BR112013026004B1 - Variante de gdnf humano, sua composição farmacêutica e seu uso, bem como intermediário para uso na preparação da variante - Google Patents

Abstract

variantes de gdnf humano. a presente invenção refere-se a novas variantes de fator neurotrófico derivado de células gliais humanas (gdnf) e a métodos para seu uso.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina, particularmente ao campo de proteínas terapêuticas. Especificamente, a presente invenção se refere a novas variantes do fator neurotrófico derivado de células gliais humanas (GDNF). As novas variantes de GDNF podem ser úteis no tratamento da doença de Parkinson.

[0002] O GDNF é um fator neurotrófico bem conhecido que se relata por proporcionar suporte trófico a neurônios dopaminérgicos in vitro e in vivo. Além disso, relatou-se que o GDNF proporciona melhoras funcionais e tem ações neuroprotetoras em modelos em roedores e primatas da doença de Parkinson. Proteína GDNF de tipo selvagem de E. coli foi administrada por via central a pacientes sofrendo de doença de Parkinson com resultados mistos. Em dois pequenos estudos de rótulo aberto, relatou-se que a GDNF de tipo selvagem produz uma melhora de longa duração na função motora. Entretanto, em um ensaio em Fase lia, controlado com placebo e randomizado de 34 pacientes, a distribuição intraputamenal de GDNF não mostrou nenhuma melhora sintomática em 6 meses. Um aumento no sinal biomarcador só ficou evidente no tecido imediato em torno do sítio de infusão. Um relato recente declara que o GDNF pode ser uma molécula promissora para resgatar nervos moribundos; entretanto, a distribuição da molécula à área correta do cérebro ainda é um desafio desencorajador. Nature, Vol 466:19 August 2010.

[0003] Proteínas GDNF truncadas são relatadas no WO97/11964 (PCT/US96/14915); entretanto, ainda há necessidade de novas variantes de GDNF com propriedades farmacológicas, estabilidade e propriedades de biodistribuição desejadas. Há necessidade de uma forma variante de GDNF que seja estável no dispositivo de distribuição e facilite a biodistribuição ao cérebro desejada, demonstrando, ao mesmo tempo, a potência desejada e propriedades de imunogenicidade aceitáveis. Variantes de GDNF que oferecem uma ou mais dessas propriedades desejáveis pode ser uma nova terapia medicinal farmaceuticamente útil, particularmente para uso no tratamento de doença de Parkinson.

[0004] A presente invenção apresenta uma nova variante de GDNF truncada do domínio GDNF humano maduro desprovido dos primeiros 31 aminoácidos na N-terminal ("GDNF truncado em Δ31-N- terminal"), com certas substituições de aminoácidos introduzidas para proporcionar variantes de GDNF estáveis e adequadamente potentes oferecendo propriedades de biodistribuição desejáveis e um perfil de imunogenicidade farmaceuticamente aceitável. A presente invenção apresenta certas variantes de GDNF humano que conferem uma ou mais vantagens com relação a GDNF de tipo selvagem humano maduro, incluindo variantes que tenham melhor estabilidade farmacêutica, assim como melhor biodistribuição ligação a heparina reduzida, desamidação reduzida, suscetibilidade reduzida à formação de succinimida e potencial de imunogenicidade reduzido em comparação com GDNF de tipo selvagem humano. Certas novas variantes de GDNF podem ser uma nova opção de tratamento útil para pacientes com doença de Parkinson.

[0005] A presente invenção apresenta uma variante de GDNF humano compreendendo a SEQ ID N°: 23RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILXaa84NLSXaa88NXaa9oRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLV YHILRXaai25HSAKXaai3oCGCI (SEQ ID N°: 23), em que: i) Xaaβ4 é K ou A; ii) Xaassé R ou K; iii) Xaagoé R ou K; iv)Xaai2sé K ou E; e v) Xaaiaoé R ou E.

[0006] A invenção também apresenta uma variante de GDNF humano em que a dita variante é selecionada do grupo que consiste em: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKI LKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKR CGCI (SEQ ID N°:9), RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKI LANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKR CGCI (SEQ ID N°:12), e RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKIL ANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKEC GCI (SEQ ID N°:15).

[0007] Em um aspecto, a invenção apresenta uma variante de GDNF humano compreendendo uma sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID N°: 9: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKIL KNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKR CGCI.

[0008] A invenção também apresenta um intermediário utilizável para a preparação de uma Variante truncada em Δ31-N-terminal de GDNF humano maduro. O intermediário compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 23: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKI LXaa84NLSXaa88NXaa9oRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHI LRXaai2sHSAKXaai3oCGCI (SEQ ID N°: 23), que é estendida na N- terminal com um peptídio de sinal de secreção. Inúmeras sequências de peptídio de sinal de secreção podem ser usadas aqui. Sequências de peptídio de sinal de secreção exemplificativas incluem o peptídio de sinal de secreção de líder kapa de murídeo, com a sequência de METDTLLLWVLLLVWPGSTG (SEQ ID N°: 25), e o peptídio de sinal de secreção de hormônio do crescimento humano com a sequência de MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID N°: 32).

[0009] Intermediários com esses peptídios de sinal de secreção podem produzir as variantes de GDNF humano reivindicadas com maior rendimento com relação a construtos de GDNF truncados com outras sequências líderes. Os intermediários apresentados que incluem um peptídio de sinal de secreção podem, portanto, ter uma uma sequência de aminoácidos de: METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGY ETKEELIFRY CSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFL DDNLVYHIL RKHSAKRCGCI (SEQ ID N°: 28); ou MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTD L GLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQAC CRP IAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID N°: 35).

[00010] A invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo uma variante de GDNF humano conforme reivindicada pela presente invenção e um ou mais diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A invenção apresenta uma variante de GDNF humano para uso como um medicamento. A invenção também apresenta uma variante de GDNF humano para uso no tratamento de doença de Parkinson. A invenção apresenta uma variante de GDNF para uso como uma terapia.

[00011] Prefere-se uma variante em que Xaas4 é A, Xaass é K, e Xaago é K.

[00012] Prefere-se uma variante em que Xaas4 é K, Xaass é R, e Xaa90 éR.

[00013] Prefere-se uma variante em que Xaai25 é K, e Xaano é R.

[00014] Prefere-se uma variante em que Xaas4 é A, Xaass é K, e Xaa90é K, Xaai25 é E, e Xaanoé E.

Descrição Detalhada

[00015] Relatou-se que GDNF de tipo selvagem se liga à heparina e à matriz extracelular, provavelmente mediante as cargas positivas localizadas nos resíduos de aminoácidos 1 - 31 N-terminais, consequentemente, limitando a distribuição de GDNF quando da distribuição no cérebro (Lin et al., J Neurochem 63, 758-768, 1994; Rickard et al., Glycobiology 13, 419-426, 2003; Piltonen et al., Experimental Neurology 219, 499-506, 2009) . Também se relatou que o GDNF proporciona melhoras funcnionais e tem ações neuroprotetoras em modelos em roedores e primatas da doença de Parkinson (Tomac et al, 1995; Gash et al., 1996). A proteína GDNF de tipo selvagem de E. coli foi administrada por via central a pacientes sofrendo da doença de Parkinson com resultados mistos. Em dois pequenos estudos com rótulo aberto, o GDNF prodiziu melhora de longo prazo na função motora (Gill et al., 2003, Slevin et al., 2005). Além disso, um surgimento aumentado de neurônios dopaminérgicos era evidente em um paciente que morreu de causas não relacionadas - infarto do miocárdio (Love et al 2005). Entretanto, em um ensaio em Fase lia, controlado com placebo e randomizado de 34 pacientes conduzido por Amgen, a distribuição intraputâmen de GDNF (Liatermin) não mostrou nenhuma melhora sintomática em 6 meses (Lang et al., 2006). As variantes de GDNF reivindicadas exibem propriedades aperfeiçoadas em comparação com a proteína GDNF de tipo selvagem de E. coli previamente testada.

