EA025129B1 - Варианты нейротрофического фактора глиальных клеток (gdnf) человека - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым вариантам нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) человека и способам их применения.

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области терапевтических белков. В частности, настоящее изобретение относится к новым вариантам нейротрофического фактора глиальных клеток (ΟΌΝΕ) человека. Новые варианты ΟΌΝΕ могут быть полезны для лечения болезни Паркинсона.

ΟΌΝΕ представляет собой хорошо известный нейротрофический фактор, который, как сообщалось, обеспечивает алиментарную поддержку дофаминергических нейронов ίη νίΐτο и ίη νίνο. Кроме того, сообщалось, что ΟΌΝΕ обеспечивает функциональные улучшения и обладает нейропротективным действием в моделях болезни Паркинсона у грызунов и приматов. Белок ΟΌΝΡ дикого типа из Е. сой вводили в центральную нервную систему пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, что приводило к противоречивым результатам. В двух небольших открытых исследованиях обнаружили, что ΟΌΝΕ дикого типа вызывает длительное улучшение двигательной функции. Тем не менее, в фазе 11а рандомизированного плацебо-контролируемого исследования с участием 34 пациентов выявили, что при доставке ΟΌΝΕ в скорлупу чечевицеобразного ядра в течение 6 месяцев не наблюдалось улучшений. Повышение сигнала биомаркера было выраженным только в близлежащей ткани, окружающей место введения. В одном недавнем источнике сообщалось, что ΟΌΝΕ может представлять собой перспективную молекулу для спасения умирающих нервов; тем не менее, доставка данной молекулы в соответствующую область мозга остается очень сложной. №Цигс. т. 466:19 августа 2010.

Укороченные белки ΟΌΝΡ описаны в \УО 97/11964 (РСТ/ϋδ 96/14915); тем не менее, сохраняется потребность в новых вариантах ΟΌΝΕ, обладающих желательными фармакологическими свойствами, стабильностью и биораспределением. Существует потребность в вариантной форме ΟΌΝΕ, которая будет стабильна внутри средства доставки и будет способствовать желательному биораспределению в головном мозге, при этом демонстрируя желаемую эффективность и приемлемые иммуногенные свойства. Варианты ΟΌΝΕ, обладающие одним или более из перечисленных желательных свойств, могут представлять собой новые фармацевтически пригодные лекарственные средства, в частности, для применения для лечения болезни Паркинсона.

Согласно настоящему изобретению предложен новый укороченный вариант ΟΌΝΕ зрелого домена ΟΌΝΕ человека, в котором нет первых 31 аминокислот на Ν-конце (Д31-Ы-укороченный ΟΌΝΕ), в который введены некоторые замены аминокислот для получения стабильных, достаточно эффективных вариантов ΟΌΝΕ, обладающих желательными свойствами биораспределения и фармацевтически приемлемым профилем иммуногенности. Согласно настоящему изобретению предложены некоторые варианты ΟΌΝΕ человека, которые дают одно или более преимуществ по сравнению со зрелым ΟΌΝΕ дикого типа человека, включая варианты, которые обладают улучшенной фармацевтической стабильностью, а также улучшенным биораспределением, сниженной способностью к связыванию с гепарином, сниженным дезаминированием, сниженной тенденцией к образованию сукцинимида и сниженным иммуногенным потенциалом по сравнению с ΟΌΝΕ дикого типа человека. Некоторые новые варианты ΟΌΝΡ могут представлять собой полезный новый вариант лечения пациентов с болезнью Паркинсона.

Согласно настоящему изобретению предложен вариант ΟΌΝΡ человека, содержащий 8ЕЦ ГО ΝΟ: 23

КООКОКОРЮСАЪТА1НЕНУТОЕСгЕСУЕТКЕЕЫРКУС308С1ЭА АЕТТУОКШХааваМ Е8Хаа₈₈НХаа₉оКЕУ8ЕКУ09АССКР1АРОООЕ8РЕПОНЕУ¥Н1ЕКХаа₁25Н8АКХаа1зо СОС1 (ЗЕГ) Ю N0: 23), где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой К или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой К или К; ίν) Хаа_!25 представляет собой К или Е; ν) Хаа1₃₀ представляет собой К или Е.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен вариант ΟΌΝΕ человека, отличающийся тем, что указанный вариант выбран из группы, состоящей из

ΚΟΓ)ΚΓ;^Κ()0νί.ΤΑΠΙΕΝνΤΟΕΟΕΟΥΈτΚΕΕΙ_ΙΡΚ.ΥΕ3Ο80ΟΑΑΕΊΤΥΟΚΙ[_ΚΝ1.3 ΕΝΚΚΕν£ΕΚνθρΑί'€1<Ρ1ΛΕΟΟΟΕ8ΡΕΟΓ3ΝΤ.νΥΗΠ^ΚΚΗ3ζ\ΚΡ.εθΕΙ (ЗЕГ) ГО N0:9),

Κ.0Γ)Ε.ΓτΚΓ)ΚΓτ0\'ΕΤΑΙΗΕΝνΤΟΕ0Ε0ΥΕΠίΕΕΕΙΓΚΥ08Ο8ΓΌΆΑΕΤΤΥΒΚ]ΕΑΝΕ3 КМККЕУЗЕКУООАССКР1АРОООЕ8РЕООБЕУУН1Ы1КНЗАККСОС1 (ЗЕГ) ГО N0:12), и

Κ60ΚΟΚ0Κ(Χ;νΕΤΑΙΗΕΝνΤϋΕΟΕΟΥΕΤΚΕΕΕΙΡΚΥ05Ο3€ΏΑΑΕΤΤΥΟΚΙΕΑΝΕ3 К)Ж1ФУ5ЕКУ<Х)АССКИАРОООЕ5РЬООБЕУУН1ЕКЕН5АКЕССС1 (ЗЕГ) ГО N0:15).

В некотором аспекте согласно настоящему изобретению предложен вариант ΟΌΝΡ человека, со- 1 025129 держащий последовательность аминокислот, представленную в §ЕЦ ГО N0:9

КОрКОКОКОСгТ.ТА1НТ.МУТОЕС|ЬСтеТКЕЕЫГКУСКС|ЗСОААСТТТОКГЬКМ15

КМКК1Л'81:КУОС)АССКР[АЕОООЕЯЕЕООМЬ\УН]и<КНЗАККС(КЛ.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен интермедиат, полезный для получения ΔβΙ-Ν-укороченного варианта зрелого ΟΌΝΡ человека. Указанный интермедиат включает последовательность аминокислот, представленную в §ЕЦ ГО N0: 23

КСОКОКОКОСУЪТАПШЧУТПЕОЕОМТКЕЕЕТКУСЗОЗСОААЕГПТЖГОХаа^ Ь5Хаа88НХаа9оКЬУ8ЕКУО9АССКР1АРОООЕ8РЕООЫЕУ¥Н1ЕКХаа125Н8АКХаа1₃0 ССС1 (8 ЕО ГО N0: 23), к Ν-концу которой присоединен секреторный сигнальный пептид. В настоящем изобретении можно применять множество последовательностей секреторных сигнальных пептидов. Примеры последовательностей секреторных сигнальных пептидов включают секреторный сигнальный лидерный пептид каппа мыши, имеющий последовательность ΜΕΤΌΤΕΕΕ^νΕΕΕ^ΥΡΟδΤΟ (8ЕЦ ΙΌ N0: 25), и секреторный сигнальный пептид гормона роста человека, имеющий последовательность ΜΛΤ08ΚΤ5ЕЕЕАЕОЕЕСЕРАЕОЕО5А (5ЕО ГО N0: 32).

Интермедиаты, содержащие указанные секреторные сигнальные пептиды, позволяют получить заявленные варианты ОИОТ¹ человека с более высоким выходом, чем конструкции укороченного ОИОТ¹, содержащие другие лидерные последовательности. Описанные интермедиаты, включающие секреторный сигнальный пептид, таким образом, могут иметь следующие последовательности аминокислот:

МЕТПТЬЕЕ^УЬЬЕХУУРОЗТСКООКОКОКОСУЕТАЩЕЧУТОЬОЬОУЕТКЕЕЫРК. Υ0808€ηΑΑΕΤΤΥΌΚΠ,ΚΝ1.3ΚΝΚΚΕν8Ρ.ΚνθΟΑ€ί'ΚΡ[ΑΡΟΟΟΕ8ΕΕΟΟΝΕνΥΗί ЬККН8АККСОС1 (8Е0 ГО N0: 28); или

МАТО8КТ8ЬЬЬАРОЕЕСЕР\¥Е0Еа8АКО0Е.ОК0КССУЬТА1НЬОТТОЬСЬО¥ЕТК ΕΕΠΕΚΥΟδΟδΟϋΑΑΕΤΤΥϋΚ^ΚΝΕδΚΝΙΗΗ,νδΕΚνΟΟΑΟΟΚΡΙΑΓϋΟΟΕδΓΕΟΟΝ ίνΥΗΙΕΚΚΗδΑΚΚσΟΟΙ (ЗЕ<2 ГОΝΟ: 35).

Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая вариант ОИОТ¹ человека согласно настоящему изобретению и один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или вспомогательных веществ. Согласно настоящему изобретению предложен вариант человека для применения в качестве лекарственного средства. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен вариант ОИОТ¹ человека для применения для лечения болезни Паркинсона. Согласно настоящему изобретению предложен вариант для применения в качестве терапевтического средства.

Вариант, в котором Хаа₈₄ представляет собой А, Хаа₈₈ представляет собой К и Хаа₉₀ представляет собой К, является предпочтительным.

Вариант, в котором Хаа₈₄ представляет собой К, Хаа₈₈ представляет собой К и Хаа₉₀ представляет собой К, является предпочтительным.

Вариант, в котором Хаа1₂₅ представляет собой К и Хаа^₀ представляет собой К, является предпочтительным.

Вариант, в котором Хаа₈₄ представляет собой А, Хаа₈₈ представляет собой К и Хаа₉₀ представляет собой К, Хаа₁₂₅ представляет собой Е и Хаа₁₃₀ представляет собой Е, является предпочтительным.

Подробное описание изобретения

Сообщалось, что ОИОТ¹ дикого типа связывается с гепарином и внеклеточным матриксом, вероятно, посредством положительных зарядов, расположенных в ^концевых аминокислотных остатках 1-31, тем самым ограничивая распределение ОИОТ¹ при доставке в головной мозг (Ьш и др., 1. №игосЕет 63, 758-768, 1994; Кюкагб и др., О1усоЪю1оду 13, 419-426, 2003; РШоиеи и др., Е.хрептеШа1 №иго1оду 219, 499-506, 2009). Также сообщалось, что ОИОТ¹ обеспечивает функциональные улучшения и обладает нейропротективным действием в моделях болезни Паркинсона у грызунов и приматов (Тотас и др., 1995; ОакЕ и др., 1996). Белок ОИОТ¹ дикого типа из Е. соЕ вводили в центральную нервную систему пациентов, страдающих от болезни Паркинсона, что приводило к противоречивым результатам. В двух небольших открытых исследованиях обнаружили, что ОИОТ¹ дикого типа вызывает длительное улучшение двигательной функции (ОШ и др., 2003, §1еуш и др., 2005). Кроме того, наблюдалось явное повышенное разрастание дофаминергических нейронов у одного пациента, который умер от независимой причины - инфаркта миокарда (Ьоуе и др., 2005). Тем не менее, в фазе 11а рандомизированного плацебоконтролируемого исследования с участием 34 пациентов, осуществленного Атдеи, доставка ОИОТ¹ (Лиатермина) в скорлупу чечевицеобразного ядра в течение 6 месяцев не приводила к улучшению (Ьаид и др., 2006). Предложенные варианты ОИОТ¹ проявляют улучшенные свойства по сравнению с ранее исследованным белком ОИОТ¹ дикого типа из Е. соЕ.

Последовательность полноразмерной конструкции ОИОТ¹ дикого типа (211 АК), включающая сигнальный пептид (первые 19 аминокислот, §ЕЦ ГО N0: 4), продомен (курсивный шрифт, §ЕЦ ГО N0: 5) и зрелый пептид (подчеркнут, §ЕЦ ГО N0: 3), указана в §ЕЦ ГО N0: 1

- 2 025129

РРС>ЕРРШРР7С>ЛЖДгХД5РРКОМАУЬРККЕКМКОААААК!РЕЧ5КСКОКЕСОК

ОКРЖОСУЕТАШЬКУТРЕОЕОУЕТКЕЕЦРКУСЗОЗСРААЕТТУРКЩКМЬЗКМКК

ЬУЗРКУСОАССКР1АРРРРЬЗРЬРРМТ.УУНП-ККНЗАККСССТ

Последовательность полноразмерной ДНК ΟΌΝΡ дикого типа указана в §ЕЦ ГО N0: 2 АТСААОСТСТОООАССТООТООССОТОТОССТООТОСТССТОСАСАССОССАО СССТТТСССАСТСССАССССССААОАОАСССССАОАООССССАССССАССАСА ОААОССТСООСАООСООАОООССССАТТСССССТСАССАСССАСАССААСАТС ССАОАООАСТАССССОАССАОТТСОАСОАСОТСАТООАСТТСАТССАООССАС САТСААОАООСГОААОАООГСАСССОАСААС.САСАТСССССТССТССССАССС СССАСАССААСАСССАССССССССССОССААСССАОАОААТТССАООООСАА СООСАОААООООТСААСООООСААОААСАСССССТССОТОСТОАССОССАТС САССТОААСОТОАССОАССТОООССТССССТАССАСАССААССАООАОСТОАТ СТТСАССТАСТССАСССССАССТОСОАСОСССССОАОАССАССТАСОАСААОА ТССТОААОААССТОАОСАООААСАССССССТССТСТСССАСААССТСССССАС ОССТОСТОСАООСССАТСОССТТСОАСОАСОАССТОАОСТТССТООАСОАСААС СТОСТСТАССАСАТССТСАССААСгСАСАОСОССААОАОАТОСОССТОСАТС.

Положения аминокислот вариантов согласно настоящему изобретению определяют по полипептиду зрелого ΟΌΝΕ дикого типа человека, состоящему из 134 аминокислот (8ЕЦ ГО N0: 3). Мутации обозначены путем указания исходной аминокислоты, затем порядкового номера данной аминокислоты, а затем заменяющей аминокислоты. Численное обозначение каждого варианта приведено на основании зрелой последовательности дикого типа (зрелый ΟΌΝΕ ДТ) до укорачивания. Например, замену Ьук (К) в положении 84 (т.е. К84) на А1а (А) обозначают К84А. Аналогично, несколько замен Ьук (К) в положении 84 на А1а (А), Агд (К) в положении 88 на Ьуз (К), Агд (К) в положении 90 на Ьуз (К) и Акр (Ό) в положении 95 на С1и (Е) обозначают К84А/К88К/К90КГО95Е. В данной заявке аббревиатура КАККЕ относится к К84А-К88К-К90КГО95Е.

В данной заявке полноразмерный ΟΌΝΕ относится к последовательности целого белка, включающей сигнальный пептид, продомен и зрелый домен.

В данной заявке зрелый ΟΌΝΕ или полноразмерный зрелый ΟΌΝΕ относится к целому зрелому домену ΟΌΝΡ (от которого отщеплены сигнальный пептид и про домен).

В данной заявке А31-Шукороченный ΟΌΝΡ относится к зрелому домену ΟΌΝΕ, в котором нет первых 31 аминокислот на Ν-конце. В данной заявке термины А31-Шукороченный ΟΌΝΕ и вариант ΟΌΝΕ человека (или ΟΌΝΡν) используют взаимозаменяемо.

При трансфекции полноразмерными конструкциями ΟΌΝΕ клеток НЕК293 получают преимущественно полноразмерный зрелый ΟΌΝΕ в течение 5 дней. При трансфекции полноразмерными конструкциями ΟΌΝΕ клеток СН0 в течение более длительного периода времени и при получении стабильной линии клеток укороченные формы ΟΌΝΕ представляют собой преобладающие формы (Ьш и др., §с1еисе 260, 1130-1132, 1993). Дельта31 (Δ31), укороченная вариантная форма зрелого ΟΌΝΕ человека, в которой удалены с 1 по 31 аминокислотные остатки на Ν-конце, имеет последовательность §ЕЦ ГО Ν0: 8, и ее можно очистить из смеси.

