KR20150021493A - 티올 관능기를 포함하는 개질된 올리고뉴클레오티드 및 이를 이용한 핵산의 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금 표면 또는 접합된 표면(grafted surface), 특히 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합(carbon-carbon double bond) 또는 탄소-탄소 삼중 결합(carbon-carbon triple bond) 또는 할로아세트아미드(haloacetamide functions) 관능기, 바람직하게 말레이미드(maleimide) 또는 아크릴아미드 관능기(acrylamide functions)를 포함하는 표면 위에 고정될 수 있는, 둘 이상의 티올 관능기(thiol functions)를 가지는 개질된 올리고뉴클레오티드(modified oligonucleotide)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개질된 올리고뉴클레오티드 및 생물학적 샘플(biological sample)로부터 증폭된 표적 핵산(target nucleic acid) 사이의 혼성화(hybridization)를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 병원체(pathogenic organism), 바람직하게 바이러스(virus)를 검출하고 유전자형 분석(genotyping)하거나 서열화(sequencing)하는 방법에 관한 것이다.

Description

티올 관능기를 포함하는 개질된 올리고뉴클레오티드 및 이를 이용한 핵산의 검출{MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES COMPRISING THIOL FUNCTIONS AND THE USE OF SAME FOR THE DETECTION OF NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 금 표면 또는 접합된 표면(grafted surface), 특히 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합(carbon-carbon double bond) 또는 탄소-탄소 삼중 결합(carbon-carbon triple bond) 또는 할로아세트아미드(haloacetamide functions) 관능기, 바람직하게 말레이미드(maleimide) 또는 아크릴아미드 관능기(acrylamide functions)를 포함하는 표면 위에 고정될 수 있는, 둘 이상의 티올 관능기(thiol functions)를 가지는 개질된 올리고뉴클레오티드(modified oligonucleotide)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개질된 올리고뉴클레오티드 및 생물학적 샘플(biological sample)로부터 증폭된 표적 핵산(target nucleic acid) 사이의 혼성화(hybridization)를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 병원체(pathogenic organism), 바람직하게 바이러스(virus)를 검출하고 유전자형 분석(genotyping)하거나 서열화(sequencing)하는 방법에 관한 것이다.
다른 뉴클레오티드의 연속 서열에 의해 부여된 물리화학적 안정성 및 특이성이 형성되기 때문에, 핵산은 인간, 동물성, 식물성, 세균성 또는 바이러스성 유기체의 특이성을 검출하고 식별하는 방법에서 매우 적합하게 이용되는 분자(molecules)이다.
이러한 특성은 종래의 분자 인식 요소(molecular recognition element) 및 트랜스듀서(transducer)로 이루어진 신뢰성있고 민감한 바이오센서(biosensor)의 개선을 유도한다. 분자 인식 요소, 소위 "프로브(probe)"는 일반적으로 트랜스듀서의 표면 위에 고정되며, "표적(target)" 핵산 분자에 대하여 높은 특이성 및 민감성을 나타낸다. 트랜스듀서의 역할은분자 인식 이벤트(molecular recognition event), 즉 프로브의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequences) 및 표적의 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화를 쉽게 측정될 수 있는 신호로 변환시키는 것이다. 따라서, 바이오센서는 프로브 및 표적에 포함된 두 개의 상호 보완적인 뉴클레오티드 서열의 결합 가능성을 이용하며, 두 서열의 혼성화가 이루어질 때 신호를 발생시킨다.
바이오센서는 프로브 및 표적 서열의 혼성화를 나타내기 위해 이용된 변환 방법에 의해 특징화된다.
바이오센서는 직접 변환으로 특별한 라벨링(labelling)을 이용하지 않고 서열의 혼성화를 검출할 수 있다. 바이오센서는 예를 들어 일정한 전위에서 전류의 변화를 검출하는 전류법(amperometry), 두 개의 전극 사이에서 전도성(conductivity)의 변화를 검출하는 전기전도도법(conductometry) 또는 일정한 전류에서 변위의 변화를 검출하는 전위차법(potentiometry)과 같은 전자 이동 반응(electron transfer reactions)에 의해 변환이 이루어지는 전기화학적 시스템(electrochemical systemss)을 포함한다. 또한, 바이오센서는 직접 변환으로 압전 기술(piezoelectric technologies)에 기반하며 예를 들어 주파수가 그 표면에 발생하는 변화에 반응하여 변화하는 수정 진동자(quartz crystal)의 특성을 나타내는 중량 측정 시스템(gravimetric systems)을 포함한다. 일반적으로 바이오센서는 직접 변환으로 빠르고 특수하나 제한된 민감도(10-9~10-12M)를 가진다. 직접 변환으로 바이오센서는 비용이 저렴하고 자유롭게 사용가능하며 휴대할 수 있는 진단 시스템(diagnostic system)을 생성하는데 매우 적합하다.
이러한 부분에 있어서, 간접 변환을 이용하는 바이오센서는 표적 핵산 서열의 라벨링을 필요로하며, 검출 전에 세척 단계의 수행을 필요로한다. 일반적으로 간접 변환을 이용하는 바이오센서는 레이저-유도 자극(laser-induced excitation)에 반응하여 하나 이상의 형광 마커(fluorescent marker)에 의해 광의 방사에 기반하는 공초점 현미경(confocal microscope)에 접합된 리더기(reader)에서 검출이 이루어지는 광학 시스템의 형상이다. 따라서, 간접 변환을 이용하는 바이오센서는 일반적으로 작동하는데 복잡하고 유자격자(qualified personnel)가 필요하나 검출에 대하여 고감도(10-12~10-15M)를 가지는 중장비(heavy instruments)를 필요로 한다. 간접 변환을 이용하는 바이오센서는 대부분 핵산에 기반하는 진단 분야에 이용되는 기술을 형성한다.
직접 또는 간접 변환을 이용하는 바이오센서는 동시에 수천 또는 수만의 핵산 서열의 혼성화를 검출할 수 있으며, 일반적으로 고체 지지체(solid supports) 위에 점(dots) 형상으로 고정된 프로브의 순차적 서열 형상으로 배치된다. 각각의 점은 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 약 106의 동일한 프로브를 포함하며, 한 점과 그 다음 점의 프로브의 뉴클레오티드 서열은 다르다.
"마이크로어레이(Microarrays)"는 약 20~50㎛의 크기를 가지는 1000~106의 점을 포함하는, 매우 복잡한 바이오센서이다. 마이크로어레이는 매우 복잡하고 값비싸며, 주로 DNA 서열화(sequencing), 유전병(genetic diseases)의 연구 및 다형성(polymorphism) 분석을 목적으로 한다. 특히, 이러한 바이오센서의 타입은 Affymetrix사, Illumina사 및 Agilent사에 의해 개선된다. 이 부분에서, "마이크로어레이"는 200㎛ 이상의 크기를 가지는 1000~10000개의 점을 포함하는, 매우 복잡한 바이오센서이다.
프로브는 공유 결합(covalent coupling) 또는 비공유 결합적으로 바이오센서 위에 고정될 수 있다. 프로브와 트랜스듀서의 공유 결합은 예를 들어 포토리소그래피(photolithography) 또는 관능화된 실란(functionalized silane)으로 코팅된 표면과 아민화된 올리고뉴클레오티드(aminated oligonucleotide)의 반응에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 프로브는 예를 들어 금 원자 및 황 원자 사이의 결합에 의해 금속 표면 위에 및 특히 금 표면 위에 고정될 수 있다. 그러나, Au-S 결합은 적당한 강도를 가지며, 단일 금-황 결합은 매우 안정적인 방식으로 금 표면 위에 프로브를 고정하는데 충분하지 않다. 사실상, 검출 방법은 Au-S 결합을 불안정하게 만드는 강한 기계적 응력(mechanical stresses)을 발생시키는 세척 단계를 포함한다.
또한, 프로브는 예를 들어 정전 흡착(electrostatic adsorption)에 의해 비공유 결합적으로 트랜스듀서에 결합될 수 있다. 예를 들어 비공유 결합은 프로브의 DNA의 음으로 하전된 포스페이트(negatively-charged phosphates) 및 γ-아미노프로필실란(γ-aminopropylsilane)으로 또는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)의 층으로 코팅된 트랜스듀서의 표면 사이의 상호작용으로 이루어진다. 프로브 및 트랜스듀서 사이의 비공유 결합 상호작용은 검출 과정 동안, 특히 혼성화의 검출이 혼성화 단계 후에 프로브의 뉴클레오티드 서열에 결합되지 않는 라벨링된 표적 뉴클레오티드 서열을 제거하는 것을 필요로하기 때문에 간접 변환에 의해 검출이 이루어질 때 수행되는 세척 단계에 약간의 저항성을 제공한다. 게다가, 비공유 결합은 혼성화 단계 또는 세척 단계의 엄격성(stringency)을 증가시키기 위해 작동 조건이 변하는 것을 허용하지 않아서, 더 특별하게 한다.
EP 0 523 978은 티올기로 치환된 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 이용될 수 있는 포스포라미다이트(phosphoramidite) 또는 포스포네이트 화합물(phosphonate compounds)을 개시한다. 그러나, 이러한 화합물은 단 한번 및 올리고뉴클레오티드의 5'-말단으로만 도입될 수 있다.
US 7,601,848은 적어도 두 개의 금-황 결합을 형성하기 위해 및 금 표면 위로 올리고뉴클레오티드를 안정화시키기 위해 올리고머(oligomers)에 포함되는 두 개의 황 원자를 포함하는 다관능 화합물(polyfunctional compound)을 개시한다. 이러한 화합물 중 몇몇은 포스포라미다이트 관능기(phosphoramidite function)를 포함한다. 그러나, US 7,601,848에서 이용된 화합물은 매우 값비싼 화합물로부터 제조되며, 올리고뉴클레오티드 위로 다관능 화합물의 결합은 이러한 화합물의 입체 장애(steric hindrance) 때문에 충분한 효율을 가지지 않는다. US 7,601,848에서, 결합제(binding agent)는 서로에 티올 화합물을 결합하기 위하여 및 올리고뉴클레오티드로 티올 화합물의 다중 도입(multiple introduction)을 이루기 위하여 필요하다.
본 발명의 목적은 금속(예를 들어, 금)으로 코팅된 표면 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 접합된 표면 둘 다를 포함하는 다양한 지지체 위로 단순하게 및 효율적으로 접합할 수 있는, 적어도 두 개의 티올 관능기를 가지는 올리고뉴클레오티드로부터 형성된 프로브를 개선하는 것이다. 본 발명의 프로브는 적어도 부분적으로 위에 언급된 단점을 극복하며, 검출 동안 이용된 변환 타입(직접 또는 간접)에 상관 없이 표적 뉴클레오티드 서열의 검출의 특이성 및 민감도를 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 현존하는 방법 보다 경제적이고 빠르며 민감하고 더 유연하며 자동화하기 쉬우며 병원체 또는 전염성 유기체(infectious organisms)의 또는 원인이 있거나 질병에 관련된 유전자(genes)의 핵산을 검출하고, 서열화하며 및/또는 유전자형 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 화학식(XIIb) 또는 화학식(XIIIb)에 대응하는 개질된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(XIIb) N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I'b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I'b)y'
(XIIIb) (Ic')-(I'b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I'b)y'-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I'b)y''
상기 화학식에서,
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(I'b)는 다음의 화학식의 화합물이며:
Figure pct00001
(Ic')는 다음의 화학식의 화합물이고:
Figure pct00002
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y은 2~12의 정수이고,
p는 0 또는 1이며,
p가 1일 때 y'는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y'는 0이고,
p가 1일 때 y''는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y''는 0이며,
정수 (y + y') 또는 (y + y' + y'')의 합계는 2~12이며,
X는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되며,
Y는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되고,
Z는 C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups), C1-C12 NCO-알킬기, C1-C12 CON-알킬기로부터 선택되며,
W는 C1-C12 알칸 트리일기(alkane triyl groups), C6-C18 아릴 트리일기(aryl triyl groups) 및 C6-C18 아르알칸 트리일기(aralkane triyl groups), 바람직하게 CH, CCH3, CCH2CH3, 사이클로헥산 트리일(cyclohexane triyl) 및 벤젠 트리일(benzene triyl)로부터 선택된 그룹에서 선택되고,
R은 H이거나, C1-C12 아실(acyl), C1-C12 S-알킬, C6-C12 S-아릴(aryl), S-2-피리딘(pyridine), 산소-함유 또는 질소-함유 C1-C12 S-헤테로알킬(heteroalkyl), C3-C12 S-사이클로알킬(cycloalkyl), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 S-사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되며,
R1은 2-시아노에틸(cyanoethyl)기 또는 R'1R'2R'3SiCH2CH2기로부터 선택되고, R'1R'2R'3SiCH2CH2에서 R'1, R'2 및 R'3는 동일하거나 다르며, 1~12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기 및 C6-C12 아릴기로부터 선택된다.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드는 다음의 화학식에 대응한다:
Figure pct00003
상기 화학식에서,
n, y, N1,…,Nn-1, X, Y, Z, W 및 R은 위와 동일한 의미를 가지며, Bn는 n-차(n-th) 뉴클레오티드의 염기(base)를 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 개질된 올리고뉴클레오티드는 다음의 화학식에 대응한다:
Figure pct00004
상기 화학식에서,
n, y, N2,…,Nn, X, Y, Z, W 및 R은 위와 동일한 의미를 가지며, B1는 1차(1st) 뉴클레오티드의 염기(base)를 나타낸다.
본 발명의 실시예에 따라, 위에 기술된대로 개질된 올리고뉴클레오티드는 바이러스, 박테리아 또는 원인이되거나 질병에 포함되는 유전자에 특이적인 뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따라, 뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 다음으로부터 선택된다:
- C형 간염 바이러스(hepatitis C virus; HCV)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 35 또는 서열번호(SEQ ID NO) 36;
- 플라비바이러스(flaviviruses)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17 또는 서열번호(SEQ ID NO) 40;
- 뎅기열 바이러스(dengue virus)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 18 또는 서열번호(SEQ ID NO) 41;
- 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus; WNV)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 19.
본 발명의 실시예에 따라, 뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 알파 아노머(alpha anomer), 베타 아노머(beta anomer), 선형 또는 스템-루프(stem-loop)형 ("스네일(snail)") 타입의 구조를 가진다.
본 발명은 위에 기술된대로 적어도 하나의 개질된 올리고뉴클레오티드가 접합된 기판(substrate)에 더 관한 것이며, 상기 기판은 상기 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅(grafting)을 허용하는 물질로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역(receiving zone)을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따라, 접합된 기판의 수용 영역은 금 또는 백금 필름으로 코팅되며, 기판은 금속, 바람직하게 구리이거나, 상기 수용 영역은 상기 수용 영역 위로 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합(알킬 관능기) 또는 탄소-탄소 삼중 결합(알키닐 관능기) 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하며, 상기 기판은 플라스틱, 바람직하게 폴리스티렌(polystyrene)이다. 본 발명의 실시예에 따라, 이용된 기판은 비전도성 폴리머(non-conductive polymers)이다. 본 발명의 다른 실시예에 따라, 본 발명을 수행하기 위해 이용된 기판은 전도성을 가진다.
본 발명의 실시예에 따라, 접합된 기판은 수평(부분 또는 전체적으로)이거나 곡선 형상이며, 바람직하게 구 형상(spherical shape)일 수 있다. 실시예에 따라, 기판은 예를 들어 마이크로입자(microparticles) 또는 나노 입자(nanoparticles)의 형태로 비평면(non-planar)이며, 바람직하게 자성(magnetic)을 띤다.
본 발명은 위에 기술된대로 개질된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브로 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법에 더 관한 것이다.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 검출 방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 근원 핵산(source nucleic acid)을 얻는 단계;
- 근원 핵산으로부터 표적 핵산의 증폭에 의해 증폭산물(amplicon)을 생성하는 단계; 및
- 위에 기술된대로 개질된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브와 상기 증폭 산물의 혼성화를 검출하는 단계.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 검출 방법은 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스의 유전자형(genotype) 및/또는 아형(subtype)을 측정할 수 있으며, 다음의 단계를 포함한다:
- 바이러스의 유전자형 및/또는 아형에 관련된 바이러스 함유 정보(virus bearing information)의 게놈 영역(genomic region)에 대응하는, 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭에 의해 증폭산물을 생성하는 단계; 및
- 바이러스의 유전자형 및/또는 아형에 특이적인 프로브와 위에 기술된대로 개질된 올리고 뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브와 상기 증폭산물의 혼성화를 검출하는 단계.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 검출 방법의 증폭산물을 생성하는 단계는 바람직하게 프라이머 쌍(primer pairs)으로부터 선택된 뉴클레오티드 프라이머(nucleotide primers)의 혼합물로 수행된다:
- 바이러스의 유전자형이 포함될지라도, 증폭산물이 HCV로부터 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 9. 이러한 프라이머 쌍은 일반적이며, HCV의 유전자형으로부터 시작해 401 nt의 "긴(long)" 증폭산물의 증폭을 허용한다;
- 서열번호(SEQ ID NO) 10 및 서열번호(SEQ ID NO) 9, 프라이머 쌍은 유전자형 1a/1b에 특이적인 191 nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용한다;
- 서열번호(SEQ ID NO) 29 및 서열번호(SEQ ID NO) 9, 프라이머 쌍은 유전자형 2에 특이적인 108 nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용한다;
- 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 11, 프라이머 쌍은 유전자형 3a에 특이적인 143 nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용한다;
- 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 30, 프라이머 쌍은 유전자형 4a/4d에 특이적인 175 nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용하며,
- 증폭산물이 플라비바이러브로부터 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 20 및 서열번호(SEQ ID NO) 21 및/또는 서열번호(SEQ ID NO) 22 및 서열번호(SEQ ID NO) 21.
본 발명은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 키트(kit)에 더 관한 것이며, 다음을 포함한다:
- 위에 기술된대로 적어도 하나의 개질된 올리고뉴클레오티드 및 상기 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅을 퍼용하는 물질로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역을 포함하는 적어도 하나의 기판; 및
- 위에 기술된대로 적어도 하나의 접합된 기판;을 포함하며,
바람직하게 상기 수용 영역은 금, 백금으로 코팅되거나 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함한다.
본 발명은 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17, 서열번호(SEQ ID NO) 18, 서열번호(SEQ ID NO) 19, 서열번호(SEQ ID NO) 35, 서열번호(SEQ ID NO) 36, 서열번호(SEQ ID NO) 40 및 서열번호(SEQ ID NO) 41로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 더 관한 것이다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드 또는 위에 기술된 개질된 올리고뉴클레오티드 또는 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 위에 기술된 접합된 기판의 이용에 더 관한 것이다.
본 발명의 실시예에 따라, 상기 이용은 바이러스 균주(viral strain), 바람직하게 HCV, 뎅기열 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스의 진단 또는 유전자형 분석을 허용한다.
본 발명의 이점은 다음에 있다:
- 티올 관능기를 함유하는 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드는 생산 비용이 저렴하고,
- 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드는 금 표면 또는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면 위에 고정될 수 있으며,
- 핵산을 검출하고 서열화하고 및/또는 유전자형 분석하는 방법에서, 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드의 이용은 수백개의 뉴클레오티드의 특정 표적 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있고,
- 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게 알려진 검출 방법에서 이용된 프로브 및/또는 유전자형 분석의 서열보다 짧으며, 검출에 대하여 우수한 민감도 및 특이성을 가진다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 예시로서 주어지고 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예의 설명을 해석하는데 명백해질 것이다.
도 1는 화합물(I)의 합성 방법을 설명하는 다이어그램(diagram)을 나타낸다.
도 2a 및 2b는 각각 화합물(Ia) 및 화합물(Ib)으로부터 시작하여 본 발명의 화합물의 올리고머의 합성 방법을 설명하는 다이어그램을 나타낸다.
도 3는 올리고뉴틀레오티드의 5'-말단에서 (I)의 올리고머가 접합된 올리고뉴클레오티드 화합물(XIIc)의 합성 방법을 설명하는 다이어그램을 나타낸다.
도 4는 올리고뉴틀레오티드의 3'-말단에서 (I)의 올리고머가 접합된 올리고뉴클레오티드 화합물(XIIc)의 합성 방법을 설명하는 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 금 표면 위로 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 정도의 히스토그램(histogram)을 나타낸다.
도 6는 60℃에서 시간의 함수로서 금 표면 위로 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 안정성을 표시하는 다이어그램을 나타낸다.
도 7는 80℃에서 시간의 함수로서 금 표면 위로 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 안정성을 표시하는 다이어그램을 나타낸다.
도 8 및 도 9는 타입 3a의 테트라티올 프로브(tetrathiol probe)로 수행되는 형광 검출(fluorescence detection)로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도(schematic diagram)를 나타낸다.
도 10는 타입 1a/1b의 테트라티올 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도(schematic diagram)를 나타낸다.
