos alcoxi C1-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, NCO-alquilo C1-C12, CON-alquilo C1-C12, Y se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C12, aminoalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, X se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C12, aminoalquilo C1-C12, alcoxi C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12, R se selecciona entre los grupos acilo C1-C12, S-alquilo C1-C12, S-arilo C6-C12, S-2-piridina, S-heteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C1-C12, S-cicloalquilo C3-C12, S-cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C12.
En el sentido de la presente invención, por "alcano tri-ilo", se entiende los alcanos tri-ilo lineales, ramificados o cíclicos, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos alquilo. Entre los grupos arilo tri-ilo que pueden estar presentes en el compuesto según la invención, pueden mencionarse el benceno tri-ilo y el naftaleno tri-ilo. Entre los grupos aralcano, pueden mencionarse el 1,3,5-trimetilbenceno tri-ilo y el trimetilnaftaleno tri-ilo.
El compuesto (I) puede distinguirse en tres subcompuestos (Ia), (Ib) y (Ic) que corresponden a las fórmulas (Ia), (Ib) y (Ic) anteriores en las que los parámetros X, Y, Z , R, R1, R2 y D tienen la misma definición que la expuesta anteriormente para la fórmula (I):
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Preferentemente, R1 se selecciona entre los grupos 2-cianoetilo y R'1R'2R'3SiCH2CH2, y R'1, R'2, R'3 idénticos o diferentes que representan un grupo seleccionado entre los grupos alquilo lineal o ramificado que comprenden 1 a 6 átomos de carbono, fenilo; preferentemente R1 se selecciona entre los grupos 2-cianoetilo y R'1R'2R'3SiCH2CH2, y R'1, R'2, R'3 idénticos o diferentes que representan un grupo seleccionado entre los grupos alquilo lineal o ramificado que comprenden 1 a 3 átomos de carbono, fenilo; incluso más preferentemente R1 se selecciona entre los grupos 2cianoetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, 2-(trifenilsilil)etilo, 2-(difenilmetilsilil)etilo.
Preferentemente, R2 se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado que comprenden 1 a 6 átomos de carbono. Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr).
Preferentemente, el soporte sólido
imagen9se selecciona entre resinas, en particular entre las resinas a base de poliestireno, poliacrilamida, polietilenglicol, celulosa, polietileno, poliéster, látex, poliamida, polidimetilacrilamida, polímeros hidrófilos sintéticos o naturales, perlas de vidrio, geles de sílice.
Preferentemente, W se selecciona entre los grupos alcano tri-ilo C1-C6, un grupo arilo tri-ilo C6-C12, un grupo aralcano tri-ilo C6-C12, más particularmente entre los grupos CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexanos tri-ilo y bencenos tri-ilo.
Preferentemente, D se selecciona entre los grupos protectores de alcoholes que permiten una desprotección ortogonal con respecto a otros grupos del compuesto (I). Más particularmente, D se selecciona entre 4,4'dimetoxitritilo (DMTr), 9-fenilxanten-9-ilo (pixilo) o fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). El grupo protector pixilo se describe específicamente en el documento de Chattopadhyaya y Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978, 639-640. Otro grupo protector de alcoholes puede ser un grupo terc-butil-dimetilsililo, en este caso, será particularmente preferente un soporte de poliestireno.
Preferentemente, Z se selecciona entre los grupos aminoalquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C6, NCO-alquilo C1-C6, CON-alquilo C1-C6.
Preferentemente, Y se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C6, aminoalquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C6.
Preferentemente, X se selecciona entre los grupos alquilo lineal o ramificado C1-C6, aminoalquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, cicloalquilo C3-C6, cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C3-C6.
Preferentemente, R se selecciona entre los grupos acilo C1-C12, S-alquilo C1-C6, S-arilo C6, S-heteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C6, S-cicloalquilo C6, S-cicloheteroalquilo que contiene óxido o que contiene nitrógeno C6.
Según un modo de realización, los alquilos lineales o ramificados se seleccionan entre grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo.
Según un modo de realización, los aminoalquilos se seleccionan entre los grupos aminometilo, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo, aminopentilo, aminohexilo, aminoheptilo, aminooctilo, aminononilo, aminodecilo, aminoundecilo, aminododecilo, aminoisopropilo, aminoisobutilo, amino-terc-butilo que comprende uno o más átomos de nitrógeno.
Según un modo de realización, los alcoxi se seleccionan entre los grupos metoxi, etoxi, propiloxi, oxibutiloxi, pentiloxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi, deciloxi, undeciloxi, dodeciloxi, isopropiloxi, isobutiloxi, terc-butiloxi que comprenden uno o más átomos de oxígeno.