[00016] A sequência do construto de comprimento total de GDNF de tipo selvagem (211 aa) contendo o peptídio de sinal (os primeiros 19 aminoácidos, SEQ ID N°: 4), pró-domínio (itálico, SEQ ID N°: 5) e peptídio maduro (sublinhado, SEQ ID N°: 3) é indicada como SEQ ID N°: 1: M^L\ND\/\/MCL\/LLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFAL SSD SNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPD^QMA\/LPRRERNRQAA AANP ENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSG SC DAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDD NLVYHILRKHSAKRCGCI. A sequência de DNA de comprimento total do GDNF de tipo selvagem é indicada como SEQ ID N°: 2: ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCA CA CCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAG G CCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATT CGC CCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGT TCGA CGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGA GGTC ACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAAC AGGC AGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAG AAG GGGTCAACGGGGCAAGAACAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATC CACC TGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAG CTG ATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCAC CTA CGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCT CCG ACAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGAC GA CCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAA GCA CAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC.

[00017] As posições de aminoácidos das variantes da presente invenção são determinadas a partir do polipeptídio de 134 aminoácidos do GDNF humano maduro de tipo selvagem (SEQ ID N°: 3). As mutações são designadas pelo aminoácido original, seguido pelo número da posição do aminoácido, seguido pelo aminoácido substituinte. A designação numérica de cada variante se baseia na sequência madura do tipo selvagem ("GDNF WT maduro") antes do truncamento. Por exemplo, uma substituição para Lys (K) na posição 84 (isto é, K84) por Ala (A) é designada por K84A. de maneira similar, as múltiplas substituições para Lys (K) na posição 84 por Ala (A), Arg (R) na posição 88 por Lys (K), Arg (R) na posição 90 por Lys (K) e Asp (D) na posição 95 por Glu (E) são designadas por K84A/R88K/R90K/D95E. Conforme aqui usado, a abreviação "KAKKE" se refere a K84A-R88K-R90K-D95E.

[00018] Conforme aqui usado, "GDNF de comprimento total" se refere à sequência de proteína total, incluindo o peptídio de sinal, pró- domínio e domínio maduro.

[00019] Conforme aqui usado, "GDNF maduro" ou "GDNF maduro de comprimento total"se refere ao GDNF domínio maduro total (com peptídio de sinal e pró-domínio clivados).

[00020] Conforme aqui usado, "GDNF truncado em Δ31-N-terminal"se refere a GDNF domínio maduro desprovido dos primeiros 31 aminoácidos na N-terminal. Conforme aqui usado, "GDNF truncado em Δ31-N-terminal" e "variante de GDNF humano" (ou "GDNFv") são usados de maneira intercambiável.

[00021] Construtos de GDNF de comprimento total, quando transfectados em células HEK293 durante 5 dias, produzem predominantemente GDNF maduro de comprimento total. Quando construtos de GDNF de comprimento total são transfectados em células CHO durante um período de tempo mais longo e durante a geração de linhagem celular estável, formas truncadas de GDNF são as formas predominantes (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993). Delta31 ("Δ31"), uma forma variante truncada de GDNF humano maduro em que os resíduos de aminoácidos de números 1 a 31 foram deletados na N-terminal, tem a SEQ ID N°: 8 e pode ser purificada da mistura.

[00022] A variante de GDNF truncado em Δ31-N-terminal pode ser produzida em um sistema de expressão em mamífero ou bacteriano por deleção tanto da sequência de peptídios do pró-domínio, quanto dos primeiros 31 resíduos de aminoácidos do peptídio de GDNF maduro no nível do DNA, e usando inúmeros peptídios de sequência de sinal de secreção, como peptídio de sinal de secreção de GDNF nativo (SEQ ID N°: 4: MKLWDVVAVCLVLLHTASA); peptídio de sinal de secreção de líder kapa de murídeo (SEQ ID N°: 25: METDTLLLWVLLLVWPGSTG); e peptídio de sinal de secreção de hormônio do crescimento humano (SEQ ID N°: 32: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA). Esses construtos podem produzir Variantes de GDNF truncadas em Δ31-N-terminal homogêneas de espécie única.

[00023] Aqueles versados na técnica compreenderão que as variantes de GDNF reivindicadas não excluem a possibilidade de glicosilação. As variantes de GDNF reivindicadas podem ser glicosiladas conforme apropriado, dependendo do sistema de expressado usado. Por exemplo, variantes de GDNF expressadas em mamíferos são glicosiladas na posição N49, ao passo que variantes expressadas em bactérias não o são.

[00024] Quando se usa um construto de sequência nativa de comprimento total (SEQ ID N°: 2), durante a expressão, produz-se uma mistura de espécies de GDNF com vários truncamentos N- terminais, assim como forma madura (não truncada) com ou sem a região de pró-domínio.

[00025] Os exemplos a seguir, realizados essencialmente conforme descrito abaixo, podem ser usados para avaliar certas características de variantes de GDNF humano da invenção.

Exemplo 1 Expressão, Purificação e Análise de Imunoqenicidade da Proteína a. Subclonagem, Mutação, Expressão, Desdobramento, Redobramento e Purificação de GDNFv expressado em E. coli

[00026] Subclonagem. E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL portadora do plasmídio pET-30a(+)/rhGDNF é cultivada em meio de caldo Luria-Bertani contendo canamicina a uma concentração final de 30 pg/mL durante uma noite a 37°C. Após colher as células por centrifugação, o vetor plasmídico é isolado usando um kit QIAquick Spin Miniprep (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA plasmídico isolado é, então, usado para reação de extensão por primer dos genes Δ31-GDNF e Δ31-N38Q-GDNF que codificam a proteína Δ31-GDNF (31 resíduos truncados da N-terminal do GDNF humano maduro) e proteína Δ31-N38Q-GDNF (31 resíduos truncados da N-terminal do GDNF humano maduro em que o resíduo aspargina na posição 38 é substituído por glutamina), respectivamente. Isso pode ser realizado usando-se os primers oligonucleotídicos Δ31-for, Δ31-rev, Δ31-N38Q-for e Δ31-N38Q-rev (SEQ ID NOs:6, 7, 39 e 40, respectivamente) contendo sítios de endonuclease de restrição Ndel e Xhol projetados para anelamento às extremidades 5' e 3' do gene. Os sítios de restrição Ndel e Xhol introduzidos nas extremidades 5' dos primers em sentido e antissentido permitem a clonagem de Δ31-GDNF e Δ31-N38Q-GDNF nos sítios correspondentes do vetor pET-30a(+). A reação de extensão por primer é realizada durante 3min a 94°C, seguida por 16 ciclos de três etapas de 1 min a 94°C, 0,5min a 55°C e 1min a 72°C, com uma etapa final de 10 min a 72°C, em um volume total de 100 pL usando 80 ng de DNA de molde, primers diretos e reversos e PCR Supermix (Invitrogen n° 10572-014). Os amplicons resultantes são verificados com eletroforese em gel de agarose e limpados com o kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00027] Tanto o gene Δ31-GDNF ou Δ31-N38Q-GDNF amplificado, quanto o vetor pET-30a(+)são digeridos durante duas horas a 37°C com Ndel e Xhol, seguido por purificação do DNA por eletroforese em gel de agarose usando o kit de Extração em Gel QIAquick. O Δ31- GDNF ou Δ31-N38Q-GDNF é, então, ligado no plasmídio pET-30a(+) usando T4 DNA ligase e de acordo com o protocolo do fabricante. 2 - 5 pL das misturas de ligação são usados para transformar diretamente 50 - 100 pL de células quimicamente competentes de E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL de acordo com o protocolo do fabricante (Agilent n° 230280). As colônias transformantes resultantes obtidas por plaqueamento em placas de ágar Luria-Bertani contendo canamicina a uma concentração final de 30 pg/mL são selecionados quanto à presença do construto corrente mediante sequenciação do plasmídio extraído em ambas as direções usando os primers oligonucleotídicos promotor T7 e terminador T7 padrões.

