TWI583698B - 人類ｇｄｎｆ之變異體 - Google Patents

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Description

人類GDNF之變異體
本發明係關於醫藥領域，特定言之關於醫療性蛋白質領域。明確言之，本發明係關於新穎之人類神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)之變異體。GDNF之該等新穎變異體適用於治療帕金森氏症(Parkinson's disease)。
GDNF為習知之神經營養因子，有報導指出其可於活體外及活體內提供營養支援多巴胺激導性神經元。此外，已有報導指出GDNF在帕金森氏症之嚙齒動物及靈長類動物模式中提供功能性改善且具有神經保護作用。已將獲自大腸桿菌(E.coli)之野生型GDNF蛋白質經中樞投與罹患帕金森氏症患者，而出現混合結果。於兩次小型開放標記研究中，報導指出該野生型GDNF針對於運動功能產生長期改善效果。然而，於34位患者之隨機化安慰劑對照IIa期試驗中，經腦殼核內傳送GDNF 6個月時仍未顯示症狀性之改善。生物標誌物信號僅在緊臨輸注部位周圍組織處明顯增強。最新報導聲明，GDNF可為救援垂死神經之有效分子；然而，傳送該等分子至腦之適宜區域仍面臨令人畏懼之挑戰。 Nature ，第466卷：2010年8月19日。
WO 97/11964(PCT/US96/14915)中報導截短型GDNF蛋白質；然而，仍舊需要具有所需藥理學特性、穩定性及生物分佈特性之新穎GDNF變異體。需要一種在傳送裝置中穩定及有利於所需腦生物分佈，同時展現所需效價及可接受 免疫原性之GDNF變異體形式。可提供其中一或多種所需特性之GDNF變異體可為新穎之醫藥上適用之藥物療法，特定言之適用於治療帕金森氏症。
本發明提供一種在N-端缺乏該等第一段31個胺基酸之成熟人類GDNF結構域之新穎截短型GDNF變異體(「△31-N-端截短型GDNF」)，且取代某些胺基酸時，可提供賦予所需生物分佈特性及醫藥可接受免疫原性之穩定之合適強效性GDNF變異體。本發明提供賦予一或多種優於成熟人類野生型GDNF之優點之某些人類GDNF之變異體，包括該等比人類野生型GDNF具有改善之醫藥穩定性，以及比人類野生型GDNF具有改善之生物分佈，降低肝素結合性，降低脫醯胺化，降低形成琥珀醯亞胺之感受性及降低免疫原性潛力之變異體。某些新穎GDNF變異體可能適用為帕金森氏症患者之新穎治療選擇。
本發明提供一種含SEQ ID NO：23RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI(SEQ ID NO：23)之人類GDNF變異體，其中：i)Xaa84為K或A；ii)Xaa88為R或K；iii)Xaa90為R或K；iv)Xaa125為K或E；及 v)Xaa130為R或E。
本發明進一步提供一種人類GDNF變異體，其中該變異體選自由下列各物組成之群：RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：9)，RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：12)，及RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(SEQ ID NO：15)。
於一態樣中，本發明提供一種包含如示於SEQ ID NO：9中之胺基酸序列之人類GDNF變異體：RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI。
本發明進一步提供一種適用於製備成熟人類GDNF之△31-N-端截短型變異體之中間物。該中間物包含胺基酸序列SEQ ID NO：23：RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI(SEQ ID NO：23)，其在該N-端藉由信號分泌肽延伸。本文中採 用信號分泌肽序列之編號。信號分泌肽序列實例包括具有序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：25)之鼠科前導信號分泌肽，及具有序列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(SEQ ID NO：32)之人類生長激素信號分泌肽。
具有該等信號分泌肽之中間物可增加產生所主張人類GDNF變異體，其產率超過具有其他前導序列之截短型GDNF構築體。包含信號分泌肽之所揭示中間物可因此具有胺基酸序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：28)；或MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：35)。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明所主張之人類GDNF之變異體及一或多種醫藥可接受稀釋劑、載劑或賦形劑。本發明提供一種適用為藥物之人類GDNF變異體。本發明進一步提供一種適用於治療帕金森氏症之人類GDNF變異體。本發明提供一種用於醫療之GDNF變異體。
其中Xaa84為A，Xaa88為K，及Xaa90為K之變異體為較佳。
其中Xaa84為K，Xaa88為R，及Xaa90為R之變異體為較 佳。
其中Xaa125為K及Xaa130為R之變異體為較佳。
其中Xaa84為A，Xaa88為K，及Xaa90為K，Xaa125為E及Xaa130為E之變異體為較佳。
已報導野生型GDNF極有可能藉由位於N-端1至31個胺基酸殘基中之正電荷結合至肝素及胞外基質，因此限制GDNF在傳送至腦中之分佈(Lin等人，J Neurochem 63，第758至768頁，1994年；Rickard等人，Glycobiology 13，第419至426頁，2003年；Piltonen等人，Experimental Neurology 219，第499至506頁，2009年)。亦已報導GDNF提供功能性改善且在嚙齒動物及靈長類動物之帕金森氏症模式中具有神經保護作用(Tomac等人，1995年；Gash等人，1996年)。已將獲自大腸桿菌之野生型GDNF蛋白質經中樞投與罹患帕金森氏症患者，而出現混合結果。於兩次小型開放標記研究中，GDNF針對運動功能產生長期改善效果(Gill等人，2003年，Slevin等人，2005年)。此外，於一位死於心肌梗塞之不相關病因之患者中發現多巴胺激導性神經元分枝明顯增加(Love等人，2005年)。然而，由Amgen所執行對34位患者經腦殼核傳送GDNF(利阿特明(Liatermin))進行之隨機化安慰劑對照IIa期試驗中，顯示在6個月時無症狀性改善(Lang等人，2006年)。所主張GDNF變異體相較在先前測試之獲自大腸桿菌之野生型GDNF蛋白顯示改善之性能。
將含有信號肽(第一段19個胺基酸，SEQ ID NO：4)、前結構域(斜體部分，SEQ ID NO：5)及成熟肽(下劃線部分，SEQ ID NO：3)之野生型GDNF全長構築體序列(211aa)表示為SEQ ID NO：1：MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKR SPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI。將野生型GDNF全長DNA序列表示為SEQ ID NO：2：ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGAACAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGACAAGGTGGGCCAGGCCTGCTG CAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC。
由成熟人類野生型GDNF之134個胺基酸多肽(SEQ ID NO：3)判定本發明變異體之胺基酸位置。突變之表示法係先出示原始胺基酸，接著為胺基酸位置的編號，然後為置換之胺基酸。各變異體之編號係依據截短前之野生型成熟序列表示(「成熟WT GDNF」)。例如，以Ala(A)置換位置84之Lys(K)(即K84)即表示為K84A。依類似方式，以Ala(A)置換位置84之Lys(K)、以Lys(K)置換位置88之Arg(R)、以Lys(K)置換位置90之Arg(R)及以Glu(E)置換位置95之Asp(D)之多重置換法則表示為K84A/R88K/R90K/D95E。本文所用縮寫「KAKKE」係指K84A-R88K-R90K-D95E。
如本文所用，「全長GDNF」係指全蛋白質序列，包含信號肽、前結構域及成熟結構域。
如本文所用，「成熟GDNF」或「全長成熟GDNF」係指全GDNF成熟結構域(截斷信號肽及前結構域)。
如本文所用，「△31-N-端截短型GDNF」係指在N-端缺乏該等第一段31個胺基酸之GDNF成熟結構域。如本文所用，「△31-N-端截短型GDNF」及「人類GDNF變異體」(或「GDNFv」)可互換使用。