도 11는 1, 2, 4, 6 또는 8 티올기를 함유하는 타입 1a/1b로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 12는 다른 그라프팅 밀도에서 타입 1a/1b의 모노티올 프로브(monothiol probe)로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 13는 다른 그라프팅 밀도에서 타입 1a/1b의 디티올 프로브(dithiol probe)로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 14는 다른 그라프팅 밀도에서 타입 1a/1b의 테트라티올 프로브(tetrathiol probe)로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 15는 금 표면 위가 접합된 테트라티올 프로브로 프로브/표적 혼성화(probe/target hybridization)의 결과를 나타낸다.
도 16a는 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드 및 활성화된 알케닐기 또는 알키닐기가 접합된 표면 사이의 반응을 나타낸다.
도 16b는 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드 및 광(λ = 265mm)으로 활성화된 알케닐기 또는 알키닐기가 접합된 표면 사이의 반응을 나타낸다.
도 17는 타입 1a/1b의 테트라티올 HCV 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 18는 타입 2a/2c 및 /2b의 두 개의 테트라티올 HCV 프로브의 혼합물로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 19는 타입 3a의 테트라티올 HCV 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 20는 타입 4a/4d의 테트라티올 HCV 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 21는 플라비바이러스에 대하여 일반적인 테트라티올 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 22는 뎅기열의 항원형(serotype) 4에 특이적인 테트라티올 프로브로 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
도 23는 웨스트 나일 바이러스에 대하여 일반적인 테트라티올 프로브로 수행되는 수행되는 형광 검출로 ELOSA 테스트의 결과의 개요도를 나타낸다.
본 발명은 포스포라미다이트(phosphoramidite), H-포스포네이트 구조(H-phosphonate structure)의 화합물 또는 보호 티올 관능기(protected thiol function)를 가지는 고체 지지체에 접합된 화합물의 제조를 기술한다. 이러한 티올 화합물은 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위하여 올리고뉴클레오티드에 도입된다. 따라서, 얻어진 개질된 올리고뉴클레오티드는 복수의 티올 관능기를 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 아래에 기술된 방법에 의해 얻어질 수 있고 2~12개의 티올 관능기를 포함하는 개질된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 개질된 올리고뉴클레오티드의 이용에 더 관한것이다.
티올 화합물
본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드로 도입되는 티올 화합물은 다음의 화학식(I)에 대응한다:
Figure pct00005
(I)
상기 화학식(I)에서,
T는 -O-P(OR1)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)JC(O)NH-로부터 선택된 그룹이며,
- R1은 2-시아노에틸(cyanoethyl)기 및 R'1R'2R'3SiCH2CH2기로부터 선택되며, 동일하거나 다를 수 있는 R'1, R'2, R'3는 1~12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬 및 C6-C12 아릴로부터 선택된 그룹을 나타내고,
- R2는 1~12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기, 피롤리덴으로부터 선택되고,
- J는 단일 결합, -CH2-, -CH2CH2-, CH2OCH2-, Ph가 벤질(benzyl)인 -CH2OPhOCH2-로부터 선택되고,
- 고체 지지체를 나타내며,
D는 보호 알코올기이며,
W는 C1-C12 알칸 트리일기(alkane triyl groups), C6-C18 아릴 트리일기(aryl triyl groups) 및 C6-C18 아르알칸 트리일기(aralkane triyl groups)로부터 선택되고,
Z는 C1-C12 알콕시기, 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기, C1-C12 NCO-알킬기, C1-C12 CON-알킬기로부터 선택되며,
Y는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되고,
X는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되며,
R은 C1-C12 아실(acyl), C1-C12 S-알킬, C6-C12 S-아릴(aryl), S-2-피리딘(pyridine), 산소-함유 또는 질소-함유 C1-C12 S-헤테로알킬(heteroalkyl), C3-C12 S-사이클로알킬(cycloalkyl), 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 S-사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택된다.
본 발명의 의미 내에서, "알칸 트리일(alkane triyl)"은 선형, 분지형 또는 고리형 알칸 트리일(cyclic alkane triyls)이며, 선택적으로 하나 이상의 알킬기로 치환된다. 본 발명에 따른 화합물에 존재할 수 있는 아릴 트리일 중에서, 벤젠 트리일(benzene triyl) 및 나프탈렌 트리일(naphthalene triyl)이 언급될 수 있다. 아르알칸기 중에서, 1,3,5-트리메틸벤젠 트리일(1,3,5-trimethylbenzene triyl) 및 트리메틸나프탈렌 트리일(trimethylnaphthalene triyl)이 언급될 수 있다.
화합물(I)은 다음의 화학식 (Ia), (Ib) 및 (Ic)에 대응하는 서브-화합물(sub-compounds) (Ia), (Ib) 및 (Ic)으로 나뉠 수 있다.
Figure pct00006
(Ia)
Figure pct00007
(Ib)
Figure pct00008
(Ic)
바람직하게, R'1, R'2, R'3은 2-시아노에틸(2-cyanoethyl)기 및 R'1R'2R'3SiCH2CH2기로부터 선택되며, 동일하거나 다를 수 있는 는 1~6개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기 및 페닐로부터 선택된 그룹을 나타내고, 바람직하게 R1은 2-시아노에틸기 및 R'1R'2R'3SiCH2CH2기로부터 선택되고, 동일하거나 다를 수 있는 R'1, R'2, R'3는 1~3개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기 및 페닐로부터 선택된 그룹을 나타내고, 더 바람직하게 R1은 2-시아노에틸기, 2-(트리메틸실릴)에틸(2-(trimethylsilyl)ethyl), 2-(트리페닐실릴)에틸(2-(triphenylsilyl)ethyl), 2-(디페닐메틸실릴)에틸기(2-(diphenylmethylsilyl)ethyl groups)로부터 선택된다.
바람직하게, R2는 1~6개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬기로부터 선택된다. 바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이다.
바람직하게, 고체 지지체 □는 레진(resins), 특히 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 셀룰로오스(cellulose), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에스테르(polyester), 라텍스(latex), 폴리아미드(polyamide), 폴리디메틸아크릴아미드(polydimethylacrylamide), 합성 또는 천연 하이드로필릭 폴리머(synthetic or natural hydrophilic polymers), 유리 비드(glass beads), 실리카 겔(silica gels)에 기반한 레진으로부터 선택된다.
바람직하게, W는 C1-C6 알칸 트리일기(alkane triyl groups), C6-C12 아릴 트리일기(aryl triyl group), a C6-C12 아르알칸 트리일기(aralkane triyl group), 특히 CH, CCH3, CCH2CH3, 사이클로헥산 트리일(cyclohexane triyl)기 및 벤젠 트리일기(benzene triyl groups)로부터 선택된다.
바람직하게, D는 화합물(I)의 다른 그룹에 대하여 직교 탈보호(orthogonal deprotection)를 허용하는 보호 알코올기(protective groups of the alcohols)로부터 선택된다. 더 바람직하게, D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl; DMTr), 9-페닐크산텐-9-일(9-phenylxanthen-9-yl; 픽실(pixyl)) 또는 플루오레닐메톡시카보닐(fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)로부터 선택된다. 픽실(pixyl) 보호기는 특히 문서 Chattopadhyaya 및 Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978, 639-640에서 설명된다. 알코올의 다른 가능한 보호기는 터트-부틸-디메틸실릴기(tert-butyl-dimethylsilyl group)이며, 이 경우, 폴리스티렌 지지체가 특히 바람직하다.
바람직하게, Z는 C1-C6 아미노알킬(aminoalkyl), C1-C6 알콕시(alkoxy), 산소-함유 또는 질소 함유 C3-C6 사이클로헤테로알킬, C1-C6 NCO-알킬, C1-C6 CON-알킬기로부터 선택된다.
바람직하게, Y는 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬기, C1-C6 아미노알킬, C1-C6알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C6 사이클로헤테로알킬기로부터 선택된다.
바람직하게, X는 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬기, C1-C6 아미노알킬, C1-C6알콕시, C3-C6 사이클로알킬, 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C6 사이클로헤테로알킬기로부터 선택된다.
바람직하게, R는 C1-C12 아실, C1-C6 S-알킬, C6 S-아릴, 산소-함유 또는 질소-함유 C6 S-헤테로알킬, C6 S-사이클로알킬, 산소-함유 또는 질소-함유 C6 S-사이클로헤테로알킬기로부터 선택된다.
실시예에 따라, 선형 또는 분지형 알킬은 메틸(methyl)기, 에틸(ethyl)기, 프로필(propyl), 부틸(butyl)기, 페틸(pentyl)기, 헥실(hexyl)기, 헵틸(heptyl)기, 옥틸(octyl)기, 노닐(nonyl)기, 데실(decyl)기, 운데실(undecyl)기, 도데실(dodecyl)기, 이소프로필(isopropyl)기, 이소부틸(isobutyl)기, 터트-부틸기(tert-butyl groups)로부터 선택된다.
실시예에 따라, 아미노알킬은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 아미노메틸(aminomethyl)기, 아미노에틸(aminoethyl)기, 아미노프로필(aminopropyl)기, 아미노부틸(aminobutyl)기, 아미노페틸(aminopentyl)기, 아미노헥실(aminohexyl)기, 아미노헵틸(aminoheptyl)기, 아미노옥틸(aminooctyl)기, 아미노노닐(aminononyl)기, 아미노데실(aminodecyl)기, 아미노운데실(aminoundecyl)기, 아미노도데실(aminododecyl)기, 아미노이소프로필(aminoisopropyl)기, 아미노이소부틸(aminoisobutyl)기, 아미노-터트-부틸기(amino-tert-butyl groups)로부터 선택된다.
실시예에 따라, 알콕시는 하나 이상의 산소 원자를 포함하는 메톡시(methoxy)기, 에톡시(ethoxy)기, 프로필록시(propyloxy)기, 옥시부틸록시(oxybutyloxy)기, 펜틸록시(pentyloxy)기, 헥실록시(hexyloxy)기, 헵틸록시(heptyloxy)기, 옥틸록시(octyloxy)기, 노닐록시(nonyloxy)기, 데실록시(decyloxy)기, 운데실록시(undecyloxy)기, 도데실록시(dodecyloxy)기, 이소프로필록시(isopropyloxy)기, 이소부틸록시(isobutyloxy)기, 터트-부틸록시기(tert-butyloxy groups)로부터 선택된다.
실시예에 따라, 사이클로알킬은 고리(rings), 선택적으로 하나 이상의 불포화물(unsaturations)을 포함하며, 3~12개의 탄소 원자, 바람직하게 6개의 탄소 원자를 포함하는 고리(rings)으로부터 선택된다.
실시예에 따라, 사이클로헤테로알킬은 하나 이상의 질소 및/또는 산소 원자로 치환된 고리(rings), 선택적으로 하나 이상의 불포화물을 포함하며 3~12개의 탄소 원자, 바람직하게 5개의 탄소 원자 및 하나의 질소 또는 산소 원자를 포함하는 고리로부터 선택된다.
실시예에 따라, NCO-알킬(NCO-alkyls) 및 CON-알킬(CON-alkyls)은 알킬이 메틸(methyl)기, 에틸(ethyl)기, 프로필(propyl), 부틸(butyl)기, 페틸(pentyl)기, 헥실(hexyl)기, 헵틸(heptyl)기, 옥틸(octyl)기, 노닐(nonyl)기, 데실(decyl)기, 운데실(undecyl)기, 도데실(dodecyl)기, 이소프로필(isopropyl)기, 이소부틸(isobutyl)기, 터트-부틸기(tert-butyl groups)로부터 선택된 선형 또는 분지형 알킬일 수 있는 그룹이다.
실시예에 따라, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 및/또는 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직한 실시예에 따라, 티올 화합물(Ia)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(VI)이다:
Figure pct00009
(VI)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R, R1, R2 및 D는 상기 (Ia)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
다른 실시예에 따라, 티올 화합물(Ia)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(VII)이다:
Figure pct00010
(VII)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R, R1, R2 및 D는 상기 (Ia)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
실시예에 따라, 티올 화합물(Ic)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(VIII)이다:
Figure pct00011
(VIII)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R 및 □는 상기 (Ic)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게, J는 에틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
실시예에 따라, 티올 화합물(Ia)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(IX)이다:
Figure pct00012
(IX)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R, R1, R2 및 D는 상기 (Ia)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
실시예에 따라, 티올 화합물(Ia)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(X)이다:
Figure pct00013
(X)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R, R1, R2 및 D는 상기 (Ia)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
실시예에 따라, 티올 화합물(Ia)은 다음의 화학식에 대응하는 화합물(XI)이다:
Figure pct00014
(XI)
상기 화학식에서,
n은 1~12, 바람직하게 1~6의 정수이고,
R, R1, R2 및 D는 상기 (Ia)와 동일한 정의를 가진다.
바람직하게, R2는 이소프로필기(isopropyl group; iPr)이고 R1는 시아노에틸기(cyanoethyl group)이다.
바람직하게, R은 아세틸기이다.
바람직하게 D는 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl)이다.
제조 과정
화합물 (Ia), (Ib) 및 (Ic)의 제조 과정은 도 1의 다이어그램에 나타낸다.
화합물 (Ia), (Ib) 및 (Ic)은 다음의 화학식을 가지는 동일한 화합물(II)로부터 얻어진다:
Figure pct00015
(II)
상기 화학식에서,
D, X, W, Y, Z 및 R은 티올 화합물(I)에서와 같이 동일한 의미를 가진다.
화학식(Ia)의 화합물은 다음의 다이어그램에 나타낸 반응에 의해 얻어질 수 있다:
Figure pct00016
또는 바람직하게 디이소프로필아민 테트라졸리드(diisopropylamine tetrazolide)의 염이 존재하는, 다음의 다이어그램에 나타낸 반응에 의해 얻어질 수 있다:
Figure pct00017
화학식(Ib)의 화합물은 다음의 다이어그램에 나타낸 반응에 의해 얻어질 수 있다:
Figure pct00018
상기 화학식에서,
Q 및 Q'는 서로 독립적으로, 치환되(substituted)거나 비치환된 벤젠기(unsubstituted benzene group)를 나타낸다.
화합물 (Ia) 및 (Ib)를 얻기 위한 이전의 반응은 바람직하게 염기가 존재하는 화합물(II), 예를 들어, 무수 디클로로메탄(anhydrous dichloromethane)과 같은 무수 용매(anhydrous solvent)에서 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine; DIEA)로부터 시작하여 이루어진다.
또한, 화학식 (Ic)의 화합물은 바람직하게 다음의 다이어그램에 나타낸 반응 단계에 따라 화합물 (II)로부터 얻어진다:
Figure pct00019
바람직하게 화합물 (Ic)를 얻기 위한 이전의 반응은 트리에틸아민(triethylamine)과 같은 염기가 존재하는, 피리딘(pyridine)과 같은 무수 용매에서 이루어진다.
또한, 다음의 반응 다이어그램에 따라 화합물 (Ic)가 얻어질 수 있다:
Figure pct00020
상기 화학식의 화합물(II)에서, X, W, Z, Y 및 R 그룹은 한 실시예에 대응하는 화합물 (I)에서와 같은 동일한 의미를 가진다.
화학식 (II)의 화합물은 아래에 기술된 반응 단계에 따라 화합물 (III)로부터 얻어질 수 있다:
Figure pct00021
상기 화학식에서, G는 할로겐(halogen), 바람직하게 브롬(bromine) 또는 요오드(iodine)이다.
바람직하게, 아래에 기술된 반응은 무수 톨루엔(anhydrous toluene)과 같은 무수 용매에서 및 크라운 에테르(crown ether)가 존재하여 수행된다.
화합물(III)은 아래에 기술된 반응 단계에 따라 화합물(IV)로부터 얻어질 수 있다:
Figure pct00022
상기 화학식에서,
G 및 G'는 동일하거나 다를 수 있는 할로겐 원자이며, 바람직하게 브롬 또는 요오드 원자이다.
Z'는 C1-C12 아미노알킬(aminoalkyl)기, C1-C12 알콕시(alkoxy)기, 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬(cycloheteroalkyl)기, C1-C12 NCO-알킬기, C1-C12 CON-알킬기이며,
Z''는 C1-C12 선형 또는 분지형 알킬기, C1-C12 아미노알킬기, C1-C12 알콕시기, C3-C12 사이클로알킬기, 산소-함유 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기, C1-C12 NCO-알킬기, C1-C12 CON-알킬기이고,
디할로겐화 화합물(dihalogenated compound) G-Z''-G'는 화합물(III)의 Z-G 그룹의 형성을 유도하도록 화합물(IV)의 Z'그룹과 반응한다.
바람직하게, 화합물(III)를 얻는 단계는 NaH와 같은 알칼리 하이이드라드(alkali hydride)의 존재하에 이루어진다.
화합물(IV)은 다음의 반응 단계에 따라 알코올 관능기의 보호에 의해 상용 화합물 (V)로부터 얻어질 수 있다:
Figure pct00023
알코올 관능기의 보호 단계는 D의 선택에 의존하여 기술의 숙련자에게 잘 알려진 조건 하에 수행된다.
실시예에 따라, 화합물(IV)은 알코올 관능기를 보호하기 위하여 바람직하게 피리딘(pyridine)과 같은 용매에서 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(DMTr-Cl)과 반응하여 화합물(V)로부터 얻어진다.
다른 실시예에 따라, 화합물(IV)은 문서 Chattopadhyaya 및 Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978, 639-640에 기술된 조건 하에 9-페닐크산텐-9-일 클로라이드(9-phenylxanthen-9-yl chloride; pixyl-Cl)에서 시작하여 화합물(V)로부터 얻어진다.
다른 실시예에 따라, 화합물(IV)은 기술의 숙련자에게 잘 알려진 조건 하에 플루오레닐메톡시카보닐 클로라이드(fluorenylmethoxycarbonyl chloride; Fmoc-Cl)와 반응하여 화합물(V)로부터 얻어진다.
위의 화학식(II)~(V)에서, X, Y, W, Z, D, R, R1, R2는 위에 주어진 화학식(I)의 의미와 동일한 의미를 가진다.
바람직하게, 개시 화합물(I)은 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에탄(1,1,1-tris(hydroxymethyl)ethane) 또는 2,2-비스(하이드록시메틸)프로피온산(2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid) 또는 1,3,5-트리스(하이드록시에톡시)벤젠(1,3,5-tris(hydroxyethoxy)benzene) 또는 1,3,5-트리스(하이드록시메틸)사이클로헥산(1,3,5-tris(hydroxymethyl)cyclohexane) 또는 2-아미노-1.3-프로판디올(2-amino-1,3-propanediol)이다.
티올 화합물의 올리고머
올리고머는 위에 설명된 화학식(I)의 티올 화합물로부터 형성될 수 있다. 이러한 올리고머의 합성 방법은 화학식(Ia)의 화합물의 올리고머화를 도 2a의 다이어그램에 기술하며, 화학식(Ib)의 화합물의 올리고머화를 도 2b의 다이어그램에 기술한다.
제 1단계에서, 화합물(Ic)의 알코올 관능기는 화합물(Ic.1)을 유도하기 위하여 탈보호화된다. 탈보호 단계는 바람직하게 그룹 DMTr 및 픽실(Pixyl)에 대한 디클로로아세트산 또는 트리클로로아세트산 및 Fmoc 그룹에 대한 피페리딘(piperidine)이 존재하여 기술의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행된다.
Figure pct00024
이 때, 화합물(Ic.1)은 화합물 포스파이트 트리에스테르(phosphite triester) (XIV')1 또는 H-포스포네이트 디에스테르(H-phosphonate diester) (XV')1를 각각 유도하는 화합물 (Ia) 또는 (Ib)와 반응한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
이 때, 화합물 (XIV')1은 바람직하게 디아이오딘(diiodine)이 존재하여 산화되며, 그 후 디아이오딘은 포스포트리에스테르 화합물 (XIV)1을 유도하는 포스페이트 트리에스테르 결합의 산호 원자를 공급하는 물에 의해 치환된다. 산화 단계는 화합물(XIV)i 및 화합물(Ia) 사이에서 각각의 결합 단계 후 수행된다.
그 후, 동일한 방식으로, 화합물 (XIV)1은 (k-1) 산화 후 화합물 (XIV)k을 유도하는 (k-1) 화합물(Ia)와 반응한다:
Figure pct00027
및 화합물 (XV')1은 화합물 (XV')k을 유도하는, (k-1) 화합물 (Ib)와 반응하는 (XV'')1을 생성하기 위하여 알코올 관능기로 탈보호화된다:
Figure pct00028
Figure pct00029
그 후, 화합물 (XV')k은 바람직하게 포스포디에스테르 화합물 (XV)k을 유도하는 디아이오딘 및 물이 존재하여 산화된다.
Figure pct00030
마지막으로, 선택적인 마지막 단계는 동일한 화합물 (I)k을 유도하는 화합물 (XIV)k 또는 (XV)k를 탈보호하는 것이다.
Figure pct00031
(I)k
바람직하게, 올리고머는 2~12개의 화합물(I), 바람직하게 2~8개의 화합물(I)의 올리고머화로 발생하며, 즉 올리고머는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 화합물(I)을 포함한다. 바람직하게, 금 표면 위에 접합된 티올 올리고머는 3~8개, 바람직하게 4~8개의 화합물(I)을 포함하며, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면과 접합하는 티올 올리고머는 2~6개의 화합물(I)을 포함한다.
