BR112014013825A2 - ensaio de infecção respiratória - Google Patents
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Abstract
ensaio de infecção respiratória. a presente invenção se refere a produtos de ácidos nucleicos e métodos quantitativo para detecção e para triagem de uma amostra biológica quanto à presença de um micro-organismo causador de infecção respiratória. um cartão de teste para uso em um método quantitativo também é descrito na presente invenção.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO DE INFECÇÃO RESPIRATÓRIA".
[001] A presente invenção refere-se a produtos de ácidos nuclei- cos e a métodos correspondentes para triagem de uma amostra bioló- gica quanto à presença de um micro-organismo causador de infecção respiratória.
[002] Infecções respiratórias estão entre as causas mais comuns de doença humana em todo o mundo (vide Murray e Lopez (1997) - Lancet, 349, páginas 1269-1276). Indivíduos comprometidos (sistemas cardíaco, pulmonar, imunológico), os idosos e as crianças estão espe- cialmente em risco de desenvolver complicações graves. Historica- mente, o diagnóstico laboratorial rápido de infecções respiratórias tem sido realizada através de um conjunto de ensaios de (RT) PCR em Tempo Real Taqman multiplexados. No entanto, um problema signifi- cativo associado a esta abordagem multiplexada é a necessidade de preparar, executar e monitorar ensaios de triagem paralelos. Isto re- presenta um encargo financeiro indesejável, uma vez que cada ensaio realizado leva a uma duplicação dos custos de consumo vis-a-vis um único ensaio e impõe carga operacional adicional em termos de des- gaste no equipamento caro empregado para realizar estes ensaios. A dita abordagem multiplexada também impõe um tempo adicional e en- cargos de mão de obra associados à realização dos múltiplos ensaios.
[003] Portanto, há uma necessidade por um sistema de triagem mais eficiente.
[004] A presente invenção resolve um ou mais dos problemas identificados acima ao proporcionar um ensaio simples, em uma etapa (ou seja, um formato singleplex) para detectar a presença ou ausência de vários micro-organismos causadores de infecção respiratória em uma única amostra isolada.
[005] Em maiores detalhes, a presente invenção proporciona um método para detectar a presença de um ou mais de pelo menos seis micro-organismos causadores de infecção respiratória em uma amos- tra ou detectar a ausência dos ditos micro-organismos na dita amostra, o dito método compreendendo:
[006] A) aplicação de uma amostra a um cartão de teste, em que o dito cartão de teste compreende seis cavidades distintas:
[007] 1) uma primeira cavidade que inclui uma primeira sonda, em que a primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GGCAATGCWG (SEQ ID NO: 1);
[008] 2) uma segunda cavidade que inclui uma segunda sonda, em que a segunda sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAYGGGACCR (SEQ ID NO: 2);
[009] 3) uma terceira cavidade que inclui uma terceira sonda, em que a terceira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CACCAGACAC (SEQ ID NO: 3);
[0010] 4) uma quarta cavidade que inclui uma quarta sonda, em que a quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GGTCATTGGR (SEQ ID NO: 4);
[0011] 5) uma quinta cavidade que inclui uma quinta sonda, em que a quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos
CACTGGGCAC (SEQ ID NO: 5);
[0012] 6) uma sexta cavidade que inclui uma sexta sonda, em que a sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos RGTGTT- CATT (SEQ ID NO: 6);
[0013] B) permitir que o ácido nucleico presente na amostra conta- te as sondas dentro das ditas cavidades;
[0014] C) detecção da presença do complexo de ácido nucleico ligado, em que o ácido nucleico da amostra se ligou a uma ou mais das ditas sondas;
[0015] D) em que a presença de complexo de ácido nucleico liga- do confirma que o ácido nucleico de um ou mais dos ditos seis micro- organismos causadores de infecção respiratória está presente na a- mostra e em que a ausência de complexo de ácido nucleico ligado confirma que o ácido nucleico de todos os ditos seis micro-organismos causadores de infecção respiratória está ausente da amostra.
[0016] Um problema chave da técnica anterior que foi abordado pelo Requerente é o fornecimento de um conjunto robusto de sondas que são mutuamente compatíveis (ou seja, retêm especificidade de ligação precisa) dentro de um único conjunto de condições de ensaio (ou seja, um formato singleplex). Uma vantagem particular associada ao método da presente invenção é a velocidade. A título de exemplo, o método da invenção é, tipicamente, terminado dentro de 2,5 horas, de preferência dentro de 2 ou 1,5 hora. Em contraste, os ensaios multi- plex existentes levam, tipicamente, pelo menos 4-5 horas, tipicamente pelo menos 5 horas.
[0017] Outra vantagem associada com ao método de ensaio uni- plex (também conhecido como singleplex) da presente invenção é um aumento da sensibilidade, o qual permite a detecção quantitativa de micro-organismos (por exemplo, carga viral e/ou bacteriana) na amos- tra além de simplesmente determinar a presença ou ausência de um patógeno em particular na amostra.
[0018] Micro-organismos (por exemplo, vírus e bactérias) na a- mostra podem ser submetidos a uma carga de calibração para cada micro-organismo alvo. Isto permite a quantificação da carga específica de cada um dos micro-organismos na amostra. Vantajosamente, esta característica da presente invenção permite a determinação do(s) mi- cro-organismo(s) predominante(s) em amostras onde vários micro- organismos estão presentes. Por exemplo, o método de ensaio uniplex da invenção permite determinar o vírus predominante em amostras onde vários vírus estão presentes. Além disso, o método da invenção permite a detecção quantitativa de vírus em amostras ao longo do tempo, o qual é particularmente útil quando há uma flutuação na carga viral de vírus específicos.
[0019] Além disso, enquanto que os sistemas existentes empre- gam hibridização realizada sobre uma membrana, o método de ensaio da presente invenção é realizado em um sistema fechado (por exem- plo, estéril), assim, reduzindo o risco de contaminação, o que constitui outra vantagem.
[0020] As sondas 1-6 permitem, respectivamente, detecção sensí- vel de:
[0021] 1) Vírus sincicial respiratório (RSV A & B);
[0022] 2) Rinovírus;
[0023] 3) Metapneumovírus Humano (hMPV);
[0024] 4) Influenza B (Gripe B Quad);
[0025] 5) Influenza A (Gripe A CDC DC); e
[0026] 6) Influenza A subtipo H5 (H5 FRET).
[0027] Assim, o método definido acima constitui um ensaio rápido para a detecção de qualquer um ou mais dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória em um formato de ensaio uniplex (também conhecido como singleplex). Similarmente, o dito método constitui um ensaio rápido para a confirmação de que todos os ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória estão ausentes de uma amostra em um único ensaio (uniplex). Um ensaio uniplex sig- nifica que cada um dos múltiplos ensaios em cavidade de detecção individuais é realizado sob as mesmas condições de ensaio e/ou subs- tancialmente ao mesmo tempo. Em uso, uma única amostra é aplicada ao cartão de teste o qual é, então, preenchido em cada cavidade de ensaio.
[0028] Em uma modalidade, o método emprega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes selecionadas de:
[0029] 7) uma sétima cavidade que inclui uma sétima sonda, em que a sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TTTCCAGGGG (SEQ ID NO: 7);
[0030] 8) uma oitava cavidade que inclui um oitavo da sonda, em que a oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CCGCAAGTCA (SEQ ID NO: 8);
[0031] 9) uma nona cavidade que inclui uma nona sonda, em que a nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TTGCCTGGTG (SEQ ID NO: 9);
[0032] 10) uma décima cavidade que inclui uma décima sonda, em que a décima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TAARGTAGGT (SEQ ID NO: 10);
[0033] 11) uma décima primeira cavidade que inclui uma décima primeira sonda, em que a décima primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos CGGCRTCATY (SEQ ID NO: 11);
[0034] 12) uma décima segunda cavidade que inclui uma décima segunda sonda, em que a décima segunda sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos ATARTGRTAA (SEQ ID NO: 12);
[0035] 13) uma décima terceira cavidade que inclui uma décima terceira sonda, em que a décima terceira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ATAGTAATAA (SEQ ID NO: 13); em que as mes- mas etapas de processo são empregadas conforme descrito anterior- mente.
[0036] Em uma modalidade, o cartão de teste pode incluir dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou to- das as sete das ditas sétima a décima terceira cavidades (mais sondas correspondentes).
[0037] As sondas 7-13 permitem, respectivamente, a detecção sensível de:
[0038] 7) Vírus da parainfluenza humana de tipo 1 (HPIV 1);
[0039] 8) Vírus da parainfluenza humana de tipo 2 (HPIV 2);
[0040] 9) Vírus da parainfluenza humana de tipo 3 (HPIV 3);
[0041] 10) Vírus da parainfluenza humana de tipo 4 (HPIV 4);
[0042] 11) Adenovírus humanos #2;
[0043] 12) Influenza A H1 2009 sensível ao Tamiflu; e
[0044] 13) Influenza A H1 2009 resistente ao Tamiflu.
[0045] Assim, o método definido acima constitui um ensaio rápido para a detecção de qualquer um ou mais dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória em um formato de ensaio uniplex. Similarmente, o dito método constitui um ensaio rápido para a confir- mação de que todos os ditos micro-organismos causadores de infec- ção respiratória estão ausentes de uma amostra em um ensaio de formato uniplex.
[0046] Em uma modalidade, o método emprega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes selecionadas de:
[0047] 14) uma décima quarta cavidade que inclui uma décima quarta sonda, em que a décima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TACTGTGACA (SEQ ID NO: 14);
[0048] 15) uma décima quinta cavidade que inclui uma décima quinta sonda, em que a décima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos YRGCGGAACC (SEQ ID NO: 15);
[0049] 16) uma décima sexta cavidade que inclui uma décima sex- ta sonda, em que a décima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de áci- dos nucleicos TAACGAGTGT (SEQ ID NO: 16);
[0050] 17) uma décima sétima cavidade que inclui uma décima sétima sonda, em que a décima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CGAATGAATG (SEQ ID NO: 17);
[0051] 18) uma décima oitava cavidade que inclui uma décima oi- tava sonda, em que a décima oitava sonda tem uma sequência de áci- dos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos YTCTAAGCAT (SEQ ID NO: 18);
[0052] 19) uma décima nona cavidade que inclui uma décima nona sonda, em que a décima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de áci- dos nucleicos TTCTAAGCAT (SEQ ID NO: 19);
[0053] 20) uma vigésima cavidade que inclui uma vigésima sonda, em que a vigésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAGTAYCTSA (SEQ ID NO: 20);
[0054] 21) uma vigésima primeira cavidade que inclui uma vigési- ma primeira sonda, em que a vigésima primeira sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ACTGCATCCG (SEQ ID NO: 21);
[0055] 22) uma vigésima segunda cavidade que inclui uma vigési- ma segunda sonda, em que a vigésima segunda sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TGTCACCTCT (SEQ ID NO: 22);
[0056] 23) uma vigésima terceira cavidade que inclui uma vigési- ma terceira sonda, em que a vigésima terceira sonda tem uma se-
quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos AGTGTGTYAC (SEQ ID NO: 23);
[0057] 24) uma vigésima quarta cavidade que inclui uma vigésima quarta sonda, em que a vigésima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAATTTCTGG (SEQ ID NO: 24);
[0058] 25) uma vigésima quinta cavidade que inclui uma vigésima quinta sonda, em que a vigésima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TTGCCGGATG (SEQ ID NO: 25);
[0059] 26) uma vigésima sexta cavidade que inclui uma vigésima sexta sonda, em que a vigésima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CAGCAACTGT (SEQ ID NO: 26);
[0060] 27) uma vigésima sétima cavidade que inclui uma vigésima sétima sonda, em que a vigésima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TGCTCCAGAA (SEQ ID NO: 27);
[0061] 28) uma vigésima oitava cavidade que inclui uma vigésima oitava sonda, em que a vigésima oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TNGCCATTGY (SEQ ID NO: 28);
[0062] 29) uma vigésima nona cavidade que inclui uma vigésima nona sonda, em que a vigésima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GTYCCGTGRA (SEQ ID NO: 29);
[0063] 30) uma trigésima cavidade que inclui uma trigésima sonda, em que a trigésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CTGGARTCTG (SEQ ID NO: 30);
[0064] 31) uma trigésima primeira cavidade que inclui uma trigési- ma primeira sonda, em que a primeira trigésima sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CRACTGTGTC (SEQ ID NO: 31);
[0065] 32) uma trigésima segunda cavidade que inclui uma trigé- sima segunda sonda, em que a trigésima segunda sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GTGTCACCGC (SEQ ID NO: 32);
[0066] 33) uma trigésima terceira cavidade que inclui uma trigési- ma terceira sonda, em que a trigésima terceira sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAYGGRACCR (SEQ ID NO: 33);
[0067] em que as mesmas etapas de processo são empregadas conforme descrito anteriormente.
[0068] Em uma modalidade, o cartão de teste podem incluir dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais, doze ou mais, treze ou mais, quatorze ou mais, quinze ou mais, de- zesseis ou mais, dezessete ou mais, dezoito ou mais, dezenove ou mais ou todas as ditas décima quarta a trigésima terceira cavidades (mais sondas correspondentes). As ditas uma ou mais décima quarta a trigésima terceira cavidades (mais sondas correspondentes) podem ser empregadas em combinação com ou alternativamente às ditas uma ou mais sétima a décima terceira cavidades (mais sondas corres- pondentes).