全長GDNF構築體在HEK293細胞內轉染5天時，主要產生全長成熟GDNF。當全長GDNF構築體在CHO細胞中轉染 更長的時間及在建立穩定細胞系期間時，GDNF之截短形式為主要形式(Lin等人，Science 260，第1130至1132頁，1993年)。其中已在N-端刪除胺基酸殘基編號1至31之成熟人類GDNF之截短變異體形式(德塔31(「△31」))具有SEQ ID NO：8，且可自混合物中純化。
可在哺乳動物或細菌表現系統中，在DNA層級下同時刪除成熟GDNF肽之前結構域肽序列及第一段31個胺基酸殘基，並使用許多分泌信號序列肽，諸如原生GDNF分泌信號肽(SEQ ID NO：4：MKLWDVVAVCLVLLHTASA)；鼠科前導分泌信號肽(SEQ ID NO：25：METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；及人類生長激素分泌信號肽(SEQ ID NO：32：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)，產生N-端截短型△31 GDNF變異體。該等構築體可產生單物種同源△31-N-端截短型GDNF變異體。
熟習此項相關技藝者明瞭，該所主張的GDNF變異體不排除醣基化可能性。所主張的GDNF變異體可依適宜情況醣基化，取決於所使用之表現系統。例如，哺乳動物表現之GDNF變異體係在位置N49醣基化，而細菌表現之變異體則不然。
在表現期間使用全長天然序列構築體(SEQ ID NO：2)時，產生具有各種不同N-端截短型之GDNF混合物，以及含有或不含前結構域區域之成熟形式(非截短型)。
基本上如下所述進行之以下實例可用於評估本發明之人類GDNF變異體之某些特性。
實例1
蛋白質表現、純化及免疫原性分析
a.大腸桿菌表現之GDNFv之次選殖、突變、表現、去折疊、再折疊及純化
次選殖。將帶有質體pET-30a(+)/rhGDNF的大腸桿菌株系BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL在37℃下，於含最終濃度為30 μg/ml之康黴素(kanamycin)之Luria-Bertani培養基中生長一夜。在藉由離心收集細胞之後，遵照製造商計劃書，使用QIA快速旋轉小型套組(QIAquick Spin Miniprep kit)(Qiagen)分離質體載體。然後將所分離的質體DNA用於△31-GDNF與△31-N38Q-GDNF基因之引子延伸反應，該等基因分別編碼△31-GDNF蛋白質(自成熟人類GDNF之N-端截短之31個殘基)及△31-N38Q-GDNF蛋白質(自成熟人類GDNF之N-端截短之31個殘基，其中位置38之天冬醯胺酸被麩醯胺酸取代)。此等可使用含有設計成連接至基因5'及3'端之NdeI及XhoI限制核酸酶內切部位之寡核苷酸引子△31-for、△31-rev、△31-N38Q-for及△31-N38Q-rev(SEQ ID NO分別為：6、7、39及40)達成。於正義及反義引子之5'端導入之該等NdeI及XhoI限制酶內切部位可使△31-GDNF及△31-N38Q-GDNF選殖進入載體pET-30a(+)之對應部位。引子延伸反應係使用80 ng模板DNA、正向及反向引子及PCR超混液(Supermix)(Invitrogen #10572-014)，在總體積100 μl下，在94℃下進行歷時3分鐘，接著如下進行16次3-步驟循環：94℃下歷時1分鐘，55℃下歷時0.5分鐘，及 72℃下歷時1分鐘，及最後在72℃下進行10分鐘之步驟。採用瓊脂糖凝膠電泳驗證所得擴增序列，並遵照製造商計劃書，使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)進行清潔。
於37℃下，利用NdeI及XhoI消解經擴增之△31-GDNF或△31-N38Q-GDNF基因及pET-30a(+)載體兩者歷時2小時，接著，使用QIAquick凝膠萃取套組(QIAquick Gel Extraction kit)，藉由瓊脂糖凝膠電泳法純化DNA。然後，使用T4 DNA連接酶並遵照製造商計劃書，將△31-GDNF或△31-N38Q-GDNF連接於pET-30a(+)質體中。取2至5 μl之該等連接反應混合物，遵照製造商計劃書(Agilent #230280)，用於直接轉形50至100 μl之大腸桿菌株系BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL化學型勝任細胞。在含有最終濃度為30 μg/ml之康黴素之Luria-Bertani瓊脂板上塗佈後得到所產生之轉形體群落，藉由使用標準T7發動子及T7終止子寡核苷酸引子，分析所選拔質體之兩個方向上之序列，以篩選正確之構築體。
突變。使用QuikChange多定點誘變套組(Stratagene,La Jolla,CA)進行定點誘變，來產製△31-N38Q-D95E-GDNF及△31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF。該方法使用嵌入pET-30a(+)作為模板之△31-N38Q-GDNF，及分別作為正向及反向引子之△31-N38Q-D95E-for及△31-N38Q-D95E-rev寡核苷酸(表1，SEQ ID NOs：41及42)。接著，使用嵌入pET-30a(+)之成功突變之△31-N38Q-D95E基因作為模板，及使用△31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-for及△31- K84A-R88K-R90K-D95E-D95E-rev寡核苷酸(表1，SEQ ID編號：43及44)分別作為正向及反向引子，以製得△31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF。證實DNA序列，及將質體轉形至大腸桿菌株系BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL化學型勝任細胞。
蛋白質表現。在37℃下，使用大腸桿菌細胞BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL承載質體pET-30a(+)/GDNFv之永久冷凍原液接種50 ml含最終濃度為30 μg/ml之康黴素之2×TY培養液。9 h後，於37℃下，取5 ml菌種培養物接種6×2升之該相同液體培養基。在培養物於600 nm下之光密度達到0.8至1.4之間時(通常在16 h後)，添加IPTG至最終濃度達到1 mM且使該培養物之溫度降至27至30℃之間維持5 h。於4℃下，以10,000 g離心20分鐘收穫細胞，並儲存於-80℃。
溶解-再折疊。將細胞糊狀物懸浮於2至3倍體積之含0.2 mg/ml溶菌酶、5 mM MgCl2及50 mM Tris-Cl(pH 8)之溶液中，且在攪拌下，於冰上培養30分鐘。所得漿液於冰上進行音波處理10分鐘(5秒脈衝，時間間隔2秒，振幅30至40%)。此後，由細胞溶胞物於20,000 g下離心20分鐘，分離回收呈包涵體之GDNFv，並溶解於4 M胍、90 mM半胱胺酸、20 mM Tris-Cl(pH 8.5)中。蛋白質經過0.2 M胍、2 M尿素、20 mM Tris-Cl(pH 8.75)進行10×稀釋，使其再折叠成活性形式。將再折叠混合物保持於4℃下2天。
純化。藉由3-步驟管柱層析法純化該再折叠之GDNFv至 均質性：1.陽離子交換層析(CEX)，SP管柱2.疏水性交互作用層析(HIC)，苯基管柱3.尺寸排除層析(SEC)，Superdex-75管柱。
首先將回復活性之蛋白質施加至於20 mM乙酸鈉(pH 5)中平衡之SP瓊脂糖凝膠快流管柱中。以含於20 mM乙酸鈉(pH 5)中之自0.3至1 M NaCl之線性遞增鹽梯度溶離GDNFv。在收集之CEX主溶出液中補充NaCl至最終濃度達到2.5 M，然後施加至含在20 mM檸檬酸鈉(pH 5)中之苯基瓊脂糖凝膠HP疏水性交互作用層析管柱上。HIC管柱係使用含在20 mM檸檬酸鈉(pH 5)中之自2.5至0 M NaCl之線性遞減鹽梯度溶離。GDNFv緊密結合至HIC管柱。所收集之HIC主溶出液隨後經過濃縮且最終施加至Superdex-75管柱，然後利用PBS(pH 7.4)溶離蛋白質。取最後收集之溶出液濃縮，通過0.22微米薄膜過濾並儲存於-80℃。
b. GDNFv在哺乳動物細胞中之表現及純化
編碼GDNF變異體之基因可採用標準分子生物技藝或在CMV發動子驅動之哺乳動物表現載體中進行基因合成而製得。採用重組質體過渡轉染人胚胎腎臟293EBNA(HEK293)細胞，及在5天後收集該培養基。於另一方法中，產製穩定之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系來表現GDNF變異體。依據製造商使用說明，次選殖編碼變異體蛋白質之基因至讀碼框內具有前結構域之天然GDNF信號序列之含麩醯胺酸合成酶(GS)表現質體骨架(基於pEE12.4之質 體，英國Lonza Biologics,Slough)中。由基於pEE12.4之載體中之全長GDNF構築體(SEQ ID NO：2)在CHO中轉染，且產生GDNF之截短形式，其中△31為前結構域形式且可自混合物中純化。當移除前結構域及第一段N-端31個胺基酸時，接著可有效產生△31-N-端截短型GDNF變異體且乾淨地出現在哺乳動物表現系統中，無需自先前所報導之全長及截短型產物之混合物中純化。天然GDNF分泌信號肽亦可改用包括鼠科前導分泌信號肽或人類生長激素分泌信號肽之若干分泌信號肽置換。仍可有效產生該△31-N-端截短型GDNF變異體，且乾淨地包含所有所揭示之分泌信號肽，但包含各種不同表現程度。次選殖含有所需突變之GDNF變異體至讀碼框內具有鼠科信號序列之適宜表現載體(諸如pEMK-NF2,Lonza)中。