Вариант ΟΌΝΕ, Δ31-укороченный с Ν-конца, можно получить в системе экспрессии млекопитающего или в бактериальной системе экспрессии путем удаления как пептидной последовательности продомена, так и первых 31 аминокислотных остатков зрелого пептида ΟΌΝΕ на уровне ДНК, и применяя ряд последовательностей секреторных сигнальных пептидов, таких как нативный секреторный сигнальный пептид ΟΌΝΕ (8ЕЦ ГО Ν0: 4 МКЕЛУОУУАУСЕУЕЕНТАЗА); секреторный сигнальный лидерный пептид каппа мыши (8ЕЦ ГО Ν0: 25 МЕТОТЕЕЕ\УУЕЕЕ\УУРС8ТС); и секреторный сигнальный пептид гормона роста человека (8ЕЦ ГО Ν0: 32 МАТС5>РТ5>ЕЕЕАРСЕЕСЕР\УЕОЕС5>А). Данные конструкции позволяют получить однотипные гомогенные Δ31-N-укороченные варианты ΟΌΝΡ.

Для среднего специалиста в данной области очевидно, что предложенные варианты ΟΌΝΡ не исключают возможность гликозилирования. Предложенные варианты ΟΌΝΡ могут быть гликозилированы в соответствующих случаях в зависимости от используемой системы экспрессии. Например, варианты ΟΌΝΡ, экспрессированные в системе млекопитающего, гликозилированы по положению Ν49, тогда как варианты, экспрессированные в бактериальной системе, не гликозилированы.

Если для экспрессии используется конструкция с полноразмерной нативной последовательностью (8ЕЦ ГО Ν0: 2), получают смесь видов ΟΌΝΡ с различными укорочениями Ν-конца, а также зрелую форму (не укороченную) с участком продомена или без него.

Следующие примеры, выполненные, по существу, как описано ниже, можно использовать для оценки некоторых свойств вариантов ΟΌΝΡ человека согласно настоящему изобретению.

Пример 1. Экспрессия, очистка и анализ иммуногенности белка.

- 3 025129

а) Субклонирование, мутирование, экспрессирование, разворачивание, повторная укладка и очистка ΟΌΝΕν, экспрессированного в Е. Сой.

Субклонирование. Штамм ВЕ21-СойоиР1и8 (ОЕ3)-К1РЬ Е. сой, несущий плазмиду рЕТ-30а(+)/ ιΉΟΌΝΕ. растили на питательной среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в конечной концентрации 30 мкг/мл, в течение ночи при 37°С. После сбора клеток путем центрифугирования выделяли плазмидный вектор с использованием набора О1Ас.]шск δρίη М1шргер (Ц1адеи), следуя протоколу производителя. Выделенную плазмидную ДНК затем использовали для реакции удлинения праймеров для генов Δ31-ΟΌΝΕ и Δ31-Ν380-ΟΌΝΕ кодирующих белок Δ31-ΟΌΝΕ (31 остаток удален с Ν-конца зрелого ΟΌΝΕ человека) и белок Δ31-Ν380-ΟΌΝΡ (31 остаток удален с Ν-конца зрелого ΟΌΝΕ человека и остаток аспарагина в положении 38 заменен на глутамин) соответственно. Это можно осуществить, применяя олигонуклеотидные праймеры Δ31-Ροτ, Δ31-Γον, Δ31-N38^-Го^ и Δ31-Ν38Ο-γου (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 6, 7, 39 и 40 соответственно), содержащие сайты рестрикции эндонуклеазами ΝύοΙ и Хйо1, разработанные таким образом, чтобы они отжигались на 5'- и 3'-концы гена. Сайты рестрикции ΝύοΙ и Хйо1, введенные в 5'концы смыслового и антисмыслового праймеров, обеспечивают возможность клонирования Δ31-ΟΌΝΕ и Δ31-Ν380-ΟΌΝΡ в соответствующие сайты вектора рЕТ-30а(+). Реакцию удлинения праймера осуществляли в течение 3 мин при 94°С, затем следовало 16 трехэтапных циклов: 1 мин при 94°С, 0,5 мин при 55°С и 1 мин при 72°С и конечный этап 10 мин при 72°С, в общем объеме 100 мкл, с применением 80 нг матричной ДНК, прямой и обратный праймеры и смесь для ПЦР РСК 8ирегт1х (Птуйгодст номер в каталоге 10572-014). Полученные ампликоны проверяли путем электрофореза в агарозном геле и очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР О1Ас|шск (Ц1адеи), следуя протоколу производителя.

Как амплифицированный ген Δ31-ΟΌΝΕ или Δ31-Ν38φ-ΟΟΝΕ, так и вектор рЕТ-30а(+) расщепляли в течение 2 ч при 37°С рестриктазами ΝύοΙ и Хйо1, а затем очищали ДНК путм электрофореза в агарозном геле с использованием набора О1Ас.]шск Се1 Ехйасйои. Δ31-ΟΌΝΕ или Δ31-Ν380-ΟΌΝΕ затем лигировали в плазмиду рЕТ-30а(+), применяя Т4 ДНК-лигазу и следуя протоколу производителя. 2-5 мкл реакционных смесей лигирования использовали для непосредственной трансформации 50-100 мкл химически компетентных клеток штамма ВЕ21-СойоиР1и8 (ОЕ3)-К1РЬ Е. сой, следуя протоколу производителя (Адйеи!, номер в каталоге 230280). Колонии трансформантов, полученные путем посева на чашки с агаром Луриа-Бертани, содержащим канамицин в конечной концентрации 30 мкг/мл, подвергали скринингу на присутствие правильной конструкции путем секвенирования выделеной плазмиды в обоих направлениях, применяя стандартные олигонуклеотидные праймеры, содержащие последовательности промотора и терминатора Т7.

Мутации. Сайт-направленный мутагенез осуществляли с использованием набора ЦшкСйаиде ΜυΙΙί 8йе-Ойес1ей Ми1адеие818 (81та1адеие, Ла-Хойя, Калифорния), с получением А31-Е380-О95Е-ООЕР и А31-Е38О-К84А-К88К-К90К-О95Е-ООЕР. В данном способе используют Δ31-Ν380-ΟΌΝΕ встроенный в рЕТ-30а(+), в качестве матрицы и олигонуклеотиды А31-Е38ОГО95Е-Гог и Δ31-N38^-^95Ε-^еν (табл. 1, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 41 и 42) в качестве прямого и обратного праймеров соответственно. Затем успешно мутированный ген Δ31-4380-09.^, встроенный в рЕТ-30а(+), используют в качестве матрицы, а олигонуклеотиды А31-К380-К84А-К88К-К90К-О95Е-Гог и :\3 1-Е84А-И88Е-И90Е-Э95Е-Э95Е-ге\ (табл. 1, 8ЕО ГО ΝΟ8: 43 и 44) используют в качестве прямого и обратного праймеров соответственно с получением Δ31Ы38Ц-К84А-К88К-К90К-О95Е-ООКР. Затем проверяют правильность последовательности ДНК и трансформируют полученной плазмидой химически компетентные клетки штамма ВЬ21-СойоиР1и8 (ОЕ3)-К1РЬ Е. сой.

Экспрессия белка. Клетки из замороженных исходных растворов клеток ВЬ21-СойоиР1и8 (ОЕ3)КГРЬ Е. сой, несущих плазмиду рЕТ-30а(+)/00№А, применяли для инокулирования 50 мл питательной среды 2хТУ, содержащей канамицин в конечной концентрации 30 мкг/мл, при 37°С. Через 9 ч 5 мл заквасочной культуры использовали для инокулирования 6x2 л такой же жидкой культуральной среды при 37°С. Когда культура достигала оптической плотности при 600 нм между 0,8 и 1,4, обычно через 16 ч, добавляли 1РТО до конечной концентрации 1 мМ и температуру культуры снижали до 27-30°С в течение 5 ч. Клетки собирали путем центрифугирования при 10000 д в течение 20 мин при 4°С и хранили при -80°С.

Растворение - повторная укладка. Осадок клеток суспендировали в 2-3 объемах раствора, содержащего 0,2 мг/мл лизоцима, 5 мМ МдС1₂ и 50 мМ Трис-С1 при рН 8, и оставляли для инкубации при перемешивании в течение 30 мин на льду. Полученную в результате этого взвесь разрушали ультразвуком на льду в течение 10 мин (импульсы по 5 с, интервал 2 с, амплитуда 30-40%). После этого получали ΟΌΝΕν в виде телец включений, которые выделяли из клеточного лизата путем центрифугирования при 20000 д в течение 20 мин и растворяли в 4 М гуанидине, 90 мМ цистеине, 20 мМ Трис-С1, рН 8,5. Полученный белок пересворачивали с получением его активной формы путем 10Х разведения в 0,2 М гуанидине, 2 М мочевине, 20 мМ Трис-С1, рН 8,75. Смесь для пересворачивания выдерживали при 4°С в течение 2 дней.

Очистка. ΟΌΝΕν после повторного сворачивания очищали до гомогенного состояния путем 3этапной колоночной хроматографии.

- 4 025129

1. Катионообменная хроматография (КОХ) на колонке 8Р.

2. Хроматография гидрофобных взаимодействий (ХГВ) па фенильной колонке РНспу1.

3. Эксклюзионная хроматография (ЭХ) на колонке 8ирегбех-75.

Ренатурированный белок сначала наносили на колонку с 8Р-сефарозой быстрого пропускания (§Р ЗерЬагозе Раз! Г1о\у), уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия, рН 5. ΟΌΝΡν элюировали восходящим линейным градиентом соли от 0,3 до 1 М ΝαΟ в 20 мМ ацетате натрия, рН 5. В объединенный основной поток КОХ добавляли ΝαΟ до конечной концентрации 2,5 М, а затем наносили на колонку для хроматографии гидрофобных взаимодействий РНепу1 Зерйагозе НР в 20 мМ цитрате натрия, рН 5. Колонку для ХГВ элюировали нисходящим линейным градиентом соли от 2,5 до 0 М ΝαΟ в 20 мМ цитрате натрия, рН 5. ΟΌΝΡν крепко связывался с колонкой для ХГВ. Объединенный основной поток с колонки ХГВ затем концентрировали и, наконец, наносили на колонку §ирегбех-75, белок элюировали ФБР, рН 7,4. Конечный пул концентрировали, фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и хранили при -80°С.

Ь) Экспрессия ΟΌΝΡν в клетках млекопитающих и очистка.

Гены, кодирующие варианты ΟΌΝΡ, можно получить, применяя стандартные методики молекулярной биологии, или путем синтеза гена в клетках млекопитающего в векторе экспрессии под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ). Рекомбинантные плазмиды использовали для временной трансфекции клеток эмбриональной почки человека 293ΕΒΝΑ (НЕК293) и собирали среды через 5 дней. В другом способе получали стабильные линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) для экспрессии вариантов ΟΌΝΡ. Гены, кодирующие варианты белка, субклонировали в каркасы экспрессионных плазмид, содержащих ген глутаминсинтетазы (Ο8) (плазмиды на основе рЕЕ12.4, Боп/а ВюКщсз, Слау, Великобритания) в одной рамке считывания с нативной сигнальной последовательностью ΟΌΝΡ с продоменом, согласно инструкции производителя. Полноразмерными конструкциями ΟΌΝΡ (5>ЕО ΙΌ ΝΟ: 2) в векторах на основе рЕЕ12.4 трансфицировали клетки СНО и получали укороченные формы ΟΌΝΡ, при этом преобладающей формой была Δ31, и ее можно было очистить от смеси. Удаление продомена и первых 31 Ν-концевых аминокислот, эффективное получение чистого Δ31-N-укороченного варианта ΟΌΝΡ в системе экспрессии млекопитающего, без необходимости очистки из смеси полноразмерных и укороченных продуктов, известной ранее. Нативный секреторный сигнальный пептид ΟΌΝΡ также можно заменить на некоторое количество секреторных сигнальных пептидов, включая секреторный сигнальный лидерный пептид каппа мыши или секреторный сигнальный пептид гормона роста человека. Все описанные секреторные сигнальные пептиды также обеспечивают эффективное получение чистого Δ31-Νукороченного варианта ΟΌΝΡ, но уровни экспрессии при этом отличаются. Варианты ΟΌΝΡ, включающие желательные мутации, субклонировали в подходящие векторы экспрессии (такие как рΕМК-NΡ2, Боп/а) в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью каппа мыши.

Очистка. ΟΌΝΡν очищали до гомогенного состояния с помощью 4-этапной хроматографии на гранулах.

1. Катионообменная хроматография (КОХ) на колонке 8Р.

2. Хроматография гидрофобных взаимодействий (ХГВ) на колонке РЬеиу1.

3. Катионообменная хроматография (КОХ) на колонке смешанного режима Сар!оММС.

4. Эксклюзионная хроматография (ЭХ) на колонке 8ирегбех-75.

Вкратце, собранные культуральные среды, содержащие варианты белка ΟΌΝΡ, сначала наносили на колонку §Р ЗерЬагозе Ρακί Б1о\у, уравновешенную 20 мМ ацетатом натрия, рН 5. ΟΌΝΡν элюировали линейным градиентом соли от 0 до 1 М ΝαΟ в 20 мМ ацетате натрия, рН 5. В объединенный основной поток КОХ добавляли ΝαΟ до конечной концентрации 2,5 М, а затем наносили на колонку РНепу1 §ерйагозе НР для хроматографии гидрофобных взаимодействий в 20 мМ ацетате натрия, рН 5. Колонку для ХГВ элюировали обратным линейным градиентом соли от 2,5 до 0 М ΝαΟ в 20 мМ ацетате натрия, рН 5. ΟΌΝΡν слабо связывался с колонкой для ХГВ. Объединенный элюат и ранние элюированные фракции затем наносили на смолу смешанного режима колонки Сар!о ММС при рН 5. Колонку промывали 50 мМ Трис-С1, рН 8, а затем элюировали ΟΌΝΡν линейным градиентом соли от 0 до 1 М ΝαΟ в 50 мМ ТрисС1, рН 8. Основной поток с Сар!о ММС, наконец, наносили на колонку §ирегбех-75 и элюировали белок с помощью ФБР, рН 7,4. Конечный поток фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и хранили при 2-8°С.

- 5 025129

Таблица 1

Олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПЦР и сайт-направленного мутагенеза

Праймер	Последовательность нуклеотидов	Назначение
Д31-Гог°	5 'Т АТ.АС.-1 ТА ГОССТССАСААССТССТАААААССОТССТТСТСТССТ О-З’ (£Е<2 ГО Νο: 6)	ПЦР
Δ31-ΐϋν“	5’-ООТОСТСС.4(ТГТАТТАААТОСАООСОСААССТТТСССССТ-3' (8Е<3 ГО Νο: 7}	ПЦР
Δ31-Ν38Ο-£οι'’*	5 - ТАТАСАТАТОСОТООАСААСОТСОТАААСААССТООТТОТОТОСТО -3’ (5ЕЦ ГО Νο: 39)	ПЦР
А31-ЮЭД-геу	3’-С.СТ0СТС0АСТГАТТАААТ0СА0ССС.СААС0ТТТССС0СТ-Г (5Е<? ГО Νο: 40}	ПЦР
Δ31-Ν380-Ο9 5Е-£ог°	5’-СТСТССТСАСССАСАААСТСССТСАС-3’ (5ЕОГО Νο: 41)	Мутагенез
Д31-Ц38О-О95Е-геу‘	5'-СТСАСССАСТТТ£ТСОСТСАССАСАС-3’ (8Е<3 ГО Νο: 42)	Мутагенез
Δ31-Ν38Ο-ΚΑΚΚΕ- ϊν/'ιιρχ,υιιιι)	5’- сстатсатаааатсстсссааасстоаосааоаасааасстстсс ТСАОСОАСАААС-3’ (8Е0 ГО Νο: 43)	Мутагенез
Δ31-Ν380-ΚΑΚΚΕгет4 (обратный)	5’- СТТТСТСОСТСАССАСАСОТТТОТТСТТССТСАССТТГаССАООАТГ ТТАТСАТАОС-3’ (8Е<Э ГО Νο: 44)	Мутагенез

^а Сайты рестрикции для эндонуклеаз ΝάβΙ и Хйо1 выделены курсивом.

^Ь Подчеркивание букв указывает на некомплементарность.

Анализ иммуногенного потенциала ЕрАах.

Получали выбранные варианты ΟΌΝΡ человека с сниженной вероятностью связывания с НЬА-ΌΚ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟδ: 12 и 15) и сравнивали их с ΟΌΝΡ дикого типа в анализе на связывание ΟΡΚα и гепарина.

