JP2015514402A - チオール官能基を含む修飾オリゴヌクレオチドおよび核酸検出のためのこれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’(XIIb)
または式(XIIIb):
(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y”(XIIIb)
[式中、
N1、…、Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…、Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(I’b)は、式:
(Ic’)は、式:
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
pは、0または1を表し、
pが値1を有する場合、y’は0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y’は0に等しく、
pが値1を有する場合、y”は0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y”は0の値を有し、
整数(y+y’)または(y+y’+y”)の合計は、2から12の間に含まれ、
Xは、直鎖または分岐鎖の、C1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Yは、直鎖または分岐鎖の、C1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Zは、C1−C12アルコキシ基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基、C1−C12NCO−アルキル基、C1−C12CON−アルキル基から選択され、
Wは、C1−C12アルカントリイル基、C6−C18アリールトリイル基およびC6−C18アラルカン(aralkane)トリイル基から選択され、好ましくは、CH、CCH3、CCH2CH3、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイルから選択される基であり、
Rは、HまたはC1−C12アシル、C1−C12S−アルキル、C6−C12S−アリール、S−2−ピリジン、酸素含有または窒素含有C1−C12S−ヘテロアルキル、C3−C12S−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有C3−C12S−シクロヘテロアルキル基から選択され、ならびに、
R1は、2−シアノエチルまたはR’1R’2R’3SiCH2CH2基(式中R’1、R’2およびR’3は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分岐鎖の、C1−12アルキルおよびC6−C12アリールから選択される基を表す)から選択される]
に対応する修飾オリゴヌクレオチドに関する。
に対応する。
に対応する。
−C型肝炎ウイルス(HCV)に特異的な配列番号1、配列番号4、配列番号27、配列番号28、配列番号35もしくは配列番号36の配列、
−フラビウイルスに特異的な配列番号16、配列番号17もしくは配列番号40の配列
−デングウイルスに特異的な配列番号18もしくは配列番号41の配列、または
−西ナイルウイルス(WNV)に特異的な配列番号19の配列、
から選択される。
−生体試料から少なくとも1つ供給源核酸を得るステップ、
−前記供給源核酸からの標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−前記アンプリコンと、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも1つの検出プローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む。
−標的ヌクレオチド配列の増幅によりアンプリコンを作製するステップであって、前記標的ヌクレオチド配列は、ウイルスの遺伝子型および/または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応するステップと、
−少なくとも1つの検出プローブを有する前記アンプリコンと、ウイルスの遺伝子型および/または亜型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記検出プローブは、上述した修飾オリゴヌクレオチドより形成されている検出プローブであるステップと、
を含む。
−配列番号8および配列番号9、どのようなウイルス遺伝子型が関与していても、アンプリコンがHCVから作製され、このプライマーペアは包括的であり、HCVの任意の遺伝子型から出発する401ntの「長鎖」アンプリコンの増幅を可能にするペア;
−配列番号10および配列番号9、遺伝子型1a/1bに特異的な191ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号29および配列番号9、遺伝子型2に特異的な108ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号8および配列番号11、遺伝子型3aに特異的な143ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号8および配列番号30、遺伝子型4a/4dに特異的な175ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;ならびに
−配列番号20および配列番号21、および/または配列番号22および配列番号21アンプリコンが、フラビウイルスから作製される場合のペア、
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される。
−上記の少なくとも1つの修飾オリゴヌクレチド、および少なくとも1つの基材と、
−上記の少なくとも1つのグラフト化基材、を含み、
前記少なくとも1つの基材は、前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフトに耐える物質によりコーティングされた少なくとも1つのレシービングゾーンを含み、
前記レシービングゾーンが、好ましくは金、プラチナによりコーティングされるか、または少なくとも1つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む少なくとも1つの基材である、
生体試料中の少なくとも1つの標的核酸を検出するためのキットに関する。
−チオール官能基を保有する本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、作製に要するコストが高価ではない、
−本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、金表面に、または少なくとも1つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面に安定に固定できる、
−核酸の検出、シーケンシングおよび/または遺伝子型決定のための方法における本発明の修飾オリゴヌクレオチドの使用は、数百のヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を特異的に検出可能にする、