Según un modo de realización, los cicloalquilos se seleccionan entre los anillos, que comprenden opcionalmente una
o más insaturaciones, que comprenden 3 a 12 átomos de carbono, preferentemente 6 átomos de carbono.
Según un modo de realización, los cicloheteroalquilos se seleccionan entre anillos sustituidos con uno o más átomos de nitrógeno y/u oxígeno, que comprenden opcionalmente una o más insaturaciones y que comprenden 3 a 12 átomos de carbono, preferentemente 5 átomos de carbono y un átomo de nitrógeno u oxígeno.
Según un modo de realización, los NCO-alquilos y CON-alquilos son grupos en los que los alquilos pueden ser alquilos lineales o ramificados seleccionados entre los grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo.
Según un modo de realización, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y/o R1 es un grupo cianoetilo.
Según un modo de realización preferente, el compuesto tiol (Ia) es el compuesto (VI) que corresponde a la siguiente fórmula:
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en la que, n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente comprendido entre 1 y 6,
R, R1, R2 y D tienen la misma definición que anteriormente para (Ia). Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr), y R1 es un grupo cianoetilo. Preferentemente, R es un grupo acetilo. Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo. Según otro modo de realización, el compuesto tiol (Ia) es el compuesto (VII) que corresponde la siguiente fórmula:
imagen11
en la que, n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente comprendido entre 1 y 6, R, R1, R2 y D tienen la misma definición que anteriormente para (Ia). Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr), y R1 es un grupo cianoetilo.
20 Preferentemente, R es un grupo acetilo. Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo. Según un modo de realización, el compuesto tiol (Ic) es el compuesto (VIII) que corresponde a la siguiente fórmula:
imagen12
en la que,
n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6, imagen13
R y tienen la misma definición que anteriormente para (Ic).
Preferentemente, R es un grupo acetilo. Preferentemente, J es un grupo etilo. Preferentemente D es 4,4'dimetoxitritilo.
Según un modo de realización, el compuesto tiol (Ia) es el compuesto (IX) de la fórmula:
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en la que, n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6,
R, R1, R2 y D tienen la misma definición que anteriormente para (la). Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo. Preferentemente, R es un grupo acetilo. Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo. Según un modo de realización, el compuesto tiol (Ia) es el compuesto (X) de fórmula:
imagen15
en la que, n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6, R, R1, R 2 y D tienen la misma definición que anteriormente para (la). Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.
15 Preferentemente, R es un grupo acetilo.
Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.
Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.
Según un modo de realización, el compuesto tiol (Ia) es el compuesto (XI) de fórmula:
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en la que, n es un número entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente comprendido entre 1 y 6, R, R1, R2 y D tienen la misma definición que anteriormente para (Ia).
5 Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.
Preferentemente, R es un grupo acetilo.
Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.
Procedimiento de fabricación
El procedimiento de fabricación de los compuestos (Ia), (Ib) y (Ic) se representa en el esquema de la figura 1. 10 Los compuestos (Ia), (Ib) y (Ic) se obtienen a partir del mismo compuesto (II) que presenta la siguiente fórmula:
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en la que D, X, W, Y, Z y R tienen la misma definición que en el compuesto tiol (I). El compuesto de fórmula (Ia) puede obtenerse según la reacción representada en el siguiente esquema:
imagen18
15 o según la reacción representada en el siguiente esquema, preferentemente en presencia de sal de tetrazolida de diisopropilamina:
imagen19
El compuesto de fórmula (Ib) puede obtenerse según la reacción representada en el siguiente esquema:
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en la que Q y Q' representan, independientemente uno del otro, un grupo benceno sustituido o no.
5 La reacción precedente de obtención del compuesto (Ia) o (Ib) se efectúa a partir del compuesto (II), preferentemente en presencia de una base, por ejemplo diisopropiletilamina (DIEA), en un disolvente anhidro, tal como diclorometano anhidro.
El compuesto de fórmula (Ic) se obtiene asimismo a partir del compuesto (II) pero preferentemente según la etapa de reacción representada en el siguiente esquema:
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La reacción precedente de obtención del compuesto (Ic) se efectúa preferentemente en un disolvente anhidro, tal como piridina, en presencia de una base, tal como trietilamina.
Asimismo puede obtenerse el compuesto (Ic) según el siguiente esquema de reacción:
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El compuesto (II) de fórmula anterior, en la que los grupos X, W, Z, Y y R tienen la misma definición que en el compuesto (I), corresponde a un modo de realización.