[00028] Mutações. Realiza-se mutagênese direcionada a sítio com um kit de mutagênese direcionada a sítio QuikChange Multi (Stratagene, La Jolla, CA) para preparar Δ31-N38Q-D95E-GDNF e Δ31- N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF. O método usa Δ31-N38Q- GDNF, inserido em pET-30a(+) como um molde, e oligonucleotídeos Δ31-N38Q-D95E-for e Δ31-N38Q-D95E-rev (Tabela 1, SEQ ID Nos:41 e 42) como primers direto e reverso, respectivamente. Subsequentemente, o gene Δ31-N38Q-D95E com mutação bem sucedida inserido em pET-30a(+) é usado como um molde, e os oligonucleotídeos Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-for e Δ31-K84A- R88K-R90K-D95E-D95E-rev (Tabela 1, SEQ ID NOS:43 e 44) como primers direto e reverso, respectivamente, para produzir Δ31-N38Q- K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF. A sequência de DNA é confirmada, e o plasmídio é transformado em células E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL quimicamente competentes.

[00029] Expressão da Proteína. Estoques congelados permanentes de células E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL portadoras do plasmídio pET-30a(+)/GDNFv são usados para inocular 50 mL de meio de caldo 2xTY contendo canamicina a concentrações finais de 30 pg/mL, a 37°C. Após 9h, 5 mL da cultura de partida é usada para inocular 6x2 litros do mesmo meio de cultura líquido a 37°C. Quando a cultura atinge uma densidade óptica a 600 nm entre 0,8 e 1,4, tipicamente após 16h, adiciona-se IPTG a uma concentração final de 1 mM, e a temperatura da cultura é reduzida entre 27 e 30°C durante 5 h. As células são colhidas por centrifugação a 10.000 g durante 20 min a 4°C e armazenadas a -80°C.

[00030] Solubilização-Redobramento. A pasta de células é posta em suspensão em 2 - 3 volumes de uma solução de lisozima a 0,2 mg/mL, MgCh a 5mM e Tris-CI a 50 mM a pH 8 e deixada incubar com agitação durante 30 min em gelo. A suspensão resultante é sonicada em gelo durante 10 min (pulsos de 5 s, intervalo de 2 s, 30-40% de amplitude). Depois disso, o GDNFv é recuperado na forma de corpúsculos de inclusão que são isolados do lisado celular por centrifugação a 20.000 g durante 20 min e solubilizados em 4M de guanidina, 90 mM de cisteína, 20 mM de Tris-CI, pH 8,5. A proteína é redobrada na forma ativa por diluição a 10X com 0,2 M de guanidina, 2M de ureia, 20 mM de Tris-CI, pH 8,75. A mistura de redobramento é mantida a 4°C. durante 2 dias.

[00031] Purificação. O GDNFv redobrado é purificado até a homogeneidade através de 3 etapas de cromatografia em coluna: 1. Cromatografia de troca de cations (CEX) em coluna SP; 2. Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em coluna Fenil; 3. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em coluna Superdex-75.

[00032] A proteína renaturada é primeiro aplicada a uma coluan de fluxo rápido SP Sepharose equilibrada em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. GDNFv é eluído com um gradiente de sal linear ascendente de 0,3 a 1 M de NaCI em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. O conjunto principal CEX é suplementado com NaCI a uma concentração final de 2,5 M e, então, aplicado a uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica Fenil Sepharose HP em citrato de sódio a 20 mM, pH 5. A coluna HIC é eluída com um gradiente de sal linear descendente de 2,5 a 0 M de NaCI em citrato de sódio a 20 mM, pH 5. GDNFv se liga firmemente à coluna HIC. O conjunto principal HIC é, então, concentrado e finalmente aplicado a uma coluna Superdex-75, e a proteína é eluída com PBS, pH 7,4. O conjunto final é concentrado, filtrado através de uma membrana de 0,22 microns e armazenado a - 80°C.

b. Expressão e Purificação de GDNFv em Células de Mamíferos

[00033] Genes que codificam variantes de GDNF podem ser preparados usando técnicas padronizadas de biologia molecular ou por síntese de gene em um vetor de expressão em mamíferos acionado por promotor CMV. Os plasmídios recombinantes são usados para transfectar transitoriamente células renais embrionárias humanas 293EBNA (HEK293), e o meio é colhido após 5 dias. Em outro método linhagens celulares de ovário de hamster chinês estáveis (CHO) são geradas para expressar variantes de GDNF. Genes que codificam as proteínas variantes são subclonadas nas estruturas principais de plasmídios de expressão contendo Glutamina Sintetase (GS) (plasmídios à base de pEE12.4, Lonza Biologies, Slough, UK) em quadro com a sequência de sinal de GDNF nativa com pró-domínio de acordo com as instruções do fabricante. Construtos de GDNF de comprimento total (SEQ ID N°: 2) em vetores à base de pEE12.4 são transfectados em CHO e produzem formas truncadas de GDNF em que Δ31 é a forma predominante e pode ser purificada da mistura. Quando o pró-domínio e os primeiros 31 aminoácidos da N-terminal são removidos, então, a variante de GDNF truncada em Δ31-N- terminal é produzida de maneira eficiente e limpa em um sistema de expressão em mamífero, sem a necessidade de purificação de uma mistura de produtos de comprimento total e truncados conforme anteriormente relatado. O peptídio de sinal de secreção de GDNF nativo também pode ser substituídos por inúmeros peptídios de sinal de secreção, incluindo o peptídio de sinal de secreção de líder kapa de murídeo ou o peptídio de sinal de secreção de hormônio do crescimento humano. A variante de GDNF truncada em Δ31-N- terminal ainda é produzida de maneira eficiente e limpa com todos os peptídios de sinal de secreção apresentados, mas com níveis de expressão variáveis. Variantes de GDNF incorporando as mutações desejadas são subclonados em vetores de expressão adequados (como pEMK-NF2, Lonza) em quadro com a sequência de sinal kapa de murídeo.

[00034] Purificação. GDNFv é purificado até a homogeneidade mediante cromatografia em glóbulos de 4 etapas: 1. Cromatografia de troca de cátions (CEX) em coluna SP 2. Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em coluna Fenil 3. Cromatografia de troca de cátions (CEX) em coluna Capto MMC multimodelo 4. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em coluna Superdex-75.

[00035] Resumidamente, o meio de cultura colhido contendo proteínas variantes de GDNF é primeiro aplicado a uma coluna de fluxo rápido SP Sepharose equilibrada em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. GDNFv é eluído com um gradiente de sal linear de 0 a 1M de NaCI em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. O conjunto principal CEX é suplementado com NaCI a uma concentração final de 2,5 M e, então, aplicado a uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica Fenil Sepharose HP em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. A coluna HIC é eluída com um gradiente de sal linear inverso de 2,5 a 0 M de NaCI em acetato de sódio a 20 mM, pH 5. GDNFv se liga fracamente à coluna HIC. Um conjunto do fluxo e frações de eluição iniciais é, então, aplicada à resina multimodelo da coluna Capto MMC a pH 5. A coluna é lavada com Tris-CI a 50 mM, pH 8, e, então, o GDNFv é eluído com um gradiente de sal linear de 0 a 1 M de NaCI em Tris-CI a 50 mM, pH 8. O fluxo principal da Capto MMC é finalmente aplicado a uma coluna Superdex-75, e a proteína é eluída com PBS, pH 7,4. O conjunto final é filtrado através de uma membrana de 0,22 microns e armazenado a  2-8°C.