실시예에 따라, 올리고머는 화학식(Ia)의 화합물로부터만 또는 화학식(Ib)의 화합물로부터만 생성된다. 올리고머화는 제 1 화합물(I)의 탈보호화된 알코올 관능기 및 제 2 화합물(I)의 포스포라미다이트(phosphoramidite) 또는 H-포스포네이트(H-phosphonate) 관능기 사이의 반응에 의해 이루어진다.
화합물(Ia) 및 화합물(Ib)의 혼합물로부터 시작하여 올리고머의 제조를 예상할 수 있으나, 이러한 실시예에 대한 관심은 적다.
바람직하게, 올리고머는 포스포라미다이트 화합 반응(phosphoramidite chemistry), 즉 타입(Ia)의 화합물의 올리고머화에 의해 제조된다.
올리고머화는 고체 지지체 위에서 또는 용액에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 올리고머화는 고체 지지체 위에서 수행된다. 사실상, 용액에서의 올리고머화는 크로마토그래피(chromatography)에 의한 정제 단계를 포함하며, 단계는 특히 진단적 적용에 필요한 적은 양으로 경제적으로 실행될 수 없다.
화합물(Ia) 또는 화합물(Ib)의 올리고머가 접합된 고체 지지체는 다음의 화학식 (XVI)k에 대응한다:
Figure pct00032
(XVI)k
상기 화학식에서,
k는 1~11의 정수를 나타내며,
(Ic)는 위와 동일한 의미를 가지며,
(I')는 (I'a) 또는 (I'b)를 나타내며, (I'a) 및 (I'b)은 다음과 같다:
Figure pct00033
및
Figure pct00034
.
화합물(IC) 및 화학식(Ia)의 화합물로부터 형성된 고체 지지체 위의 올리고머는 다음의 화학식 (XIV)k에 대응한다:
Figure pct00035
(XIV)k
상기 화학식에서,
D, X, Y, W, Z, J, R 및 R1는 위와 동일한 의미를 가지며, 게다가 R은 H를 나타낼 수 있으며; k는 1~11의 정수이다.
화합물(IC) 및 화학식(Ib)의 화합물로부터 형성된 고체 지지체 위의 올리고머는 다음의 화학식 (XV)k에 대응한다:
Figure pct00036
(XV)k
상기 화학식에서, D, X, Y, W, Z, J 및 R는 위와 동일한 의미를 가지며, 게가다 R은 H를 나타낼 수 있고; k는 1~11의 정수이다.
올리고머가 화합물(Ic) 및 화합물(Ib)로부터 시작하여 고체 지지체 위에 형성될 때의 경우, 얻어진 (XV)k 화합물은 화합물 (XIV)k와 동일한 화학식에 대응하나, R1은 H-포스포네이트 디에스테르 결합(H-phosphonate diester bonds)의 산화 후 수소 원자이다.
올리고마화 반응의 말단에서, 종래의 방법에 의한 티올 관능기의 탈보호화가 예상될 수 있고, 이 때 R은 H를 나타낸다.
개질된 올리고뉴클레오티드
본 발명의 주제는 위에 기술된대로 적어도 10개의 뉴클레오티드 및 적어도 두 개의 티올 화합물(I)를 포함하는 개질된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 출원에서, 용어 올리고뉴클레오티드는 4~100개의 뉴클레오티드로 이루어진 사슬을 나타낸다.
본 발명에 따른 티올 화합물은 올리고뉴클레오티드의 사슬의 위치 3' 또는 위치 5'에서 접합된다.
개질된 올리고뉴클레오티드의 제조 방법은 적어도 다음의 단계를 포함한다:
- 5'-티올 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드로 화합물(I)을 그라프팅(grafting)하는 단계; 또는
- 3'-티올 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 화합물(I)의 올리고머로 뉴클레오티드를 그라프팅하는 단계.
실시예에 따라, 접합된 올리고뉴클레오티드는 다음의 화학식(XIIa)에 대응한다:
Figure pct00037
상기 화학식에서,
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(I')는 화학식(I'a) 또는 (I'b)의 화합물을 나타내며,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
p는 0 또는 1이며,
p가 1일 때 y'는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y'는 0이고,
정수 (y + y')의 합은 12 보다 적으며,
□는 고체 지지체이다.
개질된 올리고뉴클레오티드(XIIa)는 올리고뉴클레오티드 N의 위치 5'에서 또는 뉴클레오티드 사슬에서 둘 이상의 티올 화합물을 가진다. 개질된 올리고뉴클레오티드(XIIa)는 올리고뉴클레오티드의 위치 5'에서 (I)로부터 얻어진 올리고머의 신장(elongation)에 따라 화합물(I)을 그라프팅하여 얻어진다. 그 후, p = 1인 경우, 뉴클레오티드 사슬의 신장은 계속된다. 그 후, 동일한 방식으로, 올리고뉴클레오티드 M의 위치 5'에서 하나 이상의 추가 화합물(I)의 그라프팅이 예상될 수 있다.
화합물(XIIa)을 얻기 위한 다이어그램은 도 3에 기술되며, 다이어그램에서 티올 화합물은 타입(Ia)이며, p는 0이다. 화합물(XIIa)의 제조에서 첫번째 3 단계는 올리고뉴클레오티드의 합성을 허용한다. 올리고뉴클레오티드는 기술의 숙련자에게 잘 알려진 종래의 방법에 의해 고체 지지체 위에서 합성된다. 첫번째 단계에서, 제 1 뉴클레오티드는 고체 지지체 위로 접합되며, 그 후 다른 뉴클레오티드는 기술의 숙련자에게 잘 알려진 합성 방법에 의해 접합된다. 다음의 화합물이 얻어진다:
Figure pct00038
(XIIa.1)
그 후, 다른 뉴클레오티드는 화학식(XIIa.2)의 화합물을 유도하는 동일한 방법에 의해 접합된다.
그 다음 단계에서, 위에 기술된대로 타입(Ia)의 티올 화합물은 화합물(XIIa.3)을 유도하는 올리고뉴클레오티드(XIIa.2)의 위치 5'에서 접합된다:
Figure pct00039
(XIIa.3)
이 단계에서, 그라프팅은 화합물((XIIa.2)의 말단 뉴클레오티드(terminal nucleotide)의 위치 5'에서 알코올 관능기와 화합물(Ia)의 포스포라미다이트 관능기의 반응으로 종래적으로 이루어진다.
도 3의 다이어그램에서, 합성 예는 타입(Ia)의 티올 화합물의 올리고머화로 기술된다; 유사한 합성 방법은 타입(Ib)의 티올 화합물로 개질된 올리고뉴클레오티드의 합성을 위해 이용된다.
그 후, 이전, 특히 도 2a 및 도 2b에 기술된대로 올리고머화는 화학식의 화합물(XIIa.4) 를 유도하는, 하나 이상의 화합물 (Ia) 또는 (Ib)과 반응하여 위의 화합물(XIIa.3)로부터 시작하여 이루어진다:
Figure pct00040
또는 구조적식(p = 0인 경우)으로 나타낸다:
Figure pct00041
(XIIa.4)
상기 화학식에서,
D, R, X, Y, W, Z, R1는 화합물(I)에서와 같은 동일한 의미를 가지며, R1은 또한 H를 나타내고,
n, y 및 N1, N2,…Nn-1는 화합물(XIIa)에서와 같은 동일한 의미를 가지며,
Bn은 뉴클레오티드 사슬에서 종래적으로 이용된 염기이다.
올리고머의 신장이 타입(Ib)의 화합물로 이루어지는 경우, 개질된 올리고뉴클레오티드는 개질된 올리고뉴클레오티드(XIIa.4)의 구조와 유사한 구조를 가지나, R1은 H를 나타낸다.
그 후, 뉴클레오티드 화합물 M1, M2,…Mm의 그라프팅은 p = 1로 생성물 (XIIa)을 유도하여 이루어질 수 있다. 이 경우, 신장이 고체 지지체 위에서 이루어진다.
그라프팅 단계는 기술의 숙련자에게 알려진 방법에 의해 종래적으로 수행된다.
다른 실시예에 따라, 접합된 올리고뉴클레오티드는 다음의 화학식(XIIIa)에 대응한다:
Figure pct00042
상기 화학식에서
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(I')는 화학식(I'a) 또는 (I'b)의 화합물을 나타내며,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
y'는 2~12의 정수이며,
y'가 0이 아닌 경우, p는 0 또는 1이며,
y'가 0인 경우, p는 0이고,
p가 1인 경우, y''는 0~12의 정수이며,
p가 0인 경우, y''는 0이고,
정수 (y+y'+y'')의 합은 12 보다 적다.
화합물(XIIIc)의 합성 방법을 나타내는 다이어그램은 J가 에틸기인 타입(Ic)의 화합물 및 타입(Ib)의 화합물로부터 형성된 올리고머를 이용하여 도 4에서 설명된다.
화학식(XIIIc)의 화합물의 합성은 화학식(I)의 본 발명에 따른 티올 화합물을 올리고머화하는 제 1 단계를 포함하며, 위에 기술된 방법은 화학식(XIIIa.1)의 화합물을 유도한다:
Figure pct00043
(XIIIa.1)
상기 화학식에서,
(Ic)는 이전과 동일한 의미를 가지며,
(I')는 타입(I'a) 또는 (I''b)의 그룹을 나타내며, 여기에서,
Figure pct00044
이거나,
(I')가 (I''b)를 나타내는 경우 구조식으로 나타낸다:
Figure pct00045
(XV')y
두 번째 단계에서, 제 1 뉴클레오티드 N1는 다음의 화학식(XIIIa.2)의 화합물을 유도하는 화학식(XIIIa.1)의 올리고머 위가 접합된다:
Figure pct00046
(XIIIa.2)
이러한 그라프팅 단계는 화합물(XIIIa.1)의 올리고머 사슬의 말단에서 탈보호화된 알코올 관능기 및 제 1 뉴틀레오티드 N1의 포스포라미다이트 또는 H-포스포네이트 관능기 사이의 반응에 의해 수행된다.
그 후, 개질된 올리고뉴클레오티드는 기술의 숙련자에게 알려진 다른 방법, 특히 티올 화합물에 존재하는 제 1 뉴클레오티드의 5'에서의 알코올 관능기 및 제 2 뉴클레오티드의 위치 3'에서 포스포라미다이트 또는 H-포스포네이트 관능기 사이의 반응에 의해 기술에 숙련자에게 잘 알려진 종래의 방법으로 합성된다. 합성은 화학식(XIIIa)의 화합물을 유도하는, 기술의 숙련자에게 잘 알려진 뉴클레오티드 사슬의 신장의 유사한 연속 단계에 의해 지속된다.
따라서, 본 발명의 주제는 고체 지지체에 개질된 올리고뉴클레오티드를 접착시키는 결합의 절단 후, 위의 화학식 (XIIa) 및 (XIIIa)의 화합물로부터 얻어진 화합물에 관한 것이다. 결합 절단(Bond cleavage)은 에스테르 관능기의 레벨에서 이루어진다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 지지되지 않은 개질된 올리고뉴클레오티드는 다음의 구조식(XIIb)을 가진다:
Figure pct00047
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(I'b)는 위에 정의된 화학식의 화합물을 나타내며,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
p는 0 또는 1이며,
p가 1일 때 y'는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y'는 0이고,
정수 (y + y')의 합은 12 보다 적다.
지지체의 회수는 두 단계로 이루어지며, 첫 단계는 존재하는 경우(포스포라미다이트의 경우) 시아노에틸기를 제거하기 위하여 비-뉴클레오필릭 강염기(피페리딘 또는 DBU)로 수행되고, 두 번째 단계는 기술의 숙련된 자에게 알려진 종래 방법에 의해, 바람직하게 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide; NH4OH)로 화합물(XIIa)을 처리하여 수행된다. 티올 관능기와 강하게 반응하는, 시아노에틸기의 제거 동안 아크릴로니트릴을 형성하므로 티올기의 탈보호화 전 시아노에틸기를 제거할 필요가 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 지지되지 않은 개질된 올리고뉴클레오티드는 다음의 구조식(XIIIb)을 가진다:
Figure pct00048
상기 구조식에서,
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(Ic')는 고체 지지체로 에스테르 결합의 절단에 의해 (Ic)로부터 얻어진 화합물을 나타내며, 바람직하게 다음의 구조식을 가진다:
Figure pct00049
(I'b)는 위에 정의된 화학식의 화합물을 나타내며,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
y'는 2~12의 정수이며,
y'가 0이 아닌 경우, p는 0 또는 1이며,
y'가 0인 경우, p는 0이고,
p가 1인 경우, y''는 0~12의 정수이며,
p가 0인 경우, y''는 0이고,
정수 (y+y'+y'')의 합은 12 보다 적다.
지지체의 회수는 기술의 숙련자에게 알려진 종래 방법에 의해, 바람직하게 암모늄 하이드록사이드(NH4OH)로 화합물(XIIIa)를 처리하여 이루어진다.
본 발명의 실시예에 따라, p = 0인 경우, 개질된 올리고뉴클레오티드는 구조식(XIIb)에 대응한다:
Figure pct00050
(XII b)
상기 구조식에서,
n, y, N1,…Nn-1, X, Y, Z, W 및 R은 위에서와 같은 동일한 의미를 가지며,
Bn은 n차 뉴클레오티드(n-th nucleotide)의 염기이다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, p = 0인 경우, 개질된 올리고뉴클레오티드는 구조식(XIIIb)에 대응한다:
Figure pct00051
(XIII b)
상기 구조식에서,
n, y, N2,…Nn, X, Y, Z, W 및 R은 위에서와 같은 동일한 의미를 가지며,
B1은 1차 뉴클레오티드(n-th nucleotide)의 염기이다.
본 발명은 티올 관능기의 탈보호에 의해 및 고체 지지체에 화합물을 결합시키는 결합의 절단(각각도 3 및 4)에 의해 화합물(XIIa) 및 (XIIIa)로부터 각각 시작하여 얻어진 개질된 올리고뉴클레오티드(XIIc) 및 (XIIIc)에 더 관한 것이다.
기술의 숙련자에게 알려진 처리에 의해 화합물(XIIa)의 티올 관능기 및 포스포라미다이트 관능기의 탈보호화 후, 올리고뉴클레오티드가 타입(Ia)의 하나 이상의 티올 화합물로 개질될 때, 화학식(XIIc)의 화합물이 얻어진다:
Figure pct00052
상기 화학식에서,
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(I'')는
Figure pct00053
이며,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
p는 0 또는 1이며,
p가 1일 때 y'는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y'는 0이고,
정수 (y + y')의 합은 12 보다 적으며,
p = 0일 때 다음의 구조식으로 나타낸다:
Figure pct00054
상기 구조식에서,
X, Y, W, Z, R1는 화합물(I)에서와 동일한 의미를 가지며,
N1, …Nn, n, y는 화합물(XIIa)에서와 동일한 의미를 가지고,
Bn은 뉴클레오티드 사슬에서 종래적으로 이용된 염기를 나타낸다.
기술의 숙련자에게 알려진 처리에 의해 화합물(XIIIa)의 티올 관능기의 탈보호화 후, 올리고뉴클레오티드가 타입(Ib)의 하나 이상의 티올 화합물로 개질될 때, 화학식(XIIIc)의 화합물이 얻어진다:
Figure pct00055
상기 화학식에서,
N1,…, Nn은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내며,
M1,…, Mm은 서로 독립적으로 뉴클레오티드를 나타내고,
(Ic')는 고체 지지체로 에스테르 결합의 절단에 의해 (Ic)로부터 얻어진 화합물을 나타내며,
(I'')는
Figure pct00056
이고,
n은 4~100의 정수이고,
m은 4~100의 정수이며,
y는 2~12의 정수이고,
y'는 2~12의 정수이며,
y'가 0이 아닌 경우, p는 0 또는 1이며,
y'가 0인 경우, p는 0이고,
p가 1인 경우, y''는 0~12의 정수이며,
p가 0인 경우, y''는 0이고,
정수 (y+y'+y'')의 합은 12 보다 적으며;
y' = p = 0인 경우 다음의 구조식으로 나타낸다:
Figure pct00057
상기 구조식에서,
X, Y, W, Z는 화합물(I)에서와 동일한 의미를 가지며,
N2,…Nn, n및 y은 화합물(XIIa)에서와 동일한 의미를 가지며,
Bn은 뉴클레오티드 사슬에서 종래적으로 이용된 염기에 대응한다.
올리고뉴클레오티드의 합성 동안, 티올 관능기는 바람직하게 보호된다. 사실상, 티올 관능기는 새로운 포스포라미다이트 관능기(incoming phosphoramidite function)와 반응할 수 있다.
티올 관능기의 탈보호화 단계 및 고체 지지체의 제거 단계는 개질된 올리고뉴클레오티드(XIIa) 또는 (XIIIa)의 단일 처리 단계로 수행될 수 있다.
또한, 고체 지지체의 제거는 제 1 단계로 수행될 수 있고, 그 후 티올 관능기의 탈보호화는 제 2 단계로 수행된다.
최종 올리고뉴클레오티드(XIIc)(각각 최종 올리고뉴클레오티드((XIIIc))는 화합물(Ia)로부터 시작하든 화합물(Ib)로부터 시작되든, 개시 티올 화합물과 관계없이 얻어진다. 사실상, 모노머(Ia) 또는 (Ib)가 이용되든 상관 없이, 올리고머화 반응으로부터 생성된 티올 단량체(thiol monomer unit)는 아래에 기술된 화합물(I'')에 대응한다.
아래에 기술된 화학식 (XVI)k의 접합된 지지체는 올리고뉴클레오티드 합성의 개시를 허용한다. 특히 올리고머뉴클레오티드의 위치 3'에서 폴리티올 서열로서 이용될 올리고머의 서열가 접합된 고체 지지체의 공업용 또는 준공업용 제조가 예상될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 위에 기술된대로, 뉴클레오티드 서열(N1-N2-…Nn-1-Nn) 및 선택적으로 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 원인이 되거나 질병에 포함된 바이러스, 박테리아 또는 유전자에 특이적이다.
본 출원의 의미 내에서, "특이성"은 서열 (N1-N2-…Nn-1-Nn) 및 선택적으로 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)가 바이러스 또는 박테리아의 유전자 또는 게놈에 포함된 적어도 하나의 표적 핵산 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 상호보완하는 것을 의미한다. 따라서, 대응하는 표적 서열의 부분 또는 전체적으로 서열 서열 (N1-N2-…Nn-1-Nn) 및 선택적으로 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)의 혼성화는 최대 2개의 비염기쌍(mispairings)을 가지는 핵산의 이중 나선(duplex) 형상을 유도하는 것으로 이해된다. 본 발명의 한 실시예에서, 용어 "특이성"은 형성된 이중 나선(duplex)이 하나 또는 두 개의 비염기쌍(mispairings)만을 포함하는 것을 나타낸다. 바람직하게, 형성된 이중 나선은 임의의 염기쌍을 포함하지 않는다. "바이러스 또는 박테리아의 유전자 또는 게놈의 서열 특성"은 바이러스 또는 박테리아 유기체의 유전체, 염색체 또는 플라스미드(plasmid) 영역을 의미하므로, 특유한 유전자 변이 때문에 다른 유기체에서 발견되지 않는 뉴클레오티드의 서열을 가진다.
본 발명 내에서, 용어 "개질된 올리고뉴클레오티드" 및 "프로브"는 동의어로 이용되며, 위에 기술된대로 4~100개의 뉴클레오티드를 가지며 적어도 2개의 티올 관능기를 가지는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드가 유전자형 분석을 위해 이용될 때, 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드는 13~20개의 뉴클레오티드, 바람직하게 14 또는 15량체(mer)의 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 프로브는 적합한 표면, 금 또는 말레이미드기로 코팅된 표면 위로 접합되는 능력을 가지며, 뉴클레오티드 일부를 통해 표적 뉴클레오티드 서열로 혼성화되는 능력을 가진다.
바람직하게, 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드는 2~12개의 티올 관능기, 특히 2~8개의 티올 관능기를 포함하며, 즉 개질된 올리고뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 관능기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 금 표면 위로 접합되는 개질된 올리고뉴클레오티드는 3~8, 바람직하게 4~8개의 티올 관능기를 포함한다. 바람직하게, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면과 접합하는 개질된 올리고뉴클레오티드는 2~8개의 티올 관능기 및 바람직하게 4개의 티올 관능기를 포함한다.
본 발명에 이용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 프로브에 상호보완적이거나 부분적으로 상호보완적이며 바이러스 또는 박테이라의 유전자 또는 게놈으로부터 증폭되는, 바람직하게 게놈의 특성 영역으로부터 증폭되는 서열을 나타낸다.