−本発明の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出のより優れた感度および特異性を有しながら、公知の検出方法および/または遺伝子型決定において使用されるプローブより有利に短い、
である。
チオール化合物は、本発明の修飾オリゴヌクレオチド内への導入が意図され、下記の式(I):
Tは、−O−P(OR1)N(R2)2、−O−PH(O)O−、−OC(O)JC(O)NH−□から選択される基であり、
・R1は、2−シアノエチル、R’1R’2R’3SiCH2CH2および基R’1、R’2、R’3から選択され、R’1、R’2、R’3は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分岐鎖の、1から12の炭素原子を有するアルキル基およびC6−C12アリール基から選択され、
・R2は、直鎖もしくは分岐鎖の、1から12の炭素原子を含むアルキル基、ピロリジンから選択され、
・Jは、単結合、−CH2−、−CH2CH2−、−CH2OCH2−、Phがベンジルである−CH2OPhOCH2−の基から選択され、
・□は、固体支持体を表し、
Dは、アルコールの保護基であり、
Wは、C1−C12アルカントリイル基、C6−C18アリールトリイル基およびC6−C18アラルカン(aralkane)トリイル基から選択され、
Zは、C1−C12アルコキシ、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル、C1−C12NCO−アルキル、C1−C12CON−アルキルから選択され、
Yは、直鎖または分岐鎖の、C1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Xは、直鎖または分岐鎖の、C1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Rは、C1−C12アシル、C1−C12S−アルキル、C6−C12S−アリール、S−2−ピリジン、酸素含有または窒素含有C1−C12S−ヘテロアルキル、C3−C12S−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有C3−C12S−シクロヘテロアルキル基から選択される。)
に対応する。
R’1、R’2、R’3は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分岐鎖の、1から6の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
好ましくはR1は、2−シアノエチルおよびR’1R’2R’3SiCH2CH2基から選択され、
R’1、R’2、R’3は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分岐鎖の、1から3の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
さらにより好ましくは、R1は、2−シアノエチル、2−(トリメチルシリル)エチル、2−(トリフェニルシリル)エチル、2−(ジフェニルメチルシリル)エチル基から選択される。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
R、R1、R2およびDは、上記の(Ia)と同じ定義を有する)
に対応する化合物(VI)である。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
R、R1、R2およびDは、上記の式(Ia)と同じ定義を有する)
に対応する化合物(VII)である。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
Rおよび□は、上記の式(Ic)と同じ定義を有する)
に対応する化合物(VIII)である。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
R、R1、R2およびDは、上記の式(Ia)と同じ定義を有する)
の化合物(IX)である。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
R、R1、R2およびDは、上記の(Ia)と同じ定義を有する)
の化合物(X)である。
nは、1から12の間、好ましくは1から6の間の整数であり、
R、R1、R2およびDは、上記の式(Ia)と同じ定義を有する)
の化合物(XI)である。
化合物(Ia)、(Ib)および(Ic)の製造方法を、図1の概略図に表す。
を有する同じ化合物(II)から得られる。
または、好ましくはジイソプロピルアミンテトラゾリドの塩の存在下で、下記の式:
に表された反応によって得ることができる。
に従って得ることができる。
GおよびG’はハロゲン原子であり、同一であっても、または異なっていてもよく、好ましくはGおよびG’は臭素またはヨウ素原子であり、
Z’は、C1−C12アミノアルキル、C1−C12アルコキシ、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル、C1−C12NCO−アルキル、C1−C12CON−アルキル基であり、
Z”は、C1−C12の直鎖または分岐鎖アルキル、C1−C12アミノアルキル、C1−C12アルコキシ、C3−C12シクロアルキル、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル、C1−C12NCO−アルキル、C1−C12CON−アルキル基であり、
ジハロゲン化化合物G−Z”−G’は、化合物(IV)のZ’基と反応して、化合物(III)のZ−G基の形成をもたらすことが意図される)
に従って得ることができる。
オリゴマーは、上記の式(I)のチオール化合物から形成することができる。これらのオリゴマーの合成方法は、式(Ia)の化合物のオリゴマー化に関しては図2Aの略図に、式(Ib)の化合物のオリゴマー化に関しては図2Bの略図に記載する。
(Ic)-(I’)k (XVI)k
(式中、
kは、1から11の整数を表し、
(Ic)は、上記と同じ意味を有し、
(I’)は、(I’a)または(I’b):
に対応する。
に対応する。
に対応する。
本発明の対象は、上記のような、少なくとも10のヌクレオチドおよび少なくとも2のチオール化合物(I)を含む修飾オリゴヌクレオチドに関する。
−化合物(I)をオリゴヌクレオチド上にグラフトして、5’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、または
−化合物(I)のオリゴマー上にヌクレオチドをグラフトして、3’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、
を含む。
□-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’)y’ (XIIa)
(式中、
N1、…Nnは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(I’)は、式(I’a)または(I’b)の化合物を表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
pは、0または1を表し、
y’は、pが値1を有する場合、0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y’は0に等しく、