Análise Epivax do potencial de imunogenicidade

[00036] Variantes de GDNF humano selecionadas, com uma probabilidade reduzida de ligação a HLA-DR, são preparadas (SEQ ID Nos: 12 e 15) e comparadas com GDNF de tipo selvagem no ensaio de ligação a GFRa e heparina.

Exemplo 2 Estabilidade de GDNF tipo selvagem e variante Δ31 GDNF

[00037] A estabilidade do GDNF maduro de comprimento total tipo selvagem e das variantes de GDNF truncadas em Δ31-N-terminal podem ser avaliadas usando inúmeras técnicas analíticas, como RP- HPLC, SE-HPLC, HPLC de troca de cátions e espectrometria de massa para identificar quaisquer sítios de degradação nessas moléculas. Fazem-se, então, mutações para remover os sítios de degradação química para melhorar a estabilidade da variante de GDNF humano.

[00038] Cromatografia em fase reversa analítica (RP-HPLC). Em coluna Zorbax C8 SB-300Â, 3,5 microns, 4,6 x 50 mm aquecida a 60°C (Agilent Technologies n° 865973-909). A fase móvel é TFA a 0,1% em H2O. O GDNFV elui como um único pico a 214 nm com um tempo de retenção de 19 - 20min por um gradiente de acetonitrila linear de 5 a 50% durante 30min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min durante 35min.

[00039] Cromatografia de exclusão de tamanho analítica (SEC- HPLC). Em coluna TSK-G-2000-SW-XL, 5 microns, 7,8 x 300 mm (TOSOH BIOSEP n° 08540). Fase móvel: PBS + NaCI a 350 mM, pH 7,4, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min durante 35 min. O GDNFv elui como um único pico a 214 nm com um tempo de retenção de ~16 - 17min.

[00040] Cromatografia de troca de cátions analítica (CEX-HPLC). Em coluna Dionex, Propac WCX-10, 4 x 250 mm (Dionex n° 054993). A fase móvel é fosfato de sódio a 20 mM, acetonitrila a 10%, pH 7, O GDNFv elui como um pico complexo com um tempo de retenção de 25 - 30min por um gradiente de sal linear de 0,15 a 0,6 M de NaCI durante 45min com uma taxa de fluxo de 1 mL/min durante 52min.

[00041] Análise de Estabilidade Química (LC-MS) de Tipo Selvagem (GDNF bacteriano de comprimento total) versus GDNFv de CHO de Tipo Selvagem (GDNF truncado em Δ31-N-terminal).

[00042] GDNFv de tipo selvagem (GDNF bacteriano de comprimento total) versus de CHO de tipo selvagem (GDNF truncado em Δ31-N- terminal) são estressados a 37°C durante 4 semanas para identificar aminoácidos que possam estar associadas à instabilidade química. Amostras 1- GDNF de comprimento total de E.coli WT a 4°C durante 4 semanas, 1,0 mg/mL 2- GDNF de comprimento total de E.coli WT a 37°C durante 4 semanas, 1,0 mg/mL 3- Δ31-GDNFv de CHO WT a 4°C durante 4 semanas, 1,0 mg/mL 4- Δ31-GDNFV de CHO WT a 37°C durante 4 semanas, 1,0 mg/mL

[00043] Análise Intacta e Parcialmente Molecular. Uma alíquota de 10 pL de cada amostra (a solução é misturada com 20 pL de água ou uma alíquota de 10 pL de cada solução) é misturada com 40 pL de tampão tris-HCI a 100 mM, pH8, 1,0 pL de DTT a 50 mg/mL à temperatura ambiente durante 30 min. Cada amostra é submetida a análise LC/MS.

[00044] Digestão com Lys-C. Uma alíquota de 20 pL de cada solução de amostra é liofilizada até secar sob um sistema de vácuo rápido, e o material é, então, reconstituído em 0,5 pL de DTT a 50 mg/mL e 4,5 pL de guanidina-HCI a 6 M, tampão tris-HCI a 0,5 M, pH 8. A mistura é incubada a 37°C durante 30 minutos, e cada solução é, então, diluída com 93 pL de água e tratada com 2 pL de Lys-C a 0,2 mg/mL (Wako) a 37°C durante DUAS horas. Para GDNFv de CHO, 30 pL de produto de digestão tríptica são tratados com 0,5 pL de PNGase F a 37°C durante uma hora (para avaliar o perfil de carboidratos). O produto de digestão é acidificado com 2 pL de TFA a 10% em H2O antes da análise LC/MS.

[00045] Análise LC/MS. As soluções de amostra são analisadas por um espectrômetro de massa Waters SYNAPT acoplado com um espectrômetro de massa Waters Acquity UPLC ou Water LCT premier com um HPLC Waters 2795.

[00046] Análise de Cima Para Baixo. Os produtos de clivagem para GDNF de tipo selvagem são obtidos por análise LC-MS de GDNF parcialmente reduzido. Múltiplos produtos de clivagem são identificados, e dados quantitativos para essas clivagens são mostrados na Tabela 2. Várias clivagens (clivagens entre N15/R16, N22/P23, N25/S26 e N38/R39) têm vias de degradação similares, como desamidação mediante formação de succinimida. Para Δ31- GDNFv de CHO de tipo selvagem, os primeiros 31 resíduos de aminoácidos são clivados a partir da N-terminal. Embora GDNFv de CHO tenha dois sítios de N-glicosilação em potencial por cadeia, apenas um sítio é N-glicosilado. Os principais glicanos observados são oligossacarídeos di- ou triantenários com diferente galactosilação. De maneira interessante, não se detecta nenhum glicano significativamente sialilado. (Tabela 3)

[00047] Análise de Baixo Para Cima (Mapeamento de Peptídios). Cromatogramas UV do produto de digestão com Lys-C de amostras de estabilidade de GDNF reduzido mostram que, com exceção de GDNF peptídio 126-129, todos os peptídios esperados são detectados. Para material de CHO, peptídios N-terminais (antes de R32) não são detectados. O peptídio 38-60 contendo N49 está glicosilado, e mais de 95% do Asn49 estão ocupados. O peptídio 85-96 contendo N85 não está glicosilado. Esses resultados são consistentes com a análise LC/MS para amostras de GDNF reduzido.

[00048] No total, o homodímero tanto para o material de tipo selvagem, quanto de CHO é o principal componente. O componente secundário, que elui precocemente, é monomérico. de acordo com a análise de espectroscopia de massa, GDNF Cys41 forma uma ligação dissulfeto com um resíduo Cys livre para o monômero. A porcentagem relativa para os picos de monômero é muito baixa, e é < 1% para CHO e < 0,5% para o tipo selvagem por análise ultravioleta. O teor de monômero não se altera para os materiais estressados.

[00049] Também se obtêm as degradações, como oxidação, desamidação e isomerização, no mapeamento de peptídios. Os resultados são mostrados na Tabela 4. GDNF de tipo selvagem de comprimento total de E. coli. contém dois resíduos Met, M(-1) e M6, e a oxidação desses sítios é relativamente baixa. GDNF não contém nenhum resíduo Trp. GDNF tem oito resíduos Asp para o monômero de comprimento total. Os principais sítios de desamidação são N25 e N38. Como a desamidação ocorre muito mais rapidamente em tampão de elevado pH, a porcentagem relativa para esses sítios deve ser baixa quando estressados em tampão a pH 5 ou 6. Identifica-se um peptídio isomérico, 85-96, mas não está claro devido à isomerização de Asp em Iso-Asp ou racemização do resíduo de aminoácido. Sabe- se que estresse de elevado pH é geralmente racemização, e estresse de baixo pH é isomerização de Asp. Para GDNF de tipo selvagem de comprimento total, vários peptídios mostram as diferentes massas tanto para as amostras de controle (4°C), quanto estressadas (37°C). São, mais provavelmente, incorporações erradas durante a biossíntese da E. coli.