El compuesto de fórmula (II) puede obtenerse a partir del compuesto (III) según la etapa de reacción descrita a continuación:
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en la que G es un halógeno, preferentemente bromo o yodo. La reacción que se ha descrito anteriormente se efectúa preferentemente en un disolvente anhidro, tal como tolueno anhidro y en presencia de un éter de corona. 10 El compuesto (III) puede obtenerse a partir del compuesto (IV) según la etapa de reacción descrita a continuación:
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en la que, G y G' son átomos de halógeno idénticos o diferentes, preferentemente G y G' son átomos de bromo o yodo,
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Después, el compuesto (Ic.1) reacciona con el compuesto (Ia) o (Ib) para dar lugar respectivamente al compuesto fosfitetriéster (XIVʹ)1 o diéster de H-fosfonato (XVʹ)1.
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Después, el compuesto (XIVʹ)1 se oxida preferentemente en presencia de diyodo, el diyodo se desplaza a continuación por agua que suministra el átomo de oxígeno del enlace fosfato triéster para dar lugar al compuesto fosfotriéster (XIV)1. Esta etapa de oxidación se efectúa después de cada etapa de acoplamiento entre un compuesto (XIV)i y un compuesto (Ia).
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10 Después, de la misma manera, el compuesto (XIV)1 reacciona con compuestos (k-1) (Ia) para dar lugar, después de oxidaciones (k-1), al compuesto (XIV)k:
imagen28
Preferentemente, el oligómero resultante de la oligomerización de 2 a 12 compuestos (I), en particular entre 2 y 8 compuestos (I), es decir el oligómero puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 compuestos (I). Preferentemente, el oligómero tiol que tiene por objeto injertarse en una superficie de oro comprende entre 3 y 8, ventajosamente entre 4 y 8 compuestos (I) y el oligómero tiol que tiene por objeto la conjugación con una superficie que comprende al
5 menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o funciones halogenoacetamida, preferentemente funciones maleimida o acrilamida comprende ventajosamente entre 2 y 6 compuestos (I).
Según un modo de realización, el oligómero está fabricado únicamente a partir de compuestos de fórmula (Ia) o de compuestos de fórmula (Ib). La oligomerización se efectúa por reacción entre la función alcohol desprotegida de un primer compuesto (I) y la función fosforamidita o H-fosfonato de un segundo compuesto (I).
10 Asimismo es posible prever la fabricación de un oligómero a partir de una mezcla de compuestos (Ia) y compuestos (Ib), este modo de realización presenta menos interés.
Preferentemente, el oligómero se fabrica utilizando la química de fosforamiditas, es decir por oligomerización de compuestos de tipo (Ia).
La oligomerización puede efectuarse en un soporte sólido o en solución. Preferentemente, la oligomerización se
15 efectúa en un soporte sólido. En efecto, la oligomerización en solución implica etapas de purificación por cromatografía, etapas no económicamente viables, en particular para las pequeñas cantidades requeridas en aplicaciones de diagnóstico.
El soporte sólido injertado con un oligómero de un compuesto (Ia) o un compuesto (Ib) corresponde a la fórmula (XVI)k a continuación:
20 (lc)-(I')k
(XVI)k
en la que:
k representa un número entero comprendido entre 1 y 11, (lc) tiene el mismo significado que anteriormente,
25 (lʹ) representa (lʹa) o (lʹb) con:
y
imagen29
El oligómero en un soporte sólido formado a partir de un compuesto (Ic) y de compuestos de fórmula (Ia) 30 corresponde a la siguiente fórmula (XIV)k:
imagen30
imagen31
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en la que,
D, R, X, Y, W, Z, R1 tienen la misma definición que para el compuesto (I) y R1 puede representar además H, n, y y N1, N2, ...Nn-1 tienen la misma definición que para el compuesto (XIIa), 5 Bn representa una base clásicamente utilizada en una cadena nucleotídica.
En el caso en el que la elongación del oligómero se efectúe con compuestos de tipo (Ib), el oligonucleótido modificado presenta una estructura similar a la del oligonucleótido modificado (XIIa.4) pero en la que R1 representa
H.
Un injerto posterior de compuestos nucleotídicos M1,M2, ... Mm está entonces disponible para proporcionar el 10 producto (XIIa) con p = 1. En estos casos, la elongación se efectúa igualmente en un soporte sólido.
Esta etapa de injerto se efectúa de manera clásica por procedimientos conocidos por el experto en la materia.