[0069] As sondas 14-30 permitem, respectivamente, a detecção sensível de:
[0070] 14) Vírus sincicial respiratório (RSV #2); (RSV #3)
[0071] 15) Enterovírus;
[0072] 16) Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS);
[0073] 17) Coronavírus de Grupo 2 OC43 e HKU1 (GP2 OC43/HKU1);
[0074] 18) Coronavírus de Grupo 1 NL63 (GP1 NL63);
[0075] 19) Coronavírus de Grupo 1 229E (229E GP1);
[0076] 20) Adenovírus humanos;
[0077] 21) Bocavírus;
[0078] 22) Influenza A (Gripe A Quad);
[0079] 23) Influenza A H1 2009 (H1 sw 2009);
[0080] 24) Influenza A N1 2009 (N1 CFI);
[0081] 25) Influenza A H1 Sazonal (H1 sazonal CFI);
[0082] 26) Influenza A H3 Sazonal (H3 sazonal CFI);
[0083] 27) Influenza A H5 (H5 CFI);
[0084] 28) Influenza A H7 (H7);
[0085] 29) Influenza A H9 (H9 a);
[0086] 30) Influenza A H9 (H9 b);
[0087] 31) Vírus da parainfluenza humana de tipo 1 (HPIV 1 #2);
[0088] 32) Vírus da parainfluenza humana de tipo 3 (HPIV 1 #3); e
[0089] 33) Rinovírus #2.
[0090] Assim, o método definido acima constitui um ensaio rápido para a detecção de qualquer um ou mais dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória em um formato de ensaio uniplex. Similarmente, o dito método constitui um ensaio rápido para a confir- mação de que todos os ditos micro-organismos causadores de infec- ção respiratória estão ausentes de uma amostra em ensaio de formato uniplex.
[0091] Em uma modalidade, o método emprega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes, em que as ditas sondas adicionais se ligam a (e, assim, detectam) agentes causadores de pneumonia atípica. Os pacientes infectados com infecções respiratórias bacteria- nas atípicas não respondem aos antibióticos convencionais, muitas vezes agravando sua condição e drenando recursos de saúde. A iden- tificação convencional em laboratório de organismos associados à pneumonia bacteriana atípica pode ser difícil, lenta e dispendiosa e, portanto, a presente invenção constitui um aprimoramento dramático a este respeito. Assim, nesta modalidade, uma ou mais sondas adicio- nais são empregadas para detectar um ou mais dos seguintes: C- hlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneu- mophila, Mycoplasma pneumonia e Coxiella burnettii. Consequente- mente, em uma modalidade, o método da presente invenção emprega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes selecionadas de:
[0092] 34) uma trigésima quarta cavidade que inclui uma trigésima quarta sonda, em que a trigésima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos AATTGGCTTT (SEQ ID NO: 34);
[0093] 35) uma trigésima quinta cavidade que inclui uma trigésima quinta sonda, em que a trigésima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GGAGAGTGTG (SEQ ID NO: 35);
[0094] 36) uma trigésima sexta cavidade que inclui uma trigésima sexta sonda, em que a trigésima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CAGACGCTGG (SEQ ID NO: 36);
[0095] 37) uma trigésima sétima cavidade que inclui uma trigésima sétima sonda, em que a trigésima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos CGGCGTTTAT (SEQ ID NO: 37);
[0096] 38) uma trigésima oitava cavidade que inclui uma trigésima oitava sonda, em que a trigésima oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CTTGGTGTGA (SEQ ID NO: 38);
[0097] 39) uma trigésima nona cavidade que inclui uma trigésima nona sonda, em que a trigésima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CTTGGTGTGA (SEQ ID NO: 39);
[0098] em que as mesmas etapas de processo são empregadas conforme descrito anteriormente.
[0099] Em uma modalidade, o cartão de teste podem incluir dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou todas as seis das ditas trigésima quarta a trigésima nona cavidades (mais sondas correspondentes). As ditas uma ou mais trigésima quarta a trigésima nona cavidades (mais sondas correspondentes) podem ser usadas em combinação com ou alternativamente às ditas décima quarta a trigési- ma terceira cavidades (mais sondas correspondentes) e/ou em combi- nação com ou alternativamente às ditas uma ou mais sétima a trigési- ma terceira cavidades (mais sondas correspondentes).
[00100] As sondas 34-39 permitem, respectivamente, a detecção sensível de:
[00101] 34) Legionella pneumophilia;
[00102] 35) Mycoplasma pneumoniae;
[00103] 36) Chlamydiophilia pneumoniae;
[00104] 37) Coxiella burnetti;
[00105] 38) Chlamydiophilia psittaci; e
[00106] 39) Chlamydiophilia abortus.
[00107] Assim, o método definido acima constitui um ensaio rápido para a detecção de qualquer um ou mais dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória em um formato de ensaio uniplex. Similarmente, o dito método constitui um ensaio rápido para a confir- mação de que todos os ditos micro-organismos causadores de infec- ção respiratória estão ausentes de uma amostra em um ensaio de formato uniplexed.
[00108] Em uma modalidade, o método da presente invenção em- prega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades de 'controle' adicionais e uma ou mais sondas de 'controle' adicionais cor- respondentes selecionadas de:
[00109] 40) uma quadragésima cavidade que inclui uma quadragé- sima sonda, em que a quadragésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos AGATCAAGGT (SEQ ID NO: 40);
[00110] 41) uma quadragésima primeira cavidade que inclui uma quadragésima primeira sonda, em que a quadragésima primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ACCTGAAGGC (SEQ ID NO: 41)
[00111] em que as mesmas etapas de processo são empregadas conforme descrito anteriormente.
[00112] Em uma modalidade, o cartão de teste pode incluir uma ou ambas das ditas quadragésima ou quadragésima primeira cavidades (mais sondas correspondentes). Sondas/alvos de sonda de 'controle" alternativos podem ser empregados. As ditas sondas de 'controle' po- dem ser usadas em combinação com qualquer uma das modalidades anteriormente descritas.
[00113] As sondas de controle 40-41 permitem, respectivamente, a detecção sensível de:
[00114] 40) Bacteriófago MS2 de Escherichia coli (MS2 IC); e
[00115] 41) Gene de ribonuclease P humana (RNAse P).
[00116] A presença de uma ou mais sondas de 'controle' permite confirmação (substancialmente simultânea) de que o ensaio é, salvo indicação em contrário, realizado normalmente. Por exemplo, a amos- tra é enriquecida com bacteriófago MS2 de Escherichia coli (MS2 IC) antes de extração de ácidos nucleicos. Detecção de ácido nucleico de bacteriófago MS2 na amostra usando a sonda de bacteriófago MS2 permite confirmação de que os vários estágios envolvidos no ensaio uniplex são realizados com êxito. Bacteriófago MS2 simplesmente constitui um exemplo de um controle interno, embora qualquer alterna- tiva adequada possa ser utilizada com o método da presente invenção.
[00117] Em uma modalidade, o cartão de teste inclui uma sonda que permite a detecção do gene de ribonuclease P humana (RNase P). A presença de ácido nucleico de RNAse P humana na amostra in-
dica que material biológico humano foi coletado. Alternativamente, ou- tros marcadores de genoma humano podem ser usados como alvos de sondas e suas sondas correspondentes podem ser incluídas no cartão de teste.
[00118] O método de ensaio da presente invenção pode incluir uma etapa de amplificação de ácido nucleico, caso no qual cada sonda da presente invenção é empregada em combinação com um par de inici- adores (direto e reverso) - o dito par de iniciadores coopera para am- plificar um trecho de ácido nucleico alvo o qual é, então, reconhecido pela sonda (por meio de ligação à mesma) durante a etapa de detec- ção. A título de exemplo, iniciadores 1f (direto) e 1r (reverso) se coor- denam com a primeira sonda e, em uso, todas as três sequências de ácidos nucleicos são incluídas na primeira cavidade. O mesmo se apli- ca aos iniciadores 2f & 2r em combinação com a segunda sonda (den- tro da segunda cavidade) aos iniciadores 41f & 41r em combinação com a quadragésima primeira sonda (dentro da quadragésima primeira cavidade).
[00119] Em uma modalidade, o método emprega um cartão de teste compreendendo uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes selecionadas de:
[00120] 42) uma quadragésima segunda cavidade que inclui uma quadragésima segunda sonda, em que a quadragésima segunda son- da tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GTGCARTTYG (SEQ ID NO: 338);
[00121] 43) uma quadragésima terceira cavidade que inclui uma quadragésima terceira sonda, em que a quadragésima terceira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos YGCYTCGGAR (SEQ ID NO: 339);
[00122] 44) uma quadragésima quarta cavidade que inclui uma quadragésima quarta sonda, em que a quadragésima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CTTGTGGANC (SEQ ID NO: 340);
[00123] 45) uma quadragésima quinta cavidade que inclui uma quadragésima quinta sonda, em que a quadragésima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CATTCCATTC (SEQ ID NO: 341);
[00124] 46) uma quadragésima sexta cavidade que inclui uma qua- dragésima sexta sonda, em que a quadragésima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos WGTGTTTGCA (SEQ ID NO: 342);
[00125] 47) uma quadragésima sétima cavidade que inclui uma quadragésima sétima sonda, em que a quadragésima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ACCACGGGAT (SEQ ID NO: 343);
[00126] 48) uma quadragésima oitava cavidade que inclui uma quadragésima oitava sonda, em que a quadragésima oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequên-
cia com a sequência de ácidos nucleicos GTCCTCGCTG (SEQ ID NO: 344);
[00127] 49) uma quadragésima nona cavidade que inclui uma qua- dragésima nona sonda, em que a quadragésima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GCCCGCGACG (SEQ ID NO: 345);
[00128] em que as mesmas etapas de processo são empregadas conforme descrito anteriormente.
[00129] As sondas 42-49 permitem, respectivamente, a detecção sensível de:
[00130] 42) Adenovírus;
[00131] 43) Adenovírus ADP17;
[00132] 44) Parechovírus;
[00133] 45) Vírus da Influenza B;
[00134] 46) Vírus da Influenza B;
[00135] 47) Mycobacterium tuberculosis;
[00136] 48) Mycobacterium tuberculosis;
[00137] 49) Micobacteria (geral);
[00138] Assim, o método definido acima constitui um ensaio rápido para a detecção de qualquer um ou mais dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória em um formato de ensaio uniplex. Similarmente, o dito método constitui um ensaio rápido para a confir- mação de que todos os ditos micro-organismos causadores de infec- ção respiratória estão ausentes de uma amostra em um ensaio de formato uniplexed.
[00139] O iniciador 1f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- AGCWGGATTCTACC (SEQ ID NO: 42) e o iniciador 1r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TCCCATTATGCCTAG (SEQ ID NO: 43).
[00140] O iniciador 2f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCT- GAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 44) e o iniciador 2r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO: 45).
[00141] O iniciador 3f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATCCCACAAAAYCAG (SEQ ID NO: 46) e o iniciador 3r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com CTACACATAATAARA (SEQ ID NO: 47).
[00142] O iniciador 4f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO: 48) e o iniciador 4r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO: 49).
[00143] O iniciador 5f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO: 50) e o iniciador 5r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TGGACAAAKCGTCTA (SEQ ID NO: 51).
[00144] O iniciador 6f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGR- TACGCTGCAGAC (SEQ ID NO: 52) e o iniciador 6r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGTCCAGACATCTAG (SEQ ID NO: 53).
[00145] O iniciador 7f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- TACTCAGAGACCCA (SEQ ID NO: 54) e o iniciador 7r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com ATAYTGTTGCATAGC (SEQ ID NO: 55).
[00146] O iniciador 8f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGCTCCTGATCARCC (SEQ ID NO: 56) e o iniciador 8r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TCCCACCATRGCATA (SEQ ID NO: 57).
[00147] O iniciador 9f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TATCCTCAGAGATCC (SEQ ID NO: 58) e o iniciador 9r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com ACATACTGTTGCATG (SEQ ID NO: 59).
[00148] O iniciador 10f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTTGTACAGGARATG (SEQ ID NO: 60) e o iniciador 6r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TCCCACCATRGCATA (SEQ ID NO: 61).
[00149] O iniciador 11f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com RGTSGAYCCCATGGA (SEQ ID NO: 62) e o iniciador 11r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com SGGYGTRCGSAGGTA (SEQ ID NO: 63).
[00150] O iniciador 12f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 64) e o iniciador 12r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com CCCTGCAYACACATG (SEQ ID NO: 65).
[00151] O iniciador 13f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 66) e o iniciador 13r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com CCCTGCAYACACATG (SEQ ID NO: 67).
[00152] O iniciador 14f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CATCTGYTTAACAAG (SEQ ID NO: 68) ou GGARACATACGTGAA (SEQ ID NO: 260) e o iniciador 14r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AAGAIACTGATCCTG (SEQ ID NO: 69) ou ATTGTAYTGAA- CAGC (SEQ ID NO: 261).
[00153] O iniciador 15f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 70) e o iniciador 15r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com CGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO: 71).
[00154] O iniciador 16f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTATCCAAAATGTGA (SEQ ID NO: 72) e o iniciador 16r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO: 73).
[00155] O iniciador 17f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTATCCTAARTGTGA (SEQ ID NO: 74) e o iniciador 17r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com ATCACCACTRCTAGT (SEQ ID NO: 75).
[00156] O iniciador 18f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTATCCCAAATGTGA (SEQ ID NO: 76) e o iniciador 18r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com AGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO: 77).
[00157] O iniciador 19f compreende uma sequência de ácidos nu-
cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTATCCTAAGTGTGA (SEQ ID NO: 78) e o iniciador 19r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO: 79).
[00158] O iniciador 20f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com KCNTACATGCACATC (SEQ ID NO: 80) e o iniciador 20r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO: 81).
[00159] O iniciador 21f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO: 82) e o iniciador 21r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TGTTCACTCGCCGGA (SEQ ID NO: 83).
[00160] O iniciador 22f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com MGAGGTCGAAACGTA (SEQ ID NO: 84) e o iniciador 22r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CACGGTGAGCGTRAA (SEQ ID NO: 85).