純化。藉由4-步驟珠粒層析法純化GDNFv至均質性：1.陽離子交換層析(CEX)，SP管柱2.疏水性交互作用層析(HIC)，苯基管柱3.陽離子交換層析(CEX)，多模式Capto MMC管柱4.尺寸排除層析(SEC)，Superdex-75管柱。
簡言之，先施加所收穫之含GDNF變異體蛋白質之培養基至經過20 mM乙酸鈉(pH 5)平衡之SP瓊脂糖凝膠快流管柱上。利用含在20 mM乙酸鈉(pH 5)中之自0至1 M NaCl之線性鹽梯度溶離GDNFv。在所收集CEX主溶出液中補充NaCl至最終濃度為2.5 M，然後施加至含在20 mM乙酸鈉(pH 5)中之苯基瓊脂糖凝膠HP疏水性交互作用層析管柱 上。利用含在20 mM乙酸鈉(pH 5)中之自2.5至0 M NaCl之逆相線性鹽梯度溶離該HIC管柱。GDNFv係弱結合至HIC管柱。收集流過管柱之前段溶出液施加至pH 5下Capto MMC管柱之多模式樹脂上。利用50 mM Tris-Cl(pH 8)洗滌該管柱，然後利用含在50 mM Tris-Cl(pH 8)中之自0至1 M NaCl之線性鹽梯度溶離GDNFv。最終將Capto MMC主溶出流施加至Superdex-75管柱，且利用PBS(pH 7.4)溶離蛋白質。收集最終溶出液通過0.22微米薄膜過濾，並儲存於2至8℃。
免疫原性潛力之Epivax分析
製造降低與HLA-DR之結合概率之選拔人類GDNF變異體(SEQ ID NO：12及15)並利用GFRα及肝素結合試驗法，與 野生型GDNF進行比較。
實例2
GDNF野生型及△31 GDNF變異體之穩定性
可採用許多分析技術(諸如RP-HPLC、SE-HPLC、陽離子交換HPLC及質譜分析)評估全長成熟GDNF野生型及△31-N-端截短型GDNF變異體之穩定性，來判定該等分子中之任何降解部位。然後進行突變，移除化學降解部位，來改善人類GDNF變異體之穩定性。
分析級逆相層析法(RP-HPLC)。Zorbax C8 SB-300Å,3.5微米，4.6×50 mm管柱(Agilent Technologies # 865973-909)於60℃下加熱。流動相為在0.1% TFA之水溶液。依1 ml/分流速維持35分鐘下，以自5至50%之線性乙腈梯度進行30分鐘，在214 nm處出現滯留時間為19至20分鐘之單峰，為GDNFv之溶出液。
分析級尺寸排除層析法(SEC-HPLC)。TSK-G-2000-SW-XL,5微米，7.8×300 mm管柱(TOSOH BIOSEP #08540)。流動相：PBS+350 mM NaCl,pH 7.4，流速為0.5 ml/分維持35分鐘。在214 nm處出現滯留時間為~16至17分鐘之單峰，為GDNFv之溶出液。
分析級陽離子交換層析法(CEX-HPLC)。Dionex,Propac WCX-10,4×250 mm管柱(Dionex #054993)。流動相為20 mM磷酸鈉、10%乙腈，pH 7。依1 ml/分流速維持52分鐘下，以自0.15至0.6 M NaCl之線性鹽梯度溶離45分鐘，在滯留時間為25至30分鐘時出現複合峰，為GDNFv之溶出 液。
野生型(全長細菌GDNF)對野生型CHO GDNFv(N-端△31截短型GDNF)之化學穩定性分析(LC-MS)。
於37℃之逆境壓力下維持4週，比較野生型(全長細菌GDNF)與野生型CHO GDNFv(N-端△31截短型GDNF)，以判定可能與化學不穩定性有關之胺基酸。
樣本
1-WT大腸桿菌全長GDNF，於4℃維持4週，1.0 mg/mL 2-WT大腸桿菌全長GDNF，於37℃維持4週，1.0 mg/mL 3-WT CHO △31-GDNFv，於4℃維持4週，1.0 mg/mL 4-WT CHO △31-GDNFv，於37℃維持4週，1.0 mg/mL
完整分子及部分分子之分析。在環境溫度下，各樣本取10 μL等分試樣(該溶液係與20 μL水或各溶液之10 μL等分試樣混合)與40 μL 100 mM tris-HCl緩衝劑(pH 8)、1.0 μL 50 mg/mL DTT混合30分鐘。提交各樣本用於LC/MS分析。
Lys-C消解法。在高速真空系統下，各樣本溶液取20 μL等分試樣冷凍乾燥，然後將該物質於0.5 μL 50 mg/mL DTT及4.5 μL 6 M胍-HCl、0.5 M tris-HCl緩衝液(pH 8)中重新組合。於37℃下培養該混合物30分鐘，然後使用93 μL水稀釋各溶液，且於37℃下以2 μL 0.2 mg/mL Lys-C(Wako)處理2小時。對於CHO GDNFv，於37℃下以0.5 μL PNGase F處理30 μL胰蛋白酶消解物1小時(供評估碳水化合物形態)。在LC/MS分析之前，利用2 μL 10% TFA水溶液酸化該消解物。
LC/MS分析。依據偶聯Waters Acquity UPLC之Waters SYNAPT質譜儀或偶聯Waters 2795 HPLC之Water LCT Premier質譜儀分析該等樣本溶液。
由上而下分析法。藉由LC-MS分析法獲得野生型GDNF之裂解產物，用於分析部分還原之GDNF。判定多重裂解產物，該等裂解產物之定量數據示於表2。若干裂解法(在N15/R16、N22/P23、N25/S26及N38/R39之間裂解)具有類似透過形成琥珀醯亞胺之脫醯胺作用的降解路徑。對於野生型CHO △31-GDNFv，自N-端裂解第一段31個胺基酸殘基。儘管CHO GDNFv之每條鏈具有2個可能之N-醣基化部位，但只有1個部位為N-醣基化。所觀察到主要聚糖為具有不同半乳糖苷化之二-或三-觸角寡糖。令人感興趣地，未偵測到顯著唾液酸化之聚糖。
(表3)
由下而上分析法(肽圖譜分析)。還原之GDNF之穩定性樣本之Lys-C消解物之UV層析圖顯示，除了GDNF肽126至129以外，偵測到所有該等預期之肽。對於CHO物質，未偵測到N-端肽(位於R32之前)。含N49之肽38至60經醣基化且佔據95%以上之Asn49。含N85之肽85至96未發生醣基化。該等結果符合針對還原之GDNF樣本之LC/MS分析。
總言之，野生型及CHO物質兩者之均二聚體為主要組份。先溶離出之主要組份為單體。根據質譜分析法分析，GDNF Cys41與該單體之游離Cys殘基形成二硫鍵。單體峰之相對百分比極低，且依據紫外線分析，CHO中佔<1%及 野生型中佔<0.5%。對於逆境壓力下之物質，單體含量未變化。
亦自該肽之圖譜獲得諸如氧化、脫醯胺及異構化之降解產物。結果示於表4中。獲自大腸桿菌之野生型全長GDNF含有2個Met殘基(M(-1)及M6)，且該等部位之氧化相當較低。GDNF不含任何Trp殘基。GDNF具有8個適用於全長單體之Asp殘基。該等主要脫醯胺化部位為N25及N38。由於在較高pH緩衝液下較快速發生脫醯胺作用，因此在pH 5或6緩衝液之逆境壓力下時，該等部位之相對百分比應該低。判定出一種異構體肽85至96，然而，仍未了解其係Asp異構化而形成Iso-Asp或係胺基酸殘基之消旋化所致。習知高pH逆境壓力一般造成消旋化，而低pH逆境壓力則造成Asp異構化。對於野生型全長GDNF，若干肽之對照組(4℃)及逆境壓力組(37℃)樣本顯示兩者之間出現質量差異。彼等最有可能在大腸桿菌生物合成期間發生錯誤引進。
該等數據顯示，CHO細胞中產生之△31-N-端截短型GDNF變異體因缺失含有顯著氧化及脫醯胺化熱點之第一段31個胺基酸殘基，因此當在37℃逆境壓力4週時，具有比大腸桿菌所製得全長野生型成熟人類GDNF改善之化學穩定性。此外，如表5中所示，相較於突變之前之全長野生型大腸桿菌GDNF或△31-N-端截短型GDNF變異體中之任何一者，觀察到2種突變之△31-N-端截短型GDNF變異體(分別為N38Q及D95E)之生物物理及生物化學特性在突變後顯著改善。
實例3
活體外結合活性
以下分析顯示人類GDNF之某些變異體減少肝素結合性，同時維持GFRα1受體結合性，從而提供各種不同肝素及受體之結合特徵。
‧GDNFv針對生物傳感器(Biacore)上GFR之結合動力學
可在大腸桿菌(細菌)或哺乳動物細胞(CHO細胞或HEK293 EBNA細胞)中表現GDNF變異體(GDNFv：N-端-△31-截短型)且如實例1中所述純化。不論使用何種表現系統，該等變體之一級序列保持相同。
Biacore®2000生物傳感器係用於測量GDNFv對人類及大鼠GDNF家族受體(GFRα1及GFRα2)之結合動力學。於25℃下進行測量。將樣本溶於HBS-EP緩衝液(150 mM氯化鈉、3 mM EDTA，0.005%(重量/體積)表面活性劑P-20,pH 7.4)中。採用胺偶聯化學反應，以~200個反應單位(RU)程度，將蛋白質A(金黃素葡萄球菌(Staphylococcus aureus))固定於CM4感測器晶片(GE Healthcare #BR-1005-39)之流路1至4上，來捕捉GFR Fc嵌合體(重組人類GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc嵌合體；重組人類GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc嵌合體；重組大鼠GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc嵌合體；重組小鼠GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc嵌合體)。