Según otro modo de realización, el oligonucleótido injertado corresponde a la siguiente fórmula (XIIIa):
(Ic)-(I’)y-1-N1-N2-...-Nn-1-Nn-(I’)y’-[M1-M2-...-Mm-1-Mm]p-(I’)y" (XIIIa)
en la que,
15 N1, ...Nn representan independientemente entre sí, un nucleótido, M1, ...Mm representan independientemente entre sí, un nucleótido, (lʹ) representa un compuesto de fórmula (lʹa) o (lʹb), n es un número entero que varía de 4 a 100, m es un número entero que varía de 4 a 100,
20 y es un número entero que varía de 2 a 12, y' es un número entero que varía de 0 a 12 , p vale 0 o 1 si y' es diferente de 0 y, si yʹ vale 0 entonces p vale 0, y'ʹ es un número entero que varía de 0 a 12 si p vale 1 y, si p vale 0 entonces yʹʹ vale 0, la suma de números enteros (y + yʹ + y') no es superior a 12.
25 Un esquema que representa un modo de síntesis del compuesto (XIIIc) se describe en la figura 4 utilizando un oligómero formado a partir de un compuesto tipo (Ic) en el que J es un grupo etilo, y compuestos de tipo (Ib).
La síntesis del compuesto de fórmula (XIIIc) comprende una primera etapa que consiste en la oligomerización del compuesto tiol según la invención de fórmula (I), cuyo procedimiento se ha descrito previamente para dar lugar al compuesto de fórmula (XIIIa.1):
30 (Ic)-(I’)y-1 (XIIIa.1)
en la que,
(lc) tiene la misma definición que anteriormente, (lʹ) representa un grupo de tipo (lʹa) o (I'b), en el que
imagen33
(Ic)-(I’b)y-1-N1-N2-...-Nn-1-Nn-(I’b)y’-[M1-M2-...-Mm-1-Mm]p-(I’b)y" (XIIIb)
en la que,
N1, ...Nn representan independientemente entre sí, un nucleótido, M1, ...Mm representan independientemente entre sí, un nucleótido, (lʹc) representa el compuesto obtenido a partir de (lc) por escisión del enlace éster con el soporte sólido, y tiene preferentemente la estructura
imagen34
(lʹb) representa un compuesto de fórmula como se ha definido anteriormente, n es un número entero que varía de 4 a 100,
10 m es un número entero que varía de 4 a 100, y es un número entero que varía de 2 a 12, y' es un número entero que varía de 0 a 12 , p vale 0 o 1 si y' es diferente a 0 y, si yʹ vale 0 entonces p vale 0, y'ʹ es un número entero que varía de 0 a 12 si p vale 1 y, si p vale 0 entonces yʹʹ vale 0,
15 la suma de números enteros (y + yʹ + y') no es superior a 12.
La extracción del soporte se efectúa por un procedimiento clásico conocido por el experto en la materia, preferentemente por un tratamiento del compuesto (XIIIa) con hidróxido de amonio (NH4OH).
Según la presente invención, en el caso en que p = 0, el oligonucleótido modificado corresponde a la fórmula desarrollada (XIIb):
20
imagen35
imagen36
en la que n, y, Ν1, ..., Nn-1 , X, Y, Z, W y R tienen la misma definición que anteriormente, y Bn representa la base del enésimo nucleótido.
Según la presente invención, en el caso en que p = 0, el oligonucleótido modificado corresponde a la fórmula 25 desarrollada (XIIIb):
imagen37
en la que n, y, N2, ..., Nn, X, Y, Z, W y R tienen la misma definición que anteriormente, y B1 representa la base del 1er nucleótido.
La presente invención describe los oligonucleótidos modificados (XIIc) y (XIIIc) obtenidos respectivamente a partir de 5 los compuestos (XIIa) y (XIIIa) por desprotección de la función tiol y escisión del enlace que une el compuesto al soporte sólido (Figuras 3 y 4, respectivamente).