[00161] O iniciador 23f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO: 86) e o iniciador 23r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com ATGCTTGTCTTCTAG (SEQ ID NO: 87).
[00162] O iniciador 24f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATCAGTTGGCTAACA (SEQ ID NO: 88) e o iniciador 24r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com AGCCACTGCCCCATT (SEQ ID NO: 89).
[00163] O iniciador 25f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCCCCCTACAATTG (SEQ ID NO: 90) e o iniciador 25r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com ATTCTGGGTTTCCTA (SEQ ID NO: 91).
[00164] O iniciador 26f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTTGAACGCAGCAA (SEQ ID NO: 92) e o iniciador 26r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GCAACTAGTGACCTA (SEQ ID NO: 93).
[00165] O iniciador 27f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGATGCMATMAAYT (SEQ ID NO: 94) e o iniciador 27r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com CCATTGGAGTTTGAC (SEQ ID NO: 95).
[00166] O iniciador 28f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTTCGGGGCRTCATG (SEQ ID NO: 96) ou YAGYGGITACAARGA (SEQ ID NO: 262) e o iniciador 28r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CYGCATGTTTCCRTT (SEQ ID NO: 97) ou AIRAARCAT- GAYGCC (SEQ ID NO: 263).
[00167] O iniciador 29f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com IGGYYACCARTCAAC (SEQ ID NO: 98) e o iniciador 29r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com YARCATYCCATTGTG (SEQ ID NO: 99).
[00168] O iniciador 30f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com YGAYCARTGCATGGA (SEQ ID NO: 100) e o iniciador 30r compreen-
de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGCRACAGTIGAATA (SEQ ID NO: 101).
[00169] O iniciador 31f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGATGGAACCGTYAA (SEQ ID NO: 102) e o iniciador 31r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTGTTGTGACCTCAT (SEQ ID NO: 103).
[00170] O iniciador 32f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com RGCTTTCAGACAAGA (SEQ ID NO: 104) e o iniciador 32r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GACCGCATGATTGAC (SEQ ID NO: 105).
[00171] O iniciador 33f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 106) e o iniciador 33r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO: 107).
[00172] O iniciador 34f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGCAAGACGCTATG (SEQ ID NO: 108) e o iniciador 34r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTCTTTCATTTGCTG (SEQ ID NO: 109).
[00173] O iniciador 35f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTGGCAGTTGGGTCA (SEQ ID NO: 110) e o iniciador 35r compre-
ende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTTGATCCGCCCACA (SEQ ID NO: 111).
[00174] O iniciador 36f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TA- TAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO: 112) e o iniciador 36r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GATGGTCGCAGACTT (SEQ ID NO: 113).
[00175] O iniciador 37f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CATCGTTCCCGGCAG (SEQ ID NO: 114) e o iniciador 37r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTTTACTAATCCCCA (SEQ ID NO: 115).
[00176] O iniciador 38f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO: 116) e o iniciador 38r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGCGGATGCTAATGG (SEQ ID NO: 117).
[00177] O iniciador 39f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO: 118) e o iniciador 39r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCCTGCGCGGATGCT (SEQ ID NO: 119).
[00178] O iniciador 40f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTCTCCGTATTCACG (SEQ ID NO: 120) e o iniciador 40r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GACCCCACGATGAC (SEQ ID NO: 121).
[00179] O iniciador 41f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTGGACCTGCGAGCG (SEQ ID NO: 122) e o iniciador 41r compre- ende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTGTCTCCACAAGT (SEQ ID NO: 123).
[00180] O iniciador 42f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com KCNTACATGCACATC (SEQ ID NO: 80) e o iniciador 42r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO: 81).
[00181] O iniciador 43f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com I- TACATGCAYATCKC (SEQ ID NO: 267) e o iniciador 43r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com GGCRAAYTGCACCAG (SEQ ID NO: 268) or GGCAAACTGCACGAG (SEQ ID NO: 269).
[00182] O iniciador 44f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGATGGCGTRCCATA (SEQ ID NO: 272) e o iniciador 44r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACTAGAGGATGGCTG (SEQ ID NO: 273).
[00183] O iniciador 45f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTATGAACACAGCA (SEQ ID NO: 276) e o iniciador 45r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTGGACGTCTTCTCC (SEQ ID NO:
277).
[00184] O iniciador 46f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO: 48) e o iniciador 46r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de iden- tidade de sequência com TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO: 49).
[00185] O iniciador 47f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTAACACGTGGGTGA (SEQ ID NO: 280) e o iniciador 47r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO: 281).
[00186] O iniciador 48f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO: 284) e o iniciador 48r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGTCGGGACGGTGAG (SEQ ID NO: 285).
[00187] O iniciador 49f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO: 284) e o iniciador 49r compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGTCGGGACGGTGAG (SEQ ID NO: 285).
[00188] A amostra biológica é, tipicamente, uma amostra que tenha sido tirada de um paciente (isto é, uma amostra ex vivo e/ou isolada). Em uma modalidade, uma etapa de extração de ácido nucleico pode ser realizada sobre a amostra - protocolos convencionais de extração de ácido nucleico são bem conhecidos na técnica. A amostra de ácido nucleico extraída é, então, aplicada ao cartão de teste de modo que ela contate cada uma das cavidades (e, assim, cada uma das sondas dentro das ditas cavidades).
[00189] A etapa de "reação de hibridização" de ácido nucleico (compreendendo sonda e iniciadores que trabalham em conjunto) da presente invenção é, tipicamente, realizada em uma temperatura de 50-70 °C (por exemplo, 55-65 °C ou 56-64 °C ou 57-6 3 °C ou 58-62 °C ou 59-61 °C ou aproximadamente 60 °C). A dita tempe ratura é, tipica- mente, mantida durante um período de tempo de 10-30 segundos (por exemplo, 15-25 segundos ou 17-23 segundos ou 19-21 segundos ou aproximadamente 20 segundos). Se uma etapa de amplificação de ácido nucleico é incluída no método da invenção, a dita etapa de "rea- ção de hibridização" (compreendendo sonda e iniciadores adicionados em excesso no início) é, de preferência, incluída em cada ciclo da eta- pa de amplificação.
[00190] Se uma etapa de amplificação de ácido nucleico é empre- gada, esta etapa é, tipicamente, realizada em uma temperatura de 90- 100 °C (por exemplo, 92-98 °C ou 94-96 °C ou aproxi madamente 95 °C) durante um período típico de 0,1-10 segundos (p or exemplo, 0,5-5 segundos ou 0,7-2 segundos ou aproximadamente 1 segundo), segui- do por uma temperatura reduzida de 50-70 °C (por ex emplo, 55-65 °C ou 57-63 °C ou 59 -61 °C ou aproximadamente 60 °C) durante um pe- ríodo de 10-30 segundos (por exemplo, 15-25 segundos ou 17-23 se- gundos ou 19-21 segundos ou aproximadamente 20 segundos). Se uma etapa de amplificação de ácido nucleico é empregada, a dita eta- pa inclui, tipicamente, 35-55 ciclos (por exemplo, 40-50 ciclos ou 44-46 ciclos ou aproximadamente 45 ciclos). Uma etapa de transcrição re- versa é, tipicamente, empregada logo no início em uma temperatura de 40-60 °C (por exemplo, 45-55 °C ou 48-52 °C ou a proximadamente 50 °C) durante um período de tempo de 3-7 minutos, (por exemplo, 4-6 minutos ou aproximadamente 5 minutos).
[00191] Em uma modalidade, o método pode ser realizado em um instrumento Applied Biosystems 7900HT (alto rendimento). A título de exemplo, o dito instrumento pode empregar uma plataforma de RT- PCR de cartão de teste (também conhecido como placa) com 384 ca- vidades que permite, por exemplo, que oito amostras diferentes sejam analisadas em paralelo através de 8 colunas distintas presentes em um único cartão de teste - vide Figura 1. Cada coluna pode compreen- der 48 cavidades alvo individuais, deste modo, permitindo que cada amostra sofra triagem (de modo substancialmente simultâneo) para 48 diferentes micro-organismos causadores de infecção respiratória (efe- tivamente 46 micro-organismos causadores de infecção respiratória de duas cavidades de 'controle' são empregados). Aparelhos e sistemas alternativos (incluindo cartões de teste correspondentes) estão dispo- níveis comercialmente e têm igual aplicação no contexto da presente invenção.
[00192] Em uma modalidade, o método emprega PCR, tal como RT-PCR.
[00193] Em uso, uma amostra (tipicamente amostras de ácidos nu- cleicos extraídas) é misturada com tampão 2 vezes a 5 vezes concen- trado (por exemplo, tampão de PCR; também referido como mistura de reação). Por exemplo, X µl de amostra são misturados com o mesmo volume (X µl) de tampão 2 vezes concentrado. A amostra (incluindo tampão) é, então, aplicada ao cartão de teste (e em cada cavidade) - tipicamente, um volume na faixa de 0,1-50 µl ou 0,5-30 µl ou 0,5-20 µl ou 0,5-10 µl ou 1-5 µl é distribuído a cada cavidade. De preferência, aproximadamente 0,5 µl, 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl ou 5 µl de amostra (inclu- indo tampão) são distribuídos a cada cavidade.
[00194] No caso de um cartão de teste que compreende um arranjo de colunas de cavidades (vide, por exemplo, Figura 1), a amostra (in- cluindo tampão) pode simplesmente ser aplicada a um reservatório na parte superior de cada coluna e o cartão de teste, então, centrifugado em uma centrífuga para distribuir amostra mais mistura de reagentes (na faixa de volume conforme identificado acima) a cada uma das ca- vidades que formam cada coluna. No caso do sistema AB7900HT, ca- da cavidade compreende, tipicamente, 48 cavidades, de modo que amostra é aplicada por meio de distribuição centrífuga para cada um das ditas 48 cavidades. Em maiores detalhes, até 8 amostras podem ser adicionadas, respectivamente, aos 8 reservatórios na parte superi- or de cada coluna (por exemplo, com uma pipeta). Fazendo referência à Figura 1, as pequenas saliências indicam as cavidades de ensaio distintas as quais, por sua vez, incluem as sondas correspondentes (e opcionalmente os iniciadores correspondentes). O cartão de teste ilus- trado mostra uma configuração na qual 48 cavidades (também referi- das como saliências) estão presentes por canal - em uso, cada cavi- dade recebe, tipicamente, um volume de reação final de 1 µl por meio de distribuição centrífuga abaixo do canal da coluna.
[00195] Cada cavidade inclui um tipo de sonda específico da pre- sente invenção (e opcionalmente o par de iniciadores correspondente). Em uma modalidade, a dita sonda está presente na sua cavidade em uma forma liofilizada. Assim, uma vez que a amostra líquida tenha sido aplicada à superfície das cavidades, a sonda liofilizada (incluindo op- cionalmente o par de iniciadores correspondente) se torna reidratada, deste modo, permitindo que a etapa de detecção prossiga dentro de um meio líquido.
[00196] Uma cavidade da presente invenção é concebida para con- ter ligeiramente mais do que o volume correspondente de líquido (a- mostra mais tampão/mistura de reação) do ensaio do que deve ser realizado na dita cavidade. Cada cavidade é distinta para permitir a localização de um único tipo de sonda dentro de uma única cavidade, deste modo, permitindo o método para detectar a presença ou ausên-
cia de micro-organismos alvo específicos. Após aplicação da amostra ao cartão de teste, todas as cavidades contendo sonda(s) podem ser fechadas hermeticamente usando um ou mais filmes/folhas, deste mo- do, impedindo a migração acidental de líquido (e potencialmente son- das) entre as cavidades. Uma cavidade da presente invenção pode ser posicionada no mesmo plano horizontal que o cartão de teste, embora também possa ser posicionada acima ou abaixo do dito plano.
[00197] Em comparação com uma bateria padrão de configurações de reação multiplex, a presente invenção oferece economia de tempo e recursos nas manipulações de configurações de reação e permite o agrupamento de dados de vários instrumentos.
[00198] A presente invenção também fornece um cartão de teste para uso nos métodos descritos anteriormente. Em uma modalidade, o cartão de teste é feito a partir de um material plástico. Para fins de a- judar o usuário, o cartão de teste deve ter uma rigidez suficiente para suportar o peso do cartão (incluindo amostra aplicada), por exemplo, quando em uma posição substancialmente horizontal, conforme tipi- camente mantido pelo usuário durante uso normal.
[00199] O cartão de teste compreende uma pluralidade de cavida- des (opcionalmente dispostas em um formato de coluna para permitir a aplicação da amostra através de distribuição por centrifugação), em que pelo menos seis cavidades são fornecidas e em que a primeira cavidade inclui a primeira sonda, a segunda também inclui a segunda sonda, a terceira cavidade inclui a terceira sonda, a quarta cavidade inclui a quarta sonda, a quinta cavidade inclui a quinta sonda e a sexta cavidade inclui a sexta sonda da presente invenção, conforme definido aqui. Cada cavidade inclui, tipicamente, apenas (uma pluralidade de) uma sonda específica da presente invenção. A título de exemplo, em uma modalidade, a primeira sonda está presente na primeira cavidade (embora tipicamente ausente de qualquer uma das outras cavidades)
e a segunda sonda está presente na segunda cavidade (embora tipi- camente ausente de qualquer uma das outras cavidades) e assim por diante.
[00200] Cada sonda pode, opcionalmente, estar associada ao seu par de iniciador correspondente. Assim, além da primeira sonda, a primeira cavidade pode incluir o primeiro par de iniciadores direto e reverso correspondentes. Cada cavidade inclui, tipicamente, apenas (uma pluralidade de) um par de iniciadores específicos da presente invenção. A título de exemplo, em uma modalidade, o primeiro par de iniciadores (e a primeira sonda) está presente na primeira cavidade, mas tipicamente ausente de qualquer uma das outras cavidades e o segundo par de iniciadores (e a segunda sonda) está presente na se- gunda cavidade, mas tipicamente ausente de qualquer uma das outras cavidades e assim por diante. Alternativamente, mais de uma sonda (e opcionalmente seu par de iniciadores correspondente) pode estar pre- sente em uma única cavidade.