용어 "바이러스"는 복제를 위하여 호스트셀(host cell)을 필요로하는 생물학적 개체(biological entity)를 나타내며, 최소한의 핵산 및 단백질을 포함하며, 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥의 DNA 및/또는 RNA일 수 있다. 바이러스는 원핵 세포(prokaryotes)(예를 들어 마이오비리대(Myoviridae), 시포비리대(Siphoviridae), 포도비리대(Podoviridae), 마이크로비리대(Microviridae) 및 이노비리대(Inoviridae))에 기생할 수 있고, 식물(토바모바이러스(tobamovirus)와 같은 파이토바이러스(phytoviruses), 곤충(예를 들어 바큐로바이러스(baculoviruses)), 균류(fungi) 및 인간에 기생할 수 있는 것을 포함한다. 본 발명 내에서, 바이러스는 아르보바이러스(arboviruse)를 포함한다. 아르보바이러스 그룹은 다른 속(genera)에 속하는 형태상으로 이종의 바이러스(heterogeneous virus)와 함게 속 플라비바이러스(Flavivirus; Flaviviridae family(플라비비리대군)), 알파바이러스(Alphavirus; Togaviridae family(토가비리대군)), 콜티바이러스(Coltivirus; Reoviridae family(레오비리대군)), 플레보바이러스(Phlebovirus; Bunyaviridae family(부니아비리대군))을 포함한다. 더 넓게, 플라비비리대군은 특히 속 플라비바이러스(황열병 바이러스(yellow fever virus), 웨스트나일 바이러스, 진드기매개뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus; TBE), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(Saint Louis encephalitis virus), 우수투 바이러스(usutu virus) 및 뎅기열 바이러스(dengue virus)), 헤파시바이러스(Hepacivirus; hepatitis C virus(C형 간염 바이러스)) 및 페스티바이러스(Pestivirus; bovine viral diarrhoea virus(BVD, 소비루스성 설사병 바이러스), 돼지 콜레라 바이러스(swine fever virus))를 포함한다. 토가비리대군은 특히 속 알파바이러스(신드비스 바이러스(Sindbis virus), 로스강 바이러스(Ross River virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong'nyong virus), 치군군야 바이러스(Chikungunya virus)) 및 루비바이러스(Rubivirus; Rubella virus(풍진 바이러스))를 포함한다. 특히, 레오비리대군은 소화기관(digestive system)(예를 들어 로타바이러스(Rotavirus)) 또는 호흡기관(respiratory system)에 영향을 미치는 바이러스를 포함한다. 특히, 부니아비리대군(Bunyaviridae family)은 속 한타바이러스(Hantavirus; Hantavirus pulmonary syndrome(침습아스페르길루스증); Korean haemorrhagic fever(한국 출혈열)), 나이로바이러스(Nairovirus; Dugbe virus(두그비 바이러스), 오르토부니아바이러스(Orthobunyavirus; Bunyamwera virus(부니암웨라바이러스), 플레보바이러스(Phlebovirus; Rift Valley fever(리프트 밸리열)) 및 Tospovirus(토스포바이러스)를 포함한다.
본 발명 내에서, 인간에게 감염될 수 있는 바이러스는 수포성 바이러스(Vesiculovirus; stomatitis vesicular virus(구내염 수포성 바이러스) 등), 리사 바이러스(Lyssaviruses; Rabies virus(광견병 바이러스), Australian bat virus(오스트레일리아 박쥐 바이러스)); 피코르나 바이러스(Picornavirus; Rhinovirus(리노 바이러스), Poliovirus(폴리오바이러스), hepatitis A virus(A형 간염 바이러스) 등), 헤르페스 바이러스(Herpesviruses; chickenpox(수두), shingles(대상 포진), cytomegalovirus(시토메갈로 바이러스) CMV, Epstein Barr virus(엡스타인 바 바이러스) EBV 등), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses; influenza virus(인플루엔자 바이러스) 등), 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses; measles virus(홍역 바이러스), mumps virus(멈프스 바이러스) 등), 수두 바이러스(Poxviruses; smallpox virus(두창 바이러스) 등), 코로나바이러스(Coronaviruses; SARS 등), 필로바이러스(Filoviruses; Ebola(에볼라) 등), 헤파드나바이러스(Hepadnaviruses; HBV) 및 레트로바이러스(Retroviruses; HIV, HTLV 등)를 포함한다.
용어 "박테리아"는 핵(nucleus) 및 세포기관(organelles)이 부족하며 세포벽(cell wall)으로 제공된 임의의 원핵 생체(prokaryotic living organism)를 나타낸다. "박테리아"는 특히 병원체일 수 있고 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae; 디프테리아(diphtheria)), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum; 매독(syphilis)), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; 투베르쿨로시스(tuberculosis)), 마이코박테륨 레프래(Mycobacterium leprae; 나병(leprosy), 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae; 고노르호애(gonorrhoea)), 리케치아(Rickettsia; 티푸스(typhus)), 클로스트리듐테타니(Clostridium tetani; 파상풍(tetanus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae; 콜레라(cholera)), 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로콕시(Staphylococci; 기회감염균(opportunistic pathogens))와 같이 인간의 질병 및/또는 전염의 원인이될 수 있는 박테리아를 포함한다. 또한, "박테리아"는 예를 들어 이집트 콩 음성균 대장균(Gram-negative bacteria Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 적변 세균(Serratia marcescens), 여시니아엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 엔테로박터 에어로게네스균(Enterobacter aerogenes), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 및 슈도모나스에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 표피포도상구균 그램 양성균(Gram-positive bacteria Staphylococcus epidermidis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes) 및 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens)와 같은 수혈 위험성 및 병원 감염에 관련된 박테리아를 포함한다.
용어 "박테리아"는 핵(nucleus) 및 세포기관(organelles)이 부족하며 세포벽(cell wall)으로 제공된 임의의 원핵 생체(prokaryotic living organism)를 나타낸다. "박테리아"는 특히 병원체일 수 있고 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae; 디프테리아(diphtheria)), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum; 매독(syphilis)), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; 투베르쿨로시스(tuberculosis)), 마이코박테륨 레프래(Mycobacterium leprae; 나병(leprosy), 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae; 고노르호애(gonorrhoea)), 리케치아(Rickettsia; 티푸스(typhus)), 클로스트리듐테타니(Clostridium tetani; 파상풍(tetanus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae; 콜레라(cholera)), 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로콕시(Staphylococci; 기회감염균(opportunistic pathogens))와 같이 인간의 질병 및/또는 전염의 원인이될 수 있는 박테리아를 포함한다. 또한, "박테리아"는 예를 들어 이집트 콩 음성균 대장균(Gram-negative bacteria Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 적변 세균(Serratia marcescens), 여시니아엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 엔테로박터 에어로게네스균(Enterobacter aerogenes), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) 및 슈도모나스에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 표피포도상구균 그램 양성균(Gram-positive bacteria Staphylococcus epidermidis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes) 및 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens)와 같은 수혈 위험성 및 병원 감염에 관련된 박테리아를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따라, 뉴클레오티드 서열(N1-N2-…Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열(M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 다음으로부터 선택된다:
- C형 간염 바이러스(HCV)에 특이적인, 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 35 또는 서열번호(SEQ ID NO) 36,
- 플라비바이러스에 특이적인, 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17 또는 서열번호(SEQ ID NO) 40,
- 뎅기열 바이러스에 특이적인, 서열번호(SEQ ID NO) 18 또는 서열번호(SEQ ID NO) 41,
- 웨스트 나일 바이러스(WNV)에 특이적인, 서열번호(SEQ ID NO) 19.
본 발명의 실시예에 따라, 뉴클레오티드 서열(N1-N2-…Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열(M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 알파 아노머, 베타 아노머, 선형 또는 "스테일" 타입의 구조를 가진다. 뉴클레오티드 서열이 베타 아노머 타입의 구조를 가질 때, 본 발명의 개질된 올리고머(개질된 올리고머의 티올은 5'에 위치함)는 표적 서열과 반평행(antiparallel) 방식으로 혼성화된다. 뉴클레오티드 서열이 알파 모노머 타입의 구조를 가질 때, 본 발명의 개질된 올리고머(개질된 올리고머의 티올은 3'에 위치함)는 표적 서열과 평행 방식으로 혼성화된다.
표면 관능화(surface functionalization)
본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드는 기판의 표면을 관능화하기 위하여 기판에 증착된다. 기판은 금속일 수 있거나 폴리머로 형성될 수 있고, 전도성이거나 비전도성이다. 기판은 수평(부분적으로 또는 전체적으로)하거나 곡선 형상이며, 바람직하게 구 형상일 수 있다.
실시예에 따라, 기판은 예를 들어 마이크로입자(microparticles) 또는 나노 입자(nanoparticles)의 형태로 비평면(non-planar)이며, 바람직하게 자성(magnetic)을 띤다. 본 발명에 따라 개질된 뉴클레오티드는 마이크로입자(microparticles) 또는 나노 입자(nanoparticles) 위로 절합될 수 있다. 바람직하게, 이러한 입자는 자성을 띤다. 사실상 자성 입자(magnetic particles)는 이후 자석의 사용에 의해 검출하고, 유전자형 분석하거나 서열화하는 테스트를 목적으로, 전극의 표면에 또는 마이크로판(microplate)의 벽의 하부에 쉽게 전달될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 검출 방법에서 마이크로입자 또는 나노입자의 비평면 지지체의 이용은 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드가 접합될 수 있는 표면 영역에서 증가될 수 있으며, 따라서 프로브 및 표적 서열 사이의 혼성화 비율을 증가시킬 수 있다.
실시예에 따라, 기판은 금속, 예를 들어 구리 또는 티타늄이며, 기판의 표면은 부분적으로 또는 전체적으로 금 또는 백금 필름, 바람직하게 금으로 코팅된다.
실시예에 따라, 기판은 폴리머, 바람직하게 전도성 폴리머이다.
실시예에 따라, 기판은 금 또는 백금 필름으로 덮이며 알케닐, 알키닐 또는 할로아세트아미드 관능기, 예를 들어 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기로 덮여지는 수용 영역을 포함할 수 있으며, 수용 영역 위로 개질된 올리고뉴클레오티드가 증착된다.
본 발명의 실시예에 따라, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 그룹은 알파 위치(alpha position)의 카보닐 관능기에 의해 활성화된 알켄으로부터 선택되며, 바람직하게 알켄은 말레이미드 및 아크릴아미드기로부터 선택된다.
본 발명의 실시예에 따라, 할로아세트아미드기(haloacetamide groups)는 브로모아세트아미도(bromoacetamido)기 및 요도아세트아미드(iodoacetamido)기로부터 선택된다.
본 발명의 실시예에 따라, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 그룹은 알파 위치의 카보닐 관능기(carbonyl function)에 의해 활성화된 알킨으로부터 선택되며, 바람직하게 알킨은 2-프로핀아미드기로부터 선택된다.
도 16a에 나타낸대로, 화합물 gpt-SH는 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 티올 관능기는 알파 위치의 카보닐 관능기에 의해 활성화된 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합과 반응한다. 도 13a의 상부에서 하부까지, 제 1 관능화 반응은 말레이미드가 접합된 표면에 대응하며, 제 2 반응은 아크릴아미드가 접합된 표면에 대응하며, 제 3 반응은 요도아세트아미도 또는 브로모아세트아미도가 접합된 표면에 대응하고, 제 4 반응은 2개의 티올 화합물을 포함하는 본 발명에 따른 개질된 뉴클레오티드의 경우에 제조된 2-프로핀아미드가 접합된 표면에 대응한다.
도 16b의 경우, 표면은 비활성화된 알케닐기(1차 반응) 및 알키닐기(2차 반응)가 접합된다. 개질된 올리고뉴클레오티드의 티올 관능기 및 표면 그룹(surface groups) 사이의 반응은 광(λ = 265nm)의 활성화를 이용하여 이루어진다. 제 1 관능화 반응은 gpt-SH로 도식적으로 나타낸 모노티올이 개질된 올리고뉴클레오티드(monothiol modified oligonucleotide)를 이용하여 수행되며, 제 2 반응은 디티올이 개질된 올리고뉴클레오티드(dithiol modified oligonucleotide)를 이용하여 수행된다.
지지체가 알키닐 관능기로 접합될 때, 폴리티올이 개질된 올리고뉴클레오티드(polythiol modified oligonucleotide)로 표면 관능화는 제 1 단계에서 제 1 티올 관능기 및 -yne 관능기 사이 및 그 후 제 2 단계에서 제 2 티올 관능기 및 결과적으로 발생한 -ene 관능기 사이의 두 연속 반응 때문에 고리형 구조를 유도하므로 매우 흥미롭다(도 16a 및 도 16b).
바람직한 실시예에 따라, 기판은 말레이미드 또는 아크릴아미드기가 접합된다.
따라서, 본 발명은 예를 들어 기판의 표면 및 개질된 올리고뉴클레오티드 사이의 금-황 결합을 형성하여 금 표면을 관능화할 수 있거나 티오에테르(thioether) 결합을 형성하여 말레이미드 또는 아크릴아미드가 접합된 표면을 관능화할 수 있다.
기판의 표면 위로 개질된 올리고뉴클레오티드의 고정은 위에 기술된 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액에서 처리되는 표면을 침지(immersing)하여 이루어진다. 일반적으로 하나 이상의 세척 및 건조의 추가 단계가 제공된다. 일반적으로 개질된 올리고뉴클레오티드의 용액은 기판 표면이 금일 때 10~500μM, 바람직하게 50~200μM의 농도를 가지며, 기판 표면이 말레이미드로 형성될 때 50~200nM, 바람직하게 75~150nM의 농도를 가진다. 침지(immersion)는 반응하지 않는 것들을 제거하도록 세척에 의해 이루어진다.
올리고뉴클레오티드에 존재하는 몇몇 황 원자는 올리고뉴클레오티드가 표면 위에서 안정화되도록 몇몇 금-황 결합 또는 몇몇 티오에테르 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 목적은 위에 기술된대로 적어도 하나의 개질된 올리고뉴클레오티드가 접합된 기판을 포함하는 것이며, 상기 기판은 상기 개질된 올리고뉴클레오티드를 그라프팅하는 물질로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역을 포함한다. 본 발명의 실시예에 따라, 기판은 전극 형상이다. 본 발명의 다른 실시예에 따라, 기판은 96개의 웰(wells) 또는 그 이상의 웰을 가지는 마이크로판의 형상이다.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명에 따라 접합된 기판은 금속, 바람직하게 구리 또는 티타늄이며, 금 또는 백금 필름으로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에 따라, 접합된 기판은 플라스틱, 바람직하게 폴리스티렌이며, 수용 영역은 말레이미드기로 코팅되고 및/또는 수용 영역의 표면 위로 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따라, 수용 영역으로 얻어진 본 발명에 따라 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 밀도는 96-웰 판(96-well plate)이 기판으로 이용될 때 웰 당 10nM~500nM의 그라프팅 용액을 이용하여 얻어진다. 바람직하게, 기판의 수용 영역으로 본 발명에 따라 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 밀도는 96-웰 판이 기판으로 이용될 때 웰 당 100nM의 그라프팅 용액을 이용하여 얻어진다.
마커(marker) 또는 리간드(ligands)의 고정
본 발명의 개질된 올리고머는 예를 들어, 효소(enzymatic) 마커, 색원체(chromogenic) 마커, 형광원(fluorogenic) 마커, 방사성(radioactive) 마커 또는 화학 발광 마커(chemiluminescent markers), 금속, 금속 이온, 호르몬, 단백질, 펩타이드(peptides), 사카라이드(saccharides), 올리고사카라이드(oligosaccharides), 핵산분해(nucleolytic)제 또는 or 단백질 분해제(proteolytic agents), 결합제(binding agents), 예를 들어 비오틴(biotin), 항원(antigen), 합텐(hapten), 항체(antibody) 또는 수용체(receptor)일 수 있는 하나 이상의 부착 포인트에 의해 마커 또는 리간드에 접합된다. 바람직하게, 이러한 마커 또는 리간드는 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드 및 바이러스 또는 박테리아의 유전자의 대표 표적 서열 사이의 혼성화 이벤트를 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 마커 또는 리간드는 바이러스 또는 박테리아의 유전자의 대표 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하며, 본 발명의 개질된 올리고뉴클레오티드 및 표적 서열 사이의 혼성화 이벤트를 검출할 수 있다.
검출 방법
본 발명은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법에 더 관한 것이며, 상기 방법은 위에 기술된대로 개질된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브로 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따라, 검출 방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 근원 핵산(source nucleic acid)을 얻는 단계;
- 근원 핵산으로부터 표적 핵산의 증폭에 의해 증폭산물(amplicon)을 생성하는 단계; 및
- 위에 기술된대로 개질된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브 및 상기 증폭 산물 사이의 혼성화를 검출하는 단계.
"생물학적 샘플"은 DNA 또는 RNA와 간읕 핵산을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되며 인간, 동물, 식물 또는 임의의 액체 또는 고체 조성물로부터 얻어진 임의의 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 피부, 피, 플라즈마, 세럼, 척수액(spinal fluid), 림프액(lymphatic fluid), 활액(synovial fluid), 소변(urine), 눈물(tears), 혈구(blood cells), 골수(bone marrow), 장기(organs), 종양(tumours)을 한정하지 않고 포함하여 개별적 또는 개별적으로 분리된 조직 또는 유체의 샘플 뿐 아니라 생체 외 세포 배양의 성분 샘플을 포함한다. 바람직하게, 생물학적 샘플은 용액으로 세포내 성분을 형성하기 위하여 조직 또는 세포의 구조를 파괴하기 위해 처리될 수 있다.
"증폭산물"은 생물학적 샘플에 포함된 유전자, 바이러스 또는 박테리아의 특정 표적 핵산 서열의 증폭 과정 동안 발생된 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 실시예에 따라, 증폭산물은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 생성된다. 바람직하게, 본 발명의 검출 방법에 이용된 증폭 산물은 75~500bp의 크기를 가진다. 특히, 본 발명의 방법의 이점 중 하나는 선행 기술에서 증명될 수 없는 수 백의 뉴클레오티드의 길이를 가지는 증폭산물을 이용할 수 있는 것이다. 본 발명의 검출 방법은 유전자, 바이러스 또는 박테리아에서 큰 표적 서열을 선택하고 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 검출 방법은 생물학적 샘플에 존재하는 유전자형(genotype) 및/또는 아형(subtype)을 측정할 수 있다. 증폭산물은 특히 바이러스의 유전자형 및/도는 아형에 관련된 바이러스 함유 정보의 게놈 영역(genomic region)에 대응하는 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭에 의해 형성되며, 검출은 특정 바이러스 유전자형 및/또는 아형에 특이적인 프로브로 수행된다. 본 발명의 방법은 바이러스 또는 박테리아 타입 또는 아형의 표적 서열을 포함하는 더 많은 정보에 기반하여 효과적으로 검출할 수 있다. 이러한 이점은 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오, 본 발명의 방법 및 기판의 고정 영역에 고정되는 능력으로 직접 형성된다. 바람직하게, 바이러스 또는 박테리아 게놈으로부터 가능한 짧은 표적 서열을 증폭시키는 프라이머를 형성할 필요가 없다. 본 발명의 방법은 문제의 바이러스 또는 박테리아군의 보존 영역에 국한된 플라이머를 대신 선택할 수 있으며, 긴 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 이로써, 상당한 절약과 증가된 이용성을 야기하며, 동일한 프라이머는 이용된 증폭산물의 크기에 의해 조작된 혼성화 결과를 볼 가능성이 없이 여러 바이러스 또는 박테리아 타입 및/또는 아형에 직면한 게놈 영역을 증폭시케기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 본 발명의 검출 방법의 증폭산물을 생성하는 단계는 뉴클레오티드 프라이머의 혼합물, 바람직하게 프라이머 쌍으로부터 선택된 뉴클레오티드 프라이머의 혼합물로 수행된다:
- 바이러스 유전자형이 포함될지라도, 증폭산물이 HCV로부터 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 9; 상기 프라이머쌍은 일반적이며, 임의의 HCV 유전자형으로부터 시작하여 401nt의 "긴" 증폭산물의 증폭을 허용한다;
- 서열번호(SEQ ID NO) 10 및 서열번호(SEQ ID NO) 9, 유전자형 1a/1b에 특이적인 191nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용하는 쌍;
- 서열번호(SEQ ID NO) 29 및 서열번호(SEQ ID NO) 9, 유전자형 2에 특이적인 108nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용하는 쌍;
- 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 11, 유전자형 3a에 특이적인 143nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용하는 쌍;
- 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 30, 유전자형 4a/4d에 특이적인 175nt의 "짧은" 증폭산물의 생성을 허용하는 쌍; 및
- 증폭산물이 플라비바이러스로부터 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 20 및 서열번호(SEQ ID NO) 21, 및/또는 서열번호(SEQ ID NO) 22 및 서열번호(SEQ ID NO) 21.
실시예에 따라, 96-웰 판이 기판으로 이용될 때, 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드는 검출 방법에서 웰과 10~500nM의 그라프팅 용액과 접촉을 야기하는 밀도로 이용된다. 바람직하게, 96-웰 판이 기판으로 이용될 때, 본 발명에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드의 그라프팅 용액은 100nM이다. 본 발명에 따라 개질된 올리고뉴클레오티드가 2개의 티올 관능기를 포함할 때, 이용된 그라프팅 용액은 적어도 10nM의 개질된 올리고뉴클레오티드의 농도를 가지며, 검출 방법에 이용된 증폭 산물의 농도는 적어도 100pM이다. 본 발명에 따라 개질된 올리고뉴클레오티드가 4개의 티올 관능기를 가질 때, 이용된 그라프팅 용액은 웰 당 적어도 10nM의 개질된 올리고뉴클레오티드의 농도를 가지며, 96-웰 판이 기판으로 이용될 때 검출 방법에 이용된 증폭산물의 농도는 웰 당 적어도 10pM이다.