[00050] Esses dados indicam que a variante de GDNF truncada em Δ31-N-terminal produzida em células CHO tem melhor estabilidade química devido à deleção dos primeiros 31 resíduos de aminoácidos que incluem pontos quentes significativos de oxidação e desamidação, em comparação com o GDNF humano maduro de tipo selvagem de comprimento total produzido por E. coli quando estressado durante 4 semanas a 37°C. Além disso, conforme mostrado na Tabela 5, uma melhora significativa nas propriedades biofísicas e bioquímicas das duas variantes com mutação de GDNF truncadas em Δ31-N-terminal (N38Q e D95E, respectivamente) foi observada após a mutação, em comparação com a GDNF de E. coli de tipo selvagem de comprimento total ou a variante de GDNF truncada em Δ31-N-terminal antes da mutação.

Exemplo 3 Atividades de Ligação In Vitro

[00051] Os seguintes ensaios demonstram que certas variantes de GDNF humano reduzem a ligação a heparina, mantendo ao mesmo tempo a ligação ao receptor de GFRal para proporcionar uma variedade de características de ligação diferencial a heparina e receptor. . Cinética de Ligação de GDNFv a GFRs em Biacore

[00052] Variantes de GDNF (GDNFv: truncada em Δ31-N-terminal) podem ser expressadas em células de E.coli (bacterianas) ou de mamíferos (células CHO ou células HEK293 EBNA) e purificadas conforme descrito no Exemplo 1. As sequências primárias das variantes permanecem as mesmas, independentemente do sistema de expressão que é usado.

[00053] Usa-se um instrumento Biacore® 2000 para medir a cinética de ligação de GDNFv a receptores da família GDNF humanos e de rato (GFRal e GFRa2). As medições são realizadas a 25°C. As amostras são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio a 150 mM, EDTA a 3 mM, surfactante P-20 a 0,005% (p/v), pH 7,4). Proteína A, Staphylococcus aureus, é imobilizada nas células de fluxo 1 a 4 de um chip sensor CM4 (GE Healthcare n° BR-1005-39) a um nível de ~200 unidades de resposta (RUs) usando química de acoplamento de amina para capturar a quimera GFR Fc (Quimera GFRa-1 Recombinante Humano/GDNF Ra-1 Fc; Quimera GFRa-2 Recombinante Humano/GDNF Ra-2 Fc; Quimera GFRa-1 Recombinante de Rato/GDNF Ra-1 Fc; Quimera GFRa-2 Recombinante de Camundongo/GDNF Ra-2 Fc).

[00054] A ligação é avaliada usando múltiplos ciclos. Cada ciclo consiste nas seguintes etapas: 1) injeção de cerca de 10 pL de GFR a uma concentração de ~1,0 pg/mL e uma taxa de fluxo de 10 pL/min., objetivando uma captura de 120 - 150 RUs; 2) injeção de 250 pL de GDNFv a uma taxa de fluxo de 50 pL/min, em uma faixa de concentração final entre 10 nM e 0,04 nM, seguido por 20 min para dissociação; e 3) regeneração usando cerca de 30 pL de cloridrato de glicina a 10 mM, pH 1,5. As taxas de associação e dissociação para cada ciclo são avaliadas usando-se um modelo de "ligação 1:1 (Langmuir)"no software BIAevaluation, versão 4.1.

[00055] Os resultados são mostrados nas Tabelas 6 - 8 abaixo.

Ligação de Variantes de GDNF Humano a GFRal Usando ELISA

[00056] GDNF de tipo selvagem e variantes são testados em um ensaio ELISA, em que se mede a ligação das proteínas GDNF ao receptor ligado à placa (GFRal). Uma condição "sem GDNF" e/ou uma condição "proteína irrelevante" são usadas como controles negativos.

[00057] Cada poço de uma placa de 96 poços (placas Greiner 655081 Immunobind ELISA) é revestido com 70 pl de GFRal humano (quimera GFRal humano recombinante-Fc, livre de veículo) a 1 pg/mL em tampão carbonato, pH 9,6. Se um receptor irrelevante for revestido, é uma quimera Fc irrelevante e está revestido à mesma concentração que GFRal. As placas são lacradas e incubadas a 4°C durante uma noite. Os poços são aspirados e lavados duas vezes com tampão de lavagem (Tris (hidroximetil) aminometano a 20 mM, pH 7,4, NaCI a 0,15 M, Tween-20 a 0,1%), usando um lavador de placa automático. As placas são bloqueadas com 200 pL de tampão de bloqueio por poço (leite em pó Carnation Instant a 3% no tampão de lavagem acima) durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. As placas são lavadas duas vezes com tampão de lavagem.

[00058] Proteínas GDNF são serialmente diluídas em tampão de bloqueio a uma faixa de concentração apropriada, tipicamente começando a 5 pg/mL e diluindo serialmente a 1:10. Usa-se um controle sem GDNF, que consiste apenas em tampão de bloqueio. 50 pL de cada solução de GDNF são adicionados aos poços revestidos com GFRal em triplicata. As placas são incubadas durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem.

[00059] Uma alíquota de 50 pL de anticorpo anti-GDNF humano biotinilado (R&D Systems, anticorpo policlonal anti-GDNF humano de cabra biotinilado, catálogo n° BAF212) diluído a uma concentração de 1 pg/mL em tampão de bloqueio, é adicionada a cada poço e incubada durante 45minutos à temperatura ambiente. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem.

[00060] Uma alíquota de 50 pL de estreptavidina conjugada a peroxidase de raiz-forte (Jackson ImmunoResearch, catálogo n° 016- 030-084), diluída a 1:1.000 em tampão de bloqueio, é adicionada a cada poço e incubada durante 20 - 30 minutos à temperatura ambiente. Alternativamente, pode-se usar uma diluição de 1:2.000, com um tempo de incubação de 30 - 90 minutos. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem. 50 pL de substrato cromogênico (isto é, substrato OPD) são adicionados a cada poço e deixados revelar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. A reação é interrompida por adição de 100 pL de HCI a 1N a cada poço. A absorbância dos poços é lida a 490 nm em um leitor de placa Molecular Devices SpectraMax250. A absorbância média para os poços em triplicata para cada condição é determinada, e os valores resultantes são processados para cálculo de ECso com o software Graph Pad Prism para fornecer um intervalo de confiança de 95%. Essas faixas estão resumidas na Tabela 9 abaixo.

Ligação de Variantes de GDNF Humano a Heparina Usando ELISA

[00061] GDNF de tipo selvagem e variantes são testados em um ensaio ELISA, em que se mede a ligação das proteínas GDNF a heparina ligada à placa. Usa-se uma condição "sem GDNF" como um controle negativo.

[00062] Cada poço de uma placa de Ligação a Heparina de 96 poços (BD BioSciences Heparin Binding Plates, catálogo n° 354676) é revestido com 70 pL de heparina (heparina de peso molecular misto da Sigma, Sal Sódico de Heparina da Mucosa Intestinal Suína, catálogo n° H-3149) a 5 pg/mL em PBS. As placas são lacradas e incubadas à temperatura ambiente durante uma noite, protegidas da luz. Os poços são aspirados e lavados três vezes com tampão de lavagem, usando um lavador de placa automático. As placas são bloqueadas com 200 pL de tampão de bloqueio por poço durante 90 - 120 minutos a 37°C (as placas são lacradas durante essa incubação). As placas são lavadas duas vezes com tampão de lavagem.

[00063] Proteínas GDNF são serialmente diluídas em tampão de bloqueio a uma faixa de concentração apropriada, tipicamente começando a 5 pg/mL e diluindo serialmente a 1:10. Usa-se um controle "sem GDNF", consistindo apenas em tampão de bloqueio. Uma alíquota de 50 pL de cada solução de GDNF é adicionada aos poços revestidosw com heparina em triplicata. As placas são incubadas durante 1,5-2 horas à temperatura ambiente. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem.