[00201] Cada sonda pode ser imobilizada dentro de sua respectiva cavidade - a dita imobilização pode ser permanente (por exemplo, a- través de uma ligação covalente, opcionalmente introduzida por quais- quer reagentes de ligação cruzada químicos disponíveis comercial- mente) ou transitória (por exemplo, através de uma ligação não cova- lente, tal como uma ligação de hidrogênio ou através de uma ligação iônica). Por exemplo, a primeira sonda pode ser imobilizada dentro da primeira cavidade e a segunda sonda pode ser imobilizada dentro da segunda cavidade e assim por diante. Imobilização das respectivas sondas torna os cartões de teste mais fáceis de manusear, melhora a estabilidade de armazenamento e minimiza o risco de migração de sonda entre cavidades. As sondas são, de preferência, imobilizadas dentro das cavidades por simples adsorção sobre uma superfície pre- sente nas cavidades tal como, por exemplo, uma parede de uma cavi-
dade. Assim, em uma modalidade, uma solução contendo a sonda é preparada, aplicada à superfície de uma cavidade e depois deixada secar sobre a superfície da cavidade. Compostos estabilizantes con- vencionais (por exemplo, açúcares) podem ser adicionados à solução contendo sonda antes de aplicação à superfície de uma cavidade.
[00202] O cartão de teste pode incluir uma ou mais cavidades adi- cionais selecionadas da sétima cavidade a décima terceira cavidade (incluindo, respectivamente, as sétima a décima terceira sondas), con- forme descrito aqui. Por exemplo, o cartão pode incluir cada uma das sétima cavidade a décima terceira cavidade (incluindo, respectivamen- te, as sétima a décima terceira sondas).
[00203] O cartão de teste pode, alternativa ou adicionalmente, inclu- ir uma ou mais cavidades adicionais selecionadas das décima quarta cavidade a trigésima terceira cavidade (incluindo, respectivamente, a décima quarta a trigésima terceira sondas), conforme descrito aqui. Por exemplo, o cartão pode incluir cada uma das décima quarta cavi- dade a trigésima terceira cavidade (incluindo, respectivamente, a dé- cimo quarta a trigésima terceira sondas).
[00204] Cada uma das modalidades do cartão de teste descritas acima pode ainda incluir uma ou mais cavidades para detecção de a- gentes causadores de infecção respiratória microbianos atípicos (por exemplo, bacterianos). Nesta modalidade, o cartão de teste pode ain- da incluir uma ou mais cavidades adicionais selecionadas da trigésima quarta cavidade a trigésima nona cavidade (incluindo, respectivamen- te, a trigésima quarta a trigésima nona sondas), conforme descrito a- qui. Por exemplo, o cartão pode incluir cada uma das trigésimo quarta cavidade a trigésima nona cavidade (incluindo, respectivamente, a tri- gésimo quarta a trigésima nona sondas).
[00205] Cada uma das modalidades do cartão de teste descrito a- cima pode ainda incluir uma ou mais cavidades de 'controle'. Nesta modalidade, o cartão de teste pode ainda incluir uma ou ambas das quadragésima e quadragésima primeira cavidades (incluindo, respecti- vamente, as quadragésima e/ou quadragésima primeira sondas), con- forme descrito aqui.
[00206] Referência a pelo menos 80% de identidade de sequência inclui pelo menos 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo me- nos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e 100% de identi- dade de sequência (para toda e cada sequência de ácidos nucleicos apresentada aqui e/ou toda e cada SEQ ID NO apresentada aqui).
[00207] O código de referência de uma letra para nucleotídeos em- pregado ao longo do presente relatório descritivo, significa: A adenina C citosina G guanina T timina U uracila I inosina X inosina R guanina ou adenina Y timina ou citosina K guanina ou timina M adenina ou citosina S guanina ou citosina W adenina ou timina B não adenina D não citosina H não guanina
V não timina N qualquer base de ácido nucleico
[00208] Todas as sequências de ácido nucleico apresentadas aqui são apresentadas em uma orientação 5'- para 3'- (da esquerda para a direita).
[00209] As sondas da invenção são concebidas para hibridizar com sua sequência de ácidos nucleicos alvo presente no micro-organismo alvo causador de infecção respiratória em questão. É preferível que as condições de ligação sejam tais que um nível elevado de especificida- de seja conferido - ou seja, hibridização da sonda ocorre sob "condi- ções estringentes". Em geral, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C menor do que ponto de fusã o térmico (Tm) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da se- quência alvo (ou complementar) hibridiza com uma sonda perfeitamen- te correspondente. A este respeito, a Tm de sondas da presente inven- ção em uma concentração de sal de cerca de 0,02 M ou menos em um pH 7 é, por exemplo, acima de 60 °C, tal como cerca de 70 °C.
[00210] Soluções tampão pré-misturadas estão comercialmente disponíveis (por exemplo, EXPRESSHYB Hybridisation Solution da CLONTECH Laboratories, Inc.) e a hibridização pode ser realizada de acordo com as instruções do fabricante.
[00211] Sondas da presente invenção sofrem triagem para minimi- zar a autocomplementariedade e formação de dímero (ligação de son- da-sonda) e são selecionadas de modo a ter uma homologia mínima com o DNA humano. O processo de seleção envolve, tipicamente, a comparação de uma sequência de sonda candidata com DNA humano e rejeição da sonda se a homologia é superior a 50%. O objetivo deste processo de seleção é reduzir o recozimento da sonda às sequências de DNA humanas contaminantes e, consequentemente, permitir espe-
cificidade aprimorada do ensaio.
[00212] Qualquer das sondas descritas aqui pode compreender um marcador e/ou etiqueta. O marcador e/ou etiqueta pode, por exemplo, estar localizada (independentemente um do outro) no meio ou em di- reção ou na extremidade 5' ou 3' das sondas descritas aqui, por exem- plo, na extremidade 5'.
[00213] Consequentemente, na sequência de hibridização de sonda marcada/etiquetada ao ácido nucleico alvo, o marcador/etiqueta está associada ao ácido nucleico alvo. Alternativamente, se uma etapa de amplificação é empregada, as sondas podem atuar como iniciadores durante o método da invenção e o marcador/etiqueta pode, portanto, se tornar incorporado no produto de amplificação à medida que o inici- ador é ampliado.
[00214] Exemplos de marcadores adequados incluem marcadores detectáveis, tais como marcadores radioativos ou moléculas fluores- centes ou coloridas, marcadores enzimáticos ou marcadores cromo- gênicos - por exemplo, corantes que produzem uma alteração de cor visível quando de hibridização da sonda. A título de exemplo, o mar- cador pode ser digoxigenina, fluoresceína-isotiocianato (FITC), R- ficoeritrina, Alexa 532 ou Cy3. As sondas contêm, de preferência, um marcador Fam (por exemplo, um marcador 5' Fam) e/ou um ligante da ranhura menor (Minor Groove Binder - MGB). O marcador pode ser uma molécula repórter, a qual é detectada diretamente, tal como por exposição a um filme fotográfico ou raios X. Alternativamente, o mar- cador não é diretamente detectável, mas pode ser detectado indireta- mente, por exemplo, em um sistema de duas fases. Um exemplo de detecção indireta de marcador é ligação de um anticorpo ao marcador.
[00215] Exemplos de marcadores adequados incluem "pares de complemento/anticomplemento". O termo "par de complemen- to/anticomplemento" denota porções não idênticas que formam um par não covalentemente associado, estável sob condições adequadas. Exemplos de marcadores adequados incluem biotina e estreptavidina (ou avidina). A título de exemplo, um marcador de biotina pode ser capturado usando estreptavidina, a qual pode ser revestida sobre um substrato ou suporte, tal como uma esfera (por exemplo, uma esfera magnética) ou membrana. Similarmente, um marcador de estreptavidi- na pode ser capturado usando biotina, a qual pode ser revestida sobre um substrato ou suporte, tal como uma esfera (por exemplo, uma esfe- ra magnética) ou membrana. Outros pares de complemen- to/anticomplemento exemplificativos incluem pares de receptor/ligante, pares de anticorpo/antígeno (ou hapteno ou epítopo) e similares. Outro exemplo é um marcador de sequência de ácidos nucleicos que se liga a uma sequência complementar. A última pode, em si, ser pré- marcada ou pode ser ligada a uma superfície (por exemplo, uma esfe- ra) que é separadamente marcada. Um exemplo da última modalidade é o sistema de esfera LuminexR bem conhecido. Outros pares exempli- ficativos de marcadores e moléculas de captura incluem pares de re- ceptor/ligante e pares de anticorpo/antígeno (ou hapteno ou epítopo). Onde subsequente dissociação do par de complemen- to/anticomplemento é desejável, o par de complemen- to/anticomplemento tem uma afinidade de ligação, por exemplo, de menos de 109 M-1.
[00216] As sondas da invenção podem ser marcadas com diferen- tes etiquetas ou marcadores, deste modo, permitindo a identificação individualizada de cada sonda quando usada no método da presente invenção.
[00217] Qualquer método convencional pode ser empregado para ligar os marcadores de ácido nucleico a uma sonda da presente inven- ção (por exemplo, à extremidade 5' da região de ligação definida da sonda). Alternativamente, as sondas de ácidos nucleicos da presente invenção (com marcadores de ácidos nucleicos pré-ligados) pode ser construídas por fornecedores comerciais.
[00218] A amostra é, por exemplo, uma amostra clínica (ou é deri- vada de uma amostra clínica), tal como: fezes ou sangue, escarro, es- fregaços do nariz e garganta, lavagem brônquioalveolar, aspirado tra- queal, aspirado nasofaringeal, amostras de tecido do pulmão, líquido cefalorraquidiano, amostras arqueológicas. A amostra é, de preferên- cia, um tecido/amostra humana ou é uma amostra derivada do mesmo (por exemplo, uma amostra extraída de ácido nucleico).
[00219] Se uma etapa de amplificação é empregada, esta etapa pode ser realizada usando métodos e plataformas conhecidos na téc- nica, por exemplo, PCR (por exemplo, com o uso de "DNA polimerase Fast", Life Technologies), tal como PCR em tempo real, PCR com ba- se em bloco, reação em cadeia da ligase, capilares de vidro, métodos de amplificação isotérmica, incluindo amplificação mediada por ciclo isotérmico, amplificação mediada por transcrição por amplificação "rol- ling circle", amplificação com base em sequência de ácidos nucleicos, amplificação mediada por sinal da tecnologia de RNA, amplificação por deslocamento de fita, amplificação por deslocamento múltiplo isotérmi- co, amplificação dependente de helicase, amplificação isotérmica de um único iniciador e amplificação dependente de helicase circular.
[00220] Se empregada, amplificação pode ser realizada usando qualquer plataforma de amplificação - como tal, uma vantagem desta modalidade do ensaio é que ela é independente da plataforma e não está presa a um determinado instrumento.
[00221] Em uma modalidade, uma etapa de amplificação geral (pré- detecção por exemplo) pode ser empregada para aumentar a quanti- dade de ácido nucleico alvo presente na amostra. Nesta modalidade, iniciadores de amplificação por PCR são, tipicamente, empregados para amplificar aproximadamente 100-400 pares de bases de regiões do ácido nucleico alvo/complementar que contêm os alvos nucleotídi- cos da presente invenção. Na presença de uma polimerase e precur- sores de DNA adequados (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iniciadores direto e reverso são estendidos na direção 5' para 3', deste modo, ini- ciando a síntese de novas fitas de ácidos nucleicos que são comple- mentares às fitas individuais do ácido nucleico alvo. Os iniciadores, deste modo, dirigem a amplificação de sequências de ácidos nucleicos alvo, assim, gerando produtos de amplificação compreendendo as di- tas sequências de ácidos nucleicos alvo.
[00222] Em uma modalidade, uma etapa de amplificação pode ser empregada na qual as sondas da presente invenção atuam como ini- ciadores. Nesta modalidade, as sondas (que atuam como iniciadores) são estendidas a partir de suas extremidades 3' (isto é, em uma dire- ção 5'- para 3'-). Os produtos de amplificação resultantes compreen- dem, tipicamente, regiões de 100-400 pares de bases do ácido nuclei- co alvo/complementar. Esta modalidade pode ser empregada em con- junto com uma etapa de amplificação geral, conforme descrito acima.
[00223] A etapa de detecção pode ser realizada por quaisquer mei- os conhecidos. A este respeito, o produto da sonda ou amplificação pode ser etiquetado e/ou marcado e o método de detecção pode, por- tanto, compreender detecção do dito marcador e/ou etiqueta.
[00224] Em uma modalidade, a(s) sonda(s) pode(m) compreender um marcador e/ou etiqueta. Assim, em uma modalidade, após hibridi- zação da sonda marcada/etiquetada ao ácido nucleico alvo, o marca- dor/etiqueta se torna associada ao ácido nucleico alvo. Assim, em uma modalidade, o ensaio pode incluir detecção do marcador/etiqueta e correlação da presença do marcador/etiqueta com a presença de áci- do nucleico de micro-organismo infeccioso.
[00225] Em uma modalidade, a etiqueta e/ou marcador pode ser incorporado durante extensão da(s) sonda(s). Ao fazê-lo, o(s) produ-
to(s) de amplificação se torna(m) etiquetados/marcados e o ensaio po- de, portanto, compreender detecção da etiqueta/marcador e correla- ção da presença da etiqueta/marcador com a presença do produto de amplificação e, consequentemente, a presença do ácido nucleico de micro-organismo infeccioso.