整数(y+y’)の合計は12を超えることがなく、
□は固体支持体をあらわす)
に対応する。
-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’a) (XIIa.3)
□-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’a)y
の化合物(XIIa.4)
または構造式(p=0の場合):
D、R、X、Y、W、Z、R1は、化合物(I)と同じ定義を有し、R1はさらにHを表してもよく、
n、yおよびN1、N2、…Nn−1は、化合物(XIIa)と同じ定義を有し、
Bnは、ヌクレオチド鎖に従来通り使用される塩基を表す)
を得る。
(Ic)-(I’)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I’)y” (XIIIa)
(式中、
N1、…Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(I’)は、式(I’a)または(I’b)の化合物を表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
y’は、2から12の範囲の整数であり、
pは、y’が0でなければ値0または1を有し、y’が値0を有する場合、その時pは値0を有し、
y”は、pが値1を有する場合0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、その時y”は0を有し、
整数(y+y’+y”)の合計は12を超えることはない)
に対応する。
(Ic)-(I’)y-1 (XIIIa.1)
(式中、
(Ic)は、前述と同じ定義を有し、
(I’)は、タイプ(I’a)または(I”b)の基を表し、
または
(I’)が(I”b)を表す場合の構造式として、
(Ic)-(I’)y-1-N1 (XIIIa.2)
の化合物を得る。
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’ (XIIb)
(式中、
N1、…Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(I’b)は、上で定義された式の化合物を表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
pは、0または1を表し、
y’は、pが値1を有する場合、0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y’は0に等しく、
整数(y+y’)の合計は12を超えることはない)
を有する。
(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I’b)y”
(XIIIb)
(式中、
N1、…Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(Ic’)は、(Ic)から、固体支持体とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、好ましくは構造
(Ic’)
(I’b)は上で定義された式の化合物を表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
y’は、0から12の範囲の整数であり、
pは、y’が0でなければ値0または1を有し、y’が値0を有する場合、その時pは値0を有し、
y”は、pが値1を有する場合0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、その時y”は値0を有し、
整数(y+y’+y”)の合計は12を超えることはない)
を有する。
に対応する。
に対応する。
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I”)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I”)y’ (XIIc)
(式中、
N1、…Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
pは、0または1を表し、
y’は、pが値1を有する場合、0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y’は0に等しく、
整数(y+y’)の合計は12を超えることはない)
の化合物
またはp=0の場合、構造式:
X、Y、W、Z、R1は化合物(I)と同じ定義を有し、
N1、…Nn、n、yは、化合物(XIIa)と同じ定義を有し、
Bnは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基を表す)
の化合物を得る。
(Ic’)-(I’)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I”)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I”)y” (XIIIc)
(式中、
N1、…Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(Ic’)は、(Ic)から、固体支持体とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
y’は、2から12の範囲の整数であり、
pは、y’が0でなければ値0または1を有し、y’が値0を有する場合、その時pは値0を有し、
y”は、pが値1を有する場合0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、その時y”は値0を有し、
整数(y+y’+y”)の合計は12を超えることはない)
の化合物;
またはy’=p=0の場合、構造式:
X、Y、W、Zは、化合物(I)と同じ定義を有し、
N2、…Nn、nおよびyは、化合物(XIIa)と同じ定義を有し、
Bnは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基に対応する)
の化合物を得る。
−C型肝炎ウイルス(HCV)に特異的な、配列番号1、配列番号4、配列番号27、配列番号28、配列番号35もしくは配列番号36の配列、
−フラビウイルスに特異的な、配列番号16、配列番号17もしくは配列番号40の配列、
−デングウイルスに特異的な、配列番号18もしくは配列番号41の配列、または
−西ナイルウイルス(WNV)に特異的な、配列番号19の配列、
から選択される。
本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、基材の表面を官能化するために、この基材上に付着させることができる。基材は、金属またはポリマー製、導電性または非導電性であってよい。基材は、平坦(部分的または全体に)または曲面であってよく、有利には球状であってよい。
本発明の修飾オリゴマーは、1以上の結合点によりマーカーまたはリガンドに結合させることができ、このマーカーまたはリガンドは、例えば、酵素性、発色性、蛍光発生的、放射性、または化学発光のマーカー、金属、金属イオン、ホルモン、タンパク質、ペプチド、糖類、オリゴ糖、核酸分解剤もしくはタンパク質分解剤、ビオチンなどの結合剤、抗原、ハプテン、抗体または受容体であってよい。有利には、このマーカーまたはリガンドは、本発明の修飾オリゴヌクレオチドと、ウイルスまたは細菌の遺伝子の代表的標的配列との間のハイブリダイゼーション事象の検出を可能にする。