Пример 2. Стабильность ΟΌΝΡ дикого типа и варианта Δ31 ΟΌΝΡ.

Стабильность полноразмерного зрелого ΟΌΝΡ дикого типа и Δ31-N-укороченных вариантов ΟΌΝΡ можно оценить, применяя множество аналитических способов, таких как обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ), эксклюзионная ВЭЖХ, катионообменная ВЭЖХ и масс-спектрометрия, для определения какихлибо сайтов деградации в данных молекулах. Затем вводят мутации, чтобы убрать сайты химической деградации для повышения стабильности варианта ΟΌΝΡ человека.

Аналитическая обращенно-фазовая хроматография (ОФ ВЭЖХ).

Осуществляли на колонке 2огЬах С₈ 8В-300А. 3,5 мкм, 4,6x50 мм, нагретой до 60°С (Адйеи! Тесйпо1офс5. номер в каталоге 865973-909). Подвижная фаза представляла собой 0,1% ТФК в Η₂Ο. ΟΌΝΡν элюировали в виде одиночного пика на 214 нм, время удерживания составляло 19-20 мин, линейным градиентом ацетонитрила от 5 до 50% за 30 мин при скорости потока 1 мл/мин в течение 35 мин.

Аналитическая эксклюзионная хроматография (ЭХ-ВЭЖХ).

Осуществляли на колонке Т81<-С-2000-8\У-ХР 5 мкм, 7,8x300 мм (ΤΟδΟΗ ΒΙΟ8ΕΡ, номер в каталоге 08540). Подвижная фаза: ФБР + 350 мМ №С1, рН 7,4, при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 35 мин. ΟΌΝΡν элюировали в виде одиночного пика на 214 нм, время удерживания составляло ~16-17 мин.

Аналитическая катионообменная хроматография (КОХ-ВЭЖХ).

Осуществляли на колонке Пюиех, Ргорас ^СХ-10, 4x250 мм (Оюиех, номер в каталоге 054993). Подвижная фаза представляла собой 20 мМ фосфат натрия, 10% ацетонитрил, рН 7. ΟΌΝΡν элюировали в виде сложного пика, время удерживания составляло 25-30 мин, линейным градиентом соли от 0,15 до 0,6 М Ναί'Ί за 45 мин при скорости потока 1 мл/мин в течение 52 мин.

Анализ химической стабильности (ЖХ/МС) ΟΌΝΡ дикого типа (полноразмерного бактериального ΟΌΝΡ) по сравнению с ΟΌΝΡν ί'ΉΟ дикого типа ^^31-укороченным ΟΌΝΡ).

ΟΌΝΡ дикого типа (полноразмерный бактериальный ΟΌΝΡ) и ΟΌΝΡν ί'ΉΟ дикого типа (Ν-Δ31укороченный ΟΌΝΡ) подвергали воздействию температуры 37°С в течение 4 недель, чтобы определить аминокислоты, которые могут отвечать за химическую нестабильность.

Образцы:

- полноразмерный ΟΌΝΡ ДТ Е. сой при 4°С в течение 4 недель, 1,0 мг/мл,

- полноразмерный ΟΌΝΡ ДТ Е. сой при 37°С в течение 4 недель, 1,0 мг/мл,

- Δ31-ΟΌΝΡν ДТ СТО при 4°С в течение 4 недель, 1,0 мг/мл,

- Δ31-ΟΌΝΡν ДТ СТО при 37°С в течение 4 недель, 1,0 мг/мл.

Молекулярный анализ интактных и расщепленных образцов. Аликвоту 10 мкл каждого образца (раствор смешивали с 20 мкл воды или аликвотой 10 мкл каждого раствора) смешивали с 40 мкл буфера 100 мМ Трис-НС1, рН 8, 1,0 мкл 50 мг/мл дитиотреитола (ДТТ) при температуре окружающей среды в течение 30 мин. Каждый образец подвергали анализу ЖХ/МС.

Расщепление Ьу8-С. Аликвоту объемом 20 мкл раствора каждого образца лиофилизировали досуха на вакуумной центрифуге, а затем полученный материал перерастворяли в 0,5 мкл 50 мг/мл ДТТ и 4,5 мкл 6 М гуанидин-НС1, 0,5 М буфера Трис-НС1, рН 8. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а

- 6 025129 затем каждый раствор разбавляли 93 мкл воды и обрабатывали 2 мкл 0,2 мг/мл Ьук-С (\ако) при 37°С в течение 2 ч. Для СНО ΟΌΝΕν 30 мкл триптического гидролизата обрабатывали 0,5 мкл РЫОазой Ε при 37°С в течение 1 ч (чтобы оценить углеводный профиль). Гидролизат подкисляли 2 мкл 10% ТФК в Н₂О перед проведением анализа ЖХ/МС.

Анализ ЖХ/МС. Растворы образцов анализировали с помощью масс-спектрометрии \а1сгк 8ΥΝАРТ в сочетании с СВЭЖХ ЛссцЩу ИРЬС или масс-спектрометрии \а1сгк ЬСТ ргсийсг в сочетании с ВЭЖХ \Уа1егк 2795.

Нисходящий анализ. Продукты расщепления ΟΌΝΕ дикого типа получали путем ЖХ/МС анализа частично укороченного ΟΌΝΕ. Идентифицировали множество продуктов расщепления, количественные данные для этих продуктов расщепления представлены в табл. 2. Несколько продуктов расщепления (расщепления между Ν15/Ρ16, Ν22/Ρ23, N25/826 и Ν38/Κ39) характеризуются близкими механизмами разрушения, например дезаминированием через образование сукцинимида. Для Δ31-ΟΌΝΕν СНО дикого типа первые 31 аминокислотных остатков отщепляются от Ν-конца. Хотя в ΟΌΝΕν из СНО есть два потенциальных сайта Ν-гликозилирования на цепь, только один сайт Ν-гликозилируется. Большинство наблюдаемых гликанов представляли собой ди- или триантенные олигосахариды с различным галактозилированием. Интересно, что не было обнаружено значительно сиалированных гликанов (табл. 3).

Восходящий анализ (пептидное картирование). Хроматограммы в УФ-свете реакции расщепления Ьук-С образцов укороченного ΟΌΝΕ, исследуемых на стабильность, выявили присутствие всех ожидаемых пептидов за исключением пептида ΟΌΝΕ 126-129. В материале СНО Ν-концевые пептиды (до К32) обнаружены не были. Пептид 38-60, включающий Ν49, был гликозилирован и более чем 95% Акп49 были заняты.

Пептид 85-96, включающий Ν85, не был гликозилирован. Полученные результаты согласуются с результатами анализа ЖХ/МС для образцов укороченного ΟΌΝΕ.

В целом, основным компонентом материалов как дикого типа, так и СНО был гомодимер. Минорный компонент, который элюировался рано, представлял собой мономер. Согласно массспектроскопическому анализу в мономере Сук41 ΟΌΝΕ образовал дисульфидную связь со свободным остатком Сук. Относительный процент пиков мономера был очень низок и составлял <1% для СНО и <0,5% для дикого типа при исследовании в ультрафиолете. Содержание мономера не изменялось в материалах после термического воздействия.

Такие виды деградации, как окисление, дезаминирование и изомеризация, также выявили с помощью пептидного картирования. Результаты представлены в табл. 4. Полноразмерный ΟΌΝΕ дикого типа из Е. сой содержит два остатка Мс1, М(-1) и М6, и окисление этих сайтов относительно низко. ΟΌΝΕ не содержит остатков Тгр. В полноразмерном мономере ΟΌΝΕ содержится восемь остатков Акр. Основные сайты дезаминирования представляют собой Ν25 и Ν38. Поскольку дезаминирование происходит значительно быстрее в буфере с высоким рН, относительный процент таких сайтов должен быть низким при обработке буфером с рН 5 или 6. Обнаружили один изомерный пептид, 85-96, но не ясно, образовался ли он в результате изомеризации Акр до 1ко-Акр или в результате рацемизации аминокислотного остатка. Известно, что воздействие высокого рН, как правило, приводит к рацемизации, а воздействие низкого рН приводит к изомеризации Акр. Для полноразмерного ΟΌΝΕ дикого типа у нескольких пептидов оказались различные массы как в контрольном (4°С), так и в подвергнутом воздействию температуры (37°С) образцах. Их появление, наиболее вероятно, объясняется ошибками включения в процессе биосинтеза в Е. сой.

Таблица 2

Относительный процент расщепления ΟΌΝΕ

Пептиды ΟΏΝΡ	СОМРДТ-Я, сои 4 недели, 4 йС	ΟΌΝΡ ДТ- Е соП 4 недели, 37 °С	СНО-ДЗ1 - ΟΟΝΡν 4 недели, 37 °С
Ме1+ 1 - 134	90,9	57,6	нд
1-134	2,8	4,1	нд
2-134	2,5	4,2	НД
3-134	<0,5	1,5	НД
7- 134	0,5	2,4	НД
16-134	<0,5	2,9	нд
РугоЕ17, 17-134	<0,5	2,9	нд
18- 134	0,6	2,0	нд
19-134	1,7	4,1	нд
20-134	<0,5	3,8	нд
26-134	<0,5	2,7	НД
32- 134	<0,5	2,9	97,3
39- 134	<0,5	4,5	2,7

НД - Нет данных

- 7 025129

Таблица 3

ΟΗΟ-Δ31-ΟΌΝΡν: гликаны в сайте гликозилирования N49

Формула гликана в N49	Относительный процент (%)
4 ФС в течение 4 недель	37 ФС в течение 4 недель
Хеи Ас	Нех№Ас	Нех	Рс
0	2	3	0	0,5	0,5
0	2	3	1	4,3	4,4
0	3	3	0	1,9	2,2
0	3	3	1	15,1	14,8
0	4	3	0	1,8	1,5
0	3	4	1	2,6	3,1
0	4	3	1	9,4	10,0
0	5	3	0	1,3	1,5
0	4	4	1	3,4	3,5
0	5	3	1	6,6	7,0
0	4	5	1	6,3	6,5
0	5	4	1	3,4	3,7
0	6	3	1	1,3	1,4
0	5	5	1	4,0	4,5
0	5	6	0	3,4	3,1
0	6	4	1	1,5	1,5
0	5	6	I	22,5	20,9
0	б	7	0	0,7	0,6
0	6	7	1	5Д	4,6
0	7	8	1	0,5	0,8
Агликозилирование в сайте N49	4,3	4,1

Таблица 4

Пептидное картирование ЖХ/МС

	Относительный процент (%)
Остаток/Пептиды	ΟϋΝΈ ДТ-£ соН	СНО-ДЗ 1-ΟΙ)ΝΗν
	4 °С, 4 недели|37 °С, 4 недел*	4 0С, 4 недели|37 °С, 4 неделе
		Окисление
Ме((-1)	1,4	2,5	нд	нд
МеГб	6,4	11,2	нд	нд
	Дезаминирование
Ν15/Ν25, основной N25	2,8	61,5	нд	нд
N38	1,9	20,3	6,7	27,6
N89	<0,5	4,0	1,2	3,5
		Изомеризация
Пептид ΟϋΝΡ 85-96	<0,5	14,4	3,6	17,7
3 Нет данных.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Δ31-N-укороченный вариант ΟΌΝΡ, полученный в клетках СНО, обладает повышенной химической стабильностью благодаря делеции первых 31 аминокислотного остатка, которые включают важные участки окисления и дезаминирования по сравнению с полученным в Е. соН полноразмерным зрелым ΟΌΝΕ дикого типа человека, при воздействии температуры 37°С в течение 4 недель. Кроме того, в табл. 5 показано, что после введения мутации наблюдались существенные улучшения биофизических и биохимических свойств двух мутированных Δ31-Νукороченных вариантов ΟΌΝΕ (N380 и Ό95Ε соответственно) по сравнению как с полноразмерным ΟΌΝΕ дикого типа Е. соН, так и с Δ31-N-укороченным вариантом ΟΌΝΕ до введения мутации.

- 8 025129

Таблица 5

Улучшенные биофизические и биохимические свойства вариантов ΟΌΝΡ по сравнению с ΟΌΝΡ дикого типа после 4 недель инкубации при 37°С по сравнению с инкубацией при 4°С

Пример 3. Активность связывания ίη νίΐτο.

В следующих анализах показано, что некоторые варианты ΟΌΝΡ человека характеризуются сниженным связыванием в гепарином, и при этом сохраняется связывание с рецептором ΟΡΚα1, что обеспечивает целый ряд различных свойств связывания гепарина и рецептора.

Кинетика связывания ΟΌΝΡν с рецепторами ОРК на устройстве В1асоге.

Варианты ΟΌΝΡ (ΟΌΝΡν: ^А31-укороченные) можно экспрессировать в клетках Е. сой (бактериальных) или клетках млекопитающих (клетки СНО или клетки ΕΒΝΑ НЕК293) и очистить, как описано в примере 1. Первичные последовательности указанных вариантов остаются одинаковыми независимо от используемой системы экспрессии.

Для измерения кинетики связывания ΟΌΝΡν с рецепторами семейства ΟΌΝΡ человека и крысы (ΟΡΚα1 и ΟΡΚα2) использовали устройство В1асоге® 2000. Измерения осуществляли при 25°С. Образцы растворяли в буфере НВ8-ЕР (150 мМ хлорид натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,005% (вес./об.) поверхностноактивного вещества Р-20, рН 7,4). Белок Α, §1арйу1ососси8 аитеик, иммобилизовали на проточных кюветах с 1 по 4 сенсорного чипа СМ4 (ОЕ НеаИйсате, номер в каталоге ВК-1005-39) в количестве ~200 еди- 9 025129 ниц ответа (КИ), используя химию связывания амина для захвата ОРК Рс химеры (рекомбинантная человеческая ОРКа-1/ΟΌΝΕ Ка-1 Рс химера; рекомбинантная человеческая ОРКа-2/ΟΌΝΕ Ка-2 Рс химера; рекомбинантная крысиная ОРКа-1/ΟΌΝΕ Ка-1 Рс химера; рекомбинантная мышиная ОРКа-2/ΟΌΝΕ Ка2 Рс химера).

Связывание оценивали, используя множество циклов. Каждый цикл состоял из следующих этапов: 1) впрыскивание приблизительно 10 мкл ОРК при концентрации ~1,0 мкг/мл и скорости потока 10 мкл/мин с целью захвата 120-150 КИ; 2) впрыскивание 250 мкл ΟΌΝΕν при скорости потока 50 мкл/мин в диапазоне конечных концентраций между 10 и 0,04 нМ, за чем следовала диссоциация в течение 20 мин; и 3) регенерация с применением приблизительно 30 мкл 10 мМ гидрохлорида глицина, рН 1,5. Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивали, используя модель связывания 1: 1 (Лэнгмюр) в версии 4.1 программного обеспечения ΒΙΑοναΙιιαΙίοη.

Результаты представлены ниже в табл. 6-8.