[00226] A título de exemplo, em uma modalidade, o produto de am- plificação pode incorporar uma etiqueta/marcador (por exemplo, atra- vés de um dNTP etiquetado/marcado, tal como biotina-dNTP) como parte do processo de amplificação e o ensaio pode ainda compreender o uso de um parceiro de ligação complementar à dita etiqueta (por e- xemplo, estreptavidina) que inclui uma etiqueta/marcador detectável (por exemplo, um marcador fluorescente, tal como R-ficoeritrina). Des- ta forma, o produto amplificado incorpora uma etiqueta/marcador de- tectável (por exemplo, um marcador fluorescente, tal como R- ficoeritrina).
[00227] Em uma modalidade, a(s) sonda(s) e/ou o(s) produto(s) de amplificação pode(m) incluir uma outra etiqueta/marcador (como o componente de complemento) para permitir captura do(s) produto(s) de amplificação.
[00228] A título de exemplo, um emparelhamento de "complemen- to/anticomplemento" pode ser empregado, no qual um componente de captura de anticomplemento se liga à dita outra etiqueta/marcador (componente do complemento) e, assim, permite captura da(s) son- da(s) e/ou produto(s) de amplificação. Exemplos de parceiros de "complemento/anticomplemento" adequados foram descritos anterior- mente no presente relatório descritivo, tal como um par complementar de sequências de ácidos nucleicos, um par complementar de anticor- po-antígeno, etc. O componente de captura de anticomplemento pode ser ligado (por exemplo, revestido) a um substrato ou suporte sólido - exemplos de substratos/suportes adequados incluem membranas e/ou esferas (por exemplo, uma esfera magnética ou fluorescente). Méto- dos de captura são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, esferas LuminexR podem ser empregadas. Alternativamente, o uso de esferas magnéticas pode ser vantajoso porque as esferas (mais produto de amplificação capturado, marcado/etiquetado) podem ser facilmente concentradas e separadas da amostra usando métodos convencionais conhecidos na técnica.
[00229] Imobilização proporciona uma localização física para o componente de captura de anticomplemento (ou sondas) e pode servir para fixar o componente de captura/sonda em uma localização dese- jada e/ou facilitar a recuperação ou separação da sonda. O suporte pode ser um suporte sólido rígido feito, por exemplo, de vidro ou plás- tico, tal como uma esfera (por exemplo, uma esfera fluorescente ou magnética). Alternativamente, o suporte pode ser uma membrana, tal como uma membrana de náilon ou nitrocelulose. Matrizes 3D são também suportes adequados para uso com a presente invenção - por exemplo, géis de poliacrilamida ou PEG. Imobilização a um supor- te/plataforma pode ser obtida por uma variedade de meios convencio- nais. A título de exemplo, imobilização sobre um suporte, tal como uma membrana de náilon, pode ser realizada por meio de ligação cru- zada com UV. Alternativamente, as moléculas marcadas com biotina podem ser ligadas a substratos revestidos com estreptavidina (e vice- versa) e moléculas de aminoácidos preparadas com ligantes podem ser imobilizadas sobre superfícies silanizadas. Outro meio de imobili- zação é através de uma cauda de poli-T ou uma cauda de poli-C, por exemplo, na posição 3' ou 5'. As ditas técnicas de imobilização se apli- cam igualmente ao componente de sonda (e ao componente iniciador do par, se presente) da presente invenção.
[00230] Em uma modalidade, as sondas da invenção compreendem uma sequência de etiqueta/marcador de ácido nucleico (por exemplo,
ligada a cada sonda na extremidade 5' da sequência definida da sonda que se liga ao ácido nucleico alvo/complementar). Em maiores deta- lhes, cada uma das sondas é dotada de uma sequência de ácidos nu- cleicos de etiqueta/marcador diferente, em que cada uma das ditas etiquetas/marcadores se liga (especificamente) a uma sequência de ácidos nucleicos complementar presente sobre a superfície de uma esfera. Cada uma das diferentes etiquetas/marcadores se liga à sua sequência complementar homóloga (e não a qualquer uma das se- quências complementares homólogas das outras etiquetas), a qual está localizada sobre uma esfera unicamente identificável. A este res- peito, as esferas são unicamente identificáveis, por exemplo, por meio de fluorescência em um comprimento de onda específico. Assim, em uso, as sondas da invenção se ligam ao ácido nucleico alvo (se pre- sente na amostra). Posteriormente, (apenas) as sondas ligadas podem ser estendidas (na direção 3') na presença de um ou mais dNTPs mar- cados (por exemplo, dNTPs marcados com biotina, tal como biotina- dCTPs).
[00231] Os iniciadores estendidos podem ser contatados com um parceiro de ligação homólogo aos dNTPs marcados (por exemplo, um fluoroforo marcado com estreptavidina, tal como R-ficoeritrina marcada com estreptavidina), os quais se ligam a esses dNTPs marcados que se tornaram incorporados nos iniciadores estendidos. Depois disso, os iniciadores estendidos marcados podem ser identificados permitindo que os mesmos se liguem a seus ácidos nucleicos homólogos presen- tes sobre as esferas unicamente identificáveis. Os últimos podem, en- tão, ser "chamados" (por exemplo, para determinar o tipo de esfera presente por emissão de comprimentos de onda) e a natureza da ex- tensão do iniciador (e, portanto, o tipo de ácido nucleico al- vo/complementar presente) pode ser determinada. Modalidades Preferidas da Presente Invenção
[00232] A primeira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TAGGCAATGCWGC (SEQ ID NO: 124).
[00233] A segunda sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCYGGGAYGGGACCRACTA (SEQ ID NO: 125).
[00234] A terceira sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCAGCACCAGACACACC (SEQ ID NO: 126).
[00235] A quarta sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCTGGTCATTGGRGCC (SEQ ID NO: 127).
[00236] A quinta sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGCTCACTGGGCACGGT (SEQ ID NO: 128).
[00237] A sexta sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AACTGRGTGTTCATTTTGT (SEQ ID NO: 129).
[00238] A sétima sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- TARTTTCCAGGGGCAAA (SEQ ID NO: 130).
[00239] A oitava sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCATCCGCAAGTCAATG (SEQ ID NO: 131).
[00240] A nona sonda compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- TAGTTGCCTGGTGCGAA (SEQ ID NO: 132).
[00241] A décima sonda compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTGATAARGTAGGTGCTT (SEQ ID NO: 133).
[00242] A décima primeira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGCGGCRTCATYGA (SEQ ID NO: 134).
[00243] A décima segunda sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTCATARTGRTAATTAG (SEQ ID NO: 135).
[00244] A décima terceira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTCATAGTAATAATTAG (SEQ ID NO: 136).
[00245] A décima quarta sonda compreende uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGTACTGTGACAATGC (SEQ ID NO: 137) ou CAC- GARGGCTCCACRTAC (SEQ ID NO: 286).
[00246] A décima quinta sonda compreende uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCTGYRGCGGAACCGACT (SEQ ID NO: 138).
[00247] A décima sexta sonda compreende uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGCTAACGAGTGTGCG (SEQ ID NO: 139).
[00248] A décima sétima sonda compreende uma sequência de á- cidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTTGCGAATGAATGYGC (SEQ ID NO: 140).
[00249] A décima oitava sonda compreende uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTGGGYTCTAAGCATGTTA (SEQ ID NO: 141).
[00250] A décima nona sonda compreende uma sequência de áci- dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTAGGTTCTAAGCATGTCA (SEQ ID NO: 142).
[00251] A vigésima sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com
CYTCGGAGTAYCTSAGYCC (SEQ ID NO: 143).
[00252] A vigésima primeira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCAGACTGCATCCGGTCT (SEQ ID NO: 144).
[00253] A vigésima segunda sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCYTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO: 145).
[00254] A vigésima terceira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACAGAGTGTGTYACTGT (SEQ ID NO: 146).
[00255] A vigésima quarta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTGGAATTTCTGGCCC (SEQ ID NO: 147).
[00256] A vigésima quinta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGTTGCCGGATGGA (SEQ ID NO: 148).
[00257] A vigésima sexta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTACAGCAACTGTTACC (SEQ ID NO: 149).
[00258] A vigésima sétima sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CATTGCTCCAGAAWAT (SEQ ID NO: 150).
[00259] A vigésima oitava sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTCTNGCCATTGYAA (SEQ ID NO: 151) ou TGGTT- TAGCTTCGGG (SEQ ID NO: 255).
[00260] A vigésima nona sonda compreende uma sequência de á- cidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAATGTYCCTGTRACACA (SEQ ID NO: 152).
[00261] A trigésima sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AARCTGGARTCTGARG (SEQ ID NO: 153).
[00262] A trigésima primeira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTTCRACTGTGTCTCC (SEQ ID NO: 154).
[00263] A trigésima segunda sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CACTGTGTCACCGCTCA (SEQ ID NO: 155).
[00264] A trigésima terceira sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCYGGGAYGGRACCRACTA (SEQ ID NO: 156).
[00265] A trigésima quarta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGCTCAATTGGCTTTAACC (SEQ ID NO: 157).
[00266] A trigésima quinta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGTGGAGAGTGTGTG (SEQ ID NO: 158).
[00267] A trigésima sexta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAACAGACGCTGGCG (SEQ ID NO: 159).
[00268] A trigésima sétima sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTCGGCGTTTATTGG (SEQ ID NO: 160).
[00269] A trigésima oitava sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO: 161).
[00270] A trigésima nona sonda compreende uma sequência de á- cidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTACTTGGTGTGAYGC (SEQ ID NO: 162).
[00271] A quadragésima sonda compreende uma sequência de áci-
dos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCGATAGATCAAGGTGCCT (SEQ ID NO: 163).
[00272] A quadragésima primeira sonda compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com TTCTGACCTGAAGGCTCTG (SEQ ID NO: 164).
[00273] A quadragésima segunda sonda compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com CTGGTGCARTTYGCCCG (SEQ ID NO: 247).
[00274] A quadragésima terceira sonda compreende uma sequên- cia de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com CAGGAYGCYTCGGARTACCT (SEQ ID NO: 248).
[00275] A quadragésima quarta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com CCAYGCTTGTGGANCTTATGC (SEQ ID NO: 249).
[00276] A quadragésima quinta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com TTYCCCATTCCATTCATTGT (SEQ ID NO: 250).
[00277] A quadragésima sexta sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com CCCWGTGTTTGCAGTRGA (SEQ ID NO: 251).
[00278] A quadragésima sétima sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com TAGGACCACGGGATGCA (SEQ ID NO: 252).
[00279] A quadragésima oitava sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com AAGTTGTCCTCGCTGCCACTC (SEQ ID NO: 253).
[00280] A quadragésima nona sonda compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de se- quência com CAGTGCCCGCGACGGACG (SEQ ID NO: 254).
[00281] O iniciador 1f compreende uma sequência de ácidos nucle-
icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGGWGGWGAAGCWGGATTCTACC (SEQ ID NO: 165) e o iniciador 1r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo me- nos 80% de identidade de sequência com ACCTCTRTACTCTCCCAT- TATGCCTAG (SEQ ID NO: 166).
[00282] O iniciador 2f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 167) e o iniciador 1r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAAACACGGACACCCAAAG- TA (SEQ ID NO: 168).
[00283] O iniciador 3f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAT- CAGGTAAYATCCCACAAAAYCAG (SEQ ID NO: 169) e o iniciador 3r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTGAATATTAARGCACCTA- CACATAATAARA (SEQ ID NO: 170).
[00284] O iniciador 4f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO: 171) e o iniciador 4r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAGCTTGCTTGCTTARAGCA- ATAGGTCT (SEQ ID NO: 172).
[00285] O iniciador 5f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAC- CRATCCTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO: 173) e o iniciador 5r com- preende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA (SEQ ID NO: 174).
[00286] O iniciador 6f compreende uma sequência de ácidos nucle-
icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGTGGRTACGCTGCAGAC (SEQ ID NO: 175) e o iniciador 6r com- preende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTTCAGCATTATAAGTCCAGA- CATCTAG (SEQ ID NO: 176).
[00287] O iniciador 7f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCYCCTTTYATATGTATACTCAGAGACCCA (SEQ ID NO: 177) e o iniciador 7r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTTCTTCCAGT- TACATAYTGTTGCATAGC (SEQ ID NO: 178).
[00288] O iniciador 8f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- AGTGYATGACTGCTCCTGATCARCC (SEQ ID NO: 179) e o iniciador 8r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo me- nos 80% de identidade de sequência com TTGCCAATRTCTCCCAC- CATRGCATA (SEQ ID NO: 180).
[00289] O iniciador 9f compreende uma sequência de ácidos nucle- icos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTCCTTTYATCTGTATCCTCAGAGATCC (SEQ ID NO: 181) e o ini- ciador 9r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pe- lo menos 80% de identidade de sequência com TGATCTTCCCGTCA- CATACTGTTGCATG (SEQ ID NO: 182).
[00290] O iniciador 10f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGTTATAAGACAATTTCTTGTACAGGARATG (SEQ ID NO: 183) e o iniciador 10r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TTTGCAA- TRTCTCCCACCATRGCATA (SEQ ID NO: 184).
[00291] O iniciador 11f compreende uma sequência de ácidos nu-
cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGACTTTTGARGTSGAYCCCATGGA (SEQ ID NO: 185) e o inicia- dor 11r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCGAGAASGGYG- TRCGSAGGTA (SEQ ID NO: 186).
[00292] O iniciador 12f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 187) e o iniciador 12r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAGTTATCCCTGCA- YACACATG (SEQ ID NO: 188).
[00293] O iniciador 13f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGGGAAARATAGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO: 189) e o iniciador 13r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAGTTATCCCTGCA- YACACATG (SEQ ID NO: 190).