本発明はさらに、生体試料中の少なくとも1つの標的核酸を検出する方法に関し、この方法は、前記標的核酸を、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成された少なくとも1つの検出プローブにより検出するステップを含む。
−生体試料から少なくとも1つの「供給源」核酸を得るステップ、
−供給源核酸から標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−アンプリコンと、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成された少なくとも1つの検出プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む。
−配列番号8および配列番号9、どのようなウイルス遺伝子型が関与していても、アンプリコンがHCVから作製される場合。このプライマーペアは包括的であり、HCVの任意の遺伝子型から出発する401ntの「長鎖」アンプリコンの増幅を可能にする;
−配列番号10および配列番号9、遺伝子型1a/1bに特異的な、191ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号29および配列番号9、遺伝子型2に特異的な108ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号8および配列番号11、遺伝子型3aに特異的な143ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;
−配列番号8および配列番号30、遺伝子型4a/4dに特異的な175ntの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア;ならびに
−配列番号20および配列番号21、および/または配列番号22および配列番号21、アンプリコンが、フラビウイルスから作製される場合;
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される。
本発明の別の主題は、少なくとも1つのレシービングゾーンを含み、その上に少なくとも1つの本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドを配置した少なくとも1つの支持体を含む、検出および/または診断キットからなる。
[化合物1−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2−(6−S−アセチルチオヘキシルオキシメチル)−2−メチルプロパン−1,3−ジオール4の合成]
フェロセン基を5’位に含み、本発明に従ったタイプ(Ia)の漸増数のチオール化合物(1、2および4チオールの化合物)を含む3種のオリゴヌクレオチドを、DNA合成装置で合成した。金表面へのオリゴヌクレオチドの固定化をサイクリックボルタンメトリーにより可視化するために、フェロセン基を使用した。1、2または4つのチオール基を、プロパンジオールタイプの固体支持体に導入し、配列番号7のDNA配列をグラフトした。最終的に、フェロセン基を保有するアルファ−チミジンホスホラミダイトを、修飾オリゴヌクレオチドの5’位に導入した。その後の脱保護は、2ステップで実施する。第1に、ベータ−除去によりシアノエチル基を除去するために、媒体を、アセトニトリル中10%のピペリジンにより10分間処理し、得られたアクリロニトリルを、アセトニトリルによる洗浄によって媒体から除去する。次いで、濃水酸化アンモニウムによる処理で、核酸塩基上およびチオール官能基上のアシル保護基の除去を可能にし、スクシニル連結(固体支持体)の加水分解を可能にする。このプロトコルは、脱保護されたチオール官能基とアクリロニトリルとの間のMichael付加の回避を可能にする。蒸発後、支持されていない修飾オリゴヌクレオチドを、C18カラムによる逆相HPLCクロマトグラフィーにより精製する。
この研究のために、VMP3 Biologicマルチチャンネル・ポテンショスタット(Biologic Science Instruments、Pont de Claix)を使用した。結果を、EC−Labソフトウェア、Biologic Science Instruments社製を使用して記録した。
4nmolのODN−チオール(1以上のチオール化合物により修飾されたオリゴヌクレオチド)を、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP−HCL、Sigma−Aldrich)(160mM)、すなわち、溶液中、濃度20mMのTCEP−HCLで、20℃において2時間アルゴン下で還元する。
金の作用電極を、アセトン中で10分間、超音波による1回目の洗浄により、浄化する。一度乾燥させ、すべての有機残留物を表面から除去するために、表面を「ピラニア」溶液(0.7mLのH2SO4、0.3mLのH2O2)に1分間浸漬する。
すすぎ後、チオールオリゴヌクレオチドを含有するグラフティング溶液を、活性化された金電極と、不活性雰囲気下で3日間接触させる。
分析は、50mV/秒において−0.1Vから0.45Vの間で、サイクリックボルタンメトリー(CV)により実施される。グラフト層の安定性の研究は、30分ごとのサイクルで2時間、電気化学シグナルの安定化後、実施される。
チオール化合物(テトラチオール、ジチオールおよびモノチオール)により修飾された3種のオリゴヌクレオチドのグラフト率の比較を実施した。グラフト率は、フェロセンの酸化ピークの積分により決定した。実際、移動した電子電荷は、電極の表面に存在するフェロセンの数に直接関係し、したがって、金にグラフトされたプローブの数に直接関係する。
被験標的試料
1)天然標的:「HCV(+)」アンプリコン
国家規模でHCVの存在に関する検査で陽性と出た血液ドナー由来の血漿試料を、シーケンシングにより解析する。各ドナーに感染しているHCVのウイルスの遺伝子型および亜型を決定する。
−「ビオチン化HCVセンス」(配列:[Btn]−TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC GCT GCT TTG A(または[Btn]−配列番号8))および
−「HCVアンチセンス」(配列 GGC GGA ATT CCT GGT CAT AGC CTC CGT GAA (配列番号9))(Tamalet C.ら、 2003年、Journal of Medical Virology 71: 391-398頁を参照されたい)
を使用して増幅する。
5’−
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACGGTCACTGAGAATGACATCCGTGTTGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACCTAGCCCCCGAAGCCAGACAGGCCATAAGGTCGCTCACAGAGCGGCTTTACATCGGGGGTCCCCTGACTAATTCAAAAGGGCAGAACTGCGGCTATCGCCGGTGCCGCGCGAGCGGTGTGCTGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号12)