본 발명에 따른 검출 방법은 HCV의 유전자형 분석에 대한 특정 이점을 제공하므로, 특히 단순한 분자 검출 테스트를 이용하여 구별되는 HCV의 다양하게 알려진 유전형 또는 아형을 허용한다.
사실상 C형 간염 바이러스와 같은 전염병은 매우 중요한 건강상 문제를 나타내므로, 간질환(liver diseases), 간경변(cirrhoses) 및 1차 간암(primary hepatic carcinomas)이 발병하는 전염되는 개인적 위험도는 병원소(reservoir of infection)를 형성한다. 질병학 관련 연구는 새로운 진단 및 치료 시스템이 개발되지 않는 경우 10년 후 HCV로부터 발생하는 연간 사망자수의 3배를 예상하였다.
상당한 유전적 변이성에 의해 특징화된, HCV는 80개 이상의 아형을 포함하는 6개의 주요 유전자형으로 분류된다. 전염되는 유전자형 및/또는 아형의 정확한 측정은 치료 전략(therapeutic strategies)을 위해 매우 중요하며, 항바이러스 반응(antiviral response)의 유효성을 예측할 수 있으며, 치료 기간 및 치료 타입 및 복용량을 정의할 수 있다. 감염된 사람에게 발견된 HCVs의 정확한 분의 식별은 바이러스 균주(viral strains)의 분포를 측정하고 전달 인자(transmission factor)를 구별하는 목적으로 질병학적 측정하는데 중요하다.
HCV의 RNA를 검출하고 및/또는 정량화하는 상용적으로 이용가능한 많은 테스트는 HCV의 매우 보존되고 우수한 특징이 있는 영역 중 하나를 형성하는 5' 비코딩 영역(noncoding region; 5'NCR)에서 발견된 서열에 기반한다. 따라서, 5'NCR 영역은 서열 분석 및 이중 나선 유동성 테스트에 기반한 Bayer, Bayer/Siemens Healthcare의 Trugene HCV 5'NCR 키트(WO2007/076493)의 INNO LiPA HCV II 테스트와 같이 상용적으로 분포된 유전자형 분석의 다양한 알려진 방법 또는 5'NCR영역 또는 Roche Molecular Systems (US 2007/014160)에 의해 개발된 NS5 영역에서 설계된 HCVs의 복수의 타이핑(typing)을 포함하는 혼성화를 검출하는 시스템에서 표적으로서 선택된다.
그러나, 5'NCR 영역에서 돌연변이의 존재는 치료 결과의 심각한 결과를 유도하는 경우의 5~8%로 HCV 유전자형의 불충분한 분류를 유도한다. 5'NCR 영역은 바이러스의 유전자형 2 및 4를 식별하는 충분한 신뢰성도를 더이상 나타내지 않는다.
HCV의 유전자형 분석을 수행하는 기준 방법은RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)에 대하여 코딩하는, HCV의 특정 영역의 서열화 및 특히 바이러스의 NS5b 영역의 서열화로 이루어진다. 그러나, 서열화는 값이 비싸고 시간을 많이 소모하며, 전문적인 장비 및 훈련된 오퍼레이터를 필요로한다. 따라서, 서열화는 대규모의 임상 연구를 수행하는데 적합하지 않다.
따라서, 본 발명과 같이 단순한 분자 테스트를 이용하여 HCV의 다양한 알려진 유전자형 및 아형을 구별하는 HCV를 검츨하고 및/또는 유전자형 분석하는 방법을 개선할 필요성이 있다.
본 발명은 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17, 서열번호(SEQ ID NO) 18, 서열번호(SEQ ID NO) 19, 서열번호(SEQ ID NO) 35, 서열번호(SEQ ID NO) 36, 서열번호(SEQ ID NO) 40 및 서열번호(SEQ ID NO) 41로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드에 더 관한 것이다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 1의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 1a/1b의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 타입 1a/1b의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 특히 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 27의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 2의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 특히 위에 기술된 검출 방법에서 타입 2의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 35의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 2a/2c의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 특히 위에 기술된 검출 방법에서 타입 2a/2c의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 36의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 2b의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 타입 2b의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 4의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 3a의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 타입 3a의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 28의 올리고뉴클레오티드는 특히 타입 4a/4d의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 타입 4a/4d의 HCV에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17 또는 서열번호(SEQ ID NO) 40의 올리고뉴클레오티드는 특히 플라비바이러스(flaviviruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 플라비바이러스(flaviviruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 18의 올리고뉴클레오티드는 특히 뎅기열바이러스(dengue viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 뎅기열바이러스(dengue viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 41의 올리고뉴클레오티드는 특히 혈청형(serotype) 4의 뎅기열바이러스(dengue viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 혈청형(serotype) 4의 뎅기열바이러스(dengue viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 바람직하게, 서열번호(SEQ ID NO) 19의 올리고뉴클레오티드는 특히 웨스트 나일 바이러스(West Nile viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열에 대응하며, 위에 기술된 검출 방법에서 웨스트 나일 바이러스(West Nile viruses)에서 발견된 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있다.
검출 키트(Detection kits)
본 발명의 다른 주제는 본 발명에 따른 적어도 하나의 개질된 올리고뉴클레오티드가 배치되는 적어도 하나의 수용 영역을 포함하는 적어도 하나의 지지체를 포함하는 검출 및/또는 진단 키트로 이루어진다.
따라서, 검출 키트는 생물학적으로 활성인 분자를 검사하고, 진단 또는 서열화 테스트를 위해 이용될 수 있다. 진단 키트는 동일하거나 다른 올리고뉴클레오티드가 접합된 고체 지지체가 증착되는 몇몇 분리된 수용 영역을 포함한다. 예를 들어, 동일하거나 다른 개질된 올리고뉴클레오티드가 접합된 고체 지지체는 테스트 및/또는 진단 지지체를 형성하기 위하여 금 필름으로 덮여진 기판 또는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 관능기가 접합된 기판의 분리된 수용 영역에 배치될 수 있다.
특히 지지체는 금 전극(gold electrode)일 수 있다. 바람직하게, 테스트 키트는 작동 전극(working electrode), 보조 전극(counter-electrode) 및 기준 전극을 포함하는 전기화학적 셀(electrochemical cell)을 포함한다. 작동 전극은 금일 수 있으며, 보조 전극은 백금이며, 기준 전극은 은(silver)일 수 있다. 검사되는 분자와 개질된 올리고뉴클레오티드의 상호 작용은 순환 전압전류(cyclic voltammetry) 단계를 포함한다.
예를 들어, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합(알케닐 관능기) 또는 탄소-탄소 삼중 결합(알키닐 관능기) 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면으로의 그라프팅은 마이크로판 포맷(microplate format)의 진단 분야에서 응용하는데 이용되고 및/또는 ELOSA 타입(Enzyme-Linked OligoSorbent Assay)의 테스트를 수행하는데 이용된다. 이러한 타입의 테스트의 진행에서, 웰의 표면은 알케닐, 알키닐 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기 1가 접합된다. 그 후, 표면은 본 발명에 따라 개질된 올리고뉴클레오티드와 접촉한다. 따라서, 본 발명에 따라 올리고뉴클레오티드에 하나 이상의 티올 관능기가 존재하기 때문에 하나 이상의 티오에테르 결합이 형성된다. 이 때, 테스트는 관능화된 웰을 가지는 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 테스트 샘플과 접촉하며, 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 측정한다. 예를 들어, 측정은 올리고뉴클레오티드 사슬의 라벨링에 의해 형광(fluorescence)에 기반할 수 있다.
또한, 본 발명은 위에 기술되고 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면을 접합하는 적어도 두 개의 티올 관능기를 포함하는 개질된 올리고뉴클레오티드의 이용에 관한 것이다. 실시예에 따라, 화합물은 3개 이상의 티올 관능기를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는 표면 위에 고정된 개질된 올리고뉴클레오티드는 적어도 두 개의 티올 관능기를 통해 ELOSA 타입의 테스트와 같은 진단 테스트에서 이용하는데 매우 우수한 안정성을 가지며 표적에 대하여 우수한 이용 안정성을 나타낸다. 화합물에서 티올 관능기의 개수는 증가하며, 검출 테스트 동안 접합된 지지체 전체의 혼성화 수는 증가한다. 따라서, 4개의 티올 관능기를 가지는 개질된 올리고뉴클레오티드는 표적의 더 효과적인 혼성화를 얻을 수 있다.
예
예에서, "프로브"는 표면에 고정되는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 티올 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 의미한다.
"표적"은 예를 들어 진단 테스트 동안 프로브로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 사슬을 의미한다.
예 1: 올리고머의 합성
화합물 1- O -(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(6-S-아세틸티오헥실록시메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올 4 (1- O -(4,4'-dimethoxytrityl)-2-(6-S-acetylthiohexyloxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol 4 )의 합성
Figure pct00058
화합물 3은 Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J., 및 Morvan, F., Journal of Organic Chemistry 74, 2009, 1218-1222에 기술된 프로토콜(protocol)에 따르는 화합물 1로부터 얻어진다.
크라운 에테르 18-6(70mg, 0.26mmol)는 무수 톨루엔(anhydrous toluene, 10mL)에서 1-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(6-브로모헥실록시메틸)-2-메틸-1,3-프로판디올 3(1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-(6-bromohexyloxymethyl)-2-methyl-1,3-propanediol 3)(556mg, 0.95mmol)의 용액 및 칼륨 티오아세테이트(potassium thioacetat)의 용액에 첨가된다. 혼합물은 50℃에서 2시간 동안 자석 교반(magnetic stirring)된다. 디클로로메탄(dichloromethane, 150mL)로 희석 후, 혼합물은 여과되며, 유기상(organic phase)은 물(2×50mL)로 세척되며, 그 후 Na2SO4를 통해 건조된다. 증발 후, 조반응 생성물(crude reaction product)은 무색의 오일(colourless oil, 413mg, 755)의 형상으로 원하는 생성물을 형성하는 실리카 크로마토그래피(사이클로헥산에서 0~30%의 에틸 아세테이트)에 의해 정제된다.
1- O -(4,4'-디메틸록시트리틸)-2-(6-S-아세틸티오헥실록시메틸)-2-메틸-3-O-(2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필포스포라미다이트)-프로판-1,3-디올 5 (1- O -(4,4'-dimethoxytrityl)-2-(6-S-acetylthiohexyloxymethyl)-2-methyl-3-O-(2-cyanoethyl-N,N'-diisopropylphosphoramidite)-propane-1,3-diol 5 )의 합성
Figure pct00059
2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2-Cyanoethyl-N,N'-diisopropylchlorophosphoramidite)(190μL, 0.85mmol)는 무수 디클로로메탄(10mL)에서 1-O-(4,4'-디메틸록시트리틸)-2-(6-S-아세틸티오헥실록시메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올 4(1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-(6-S-acetylthiohexyloxymethyl)-2-methylpropane-1,3-diol 4)(413mg, 0.71mmol) 및 디이소프로필에틸아민(186μL, 1.06mmol)의 용액에 첨가된다. 혼합물은 주위 온도에서 1시간 동안 자석 교반된다. 과잉 시약(excess reagent)은 500μL의 물을 첨가하여 중화되고, 혼합물은 디클로로메탄(150mL)로 희석된다. 유기상은 NaHCO3 포화 수용액(100mL)으로 세척되며, 그 후 Na2SO4를 통해 건조된다. 증발 후, 조반응 생성물은 무색의 오일(400mg, 72%)의 형상으로 원하는 화합물 5를 형성하는 실리카 크로마토그래피(4%의 트리에틸아민을 포함하는 사이클로헥산에서 0~30%의 에틸 아세테이트)에 의해 정제된다.
티올 고체 지지체 6 의 합성
Figure pct00060
간유리 튜브(ground-glass tube)에서, 1-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(6-S-아세틸티오헥실록시메틸)-2-메틸-1,3-프로판디올 4(1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-(6-S-acetylthiohexyloxymethyl)-2-methyl-1,3-propanediol 4, 178mg, 0.3mmol) 및 디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine; DMAP, 36mg, 0.3mmol)은 3mL의 무수 피리딘으로 공증발된(coevaporated)다. 숙시닐(succinyl)-긴 사슬 알킬아민-CPG(제어된 포어 유리(Controlled Pore Glass))(1g), 무수 피리딘(5mL), 무수 트리에틸아민(anhydrous triethylamine, 160mL, 1.2mmol) 및 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(ethyldimethylaminopropyl carbodiimide; EDC, 280mg, 2.0mmol)이 첨가된다. 그 후, 1mL의 무수 피리딘으로 헹구어진다. 혼합물은 밤새 교반된다.
혼합물은 여과되고, CH2Cl2(10mL)로 세척되며, 그 후 건조기(desiccator)에서 건조된다. 고체 지지체 위의 티올 화합물은 3시간 동안 교반으로 THF에서 무수아세트산(acetic anhydride), N-메틸이미다졸(N-methylimidazole), 2,6-루티딘(2,6-lutidine)의 용액으로 처리된다. 혼합물은 여과되고, CH2Cl2(10mL)로 세척되며, 그 후 29μmol/g의 관능화로 티올 고체 지지체 6(940mg)를 형성하기 위하여 건조기에서 건조된다.
예 2: 개질된 올리고뉴클레오티드의 제조
위치 5'에서 페로센기(ferrocene group)를 포함하는 3개의 올리고뉴클레오티드 및 본 발명에 따라 증가하는 타입(Ia)의 티올 화합물의 수(1, 2 및 4개의 티올 화합물)는 DNA 합성기에서 합성된다. 페로센기는 순환 전압전류(cyclic voltammetry)에 의해 금 표면 위로 올리고뉴클레오티드를 고정하기 위하여 이용된다. 하나, 둘 또는 넷의 티올기는 프로판디올 타입의 고체 지지체 위로 도입되며, DNA 서열번호(SEQ ID NO) 7는 접합된다. 마지막으로, 알파-티미딘 포스포라미다이트(alpha-thymidine phosphoramidite)를 함유하는 페로센기 개질된 올리고뉴클레오티드의 위치 5'에 도입된다. 탈보호화는 두 개의 단계로 이루어진다. 첫 번째, 매체는 베타-제거(beta-removal)에 의해 시아노에틸기를 제거하기 위하여 10분 동안 아세토니트릴에서 10%의 피페리딘으로 처리되고, 그 결과 발생하는 아크릴로니트릴(acrylonitrile)은 아세토니트릴로 세척하여 매체로부터 제거된다. 그 후, 농축된 암모늄 하이드록사이드로의 처리는 핵염기(nucleobases)로 및 티올 관능기로 아실 보호기(acyl protective groups)를 제거할 수 있으며, 숙시닐 결합(succinyl linkage)(고체 지지체)을 가수분해할 수 있다. 이러한 프로토콜은 탈보호화된 티올 관능기 및 아크릴로니트릴 사이에 마이클(Michael)의 첨가를 방지할 수 있다. 증발 후, 지지되지 않은 개질된 올리고뉴클레오티드는 C18 컬럼으로 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 정제된다.
테트라티올(Tetrathiol, 4개의 티올 화합물로 개질된 올리고뉴클레오티드)
Figure pct00061
디티올(Dithiol, 2개의 티올 화합물로 개질된 올리고뉴클레오티드)
Figure pct00062
모노티올(Monothiol, 1개의 티올 화합물로 개질된 올리고뉴클레오티드)
Figure pct00063

개질된 올리고뉴클레오티드(테트라티올, 디티올 및 모노티올)의 그라프팅 및 안정성의 연구
이 연구에 대하여, VMP3 생물학적 다중채널 분압장치(Biologic multichannel potentiostat)(Biologic Science Instruments, Pont de Claix)가 이용된다. 결과는 Biologic Science Instruments의 EC-Lab 소프트웨어를 이용하여 기록된다.
전기화학적 셀은 0.28㎠의 표면 영역을 가지는 금 전극, 백금 보조 전극 및 Ag/AgCl 기준 전극으로 이루어진다.
단계 1: 티올기의 감소
4nmol의 ODN-티올(하나 이상의 티올 화합물로 개질된 올리고뉴클레오티드)는 아르곤 하에 2시간 동안 20℃에서, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP,HCL, Sigma-Aldrich)(160mM)의 용액, 즉 용액에서 20mM의 TCEP,HCl의 농도로 감소된다.
ODN은 14000rcf(rcf = 상대 원심력(Relative Centrifugal Force))에서 15분 동안 아미콘(amicon) YM3000 필터로 탈가스화된 TCEP,HCl 20mM의 용액으로 두 번의 연속 희석/원심 분리에 의해 정제된다. 탈가스화된 100mM의 포스페이트 버퍼의 450μm 로 희석 후, 매체는 아미콘 YM3000 필터로, 30분동안 14000rcf로 다시 원심분리된다.
4 nmol의 ODN, 90mM의 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 2mM의 TCEP,HCl을 포함하는 그라프팅 용액이 얻어진다.
단계 2: 금 전극의 활성화
금 작용 전극은 초음파로 10분 동안 아세톤으로 1차 세척하여 깨끗해진다. 건조되면, 표면은 표면에 남아있는 유기체를 제거하기 위하여 1분 동안 "피라나(piranha)" 용액(0.7mL H2SO4, 0.3mL H2O2)에 침지된다.
마지막으로, 전극의 염기 활성화는 여러 사이클동안 음 전위(-1.4V vs Ag/AgCl)로 0.5M 소다에서 물의 가수분해에 의해 전극에서 수소의 발생에 의한 금의 표면 세척으로 이루어진다.
단계 3: 프로브의 그라프팅
세척 후, 티올 올리고뉴클레오티드를 포함하는 그라프팅 용액은 활성 분위기 하에 3일 동안 활성화된 금 전극과 접촉한다.
세척 후, 전기화학적 셀은 분석 전극(10mM 이염기성 소듐 포스페이트, 10mM 일염기성 칼륨 포스페이트, 250mM 소듐 퍼클로레이트(sodium perchlorate), pH 6.5) 으로 채워진다.
표면은 30분 동안 1mM의 메르캅토프로판올 용액(mercaptopropanol solution)으로 부동태화되(passivated)며, 세척 후, 셀은 접합된 층을 안정화하기 위하여 2시간 동안 분석 전극에 놓인다.
단계 4: 표면이 접합된 화합물의 안정성 분석
분석은 60mV/s, -0.1V~0.45V에서 순환 전압전류(CV)에 의해 이루어진다. 접합된 층의 안정성 연구는 전기 화학적 신호의 안정화 후, 30분마다 순환하여 2시간 동안 수행된다.
셀은 1분 또는 5분 동안 60℃ 또는 80℃에서 탈가스화된 증류수로 채워지며, 세척 후, 셀은 1.5mL의 분석 전극 포스페이트(20mM) 퍼클로레이트(250mM)로 채워진다. 30분 동안 안정화 후, CV가 수행된다.
작동은 필요한만큼 반복된다.
결과
티올 화합물로 개질된 3개의 올리고뉴클레오티드(테르라티올, 디티올 및 모노티올)의 그라프팅 정도의 비교가 이루어진다. 그라프팅 정도는 페로센의 산화 피크(oxidation peak)를 적분하여 측정된다. 사실상, 전달된 전자 전하(electron charge)는 전극의 표면에 존재하는 페로센 개수에 관련되며, 금으가 접합된 프로브의 개수에 직접 관련된다.
아래에 주어진 결과는 각각의 프로브에 대한 3개의 다른 그라프팅의 그라프팅 정도의 평균 값에 대응한다.
분자/㎠
모노티올 5.21E+12
디티올 5.81E+12
테트라티올 1.40E+12
결과의 히스토그램은 도 5에 나타낸다.
모토디올 및 디티올의 그라프팅 정도는 공정하게 비교되며, 테트라티올의 낮은 그라프팅 레벨은 아마도 큰 방해 때문에 티올 결합 수에 따라 관찰된다. 이러한 차이에도 불구하고, 테트라티올의 그라프팅 정도는 여전히 비교가능하며, 매우 재생가능하다.
온도에 대하여 티올 화합물로 개질된 3개의 올리고뉴클레오티드의 안정성 검사는 탈가스화된 증류수로 수행된다. 전기화학적 반응의 평가는 순환 전압전류에 의해 측정된다. 페로센의 산화 강도의 감소 비율은 안정화 후 얻어진 신호에 관련하겨 측정된다.
이러한 감소는 시간의 함수로 도 6 및 도 7에 나타낸다.
테트라티올 분자는 물에서 60℃로 연속 처리에 대하여 매우 안정적이다(도 6). 사실상, 이러한 1분의 처리를 5회한 후, 97%의 개시 신호는 모노티올(70%의 개시 신호) 및 디티올(62%의 개시 신호)와 대조적이다.