[00064] Uma alíquota de 50 pL de anticorpo humano anti-GDNF biotinilado, diluído a uma concentração de 1 pg/mL em tampão de bloqueio, é adicionada a cada poço e incubada durante 45 minutos a uma hora à temperatura ambiente. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem.

[00065] Uma alíquota de 50 pL de estreptavidina conjugada a peroxidase de raiz-forte, diluída a 1:1.000 em tampão de bloqueio, é adicionada a cada poço e incubada durante 20 - 30 minutos à temperatura ambiente. Alternativamente, pode-se usar uma diluição de 1:2.000, com um tempo de incubação de 30 - 90 minutos. Os poços são, então, lavados 3 vezes com tampão de lavagem. Uma alíquota de 50 pL de substrato cromogênico (isto é, substrato OPD) é adicionada a cada poço e deixada revelar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. A reação é interrompida por adição de 100 pL de HCI a 1N a cada poço. A absorbância dos poços é lida a 490 nm em um leitor de placa. A absorbância média para os poços em triplicata para cada condição é determinada, e os valores resultantes são processados para cálculo de ECso com o software Graph Pad Prism para fornecer um intervalo de confiança de 95%. Essas faixas estão resumidas na Tabela 9 abaixo. Tabela 9

[00066] Esses dados mostram que a deleção dos 31 aminoácidos N-terminais (variante chamada de "Δ31 GDNF de CHO") do GDNF de tipo selvagem (chamado de "GDNF de E. coli WT") pode reduzir significativamente a ligação a heparina (aproximadamente 10 vezes), mantendo, ao mesmo tempo, a ligação a receptor de GFRcH, e esses dados também indicam que várias características diferenciais de ligação a heparina e receptor podem ser conseguidas através de variantes adicionais de GDNF humano.

Exemplo 4 Atividades In Vitro Ensaio de Brotamento de Neurito NS-1

[00067] A atividade de GDNF para diferenciação neuronal é avaliada usando células Neuroscreen-1 de rato (subclone PC12). As células são mantidas em meio basal F-12K, soro de cavalo termicamente inativado a 12,5%, soro bovino fetal termicamente inativado a 2,5% (FBS), 1X GlutaMAX™ (Invitrogen, Cat.n0 35050061) e 1X Anti-anti (Invitrogen, Cat.n0 15240) a 37°C, 95% de umidade em frascos revestidos com colágeno. Para medir o brotamento de neurito, as células Neuroscreen-1 são semeadas em placas de 96 poços Collagen I a 2.200 células por poço em meio de crescimento usando apenas os 60 interiores. Após 24h de fixação celular, o meio é removido, e novo meio de crescimento contendo GFRcH-Fc a 1 pg/mL mais GDNF diluída em uma série de diluição de 8 pontos é adicionado à placa em poços em triplicata ou seis poços por concentração. Meio mais 1 pg/mL de GFRcH-Fc é incluído como um controle negativo, e meio mais 25 ng/mL de fator de crescimento de neurito é incluído como um controle positivo para resposta celular no ensaio. As placas são incubadas durante 96h a 37°C, 95% de umidade e, então, fixadas por adição de 45 pL de solução fixadora a cada poço e incubação à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas são lavadas duas vezes com 1X tampão de lavagem do Neurite Outgrowth Hit Kit™(Cellomics, Cat.n0 K07-0001-1) e, então, lavadas duas vezes com 1X tampão do kit. As células são imunotingidas com os reagentes de brotamento de neurito do kit de acordo com as instruções do fabricante. As placas são carregadas em um Instrumento Arrayscan e analisadas usando o software Arrayscan e o algoritmo Neuronal Profiling da Cellomics. Os dados gerados pelo algoritmo são processados para cálculo da EC50 com 0 software Graph Pad Prism.

[00068] Múltiplas variantes são testadas quanto à atividade de diferenciação neuronal, e as ECsos observadas para cada variante são relacionadas na Tabela 10A.

[00069] Todas as amostras de GDNF aqui testadas têm atividade no ensaio de brotamento de neurito, em graus variáveis. As curvas de dose para a variante Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E- R130E não atingem um estabilização na dose máxima nos dois experimentos realizados, de modo que a EC50 não pôde ser calculada. Os intervalos de confiança de 95% da EC50 para as outras quatro variantes de GDNF se superpõem em faixas, demonstrando níveis similares de atividade nesse ensaio.

Fosforilação do Receptor C-Ret

[00070] O ensaio de fosforilação do receptor e c-Ret pode ser usado para demonstrar a indução da fosforilação do receptor c-Ret na posição Y1016. A atividade de GDNF para fosforilação do receptor c- Ret é avaliada em células da linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC) que tenham sido transfectadas de maneira estável para superexpressar c-Ret humano. As células são mantidas em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de FBS, 3 pg/mL de Blasticidina. Para a fosforilação de c-Ret, as células são semeadas a 5 x 105 por poço em placas de 24 poços revestidas com colágeno em meio de crescimento sem Blasticidina e deixadas fixar durante uma noite. O meio é trocado por DMEM de baixa glicose + 0,25% de BSA (albumina sérica bovina) durante 24h. Remove-se o meio de inanição, e as células são tratadas com GDNF em DMEM sem glicose, 0,25% de BSA, 1 pg/mL de GFRa1-Fc durante 30minutos a 37°C. Cada variante de GDNF é testada a múltiplas concentrações. O meio de tratamento é removido, e as células são raspadas da superfície da placa em tampão de lise gelado de Reagente de extração M-Per + coquetel inibidor de protease, inibidor de fosfatase 1, coquetel inibidor de fosfatase 2, e coquetel inibidor de fosfatase 3 (Sigma™). As suspensões de células são remoinhadas até a lise completa, centrifugadas a 14.000 x g para pelotizar detritos celulares, e o sobrenadante é quantificado quanto à concentração de proteína usando os reagentes de ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Para cada lisado de GDNF, 10 pg de proteína são separados por Géis Bis- Tris NuPAGE® Novex® a 4 - 12% (Invitrogen, Cat.n0NP0322) e transferidos para papéis de transferência com PVDF. A tirosina 1016 fosfo-Ret é detectada com um anticorpo policlonal de coelho e anticorpo de cabra anti-HRP de coelho; e c-Ret é detectado com um anticorpo monoclonal de camundongo e anticorpo de cabra anti-HRP de camundongo. Os papéis de transferência são revelados com os reagentes Supersignal West Pico™ (Thermo Scientific, Cat.n0 34081) e expostos a um filme de raios X. Cinco variantes de GDNF (GDNF de E.coli WT, Δ31 GDNF de CHO, Δ31-N38Q-D95E GDNF de CHO, Δ31- N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E GDNF de CHO e Δ31-N38Q-K84A- R88K-R90K-D95E-K125E-R130E GDNF de CHO) são testadas em DMEM sem glicose, 0,25% de meio BSA + 1 pg/mL de GFRα1-Fc quanto à atividade de fosforilação de c-Ret a quatro concentrações de 0,8, 2,0, 4,0, 10, 20, 50 e 100 ng/mL. Meio apenas, meio + 1 pg/mL GFRα1-Fc e meio + 100 ng/mL de Δ31 GDNF de CHO também foram testados como controles negativos. Cada uma das cinco variantes de GDNF induz fosforilação de c-Ret com uma ECso de 8 - 15 ng/mL. Esses dados demonstram que todas as cinco variantes de GDNF induzem fosforilação de c-Ret em Y1016 de maneira dependente da dose.

[00071] Conforme resumido na Tabela 10B, as variantes de GDNF truncadas em Δ31-N-terminal manipuladas que mostraram melhora significativa nas propriedades biofísicas e bioquímicas (Tabelas 5, 6, 9 e 10A) mantiveram propriedades biológicas otimizadas, por exemplo, ligação a receptor de GFRol comparável, ligação a heparina diminuída e brotamento de neurito comparável, após 4 semanas de incubação a 37°C.