を有する。
5’−
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCAACTGTCACTGAGAGAGACATCAGAACCGAGGAGTCCATATACCAGGCCTGCTCCCTAACCGAGGAGGCTCGCACCGCCATACACTCGCTGACTGAGAGGCTATACGTGGGAGGGCCCATGCTCAATAGCAAAGGCCAGACCTGCGGGTACAGGCGTTGCCGCGCCAGCGGGGTGCTCACCACTAGCATGGGAAACACCATTACGTGCTATGTGAAAGCTCTAGCGGCATGCAAGGCCGCAGGGATAGTAGCGCCCACGATGCTGGTATGCGGCGACGACCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTGAGGAGGACGAGCGGAACCTGAGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号31)
を有する。
5’−
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGATATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCAGGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGCGGGGGTCCTATGTTCAACAGCAAAGGGGCCCAGTGTGGTTATCGCCGTTGCCGTGCTAGTGGAGTTCTACCTACCAGCTTCGGCAATACAATCACTTGCTACATCAAGGCCACAGCGGCTGCAAGGGCCGCAGGCCTCCGGAACCCGGACTTTCTTGTCTGCGGAGACGATCTAGTCGTGGTGGCTGAGAGTGACGGCGTCGACGAGGATGGGGCGGCCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号:14)
を有する。
5’−
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGACATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCCGCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTACAACAGCAGGGGAGACCTTTGCGGAACTCGACGGTGCCGTGCAAGCGGCGTATTCACCACCAGCTTTGGGAACACACTGACGTGCTATCTTAAGGCCAGCGCGGCCATCAGGGCTGCAGGCCTAAAGGACTGCACCATGCTGGTCTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCGCTGAAAGCGATGGCGTGGAGGAGGACAACCGTGCGCTCAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号32)
を有する。
−ビオチン化センスプライマー「1a/1bセンス」、配列5’−[Btn]−TGA−CRA−CYA−GCT−GYG−GTA−AYA−CCC−T−3’(または[Btn]−配列番号10)および
−アンチセンスプライマー「HCVアンチセンス」、配列番号9(上記を参照されたい)
により増幅させる。
5’−
TGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTCTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATGCTCGTGTGCGGAGACGACCTTGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGAACCCARGAGGATGCGGCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号13)
を有する。
−ビオチン化センスプライマー「ビオチン化HCV2センス」、配列5’−[Btn]−ATG−YTG−GTR−TGC−GGC−GAC−GAC−3’(または[Btn]−配列番号29)、および
−アンチセンスプライマー「HCVアンチセンス」、配列番号9(上記を参照されたい)
により増幅させる。
5’−ATGCTGGTATGCGGCGACGACCTGGTCGTCATCTCAGAAAGCCAGGGGACTGAGGAGGACGAGCGGAACCTGAGAGTCTTCACGGAGGCTATGACCAGGAATTCCGCC−3’(配列番号33)
を有する。
−ビオチン化センスプライマー「HCVセンス」、配列番号8(上記を参照されたい)、および
−アンチセンスプライマー「3a rev」、配列:5’−GCA−GTA−AAG−CCG−YTC−CGT−GAG−3’(配列番号11)
により増幅させる。
5’−
TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCGACTGTCACTGAACAGGATATCAGGGTGGAAGAGGAGATATACCAATGCTGTAATCTTGAACCGGAGGCCAGGAAGGTGATCTCCTCCCTCACGGAGCGGCTTTACTGC−3’(配列番号15)
を有する。
−ビオチン化センスプライマー「HCVセンス」、配列番号8(上記を参照されたい)、および
−アンチセンスプライマー「HCVアンチセンス4 rev」、配列:5’−AGG−TCT−CCC−YTG−CTG−TTG−TRC−AT−3’(配列番号30)
により増幅させる。
5’−TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACTGTAACCGAAAGAGACATCAGGGTCGAGGAGGAGGTCTATCAGTGTTGTGACCTAGAGCCCGAAGCCCGCAAGGTAATATCCGCCCTCACAGAGAGACTCTACGTGGGCGGTCCCATGTACAACAGCAGGGGAGACCT−3’(配列番号34)
を有する。
5’末端がビオチン化された、15−merまたは105−merの合成オリゴヌクレオチドを合成した。
−亜型1a/1bに特異的な15−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−GCT CCR GGA ACT GCA C−3’(または[Btn]−配列番号2)を有し;
−亜型3aに特異的な15−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:[Btn]−CTT GAA CCG GAG GCC−3’(または[Btn]−配列番号5)を有し、および
−亜型4a/4dに特異的な15−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−CTA YGT GGG CGG YCC−3’(または[Btn]−配列番号39)を有する。