利用多次循環評估結合性。每次循環均由以下步驟組成：1)注入約10 μL之濃度為~1.0 μg/mL及流速為10 μL/分之GFR，旨在捕捉120至150個RU；2)以流速50 μL/分注入 250 μL之最終濃度範圍介於10 nM與0.04 nM之間之GDNFv，接著進行20分鐘解離；及3)使用約30 μL 10 mM甘胺酸鹽酸鹽(pH 1.5)再生。使用BIA評估軟體(第4.1版)中「1：1(Langmuir)結合性」模式評估每次循環之締合及離解速率。
結果示於下表6至8中。
‧使用ELISA分析人類GDNF變異體與GFRα1之結合性
在ELISA試驗中測試GDNF野生型及變異體，其中測得GDNF蛋白質與血小板結合受體(GFRα1)之結合性。採用「不含GDNF」條件及/或「非相關蛋白質」條件作為陰性對照組。
利用70 μl含在碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中之1 μg/ml人類GFRα1(重組人類GFRα1-Fc嵌合體，無載體)塗佈96-孔板(Greiner 655081免疫結合ELISA板)之各孔。假若塗佈非相關受體，則其為非相關Fc嵌合體且依GFRα1之相同濃度進行塗佈。將該等板密封及於4℃下培養過夜。吸清該等孔，繼而使用自動洗板機藉由洗滌緩衝液(20 mM參(羥甲基)胺基甲胺(pH 7.4)，0.15 M NaCl，0.1%吐溫(Tween)-20)洗滌2次。於室溫下，依每孔200 μl阻斷緩衝液(含於上述洗滌緩衝液中之3%三花(Carnation)即溶奶粉)阻斷該等板至少1小時。利用洗滌緩衝液洗滌該等板2次。
GDNF蛋白質經過連續稀釋成適宜濃度範圍之阻斷緩衝液，通常始於5 μg/ml，然後連續稀釋1：10。使用僅由阻斷緩衝液組成之「不含GDNF」為對照組。以三重複方 式，取50 μl各GDNF溶液添加至經GFRα1塗佈之孔中。該等板於室溫下培養1.5小時。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。
取50 μl已在阻斷緩衝液中稀釋至濃度1 μg/ml之生物素化抗人類GDNF抗體(R&D Systems，生物素化山羊抗人類GDNF多株抗體，目錄編號(#)BAF212)之等分試樣添加至各孔且於室溫下培養45分鐘。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。
取50 μl已在阻斷緩衝液中稀釋1：1000之辣根過氧化物酶共軛鏈黴抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch，目錄編號016-030-084)之等分試樣添加至各孔且於室溫下培養20至30分鐘。或者，可使用1：2000稀釋液，培養時間為30至90分鐘。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。將50 μl發色基質(即，OPD基質)添加至各孔，且於室溫下顯色2至3分鐘。藉由將100 μl 1 N HCl添加至各孔停止反應。於Molecular Devices SpectraMax250讀板器上，在490 nm下讀取該等孔之吸光度。針對各條件重複3次，測定孔之平均吸光度，然後利用Graph Pad Prism軟體處理所得數值，計算EC 50，可信範圍為95%。該等範圍概述於下表9。
‧使用ELISA分析人類GDNF變異體與肝素之結合性
在ELISA試驗中測試GDNF野生型及變異體，其中測定GDNF蛋白質與結合在分析板上之肝素之結合性。採用「不含GDNF」條件作為陰性對照組。
利用70 μl含在PBS中之5 μg/ml肝素(獲自Sigma之混合分 子量肝素，源自豬腸黏膜之肝素鈉鹽，目錄編號H-3149)塗佈96-孔肝素結合板(BD生物科學肝素結合板(BD Bioscience Heparin Binding Plates)，目錄編號354676)之各孔。將該等板密封及於室溫下培養過夜(避免光照)。吸清該等孔，繼而使用自動洗板機藉由洗滌緩衝液洗滌3次。於37℃下，以每孔200 μl阻斷緩衝液阻斷該等板90至120分鐘(於此培養期間密封該等板)。利用洗滌緩衝液洗滌該等板2次。
GDNF蛋白質經過連續稀釋成適宜濃度範圍之阻斷緩衝液，通常始於5 μg/ml，然後連續稀釋1：10。使用僅由阻斷緩衝劑組成之「不含GDNF」為對照組。以三次重複方式取50 μl各GDNF溶液之等分試樣添加至經肝素塗佈之孔中。於室溫下培養該等板1.5至2小時。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。
取50 μl已在阻斷緩衝液中稀釋至濃度1 μg/ml之生物素化抗人類GDNF抗體之等分試樣添加至各孔且於室溫下培養45分鐘至1小時。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。
取50 μl在阻斷緩衝液中稀釋1：1000之辣根過氧化物酶共軛鏈黴抗生物素蛋白之等分試樣添加至各孔且於室溫下培養20至30分鐘。或者，可使用1：2000稀釋液，培養時間為30至90分鐘。然後利用洗滌緩衝液洗滌該等孔3次。取50 μl發色基質(即，OPD基質)之等分試樣添加至各孔且於室溫下顯色2至3分鐘。藉由將100 μl 1N HCl添加至各孔停止反應。於讀板器上在490 nm讀取該等孔之吸光度。在 各條件下重複3次，測定孔之平均吸光度，然後利用Graph Pad Prism軟體處理所得數值，計算EC 50，可信範圍為95%。該等範圍概述於下表9。
該等數據顯示自野生型GDNF(稱為「WT大腸桿菌GDNF」)刪去N-端31個胺基酸(稱為「CHO △31 GDNF」之變異體)可顯著減少肝素結合性(約10倍)，同時維持GFRα1受體結合性，及該等數據進一步顯示，可藉由人類GDNF之其他變異體達成多種不同肝素與受體之結合特徵。
實例4
活體外活性
‧NS-1神經突增生實驗
使用大鼠Neuroscreen-1細胞(PC12次選殖體)評估GDNF對神經元分化之活性。於37℃，95%濕度下，將該等細胞保持於經膠原蛋白塗佈之燒瓶中之F-12K基礎培養基、12.5%熱滅活馬血清、2.5%熱滅活胎牛血清(FBS)、1×GlutaMAXTM(Invitrogen，目錄編號35050061)及1×抗性抗體(Anti-anti)(Invitrogen，目錄編號15240)。為了量測神經突增生，僅使用內部60個孔，依2200個細胞/孔，將該等Neuroscreen-1細胞接種於膠原蛋白I 96-孔板中之生長培養基中。在細胞黏附24小時後，移除該培養基，將含有1 μg/ml之GFRα1-Fc加上GDNF之新生長培養基稀釋成8個點之連續稀釋液後，添加至該板之三次重複試驗孔或每種濃度之6個孔中。分析細胞反應時，包括基質加上1 μg/ml GFRα1-Fc作為陰性對照組，及包括基質加上25 ng/ml神經突生長因子作為陽性對照組。於37℃，95%濕度下培養該等板96小時，然後藉由將45 μl固定液添加至各孔並於室溫下培養1小時固定。利用獲自神經突增生染色套組TM(Neurite Outgrowth Hit KitTM)(Cellomics，目錄編號K07-0001-1)之1×洗滌緩衝液洗滌該等板2次，然後利用獲自該套組之1×緩衝液洗滌2次。依據製造商使用說明，利用獲自該套組之神經突生長試劑對該等細胞進行免疫染色。將該等板裝載至Arrayscan儀器上，且利用獲自Cellomics之Arrayscan軟體及神經元形態分析(Neuronal Profiling)演算法分析。利用Graph Pad Prism軟體處理由演算法獲得之數據，計算EC50。
測試多重變異體在神經元分化中之活性，且各變異體所觀察到之EC50列於表10A中。
此處所測試之所有GDNF樣本於神經突增生試驗中具有不同程度之活性。在所進行之2個實驗中，△31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E變異體之劑量曲線均未在最大劑量時出現平頂期，因此無法計算EC50。其他4種GDNF變異體之EC 50 95%可信區間出現重疊範圍，證實其在本試驗中具有類似活性程度。
‧C-Ret受體磷酸化