Exemplo 5 Atividade da Variante de GDNF em Ensaios de Circulação de DA

[00072] Ratos Sprague-Dawley machos são anestesiados com isoflurano (3% em O2). A cabeça é raspada e esterilizada com solução de iodo antes de 0 animal ser posicionado em uma armação estereotáxica com esteira de controle de temperatura. Os olhos são protegidos com gel oftálmico, e a anestesia é mantida com isoflurano (1 - 2% em O2).

[00073] Faz-se uma incisão na linha mediana da cabeça do animal, 0 escalpo e o tecido subjacente são refletidos, e 0 crânio é secado para se visualizar 0 bregma. As coordenadas para 0 núcleo caudato são medidas a partir do bregma e da superfície durai para infusão de GDNF. Uma cânula de infusão calibre 28 é lentamente abaixada para essa posição, e a infusão começa 1 minuto depois usando uma bomba. Um bolus de 2 pL do GDNF de teste é infundido no hemisfério esquerdo durante 4 minutos a 0,5 pL/min, e a cânula permanece no lugar durante mais 3 minutos uma vez cessada a infusão. Uma vez que a cânula tenha sido removida, 0 sítio de incisão é fechado, um analgésico pós-operatório é administrado, e o animal é deixado se recuperar em uma gaiola de temperatura controlada antes de ser transferido para a gaiola de moradia. Os animais são verificados no pós-operatório de acordo com as diretrizes éticas locais. A um intervalo apropriado após a infusão, o animal é sacrificado, o cérebro é removido, e os núcleos caudatos são dissecados com precisão, pesados e congelados à espera de análise por HPLC de dopamina e metabólitos. Deixa-se o tecido congelado descongelar rapidamente, e se homogeneíza em 0,5 ml_ de tampão de homogeneização (ácido perclórico a 0,1 M (PCA), ácido etilenodiamina-tetra-acético a 0,1 mM (EDTA), ácido ascórbico a 2,5 mg/L) antes da centrifugação a 20.000 g durante 15minutos. O sobrenadante é removido e filtrado através de um dispositivo de filtração sem seringa. A análise de dopamina (DA), ácido di-hidróxi- fenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) é realizada usando-se HPLC acoplada a detecção eletroquímica. Uma alíquota de 20 pL de cada amostra é injetada e quantificada contra uma curva de calibração externa (LC4C, BAS, USA). A fase móvel consiste em 100 mM de NaH2PO4, 100 mM de H3PO4, 2 mM de OSA, 1mM de EDTA, 13% de Metanol (MeOH), pH2,8, usando uma coluna Hypersil BDS (Sílica Desativada Básica) (Thermo Scientific, Cat.n0 28105) de 150 x 3,0 mm, C18 e partícula de 3 p a 40°C. Os dados são coletados usando o softwarede cromatografia Empower. Realiza-se um ajuste logístico de 4 parâmetros em todos os dados antes da expressão como ng/g de peso de tecido úmido. O circulação de dopamina medido é expresso como (DOPAC+HVA)/DA, e as comparações são efetuadas com hemisfério esquerdo (tratado) versus hemisfério direito (intacto). Tabela 11

Os valores são a média ± e.m.p. n = 5 por grupo ** p< 0,01 ou *** p<0,001 versus lado intacto

[00074] Os dados demonstram que cada uma das variantes de GDNF nomeadas na Tabela 11 aumenta significativamente a circulação de dopamina no hemisfério tratado, em comparação com o hemisfério intacto.

Exemplo 6 Ensaios In Vivo Modelo de Lesão Retrógrada Induzida por 6-Hidróxi Dopamina (6-OHDA)

[00075] Ratos Sprague-Dawley machos são anestesiados com isoflurano (3% em 02). A cabeça é raspada e esterilizada com solução de iodo antes de o animal ser posicionado em uma armação estereotáxica com esteira de controle de temperatura. Os olhos são protegidos com gel oftálmico, e a anestesia é mantida com isoflurano (1 - 2% em 02).

[00076] Faz-se uma incisão na linha mediana da cabeça do animal, o escalpo e o tecido subjacente são refletidos, e o crânio é secado para se visualizar o bregma. As coordenadas para o núcleo caudato são medidas a partir do bregma e da superfície durai para infusão de 10 pg de 6-hidróxi-dopamina (6-OHDA). Uma cânula de infusão calibre 28 é lentamente abaixada para essa posição e a infusão começa 1 minuto depois. Um bolus de 2 pL de 6-OHDA é infundido no hemisfério esquerdo durante 4 minutos a 0,5 pL/min, e a cânula permanece no lugar durante mais 3minutos uma vez cessada a infusão.

[00077] 30minutos após a infusão de 6-OHDA, o GDNF de teste é infundido usando o mesmo protocolo. As coordenadas para a infusão de GDNF são Anterior-Posterior +1,0, LM -2,5, DV -4,5 mm a partir do bregma e superfície durai como antes.

[00078] Uma vez que a cânula tenha sido removida, o sítio de incisão é fechado, um analgésico pós-operatório é administrado, e o animal é deixado se recuperar em uma gaiola de temperatura controlada antes de ser transferido para a gaiola de moradia. Os animais são verificados no pós-operatório de acordo com as diretrizes éticas locais. A um intervalo apropriado após a infusão, o animal é sacrificado, o cérebro é removido, e os núcleos caudatos e substância negra foram dissecados com precisão, pesados e congelados à espera de análise por HPLC de dopamina e metabolites.

[00079] Deixa-se o tecido congelado descongelar rapidamente, e se homogeneíza em 0,5mL de tampão de homogeneização (PCA a 0,1 M, EDTA a 0,1 mM, ácido ascórbico a 2,5 mg/L) antes da centrifugação a 20.000 x g durante 15minutos. O sobrenadante é removido e filtrado através de um dispositivo de filtração sem seringa. A análise de dopamina (DA), DOPAC e HVA é realizada usando-se HPLC acoplada a detecção eletroquímica. Uma alíquota de 20 pL de cada amostra é injetada e quantificada contra uma curva de calibração externa. A fase móvel consiste em 100 mM de NaH2PO4, 100 mM de H3PO4, 2 mM de OSA, 1 mM de EDTA, 13% de MeOH, pH 2,8, usando uma coluna BDS Hypersil de 150 x 3,0 mm, C18 e partículas de 3 p a 40°C. Os dados são coletados usando 0 software de cromatografia Empower. Realiza-se um ajuste logístico de 4 parâmetros em todos os dados antes da expressão como ng/g de peso de tecido úmido. As comparações são realizadas com hemisfério esquerdo (tratado) versus hemisfério direito (intacto). Tabela 12: Núcleo caudate

Os valores são a média ± e.m.p. n = 8 por grupo *** p<0,001 versus lado intacto Tabela 13: Substância negra

Os valores são a média ± e.m.p. n = 8 por grupo *p<0,05, ** p< 0,01 ou *** p<0,001 versus lado intacto # p<0,05, ## p<0,01 versus veículo (lado tratado)

[00080] A administração de 6-OHDA ao núcleo caudato resulta em uma diminuição significativa nos níveis de dopamina no lado tratado em comparação com o lado intacto (Tabela 12). Um déficit significativo também é observado na substância negra (Tabela 13), que é evitado pela administração de GDNF. Todas as variantes de GDNF aqui testadas são significativamente diferentes do veículo em comparação com os lados tratados.

Biodistribuição Aguda no Cérebro de Rato

[00081] Ratos Sprague-Dawley machos são anestesiados com isoflurano (3% em O2). A cabeça é raspada e esterilizada com solução de iodo antes de 0 animal ser posicionado em uma armação estereotáxica com esteira de controle de temperatura. Os olhos são protegidos com gel oftálmico, e a anestesia é mantida com isoflurano (1 - 2% em O2).