−亜型 1a/1bに特異的な105−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−CCT CAC TTG CTA CAT CAA GGC CCA GGC AGC CTG TCG AGC CGC AGG − GCT CCR GGA ACT GCA C − CAT GCT CGT GTG TGG CGA CGA CTT AGT CGT TAT CTG TGA AAG TGC−3’(または[Btn]−配列番号3)を有し、および
−亜型3aに特異的な105−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−GAA CAG GAC ATC AGG GTG GAA GAG GAG ATA TAC CAA TGC TGT AAC − CTT GAA CCG GAG GCC - AGG AAA GTG ATC TCC TCC CTC ACG GAG CGG CTT TAC TGC GGG GGC−3’(または[Btn]−配列番号6)
を有する。
HCVのRNAポリメラーゼをコードするNS5b領域を、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの設計のための標的とした。
任意のタイプのチオールプローブ(アルファ−アノマーまたはベータ−アノマーのオリゴヌクレオチド、線形またはステム−ループのプローブ(スネイル「snail」)など)のグラフティングは、下記の最適化されたプロトコルに従って実施することができる。マレイミド活性化マイクロプレートウェル(Pierce)を、WB1バッファー(0.1MのNa2HPO4、0.15MのNaCl、0.05%のTween20(w/v)、pH7.2)により洗浄する。ウェルの官能化を、BBバッファー(0.1MのNa2HPO4、0.15MのNaCl、10mMのEDTA、pH7.2)中100nMのマルチチオールプローブ(上記)により、2時間、周囲温度(AT)において実施する。次いでウェルをWB1により3回洗浄し、BB中10μg.mL−1のシステイン−HCl溶液(Pierce)で1時間ATにおいて満たし、WB1により再度3回洗浄する。
4つのチオール官能基を有するベータ−アノマーの線形3aプローブを、100nMの密度で、マレイミド基により被覆された支持体に上記のプロトコルに従ってグラフトする。3aプローブにより得られた結果を、図8および9に提示する。
−15−merまたは105−merの3a特異的合成標的、濃度10pM、100pMまたは1000pM、
−15−merまたは105−merの1a/1b非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pM、100pMまたは1000pM、
−3a特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−1a/1b非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−3a特異的短鎖アンプリコン(143nt)、1/100および1/1000希釈、
−1a/1b非特異的短鎖アンプリコン(191nt)、1/100および1/1000希釈、
−HB単独、標的非含有、
により実施されたELOSA試験に対応する。
−15−merまたは105−merの1a/1b特異的合成標的、濃度10pM、100pMまたは1000pM,
−15−merまたは105−merの3a非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pM、100pMまたは1000pM、
−1a/1bHCV遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−3a非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−1a/1b特異的短鎖アンプリコン(191nt)、1/100および1/1000希釈、
−3a非特異的短鎖アンプリコン(143nt)、1/100および1/1000希釈、
−HB単独、標的非含有、
から得られる。
−15−merの1a/1b特異的合成標的、濃度10pMまたは1000pM、
−15−merの2a/2c、2b、3aまたは4a/4d非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pMまたは1000pM、
−1a/1bHCV遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−2a/2c、2b、3aまたは4a/4d非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−HB単独、標的非含有、
から得られる。
−15−merの2a/2cおよび2b特異的合成標的、濃度10pMまたは1000pM、
−15−merの1a/1b、3aまたは4a/4d非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pMまたは1000pM、
−2a/2b/2cHCV遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−1a/1b、3aまたは4a/4d非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−HB単独、標的非含有、
から得られる。
−15−merの3a特異的合成標的、濃度10pMまたは1000pM、
−15−merの1a/1b、2a/2b/2cまたは4a/4d非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pMまたは1000pM、
−3aHCV遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−1a/1b、2a/2b/2cまたは4a/4d非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−HB単独、標的非含有、
から得られる。
−15−merの4a/4d特異的合成標的、濃度10pMまたは1000pM、
−15−merの1a/1b、2a/2b/2cまたは3a非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pMまたは1000pM、
−4a/4dHCV遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−1a/1b、2a/2b/2cまたは3a非特異的長鎖アンプリコン、1/100希釈、
−HB(ハイブリダイゼーションバッファー)単独、標的非含有、
から得られる。
これらの結果もまた、非特異的標的が検出可能な程度にハイブリダイズしないことを示している。
ELOSA試験を、使用するプローブ中のチオール官能基の数を変化させ、異なるタイプおよび濃度の標的(15−merまたは105−merの短鎖合成標的、143ntまたは191ntの短鎖アンプリコン、401ntの長鎖アンプリコン)を試験して、実施した。図11に提示した結果は、1、2、4、6または8のチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形1a/1bプローブ(上記)により実施したELOSA試験に対応し、この線形プローブは、100nMの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。図11の結果は、下記の標的:
−15−merまたは105−merの1a/1b特異的合成標的、濃度10pM、100pMまたは1000pM、
−15−merまたは105−merの3a非特異的合成標的(陰性対照)、濃度10pM、100pMまたは1000pM、
−HB単独、標的非含有、
から得られる。
図12、13および14に提示した結果は、1、2または4つのチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形1a/1bプローブ(上記を参照されたい)により実施されたELOSA試験に対応し、このプローブは、1、10、25、50または100nMの密度で、上記のプロトコルに従って、マレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。図12は、モノチオールプローブ、すなわち、本発明に従った単一のチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示す。図13は、ジチオールプローブ、すなわち、本発明に従った2つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示し、図14は、テトラチオールプローブ、すなわち、本発明に従った4つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果例示す。
−15−merまたは105−merの1a/1b特異的合成標的、濃度1000pM、100pMまたは10pM、
−15−merまたは105−merの3a非特異的合成標的(陰性対照)、濃度、1000pM、100pMまたは10pM、
−HB単独、標的非含有、
により実施する。
ハイブリダイゼーション試験を、1a/1b特異的プローブ配列を、金表面を有する電極にグラフトすることによって実施した。
デングウイルス(血清型1、2、3および4)および西ナイルウイルスの公知の配列を、GenBankデータベースから抽出し解析した。表1は、アライメントの実施に使用したデングおよび西ナイルウイルスの配列のGenBank受託番号を載せている。
アライメントおよび配列比較を、クラスタルW2およびMega5のソフトウェアを使用して実施し、4つの領域を規定し、そのうち、
−2つは、デングおよび西ナイルウイルスのすべて並びに他のフラビウイルス、例えば日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱病ウイルスおよびウスツウイルス(非限定的リスト)に保存されており、
−1つは、デングウイルスに保存されており、
−1つは、西ナイルウイルスに保存されている。
同定された6つの領域を含むそれぞれのアンプリコンを、表1に述べた配列から出発して、Scaramozzinoらにより記載されたプライマーおよびプロトコル(Scaramozzino N. ら、Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. 2001. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927)を使用して、単純PCRを実施することによって調製する。
−MAMDセンスプライマー:[Btn]−5’−AAC−ATG−ATG−GGR−AAR−AGR−GAR−AA−3’(または[Btn]−配列番号20)、および
−cFD2アンチセンスプライマー(配列番号21):5’−GTG−TCC−CAG−CCG−GCG−GTG−TCA−TCA−GC−3’、
により実施される。
を有する。
を有する。
−FS778センスプライマー:[Btn]5’−AAR−GGH−AGY−MCD−GCH−ATH−TGG−T−3’(または[Btn]−配列番号22)、および
−cFD2アンチセンスプライマー(配列番号21):5’−GTG−TCC−CAG−CCG−GCG−GTG−TCA−TCA−GC−3’、
により場合により実施してもよい。
この増幅は、215bpの二次アンプリコンを得ることにつながる。
を有する。
を有する。
−ビオチン化「MAMD」センスフラビウイルス(配列:[Btn]−AAC ATG ATG GGR AAR AGR GAR AA(または[Btn]−配列番号20))および
−「cFD2」アンチセンスフラビウイルス(配列GTG TCC CAG CCG GCG GTG TCA TCA GC(配列番号21))(Scaramozzino N.ら、2001年、Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927頁を参照されたい)
を使用して増幅させる。
−フラビウイルスに特異的な14−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−TGG TWC ATG TGG CT−3’(または[Btn]−配列番号43)を有し;
−西ナイルウイルスに特異的な15−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−AGA AYT CAG GAG GMG−3’(または[Btn]−配列番号42)および
−デングウイルスの血清型4に特異的な15−merの合成オリゴヌクレオチドは、配列:5’[Btn]−TCA TGG AGT GGA GTG−3’(または[Btn]−配列番号44)を有する。
Claims (18)
- 式(XIIb):
(XIIb)N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’
または式(XIIIb):
(XIIIb)(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y”
[式中、
N1、…、Nnは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
M1、…、Mmは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
(I’b)は、式:
(Ic’)は、式:
nは、4から100の範囲の整数であり、
mは、4から100の範囲の整数であり、
yは、2から12の範囲の整数であり、
pは、0または1を表し、
y’は、pが値1を有する場合、0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、y’は0に等しく、
y”は、pが値1を有する場合、0から12の範囲の整数であり、pが値0を有する場合、その際は、y”は0の値を有し、
整数(y+y’)または(y+y’+y”)の合計は、12を超えることがなく
Xは、直鎖または分岐鎖のC1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Yは、直鎖または分岐鎖のC1−C12アルキル基、C1−C12アミノアルキル基、C1−C12アルコキシ基、C3−C12シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基から選択され、
Zは、C1−C12アルコキシ基、酸素含有または窒素含有C3−C12シクロヘテロアルキル基、C1−C12NCO−アルキル基、C1−C12CON−アルキル基から選択され、
Wは、C1−C12アルカントリイル基、C6−C18アリールトリイル基およびC6−C18アラルカン(aralkane)トリイル基から選択され、