80℃에서, 신호의 손실은 매우 크다(도 7). 1분의 처리를 5번 연속한 후, 83%의 개시 신호는 테트라티올에 대하여 다시 정량화될 수 있다. 따라서, 테트라티올의 안정성은 모노티올(45%의 잔여 신호)의 안정성 및 디티올(18%의 잔여 신호)의 안정성보다 위에 있다.
이러한 연구는 모노티올 또는 디티올의 그라프팅과 비교하여, 4개의 티올 화합물(테트라티올)로 개질된 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 금 위로 티올의 그라프팅 안정성이 현저하게 상승하는 것을 나타낸다. 마지막에 언급된 디티올의 안정성의 결핍은 금 위로 그라프팅 및 분자내 디설파이드 브릿지(intramolecular disulphide bridge)를 재형성하는 폐환(ring closure) 사이의 경쟁 때문에 가능하다. 따라서, 온도에 대하여 우수한 안정성을 보장하도록 그라프팅 결합으로 복수의, 4개의 티올을 유지하는 것이 바람직하다.
예 3: C형 간염 바이러스의 검출의 응용
테스트되는 표적 샘플
1) 자연적 표적: "HCV(+)" 증폭산물
전국적으로 HCV의 존재에 양성 반응을 나타내는, 헌혈인의 플라즈마 샘플은 서열화하여 분석된다. 각각의 헌혈자에게 감염된 HCV의 바이러스 유전자형 및 아형이 측정된다.
401 bp의 "HCV(+)" 증폭산물은 위에 기술된 각각의 플라즈마 샘플로부터 RT-PCR에 의해, HCV의 NS5b 바이러스 영역에서 생성된다. RNA는 제조사의 추천에 따라 고순도 바이러스 핵산 키트(High Pure Viral Nucleic Acid kit, Roche)를 이용하여 200μL의 인간 플라즈마(human plasma)로부터 추출된다. RNA는 50μL의 살균수(sterile water, DNase/RNase 불포함)에서 용출된다. 역전사(reverse-transcriptionl; AT) 단계에 대하여, 11μL의 RNA는 10분 동안 72℃에서 변성되며, 4μL의 5X First Strand Buffer (Invitrogen), 2μL의 10X 헥사뉴클레오티드 혼합(Hexanucleotide Mix, Roche), 2μL의 10mM dNTP 혼합(Invitrogen) 및 200U의 SuperScript® II Reverse Transcriptase(Invitrogen)이 존재하여 역전사된다. 역전사 조건은 다음에 있다: 23℃에서 10분, 37℃에서 10분 및 95℃에서 10분.
이 후, 5 마이크로리터(microlitres)의 cDNA는 프라이머를 이용하여 PCR(중합효소 연쇄 반응, polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다:
- "비오틴이 부착된 HCV센스(Biotinylated HCVsense)"(서열: [Btn]- TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC GCT GCT TTG A (또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 8)의) 및
- "HCV안티센스(HCVantisense)"(서열 GGC GGA ATT CCT GGT CAT AGC CTC CGT GAA (서열번호(SEQ ID NO) 9)의)(Tamalet C. 외. 2003, Journal of Medical Virology 71: 391-398에 도시).
증폭 반응은 다음을 포함하는 50μL의 반응 혼합물로 수행된다: MgCl2 없이 1X PCR 버퍼(Invitrogen), 0.2μM의 각각의 프라이머, 1.5mM의 MgCl2(Invitrogen), 0.2mM dNTP mix(Invitrogen) 및 1.3U Taq 중합효소(Polymerase)(Invitrogen).
PCR 조건은 다음에 있다: 95℃에서 5분, 40 사이클(변성: 40s, 95℃; 교배: 40s, 56℃; 신장: 50s, 72℃) 및 72℃에서 10분의 최종 연장.
얻어진 HCV 증폭산물은 아가로스 겔 전기 이동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분석되며, 시료(aliquots)가 생성되고 이용 전 -20℃로 저장된다.
최초의 바이러스 유전자형이 알려진 이러한 증폭산물은 라이브러리(library)의 형상으로 저장된다.
기준 # PTR6719로, 바이러스 균주 1a/1b로부터 얻어진 401bp의 길이를 가지는 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACGGTCACTGAGAATGACATCCGTGTTGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACCTAGCCCCCGAAGCCAGACAGGCCATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTACATCGGGGGTCCCCTGACTAATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGCTATCGCCGGTGCCGCGCGAGCGGTGTGCTGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 12).
기준 # PTR7761로, 바이러스 균주 2로부터 얻어진 401bp의 길이를 가지는 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACTGTCACTGAGAGAGACATCAGAACCGAGGAGTCCATATACCAGGCCTGCTCCCTAACCGAGGAGGCTCGCACCGCCATACACTCGCTGACTGAGAGGCTATACGTGGGAGGGCCCATGCTCAATAGCAAAGGCCAGACCTGCGGGTACAGGCGTTGCCGCGCCAGCGGGGTGCTCACCACTAGCATGGGAAACACCATTACGTGCTATGTGAAAGCTCTAGCGGCATGCAAGGCCGCAGGGATAGTAGCGCCCACGATGCTGGTATGCGGCGACGACCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTGAGGAGGACGAGCGGAACCTGAGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 31).
기준 # PTR9058로, 바이러스 균주 3a로부터 얻어진 401bp의 길이를 가지는 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGATATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCAGGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGCGGGGGTCCTATGTTCAACAGCAAAGGGGCCCAGTGTGGTTATCGCCGTTGCCGTGCTAGTGGAGTTCTACCTACCAGCTTCGGCAATACAATCACTTGCTACATCAAGGCCACAGCGGCTGCAAGGGCCGCAGGCCTCCGGAACCCGGACTTTCTTGTCTGCGGAGACGATCTAGTCGTGGTGGCTGAGAGTGACGGCGTCGACGAGGATGGGGCGGCCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 14).
기준 # PTR4162로, 바이러스 균주 4a/4d로부터 얻어진 401bp의 길이를 가지는 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGACATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCCGCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTACAACAGCAGGGGAGACCTTTGCGGAACTCGACGGTGCCGTGCAAGCGGCGTATTCACCACCAGCTTTGGGAACACACTGACGTGCTATCTTAAGGCCAGCGCGGCCATCAGGGCTGCAGGCCTAAAGGACTGCACCATGCTGGTCTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCGCTGAAAGCGATGGCGTGGAGGAGGACAACCGTGCGCTCAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 32).
이러한 긴 증폭산물을 보충하기 위하여, 다른 프라이머는 위에 기술된 각각의 플라즈마 샘플로부터 시작하여 더 짧은 증폭산물을 생성하기 위하여 설계된다. 동일한 전체 프로토콜은 "짧은" 증폭산물을 생성하며, 이용된 프라이머만 변경된다. 이용된 프라이머는 환자에게 감염되는 HCV의 유전자형 및/또는 아형에 따라 선택된다.
191 뉴클레오티드의 크기를 가지는 아형 1a/1b의 HCVs의 특정 증폭산물은 다음의 프라이머로 증폭된다:
- 서열 5'--[Btn]-TGA-CRA-CYA-GCT-GYG-GTA-AYA-CCC-T- 3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 10)의, 비오틴이 부착된 센스 프라이머(Biotinylated sense primer) "1a/1b 센스", 및
- 서열번호(SEQ ID NO) 9의 안티센스 프라이머 "HCV안티센스"(위에 도시).
기준 # PTR6719로, 바이러스 균주 1a/1b로부터 얻어진 191 뉴틀레오티드의 짧은 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-TGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 13)
108 뉴클레오티드의 크기를 가지는 아형 2의 HCVs의 특정 증폭산물은 다음의 프라이머로 증폭된다:
- 서열 5'-[Btn]-ATG-YTG-GTR-TGC-GGC-GAC-GAC-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 29)의, 비오틴이 부착된 센스 프라이머 "비오틴이 부착된 HCV 2 센스", 및
- 서열번호(SEQ ID NO) 9의, 안티센스 프라이머 "HCV안티센스"(위에 도시).
기준 # PTR7761로, 바이러스 균주 2로부터 얻어진 108 뉴틀레오티드의 짧은 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'- ATGCTGGTATGCGGCGACGACCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTGAGGAGGACGAGCGGAACCTGAGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC-3' 서열번호(SEQ ID NO) 33).
143 뉴클레오티드의 크기를 가지는 아형 3a의 HCVs의 특정 증폭산물은 다음의 프라이머로 증폭된다:
- 서열번호(SEQ ID NO) 8의, 비오틴이 부착된 센스 프라이머 "HCV 센스" (위에 도시), 및
- 서열 5'-GCA-GTA-AAG-CCG-YTC-CGT-GAG-3'(서열번호(SEQ ID NO) 11)의, 안티센스 프라이머 "3a rev".
기준 # PTR9058로, 바이러스 균주 3a로부터 얻어진 143 뉴틀레오티드의 짧은 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'-
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGATATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCAGGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 15).
175 뉴클레오티드의 크기를 가지는 아형 4a/4b의 HCVs의 특정 증폭산물은 다음의 프라이머로 증폭된다:
- 서열번호(SEQ ID NO) 8의, 비오틴이 부착된 센스 프라이머 "HCV 센스" (위에 도시), 및
- 서열 5'-AGG-TCT-CCC-YTG-CTG-TTG-TRC-AT-3' (서열번호(SEQ ID NO) 30)의, 안티센스 프라이머 "HCV 안티센스 3a rev".
기준 # PTR4162로, 바이러스 균주 4a/4b로부터 얻어진 175 뉴틀레오티드의 짧은 증폭산물의 예는 다음의 서열을 가진다:
5'- TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGACATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCCGCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTACAACAGCAGGGGAGACCT -3' (서열번호(SEQ ID NO) 34).
이전과 같이, 191, 108, 175 및 143 뉴클레오티드로 얻어진 "짧은" HCV 증폭산물은 아가로스 겔 전기 이동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분석되며, 시료(aliquots)가 생성되고 이용 전 -20℃로 저장된다.
최초의 바이러스 유전자형이 알려진 이러한 증폭산물은 라이브러리(library)의 형상으로 저장된다.
2) 15량체(mer)(15-mer) 또는 105량체(mer)(105량체(mer)-mer)의 비오틴이 부착된 올리고뉴클레오티드
5'말단에서 비오틴이 부착된 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드가 합성된다.
15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 선택된 HCV(아래에 도시)에 상호보완적이며, 다음의 서열을 가진다:
- 아형 1a/1b에 특이적인 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- GCT CCR GGA ACT GCA C-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 2)의 서열을 가지며;
- 아형 3a에 특이적인 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 [Btn]-CTT GAA CCG GAG GCC-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 5)의 서열을 가지고;
- 아형 4a/4d에 특이적인 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]-CTA YGT GGG CGG YCC-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 39)의 서열을 가진다.
아래에 나타낸 HCV 프로브의 상호보완적 서열을 포함하며 전체적으로 45 뉴클레오티드 또는 105량체(mer) 뉴클레오티드 둘 중 하나의 서열에 의한 측면으로 프레임화되고 5'말단에서 비오틴이 부착되는 긴 올리고뉴클레오티드는 프로브/표적 혼성화 테스트를 개선하기 위해 합성된다.
이용된 105량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열을 가진다:
- 아형 1a/1b에 특이적인 105량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- CCT CAC TTG CTA CAT CAA GGC CCA GGC AGC CTG TCG AGC CGC AGG - GCT CCR GGA ACT GCA C - CAT GCT CGT GTG TGG CGA CGA CTT AGT CGT TAT CTG TGA AAG TGC-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 3)의 서열을 가지며,
- 아형 3a에 특이적인 105량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- GAA CAG GAC ATC AGG GTG GAA GAG GAG ATA TAC CAA TGC TGT AAC - CTT GAA CCG GAG GCC - AGG AAA GTG ATC TCC TCC CTC ACG GAG CGG CTT TAC TGC GGG GGC-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 6)의 서열을 가진다.
HCV 서열 인식용 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계
HCV의 RNA 중합효소를 암호화하는 NS5b는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브를 설계하기 위해 표적화된다.
NS5b 영역(800개의 샘플의 뱅크(bank)를 나타내는)에서 증폭된 HCV 게놈 서열은 HCV의 각 유전자형 및/또는 아형에 대하여 매우 보존된 영역을 확인하기 위하여, 클러스탈W2 얼라이먼트 소프트웨어(clustalW2 alignment software) 및 메가5 피로게니 소프트웨어(Mega5 phylogeny software)를 이용하여 측정되고, 분석된다.
유전자형 및 선택적으로 주어진 아형의 바이러스 서열의 일반적인 인식을 허용하는 분리된 영역이 선택된다. 바이러스 유전자형 1a/1b의 전체 HCVs의 특정 검출을 허용하는 매우 보호된 영역이 확인되며, 선택된다. 동일한 방식으로, 바이러스 유전자형 2, 2a/2c, 2b, 3a 및 4a/4d의 HCVs의 특정 검출을 허용하는 영역이 확인되며, 선택된다. 선택된 각각의 영역의 상호보완적인 15량체(mer)의 올리고뉴클레오티드가 설계되며, 그 후, 다중-티올 올리고뉴클레오티드(multi-thiol oligonucleotides)가 아형 1a/1b, 2, 2a/2c, 2b, 3a 및 4a/4d의 특정 인식을 위해 선택된 서열에 기반하여 합성된다.
프로브 1a/1b를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-GTG-CAG-TCC-YGG-AGC (서열번호(SEQ ID NO) 1)이다. 이 프로브는 아형 1a 및 1b의 균주에 특이적이다.
프로브 2를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-TGG-CTY-TCT-GAG-ATG (서열번호(SEQ ID NO) 27)이다. 이 프로브는 아형 2의 균주에 특이적이다.
프로브 2a/2c를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-GGA-CTC-CTC-RGT-TCT (서열번호(SEQ ID NO) 35)이다. 이 프로브는 아형 2a 및 2c의 균주에 특이적이다.
프로브 2b를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-TAT-GGA-TTC-TTC-TGT (서열번호(SEQ ID NO) 36)이다. 이 프로브는 아형 2b의 균주에 특이적이다.
프로브 3a를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-GGC-CTC-CGG-TTC-AAG (서열번호(SEQ ID NO) 4)이다. 이 프로브는 아형 3a의 균주에 특이적이다.
프로브 4a/4d를 생성하기 위해 유지되는 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-GGR-CCG-CCC-ACR-TAG (서열번호(SEQ ID NO) 28)이다. 이 프로브는 아형 4a/4d의 균주에 특이적이다.
ELOSA(enzyme-linked oligosorbent assay)로 프로브/표적 혼성화의 평가
임의의 타입의 티올 프로브(알파 아노머(alpha anomer), 베타 아노머(beta anomer), 선형 또는 스템-루프(stem-loop)형 ("스네일(snail)"), 등)의 그라프팅은 최적화된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 말레이미드가 활성화된 마이크로판 웰(maleimide-activated microplate wells, Pierce)은 WB1 버퍼(0.1M Na2HPO4, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20 (w/v), pH 7.2)로 세척된다. 웰의 관능화는 주위 온도(AT)에서 2시간 동안 BB 버퍼(0.1M Na2HPO4, 0.15M NaCl, 10mM EDTA, pH 7.2)에서 100nM의 다중-티올 프로브(위에 기술된대로)로 이루어진다. 그 후, 웰은 AT에서 1시간 동안 BB(Pierce)에서 10μg.mL-1 시스테인-HCl 용액으로 포화된 WB1로 3번 세척되며, 다시 WB1로 3번 세척된다. mM
혼성화 테스트는 짧은 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 합성 표적 또는 긴(401 nt) 또는 짧은(191 nt 또는 143 nt) 실제 HCV 증폭산물로 수행된다. 합성 표적 및 증폭산물은 웰에 증착되기 전 150μL의 혼성화 버퍼(HB: 0.9M NaCl, 60mM NaH2PO4, 6 EDTA, pH 7.4, Denhardt 5X)로 희석된다. 95℃에서 10분의 추가 변성 단계는 마이크로벽에 전달되기 전 증폭 산물로 수행된다. 혼성화는 37℃에서 밤새 이루어진다. 벽은 AT에서 2분 동안 3번 WB2 버퍼(0.75M NaCl, 50mM NaH2PO4, 5mM EDTA, pH 7.4, SDS 0.1%)　로 세척되며, 다시 50℃에서 30분동안 세척된다.
검출 단계는 100μL의 어세이 버퍼(assay buffer)로 희석된 100μL/웰의 스트렙타이비딘-유로퓸(Streptavidin-Europium, Perkin Elmer)이 존재하여 웰의 AT에서 30분 동안 부화(incubation) 후 수행된다. 마지막으로 웰은 WB3 버퍼(WB1X, Perkin Elmer)로 6번 세척되며, 200μL의 신호 전개 버퍼(signal development buffer, "향상 버퍼(Enhancement Buffer)", Perkin Elmer)가 AT에서 5분 동안 각각의 웰에 첨가된다. 시분해 형광(time-resolved fluorescence)은 제조사의 프로토콜 (340nm에서 여기 및 615nm에서 방출)에 따라 Victor3 TM 1420 다중-라벨링 검출기(multi-labelling detector, "멀티라벨 카운터(multilabel counter)", Perkin Elmer)로 측정된다.
결과 1: 4개의 티올 관능기를 가지는 베타-아노머 선형 프로브(beta-anomeric linear probes)의 혼성화 테스트
4개의 티올 관능기를 가지는 베타-아노머 선형 3a 프로브는 100nM의 밀도로,위에 기술된 프로토콜에 따라 말레이미드기로 덮여진 지지체 위가 접합된다. 3a 프로브로 얻어진 결과는 도 8 및 도 9에 나타낸다.
ELOSA 테스트는 유지되는 프로브의 특이성을 확인하기 위하여 이용된 표적(짧은 15량체(mer) 및 105량체(mer) 합성 표적, 143nt 또는 191nt의 짧은 증폭산물, 401nt의 긴 증폭산물)의 특성 및 농도를 변경하여 이루어진다.
도 8에 나타낸 결과는 1/10, 1/100 및 1/1000의 희석에서 HCV 3a 유전자형에 특이적인 긴 증폭산물로 및 1/10, 1/100 및 1/1000의 희석에서, 비특이적 긴 증폭산물(HCV 1a/1b 유전자형에 대응하는)로 이루어진 ELOSA 테스트에 대응한다. 혼성화의 양성 제어(positive control)는 1000pM 및 5pM의 농도에서 3a 유전자형에 특이적인 합성 표적(15량체(mer)의)으로 수행된다. 혼성화의 음성 제어는 1000pM의 농도에서 비특이적인 합성 표적(15량체(mer)의)으로 또는 표적을 포함하지 않는 단독 HB(혼성화 버퍼)로 수행된다.
3a 아형에 "특이적"인 것으로 여겨지는 3a 프로브에 대하여, 프로브/표적 혼성화가 정량화될 수 있도록 "3a" 표적으로 얻어진 결과는 음성 제어로 얻어진 배경 노이즈(background noise)가 초과되게 할 필요성이 있다.
도 9에 나타낸 결과는 다음의 표적으로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다:
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 특이적인 3a 합성 표적,
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 비특이적인 1a/1b 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 3a 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b 비특이적인 긴 증폭산물,
- 1/100 및 1/1000의 희석에서, 3a 특이적인 짧은 증폭산물(specific short amplicon, 143nt),
- 1/100 및 1/1000의 희석에서, 1a/1b 비특이적인 짧은 증폭산물(191nt),
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 8 및 도 9에서 얻어진 결과는 본 발명에 따른 "3a" 프로브가 3a-특이적 합성 표적, 15량체(mer)(5pM의 농도를 가지는 표적) 또는 105량체(mer)(10pM의 농도를 가지는 표적)을 혼성화할 수 있으며, 플라즈마 유전자형 3a로부터 얻어지며 3a 유전자형(1/1000th 희석에서)에 특이적인, 401 nt의 긴 증폭산물 또는 143 nt의 짧은 증폭산물을 혼성화할 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 3a 프로브에 특이적이지 않은, 1a/1b 표적이 이들의 형상(15량체(mer) 또는 105량체(mer) 합성 표적, 짧은 증폭산물 191 nt 또는 긴 증폭산물 401 nt) 또는 이들의 농도(합성 표적에 대하여 1000pM 또는 증폭산물에 대하여 1/10th 희석)에 상관 없이 검출가능하게 혼성화되지 않는 것을 나타낸다.
도 10에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 4개의 티올 관능기를 가지는, 1a/1b 선형 프로브(위에 도시), 베타 아노머로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다.
도 10의 결과는 다음의 표적으로부터 얻어진다.