[00294] O iniciador 14f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAAGGGTCMAACATCTGYTTAACAAG (SEQ ID NO: 191) ou GGG- CAAATATGGARACATACGTGAA (SEQ ID NO: 256) e o iniciador 14r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTWGTGGGAARAAAGAI- ACTGATCCTG (SEQ ID NO: 192) ou TCTTTTTCTARGACATTG- TAYTGAACAGC (SEQ ID NO: 257).
[00295] O iniciador 15f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 193) e o iniciador 15r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAAACACGGACACCCAAAG-
TA (SEQ ID NO: 194).
[00296] O iniciador 16f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGGTTGGGATTATCCAAAATGTGA (SEQ ID NO: 195) e o inicia- dor 16r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGCAGTTGTAGCAT- CACCGGATGAT (SEQ ID NO: 196).
[00297] O iniciador 17f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGGTTGGGATTATCCTAARTGTGA (SEQ ID NO: 197) e o inicia- dor 17r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCAGTAGTTGCAT- CACCACTRCTAGT (SEQ ID NO: 198).
[00298] O iniciador 18f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGGTTGGGATTATCCCAAATGTGA (SEQ ID NO: 199) e o inicia- dor 18r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTGTACTAGCRT- CACCAGAAGT (SEQ ID NO: 200).
[00299] O iniciador 19f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGA (SEQ ID NO: 201) e o inicia- dor 19r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCTGTAGTTGCAT- CACCAGAAGT (SEQ ID NO: 202).
[00300] O iniciador 20f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO: 203) e o iniciador 20r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCACIGTGG-
GRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO: 204).
[00301] O iniciador 21f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CACKCCCAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO: 205) e o iniciador 21r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCAGAGATGTT- CACTCGCCGGA (SEQ ID NO: 206).
[00302] O iniciador 22f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAGTCTTCTAACMGAGGTCGAAACGTA (SEQ ID NO: 207) e o inici- ador 22r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pe- lo menos 80% de identidade de sequência com GGGCACGGT- GAGCGTRAA (SEQ ID NO: 208).
[00303] O iniciador 23f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCAACAGACACTGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO: 209) e o inicia- dor 23r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTTTCCCGT- TATGCTTGTCTTCTAG (SEQ ID NO: 210).
[00304] O iniciador 24f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATGGCATCAGTTGGCTAACA (SEQ ID NO: 211) e o iniciador 24r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACAGCCACTGCCCCATT (SEQ ID NO: 212).
[00305] O iniciador 25f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGAATAGCCCCCCTACAATTG (SEQ ID NO: 213) e o iniciador 25r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AATTCGCATTCTGGGTTTCC-
TA (SEQ ID NO: 214).
[00306] O iniciador 26f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTTTTTGTTGAACGCAGCAA (SEQ ID NO: 215) e o iniciador 26r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGATGAGGCAACTAGT- GACCTA (SEQ ID NO: 216).
[00307] O iniciador 27f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCGAATGATGCMATMAAYT (SEQ ID NO: 217) e o iniciador 27r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGCACCCATTGGAGTTTGAC (SEQ ID NO: 218).
[00308] O iniciador 28f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATG (SEQ ID NO: 219) ou GTNAA- ACTGAGYAGYGGITACAARGA (SEQ ID NO: 258) e o iniciador 28r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AATRGTGCACYGCATGTTTC- CRTT (SEQ ID NO: 220) ou GGCIAGAAGIAIRAARCATGAYGCC (SEQ ID NO: 259).
[00309] O iniciador 29f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGCATIGGYYACCARTCAAC (SEQ ID NO: 221) e o iniciador 29r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTTGCACAYARCATYC- CATTGTG (SEQ ID NO: 222).
[00310] O iniciador 30f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- ATGTGAYGAYCARTGCATGGA (SEQ ID NO: 223) e o iniciador 30r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAGATGAGGCRACAGTIGAA- TA (SEQ ID NO: 224).
[00311] O iniciador 31f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ATTCAGACAGGATGGAACCGTYAA (SEQ ID NO: 225) e o iniciador 31r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GATACTA- AGCTTTGTTGTGACCTCAT (SEQ ID NO: 226).
[00312] O iniciador 32f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACCCGATTRGARGCTTTCAGACAAGA (SEQ ID NO: 227) e o inicia- dor 32r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTGTTGRGACCGCAT- GATTGAC (SEQ ID NO: 228).
[00313] O iniciador 33f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGGCCCCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO: 229) e o iniciador 33r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAAACACGGACACCCAAAG- TA (SEQ ID NO: 230).
[00314] O iniciador 34f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AAAGGCATGCAAGACGCTATG (SEQ ID NO: 231) e o iniciador 34r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGTTAAGAACGTCTTT- CATTTGCTG (SEQ ID NO: 232).
[00315] O iniciador 35f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CCTTTCGTGGCAGTTGGGTCA (SEQ ID NO: 233) e o iniciador 35r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com ACTGAGCTTGATCCGCCCA- CA (SEQ ID NO: 234).
[00316] O iniciador 36f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAAGGGCTATAAAGGCGTTGCT (SEQ ID NO: 235) e o iniciador 36r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CATGATAATTGATGGTCGCA- GACTT (SEQ ID NO: 236).
[00317] O iniciador 37f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com A- ATTTCATCGTTCCCGGCAG (SEQ ID NO: 237) e o iniciador 37r com- preende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCGCGTTTACTAATCCCCA (SEQ ID NO: 238).
[00318] O iniciador 38f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO: 239) e o iniciador 38r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CTGCGCGGATGCTA- ATGG (SEQ ID NO: 240).
[00319] O iniciador 39f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCACTATGTGGGAAGGTGCTTCA (SEQ ID NO: 241) e o iniciador 39r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTAGTATCCTGCGCG- GATGCT (SEQ ID NO: 242).
[00320] O iniciador 40f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACG (SEQ ID NO: 243) e o inicia-
dor 40r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GTACGGGCGACCC- CACGATGAC (SEQ ID NO: 244).
[00321] O iniciador 41f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com AGATTTGGACCTGCGAGCG (SEQ ID NO: 245) e o iniciador 41r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAGCGGCTGTCTCCACAAGT (SEQ ID NO: 246).
[00322] O iniciador 42f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCCCARTGGKCNTACATGCACATC (SEQ ID NO: 203) e o iniciador 42r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCCACIGTGG- GRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO: 204).
[00323] O iniciador 43f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CARTGGKCITACATGCAYATCKC (SEQ ID NO: 264) e o iniciador 43r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCRCGGGCRAAYTGCACCAG (SEQ ID NO: 265) ou GCGCGGGCAAACTGCACGAG (SEQ ID NO: 266).
[00324] O iniciador 44f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GGTGGYAGATGGCGTRCCATA (SEQ ID NO: 270) e o iniciador 44r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TCTRACAAACTTACTAGAG- GATGGCTG (SEQ ID NO: 271).
[00325] O iniciador 45f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com
ATGGTYTCAGCTATGAACACAGCA (SEQ ID NO: 274) e o iniciador 45r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com TGCCAGYTTTTG- GACGTCTTCTCC (SEQ ID NO: 275).
[00326] O iniciador 46f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GCAGCTCTGATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO: 171) e o iniciador 46r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CAGCTTGCTTGCTTA- RAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO: 172).
[00327] O iniciador 47f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGA (SEQ ID NO: 278) e o inici- ador 47r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pe- lo menos 80% de identidade de sequência com CTCATCCCA- CACCGCTAAAGCGCTT (SEQ ID NO: 279).
[00328] O iniciador 48f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO: 282) e o iniciador 48r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAGTGCTAGGTCGG- GACGGTGAG (SEQ ID NO: 283).
[00329] O iniciador 49f compreende uma sequência de ácidos nu- cleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GACGGGCCTCTTCGTCRTACGCAAT (SEQ ID NO: 282) e o iniciador 49r compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com GAGTGCTAGGTCGG- GACGGTGAG (SEQ ID NO: 283). Homologia/Identidade de Sequência
[00330] Qualquer um de uma variedade de métodos de alinhamento de sequências pode ser usado para determinar a percentagem de i- dentidade incluindo, sem limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbridos tais como, por exemplo, métodos de abordagem de segmento.
Protocolos para determinação da identidade percentual são procedimentos de rotina no âmbito daqueles versados na técnica.
Mé- todos globais alinham sequências desde o início até o final da molécu- la e determinam o melhor alinhamento somando dezenas de pares de resíduos individuais e impondo penalidades por lacuna.
Métodos não limitativos incluem, por exemplo, Julie D.
Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Align- ment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); e refino iterativo, vide, por exemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.
Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Align- ments, 264(4) J.
Mol.
Biol. 823-838 (1996). Métodos locais alinham sequências identificando um ou mais motivos conservados comparti- lhados por todas as sequências de entrada.
Métodos não limitativos incluem, por exemplo, Match-box, vide, por exemplo, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CA- BIOS 501 -509 (1992); amostragem de Gibbs, vide, por exemplo, C.
Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131 ) Science 208-214 (1993); Align-M, vide, por exemplo, Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algo- rithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bio- informatics:1428-1435 (2004). Assim, a identidade de sequência per- centual é determinada por meio de métodos convencionais.
Vide, por exemplo, Altschul et al., Bull.
Math.
Bio. 48: 603-16, 1986 e Henikoff and Henikoff, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 89:10915-19, 1992.
[00331] Variantes das sequências específicas fornecidas acima po- dem também ser definidas ao recitar o número de nucleotídeos que diferem entre as sequências variantes e as sequências de referência específicas fornecidas acima. Assim, em uma modalidade, a sequên- cia pode compreender (ou consistir em) uma sequência de nucleotí- deos que difere das sequências específicas fornecidas acima em não mais de 2 posições de nucleotídeos, por exemplo, em não mais do que uma posição de nucleotídeo. São preferidas substituições conservati- vas.
[00332] A título de exemplo, as sequências de sondas variantes po- dem compreender sequências de ácido nucleico selecionadas de: GGCAATGCIG (SEQ ID NO: 287); GGCAATGCAG (SEQ ID NO: 288); GGCAATGCTG (SEQ ID NO: 289); AGGCAATGCW (SEQ ID NO: 290) ou GCAATGCWGCWCC (SEQ ID NO: 291) para a primeira son- da definida (GGCAATGCWG; SEQ ID NO: 1).
[00333] Outros exemplos de sequências de sondas variantes inclu- em: GAYGGRACCR (SEQ ID NO: 292); GAYRGGACCR (SEQ ID NO: 293); GATGGGACCR (SEQ ID NO: 294); GACGGGACCR (SEQ ID NO: 295); GAYGGGACCG (SEQ ID NO: 296); GAYGGGACCA (SEQ ID NO: 297); AYGGGACCRA (SEQ ID NO: 298); GGAYGGGACC (SEQ ID NO: 299); GAYGGGACCI (SEQ ID NO: 300); ou GAIGG- GACCR (SEQ ID NO: 301) para a segunda sonda definida (GAYGG- GACCR; SEQ ID NO: 2).
[00334] Exemplos de sequências variantes incluem: ACCAGACA- CA (SEQ ID NO: 302); GCACCAGACA (SEQ ID NO: 303); CACIAGA- CAC (SEQ ID NO: 304); CACCAGAIAC (SEQ ID NO: 305); CACCW- GACAC (SEQ ID NO: 306); CACCAGACWC (SEQ ID NO: 307); ou CACCARACAC (SEQ ID NO: 308) para a terceira sonda definida como compreendendo a sequência de ácidos nucleicos definida (CACCA- GACAC; SEQ ID NO: 3).
[00335] Mais exemplos de variantes incluem: GGTCATYGGR (SEQ ID NO: 309); GGTCATTGGG (SEQ ID NO: 310); GGTCATTGGA (SEQ ID NO: 311); GTCATTGGRG (SEQ ID NO: 312); TGGTCATTGG (SEQ ID NO: 313); GGTCATCGGR (SEQ ID NO: 314); RGTCATTGGR (SEQ ID NO: 315); AGTCATTGGR (SEQ ID NO: 316); GGTIATTGGR (SEQ ID NO: 317); ou GGTCATTIGR (SEQ ID NO: 318) para a quarta sonda compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos definida (GGTCATTGGR; SEQ ID NO: 4).
[00336] Outros exemplos de sequências de sondas variante tam- bém compreendem: ACTGGGCACG (SEQ ID NO: 319); TCACTGGGCA (SEQ ID NO: 320); CRCTGGGCAC (SEQ ID NO: 321); CGCTGGGCAC (SEQ ID NO: 322); CACTGGGIAC (SEQ ID NO: 323); CAITGGGCAC (SEQ ID NO: 324); CACTGGRCAC (SEQ ID NO: 325); CACTRGGCAC (SEQ ID NO: 326); ou CACYGGGCAC (SEQ ID NO: 327) para a quinta sonda com uma sequência de ácidos nucleicos que foi definido (CACTGGGCAC: SEQ ID NO: 5).
[00337] Exemplos de sequências de sondas variante para a sexta sonda definida (RGTGTTCATT; SEQ ID NO: 6) incluem: GRGTGTT- CAT (SEQ ID NO: 328); GTGTTCATTT (SEQ ID NO: 329); AGTGTT- CATT (SEQ ID NO: 330); GGTGTTCATT (SEQ ID NO: 331); RGTGT- TIATT (SEQ ID NO: 332); RGTRTTCATT (SEQ ID NO: 333); RGTGTTCAWT (SEQ ID NO: 334); RGTGTWCATT (SEQ ID NO: 335); RGTGTTCWTT (SEQ ID NO: 336); ou RGIGTTCATT (SEQ ID NO: 337).
[00338] Fragmentos das sequências mencionadas acima (e varian- tes de sequências, conforme definido acima) também podem ser em- pregados, por exemplo, fragmentos compreendendo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 par de bases das sequências definidas descritas aqui. Exemplo 1 - Desafio de Painel H5
[00339] Para confirmar a precisão de nosso ensaio, um cartão de teste foi preparado contendo 41 cavidades - as cavidades foram carre- gadas com as respectivas primeira a quadragésima primeira sondas, respectivamente.