[00082] Faz-se uma incisão na linha mediana da cabeça do animal, 0 escalpo e 0 tecido subjacente são refletidos, e 0 crânio é secado para se visualizar 0 bregma. As coordenadas para 0 núcleo caudato são medidas a partir do bregma e da superfície durai para infusão de GDNF (Anterior-Posterior + 0,5, Lateral Medial -3,0, Dorsal Ventral -5,5 mm). Uma cânula de infusão calibre 30 é lentamente abaixada para essa posição, e a infusão começa 1 minuto depois (usando-se uma bomba). Um bolus de 2 pL do GDNF de teste é infundido no hemisfério esquerdo durante 4 minutos a 0,5 pL/min, e a cânula permanece no lugar durante mais 3 minutos uma vez cessada a infusão. Uma vez que a cânula tenha sido removida, 0 sítio de incisão é fechado, um analgésico pós-operatório é administrado, então, 0 animal é deixado de se recuperar em uma gaiola de temperatura controlada. A um intervalo apropriado após a infusão, 0 animal é sacrificado, e 0 cérebro é removido e congelado à espera de criosseccionamento para imunoistoquímica. .

Imunoistoquímica de GDNF (IHC) no Cérebro de Rato

[00083] A biodistribuição de GDNF infundido é testada em um ensaio imunoistoquímico, em que a ligação do anticorpo ao antígeno infundido (GDNF e variantes de GDNF) é medida em cérebros de rato. Um anticorpo de controle de isotipo é usado como um controle negativo.

[00084] O criosseccionamento dos cérebros de rato congelados começa aparando-se 0 cerebelo enquanto dentro de um criostato a - 20 graus C, usando uma matriz de cérebro de rato para formar uma superfície plana. Optimal Cutting Temperature™ (OCT, Sakura ou outros fornecedores similares) é colocado em um fixador de espécime de criostato resfriado. Quando o OCT começa a congelar, a superfície caudal plana do cérebro de rato é colocada sobre o fixador de espécie usando-se pinças resriadas a -20 graus C, de modo que o OCT grude o cérebro no lugar com o cérebro mais rostral voltado para longe do fixador de espécime. O fixador de espécime é colocado no suporte de objeto e apertado. Depois de uma lâmina de micrótomo ter sido inserida no suporte de faca, usa-se a função de aparamento no criostato para descartar os bulbos olfatórios, assim como o cérebro, rostral ao trajeto de infusão. Foram feitas seções de 8 pm de espessura a intervalos de 300 pm, que foram colocadas sobre lâminas de vidro positivamente carregadas. Duas ou três seções de intervalos adjacentes são colocadas em cada lâmina de vidro para cada cérebro de rato. As lâminas são, então, colocadas em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 20 minutos e enxaguadas em tampão de lavagem salina tween-20 (TBST) tamponado com tris. Usando-se uma solução de coloração à temperatura ambiente, as lâminas são incubadas durante 10 minutos com bloqueio de enzima endógena duplo, enxaguadas com tampão de lavagem TBST, incubadas com 15 minutos cada de bloqueio de avidina e biotina, lavadas com tampão de lavagem TBST, bloqueadas com bloqueio de proteína durante 60minutos e sopradas da lâmina com uma faca de ar. Anti-GDNF humano biotinilada ou uma IgG de cabra biotinilada é diluída em diluente de anticorpo com agentes redutores de fundo a 2 pg/mL e incubada sobre a lâmina durante 60minutos, então, enxaguada com tampão de lavagem TBST 3 vezes. As lâminas são incubadas com estreptatividina biotina marcada 2 (LSAB2) (Dako, Cat.n0K0609) durante 10 minutos e enxaguadas com tampão de lavagem TBST. As lâminas são incubadas com DAB+ (duas gotas de DAB em diluente de DAB durante 5 minutos, então, enxaguadas com tampão de lavagem TBST, seguido por um enxágue com água destilada. Depois de as lâminas serem rmeovidas do autotingidor, elas são contratingidas com Hematoxylin™ e cobertas com lamínulas usando Cytoseal XYL™ (Stephens Scientific, Cat. n° 8312-4). As lâminas são deixadas secar e, então, analisadas usando Aperio XT para quantificar a biodistribuição.

Quantificação da Biodistribuição de GDNF no Cérebro de Rato

[00085] As imagens das lâminas são adquiridas no ajuste de ampliação de 20X em um Aperio ScanScope XT (operando a versão 10.00.00.1805 do software controlador). Metadados acerca das lâminas são armazenados no software baseado na web da Aperio, Spectrum (v10.0.1346.1806).

[00086] Cada seção de cérebro é manualmente delineada usando o software de visualização de imagem da Aperio, ImageScope (v10.0.36.1805). Para o primeiro estudo, delilneia-se a seção cerebral inteira com a menor quantidade de artefato de seccionamento visível. Para o segundo estudo, delineia-se a seção de cérebro inteiro mais próxima do rótulo da lâmina. Cada região delineada é analisada com o algoritmo "Contagem de Pixels Positiva" da Aperio (v9) [com todos os parâmetros mantidos em seus ajustes predeterminados, exceto o Zoom da Imagem = 0,01 e Limiar de Intensidade FRACO (Limite Superior) = 235],

[00087] A área de distribuição de GDNF em mm2 para cada rato é computada somando-se as saídas de áreas positivas e positivas fortes do algoritmo de pixels positivos. Usa-se um teste t de Student pareado para determinar a significância estatística.

[00088] Os dados de ELISA para a ligação a heparina (Tabela 9) demonstram que modificações no GDNF de tipo selvagem podem reduzir a ligação a heparina em comparação com GDNF de E.coli-WT. Esses dados, juntamente com os dados de biodistribuição mostrados acima na Tabela 14, confirmam que variantes que diminuem a ligação a heparina podem resultar em um aumento na biodistribuição no cérebro de rato. As variantes N38Q-D95E e N38Q-K84A-R88K-R90K- D95E relacionadas na tabela acima têm biodistribuição aumentada em comparação com GDNF de E.Coli-WT.

[00089] As novas variantes de GDNF da presente invenção são, de preferência, formuladas como composições farmacêuticas administradas por várias vias. Mais preferivelmente, essas variantes de GDNF são para administração parenteral ou intracranial. Essas composições farmacêuticas e processos para sua preparação são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et. al., eds., 19aed., Mack Publishing Co., 1995).

[00090] Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade da nova variante de GDNF da presente invenção necessária para proporcionar um benefício terapêutico ao paciente. Deve-se entender que a quantidade de variante de GDNF realmente administrada será determinada por um médico à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o agente ativo real administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual e a gravidade dos sintomas do paciente.

Claims (10)

1. Variante de GDNF humano, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:23: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILXaa84NLSXaa88NXaa9oRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNL VYHILRXaai25HSAKXaai3oCGCI em que: i) Xaaβ4 é K ou A; ii) Xaass é R ou K; iii) Xaa99 é R ou K; iv) Xaa-i25 é K ou E; e v) Xaai3o é R ou E.

2. Variante de GDNF humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita variante é selecionada do grupo que consiste em: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI (SEQ ID N°:9), RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI (SEQ ID N°:12), e RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREH SAKECGCI (SEQ ID N°:15).

3. Variante de GDNF humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante é: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI (SEQ. ID: 9).

4. Variante de GDNF humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante é: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI (SEQ ID N°:12).

5. Variante de GDNF humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita variante é: RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETT YDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREH SAKECGCI (SEQ ID N°:15).

6. Intermediário para uso na preparação de uma variante de GDNF truncada em Δ31-N-terminal, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGY ETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPI AFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID N°: 28); e MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTD LGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQA CCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID N°: 35).

7. Intermediário de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos é: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTD LGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQA CCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI (SEQ ID N°: 35).

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de GDNF humano como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, e um ou mais diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de ser usada no tratamento de doença de Parkinson.

10. Uso de uma variante de GDNF humano como definida em qualquer uma das de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doença de Parkinson.