En el caso en el que el oligonucleótido se modifica con uno o varios compuestos tiol de tipo (Ia), después de la desprotección de la función tiol y de la función fosforamidita (XIIa) del compuesto por un tratamiento conocido por el experto en la materia, se obtiene el compuesto de fórmula (XIIc):
10 -N1-N2-...-Nn-1-Nn-(I’ʹ)y-(M1-...-Mm-1-Mm)p-(I’ʹ)y’ (XIIc)
en la que,
N1, ...Nn representan independientemente entre sí, un nucleótido,
M1, ...Mm representan independientemente entre sí, un nucleótido,
imagen38
15 n es un número entero que varía de 4 a 100,
m es un número entero que oscila 4 a 100,
y es un número entero comprendido entro 2 a 12,
p representa 0 o 1,
y' es un número entero que varía de 0 a 12 si p vale 1 e, y' es igual a 0 si p vale 0, 20 la suma de números enteros (y + y') no es superior a 12.
o en la fórmula desarrollada en el caso en que p = 0:
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Tabla 1
Virus
Número de acceso GenBank de las secuencias
Dengue 1 (8 cepas)
FJ882517, FJ882552, EU482480, FJ639683, HM181967, AY726549, GU131762, GU131982
Dengue 2 (17 cepas)
GQ398257, HM582109, HM582110, HM582116, HM582117, AY744150, AY744149, AY744148, AY744147, EU056812, AF169686, AF169683, AF169687, AF169682, GU131896, DQ181803, EU073981
Dengue 3 (34 cepas)
GQ252678, GU131951, EU482566, GQ868574, GQ868617, FJ882577, GU131868, FJ024465, HM181974, HM181973, GQ199870, AY770511, GU370053, GQ199888, GU131939, GU131937, GU131934, HM631854, GU131905, GU189648, EU660409, DQ109373, DQ109368, DQ109310, AY676351, AY676350, FJ744740, FJ744730, DQ109400, DQ109348, GQ868593, AB214880, AY744677, EF629370
Dengue 4 (20 cepas)
AY618992, AY618990, AY858049, AY618993, GQ398256, AF289029, EU854301, EU073983, GU289913, AF326573, FJ882597, GQ199885, GQ199884, GQ199882, GQ868582, GQ868584, AY762085, AY618989, AY618988, EF457906
Nilo Occidental (15 cepas)
GQ851607, GQ851606, AY369441, AY490240, AY274504, GQ851602, GQ851603, DQ256376, DQ318019, EF429199, EF429200, JN858070, AY277251, FJ159131, FJ159129
Diseño de sondas oligonucleotídicas para el reconocimiento de secuencias del dengue y del Nilo occidental.
Los alineamientos y las comparaciones de secuencias efectuadas con software clustalW2 y Mega5 han permitido 5 definir 4 regiones, entre las cuales:
-2 se conservan entre todas las cepas de los virus del dengue y del Nilo Occidental, así como entre otros flavivirus, tales como el virus de la encefalitis japonesa, encefalitis transmitida por garrapatas, fiebre amarilla y el virus usutu (listado no exhaustivo) -1 se conserva entre los virus del dengue,
10 -1 se conserva entre el virus del Nilo Occidental.
Estas regiones se utilizaron para diseñar sondas según la presente invención, con el fin de permitir la detección genérica de flavivirus, o la detección específica del virus del dengue, de subtipo 4 del dengue o del virus del Nilo Occidental, en una muestra biológica.
Las sondas 1-3 presentadas en la tabla 2 a continuación permiten así detectar flavivirus de manera general
15 (incluyendo los flavivirus del dengue y del Nilo Occidental). La sonda 4 es específica para el virus del dengue, independientemente del serotipo. La sonda 5 es específica del serotipo 4 del virus del dengue. La sonda 6 es específica para virus del Nilo Occidental.
Tabla 2
Sonda
Secuencia Especificidad Tamaño SEQ ID
Sonda 1
5’-GCT CCC ARC CAC AT-3’ Genérica 14 meros SEQ ID NO: 16
Sonda 2
5’-AAC CAT CTR TCT TC-3’ Genérica 14 meros SEQ ID NO: 17
Sonda 3
5’-AGC CAC ATG WAC CA -3’ Genérica 14 meros SEQ ID NO: 40
Sonda 4
5’-CTT CYC CTT CYA CTC-3’ Dengue 15 meros SEQ ID NO: 18
Sonda 5
5’-CAC TCC ACT CCA TGA-3’ Dengue 4 15 meros SEQ ID NO: 41
Sonda 6
5’-CKC CTC CTG ART TCT-3’ Virus del Nilo Occidental 15 meros SEQ ID NO: 19
20 Diseño de dianas para ensayar la especificidad de reconocimiento de las sondas 1 a 6
Los amplicones que abarcan cada una de las 6 regiones identificadas se preparan efectuando una PCR simple, a partir de las secuencias mencionadas en la tabla 1, utilizando los cebadores y el protocolo descritos previamente por Scaramozzino y col. (Scaramozzino N. y col. Comparison of Flavivirus universal primer pairs and developement of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a
25 conserved region of the NS5 gene sequences. 2001. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927).
imagen57

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
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