Rは、Hであるか、またはC1−C12アシル、C1−C12S−アルキル、C6−C12S−アリール、S−2−ピリジン、酸素含有または窒素含有C1−C12S−ヘテロアルキル、C3−C12S−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有C3−C12S−シクロヘテロアルキル基から選択され、ならびに、
R1は、2−シアノエチルまたはR’1R’2R’3SiCH2CH2基(式中R’1、R’2およびR’3は、同一であっても、または異なっていてもよく、1から12の炭素原子を含む直鎖もしくは分岐鎖のアルキルおよびC6−C12アリールから選択される基を表す)から選択される]
に対応する修飾オリゴヌクレオチド。 - ヌクレオチド配列(N1−N2−…−Nn−1−Nn)および場合により、ヌクレオチド配列(M1−M2−…−Mm−1−Mm)が、疾患の原因である、または疾患に関与する、ウイルス、細菌または遺伝子に対して特異的である、請求項1から3のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
- ヌクレオチド配列(N1−N2−…−Nn−1−Nn)および場合によりヌクレオチド配列(M1−M2−…−Mm−1−Mm)が、
−C型肝炎ウイルス(HCV)に特異的な配列番号1、配列番号4、配列番号27、配列番号28、配列番号35もしくは配列番号36の配列、
−フラビウイルスに特異的な配列番号16、配列番号17もしくは配列番号40の配列、
−デングウイルスに特異的な配列番号18もしくは配列番号41の配列、または
−西ナイルウイルス(WNV)に特異的な配列番号19の配列、
から選択される、請求項4に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 - ヌクレオチド配列(N1−N2−…−Nn−1−Nn)および場合によりヌクレオチド配列(M1−M2−…−Mm−1−Mm)は、アルファアノマー、ベータアノマー、直鎖もしくはスネイルタイプの構造を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングに耐える物質によりコーティングされた少なくとも1つのレシービングゾーンを含む、少なくとも1つの請求項1から6に記載の修飾オリゴヌクレオチドによるグラフト化基材。
- −前記レシービングゾーンが金またはプラチナのフィルムによりコーティングされ、前記基材が金属、好ましくは銅もしくはチタン製である、または
−前記レシービングゾーンがその表面に、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含み、および前記基材がプラスチック、好ましくはポリスチレン製である、
請求項7に記載のグラフト化基材。 - 前記基材が非平面であり、好ましくはマイクロ粒子またはナノ粒子である、請求項7または8に記載のグラフト化基材。
- −前記標的核酸を、請求項1から6のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも1つの検出プローブにより検出するステップを含む、生体試料中の少なくとも1つの標的核酸を検出する方法。
- −前記生体試料から少なくとも1つ供給源核酸を得るステップ、
−供給源核酸から前記標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−前記アンプリコンと、請求項1から6のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも1つの検出プローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む、請求項10に記載の検出方法。 - −アンプリコンが、ウイルスの遺伝子型および/または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応す標的ヌクレオチド配列の増幅により作製され、ならびに
−検出が、ウイルスの遺伝子型および/または亜型に特異的なプローブにより実施される、
生体試料中に存在するウイルスの遺伝子型および/または亜型を決定するための、請求項11に記載の方法。 - アンプリコンの作製するステップが、ウイルスの遺伝子型および/または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応する標的ヌクレオチド配列の増幅により、好ましくはプライマーペア:
−配列番号8および配列番号9、アンプリコンがHCVの任意の遺伝子型から出発して作製される場合;
−配列番号10および配列番号9、アンプリコンが遺伝子型1a/1bのHCVから出発して作製される場合;
−配列番号29および配列番号9、アンプリコンが遺伝子型2のHCVから出発して作製される場合;
−配列番号8および配列番号11、アンプリコンが遺伝子型3aのHCVから出発して作製される場合;
−配列番号8および配列番号30、アンプリコンが遺伝子型4a/4dのHCVから出発して作製される場合;
−配列番号20および配列番号21、または配列番号22および配列番号21、アンプリコンがフラビウイルスから作製される場合、
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される、請求項12に記載の方法。 - −少なくとも1つの請求項1から6のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレチド、および前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングに耐える物質によりコーティングされた少なくとも1つのレシービングゾーンを含み、前記レシービングゾーンが、好ましくは金、プラチナによりコーティングされるか、または少なくとも1つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基ををその表面に含む少なくとも1つの基材、または
−請求項7から9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのグラフト化基材、
を含む、生体試料中の少なくとも1つの標的核酸を検出するためのキット - 配列番号1、配列番号4、配列番号27、配列番号28、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号35、配列番号36、配列番号40および配列番号41の配列から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド、請求項15に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項7から9のいずれか一項に記載のグラフト化基材の、生体試料中の少なくとも1つの標的核酸を検出するための使用。
- ウイルス株、好ましくは肝炎ウイルス、アルボウイルス、好ましくはフラビウイルス科(Flaviviridae)、トガウイルス科(Togaviridae)またはブニヤウイルス科(Bunhyaviridae)の、診断、遺伝子型決定またはシーケンシングのための、請求項16に記載の使用。
- HCV、HBV、デングウイルスまたは西ナイルウイルスの、診断、遺伝子型決定またはシーケンシングのための、請求項17に記載の使用。
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