Таблица 6

ΟΌΝΕν: Кинетика связывания и аффинность к ОРКа-1 человека

ΟΟΝΡν	^(М-’с1)	^О(Г (с1)	А'о(пМ)
£. СоП-ДТ-ΟΟΝΓ “ (8Е0 Ю N0:3)	(6,0 ± 2,3) х ΙΟ6	(3,5 ± 0,8) х 10'4	64 ±23
ЕСоН-АЗ 1 -ΟΠΝΕ (5ЕР ГО N0:8)	(4,2 ± 1,3) х Ю6	(1,7 ± 0,7) х 10'4	44 ±30
£.со//-ДЗ 1-Ν380-Ο95Ε-ΟΟΝΡ ($Е(3 ГО N0:9)	(3,9 ± 1,3) х 106	(1,6 ± 0,3) х 10-4	47 + 25
£Ο?Λ'-Δ3 1-Ν38<5-Κ84Α-Κ.88ΚΚ90Κ-Ο95Ε-ΟΟΝΡ (5Е<} ГО N0:12)	(5,0 ± 1,8) х 106	(1,6 ± 0,2) х 10'4	35 ± 18
СНО-ЛЗ1 -ΟΟΝΡ (5Ер ГО N0:8)	(3,8 ± 1,5) х 106	(0,9±0,1 X Ι0'4	29+17
СНО-ДЗ1-Ν3 80-ϋ95Ε-ΟϋΝΡ (δΕ<3Π5ΝΟ:9)	(4,5 ± 2,1) х 105	(1,1 ±0,2) х 10-4	30 ±14
СНО-ДЗ 1-Ν380-К84 А-К8 8КΚ90Κ-Ο95Ε-ΟΟΝΓ (8Е0 Ю N0:12)	(6,2 ± 3,2) х 106	(1,4 ± 0,4) х 10’4	29 ± 15

^а Определяли в присутствии 400 мМ ΝαίΤ

Таблица 7

ΟΌΝΕν: кинетика связывания и аффинность к ОРКа-2 человека

ΟϋΝΡν	ЛВДМ-'с'1,	ОггЕ'1)	ЛЪ(пМ)
Я.СоЛ-ДТ-ΟΟΝΡ ОВД ГО N0:3)	2,4 х 106	2,6 х 10'4	100
сно-дз 1-ΟΟΝΓ (Зе:о го N0:8)	5,3 х 106	2,5 х 10'4	47
СНО-ДЗ 1-Ν380-Ο95Ε-ΟΟΝΡ (5Е<3 ГО N0:9)	7,6 х 106	3,5 х ΙΟ-4	47
ΟΗΟ-Δ31-Ν380- К84А-В.88КК90КГО95Е -ΟΟΝΡ (ЗЕ<Э ГО N0:12)	9,6 х 106	4,2 х 10·4	44

Таблица 8

Кинетика связывания и аффинность ΟΌΝΕν к ОРКа-1 крысы
ΟϋΝΈν	О., (М’1 с'1)	Аои(с')	ЛЪ(пМ)
СНО-ДЗ 1-ΟϋΝΡ (8Е() ГО N0:8)	5,6 х 106	2,4 х 10-4	44
СНО-ДЗ 1-Ν380-Ο95Ε-Ο0ΝΡ (ЗЕО ГО N0:9)	9,4 х 10*	1,9 х Ι0'1	20
СНО-ДЗ Ι-Ν38Ο- К84А-К88КΚ90Κ-Ο95Ε-ΟΟΝΓ(8Η0 ГО N0:12)	9,9 х 106	2,1 х 10'4	21

Связывание вариантов ΟΌΝΕ человека с ОРКа1 с применением твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8Л).

ΟΌΝΕ дикого типа и его варианты исследовали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А), в котором измеряли связывание белков ΟΌΝΕ с рецептором (ОРКа1), адсорбированным на планшете. Условия без ΟΌΝΕ и/или посторонний белок использовали в качестве отрицательных контролей.

- 10 025129

Каждую лунку 96-луночного планшета (планшеты для ЕБ18А Отешет 655081 1ттипоЫпб) покрывали 70 мкл ΟΡΚα1 человека (рекомбинантной человеческой ОРКа1-Рс химерой, свободной от носителя) в концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6. В случае покрытия посторонним рецептором он представлял собой посторонний химерный Рс, и использовали такую же концентрацию, что и при покрытии ΟΡΚα1. Планшеты запечатывали и инкубировали при 4°С в течение ночи. Из лунок аспирировали жидкость и промывали дважды буфером для промывки (20 мМ Трис(гидроксиметил)аминометан, рН 7,4, 0,15 М Ναί'Ί. 0,1% Тгееп-20), применяя устройство для автоматической промывки планшетов. Планшеты блокировали 200 мкл блокирующего буфера на лунку (3% быстрорастворимое сухое молоко от СагпаОоп в описанном выше буфере для промывки) в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали дважды буфером для промывки.

Готовили серийные разведения белков ΟΌΝΡ в блокирующем буфере в подходящем диапазоне концентраций, обычно начиная с 5 мкг/мл и заканчивая серийным разведением 1:10. Использовали контроль без ΟΌΝΡ, который состоял только из блокирующего буфера. 50 мкл каждого раствора ΟΌΝΡ добавляли в лунки, покрытые ΟΡΚα1, в трех повторах. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки.

Аликвоту объемом 50 мкл биотинилированного антитела к ΟΌΝΡ человека (Κ&Ό §у51ет5, биотинилированное поликлональное антитело козы к ΟΌΝΡ человека, номер в каталоге ВАР212), разбавленного до концентрации 1 мкг/мл в блокирующем буфере, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки.

Аликвоту объемом 50 мкл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена Цаскьоп 1ттипоКекеагсЬ, номер в каталоге 016-030-084), разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 20-30 мин при комнатной температуре. В качестве альтернативы можно использовать разведение 1:2000 и инкубировать в течение 30-90 мин. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки. В каждую лунку добавляли 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата ортофенилендиамина (ОФД)) и проявляли при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Реакцию вводили путем инфузии добавлением 100 мкл 1Н НС1 в каждую лунку. Поглощение в лунках считывали при 490 нм на спектрофотометре для прочтения планшетов ЗресйаМах250 производства Мо1еси1аг ЭеОсек Определяли среднее поглощение, рассчитанное по трем лункам, для каждого условия, и полученные в результате этого значения обрабатывали для расчета ЕС₅₀ с помощью программного обеспечения Отарй Раб РгЙ1Ц чтобы получить 95% доверительный интервал. Данные интервалы указаны ниже в табл. 9.

Связывание вариантов ΟΌΝΡ человека с гепарином с применением ЕБ1ЗА.

ΟΌΝΡ дикого типа и его варианты исследовали методом ЕЬРЗА, в котором измеряли связывание белков ΟΌΝΕ с гепарином, адсорбированным на планшете. Условия без ΟΌΝΡ использовали в качестве отрицательного контроля.

Каждую лунку 96-луночного планшета для связывания гепарина (ВЭ ВюЗаепсек Нерапп Вшбшд Р1а1е8, номер в каталоге 354676) покрывали 70 мкл гепарина (смесью гепаринов разных молекулярных весов от З1дта, натриевой солью гепарина, приобретенной в Ротсше 1п1е8Йпа1 Мисока, номер в каталоге Н-3149) в концентрации 5 мкг/мл в ФБР. Планшеты запечатывали и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи с защитой от света. Из лунок отсасывали жидкость и промывали три раза буфером для промывки, применяя устройство для автоматической промывки планшетов. Планшеты блокировали 200 мкл блокирующего буфера на лунку в течение 90-120 мин при 37°С (для данной инкубации планшеты запечатывали). Планшеты промывали дважды буфером для промывки.

Г отовили серийные разведения ΟΌΝΡ в блокирующем буфере в подходящем диапазоне концентраций, обычно начиная с 5 мкг/мл и заканчивая серийным разведением 1:10. Использовали контроль без ΟΌΝΡ, состоящий только из блокирующего буфера. Аликвоту объемом 50 мкл каждого раствора ΟΌΝΡ добавляли в покрытые гепарином лунки в трех повторах. Планшеты инкубировали в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки.

Аликвоту объемом 50 мкл биотинилированного антитела против ΟΌΝΡ человека, разбавленного до концентрации 1 мкг/мл в блокирующем буфере, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение от 45 мин до 1 ч при комнатной температуре. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки.

Аликвоту объемом 50 мкл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 20-30 мин при комнатной температуре. В качестве альтернативы можно использовать разведение 1:2000 и инкубировать в течение 30-90 мин. Затем трижды промывали лунки буфером для промывки. Аликвоту объемом 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата ОФД) добавляли в каждую лунку и позволяли окраске развиться при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Реакцию вводили путем инфузии добавлением 100 мкл 1Ν НС1 в каждую лунку. Поглощение в лунках считывали при 490 нм на спектрофотометре для прочтения планшетов. Определяли среднее поглощение, рассчитанное по трем лункам, для каждого условия, и полученные в результате этого значения обрабатывали для расчета ЕС50 с помощью программного обеспечения Отарй Раб Рпкт, чтобы получить 95% доверительный интервал. Данные интервалы указаны ниже в табл. 9.

- 11 025129

Варианты	Кол-во экспериментов .(п)	Связывание СРК«1,£С5о 95% д оверител ь ны й интервал	Кол-во экспериментов .01)	Связывание гепарина, ЕС»о 95% доверительны й интервал
Е. СоН-ДТОШЧГ (8ΕΟ Ю N0:3)	8	0,3 - 0,4 нМ	10	0,2 - 0,4 нМ
СНО Δ31 ΟΟΝΡ (3Εζ) ГО N0:8)	14	0,3 - 0,6 нМ	16	2,0 - 5,0 нМ
СНО Δ31- N380- О95Е ΟΟΝΡ (8Е0ГО N0:9)	4	0,3-1,9 нМ	3	19,8-41,3 нМ
СНО Δ31- N380- К.84А- В.88К- К90КГО95Е ΟΟΝΓ (8Е0 ГО N0:12)	5	Невозможно определить; отсутствует максимальное плато для 4 из 5 экспер.	5	Невозможно определить; отсутствует максимальное плато для 4 из 5 экспер.
СНО Δ31- N380- К84А- К88К- К90К-Э95Е -К125Е- К130Е ΟΟΝΡ (8Е0 ГО N0:15)	1	Наблюдалось слабое связывание или отсутствие связывания при данном ЕЫ8А	1	Наблюдалось слабое связывание или отсутствие связывания при данном ЕЫ8А

* провели 2 отдельных эксперимента, ' не комплекс

Таблица 9

Полученные результаты показывают, что делеция 31 Ν-концевой аминокислоты (вариант, названный СНО Δ31 ΟΌΝΕ) в ΟΌΝΕ дикого типа (названном ДТ Е. Сой ΟΌΝΕ) может значительно уменьшать связывание с гепарином (приблизительно в 10 раз), при этом сохраняется связывание с рецептором ОРКоТ, и данные результаты дополнительно свидетельствуют о том, что с помощью дополнительных вариантов ΟΌΝΕ человека можно достичь множества различных свойств связывания гепарина и рецептора.

Пример 4. Активности ίη νίΐτο.

Анализ разрастания нейритов N8-1.

Влияние ΟΌΝΕ на дифференцировку нервных клеток оценивали, применяя клетки крысы Ыеиго5СГССП-1 (субклон РС12). Указанные клетки поддерживали в минимальной среде Р-12К, дополненной 12,5% термоинактивированной лошадиной сыворотки, 2,5% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ΕΒδ), 1Х С1и1аМАХ™ (Ιηνίίτο^η, номер в каталоге 35050061) и 1Х антибиотикомантимикотиком ΑηΙί-αηΙί ОпуПгсщсп. номер в каталоге 15240), при 37°С, влажности 95%, на покрытых коллагеном флаконах. Для измерения разрастания нейритов клетки №иго8Сгеен-1 высевали на 96луночные планшеты, покрытые коллагеном Ι типа, в количестве 2200 клеток на лунку в ростовой среде, используя только внутренние 60 лунок. Через 24 ч, отведенные на прикрепление клеток, среду удаляли и добавляли новую ростовую среду, содержащую ΟΡΚαΤ-Рс в концентрации 1 мкг/мл плюс ΟΌΝΡ, разбавленный в серии 8-кратных разведений, либо в три, либо в шесть лунок планшета на концентрацию. Среду с добавлением 1 мкг/мл ΟΡΚαΤ-Рс включили в качестве отрицательного контроля, а среду с добавлением 25 нг/мл фактора роста нервов включили в качестве положительного контроля ответа клеток в данном анализе. Планшеты инкубировали в течение 96 ч при 37°С, влажности 95%, а затем фиксировали путем добавления 45 мкл фиксажа в каждую лунку и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывали дважды 1Х буфером для промывки из набора №ип1е ОиЩгслуФ Ηίΐ Κίί™ (Се11от1С8, номер в каталоге К07-0001-1), а затем промывали дважды 1Х буфером из указанного набора. Клетки подвергали иммунному окрашиванию реагентами из набора для выявления разрастания нейритов, следуя инструкциям производителя. Планшеты загружали в устройство Аггауъсап и анализировали, применяя программное обеспечение Аггауъсап и алгоритм №игопа1 Ргой1ш§ от Се11отю8. Данные, сгенерированные указанным алгоритмом, обрабатывали для расчета ЕС₅₀ с помощью программного обеспечения Огарй Раб Рг18щ.

Несколько вариантов исследовали на влияние на дифференцировку нервов, наблюдаемые ЕС₅₀ для каждого варианта приведены в табл. 10А.

- 12 025129

Таблица 10А

ΟΌΝΕν: разрастание нейритов N8-1

ΟΟΝΤν	Повторности	(95% доверительный интервал)
КСоЛ-ДТ-ΟΟΝΡ (ХЕО ГО N0:3)	3	33 - 200 пМ
СНО-ЛЗ 1-ΠΟΝΕ (5ЕЦ ГО N0:8)	17	42-82 пМ
СНО-ЛЗ 1-Ν380-095Е-СО.ЧГ (5Е0 ГО N0:9)	5	47 - 227 пМ
СНО-ЛЗ 1-Ν38Ο-Κ84 А-К88КΚ90Κ-Ο95Ε-ΟΟΝΡ (5ЕЦ ГО N0:12)	5	52-384 пМ
СНО-ЛЗ 1-Ν380-Κ84Α-Κ88ΚК90К-О95Е-К125Е-К1ЗОЕΟϋΝΡ (5ЕО ГО N0:15)	2

а

Нет данных вследствие либо низкой эффективности, либо невозможности достичь максимального плато.

Все исследованные в данном анализе образцы ΟΌΝΕ проявили разные степени активности в тесте на разрастание нейритов. Кривые зависимости от дозы для варианта Δ31-Ν38Ο-Κ84Α-Ρ88Κ-Ρ90Κ-Ό95ΕΚ125Ε-ΚΓ30Ε не достигали плато при максимальной дозе в двух проведенных экспериментах, поэтому рассчитать ЕС₅₀ невозможно. Диапазоны 95% доверительных интервалов ЕС₅₀ для других четырех вариантов ΟΌΝΕ перекрываются, что указывает на близкие уровни активности в данном анализе.

Фосфорилирование рецептора с-Ке!.

Анализ фосфорилирования рецептора с-Кс1 можно применять для демонстрации индукции фосфорилирования рецептора с-Ке! в положении Υ1016. Активность ΟΌΝΕ по отношению к фосфорилированию рецептора с-Ке! оценивали в клетках линии нейробластомы человека 8Η-8Υ5Υ (АТСС), которые были стабильно трансфицированы для сверхэкспрессии с-Ке! человека. Указанные клетки поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), дополненной 10% РВ8, 3 мкг/мл бластицидина. Для фосфорилирования с-Ке! клетки высевали в количестве 5x10 на лунку в 24-луночные покрытые коллагеном планшеты в ростовой среде без бластицидина и позволяли им прикрепиться в течение ночи. Среду заменили на ΌΜΕΜ с низким содержанием глюкозы + 0,25% БСА (бычий сывороточный альбумин) на 24 ч. Среду для голодания клеток удаляли и клетки обрабатывали ΟΌΝΕ в безглюкозной ΌΜΕΜ с добавлением 0,25% БСА и 1 мкг/мл ОРКа1-Рс в течение 30 мин при 37°С. Каждый вариант ΟΌΝΕ тестировали в различных концентрациях. После обработки среду удаляли и клетки соскребали с поверхности планшета в ледяном лизирующем буфере, содержащем экстракционный реагент Μ-Рег + коктейль ингибиторов протеаз, ингибитор фосфатаз 1, коктейль ингибиторов фосфатаз 2 и коктейль ингибиторов фосфатаз 3 (8щта™). Суспензии клеток встряхивали на вортексе до полного лизиса, центрифугировали при 14000 д, чтобы осадить обломки клеток, и измеряли концентрацию белка в супернатанте, применяя реагенты для анализа с помощью бицинхониновой кислоты (БХК). Для каждого лизата ΟΌΝΕ 10 мкг белка разделяли посредством электрофореза в 4-12% бис-трис гелях ΝηΡΑΟΕ® Nονеx® ОшЦгодеп. номер в каталоге ΝΡ0322) и переносили на поливинилиденфторидную (ПВДФ) мембрану. Ке!, фосфорилированный по 1016 тирозину (тирозин-1016-фосфо-Ке!), выявляли с помощью поликлональных антител кролика и антитела козы против антител кролика, меченного пероксидазой хрена (НКР); и с-Ке! выявляли с помощью моноклонального антитела мыши и антитела козы против антител мыши, меченного НКР. Блоты проявляли с помощью реагентов 8ирет81дпа1 Ае§! Рюо™ (ТНегто 8с1епййс, номер в каталоге 34081) и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Пять вариантов ΟΌΝΕ (ДТ Ε. сой ΟΌΝΕ, СНО Δ31 ΟΌΝΕ, СНО Δ31-Ν38Ο-Ό95Ε ΟΌΝΕ, СНО Δ31Ν38Ρ-Κ84Α-Κ88Κ-Κ90Κ-Ό95Ε ΟΌΝΕ и СНО Δ31-Ν38Ρ-Κ84Α-Κ88Κ-Κ90Κ-Ό95Ε-Κ125Ε-Κ130Ε ΟΌΝΕ) исследовали в безглюкозной среде ΌΜΕΜ, содержащей 0,25% БСА + 1 мкг/мл СРКа1-Рс, на фосфорилирующую активность по отношению к с-Ке! в семи концентрациях, составляющих 0,8, 2,0, 4,0, 10, 20, 50 и 100 нг/мл. В качестве отрицательных контролей также тестировали образцы: только среда, среда + 1 мкг/мл СРКа1-Рс и среда + 100 нг/мл СНО Δ31 ΟΌΝΕ. Каждый из пяти вариантов ΟΌΝΕ вызывал фосфорилирование с-Ке! с ΕС5₀, равной 8-15 нг/мл. Полученные результаты демонстрируют, что все пять вариантов ΟΌΝΕ индуцируют дозозависимое фосфорилирование Υ1016 с-Ке!.