c-Ret受體磷酸化試驗法可用於證實在位置Y1016誘導cRet受體磷酸化。在已穩定轉染至過度表現人c-Ret之源自人類神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y(ATCC)之細胞中評估GDNF對c-Ret受體磷酸化之活性。將該等細胞維持於杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's modified Eagle medium) (DMEM)(10% FBS，3 μg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin))中。進行c-Ret磷酸化時，依5×105個/孔，將該等細胞接種於含生長培養基但不含殺稻瘟菌素之24-孔經膠原蛋白塗佈之板內，且進行黏附過夜。將該培養基換為低葡萄糖DMEM+0.25% BSA(胎牛血清白蛋白)維持24小時。排除該限制培養基，且於37℃下，利用不含葡萄糖DMEM、0.25% BSA、1μg/ml GFRα1-Fc之GDNF處理該等細胞30分鐘。於多種濃度下測試各GDNF變異體。排除處理培養基，然後自板表面刮取該等細胞加至冰冷溶胞緩衝液(SigmaTM)(M-Per萃取試劑+蛋白酶抑制劑混合液、磷酸酶抑制劑1、磷酸酶抑制劑混合液2及磷酸酶抑制劑混合液3)。將該等細胞懸浮液渦轉混合，以完全溶胞，以14,000×g離心形成細胞碎片集結粒，然後使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)(BCA)檢測試劑定量上清液蛋白質濃度。對於各GDNF溶胞產物，利用4至12% NuPAGE®Novex® Bis-Tris凝膠(Invitrogen，目錄編號NP0322)及PVDF轉印膜分離10 μg蛋白質。利用兔多株抗體及山羊抗兔HRP抗體偵測酪胺酸1016磷酸-Ret；然後利用小鼠單株抗體及山羊抗小鼠HRP抗體偵測c-Ret。藉由Supersignal West PicoTM(Thermo Scientific，目錄編號34081)試劑顯影墨點且於x-射線底片上曝光。
在不存有葡萄糖DMEM、0.25% BSA培養基+1 μg/ml GFRα1-Fc下，測試5種GDNF變異體(WT大腸桿菌GDNF、CHO △31 GDNF、CHO △31-N38Q-D95E GDNF、CHO △31- N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E GDNF及CHO △31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E GDNF)於0.8、2.0、4.0、10、20、50及100 ng/ml中4種濃度下之c-Ret磷酸化活性。亦測試單獨培養基、培養基+1 μg/ml GFRα1-Fc及培養基+100 ng/ml CHO △31 GDNF作為陰性對照組。5種GDNF變異體分別誘導c-Ret磷酸化，且EC 50為8至15 ng/ml。該等數據顯示所有5種GDNF變異體均隨劑量變化之方式，誘導Y1016處之c-Ret磷酸化。
如表10B中所概述，在生物物理及生物化學特性上出現顯著改善(表5、6、9及10A)之該等工程化△31-N-端截短型GDNF變異體維持最優化生物特性，例如，於37℃下培養4週之後，具有類似之GFRα1受體結合性，減少肝素結合性，及類似之神經突增生。
實例5
DA代謝試驗中之GDNF變異體活性
使用異氟烷(3%，含在O2中)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。頭部剃毛，利用碘溶液消毒後，將動物置於具有控溫墊之立體固定架上。以眼用凝膠保護眼及使用異氟烷(1至2%含在O2中)維持麻醉。
切開動物頭部中線，露出頭皮及皮下組織，且吸乾顱部以便看到囪門。自囪門及硬腦膜表面測量尾狀核之座標，以供輸注GDNF。取28號輸注套管慢慢降至該位置，且在1分鐘後開始使用幫浦輸注。依0.5 μl/分，將2 μl試驗GDNF輸液以4分鐘時間注入左半球內，一旦在輸注停止時，該套管留在原位3分鐘。一旦移除該套管即立刻縫合該切開部位，投與手術後鎮痛藥，讓該動物於控溫籠中恢復後才轉移至家籠。根據區域倫理學守則對動物進行手術後檢查，在輸注後間隔一段適當時間，犧牲動物，取出腦部及精確切下尾狀核，稱重，然後冷凍，準備用於多巴胺及代謝產物之HPLC分析。
讓冷凍組織快速解凍，且在0.5 ml均質化緩衝液(0.1 M過氯酸(PCA)、0.1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2.5 mg/L抗壞血酸)中均質化後，以20,000 g離心15分鐘。移去上清液，然後通過無針筒過濾裝置過濾。使用偶聯電化學偵測之HPLC分析多巴胺(DA)、二羥基苯乙酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)。各樣本取20 μl等分試樣注入，且相對於外標準物校正曲線(美國BAS公司之LC4C)定量。移動相由100 mM NaH2PO4、100 mM H3PO4、2 mM OSA、1 mM EDTA、13%甲醇(MeOH)組成，pH 2.8，使用Hypersil BDS(經鹼滅活矽石(Base Deactivated Silica))(Thermo Scientific，目錄編號28105)150×3.0 mm C18 3 μ微粒管柱，40℃。使用Empower層析軟體收集數據。所有數據進行4-參數邏輯擬合，然後以ng/g濕重組織表示。將多巴胺代謝測量值以(DOPAC+HVA)/DA表示，並比較左半球(處理組)與右半球(未處理組)。
數據顯示相較於為處理之半球，表11中所提及之GDNF變異體分別顯著提高經處理之半球之多巴胺代謝。
實例6
活體內試驗
‧6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘發之退化病灶模式
使用異氟烷(3%，含在O2中)麻醉雄性Sprague-Dawley大 鼠。頭部剃毛，利用碘溶液消毒後，將動物置於具有控溫墊之立體固定架上。以眼用凝膠保護眼，及使用異氟烷(1至2%，含在O2中)維持麻醉。
切開動物頭部中線，露出頭皮及皮下組織，且吸乾顱部，以便看到囪門。自囪門及硬腦膜表面測量尾狀核之座標，以供輸注10 ug 6-羥基多巴胺(6-OHDA)。將28號輸注套管慢慢降至該位置且在1分鐘後開始輸注。將2 μl 6-OHDA輸液依0.5 μl/分，以4分鐘時間注入左半球內，及在輸注停止時，該套管留在原位3分鐘。
在輸注6-OHDA 30分鐘後，利用相同過程注入測試GDNF。輸注GDNF之座標為如前述之距離囪門及硬腦膜表面之前部-後部+1.0，LM-2.5，DV-4.5 mm。
一旦移除該套管即立刻縫合該切開部位，投與手術後鎮痛藥，讓動物於控溫籠中恢復後，再轉移至家籠中。根據區域倫理學守則對動物進行手術後檢查，在輸注後間隔一段適當時間，犧牲動物，取出腦部及精確切下尾狀核及黑質，稱重然後冷凍，準備用於多巴胺及代謝產物之HPLC分析。
將冷凍組織快速解凍，且在0.5 ml均質化緩衝液(0.1 M PCA、0.1 mM EDTA、2.5 mg/L抗壞血酸)中均質化後，以20,000 g離心15分鐘。移除上清液，然後藉由無針筒過濾裝置過濾。使用偶聯電化學偵測之HPLC分析多巴胺(DA)、DOPAC及HVA。取20 μl各樣本之等分試樣注入，且相對於外標準物校正曲線定量。移動相由100 mM NaH2PO4、100 mM H3PO4、2 mM OSA、1mM EDTA、13%甲醇(MeOH)組成，pH 2.8，使用BDS Hypersil 150×3.0 mm C18 3 μ微粒管柱，40℃。使用Empower層析軟體收集數據。所有數據進行4-參數邏輯擬合後，以ng/g濕重組織表示。比較左半球(處理組)與右半球(未處理組)。
將6-OHDA投與尾狀核內，處理組半球中多巴胺含量比未處理組半球顯著減少(表12)。亦在黑質中觀察到明顯缺損(表13)，此點可藉由投與GDNF防止。相較於處理組半球，此處所測試GDNF之所有變異體明顯不同於媒劑。
‧大鼠腦中之急性生物分佈
使用異氟烷(3%，含在O2中)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。頭部剃毛，利用碘溶液消毒後，將動物置於具有控溫墊之立體固定架上。以眼用凝膠保護眼及使用異氟烷(1至2%，含在O2中)維持麻醉。
切開動物頭部中線，露出頭皮及皮下組織，且吸乾顱 部，以便看到囪門。自囪門及硬腦膜表面測量尾狀核之座標，以供輸注GDNF(前部-後部+0.5，側中部-3.0，背腹部-5.5 mm)。將30號輸注套管慢慢降至該位置，且在1分鐘後開始輸注(使用幫浦)。取2 μl試驗GDNF輸液，以0.5 μl/分，以4分鐘時間注入左半球內，及在輸注停止時，該套管留在原位3分鐘。一旦移除該套管，即立刻縫合該切口，投與手術後鎮痛藥，然後，讓動物於控溫籠中恢復。在輸注後一段適當時間，犧牲動物，然後取出腦部冷凍，準備用於免疫組織化學之冷凍切片。
‧大鼠腦中之GDNF免疫組織化學(IHC)
於免疫組織化學試驗中測試所輸注GDNF之生物分佈，其中在大鼠腦中測定該抗體對所輸注抗原(GDNF及GDNF變異體)之結合性。採用同型物對照抗體作為陰性對照組。
冷凍大鼠腦之冷凍切片法係由修整小腦開始，同時在-20℃之冷凍切片機中，使用大鼠腦基質製作扁平表面。將Optimal Cutting TemperatureTM(OCT，Sakura或其他類似供應商)置於低溫冷凍切片機樣本夾上。當OCT開始冷凍時，使用經-20℃冷卻之鑷子，將大鼠腦之該扁平尾狀表面置於樣本夾上，因此該OCT可原位固定該腦，讓腦之最外緣背對該樣本夾。將該樣本夾置於物體固定架上並夾緊。在切片刀插入刀夾之後，利用該冷凍切片機之修整功能來去除輸注路徑最外緣之嗅球及大腦。依300 μm間隔取得8 μm厚之切片，且置於帶正電之載玻片上。