[00340] Desafiou-se o cartão de teste com um painel de vírus de proficiência de influenza H5 conhecido. O protocolo empregado inclui as seguintes etapas: 50 °C durante 5 minutos (RT); 95 °C durante 20 segundos; 95 °C durante 1 segundo x 45; e 60 °C dur ante 20 segun- dos.
[00341] Fazendo referência à Tabela 1 (vide abaixo), os resultados de Ct esperados são indicados nas colunas do lado esquerdo e os re- sultados do cartão de teste são indicados na coluna do lado direito. Em um ensaio de PCR em tempo real, uma reação positiva é detecta- da pelo acúmulo de um sinal fluorescente. O valor de Ct (limiar de ci- clo) é definido como o número de ciclos necessários para que o sinal de fluorescência cruze o limiar (ou seja, exceda o nível de fundo).
[00342] Os resultados para o cartão de teste indicaram corretamen- te todas as amostras. Notavelmente, as sondas do cartão de teste in- dicaram corretamente a mistura resistente/sensível ao Tamiflu no es- pécime G* e os dois isolados de H5N1 foram corretamente indicados com todas as três sondas relevantes. As sondas do cartão de teste também indicaram corretamente subtipos de todos os espécimes, H1/H3 sazonal e H1v2009. Todos os outros resultados da sonda foram negativos.
Tabela 1 Resultados Esperados do Painel de Proficiência de Influenza HPA (2011) ID Vírus Ti- Flu A Flu B H5 Não-H5 Susceti- Resultados do Array Card respira- po/sub- Valor Ct Valor Ct Valor Ct Subtipo HA bilidade tório tipo espera- esperado esperado Valor Ct ao Osei- do esperado tamivir A A /Brisbane/ H1N1 34,51 - - H1 35,65 - Gripe A QUAD 36,45 18 s 4,86 59/2009 Gripe A CDC 33,84 MS2 31,35 H1 CFI 32,54 H1 32,75 RnP 23,56 B A/Perth/16/ H3N2 35,37 - - H3 33,54 - Gripe A QUAD ---- 18s 5,43 2009 Gripe A CDC 35,30 M82 30,80 H3 CFi 32,05 H3 33,30 RnP 23,44
62/71 C B/Brisbane/ B - 33,39 - - - 18s 7,08 60/2009 Gripe B QUAD 35,51 MS2 29,69 Gripe B ABI 33,89 RnP 24,45 D* A/England/ H1N1 32,21 - - H1 27,18 Sensível Gripe A QUAD 33,10 Sens Tami- 107/2010 (2009) N1 30,50 gripe 33,04 18s 5,89 Gripe A CDC 29,91 MS2 32,39 H1v 30,9 H1v 31,02 N1CFI 32,81 RnP 23,91 E A/England/ H1N1 34,36 - - H1 28,97 Resis- Gripe QUAD 35,70 Tamigripe Resis 90/2011 (2009) N1 31,66 tente 33,04 18s 5,71 Gripe A CDC 32,25 MS2 32,08 H1v 32,04 H1b 32,36 N1 CFI 32,81 RnP 23,98
ID Vírus Ti- Flu A Flu B H5 Não-H5 Susceti- Resultados do Array Card respira- po/sub- Valor Ct Valor Ct Valor Ct Subtipo HA bilidade tório tipo espera- esperado esperado Valor Ct ao Osei- do esperado tamivir F* B/England/ B - 21,04 - - - 18s 7,60 176/2010 Gripe B QUAD 29,15 MS2 31,70 Gripe B 22,20 RnP 26,50 G* A/England/ H1N1 30,87 - - H1 25,95 Sensível Gripe A QUAD 30,86 Tamigripe 107/2010 & (2009) N1 28,45 Resis- S/R 32,18/31,27 18s 5,16 A/England/ tente Gripe A CDC 27,99 MS2 31,60 90/2011 Mistura H1v 28,96 H1v 28,53 N1cFI 28,71 RnP 23,40 H A/Aragon/ H1N1 32,92 - - H1 36,08 Sensível Gripe A QUAD 33,79 18s 6,18
63/71 3216/2008 N1 37,94 Gripe A CDC 32,32 MS2 30,65 N1 31,61 H1 38,70 RnP 23,44 I Células Hep - - - - - - Todos barras negativas para os 2 (negativo) controles J A/Suíno/ H3N2 31,95 - - H3 32,97 - Gripe A QUAD 30,73 18s 6,05 Itá- Gripe A CDC 23,75 MS2 31,14 lia/1477/96 H3 CFI 27,36 H3 32,94 RnP 24,56 K A/Pensilvâ- H3N2 20,55 - - H3 35,56 - Gripe A QUAD 21,37 18s 6,29 nia/14/2010 Gripe A CDC 20,75 MS2 30,24 H3 CFI 24,30 H3 19,35 RnP 24,60
ID Vírus Ti- Flu A Flu B H5 Não-H5 Susceti- Resultados do Array Card respira- po/sub- Valor Ct Valor Ct Valor Ct Subtipo HA bilidade tório tipo espera- esperado esperado Valor Ct ao Osei- do esperado tamivir L A/Egito/3300 H5N1 24,20 - 33,49 - - Gripe A QUAD 24,55 Tamigripe NAMRUS/ Sens 28,43 18s 7,04 2008 (RG13) Gripe A CDC 23,70 N1CFI 38,22 MS2 30,84 H5 CFI 29,59 H5 FRET 24,14 H5 24,54 RnP 24,49 M A/ck/Vietnã/ H5N1 24,39 - 27,72 - - Gripe A QUAD 25,25 Tamigripe NCVD- Sen 30,04 18s 6,19 016/2008 Gripe A CDC 24,16 N1CFI 26,37
64/71 (RG12) MS2 31,32 H5 CFI 25,37 HS FRET 25,23 H5 23,27 RnP 25,02 1 Valor de Ct médio a partir de pré-testagem usando iniciadores/sondas para HPA NSM 25. 2 Valor de Ct médio a partir de pré-testagem usando iniciadores/sondas para HPA NSM 29, 48 e 50.
Exemplo 2 - Desafio com Painel de Flu A/B
[00343] Para confirmar a precisão do nosso ensaio, um cartão de teste foi preparado conforme para o Exemplo 1 contendo 41 cavidades - as cavidades foram carregadas com nossas respectivas primeira a quadragésima primeira sondas, respectivamente.
[00344] Desafiou-se o cartão de teste com um painel de vírus de proficiência de vírus da gripe A/B. Fazendo referência à Tabela 2 (vide abaixo), os resultados de Ct esperados são indicados nas colunas do lado esquerdo e os resultados do cartão de teste são indicados na co- luna do lado direito. Mais uma vez, o arranjo indicou corretamente ca- da uma das amostras no painel. Tabela 2 QCMD 2010 Vírus da Influenza A e B RNA EQA Programa Código Matriz Conteú- Valor Resul- Valor ct Resultados Painel dos Ct tado em tem- Arranjo PCR Amostra Espe- po real rado "in hou- se" INFRNA VTM Gripe-A 30 Gripe- 25 Gripe A 10-01 H3N2 A posi- 33,99/31,71 tivo H3 sazonal núcleo 39,87/30,49 INFRNA VTM Gripe-A 35 Gripe- 27 Gripe A 10-02 H1N1v A posi- 35,97/31,97 tivo H1v núcleo 31,37/32,06 N1 32,06 Tams 33,50 INFRNA VTM Gripe-A 33 Gripe- 28 Gripe A 10-03 H1N1 A posi- 38,71/35,39 tivo H1 sazonal 35,7/33,33 INFRNA VTM Gripe Gripe 26 10-04 A/B neg A/N neg núcleo
QCMD 2010 Vírus da Influenza A e B RNA EQA Programa Código Matriz Conteú- Valor Resul- Valor ct Resultados Painel dos Ct tado em tem- Arranjo PCR Amostra Espe- po real rado "in hou- se" INFRNA VTM Gripe-A 35 Gripe- 25 Gripe A 10-05 H1N1v A posi- 34,91/32,77 tivo H1v núcleo 32,17/31,37 N1 31,66 TamS 34,66 INFRNA VTM Gripe-B 32 Gripe- 32 Gripe B 10-06 B posi- 31,96/30/42 tivo núcleo INFRNA VTM Gripe-B 39 Gripe- 23 Gripe B 10-07 B posi- 34,09/28,23 tivo núcleo INFRNA VTM Gripe-A 30 Gripe- Gripe A 10-08 H1N1v A posi- 31,83/28,49 tivo H1v núcleo 28,94/27,88 N1 28,612 TamS 30,47 INFRNA VTM Gripe-A 29 Gripe- 25 Gripe A 10-09 H1N1 A posi- 33,16/30,88 tivo H1 sazonal núcleo 30,92/30,237 INFRNA VTM Gripe Gripe 10-10 A/B neg A/B neg núcleo INFRNA VTM Gripe-A 38 Gripe- 29 Gripe A --- 10-11 H1N1v A posi- /35,53 H1v tivo 33,99/35,75 N1 35,81 TamS 25,71 INFRNA VTM Gripe-A 37 Gripe- 27 Gripe A 10-12 H3N2 A posi- 39,33/34,35 tivo H3 sazonal 33,41/---
Exemplo 3 - Um espécime de um paciente com suspeita de gripe aviá- ria H5 foi analisada de acordo com a presente invenção em paralelo com os ensaios multiplex convencionais
[00345] Um professor aposentado de 60 anos de idade, da Tasmâ- nia, Austrália, viajou com sua esposa para Hong Kong em 26 de agos- to de 2011. A pessoa permaneceu em Hong Kong durante 5 dias antes de ir para o Reino Unido, chegando em 31 de Agosto de 2011. A pes- soa deu entrada no hospital em 4 de setembro de 2011, mas foi man- dado para casa, uma vez que não foi considerado doente. A pessoa retornou em 8 de setembro de 2011, tendo ficado mais doente. Amos- tras respiratórias (escarro e esfregaço do nariz/garganta) foram tiradas em 8 de setembro de 2011.
[00346] No sábado, 10 de setembro de 2011, os espécimes foram testados de acordo com a presente invenção (ensaio terminado em um total de 2 horas) e os resultados do cartão de teste são indicados a- baixo.
[00347] Sonda 22 (Flu A Quad) = 26,3
[00348] Sonda 5 (Flu A CDC) = 23,7
[00349] Sonda 26 (H3) = 22,7
[00350] Controles positivos: Sonda 40 (fago MS2) = 32,0; sonda 41 (RNase P) = 22,6
[00351] Todas as outras sondas no cartão de teste foram claramen- te negativas. Resultado cartão de teste: H5 negativo, influenza H3N2 sazonal impor- tada
[00352] Em paralelo, um ensaio multiplex convencional foi realizado (ensaios terminado em um total de 4-5 horas) e os resultados são a- presentados a seguir:
[00353] Gripe A Quad = 26,4
[00354] Gripe A CDC = 17,9
[00355] H3 CfI = 19,7 Resultado do multiplex de rotina: H5 negativo, influenza H3N2 sazonal importada
[00356] Estes dados confirmam que o ensaio com o cartão de teste singleplex da presente invenção foi muito mais rápido (mais de duas vezes mais rápido) e ainda mais preciso (maiores valores de Ct) na distribuição dos resultados do ensaio. Além disso, a abordagem de cartão de ensaio singleplex da presente invenção permite uma triagem consideravelmente mais abrangente (em termos do número de diferen- tes patógenos testados) do que as abordagens multiplex convencio- nais (todos em um espaço de tempo muito reduzido). Exemplo 4 - Um segundo caso de suspeita de H5 aviária foi analisado de acordo com a presente invenção em paralelo com testes multiplex convencionais
[00357] Uma senhora de 50 anos de idade que tinha viajado recen- temente para o Norte da Somália, Djibuti e Dubai, deu entrada em um hospital de Londres com um caso agudo de pneumonia bilateral (re- querendo intubação) em 11/11/1o. Amostras (esfregaços do na- riz/garganta) foram testados de acordo com a presente invenção (tem- po total de ensaio = 2 horas) e os resultados dos cartões de teste são indicados abaixo.
[00358] Sonda 3 (hMPV) = 31,0 - este foi o único vírus detectado na amostra
[00359] Controles positivos: Sonda 40 (fago MS2) = 31,0: Sonda 41 (RNase P) = 29,4
[00360] Todas as outras sondas no cartão eram claramente negati- vas. Resultado: negativo para o vírus da influenza aviária H5, paciente tem uma infecção por hMPV Resultados paralelos do multiplex (tempo de ensaio = 4-5 horas)
[00361] MPVh = 25,0 Resultado: negativo para o vírus da influenza aviária H5 e infecção por hMPV confirmada.
[00362] Estes dados confirmam que a abordagem com cartão de teste singleplex da presente invenção se mostrou superior (maiores valores de Ct) e forneceu resultados mais rápidos do que os testes multiplex convencionais, distribuindo os resultados horas antes e fa- zendo uma triagem do paciente quanto a patógenos virais e bacteria- nos adicionais. Exemplo 5 - Desempenho da presente invenção foi avaliado através de Controle de Qualidade para painéis de Diagnóstico Molecular.