В табл. 10В показано, что искусственные Δ31-N-укороченные варианты ΟΌΝΕ, которые демонстрировали существенные улучшения биофизических и биохимических свойств (табл. 5, 6, 9 и 10А), сохранили оптимизированные биологические свойства, например сравнимое связывание рецептора ΟΕКα1, сниженное связывание с гепарином и сравнимое разрастание нейритов, после 4 недель инкубации при 37°С.

- 13 025129

Таблица 10В

Сравнение биологической активности ДТ- Е. сой ΟΌΝΕ и Д31-Н-укороченных вариантов ΟΌΝΡ после 4 недель инкубации при 37°С по сравнению с образцами, инкубированными при 4°С

	ДТ- Е. соН СГЖР (5>Е<3 ГО ΝΟ: 3)	СНО-Д31ΟϋΝΡν (ЗЕО Ю ΝΟ: 8)	СНО-Д31- Ν38(3-ϋ95ΕΟΟΝΤν (5ЕЦ ПЭ ΝΟ: 9)	СНО-Д31-МЗД- К84А-К88К- К90К-О95Е- ΟϋΝΡν (3ΕΟΙΟΝΟ: 12)
	4’С	37 “С	4°С	37’С	4’С	37 Т	4 °С	37 *С
ОРКа-1 (В1асоге, Кл, лМ}	64 ± 23	ни	29 ±17	ни	30 ± 14	ни	29 ± 14	ни
ОРКа-1 (ЕЫЗА, ЕС*. иМ)	0,4	ни	0,6	пи	0,8	ни	н&	но
Гепарин (ЕЫ8А, нМ)	0,3	0,4	2,7	5,/	18,0	ни	но	но
Разрастание нейритов (диапазон ОД, пМ)	33-200	ни	42-32	ни	47-227	ни	52-384	нд

Нет данных (нд);

Не определено (но); Нет изменений (ни)

Пример 5. Активность вариантов ΟΌΝΡ в анализах метаболизма дофамина (ДА).

Самцов крыс линии Зргадие-ПаМеу обезболивали, применяя изофлуран (3% в О₂). Голову брили и стерилизовали раствором йода, а затем фиксировали животное в стереотаксической рамке с терморегулируемой подложкой. Глаза защищали с помощью офтальмологического геля и поддерживали анестезию с помощью изофлурана (1-2% в О₂).

На голове животного делали срединный разрез, кожу черепа и находящуюся под ней ткань отгибали и осушали череп, чтобы было видно брегму. Для инфузии ΟΌΝΕ отмеряли координаты хвостатого ядра от брегмы и поверхности твердой мозговой оболочки. Инфузионный катетер 28 калибра медленно погружали в данном положении и спустя 1 мин начинали инфузию с применением насоса. Разовую дозу 2 мкл тестируемого ΟΌΝΕ вводили инфузией в левое полушарие в течение 4 мин при скорости потока 0,5 мкл/мин и оставляли катетер на месте в течение дополнительных 3 мин после прекращения инфузии. Сразу после удаления катетера место разреза зашивали, вводили послеоперационный анальгетик и позволяли животному восстановиться в клетке с контролируемой температурой перед переносом в домашнюю клетку. После операции животных проверяли в соответствии с местным руководством по этике. Через подходящий промежуток времени после инфузии умерщвляли животное, удаляли головной мозг, хвостатые ядра аккуратно иссекали, взвешивали и замораживали до момента проведения анализа ВЭЖХ на дофамин и метаболиты.

Замороженной ткани позволяли быстро оттаять и гомогенизовали ее в 0,5 мл буфера для гомогенизации (0,1 М перхлорная кислота (ПХК), 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 2,5 мг/л аскорбиновой кислоты) перед центрифугированием при 20000 д в течение 15 мин. Супернатант удаляли и фильтровали через фильтрующее устройство без шприца. Анализ на дофамин (ДА), дигидроксифенилуксусную кислоту (ДОФУК) и гомованилиновую кислоту (ГВК) осуществляли методом ВЭЖХ с детектированием электрохимическим детектором. Впрыскивали аликвоту объемом 20 мкл каждого образца и осуществляли количественный анализ с использованием внешней калибровочной кривой (ЬС-4С, ΒΑδ, США). Подвижная фаза состояла из 100 мМ №Н₂РО₄. 100 мМ Н₃РО₄, 2 мМ растворимой в масле кислоты (РМК), 1 мМ ЭДТА, 13% метанола (МеОН), рН 2,8, использовали колонку С18 Нуреткй ΒΌδ (кремний, деактивированный основанием) (Тйетшо δ^ιιΙίΓχ, номер в каталоге 28105) размером 150x3,0 мм с диаметром частиц 3 мкм при 40°С. Результаты регистрировали, применяя программное обеспечение для хроматографии Ешро^ет. Осуществляли 4-параметрическую логарифмическую аппроксимацию всех данных, а затем представляли их в виде нг/г сырой массы ткани. Меру метаболизма дофамина выражали в виде (ДОФУК+ГВК)/ДА и осуществляли сравнение левого полушария (обработанного) с правым полушарием (интактным).

- 14 025129

Таблица 11

Вариант	Метаболизм дофамина	Метаболизм дофамина
	Обработанное (левое)	Интактное (правое)
Е. соЛ-ДТ ΟΠΝΕ (5Е<2 ГО N0:3)	0,25 ± 0,025	0,15 ± 0,008
СНО-ДЗ 1-ΟΟΝΕ (ЗЕС) ГО N0:8)	0,25 ±0,016”'	0,14 ± 0,006
СНО-ДЗ 1-Ν380-Ο95Ε-ΟΓ)1\Τ (ЗЕО ГО N0:9)	0,25±0,018	0,13±0,007
СНО-ДЗ1-Ν38Ο-Κ84Α-Κ88Κ- К90КГО95Е -ΟΟΝΡ (8ЕО ГО ΝΟ: 12)	0,20±0,015	0,13±0,012
СНО-ДЗ 1-Ν38Ο-Κ84Α-Κ88Κ- Κ90Κ-Ο95Ε-Κ125Ε-Κ130Ε-ΟΟΝΤ (8Ε0ΙΟΝΟ15)	0,19±0,021 ”	0,14 ±0,011

Значения представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, η=5 на группу ** р< 0,01 или *** р<0,001 по сравнению с интактной стороной

Представленные результаты демонстрируют, что каждый из вариантов ΟΌΝΡ, перечисленных в табл. 11, значительно повышал метаболизм дофамина в обработанном полушарии по сравнению с интактным полушарием.

Пример 6. Анализы ίη νί\Ό.

Модель дегенеративного нарушения, вызванного 6-гидроксидофамином (6-ГДА).

Самцов крыс линии §ргадие-ПаМеу обезболивали, применяя изофлуран (3% в О₂). Голову брили и стерилизовали раствором йода, а затем фиксировали животное в стереотаксической рамке с терморегулируемой подложкой. Глаза защищали с помощью офтальмологического геля и поддерживали анестезию с помощью изофлурана (1-2% в О2).

На голове животного делали срединный разрез, кожу черепа и находящуюся под ней ткань отгибали и осушали череп, чтобы было видно брегму. Отмеряли координаты хвостатого ядра от брегмы и поверхности твердой мозговой оболочки для инфузии 10 мкг 6-гидроксидофамина (6-ГДА). Инфузионный катетер 28 калибра медленно погружали в данное положение, и спустя 1 мин начинали инфузию. Разовую дозу 2 мкл 6-ГДА вводили путем инфузии в левое полушарие в течение 4 мин при скорости потока 0,5 мкл/мин и оставляли катетер на месте в течение дополнительных 3 мин после прекращения инфузии.

Через 30 мин после инфузии 6-ГДА вводили путем инфузии тестируемый ΟΌΝΡ, используя тот же протокол. Координаты для инфузии ΟΌΝΡ были следующими: передне-заднее положение +1,0, боковоесреднее -2,5, дорсально-вентральное -4,5 мм от брегмы и поверхности твердой мозговой оболочки, как и ранее.

Сразу после удаления катетера место разреза зашивали, вводили послеоперационный анальгетик и позволяли животному восстановиться в клетке с контролируемой температурой перед переносом в домашнюю клетку. После операции животных исследовали в соответствии с местным этическим руководством. Через подходящий промежуток времени после инфузии умерщвляли животное, удаляли головной мозг и хвостатые ядра, черное вещество аккуратно иссекали, взвешивали и замораживали до момента проведения анализа ВЭЖХ на дофамин и метаболиты.

Замороженной ткани позволяли быстро оттаять и гомогенизовали ее в 0,5 мл буфера для гомогенизирования (0,1 М ПХК, 0,1 мМ ЭДТА, 2,5 мг/л аскорбиновой кислоты) перед центрифугированием при 20000 д в течение 15 мин. Супернатант удаляли и фильтровали через фильтрующее устройство без шприца. Анализ дофамина (ДА), ДОФУК и ГВК осуществляли с применением ВЭЖХ с обнаружением электрохимическим детектором. Впрыскивали аликвоту объемом 20 мкл каждого образца и осуществляли количественный анализ с использованием внешней калибровочной кривой. Подвижная фаза состояла из 100 мМ NаН₂РО₄, 100 мМ Н₃РО₄, 2 мМ РМК, 1 мМ ЭДТА, 13% МеОН, рН 2,8, использовали колонку С18 ВЭ5> НурегзП размером 150x3,0 мм с диаметром частиц 3 мкм при 40°С. Результаты регистрировали, применяя программное обеспечение для хроматографии Етро^ег. Осуществляли 4-параметрическую логарифмическую аппроксимацию всех данных, а затем представляли их в виде нг/г сырой массы ткани. Осуществляли сравнение левого полушария (обработанного) с правым полушарием (интактным).

- 15 025129

Таблица 12

Хвостатое ядро

Вариант	Дофамин (нг/г)	Дофамин (н г/г)	% истощения
	Обработанное (левое)	Интактное (правое)
Среда	2617,59 ±526,91 *	14033,40 ±408,75	81,35
£.со//-ДГ- СОЖ (5Е<! Ю N0:3)	2707,72 ± 725,92	14805,36 ±536,71	81,71
СНО-Д31- СГОЖ ГО N0:8)	2023,86 ±818,03 '	14456,09 ±691,53	86,00
СНО-Д31- Ν38<2-ϋ95Ε- ООЖ (5Ε9 ГО N0:9)	2676,57 ± 558,37 ’	14986,15 ±931,85	82,14
СНО-Д31- Ν38Ο-Κ84Α- Κ88Κ-Κ90Κ- ϋ95Ε -ΟΟΝΡ (8Ε<3 Ю ΝΟ: Π)	3112,14 ± 717,45	13730,74 ± 1238,50	77,33

Значения представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, п=8 на группу ***р<0,001 по сравнению с интактной стороной

Таблица 13

Черное вещество

Вариант	Дофамин (нг/г)	Дофамин (нг/г)	% истощения
	Обработанное (левое)	Интактное (правое)
Среда	571,33 ± 90,65 *”	990,73 ± 134,48	42,33
£Со/;-ДТ- СГОЖ (ЗР-О ΓΟΝΟ: 3)	836,51 ±97,15	1167,38 ±62,07	28,34
СНО-Д31- СОЖ (5Е<3 Ю ΝΟ: 8)	856,48 ±75,45	1160,82 ± 100,56	26,22
СНО-ДЗ,- Ν380-Ο95Ε- СОЖ (ЗЕО ГО ΝΟ: 9)	903,68 ± 52,60 *’	1152,24 ± 115,61	21,57
СНО-Д31- Ν38Ο-Κ84Α- К88К-К90К- ϋ95Ε ΟΟΝΡ (5ЕС) ГО ΝΟ: 12)	970,06 ± 108,05 “	1174,45 ± 134,94	17,40

Значения представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего, п=8 на группу *р<0,05, ** р< 0,01 или *** р<0,001 по сравнению с интактной стороной # р<0,05, ## р<0,01 по сравнению со средой (для обработанной стороны)

Введение 6-ГДА в хвостатое ядро приводило к существенному снижению уровней дофамина в обработанной стороне по сравнению с интактной стороной (табл. 12). В черном веществе также наблюдался существенный недостаток (табл. 13), который предотвратили введением ΟΌΝΡ. Результаты для всех протестированных в данном анализе вариантов ΟΌΝΡ значительно отличались от результатов для среды при сравнении обработанных сторон.

Кратковременное биораспределение в головном мозге крысы.

Самцов крыс линии 8ргадис-0а^1су обезболивали, применяя изофлуран (3% в О₂). Голову брили и

- 16 025129 стерилизовали раствором йода, а затем фиксировали животное в стереотаксической рамке с терморегулируемой подложкой. Глаза защищали с помощью офтальмологического геля и поддерживали анестезию с помощью изофлурана (1-2% в О₂).

На голове животного делали срединный разрез, кожу черепа и находящуюся под ней ткань отгибали и осушали череп, чтобы было видно брегму. Для инфузии ΟΌΝΡ отмеряли координаты хвостатого ядра от брегмы и поверхности твердой мозговой оболочки (передне-заднее положение +0,5, боковоесреднее -3,0, дорсально-вентральное -5,5 мм). Инфузионный катетер 30 калибра медленно погружали в данное положение и спустя 1 мин начинали инфузию (применяя насос). Разовую дозу 2 мкл тестируемого ΟΌΝΡ вводили путем инфузии в левое полушарие в течение 4 мин при скорости потока 0,5 мкл/мин и оставляли катетер на месте в течение дополнительных 3 мин после прекращения инфузии. Сразу после удаления катетера место разреза зашивали, вводили послеоперационный анальгетик, а затем позволяли животному восстановиться в клетке с контролируемой температурой. Через подходящий промежуток времени после инфузии умерщвляли животное и головной мозг удаляли и замораживали до момента изготовления криосрезов для иммуногистохимии.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) ΟΌΝΡ в головном мозге крысы.

Биораспределение введенного ΟΌΝΡ исследовали в иммуногистохимическом анализе, в котором измеряли связывание антитела с введенным путем инфузии антигеном (ΟΌΝΡ и вариантами ΟΌΝΡ) в головном мозге крыс. Изотипическое контрольное антитело использовали в качестве отрицательного контроля.