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 특이적인 1a/1b 합성 표적,
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 비특이적인 3a 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b HCV 유전형에 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 3a 비특이적인 긴 증폭산물,
- 1/100 및 1/1000의 희석에서, 1a/1b 특이적인 짧은 증폭산물(specific short amplicon, 191nt),
- 1/100 및 1/1000의 희석에서, 3a 비특이적인 짧은 증폭산물(143nt),
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 10에서 얻어진 결과는 본 발명에 따른 1a/1b 프로브가 1a/1b에 특이적인 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 합성 표적(10pM의 농도를 가지는 표적)을 혼성화할 수 있으며, 플라즈마 유전자형 1a/1b로부터 얻어지며 유전자형 1a/1b(1/1000th 희석에서)에 특이적인 191 nt의 짧은 증폭산물 및 유전자형 1a/1b(1/100th 희석에서)에 특이적인, 401 nt의 긴 증폭산물을 혼성화할 수 있는 것을 나타낸다.
또한, 이러한 결과는 1a/1b 프로브에 특이적이지 않은, 3a 표적이 이들의 형상(15량체(mer) 또는 105량체(mer) 합성 표적, 짧은 증폭산물 143 nt 또는 긴 증폭산물 401 nt) 또는 이들의 농도(합성 표적에 대하여 1000pM 또는 증폭산물에 대하여 1/10th 희석)에 상관 없이 검출가능하게 혼성화되지 않는 것을 나타낸다.
도 17에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 4개의 티올 관능기를 가지는, 베타 아노머 선형 1a/1b 프로브로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다.
도 17의 결과는 다음의 표적으로부터 얻어진다.
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 특이적인 1a/1b 합성 표적,
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 비특이적인 2a/2c, 2b, 3a 또는 4a/4d 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b HCV 유전형에 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 2a/2c, 2b, 3a 또는 4a/4d 비특이적인 긴 증폭산물,
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 18에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 50nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 4개의 티올 관능기를 가지는, 두 개의 베타 아노머 선형 1a/1b 프로브(서열번호(SEQ ID NO) 35의 2a/2c 및 서열번호(SEQ ID NO) 36의 2b)를 혼합하여 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다.
도 18의 결과는 다음의 표적으로부터 얻어진다.
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 2a/2c 및 2b 특이적인 합성 표적,
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 1a/1b, 3a 또는 4a/4d 비특이적인 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 2a/2b/2c HCV 유전형에 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b, 3a 또는 4a/4d 비특이적인 긴 증폭산물,
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 19에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 4개의 티올 관능기를 가지는, 베타 아노머 선형 3a 프로브로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다.
도 18의 결과는 다음의 표적으로부터 얻어진다.
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 3a 특이적인 합성 표적,
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 1a/1b, 2a/2b/2c 또는 4a/4d 비특이적인 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 3a HCV 유전형에 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b, 2a/2b/2c 또는 4a/4d 비특이적인 긴 증폭산물,
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 20에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 4개의 티올 관능기를 가지는, 베타 아노머 선형 4a/4d 프로브로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다.
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 4a/4d 특이적인 합성 표적,
- 10pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer)의 1a/1b, 2a/2b/2c 또는 3a 비특이적인 합성 표적(음성 제어),
- 1/100의 희석에서, 4a/4d HCV 유전형에 특이적인 긴 증폭산물(specific long amplicon),
- 1/100의 희석에서, 1a/1b, 2a/2b/2c 또는 3a 비특이적인 긴 증폭산물,
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB(혼성화 버퍼(hybridization buffer)).
증폭산물을 이용하여 수행되는 테스트에 대하여, 다른 기원이나 동일한 아형의 바이러스 균주로부터 시작하여 수행되는 3개의 독립적 실험 결과는 도 17~20에 나타낸다.
도 17~20에 나타낸 결과는 본 발명에 따른 각각의 프로브 1a/1b, 2a//2c, 2b, 3a 또는 4a/4d가 1a/1b, 2a//2c, 2b, 3a 또는 4a/4d에 특이적인 15량체(mer)의 합성 표적(10pM의 농도를 가지는 표적)으로 혼성화될 수 있으며, 동일한 유전자형(1/100th 희석에서)의 특정 증폭산물로 혼성화될 수 있다. 또한, 이러한 결과는 비-특이적 표적이 검출가능하게 혼성화되지 않는 것을 나타낸다.
결과 2: 티올 관능기 수의 영향 조사
또한, ELOSA 테스트는 이용된 프로브에서의 티올 관능기 개수가 변경되고 표적의 다른 타입 및 농도(15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 짧은 합성 표적, 143 nt 또는 191 nt의 짧은 증폭산물, 401 nt의 긴 증폭산물)를 테스트하여 수행된다.
도 11에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로 접합되는, 1, 2, 4, 6 또는 8개의 티올 관능기를 가지는, 베타 아노머 선형 1a/1b 프로브(위에 도시)로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다. 도 11의 결과는 다음의 표적으로부터 얻어진다:
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 1a/1b 특이적인 합성 표적,
- 10pM, 100pM 또는 1000pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 3a 비특이적인 합성 표적(음성 제어),
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
각각의 프로브/표적 혼성화 조건은 마이크로판에서 삼중으로 테스트된다. 테스트는 혼성화의 검출을 위해(3개의 다른 마이크로판) 프로브의 그라프팅 단계로부터 완전히, 3번 반복된다. 따라서, 본 출원서에 나타낸 결과는 9개의 측정에서 평균 값에 대응한다.
도 11에서 얻어진 결과는 티올이 존재하면, 1a/1b 프로브와 15량체(mer)의 1a/1b 특이적 합성 표적의 혼성화가 10pM의 표적으로부터 시작하여 검출가능한 것을 나타낸다. 105량체(mer)의 1a/1b 특이적 합성 표적의 검출은 프로브가 2개의 티올 관능기를 포함할 때 100pM 또는 프로브가 4, 6 또는 8개의 티올 관능기를 포함할 때 10pM의 표적의 농도를 차례로 필요로한다. 검출가능한 혼성화는 3a 표적 크기(15량체(mer) 또는 105량체(mer)) 또는 3a 표적의 농도(테스트된 최대 농도: 1000pM)에 상관 없이, 1a/1b 프로브에 비특이적인 3a 표적이 존재하여 관찰되지 않는다. 따라서, 이 결과는 접합된 올리고뉴클레오티드 프로브에 티올 관능기의 추가가 문제가 되는 표적의 검출 성능을 향상시킨다. 이용된 프로브에서 4개의 티올 관능기의 존재는 10pM의 농도에서 모든 합성 표적(15량체 또는 105량체)를 검출 할 수 있다.
결과 3: 그라프팅 밀도의 영향 조사
도 12, 13 및 14에 나타낸 결과는 위에 기술된 프로토콜에 따라 10, 25, 50 또는 100nM의 밀도로 말레이미드기로 덮여진 지지체 위에 접합되는, 1, 2, 또는 4개의 티올 관능기를 가지는, 베타 아노머 선형 1a/1b 프로브(위에 도시)로 수행되는 ELOSA 테스트에 대응한다. 도 12는 즉, 본 발명에 따른 단일 티올 화합물을 포함하는, 모노티올 프로브(monothiol probe)에 대하여 얻어진 결과를 나타낸다. 도 13은 즉, 본 발명에 따라 2개의 티올 화합물을 포함하는, 디티올 프로브(dithiol probe)에 대하여 얻어진 결과를 나타내며, 도 14는 즉, 본 발명에 따라 4개의 티올 화합물을 포함하는, 테트라티올 프로브(tetrathiol probe)에 대하여 얻어진 결과를 나타낸다.
각각의 경우, 혼성화 테스트는 다음의 표적으로 수행된다.
- 1000pM, 100pM 또는 10pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 1a/1b 특이적인 합성 표적,
- 1000pM, 100pM 또는 10pM의 농도에서, 15량체(mer) 또는 105량체(mer)의 3a 비특이적인 합성 표적(음성 제어),
- 표적을 포함하지 않는, 단독 HB.
도 12, 13 및 14에 나타낸 결과는 1a/1b 표적과 1a/1b 프로브의 혼성화의 특이성을 확인하므로, 검출가능한 혼성화는 3a 표적의 농도에 상관 없이, 3a가 존재하여, 관찰되지 않는다.
이러한 결과는
(1) 이용된 프로브에서 단일 티올의 존재가 105nt의 크기를 가지며, 검출되는 표적을 허용하지 않고,
(2) 2개의 티올 관능기에서 시작하여, 프로브 및 105nt의 표적(특히, 100pM의 표적에서 시작하여) 사이의 혼성화를 검출할 수 있으며,
(3) 우수한 결과는 테트라티올 프로브로 얻어지는 것을 확인한다.
반면, 모노티올 프로브의 그라프팅 밀도는 표적(15량체 및 105량체)일지라도 혼성화 신호에 매우 영향을 주기 않으므로 혼성화는 디티올 및 테트라티올 프로브의 경우 그라프팅 밀도에 투여 의존적(dose-dependent)이다. 우수한 프로브/표적 혼성화 신호(15량체 및 105량체는 100nM에서 접합된 테르라티올 프로브로 얻어진다.
금 표면으로 전극의 프로브/표적 혼성화의 측정
혼성화 테스트는 금표면으로 전극의 1a/1b 특이적 프로브 서열을 그라프팅하여 이루어진다.
테트라티올 프로브를 함유하는 올리고 뉴클레오티드의 서열번호(SEQ ID NO) 1은 셀의 금 표면으로 작용 전극 위에 그라프팅된다. 105량체 1a/1b 특이적 표적(서열번호(SEQ ID NO) 3의)의 혼성화는 표적의 3개의 다른 농도 : 1pM, 10pM 및 100pM으로 측정된다. 음성 제어는 서열번호(SEQ ID NO) 6(음성 제어)의 105량체 3a 특이적 표적으로 수행된다.
혼성화 반응은 다른 펄스 전압 전류(pulse voltammetry)에 의해 측정된다. 얻어진 결과는 도 15에 나타낸다.
y-축의 값은 전류 변화의 표준 값에 대응한다.
얻어진 결과는 전기화학(electrochemistry)에 의한 혼성화 테스트가 1pM의 타겟 농도에 민감하며 특이적인 것을 나타낸다. 또한 테스트가 100pM에서 수행될 때 보다 1pM에서 신호의 변화가 더 큰 것으로 나타난다. 타겟의 높은 농도에서, 전극 표면으로 타겟의 비특이적 흡착은 인식 반응의 효율을 감소시킨다. 전기화학법은 혼성화 반응의 정량화 측정을 허용하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 전기화학법은 매우 높은 민감도로 특이적인 예스/노 반응(yes/no response)을 제공한다.
예 4: 뎅기열 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스와 같은 플라비 바이러스의 검출에 적용
뎅기열 바이러스(항원형 1, 2, 3 및 4) 및 웨스트 나일 바이러스의 알려진 서열은 젠뱅크 데이터베이스(GenBank database)로부터 추출되며, 분석된다. 표 2은 정렬하기 위해 이용된 뎅기열 바이러스 및 웨스트나일 바이러스의 서열의 젠뱅크 등록 번호(GenBank accession numbers)를 나열한다:
바이러스 서열의 젠뱅크 등록 번호
뎅기열 1 (8 균주)
 FJ882517, FJ882552, EU482480, FJ639683, HM181967, AY726549, GU131762, GU131982
뎅기열 2 (17 균주) GQ398257, HM582109, HM582110, HM582116, HM582117, AY744150, AY744149, AY744148, AY744147, EU056812, AF169686, AF169683, AF169687, AF169682, GU131896, DQ181803, EU073981
뎅기 3 (34 균주)
 GQ252678, GU131951, EU482566, GQ868574, GQ868617, FJ882577, GU131868, FJ024465, HM181974, HM181973, GQ199870, AY770511, GU370053, GQ199888, GU131939, GU131937, GU131934, HM631854, GU131905, GU189648, EU660409, DQ109373, DQ109368, DQ109310, AY676351, AY676350, FJ744740, FJ744730, DQ109400, DQ109348, GQ868593, AB214880, AY744677, EF629370
뎅기 4 (20 균주)
 AY618992, AY618990, AY858049, AY618993, GQ398256, AF289029, EU854301, EU073983, GU289913, AF326573, FJ882597, GQ199885, GQ199884, GQ199882, GQ868582, GQ868584, AY762085, AY618989, AY618988, EF457906
웨스트나일 (15 균주) GQ851607, GQ851606, AY369441, AY490240, AY274504, GQ851602, GQ851603, DQ256376, DQ318019, EF429199, EF429200, JN858070, AY277251, FJ159131, FJ159129
뎅기열 또는 웨스트 나일 서열의 인식을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계
정렬 및 서열 비교는 다음과 같이 형성되는 4개의 영역을 허용하는 클러스탈1W2(clustalW2) 및 메가5(Mega5) 소프트웨어를 이용하여 이루어진다:
- 2개는 뎅기열 및 웨스트 나일 바이러스의 모든 균주 중에서 및 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 진드기매개뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus), 황열병 바이러스(yellow fever virus) 및 우수투 바이러스(usutu virus)와 같은 다른 플라비바이러스 중에서 보존되고,
- 1개는 뎅기열 바이러스 중에서 보존되며,
- 1개는 웨스트 나일 바이러스 중에서 보존된다.
이러한 영역은 생물학적 샘플에서, 플라비 바이러스의 일반적인 검출 또는 뎅기열 아형 4의 뎅기열 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스의 특이적 검출을 허용할 목적으로, 본 발명에 따른 프로브를 설계하는데 이용된다.
아래의 표 3에 나타낸 프로브 1~3는 일반적으로 플라비바이러스(뎅기열 및 웨스트 나일 플라비바이러스를 포함하는)의 검출을 허용한다. 프로브 4는 항원형에 상관 없이, 뎅기열 바이러스에 특이적이다. 프로브 5는 뎅기열 바이러스의 항원형 4에 특이적이다. 프로브 6는 웨스트 나일 바이러스에 특이적이다.
프로브 서열 특이성 Size SEQ ID
프로브 1 5'-GCT CCC ARC CAC AT-3' 유전자형 14량체 서열번호(SEQ ID NO) 16
프로브 2 5'-AAC CAT CTR TCT TC-3' 유전자형 14량체 서열번호(SEQ ID NO) 17
프로브 3 5'-AGC CAC ATG WAC CA -3' 유전자형 14량체 서열번호(SEQ ID NO) 40
프로브 4 5'-CTT CYC CTT CYA CTC-3' 뎅기열 15량체 서열번호(SEQ ID NO) 18
프로브 5 5'-CAC TCC ACT CCA TGA-3' 뎅기열 4 15량체 서열번호(SEQ ID NO) 41
프로브 6 5'-CKC CTC CTG ART TCT-3' 웨스트나일 바이러스 15량체 서열번호(SEQ ID NO) 19
프로브 1~6의 인식 특이성을 테스트하는 표적의 설계
확인된 6개의 영역을 각각 포함하는 증폭산물은 Scaramozzino 외(Scaramozzino N. 외. Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. 2001. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927)에 의해 이전에 기술된 프라이머 및 프로토콜을 이용하여, 표 2에 언급된 서열로부터 시작하여, 단순한 PCR을 수행하여 제조된다.
PCR에 의한 1차 증폭(Primary amplification)은 다음으로 이루어진다:
- MAMD 센스 프라이머: [Btn]-5'-AAC-ATG-ATG-GGR-AAR-AGR-GAR-AA-3'(또는 [Btn]- 서열번호(SEQ ID NO) 20), 및
- cFD2 안티센스 프라이머(서열번호(SEQ ID NO) 21) : 5'-GTG-TCC-CAG-CCG-GCG-GTG-TCA-TCA-GC -3'.
이러한 증폭은 얻어지는 263bp의 1차 증폭을 유도한다.
바이러스 부하(viral load)가 배우 낮을 때, 2차 PCR은 매트릭스(matrix)로서 제 1 PCR로 형성된 증폭 생성물을 이용하여 수행된다. 바람직하게 "헤미네스트된(heminested)" PCR은 민감도에 충분한 이득을 준다.
기준 번호 FJ882517를 가지는, 뎅기열 바이러스의 균주로부터 시작하여 증폭 후 얻어진 263bp의 증폭산물의 예는 5'-AACATGATGGGGAAGAGAGAGAAAAAACTAGGAGAGTTCGGAAAGGCAAAAGGAAGTCGTGCAATATGGTACATGTGGCTGGGAGCACGCTTTCTAGAGTTCGAAGCTCTTGGTTTCATGAACGAAGATCACTGGTTCAGCAGAGAGAATTCACTCAGCGGAGTGGAAGGAGAAGGACTCCACAAACTTGGATATATACTCAGAGACATATCAAAGATTCCAGGGGGAAACATGTATGCAGATGACACAGCCGGATGGGACAC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 23)의 서열을 가진다.
기준 번호 EF429200/H442를 가지는, 웨스트 나일 바이러스의 균주로부터 시작하여 증폭 후 얻어진 263bp의 증폭산물의 예는 5'-AACATGATGGGAAAGAGAGAGAAGAAGCCTGGAGAGTTCGGCAAGGCTAAAGGCAGCAGAGCCATCTGGTTCATGTGGCTGGGGGCTCGTTTCCTGGAGTTTGAAGCTCTCGGATTCCTCAATGAAGACCACTGGCTGGGTAGGAAGAACTCAGGAGGAGGAGTTGAAGGCTTAGGACTGCAGAAGCTTGGGTACATCTTGAAGGAAGTTGGGACAAAGCCTGGAGGAAAGATTTACGCCGATGATACCGCAGGCTGGGACAC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 25)의 서열을 가진다.
PCR에 의한 2차 증폭은 다음의 매트릭스로 상기 1차 증폭을 이용하여, Scaramozzino, 외에 의해 설명된 프로토콜에 따라 선택적으로 수행될 수 있다:
- FS778 센스 프라이머: [Btn] 5'- AAR-GGH-AGY-MCD-GCH-ATH-TGG-T- 3'(또는 [Btn]- 서열번호(SEQ ID NO) 22), 및
- cFD2 안티센스 프라이머 (서열번호(SEQ ID NO) 21): 5'-GTG-TCC-CAG-CCG-GCG-GTG-TCA-TCA-GC -3'.
이러한 증폭은 얻어지는 215bp의 2차 증폭을 유도한다.
기준 번호 FJ882517를 가지는, 뎅기열 바이러스의 균주로부터 시작하여 증폭 후 얻어진 215bp의 증폭산물의 예는 5'-AAAGGAAGTCGTGCAATATGGTACATGTGGCTGGGAGCACGCTTTCTAGAGTTCGAAGCTCTTGGTTTCATGAACGAAGATCACTGGTTCAGCAGAGAGAATTCACTCAGCGGAGTGGAAGGAGAAGGACTCCACAAACTTGGATATATACTCAGAGACATATCAAAGATTCCAGGGGGAAACATGTATGCAGATGACACAGCCGGATGGGACAC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 24)의 서열을 가진다.
기준 번호 EF429200/H442를 가지는, 웨스트 나일 바이러스의 균주로부터 시작하여 증폭 후 얻어진 215bp의 증폭산물의 예는 5'-AAAGGCAGCAGAGCCATCTGGTTCATGTGGCTGGGGGCTCGTTTCCTGGAGTTTGAAGCTCTCGGATTCCTCAATGAAGACCACTGGCTGGGTAGGAAGAACTCAGGAGGAGGAGTTGAAGGCTTAGGACTGCAGAAGCTTGGGTACATCTTGAAGGAAGTTGGGACAAAGCCTGGAGGAAAGATTTACGCCGATGATACCGCAGGCTGGGACAC-3'(서열번호(SEQ ID NO) 26)의 서열을 가진다.
다른 실시예에서, 증폭산물은 비대칭 RT-PCR에 의해 플라비바이러스, 뎅기열 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스의 바이러스 RNAㄴ로부터 제조된다. 바이러스 RNAs는 생체내에 생성된 뎅기열 바이러스(1-4) 및 웨스트 나일 바이러스(아메리카인 기원 NY 또는 아프리카인 기원 Af의)로부터 추출된다. 263bp의 증폭산물은 위에 기술된 RNA의 각각의 샘플로부터 시작하여, RT-PCR에 의해, 플라비바이러스의 NS5 바이러스 영역으로부터 제조된다. 역전사(reverse-transcription, AT) 단계를 수행하기 위하여, 5μL의 RNA는 10분동안 72℃에서 변성되고, 4μL의 5X First Strand Buffer(Invitrogen), 2μL의 10X 헥사뉴클레오티드 혼합(Hexanucleotide Mix, Roche), 2μL의 10mM dNTP 혼합(Invitrogen) 및 200U의 SuperScript® II Reverse Transcriptase(Invitrogen)이 20μL의 전체 부피로 존재하여 역전사된다. 역전사 조건은 다음에 따른다: 25℃에서 10분, 42℃에서 60분 및 95℃에서 10분.
이 후, 5 마이크로리터(microlitres)의 cDNA는 프라이머를 이용하여 PCR(중합효소 연쇄 반응, polymerase chain reaction)에 의해 증폭된다:
- 비오틴이 부착된 "MAMD" 센스 플라비바이러스(서열: [Btn]- AAC ATG ATG GGR AAR AGR GAR AA(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 20)의), 및
- "cFD2" 안티센스 플라비바이러스"(서열 GTG TCC CAG CCG GCG GTG TCA TCA GC(서열번호(SEQ ID NO) 21)의)(Scaramozzino N. 외, 2001, Journal of Clinical Microbiology 39: 1922~1927에 도시).