將每一個鼠腦之2或3片相鄰切片置於載玻片上。然後將該等載玻片置於室溫之4%多聚甲醛中保持20分鐘，接著利用tris-緩衝生理食鹽水Tween-20(TBST)洗滌緩衝液沖洗。在室溫下使用染色溶液，與雙重內源性酶阻斷劑培養該等載玻片10分鐘，利用TBST洗滌緩衝液沖洗，分別與抗生物素蛋白(Avidin)及生物素阻斷劑培養15分鐘，藉由TBST洗滌緩衝液洗滌，利用蛋白質阻斷劑阻斷60分鐘，然後使用空氣刀噴載玻片。以具有背景還原劑之抗體稀釋劑稀釋生物素化抗人類GDNF或生物素化山羊IgG至2 μg/ml，繼而在載玻片上培養60分鐘，然後利用TBST洗滌緩衝液沖洗3次。利用經標記之鏈黴抗生物素蛋白生物素2(LSAB2)(Dako，目錄編號K0609)培養該等載玻片10分鐘，繼而利用TBST洗滌緩衝液沖洗。該等載玻片與DAB+(2滴含在DAB稀釋劑中之DAB)培養5分鐘，然後利用TBST洗滌緩衝液沖洗，接著利用蒸餾水沖洗。從自動染色機移出載玻片之後，利用HematoxylinTM復染，且使用Cytoseal XYLTM(Stephens Scientific，目錄編號8312-4)覆蓋蓋玻片。使該等載玻片乾燥，然後使用Aperio XT分析，以定量生物分佈。
‧GDNF於大鼠腦中生物分佈之定量法
於Aperio ScanScope XT(採用控制器軟體之v10.00.00.1805運轉)上，以20×放大率設定值獲得載玻片之影像。將該等載玻片之相關元數據儲存於Aperio之web-based軟體，Spectrum(v10.0.1346.1806)。
每個腦切片均使用Aperio影像觀測儀軟體，ImageScope(v10.0.36.1805)手動分析輪廓。第一次試驗中，分析具有最少量可見切片假象之全腦切片之輪廓。第二次試驗中，則分析最接近載玻片標記之全腦切片之輪廓。使用Aperio「正像素計數」演算法(v9)[且所有該等參數維持在其預設值，但其中改為影像放大=0.01及強度臨限值WEAK(上限)=235]分析各輪廓區域。
由來自正像素演算法之正像素及強正像素面積輸出總和計算各大鼠之GDNF分佈面積(單位為mm2)。採用配對史都登氏(Student's)t-試驗法判定統計學有效性。
肝素結合性之相關ELISA資料(表9)證實，相較於大腸桿菌-WT GDNF，野生型GDNF之改性可減少肝素結合。該 等數據連同以上在表14中所示之生物分佈數據證實，減少肝素結合之變異體可增加大鼠腦中生物分佈。列於上表中之N38Q-D95E及N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E變異體具有比大腸桿菌-WT-GDNF增加之生物分佈。
本發明之該等新穎GDNF變異體較佳係調配成可依多種途徑投與之醫藥組合物。最佳地，該等GDNF變異體適於非經腸式或經顱內投與。該等醫藥組合物及其製程係相關技藝習知。參見，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人，編輯，第19版，Mack Publishing Co.,1995年)。
治療有效量為對患者賦予療效時所需之本發明該等新穎GDNF變異體的用量。應明瞭，GDNF變異體的實際投與量應由醫師根據相關情況判定，包括待治療之病況，投藥途徑之選擇，投與之實際活性劑，個別患者之年齡、體重及反應，及患者症狀之嚴重度。
序列表
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GGTGCTCGAGTTATTAAATGCAGCCGCAACGTTTCGCGCT
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MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKQRGC VLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI
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<SEQ ID NO：24；PRT1；人工序列>
MKLWDVVAVCLVLLHTASARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI其中：i)Xaa84為K或A；ii)Xaa88為R或K；iii)Xaa90為R或K；iv)Xaa125為K或E；及v)Xaa130為R或E。
<SEQ ID NO：25；PRT1；家鼠>
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
<SEQ ID NO：26；DNA；家鼠>
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCTACCGGT
<SEQ ID NO：27；DNA；人工序列>
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCTACCGGTAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCT GCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
<SEQ ID NO：28；PRT1；人工序列>
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
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<SEQ ID NO：30；PRT1；人工序列>
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<SEQ ID NO：31；PRT1；人工序列>
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI其中：i)Xaa84為K或A；ii)Xaa88為R或K；iii)Xaa90為R或K；iv)Xaa125為K或E；及v)Xaa130為R或E。
<SEQ ID NO：32；PRT1；現代人>
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
<SEQ ID NO：33；DNA；現代人>
ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCC
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ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCCAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCG AGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
<SEQ ID NO：35；PRT1；人工序列>
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
<SEQ ID NO：36；DNA；人工序列>
ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCCAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
<SEQ ID NO：37；PRT1；人工序列>
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANL SKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
<SEQ ID NO：38；PRT1；人工序列>
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI其中：i)Xaa84為K或A；ii)Xaa88為R或K；iii)Xaa90為R或K；iv)Xaa125為K或E；及v)Xaa130為R或E。
<SEQ ID NO：39；DNA；引子>
TATACATATGCGTGGACAACGTGGTAAACAACGTGGTTGTGTGCTG
<SEQ ID NO：40；DNA；引子>
GGTGCTCGAGTTATTAAATGCAGCCGCAACGTTTCGCGCT
<SEQ ID NO：41；DNA；引子>
GTCTGGTGAGCGAGAAAGTGGGTCAG
<SEQ ID NO：42；DNA；引子>
CTGACCCACTTTCTCGCTCACCAGAC
<SEQ ID NO：43；DNA；引子>
CCTATGATAAAATCCTGGCAAACCTGAGCAAGAACAAAC GTCTGGTGAGCGAGAAAG
<SEQ ID NO：44；DNA；引子>
CTTTCTCGCTCACCAGACGTTTGTTCTTGCTCAGGTTTGCCAGGATTTTATCATAGG
SEQ ID NO：1：AA-人類GDNF野生型全長
SEQ ID NO：2：DNA-人類GDNF野生型全長
SEQ ID NO：3：AA-人類成熟野生型GDNF
SEQ ID NO：4：AA-人類GDNF天然分泌信號肽
SEQ ID NO：5：AA-人類GDNF前結構域
SEQ ID NO：6：DNA-△31-正向引子
SEQ ID NO：7：DNA-△31-反向引子
SEQ ID NO：8：AA-突變體1：δ-31 GDNF
SEQ ID NO：9：AA-GDNF變異體2：△31+N38Q+D95E(選殖體D9)蛋白質(103aa)