Получение криосрезов из замороженного головного мозга крыс начинали с отсекания мозжечка внутри криостата при -20°С с использованием шаблона головного мозга крысы для получения плоской поверхности. Состав Орйша1 Сийид ТешрегаШге™ (ОСТ, от §акига или других аналогичных поставщиков) помещали на охлажденный криостатный фиксатор для образца. По мере замерзания ОСТ плоскую каудальную поверхность головного мозга крысы помещали на фиксатор для образца, применяя охлажденный до -20°С пинцет, таким образом, что ОСТ закреплял головной мозг на месте, при этом самая передняя часть головного мозга была повернута в направлении от фиксатора образца. Фиксатор для образца помещали в держатель объекта и закрепляли. После того как лезвие микротома было вставлено в держатель ножа, использовали функцию подрезки на криостате, чтобы отбросить обонятельные луковицы, а также часть головного мозга, расположенную спереди от следа инфузии. Делали срезы толщиной 8 мкм с интервалами по 300 мкм и помещали на положительно заряженные предметные стекла. На каждое предметное стекло помещали по два или три сделанных подряд среза для каждого головного мозга крысы. Стекла затем помещали в 4% параформальдегид при комнатной температуре на 20 мин и промывали в буфере для промывки - буферном растворе трис, содержащем Т\уееп-20 (ΤΒδΤ). Применяя раствор для окрашивания при комнатной температуре, стекла инкубировали в течение 10 мин с двойным реагентом для блокировки эндогенных ферментов, промывали буфером для промывки ΤΒδΤ, инкубировали в течение 15 мин с каждым из блокирующих реагентов авидином и биотином, промывали буфером для промывки ΤΒδΤ, блокировали с помощью блокировки белка в течение 60 мин и сдували со стекла, применяя воздушный нож. Биотинилированное антитело против ΟΌΝΡ человека или биотинилированные ΙβΟ козы разбавляли в разбавителе для антител с агентами, уменьшающими фоновое окрашивание, до концентрации 2 мкг/мл и инкубировали с ними стекла в течение 60 мин, затем трижды промывали буфером для промывки ΤΒδΤ. Стекла инкубировали с меченым стрептавидином-биотином 2 (ΡδΑΒ2) (Нако, номер в каталоге К0609) в течение 10 мин и промывали буфером для промывки ΤΒδΤ. Стекла инкубировали с ΌΑΒ+ 2 капли ΌΑΒ в разбавителе ΌΑΒ в течение 5 мин, затем промывали буфером для промывки ΤΒδΤ, а затем споласкивали дистиллированной водой. После удаления стекол из автоматизированной системы окрашивания (автостейнера), осуществляли контрастное окрашивание гематоксилином™ и заклеивали покровными стеклами, применяя Су!озеа1 ХУЪ™ (Ъ1еркеп5 δ^ηΙίΓία, номер в каталоге 8312-4). Стеклам позволяли высохнуть, а затем анализировали их, применяя Арепо ΧΤ для измерения биораспределения.

Измерение биораспределения ΟΌΝΡ в головном мозге крысы.

Изображения со стекол получали с 20х увеличением с помощью сканирующей системы Арепо δсаηδсοре ΧΤ (запускали программное обеспечение СойтоПег версии 10.00.00.1805). Метаданные со стекол хранили в доступном через сеть программном обеспечении δресΐ^ит (версии 10.0.1346.1806) от Арепо.

Каждый срез головного мозга обводили вручную, применяя программное обеспечение для визуализации изображений Iтадеδсοре (версии 10.0.36.1805) от Арепо. Для первого исследования обводили срез целого головного мозга с наименьшим количеством видимых артефактов изготовления срезов. Для второго исследования обводили срез целого головного мозга, расположенный ближе всего к маркировке стекла. Каждый обведенный участок анализировали, применяя алгоритм РозДтуе Р1хе1 СоиШ (версии 9) от Арепо [все параметры оставили установленными по умолчанию за исключением увеличения изображения = .01 и порога интенсивности Слабый (верхний предел) = 235].

Площадь распределения ΟΌΝΡ в мм² для каждой крысы вычисляли путем сложения положительных и резко положительных площадей, вычисленных с помощью алгоритма положительных пикселей.

- 17 025129

Статистическую значимость определяли с помощью парного критерия Стьюдента.

Таблица 14

Биораспределение ΟΌΝΡν в головном мозге крысы

ΟΒΝΡν	Средняя площадь распределения (мм2)
ЕСой-ДТ-ΟϋΝΡ (5ЕЦ ГО N0: 3)	7,05 + 2,92 Эксперимент 1 9,16 ± 4,19 Эксперимент 2
СНО-ΔΪΙ-ΟΌΝΡ (3Εζ> ГО N0: 8)	16,07 ± 5,69* Эксперимент 1 20,88 ± 6,56** Эксперимент 2
СНО-Δί 1-Ν38φ-Ο95ΕΟϋΝΓ (8Е<3 ГО N0: 9)	17,91 ± 1,47** Эксперимент?
СНО-ДЗ1-Ν3 8О-К84 АК88К-К90КГО95ЕΟϋΝΡ (8Е<2 ГО N0: 12)	20,86 ± 3,54** Эксперимент 2
Среда (ФБР, отрицательный контроль)	0,41 + 0,25 Эксперимент 1
1§О (отрицательный контроль)	0,01 ±0,03 Эксперимент 1

* Для Δ31, р<0,003 по сравнению со средой, 1§С и Е.соП-ДТ-СЭЖ, ** Статистически значимый по сравнению с Е. соН ДТ-ΟΟΝΕ. р<0,05

Результаты ЕЫ§Л по связыванию гепарина (табл. 9) показали, что модификации, введенные в ΟΌΝΡ дикого типа, могут уменьшать связывание с гепарином по сравнению с Е. соП-ДТ ΟΌΝΡ. Эти результаты вместе с результатами эксперимента по биораспределению, показанными выше в табл. 14, подтверждают, что варианты, которые уменьшают связывание с гепарином, могут приводить к повышению биораспределения в головном мозге крысы. Варианты И38О-Э95Е и №8р-К84А-К88К-К90К-Э95Е, перечисленью в таблице выше, обладают повышенным биораспределением по сравнению с Е. соН-ДТΟΌΝΡ.

Новые варианты ΟΌΝΡ согласно настоящему изобретению предпочтительно входят в состав фармацевтических композиций, которые можно вводить различными путями. В наиболее предпочтительном случае такие варианты ΟΌΝΡ предназначены для парентерального или интракраниального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. См., например, РепипдЮп: ТНс §аеисе апй Ртасйсе о£ Ркаттасу (А. Сеииаго, и др., ред., 19^ое изд., Маск РиЬБкЫпд Со., 1995).

Терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество нового варианта ΟΌΝΡ согласно настоящему изобретению, которое необходимо, чтобы принести пациенту терапевтическую пользу. Очевидно, что количество варианта ΟΌΝΡ, которое фактически вводят, должен определять врач в свете соответствующих обстоятельств, включая состояние, от которого лечат, выбранный путь введения, фактически вводимый активный агент, возраст, вес и ответ конкретного пациента, а также тяжесть симптомов пациента.

- 18 025129

Перечень последовательностей <5Εζ> ГО ΝΟ: 1; ПРТ1; Нолю $ар>еп$>

МКЬ\УБУУАУСЬУЬЬНТА8АРРЬРАОККРРЕАРАЕОК5ЬОККК.АРРАЬ58О8НМРЕ ^ΥΡ^^Ρ^^VΜ^ΡI^ΑΤIΚΚ^ΚΚ8Ρ^Κ^ΜΑV^ΡΚΚΕΚNΚ^ΑΑΑΑNΡΕNЗΚ.6ΚСΚΚ

С9КСК1ЧКСС\ЪТА!НЬКУТОЬСЬО¥ЕТКЕЕЫРКУС8С8СОААЕТТ¥ОК1ЬК>Я.5К

ЖКЬУ8ОКУС9АССКР1АРОООЬ8РЬООМЬУ¥Н1ЬККН5АККСССГ <8Е<> ГО N0: 2; ДНК; Ното зар1еп5>

АТОААОСТОТСООАСОТООТООССОТОТОССТООТОСТОСТОСАСАССОССАО

СОСТТТСССАСТОССАОСССССААОАОАСССССАОАСОССССАОССОАООАСА

ОААОССТОСОСАООСООАОООССССАТТСОСССТОАОСАОСОАСАОСААСАТО

ССАОАСОАСТАССССОАССАОТТССАСОАССТСАТООАСТТСАТССАООССАС

САТСААСАООСТСААОАСОТСАССССАСААССАОАТОСССОТССТССССАОСС

ОСОАОАООААСАООСАООССОССОССОССААСССАОАОААТТССАООООСАА

ОООСАОААООООТСААСООООСААОААСАООООСТОСОТОСТСАССОССАТС

САССТОААСОТОАССОАССТОООССТОООСТАСОАОАССААООАООАОСТОАТ

СТТСАООТАСТСЗСАОСООСАОСТОССАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОА

ТССТСААОААССТОАОСАОСААСАООСООСТОСТСТССОАСААОСТОООССАО

ОССТОСТОСАСОСССАТССССТТСОАСОАСОАССТОАССТТССТООАСОАСААС

СТОСТСТАССАСАТССТСАСОААОСАСАОСОССААОАСАТОССКЗСТОСАТС <ЗЕф ГО N0: 3; ПРТ1; Ното 8ар»еп$>

3ΡΟΚςΜΑνΕΡΚΚΕΚΝΚ0ΑΑΑΑΝΡΕΝ3ΚΟΚΟΚΚ(Χ3ΚΟΚΝΚΟ€νΤΤΑΙΗΕΝνΤΟΕΟ

ЕОУЕТКЕЕЕ1РКУС5СЗСОААЕТТУОК1ЕКХ1Е51ШР1и_УЗОКУОрАССКР1АРООО

ЬЗРЕООМЪУУНГЕККНЗАККСОС1 <ЗЕ<> ГО N0: 4, ПРТ1; Ното 5ар1епз>

МКЬТОУУАУСЬУЬЬНТАЗА <ЗЕр ГО N0: 5; ПРТ1; Ното зар1еп8>

ΡΡΕΡΑΟΚΚΡΡΕΑΡΑΕΟΚδΕαΚΚΚΑΡΡΑΕδδΌδΝΜΡΕΟΥΡΟί^ΡΟΟνΜΌΡίρΑΊΊΚΚΕΚ

К <5Е() ГО N0: 6; ДНК; Праймер>

ТАТАСАТАТСССТООАСААСОТООТАААААССОТООТТСТСТССТС <8Εζ> ГО N0; 7; ДНК; Праймер>

ООТОСТСОАОТТАТТАААТОСАОССОСААСОТТТСОСОСТ <8Еф ГО N0: 8; ПРТ1; Ното зар1еп5>

КС^КСКЖССУЬТАШЕНУТБЬОЬОУЕТКЕЕЫРКУСЗОЗСОААЕТТУСКГОКЫЬЗ

КМККЬУЗСКУООАССКР1АРОПОЬ8РЬООМ,У¥НГОККН5АККСОС1 <ЗЕ<3 ГО N0: 9; ПРТ1; Искусственная последовательность?

КООКОКрКОСУЬТАГНЬНУТОЕОЬОУЕТКЕЕЫРКУСЗОЗСОААЕТТУОКГОКМЬЗ

КМККЕУ5ЕКУОВАССКРТАГОООЕ5РЕООНЕУУНГОККН5АКК.СОС1 <3Εζ) ГО N0: 10, ДНК; Искусственная последовательность?

АТОААОСТОТОООАСОТООТООССОТОТСССТСЮТОСТССТОСАСАССОССАО

СОСТТТСССАСТОССАОССООСААОАОАСССССАСАООССССАОССОА6ОАСА

ОААОССТОООСАООСООАООСССССАТТСОСССТОАОСАОСОАСАОСААСАТО

ССАСАООАСТАССССОАССАОТТСОАСОАСОТСАТСОАСТТСАТССАССССАС

САТСААСАООСТОААСАССТСАСССОАСААССАОАТОСССОТОСТОСССАООС бООАОАООААСАООСАОСЗСССССОССОССААСССАСАОААТТССАССООСАА

ОООСАОААООСЮТСААССОСЮСААОСАОАООООСТОСаТОСТОАССОССАТС

САССТСААСОТОАССОАССТОООССТОООСТАСОАОАССААООА(ЗОАОСТОАТ

СТТСАООТАСТССАССОССАОСТССОАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОА

ТССТОААОААССТОАССАООААСАООСООСТСЮТСТССОАОААСЮТОООССАО

СССТОСТОСАООСССАТССССТТСОАСОАСОАССТОАОСТТССТООАСОАСААС

СТООТОТАССАСАТССТОАООААОСАСАОСОССААОАОАТОСООСТССАТС <8Εζ) ГО N0: 11; ПРТ1, Искусственная последовательность?

МКЕ\УОУУАУСЬУЬЕНТАЗАРРЕРАОККРРЕАРАЕОКЗЬОКККАРРАЬ38О8НМРЕ

0ΥΡ0ρΡ0ϋνΜ0Ρ^ΑΤΪΚΐυ.ΚΚ8ΡΌΚρΜΑνΕΡΚΚΕΚΝΙ«3ΑΑΑΑΝΡΕΝ8Β.0Κ0ΚΚ

О^КСК()КОСУЬТА1НЬКУТПЬОЬО¥ЕТКЕЕЫРК¥С503СОААЕТТ¥ОК1ЬККЬЗК

М<К1.У8ЕКУООАССКР1АНП1)ОЬ8РЫЖМЬУУН1ЬККП8.АККСС1С1 <8Е<2 ГО N0: 12; ПРТ1, Искусственная последовательность?

КО9КОК9КОСУ1ТА1НЬКУТПЕОЕОУЕТКЕЕЫРКУСЗО8СОААЕТТУПК1ЕАЪ1ЬЗ

К]ЧККЬУ8ЕКУС9АССКР[АР0ВВЬЗРЬ0О1иУУН1ЬККН8АККССС1 <5Е<3 ГО N0: 13; ДНК; Искусственная последовательность?

АТСААОСТОТОССАСОТОСТСКЗССОТОТОССТСОТОСТССТОСАСАСССССАО

СССТТТСССАСТСГССАСССООСААСАОАСССССАОАСОССССАОСССАООАСА

ОААСССТОООСАСОСООАОООССССАТТСОСССТОАОСАОСОАСАОСААСАТО

ССАОАООАСТАССССОАССАОТТСОАССАСОТСАТООАСТТСАТССА6СССАС

САТСААОАСССТСААОАСОТСАСССОАСААССАОАТСОСССТССТССССАООС

ОООАОАОСААСАОССАОССССССОСССССААСССАСАСААТТССАООООСАА

ОСОСАОААООООТСААССОООСААОСАОАООООСТОСОТОСТОАССОССАТС

САССТОААСОТОАССОАССТСООССТСООСТАССАОАССААООАСОАОСТОАТ

СТТСАОСТАСТОСАаСООСАОСТССОАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОА

ТССТСОССААССТСАОСААОААСААОСООСТОаТСТССОАСААОСТСССССАО

СССТОСТССАООСССАТССССТТССАСОАСОАССТОАОСТТССТОСАСОАСААС

СТООТОТАССАСАТССТОАООААОСАСАССОССААОАОАТОСООСТОСАТС <ЗЕ() ГО N0: 14; ПРТ1; Искусственная последовательность?

МКЬТОУУАУСЬУЪЬНТАЗАРРЬРАОККРРЕАРАЕОКЗЕОКККАРРАЬЗЗВЗКМРЕ

ΟΥΡΟ9ΡΟΏνΜΟΡΙ0ΑΤΙΚΚΕΚΚδΡΟΚ9ΜΑνΕΡΕΚΕΕΝΚ0ΑΑΑΑΝΡΕΝ3ΚΟΚΟΡΚ

С9КОК9КССУЬТА1НЬНУТОЕОЕСУЕТКЕЕЫРКУС8С8СОААЕТТУОК1ЬА1ЧЕ5К

МККЕУ8ЕКУСрАССКР[АРОООЕЗРЕОО]ЧЕУУН1ЕККНЗАККССС1 <ЗЕ() ГО N0: 15; ПРТ1, Искусственная последовательность?

КС9КОК9КОСУЬТА1Н1ЛЧУ1Т>ЕОЕО¥ЕТКЕЕЕ1РКУСЗС5СВААЕТТУ13К1ЕА№,8

КЯК1<ЕУ§ЕКЛОрАССКР1АРООСЕ5РЕВПКЕУУН1ЕКЕН8АКЕССС1

- 19 025129 <ЗЕ(3 ГО N0; 16, ДНК; Искусственная последовательность®

АТОААОСТОТОООАСОТООТООССОТОТОССТООТОСТОСТОСАСАССОССАО

СОСТТТСССАСТСССАОССОССААОАаАСССССАОАОСССССАССССАСОАСА

СААСССТССССАССССОАСОСССССАТТСССССТОАССАСССАСАССААСАТС

ССАОАООАСТАСССССАССАОТТСОАСОАСОТСАТООАСТТСАТССАООССАС

САТСААОАОССТОААСАССТСАССССАСААССАОАТССССОТОСТОСССАОСС

СООАОАССААСАСОСАОеССбССССССССААСССАСАОААТТССАООСССАА

ОООСАОААООООТСААСОСгСЮСААССАОАООСгССТОСОТССТОАССОССАТС

САССТСААСОТОАССОАССТОООССТОСОСТАСОАОАССААСОАООАОСТСАТ

СТТСАССТАСТОСАССООСАОСТОСОАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОА

ТССТСОССААССТОАССААОААСААОСООСТООТСТССОАОААООТСЮОССАО

ОССТОСТССАСЮСССАТСОССТТССАСОАСОАССТОАССТТССТСОАСОАСААС

СТСОТСТАССАСАТССТОАОООАОСАСАОССЗССААООАОТОСООСТСгСАТС <8Εζ) ГО N0: 17; ПРТ1, Искусственная последовательность®

МКЬШ0УУАУСЬУЕЬНТА8АГРЕРАЖКРРЕАРАЕОК.8ЬО1<ККАРРАЬ3808Ъ1МРЕ θΥΡΟ0ΡΟθνΜϋΡΙ0ΑΤΙΚΚΕΚΚ5ΡϋΚ0ΜΑνΕΡΚΚΕΚΝΚ0ΑΑΑΑΝΡΕΝ5Κ.ΟΚΟΚΚ.