비대칭 증폭 반응(asymmetric amplification reaction)은 다음을 포함하는 50μL의 반응 혼합물로 이루어진다: MgCl2 없이 1X PCR 버퍼(Invitrogen), 0.2μM의 MAMD, 0.02μM의 cFD2, 1.5mM의 MgCl2(Invitrogen), 0.2mM dNTP mix(Invitrogen) 및 1.5U Taq 중합효소(Polymerase)(Invitrogen). PCR 조건은 다음에 있다: 95℃에서 5분, 40 사이클(변성: 40초, 95℃; 혼성화: 40초, 53℃; 신장: 50초, 72℃) 및 72℃에서 10분의 최종 연장. 얻어진 증폭산물은 아가로스 겔 전기 이동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분석되며, 시료(aliquots)가 생성되고 이용 전 -20℃로 저장된다. 최초의 바이러스 유전자형이 알려진 이러한 증폭산물은 라이브러리(library)의 형상으로 저장된다.
5'말단에서 비오틴이 부착된 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 위에 선택된 프로브, 즉 플라비바이러스를 검출하는 일반적인 프로브(generic probe) 3, 웨스트 나일 바이러스를 검출하는 일반적인 프로브 및 뎅기열 바이러스의 항원형 4에 특이적인 프로브에 상호보완적이다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 다음의 서열을 가진다:
- 플라비바이러스에 특이적인 14량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- TGG TWC ATG TGG CT-3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 43)의 서열을 가지며;
- 웨스트나일 바이러스에 특이적인 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- AGA AYT CAG GAG GMG -3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 42)의 서열을 가지고;
- 뎅기열 바이러스의 항원형 4에 특이적인 15량체(mer)의 합성 올리고뉴클레오티드는 5' [Btn]- TCA TGG AGT GGA GTG -3'(또는 [Btn]-서열번호(SEQ ID NO) 44)의 서열을 가진다.
혼성화 테스트는 일반적으로 플라비바이러스를 인식하는 프로브 3(도 21에 도시), 특히 뎅기열의 항원형 4를 인식하는 프로브 5(도 22에 도시), 및 웨스트나일 바이러스를 인식하는 프로브 6(도 23에 도시)으로 수행된다. 4개의 티올 관능기를 가지는 프로브는 위에 기술된 프로토콜에 따라 말레이미드기로 덮여진 지지체 위로, 200nM의 밀도로, 그라프팅된다. 그 후, ELOSA 테스트는 유지되는 프로브의 특이성을 확인하기 위하여 프로브 3에 대하여 1/10의 희석 및 프로브 5 및 프로브 6에 대하여 1/50의 희석에서, 뎅기열 바이러스의 항원형 1, 2, 3 또는 4, 미국인 기원(NY) 또는 아프리카인(Af)의 웨스트 나일 바이러스의 항원형 1, 2, 3 또는 4 또는 C형 간염 바이러스(긴 3a 증폭산물)의 항원형 1, 2, 3 또는 4로부터 제조된 증폭산물을 이용하여 수행된다. 도 21, 22 및 23의 다이어그램에서, 값 "샘플/배경 노이즈(samples/background noise)"이 표적을 포함하지 않고, 단독 혼성화 버퍼에 대응하는, 제어(HB)를 위해 측정된 횟수에 대한 각각의 샘플을 측정한 횟수의 비율을 측정하여 얻어진다. 이러한 테스트에 이용된 뎅기열 바이러스 및 웨스트나일 바이러스의 증폭산물은 위에 기술된 비대칭 RT-PCR의 방법으로 얻어진다.
도 21, 22 및 23에 나타낸 결과는 플라비바이러스에 일반적인 프로브, 뎅기열에 특이적인 프로브 4 및 웨스트 나일에 일반적인 프로브만 문제가 되는 바이러스에 대응하는 증폭산물로 충분히 혼성화된다.
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE MONTPELLIER UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON ETABLISSEMENT FANCAIS DU SANG <120> MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES COMPRISING THIOL FUNCTIONS AND THE USE OF SAME FOR THE DETECTION OF NUCLEIC ACIDS <150> 1253122 <151> 2012-04-04 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 1 gtgcagtccy ggagc 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 2 gctccrggac tgcac 15 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 3 cctcacttgc tacatcaagg cccaggcagc ctgtcgagcc gcagggctcc gggactgcac 60 catgctcgtg tgtggcgacg acttagtcgt tatctgtgaa agtgc 105 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 4 ggcctccggt tcaag 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 5 cttgaaccgg aggcc 15 <210> 6 <211> 105 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 6 gaacaggaca tcagggtgga agaggagata taccaatgct gtaaccttga accggaggcc 60 aggaaagtga tctcctccct cacggagcgg ctttactgcg ggggc 105 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 7 ccaagcacga tgt 13 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 8 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg a 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 9 ggcggaattc ctggtcatag cctccgtgaa 30 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 10 tgacracyag ctgyggtaay accct 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 11 gcagtaaagc cgytccgtga g 21 <210> 12 <211> 401 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 12 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actcaacggt cactgagaat gacatccgtg 60 ttgaggagtc aatttaccaa tgttgtgacc tagcccccga agccagacag gccataaggt 120 cgctcacaga gcggctttac atcgggggtc ccctgactaa ttcaaaaggg cagaactgcg 180 gctatcgccg gtgccgcgcg agcggtgtgc tgacgaccag ctgcggtaat accctcacat 240 gttacttgaa ggcctctgcg gcctgtcgag ctgcaaagct ccaggactgc acaatgctcg 300 tgtgcggaga cgaccttgtc gttatctgtg aaagcgcggg aacccargag gatgcggcga 360 gcctacgagt cttcacggag gctatgacca ggaattccgc c 401 <210> 13 <211> 191 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 13 tgacgaccag ctgcggtaat accctcacat gttacttgaa ggcctctgcg gcctgtcgag 60 ctgcaaagct ccaggactgc acaatgctcg tgtgcggaga cgaccttgtc gttatctgtg 120 aaagcgcggg aacccargag gatgcggcga gcctacgagt cttcacggag gctatgacca 180 ggaattccgc c 191 <210> 14 <211> 401 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 14 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actcgactgt cactgaacag gatatcaggg 60 tggaagagga gatataccaa tgctgtaatc ttgaaccgga ggccaggaag gtgatctcct 120 ccctcacgga gcggctttac tgcgggggtc ctatgttcaa cagcaaaggg gcccagtgtg 180 gttatcgccg ttgccgtgct agtggagttc tacctaccag cttcggcaat acaatcactt 240 gctacatcaa ggccacagcg gctgcaaggg ccgcaggcct ccggaacccg gactttcttg 300 tctgcggaga cgatctagtc gtggtggctg agagtgacgg cgtcgacgag gatggggcgg 360 ccctgagagc cttcacggag gctatgacca ggaattccgc c 401 <210> 15 <211> 143 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 15 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actcgactgt cactgaacag gatatcaggg 60 tggaagagga gatataccaa tgctgtaatc ttgaaccgga ggccaggaag gtgatctcct 120 ccctcacgga gcggctttac tgc 143 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 16 gctcccarcc acat 14 <210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 17 aaccatctrt cttc 14 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 18 cttcyccttc yactc 15 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 19 ckcctcctga rttct 15 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 20 aacatgatgg graaragrga raa 23 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 21 gtgtcccagc cggcggtgtc atcagc 26 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 22 aargghagym cdgchathtg gt 22 <210> 23 <211> 263 <212> DNA <213> Dengue virus 1 <400> 23 aacatgatgg ggaagagaga gaaaaaacta ggagagttcg gaaaggcaaa aggaagtcgt 60 gcaatatggt acatgtggct gggagcacgc tttctagagt tcgaagctct tggtttcatg 120 aacgaagatc actggttcag cagagagaat tcactcagcg gagtggaagg agaaggactc 180 cacaaacttg gatatatact cagagacata tcaaagattc cagggggaaa catgtatgca 240 gatgacacag ccggatggga cac 263 <210> 24 <211> 215 <212> DNA <213> Dengue virus 1 <400> 24 aaaggaagtc gtgcaatatg gtacatgtgg ctgggagcac gctttctaga gttcgaagct 60 cttggtttca tgaacgaaga tcactggttc agcagagaga attcactcag cggagtggaa 120 ggagaaggac tccacaaact tggatatata ctcagagaca tatcaaagat tccaggggga 180 aacatgtatg cagatgacac agccggatgg gacac 215 <210> 25 <211> 263 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 25 aacatgatgg gaaagagaga gaagaagcct ggagagttcg gcaaggctaa aggcagcaga 60 gccatctggt tcatgtggct gggggctcgt ttcctggagt ttgaagctct cggattcctc 120 aatgaagacc actggctggg taggaagaac tcaggaggag gagttgaagg cttaggactg 180 cagaagcttg ggtacatctt gaaggaagtt gggacaaagc ctggaggaaa gatttacgcc 240 gatgataccg caggctggga cac 263 <210> 26 <211> 215 <212> DNA <213> West Nile virus <400> 26 aaaggcagca gagccatctg gttcatgtgg ctgggggctc gtttcctgga gtttgaagct 60 ctcggattcc tcaatgaaga ccactggctg ggtaggaaga actcaggagg aggagttgaa 120 ggcttaggac tgcagaagct tgggtacatc ttgaaggaag ttgggacaaa gcctggagga 180 aagatttacg ccgatgatac cgcaggctgg gacac 215 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 27 tggctytctg agatg 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 28 ggrccgccca crtag 15 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 29 atgytggtrt gcggcgacga c 21 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 30 aggtctcccy tgctgttgtr cat 23 <210> 31 <211> 401 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 31 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actcaactgt cactgagaga gacatcagaa 60 ccgaggagtc catataccag gcctgctccc taaccgagga ggctcgcacc gccatacact 120 cgctgactga gaggctatac gtgggagggc ccatgctcaa tagcaaaggc cagacctgcg 180 ggtacaggcg ttgccgcgcc agcggggtgc tcaccactag catgggaaac accattacgt 240 gctatgtgaa agctctagcg gcatgcaagg ccgcagggat agtagcgccc acgatgctgg 300 tatgcggcga cgacctggtc gtcatctcag aaagccaggg gactgaggag gacgagcgga 360 acctgagagt cttcacggag gctatgacca ggaattccgc c 401 <210> 32 <211> 401 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 32 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actccactgt aaccgaaaga gacatcaggg 60 tcgaggagga ggtctatcag tgttgtgacc tagagcccga agcccgcaag gtaatatccg 120 ccctcacaga gagactctac gtgggcggtc ccatgtacaa cagcagggga gacctttgcg 180 gaactcgacg gtgccgtgca agcggcgtat tcaccaccag ctttgggaac acactgacgt 240 gctatcttaa ggccagcgcg gccatcaggg ctgcaggcct aaaggactgc accatgctgg 300 tctgtggcga cgacttagtc gttatcgctg aaagcgatgg cgtggaggag gacaaccgtg 360 cgctcagagc cttcacggag gctatgacca ggaattccgc c 401 <210> 33 <211> 108 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 33 atgctggtat gcggcgacga cctggtcgtc atctcagaaa gccaggggac tgaggaggac 60 gagcggaacc tgagagtctt cacggaggct atgaccagga attccgcc 108 <210> 34 <211> 175 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 34 tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg actccactgt aaccgaaaga gacatcaggg 60 tcgaggagga ggtctatcag tgttgtgacc tagagcccga agcccgcaag gtaatatccg 120 ccctcacaga gagactctac gtgggcggtc ccatgtacaa cagcagggga gacct 175 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 35 ggactcctcr gttct 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 36 tatggattct tctgt 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 37 agaacygagg agtcc 15 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 38 acagaagaat ccata 15 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 39 ctaygtgggc ggycc 15 <210> 40 <211> 14 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 40 agccacatgw acca 14 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 41 cactccactc catga 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 42 agaaytcagg aggmg 15 <210> 43 <211> 13 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 43 tggwcatgtg gct 13 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequences <400> 44 tcatggagtg gagtg 15

Claims (18)

  1. 개질된 올리고뉴클레오티드(Modified oligonucleotide)로서,
    다음의 화학식(XIIb):
    (XIIb) N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I'b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I'b)y'; 또는
    다음의 화학식 (XIIIb):
    (Ic')-(I'b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I'b)y'-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I'b)y'';에 대응하며,
    상기 화학식(XIIb) 또는 상기 화학식(XIIIb)에서,
    N1,…, Nn은 서로 독립적으로, 뉴클레오티드를 나타내며,
    M1,…, Mm은 서로 독립적으로, 뉴클레오티드를 나타내고,
    (I'b)는 다음의 화학식의 화합물이며:
    Figure pct00064

    (Ic')는 다음의 화학식의 화합물이고:
    Figure pct00065

    n은 4~100의 정수이고,
    m은 4~100의 정수이며,
    y은 2~12의 정수이고,
    p는 0 또는 1이며,
    p가 1일 때 y'는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y'는 0이고,
    p가 1일 때 y''는 0~12의 정수이며, p가 0일 때 y''는 0이며,
    정수 (y + y') 또는 (y + y' + y'')의 합계는 12이하이며,
    X는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups) 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되며,
    Y는 선형 또는 분지형의 C1-C12 알킬기(alkyl groups), C1-C12 아미노알킬기(aminoalkyl groups), C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), C3-C12 사이클로알킬기(cycloalkyl groups), 산소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups) 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되고,
    Z는 C1-C12 알콕시기(alkoxy groups), 산소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups) 또는 질소-함유 C3-C12 사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups), C1-C12 NCO-알킬기(NCO-alkyl groups), C1-C12 CON-알킬기(CON-alkyl groups)로부터 선택되며,
    W는 C1-C12 알칸 트리일기(alkane triyl groups), C6-C18 아릴 트리일기(aryl triyl groups) 및 C6-C18 아르알칸 트리일기(aralkane triyl groups)로부터 선택되며,
    R은 H이거나, C1-C12 아실(acyl), C1-C12 S-알킬, C6-C12 S-아릴(aryl), S-2-피리딘(pyridine), 산소-함유 C1-C12 S-헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 질소-함유 C1-C12 S-헤테로알킬(heteroalkyl), C3-C12 S-사이클로알킬(cycloalkyl), 산소-함유 C3-C12 S-사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups) 또는 질소-함유 C3-C12 S-사이클로헤테로알킬기(cycloheteroalkyl groups)로부터 선택되며,
    R1은 2-시아노에틸(cyanoethyl)기 또는 R'1R'2R'3SiCH2CH2기로부터 선택되고, R'1R'2R'3SiCH2CH2에서 R'1, R'2 및 R'3는 동일하거나 다를 수 있으며 1~12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬 및 C6-C12 아릴로부터 선택되는, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    다음의 화학식에 대응하며:
    Figure pct00066

    상기 화학식에서,
    n, y, N1,…,Nn-1, X, Y, Z, W 및 R은 상기 제1항의 정의와 동일하며, Bn는 n-차(n-th) 뉴클레오티드의 염기(base)인, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서,
    다음의 화학식에 대응하며:
    Figure pct00067

    n, y, N2,…,Nn, X, Y, Z, W 및 R은 상기 제1항의 정의와 동일하며, B1는 1차(1st) 뉴클레오티드의 염기(base)인, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 질병의 원인이 되거나 질병에 포함되는 바이러스, 박테리아 또는 유전자에 특이한, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 상기 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)은:
    - C형 간염 바이러스(hepatitis C virus; HCV)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 35 또는 서열번호(SEQ ID NO) 36;
    - 플라비바이러스(flaviviruses)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17 또는 서열번호(SEQ ID NO) 40;
    - 뎅기열 바이러스(dengue virus)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 18 또는 서열번호(SEQ ID NO) 41;
    - 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus; WNV)에 특이적인 서열번호(SEQ ID NO) 19;로부터 선택되는, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열 (N1-N2-…-Nn-1-Nn) 및 선택적으로 상기 뉴클레오티드 서열 (M1-M2-…-Mm-1-Mm)은 알파 아노머(alpha anomer), 베타 아노머(beta anomer), 선형 또는 "스네일(snail)" 타입의 구조를 가지는, 개질된 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항에 따른 적어도 하나의 개질된 뉴클레오티드가 접합된 기판으로서, 상기 기판은 상기 개질된 뉴클레오티드의 접합을 허용하는 기질로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역을 포함하는, 기판.
  8. 제7항에 있어서,
    - 상기 수용 영역은 금 또는 백금 필름으로 코팅되며, 상기 기판은 금속, 바람직하게 구리 또는 티타늄이거나,
    - 상기 수용 영역은 상기 수용 영역의 표면 위로 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기(haloacetamide functions), 바람직하게 말레이미드 관능기(maleimide functions) 또는 아크릴아미드 관능기(acrylamide functions)를 포함하며, 상기 기판은 플라스틱, 바람직하게 폴리스티렌(polystyrene)인, 접합된 기판.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 기판은 비평면(non-planar)이며, 바람직하게 마이크로입자 또는 나노입자인, 접합된 기판.
  10. 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법으로서,
    - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 개질된 뉴클레오티드에 의해 형성된 적어도 하나의 검출 프로브로 상기 표적 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    - 상기 생물학적 샘플로부터 적어도 하나의 근원 핵산(source nucleic acid)을 얻는 단계;
    - 상기 표적 핵산의 증폭에 의해, 상기 근원 핵산으로부터 증폭산물(amplicon)을 생성하는 단계; 및
    - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 상기 개질된 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 상기 적어도 하나의 검출 프로브와 상기 증폭산물의 혼성화(hybridization)를 검출하는 단계;를 포함하는, 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스의 유전자형(genotype) 및/또는 아형(subtype)을 측정하기 위하여,
    - 상기 증폭산물은 바이러스의 유전자형 및/또는 아형에 관련된 바이러스 정보(virus bearing information)의 게놈 영역(genomic region)에 대응하는, 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭에 의해 생성되며,
    - 상기 바이러스 유전자형 및/또는 아형에 특이적인 프로브로 검출이 이루어지는, 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    뉴클레오티드 프라이머의 혼합물로, 바람직하게 다음의 프라이머 쌍으로 바이러스의 유전자형 및/또는 아형에 관련된 바이러스 정보의 게놈 영역에 대응하는 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시켜, 상기 증폭산물의 제조 단계가 수행되는, 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 방법:
    - HCV의 모든 유전자형으로부터 시작하여 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 9;
    - HCV의 유전자형 1a/1b으로부터 시작하여 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 10 및 서열번호(SEQ ID NO) 9;
    - HCV의 유전자형 2로부터 시작하여 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 29 및 서열번호(SEQ ID NO) 9;
    - HCV의 유전자형 3a로부터 시작하여 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 11;
    - HCV의 유전자형 4a/4b로부터 시작하여 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 8 및 서열번호(SEQ ID NO) 30;
    - 플라비바이러스로부터 증폭산물이 생성될 때, 서열번호(SEQ ID NO) 20 및 서열번호(SEQ ID NO) 21, 또는 서열번호(SEQ ID NO) 22 및 서열번호(SEQ ID NO) 21.
  14. 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 키트(kit)로서,
    - 제1항 내지 제6항 중 한 항에 따른 적어도 하나의 개질된 올리고뉴클레오티드 및 상기 개질된 올리고뉴클레오티드의 접합을 허용하는 기질로 코팅된 적어도 하나의 수용 영역; 또는
    - 제7항 내지 제9항에 따른 적어도 하나의 접합된 기판;을 포함하며,
    바람직하게, 상기 수용 영역은 금 또는 백금으로 코팅되거나, 상기 수용 영역의 표면 위에 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합 또는 할로아세트아미드 관능기, 바람직하게 말레이미드 관능기 또는 아크릴아미드 관능기를 포함하는, 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 키트.
  15. 서열번호(SEQ ID NO) 1, 서열번호(SEQ ID NO) 4, 서열번호(SEQ ID NO) 27, 서열번호(SEQ ID NO) 28, 서열번호(SEQ ID NO) 16, 서열번호(SEQ ID NO) 17, 서열번호(SEQ ID NO) 18, 서열번호(SEQ ID NO) 19, 서열번호(SEQ ID NO) 35, 서열번호(SEQ ID NO) 36, 서열번호(SEQ ID NO) 40 및 서열번호(SEQ ID NO) 41로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 개질된 올리고뉴클레오티드의 이용, 제15항에 따른 올리고뉴클레오티드의 이용 또는 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 표적 핵산을 검출하는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 접합된 기판(grafted substrate)의 이용.
  17. 제16항에 있어서,
    바이러스 균주, 바람직하게 간염 바이러스(hepatitis viruses) 또는 아르보바이러스(arboviruses), 바람직하게 플라비바이러스과(Flaviviridae), 토가바이러스과(Togaviridae) 또는 분히아바이러스(Bunhyaviridae)를 진단(diagnostics), 유전자형 분석(genotyping) 또는 서열화(sequencing)하는, 이용.
  18. 제17항에 있어서,
    HCV, HBV, 뎅기열 바이러스(dengue viruses) 또는 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)를 진단(diagnostics), 유전자형 분석(genotyping) 또는 서열화(sequencing)하는, 이용.
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