SEQ ID NO：10：DNA構築體序列-GDNF變異體2：△31+N38Q+D95E(選殖體D9)DNA(pEE12.4)
SEQ ID NO：11：AA-GDNF變異體2：△31+N38Q+D95E(選殖體D9)蛋白質構築體(211aa)。
SEQ ID NO：12：AA-GDNF變異體3：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(選殖體F2.1)蛋白質序列(103aa)
SEQ ID NO：13：DNA構築體序列-GDNF變異體3：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(clone F2.1)DNA序列
SEQ ID NO：14：AA-GDNF變異體3：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(選殖體F2.1)蛋白質構築體(211aa)
SEQ ID NO：15：AA-GDNF變異體4：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E+K125E+R130E(選殖體4.3)蛋白質序列(103aa)：SEQ ID NO：16：DNA構築體序列-GDNF變異體4：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E+K125E+R130E(選殖體4.3)DNA序列
SEQ ID NO：17：AA-GDNF變異體4：△31+N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E+K125E+R130E(選殖體4.3)蛋白質構築體
SEQ ID NO：18：DNA-人類GDNF天然分泌信號肽
SEQ ID NO：19：DNA-天然肽-△-31 N38Q+D95E構築體
SEQ ID NO：20：AA-天然肽-△-31 N38Q+D95E(122aa)：SEQ ID NO：21：DNA-天然肽-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E
SEQ ID NO：22：AA-天然肽-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(122aa)：SEQ ID NO：23：AA-變異體之共同序列
SEQ ID NO：24：AA-天然肽-變異體之共同序列
SEQ ID NO：25：AA-鼠科前導分泌信號肽(MKL)
SEQ ID NO：26：DNA-鼠科前導分泌信號肽(MKL)
SEQ ID NO：27：DNA-MKL-△-31 N38Q+D95E構築體
SEQ ID NO：28：AA-MKL-△-31 N38Q+D95E(123aa)：SEQ ID NO：29：DNA-MKL-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E構築體
SEQ ID NO：30：AA-MKL-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(123aa)：SEQ ID NO：31：AA-鼠科前導序列-變異體之共同序列
SEQ ID NO：32：AA-人類生長激素分泌信號肽(hGH)
SEQ ID NO：33：DNA-人類生長激素分泌信號肽(hGH)
SEQ ID NO：34：DNA-hGH-△-31 N38Q+D95E構築體
SEQ ID NO：35：AA-hGH-△-31 N38Q+D95E(129aa)：SEQ ID NO：36：DNA-hGH-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E構築體
SEQ ID NO：37：AA-hGH-△-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E(123aa)：SEQ ID NO：38：AA-hGH-變異體之共同序列
SEQ ID NO：39：DNA-△31-N38Q-正向引子
SEQ ID NO：40：DNA-△31-N38Q-反向引子
SEQ ID NO：41：DNA-△31-N38Q-D95E-正向引子
SEQ ID NO：42：DNA-△31-N38Q-D95E-反向引子
SEQ ID NO：43：DNA-△31-N38Q-KAKKE-正向引子
SEQ ID NO：44：DNA-△31-N38Q-KAKKE-反向引子
<110> 美國禮來大藥廠<120> 人類GDNF之變異體<130> X19073 <140> 101110653 <141> 2012/03/27 <150> 61/474,024 <151> 2011/04/11 <160> 44 <170> 專利案第3.5版<210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> 現代人<400> 1 <210> 2 <211> 633 <212> DNA <213> 現代人<400> 2 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> 現代人<400> 3 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> 現代人<400> 4 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> 現代人<400> 5 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 6 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 7 <210> 8 <211> 103 <212> PRT <213> 現代人<400> 8 <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 9 <210> 10 <211> 309 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 10 <210> 11 <211> 211 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 11 <210> 12 <211> 103 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 12 <210> 13 <211> 633 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 13 <210> 14 <211> 211 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體 <400> 14 <210> 15 <211> 103 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 15 <210> 16 <211> 633 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 16 <210> 17 <211> 211 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 17 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> 現代人<400> 18 <210> 19 <211> 366 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 19 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 20 <210> 21 <211> 366 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 21 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 22 <210> 23 <211> 103 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<220> <221> 其他特徵 <222> (53)..(53) <223> 位置53之處之Xaa為Lys或Ala <220> <221> 其他特徵 <222> (57)..(57) <223> 位置57之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (59)..(59) <223> 位置59之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (94)..(94) <223> 位置94之處之Xaa為Lys或Glu <220> <221> 其他特徵 <222> (99)..(99) <223> 位置99之處之Xaa為Arg或Glu <400> 23 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<220> <221> 其他特徵 <222> (72)..