С0К.ОКаКОС\ЪТА1НЬК\-'ТОЬСЬС^,гЪТКЕЕЫРКУС8С5СПА,АЕТТУТ>К1ЬАМЬ8К

МККЕУЗЕКУО9АССРР1АЕООСЕ8РЬОО1ЧЬУ¥Н1ЬКЕНЗАКЕС0С1 <8Е<3 ГО N0: 1 δ; ДНК; Ното 5ар1епз>

АТОААОСТОТОООАСОТООТООССОТОТОССТООТОСТОСТОСАСАССОССАО

СССТ <8Е(3 ГО N0: 19; ДНК; Искусственная последовательность®

АТСААОСТОТОССАССТСОТССССОТОТСССТСОТОСТОСТОСАСАССОССАО

СОСТАООООТСААСООООСААОСАОАООСОСТОСОТОСТОАССОССАТССАСС

ТОААСОТОАССОАССТОССССТОСССТАСОАОАССААООАСОАССТОАТСТТС

АООТАСТОСАСССОСАОСТОССАСОСССССОАОАССАССТАСОАСААОАТССТ

ОААОААССТОАОСАООААСАООСООСТООТСТССОАСААООТООСССАООСС

ТОСТОСАОССССАТСОССТТСОАСОАСОАССТСАССТТССТООАССАСААССТО

СТОТАССАСАТССТОАСОААССАСАОСОССААОАОАТСССОСТОСАТС <8Е<3 ГО N0: 20; ПРТ1; Искусственная последовательность®

МКЬТОУУАУСЕУЬЕНТАЗАКО^КСКрКОСУЕТАШЬНУТОЬСЕОУЕТКЕЕиРК.

ΥΟδΟδΟΏΑΑΕΤΤΥΌΚΙΕΚΝΕδΚΝΚΚΕνδΕΚνοηΑΟΟΚΡΙΑΡΟΟΟΕδΡΕΟΟΝΕνΥΗΙ

ЕККН5АККС0С1 <8Е<3 ГО N0: 21; ДНК; Искусственная последовательность®

АТОААССТСТССОАССТСОТСССССТСТ(5ССТООТОСТОСТОСАСАСССССАО

СОСТАООООТСААСООООСААОСАОАООООСТОСОТОСТОАССОССАТССАСС

ТОААССТСАССОАССТОСОССТСОССТАСОАОАССААООАСЮАОСТОАТСТТС

АСОТАСТССАОССССАОСТСССАСС5ССССССАОАССАССТАСОАСААОАТССТ

ООССААССТОАОСААОААСААОСООСТООТСТССОАОААООТОООССАООССТ

ОСТОСАССЗСССАТСОССТТССАСОАСОАССТОАССТТССТООАСОАСААССТО

ОТОТАССАСАТССТСАССААССАСАСССССААОАОАТОССССТССАТС <8Е(Д ГО N0: 22; ПРТ1; Искусственная последовательность® ΜΚΕ\νΌννΑν€ΕνΕΕΗΤΑ$ΑΚΟ<2Κ.ΟΚ()ΚΟ€νΕΤΑ1ΗΕΝνΤΟΕΟΕΟΥΕΤΚΕΕΕΙΡΚ ΥεδΟδΟΟΑΑΕΤΤΥΟΚΙΕΑΝΕδΚΝΚΚΕνδΕΚνΟφΑίΤΚΡΙΑΡΏΟϋΕδΡΕΟΟΝΕνΥΗΙ ЕККН5АККС0С1 <5Εζ) ГО ΝΟ: 23; ПРТ1; Искусственная последовательность®

Κ03Κ0Κ3Κ0ϋνΕΤΑΙΗΕΝνΤΏΕΟΕΟΥΕΤΚΕΕΕΙΡΚ.Υ05Ο5€Γ>ΑΑΕΤΤΥΟΚΙΕΧ3&84Ν

Е8Хаа8в1ЧХаа9оКЕУ8ЕКУОрАССКР1АРОПОЕ8РЕООКЕУУН1ЕКХаа,25Н8АКХаа1зо

С0С1, где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой Κ или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой Κ или К; ίν) Хаа_!25 представляет собой К или Е; ν) Хаа^о представляет собой Κ или Е.

<5ЕЦ ГО N0: 24; ПРТ1, Искусственная последовательность^

МКИУОУУАУСЬУЬЬНТАЗАКСрКСКОКССУЬТАПЮОТТОЬСЬОтеТКЕЕиРИ

УСКОЗСОААЕТТУОКГОХааваКЬКХаавяМХааиКЬУЗЕКУСрАССКИАГОООЬЗРЬО

ОТГОУУНГОКХаашНЗАКХаапоСОа где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой Κ или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой Κ или К; ίν) Хаа1₂₅ представляет собой К или Е; ν) Хаа₁₃₀ представляет собой Κ или Е.

<5Ε(^Π>Ν0: 25; ПРТ1, Миа П1и5си1и5>

МЕТотихвдуьььхууразто <5Ер ГО N0: 26; ДНК; Ми$ ти5Си1и&>

АТСОАСАСАОАСАСАСТССТССТАТСССТАСТССТССТСТСССТТССАССАТСТ ассост <§ЕС> ГО N0: 27; ДНК; Искусственная последовательность^

АТООАОАСАОАСАСАСТССТОСТАТОООТАСТОСТОСТСТОООТТССАООАТСТ

АССООТАООООТСААСООООСААОСАОАСЮООСТОСОТОСТОАССОССАТССА

ССТСААСОТОАСССАССТСССССТСеОСТАСеАОАССААСОАООАОСТОАТСТ

ТСАСОТАСТОСАОСООСАОСТОСОАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОАТС

СТОААОААССТОАОСАООААСАООСООСТООТСТССОАОААООТОООССАОО

- 20 025129

ССТСЗСТСЗСАООСССАТСОССТТСОАСОАСОАССТОАОСТТССТООАСОАСААСС

ТООТОТАССАСАТССТОАООААОСАСАОСОССААОАОАТССООСТОСАТС <8ЕЦ ГО N0: 28; ПРТ1; Искусственная последовательность* МЕТОТЬЬЫУУЬЕЬУУУРОЗТОаСЦаСКЦКОСУЬТАШЬМУТОЪОЕОУЕТКЕЕЫРК. УС8Ст5СОЛАЕ1’1\'[)К1ЕКХЕ8РХККЕУЗЕКУСтГ)АССЕР(АРВЕГИ5РЕ1ЮИЕУУН1 ЕККНЗАККСОС1 <8ЕЦ ГО N0: 29; ДНК; Искусственная последовательность*

АТООАОАСАОАСАСАСТССТОСТАТООСТАСТОСТОСТСТСЮОТТССАООАТСТ

АСССЕтТАООООТСААСОСОССААОСАОАООООСТОСОТОСТОАСССЗССАТССА

ССТОААСОТОАССОАССТООСССТеООСТАСОАОАССААСГОАООАОСТОАТСТ

ТСАООТАСТОСАОСООСАОСТОСОАСОССОССОАОАССАССТАСОАСААОАТС

СТООССААССТОАОСААОААСААОСООСТСОТСТССОАОААООТОСОССАООС

СТОСТОСАОССССАТСОССТТСОАСОАССАССТОАОСТТССТООАССАСААССТ

ООТОТАССАСАТССТОАСОААССАСАОСОССААОАОАТОССОСТОСАТС

ЗЕО ГО N0; 30, ПРТ1; Искусственная последовательность*

МЕ(1ЛЕЕЕ\У\ЪЕЕУ'\ТС5ТСЖООКОКрКОСУЕТА1[ТЕЖ-ТОЕЙЕС;УЕТКЕЕЕ1ГК.

ΥΕ303ΕΟΑΑΕΤΤΥΙ)ΚΙΕΑΝΕ3ΚΝΚΚΕν3ΕΚν(Χ)Α€ΕΚΡΙΑΡΌΟΟΕ8ΡΕΟΠΧΕνΥΗΙ

ЕККН5АККСОС1 <8Ер ГО N0: Зр ПРТ1; Искусственная последовательность*

ΜΕΤΟΤΕΕΕ\ννΕΕΕΛννΡΟ8ΤΟΚΓΚ2Κ(Η<0ΚΰΕνΕΤΑΙΗΕΝνΤΟΕΟΕ(ιΥΕΤΚΕΕΕ[ΡΚ.

УСЗСЗСОААЕТТУЦКГОХаамИЕЗХаазвМХааадКЕУЗЕКУОрАССКИАРОООЕЗРЕО

ЦИЕУУНГОКХаапвНЗАКХааивССС!

где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой К или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой К или К; ίν) Хаа₄₂₅ представляет собой К или Е; ν) Хаа^о представляет собой К или Е.

<5Ер ГО N0: 32; ПРТ1, Ното Бар1еп5>

МАТО8КТЗЕЕЕАРОЕЕСЕР\¥Е<ЗЕС8А <8ЕС2 ГО N0: 33; ДНК; Ното 5ар|спз>

АТСЗОСТАССООСАОСАООАССТСТСТОСТОСТООССТТСООССТОСТСТ(ЗССТС

СССТООСТОСАООААООСАОСОСС *5Ер ГО N0: 34; ДНК; Искусственная последовательность*

АТООСТАССООСАОСАООАССТСТСТССТССТООССТТСООССТОСТОТОССТО

СССТООСТОСАООААООСАОСОССАООООТСААСООООСААОСАОАООООСТ

ОСОТОСТОАССОССАТССАССТОААСОТОАССОАССТОООССТООССТАСОАО

АССААООАООАОСТОАТСТТСАООТАСТОСАОСООСАОСТССОАСОССОССОА

ОАССАССТАССАСААСАТССТСААОААССТОАССАООААСАООСООСТСОТСТ

ССОАОААООТОООССАООССТОСТОСАООСССАТСОССТТСОАСОАСОАССТС

АССТТССТСОАСОАСААССТООТОТАССАСАТССТОАООААОСАСАОСОССАА

ОАОАТОСООСТОСАТС <8Ер ГО N0 35; ПРТ1; Искусственная последовательность* ΜΑΊΌ3ΚΤ5ΕΕΕΑΡΟΕΕΕΕΡ\νΕΟΕΟ$ΑΚΟΟΚΟΚρκΟΕνΕΤΛΙΗΕΝντοΕΟΕΟΥΕΊΚ ΕΕΕΙΡΚΥΕ5Ο5ΕΟΑΑΕΤΤΥΟΚΠ.ΚΝΕ8ΚΝΚΚΕν8ΕΚνσ0)Α€€ΚΡΙΑΡΟΟΟΕ8ΡΕΟΟΝ ЕУУНГОККН8АККС0С1 <8Ер ГО N0: 36; ДНК; Искусственная последовательностЬ*

АТООСТАССООСАОСАООАССТСТСТОСТОСТООССТТСООССТОСТОТОССТО

СССТООСТОСАООААООСАОСОССАООООТСААСООООСААОСАОАООООСТ

ОСОТОСТОАССОССАТССАССТОААСОТОАССОАССТОООССТОООСТАСОАО

АССААООАООАОСТОАТСТТСАСОТАСТОСАОССОСАОСТОСОАСОСССССОА

ОАССАССТАСОАСААОАТССТООССААССТОАОСААОААСААОСООСТООТСТ

ССОАОААООТОООССАООССТОСТОСАООСССАТСОССТТСОАСОАСОАССТО

АОСТТССТООАСОАСААССТООТОТАССАСАТССТОАООААОСАСАОСОССАА

ОАОАТОСООСТОСАТС <ЗНр ГО N0: 37; ПРТ1; Искусственная последовательность*

МА'ГО81<ТЗЕЕЕАГС!Т,ЕСЕР№Т.рЕО5АКОрКОКЕ>РтеУЕТА1НЕ\УТГ)ЕОЕОУЕТК

ЕЕЕ1РК¥С803СОААЕТТУ13К1ЕАЧЕ8КНККЕУ8ЕКУСрАССКР1АРООГ)ЕЗЕЕПГ)К

ЕУУНГОККНЗАККССС!

*8Ер ГО N0: 38; ПРТ1; Искусственная последовательность* МАТОЗКТЗЕЕЕАЕОЕЕСЕРЗУЕРЕОЗАКОрКОКрКОСУЕТАШЕИУТОЕОЕОУЕТК ЕЕирКУСЗОЗСОЛАЕТТУОКГОХаавЖЗХааиКХааиРЕУЗЕКУСОАССВПАРОО ОЕЗРЕООИЕУУНГОКХаапгНЗАКХаапоСОС!

где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой К или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой К или К; ίν) Хаа1₂₅ представляет собой К или Е; ν) Хаа₁₃₀ представляет собой К или Е.

- 21 025129

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9 <8Ε() ГО ΝΟ: 39; ДНК; Праймер>

ТАТАСАТАТОСОТООАСААСОТООТАААСААСОТООТТОТОТОСТО <8Ε0 ΙΟ ΝΟ: 40; ДНК; Праймер>

ОСТССТСОАОТТАТТАААТОСАОССОСААСОТТТСОСОСТ <5ЕС> ГО ΝΟ: 41; ДНК; Праймер>

ОТСТООТОАОСОАОАААОТОООТСАО <5Е0 ГО N0: 42; ДНК; Праймер>

СТОАСССАСТТТСТСОСТСАССАОАС <8Е0 ГО N0: 43; ДНК; Праймер>

ССТАТОАТААААТССТООСАААССТОАОСААОААСАААСОТСТООТОАОСОАО АААО <5Е<3 ГО ΝΟ: 44; ДНК; Праймер>

СТТТСТСОСТСАССАОАСОТТТОТТСТТОСТСАСЗОТТТОССАООАТТТТАТСАТА ОС

I: АК - полноразмерный ΟΌΝΡ дикого типа человека.

7: ДНК - полноразмерный ΟΌΝΡ дикого типа человека.

5: АК - зрелый ΟΌΝΡ дикого типа человека.

1·: АК - нативный секреторный сигнальный пептид ΟΌΝΡ человека.

5: АК - продомен ΟΌΝΡ человека.

5: ДНК - прямой праймер Δ31-ίοτ.

7: ДНК - обратный праймер А31-гса.

8: АК - вариант 1: Δ31 ΟΌΝΡ.

9: АК - вариант ΟΌΝΡ 2: Δ31·\38Ο·|)95Η (клон Ό9), белок (103 АК).

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10: последовательность ДНК-конструкции - вариант ΟΌΝΡ 2: Δ31+Ν38Ο+Ό95Ρ (клон Ό9), ДНК (рЕЕ12.4).

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11: АК - вариант ΟΌΝΡ 2: Δ31+N38^+^95Е (клон Ό9), белковая конструкция (211

АК).

81®) ΙΌ ΝΟ: 12: АК - вариант ΟΌΝΡ 3: :\3 1-\38О-К84Л-Н88К-Н90К-П95Н (клон Ρ2.1), белковая последовательность (103 АК).

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 13: последовательность ДНК-конструкции - вариант ΟΌΝΡ 3: Δ31+Ν38Ο+Ι<84Λ-Κ.88Ι<К90КГО95Е (клон Ρ2.1), последовательность ДНК.

81®) ΙΌ ΝΟ: 14: АК - вариант ΟΌΝΡ 3: Δ31+N38^+К84Λ-К88К-К90К-^95Е (клон Ρ2.1), белковая конструкция (211 АК).

81®) ΙΌ ΝΟ: 15: АК - вариант ΟΌΝΡ 4: Δ31+N38^+К84Λ-К88К-К90К-^95Е+К125Е + К130Е (клон 4.3), белковая последовательность (103 АК).

ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 16: последовательность ДНК-конструкции - вариант ΟΌΝΡ 4: Δ31+Ν38Ο+ К84А-К88КК90КГО95Е+К125Е+К130Е (клон 4.3), последовательность ДНК.