[00363] A fim de avaliar plenamente o desempenho do cartão de teste, painéis de Controle de Qualidade para Diagnóstico Molecular (Quality Control for Molecular Diagnostics - QCMD) externos disponí- veis no mercado (www.qcmd.org) para uma série de diferentes pató- genos foram testados,deste modo, fornecendo uma característica In- ternacional para a qualidade, desempenho e robustez dos resultados de cartão de teste. QCMD 2011 Legionella pneumophila DNA EQA Programa 100% CORRETO QCMD 2010 Vírus da parainfluenza RNA EQA Programa 100% CORRETO QCMD 2010 Rinovírus & Coronavírus RNA EQA Programa 100% CORRETO QCMD 2011 Enterovírus RNA EQA Programa 11/12 correto QCMD 2010 Adenovírus DNA EQA Programa 6/8 correto QCMD 2010 Metapneumovírus & Vírus Sincicial Respiratório 10/12 correto QCMD 2011 C. pneumoniae & Mycoplasma pneumoniae 9/11 correto
[00364] Estes dados confirmam que a abordagem com cartão de teste singleplex da presente invenção permitiu tanto sensibilidade quanto desempenho que são comparáveis ao ensaios multiplex con- vencionais, embora concluído em um período de tempo muito mais curto (2 horas versus 4-5 horas). Exemplo 6 - Uma avaliação comparativa cabeça-a-cabeça da presente invenção com ensaios respiratórios multiplex convencionais usando 216 espécimes clínicos positivos para vários vírus.
[00365] Os resultados de cartão de ensaio são apresentados abai- xo. 30 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para RSV de rotina 14 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para Flu B de rotina (os espécimes incluíam duas coinfec- ções, hMPV & RSV) 54 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para Gripe A de rotina (os espécimes incluíam um isolado resistente ao Tamiflu e uma co-infecção por gripe B) espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para vírus Boca de rotina (descobriu-se que 8/10 eram coinfec- ções pelo cartão ensaio, altas cargas virais de Bocavírus - valores de Ct na faixa de 15-26) 31 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para vírus da de rotina parainfluenza huma- na (tipos 1-4) 17 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para Adenovírus de rotina
22 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para rinovírus de rotina 11 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para enterovírus de rotina 11 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para Coronaví- de rotina rus 16 espécimes positi- 100% de concordância com ensaios multiplex vos para metapneu- de rotina movírus
[00366] Estes dados confirmam que a abordagem com cartão de teste singleplex da presente invenção mais uma vez demonstrou ser altamente sensível e específico, bem como robusto, detectando ape- nas os patógenos corretos. Em particular, nenhum falso positivo foi observado com o cartão de teste. O único resultado falso negativo foi com um único espécime de coronavírus que teve um Ct > 32 em nosso ensaio multiplex em tempo real de rotina e não foi detectado no cartão de arranjo. Coinfecções também foram identificadas corretamente u- sando os cartões de teste. 31 espécimes negativos conhecidos tam- bém foram processados através dos cartões e nenhum resultado falso positivo foi observado para qualquer um dos alvos.
Claims (3)
1. Método uniplex quantitativo para detecção da presença de um ou mais de pelo menos seis micro-organismos causadores de infecção respiratória em uma amostra ou detectar a ausência dos ditos micro-organismos causadores de infecção respiratória na dita amostra, o dito método compreendendo: A) aplicação de uma amostra a um cartão de teste, em que o dito cartão de teste compreende seis cavidades distintas: 1) uma primeira cavidade que inclui uma primeira sonda, em que a primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GGCAATGCWG (SEQ ID NO: 1); 2) uma segunda cavidade que inclui uma segunda sonda, em que a segunda sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAYGGGACCR (SEQ ID NO: 2); 3) uma terceira cavidade que inclui uma terceira sonda, em que a terceira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CACCAGACAC (SEQ ID NO: 3); 4) uma quarta cavidade que inclui uma quarta sonda, em que a sonda tem uma quarta sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GGTCATTGGR (SEQ ID NO: 4); 5) uma quinta cavidade que inclui uma quinta sonda, em que a quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com-
preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CACTGGGCAC (SEQ ID NO: 5); 6) uma sexta cavidade que inclui uma sexta sonda, em que a sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de iden- tidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos RGTGTT- CATT (SEQ ID NO: 6); B) permitir que o ácido nucleico presente na amostra conta- te as sondas dentro das ditas cavidades; C) detecção da presença do complexo de ácido nucleico ligado, em que o ácido nucleico da amostra se ligou a uma ou mais das ditas sondas; caracterizado pelo fato de que a presença de complexo de ácido nucleico ligado confirma que o ácido nucleico de um ou mais dos ditos seis micro-organismos causadores de infecção respiratória está presente na amostra e em que a ausência de complexo de ácido nu- cleico ligado confirma que o ácido nucleico de todos os ditos seis mi- cro-organismos causadores de infecção respiratória está ausente na amostra.
2. Método quantitativo de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas correspondentes a- dicionais selecionadas de: 7) uma sétima cavidade que inclui uma sétima sonda, em que a sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 7; 8) uma oitava cavidade que inclui um oitavo da sonda, em que a oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que com- preende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; 9) uma nona cavidade que inclui uma nona sonda, em que a nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreen- de uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de iden- tidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9; 10) uma décima cavidade que inclui uma décima sonda, em que a décima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 10; 11) uma décima primeira cavidade que inclui uma décima primeira sonda, em que a décima primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 11; 12) uma décima segunda cavidade que inclui uma décima segunda sonda, em que a décima segunda sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 12; 13) uma décima terceira cavidade que inclui uma décima terceira sonda, em que a décima terceira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 13.
3. Método quantitativo de acordo com a reivindicação 2, ca-
racterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende cada uma das sétima a décima terceira cavidades adicionais e as sétima a déci- ma terceira sondas adicionais.
4. Método quantitativo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais selecionadas de: 14) uma décima quarta cavidade que inclui uma décima quarta sonda, em que a décima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TACTGTGACA (SEQ ID NO: 14); 15) uma décima quinta cavidade que inclui uma décima quinta sonda, em que a décima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos YRGCGGAACC (SEQ ID NO: 15); 16) uma décima sexta cavidade que inclui uma décima sex- ta sonda, em que a décima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de áci- dos nucleicos TAACGAGTGT (SEQ ID NO: 16); 17) uma décima sétima cavidade que inclui uma décima sétima sonda, em que a décima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CGAATGAATG (SEQ ID NO: 17); 18) uma décima oitava cavidade que inclui uma décima oi- tava sonda, em que a décima oitava sonda tem uma sequência de áci- dos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos YTCTAAGCAT (SEQ ID NO: 18); 19) uma décima nona cavidade que inclui uma décima nona sonda, em que a décima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de áci- dos nucleicos TTCTAAGCAT (SEQ ID NO: 19); 20) uma vigésima cavidade que inclui uma vigésima sonda, em que a vigésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAGTAYCTSA (SEQ ID NO: 20); 21) uma vigésima primeira cavidade que inclui uma vigési- ma primeira sonda, em que a vigésima primeira sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ACTGCATCCG (SEQ ID NO: 21); 22) uma vigésima segunda cavidade que inclui uma vigési- ma segunda sonda, em que a vigésima segunda sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TGTCACCTCT (SEQ ID NO: 22); 23) uma vigésima terceira cavidade que inclui uma vigési- ma terceira sonda, em que a vigésima terceira sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos AGTGTGTYAC (SEQ ID NO: 23); 24) uma vigésima quarta cavidade que inclui uma vigésima quarta sonda, em que a vigésima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAATTTCTGG (SEQ ID NO: 24); 25) uma vigésima quinta cavidade que inclui uma vigésima quinta sonda, em que a vigésima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TTGCCGGATG (SEQ ID NO: 25); 26) uma vigésima sexta cavidade que inclui uma vigésima sexta sonda, em que a vigésima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CAGCAACTGT (SEQ ID NO: 26); 27) uma vigésima sétima cavidade que inclui uma vigésima sétima sonda, em que a vigésima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TGCTCCAGAA (SEQ ID NO: 27); 28) uma vigésima oitava cavidade que inclui uma vigésima oitava sonda, em que a vigésima oitava sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos TNGCCATTGY (SEQ ID NO: 28); 29) uma vigésima nona cavidade que inclui uma vigésima nona sonda, em que a vigésima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GTYCCGTGRA (SEQ ID NO: 29); 30) uma trigésima cavidade que inclui uma trigésima sonda, em que a trigésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos
80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CTGGARTCTG (SEQ ID NO: 30); 31) uma trigésima primeira cavidade que inclui uma trigési- ma primeira sonda, em que a primeira trigésima sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos CRACTGTGTC (SEQ ID NO: 31); 32) uma trigésima segunda cavidade que inclui uma trigé- sima segunda sonda, em que a trigésima segunda sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GTGTCACCGC (SEQ ID NO: 32); 33) uma trigésima terceira cavidade que inclui uma trigési- ma terceira sonda, em que a trigésima terceira sonda tem uma se- quência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de áci- dos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos GAYGGRACCR (SEQ ID NO: 33).
5. Método quantitativo de acordo com a reivindicação 4, ca- racterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende cada uma das décima quarta a trigésima terceira cavidades e as décima quarta a trigésima terceira sondas adicionais correspondentes.
6. Método quantitativo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende uma ou mais cavidades adicionais e uma ou mais sondas adicionais correspondentes selecionadas de: 34) uma quarta cavidade trinta que inclui uma trigésima quarta sonda, em que a trigésima quarta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 34;
35) uma trigésima quinta cavidade que inclui uma trigésima quinta sonda, em que a trigésima quinta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 35; 36) uma trigésima sexta cavidade que inclui uma trigésima sexta sonda, em que a trigésima sexta sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 36; 37) uma trigésima sétima cavidade que inclui uma trigésima sétima sonda, em que a trigésima sétima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 37; 38) uma oitava cavidade trinta que inclui uma trigésima oi- tava sonda, em que o oitavo sonda trinta tem uma sequência de áci- dos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 38; 39) uma trigésima nona cavidade que inclui uma trigésima nona sonda, em que a trigésima nona sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 39).
7. Método quantitativo de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende cada uma das décima quarta a trigésima nona cavidades e as décima quarta a trigésima nona sondas adicionais.
8. Método quantitativo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende uma ou mais cavidades de controle adicionais e uma ou mais sondas de controle adicionais correspondentes selecionadas de: 40) uma quadragésima cavidade que inclui uma quadragé- sima sonda, em que a quadragésima sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos AGATCAAGGT (SEQ ID NO: 40); 41) uma quadragésima primeira cavidade que inclui uma quadragésima primeira sonda, em que a quadragésima primeira sonda tem uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma se- quência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ACCTGAAGGC (SEQ ID NO: 41).
9. Método quantitativo de acordo com a reivindicação 8, ca- racterizado pelo fato de que o cartão de teste compreende uma ou ambas das quadragésima a quadragésima primeira cavidade e das quadragésima a quadragésima primeira sondas adicionais correspon- dentes.
10. Método quantitativo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o dito método in- clui uma etapa de amplificação de ácido nucleico antes de detecção.
11. Cartão de teste para uso em um método quantitativo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracteri- zado pelo fato de que o dito cartão de teste compreende uma plurali- dade de cavidades, em que pelo menos seis cavidades são fornecidas e em que a primeira cavidade inclui a primeira sonda, a segunda cavi- dade inclui a segunda sonda, a terceira cavidade inclui a terceira son- da, a quarta cavidade inclui a quarta sonda, a quinta cavidade inclui a quinta sonda e a sexta cavidade inclui a sexta sonda da presente in-
venção, conforme definido nas reivindicações precedentes.
12. Cartão de teste de acordo com a reivindicação 11, ca- racterizado pelo fato de ainda compreender uma ou mais (de preferên- cia todas) das sétima a décima terceira cavidades adicionais, em que as ditas cavidades contêm as respectivas sétima a décima terceira sondas.
13. Cartão de teste de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma ou mais (de preferência todas) as décima quarta a trigésima terceira cavidades a- dicionais, em que as ditas cavidades contêm as respectivas décima quarta a trigésima terceira sondas.
14. Cartão de teste de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma ou mais (de preferência todas) das trigésima quarta a trigésima nona cavidades adicionais, em que as ditas cavidades contêm as res- pectivas trigésima quarta a trigésima nona sondas.
15. Cartão de teste de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma ou ambas (de preferência ambas) da quadragésima e quadragé- sima primeira cavidades adicionais, em que as ditas cavidades contêm as respectivas quadragésima e quadragésima primeira sondas.
16. Cartão de teste de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que as sondas são i- mobilizadas sobre a superfície das respectivas cavidades em que, de preferência, as sondas estão presentes na forma liofilizada adsorvida à superfície das respectivas cavidades.
Figura 1: Gráficos de amplificação quantitativa para três diferentes ensaios alvo de Influenza B (Influenza B Quad; Influenza B ABI; e Influenza B Bruges) sobre o Array Card usando as sondas da invenção Gráfico de amplificação 3 diferentes ensaios de Influenza B Controle de construto de plasmídeo multi-alvo 1/2
3.624 cópias 362 cópias 36 cópias 3 cópias Ciclo Figura 1 Legenda A Figura 1 mostra uma capacidade de detecção em diluição de -9 para todos os três ensaios de Influenza B. Neste nível de diluição, a mistura de reação contém apenas 3 cópias genômicas do micro-organismo alvo. A natureza uniforme das curvas de amplificação por PCR em tempo real para a série de diluições também é mostrada, a qual fornece a eficiência de PCR ótima para estimativas quantitativas.
Figura 2: Gráfico de amplificação quantitativa para ensaio alvo de Influenza resistente ao Tamiflu sobre o Array Card usando as sondas da invenção Gráfico de amplificação Ensaio de resistência ao Tamiflu Controle de construto de plasmídeo multi-alvo
36.240 cópias 2/2
3.624 cópias 362 cópias 36 cópias 3 cópias Ciclo Figura 2 Legenda A Figura 2 mostra uma capacidade de detecção em diluição de -9 para a cepa resistente ao Tamiflu. Neste nível de diluição, a mistura de reação contém apenas 3 cópias genômicas do micro-organismo alvo.
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