(72) <223> 位置72之處之Xaa為Lys或Ala <220> <221> 其他特徵 <222> (76)..(76) <223> 位置76之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (78)..(78) <223> 位置78之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (113)..(113) <223> 位置113之處之Xaa為Lys或Glu <220> <221> 其他特徵 <222> (118)..(118) <223> 位置118之處之Xaa為Arg或Glu <400> 24 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> 家鼠<400> 25 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> 家鼠<400> 26 <210> 27 <211> 369 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 27 <210> 28 <211> 123 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 28 <210> 29 <211> 369 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 29 <210> 30 <211> 123 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 30 <210> 31 <211> 123 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體 <220> <221> 其他特徵 <222> (73)..(73) <223> 位置73之處之Xaa為Lys或Ala <220> <221> 其他特徵 <222> (77)..(77) <223> 位置77之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (79)..(79) <223> 位置79之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (114)..(114) <223> 位置114之處之Xaa為Lys或Glu <220> <221> 其他特徵 <222> (119)..(119) <223> 位置119之處之Xaa為Arg或Glu <400> 31 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> 現代人<400> 32 <210> 33 <211> 78 <212> DNA <213> 現代人<400> 33 <210> 34 <211> 387 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 34 <210> 35 <211> 129 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體 <400> 35 <210> 36 <211> 387 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 36 <210> 37 <211> 129 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 37 <210> 38 <211> 129 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<220> <221> 其他特徵 <222> (79)..(79) <223> 位置79之處之Xaa為Lys或Ala <220> <221> 其他特徵 <222> (83)..(83) <223> 位置83之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (85)..(85) <223> 位置85之處之Xaa為Arg或Lys <220> <221> 其他特徵 <222> (120)..(120) <223> 位置120之處之Xaa為Lys或Glu <220> <221> 其他特徵 <222> (125)..(125) <223> 位置125之處之Xaa為Arg或Glu <400> 38 <210> 39 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 39 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 40 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 41 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 42 <210> 43 <211> 57 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 43 <210> 44 <211> 57 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 44

Claims (13)

  1. 一種含胺基酸序列SEQ ID NO：23之人類△31-N-端截短型GDNF變異體：RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI其中：i)Xaa84為K或A；ii)Xaa88為R或K；iii)Xaa90為R或K；iv)Xaa125為K或E；及v)Xaa130為R或E。
  2. 如請求項1之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其中該變異體選自由下列組成之群：RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：9)，RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：12)，及RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(SEQ ID NO：15)。
  3. 如請求項2之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其中該變異體為RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ.ID：9)。
  4. 如請求項2之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其中該變異體為RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：12)。
  5. 如請求項2之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其中該變異體為RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(SEQ ID NO：15)。
  6. 如請求項1至5中任一項之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其適用為藥物。
  7. 如請求項1至5中任一項之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其適用於治療帕金森氏症(Parkinson's disease)。
  8. 如請求項1至5中任一項之人類△31-N-端截短型GDNF變異體，其適用於療法。
  9. 一種中間物，其係用於製備△31-N-端截短型GDNF變異體，該中間體包含選自由下列組成之群之胺基酸序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIH LNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：28)；及MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：35)。
  10. 如請求項9之中間物，其中該胺基酸序列為MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(SEQ ID NO：35)。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之人類△31-N-端截短型GDNF變異體及一或多種醫藥可接受稀釋劑、載劑或賦形劑。
  12. 一種如請求項11之組合物於製造適於治療帕金森氏症之藥物之用途。
  13. 一種如請求項1至5中任一項之人類△31-N-端截短型GDNF變異體於製造適於治療帕金森氏症之藥物之用途。
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