81®) ΙΌ ΝΟ: 17: АК - вариант ΟΌΝΡ 4: Δ31+N38^+К84Λ-К88К-К90К-^95Е+К125Е + К130Е (клон 4.3), белковая конструкция.

8: ДНК - нативный секреторный сигнальный пептид ΟΌΝΡ человека.

): ДНК - конструкция нативный пептид^31 Ν38Ο+Ό95Ρ.

): АК - нативный пептид^31 Ν38Ο+Ό95Ρ (122 АК).

I: ДНК - нативный пептид-А31 Ю8р+К84А-К88К-К90КГО95Е.

>: АК - нативный пептид^31 Ю8р+К84А-К88К-К90КГО95Е (122 АК).

: АК - консенсусная последовательность вариантов.

: АК - нативный пептид-консенсусная последовательность вариантов.

5: АК - секреторный сигнальный лидерный пептид каппа мыши (МКЬ).

>: ДНК - секреторный сигнальный лидерный пептид каппа мыши (МКЬ).

7: ДНК - конструкция МКР-А31 Ν38Ο+Ό95Ρ.

8: АК - ΜΧΌ-Δ31 \38(®1)95Н (123 АК).

): ДНК - конструкция ΜΧΌ-Δ31 Ю8р+К84А-К88К-К90КГО95Е.

): АК - ΜΧΌ-Δ31 Ю8р+К84А-К88К-К90КГО95Е (123 АК).

: АК - лидерный пептид каппа мыши-консенсусная последовательность вариантов.

7: АК - секреторный сигнальный пептид гормона роста человека (НСН).

8: ДНК - секреторный сигнальный пептид гормона роста человека (ЮН). к ДНК - конструкция ЮН-А31 Ν38Ο+Ό95Ρ.

81®)	ΙΌ	ΝΟ:	18
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	19
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	20
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	21
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	22
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	23
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	24
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	25
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	26
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	27
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	28
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	29
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	30
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	31
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	32
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	33
81®)	ΙΌ	ΝΟ:	34

- 22 025129

8ΕΟ	ГО	Ш:	35:
8ΕΟ	ГО	Ш:	36:
8ΕΟ	го	Ш:	37:
8ΕΟ	го	Ш:	38:
8ΕΟ	го	Ш:	39:
8ΕΟ	го	Ш:	40:
8ΕΟ	го	Ш:	41:
8ΕΟ	го	Ш:	42:
8ΕΟ	го	Ш:	43:
8ΕΟ	го	Ш:	44:

ΑΚ - ЬСН-А31 Ν38Ρ+Ό95Ε (129 ΑΚ).

ДНК - конструкция ЬСН^1 N38^+Κ84Α-К88Κ-К90Κ-^95Ε. ΑΚ - ЬСН-А31 N38^+Κ84Α-К88Κ-К90Κ-^95Ε (123 ΑΚ).

ΑΚ - НСН-консенсусная последовательность вариантов.

ДНК - праймер Δ31-Ν38Ο-ΙΟΓ.

ДНК - праймер А31-И38О-геу.

ДНК - праймер Δ31-Ν38ρ-Ό95Ε-ίθΓ.

ДНК - праймер Δ31-Ν38ρ-Ό95Ε-ΐΐν.

ДНК - праймер Δ31-Ν38ρ-ΚΑΚΚΕ-ίΟτ.

ДНК - праймер Δ31-Ν38ρ-ΚΑΚΚΕ-κν.

<110> ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ <120> ВАРИАНТЫ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК (6ΌΝΡ) ЧЕЛОВЕКА <130> Х19073 <150> 61/474024 <151> 2011-04-11 <160> 44 <170> Ра!еп!1п νβίδίοη 3.5 <210> 1 <211> 211 <212> РРТ <213> Ногтю зарйепз <400> 1

Мей 1

Ьуз Ьеи Тгр Азр Уа1 \7а1 А1а Уа1 Суз Ьеи Уа1 Ьеи

Ьеи

ΗΪ3 15

ТЬг

5

10

А1а

Зег

А1а

РЬе

Рго

Ьеи

Рго

А1а

С1у

Ьуз

Агд

Рго

Рго

С1и

А1а

Рго

20

25

30

А1а

С1и

Азр

Агд

Зег

Ьеи

С1у

Агд

Агд

Агд

А1а

Рго

РЬе

А1а

Ьеи

Зег

35

40

45

Зег

Азр

Зег

Азп

Ме!

Рго

С1и

Азр

Туг

Рго

Азр

С1п

РЬе

Азр

Азр

Уа1

50

55

60

Ме!

Азр

РЬе

Не

С1п

А1а

ТЬг

Не

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Азр

65

70

75

30

Ьуз

С1п

Ме!

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

Агд

С1и

Агд

АЗП

Агд

С1п

А1а

А1а

85

90

95

А1а

А1а

Аз η

Рго

С1и

Азп

Зег

Агд

С1у

Ьуз

С1у

Агд

Агд

С1у

С1п

Агд

100

105

ПО

С1у

Ьуз

Азп

Агд

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

ТЬг

А1а

Не

Ηί$

Ьеи

Азп

Уа1

ТЬг

115

120

125

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Туг

С1и

ТЬг

Ьуз

С1и

С1и

Ьеи

Не

РЬе

Агд

Туг

130

135

140

Суз

Зег

С1у

$ег

Суз

Азр

А1а

А1а

С1и

ТЬг

ТЬг

Туг

Азр

Ьуз

Не

Ьеи

145

150

155

160

Ьуз

Аз η

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд

Агд

Ьеи

Уа1

Зег

Азр

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

165 170 175

- 23 025129

Азр Азп Ьеи Уа1 Туг ΗΪ3 Не Ьеи Агд Ьуз ΗΪ3 Зег А1а Ьуз Агд Суз

С1у Суз Не 210 <210> 2 <211> 633 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <400> 2 аЬдаадсЬдЬ дддасдсддс ддссдЬдСдс сЬддЬдсхдс Ьдсасассдс садсдсРСРс 60 ссасЬдссад ссддсаадад асссссадад дссссадссд аддасадаад ссЬдддсадд 120 сддадддссс саЬЬсдсссС дадсадсдас адсаасаЬдс сададдасЬа ссссдассад 180

ССсдасдасд ЬсаЬддасЬЬ саЬссаддсс ассаЬсаада ддсЬдаадад дссасссдас 240 аадсадаедд ссдРдсРдсс саддсдддад аддаасаддс аддссдссдс сдссаассса 300 дадааССсса ддддсааддд садааддддС. саасддддса адаасадддд сСдсдСдсСд 360 ассдссаСсс асссдаасдс дассдассСд ддсссдддсс асдадассаа ддаддадссд 420 аСсССсаддС асСдсадсдд садсСдсдас дссдссдада ссассСасда саадаСсссд 480 аадаассСда дсаддаасад дсддссддСс Сссдасаадд Сдддссаддс сСдсСдсадд 540 сссаСсдссс ссдасдасда сссдадсссс сСддасдаса ассСддСдСа ссасаСссСд 600 аддаадсаса дсдссаадад аСдсддсСдс асе 633 <210> 3 <211> 134 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 3

Зег Рго Азр Ьуз С1п Мер А1а Уа1 Ьеи Рго Агд Агд 61и Агд Азп Агд

10 15

С1п А1а А1а А1а А1а Азп Рго С1и Азп Зег Агд С1у Ьуз С1у Агд Агд 20 25 30

С1у С1п Агд С1у Ьуз Азп Агд С1у Суз Уа1 Ьеи ТЬг А1а 11е Н1з Ьеи 35 40 45

Азп Йа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи Не 50 55 60

РЪе Агд Тух Су® Зег С1у Зег Су® Азр А1а А1а 31и ТЪг ТЬг Туг Азр 65 70 75 80

Ьу$ Не Ьеи Ьуз Азп Ьеи Зег Агд Азп Агд Агд Ьеи Уа1 Зег Азр Ьу5 85 90 95

Уа1 С1у С1п А1а Суз Су® Агд Рго 11е А1а РЬе Азр Азр Агр Ьеи Зег 100 105 НО

РЪе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг ΗΪ3 Не Ьеи Агд Ьуз Н1з Зег А1а 115 120 125

Ьуз Агд Суз С1у Суз 11е 130 <210> 4 <211> 19 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 4

МеЬ Ьуэ Ьеи Тгр Азр \7а1 Уа1 А1а Уа1 Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ3 ТЪг 15 10 15

А1а Зег А1а <210> 5 <211> 58 <212> РКТ <213> Ното заргепз <400> 5

РЪе Рго Ьеи Рго А1а С1у Ьуз Агд Рго Рго (31и А1а Рго А1а С1и Азр 15 10 15

Агд Зег Ьеи С1у Агд Агд Агд А1а Рго РЪе А1а Ьеи Зег Зег Азр Зег

Азп МеС Рго С1и Азр Туг Рго Азр 51п РЪе Азр Азр Уа1 МеС Азр РЪе 35 40 45

11е С1п А1а ТЪг 11е Ьуз Агд Ьеи Ьуз Агд <210> 6 <211> 46 <212> 0ΝΑ <213> АгЫНсха! Зедиепсе <220>

<223> ЗупЬЬеьЬс СопзСгисС <400> 6

СаСасаСаСд сдСддасаас дСддСааааа ссдСддССдС дСдссд <210> 7 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> АгСЬГхсха! Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеСЬс СопзСгисС <400> 7 ддСдсСсдад ССаССаааСд садссдсаас дСССсдсдсС <210> 8 <211> 103 <212> РКТ <213> Нечто зарЬепз <400> 8

Агд С1у С1п Агд С1у Ьуз Азп Агд 01у Суз Уа1 Ьеи ТЬг А1а Не НЬз

Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи

Не РЬе Агд Туг Суз Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и ТЬг ТЬг Туг

Азр Ьуз 11е Ьеи Ьуз Азп Ьеи Зег Агд Азп Агд Агд Ьеи Уа1 Зег Азр 50 55 60

Ьуз Уа1 С1у 01п А1а Суз Суз Агд Рго Не А1а РЬе Азр Азр Азр Ьеи

Зег РЬе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг НЬз Не Ьеи Агд Ьуэ НЬз Зег

А1а Ьуз Агд Суз <31у Суз Не 100 <210> 9 <211> 103 <212> РКТ <213> ΑΓίϊίίσϊβΙ Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеЫс СопзСгисС <400> 9

Агд С1у С1п Агд С1у Ьуз С1п Агд 01у Суз Уа1 Ьеи ТЬг А1а 11е НЬз

Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи

Не РЬе Агд Туг Суз Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и ТЬг ТЬг Туг

Азр Ьуз 11е Ьеи Ьуз Азп Ьеи Зег Агд Азп Агд Агд Ьеи Уа1 Зег С1и

Ьуз Уа1 С1у С1п А1а Суз Суз Агд Рго Не А1а РЬе Азр Азр Азр Ьеи

Зег РЬе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг НЬз Не Ьеи Агд Ьуз НЬз Зег <210> 10 <211> 309 <212> 0ΝΑ <213> ΑΓΤίίίοϊβΙ Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬесЬс СопзСгисС <400> 10 аддддссаас ддддсаадса даддддсСдс дСдсСдассд ссасссассС даасдсдасс 60 дасссдддсс сдддсСасда дассааддад дадсСдассС СсаддСасСд садсддсадс 120

Сдсдасдссд ссдадассас сСасдасаад аСссСдаада асссдадсад даасаддсдд 180 ссддсссссд адааддСддд ссаддссСдс сдсаддссса СсдссССсда сдасдассСд 240 адсССссСдд асдасаассС ддСдСассас аСссСдадда адсасадсдс саададаедс 300 ддсСдсаСс 309 <210> 11 <211> 211 <212> РКТ <213> АгЫНсЬаЬ Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеСЬс СопзСгисС

МеС Ьуз Ьеи Тгр Азр Уа1 Уа1 А1а Уа1 Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи НЬз ТЬг 15 10 15

АЬа

Зег

АЬа

РЬе

Рго

Ьеи

Рго

АЬа

С1у

Ьуз

Агд

Рго

Рго

С1и

АЬа

Рго

20

25

30

А1а

С1и

Азр

Агд

Зег

Ьеи

С1у

Агд

Агд

Агд

АЬа

Рго

РЬе

А1а

Ьеи

Зег

35

40

45

Зег

Азр

Зег

Азп

МеС

Рго

б1и

Азр

Туг

Рго

Азр

С1п

РЬе

Азр

Азр

Уа1

50

55

60

МеС

Азр

РЬе

Не

С1п

АЬа

ТЬг

Не

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьуз

Агд

Зег

Рго

Азр

65

70

75

80

Ьуз

С1п

МеС

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

Агд

С1и

Агд

Азп

Агд

С1п

АЬа

А1а

35

90

95

А1а

АЬа

Азп

Рго

С1и

Азп

Зег

Агд

С1у

Ьуз

С1у

Агд

Агд

61 у

С1п

Агд

100

105

но

31у

ЬуЗ

С1п

Агд

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

ТЬг

А1а

Не

Ηί3

Ьеи

Азп

Уа1

ТЬг

115

120

125

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Туг

С1и

ТЬг

Ьуз

С1и

<31и

Ьеи

Не

РЬе

Агд

Туг

130

135

140

Суз

Зег

С1у

Зег

Суз

Азр

А1а

А1а

С1и

ТЬг

ТЬг

Туг

Азр

Ьуз

Не

Ьеи

145

150

155

160

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд

Агд

Ьеи

Уа1

Зег

С1и

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

165

170

175

А1а

Суз

Суз

Агд

Рго

Не

А1а

РЬе

Азр

Азр

Азр

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

Азр

180

185

190

Азр

Азп

Ьеи

7а1

Туг

Ηΐ5

Не

Ьеи

Агд

Ьуз

Н1з

Зег

А1а

Ьуз

Агд

Суз

195

200

205

С1у

Суз

Не

210 <210> 12 <211> 103 <212> РКТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеПс СопзЬгисЬ <40О> 12

Агд С1у С1п Агд С1у Ьуз С1п Агд С1у Суз Уа1 Ьеи ТЬг А1а Не Н1з 15 10 15

Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи 20 25 30

11е РЬе Агд Туг Суз Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и ТЬг ТЬг Туг 35 40 45

Азр Ьуз 11е Ьеи А1а Азп Ьеи Зег Ьуз Азп Ьуз Агд Ьеи Уа1 Зег С1и 50 55 60

Ьуз Уа1 61у С1п АЬа Суз Суз Агд Рго 11е А1а РЬе Азр Азр Азр Ьеи 65 70 75 80

Зег РЬе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг НЬз Не Ьеи Агд Ьуз НЬз Зег 85 90 95

А1а Ьуз Агд Суз С1у Суз Не 100 <210> 13 <211> 633 <212> ϋΝΑ <213> АгН£ЬсЬа1 Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеЫс СопзСгисЬ <400> 13 аЬдаадсидс дддасдСддС ддссдЬдСдс сСддСдсСдс Сдсасассдс садсдсСССс 60 ссасЬдссад ссддсаадад асссссадад дссссадссд аддасадаад ссСдддсадд 120 сддадддссс саССсдсссС дадсадсдас адсаасаСдс сададдасСа ссссдассад 180

ССсдасдасд СсаСддасСС саСссаддсс ассаСсаада ддссдаадад дСсасссдас 240 аадсадаСдд ссдСдсСдсс саддсдддад аддаасаддс аддссдссдс сдссаассса 300 дадааССсса ддддсааддд садааддддС саасддддса адсададддд сСдсдсдсСд 360 ассдссаСсс асссдаасдс дассдасссд ддсссдддсС асдадассаа ддаддадсСд 420 аСсССсаддС асСдсадсдд садсСдсдас дссдссдада ссассСасда саадаСссСд 480 дссаассСда дсаадаасаа дсддсСддСс Сссдадаадд сдддссаддс сСдсСдсадд 540 сссаСсдссС Ссдасдасда ссСдадсССс сСддасдаса ассСддСдСа ссасаСссСд 600 аддаадсаса дсдссаадад асдсддссдс асе 633 <210> 14 <211> 211 <212> РЕТ <213> АгСЬГЬсЬа! Зедиепсе

- 26 025129

<213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе

ТЬг

Рго

Зег

Уа1

Азр

А1а

Агд

ТЬг

Туг

Ьеи

160

С1п

А5р

Суз <220>

<223> ЗупБЬеЫс СопзЪгисС <400> 15

Агд С1у С1п Агд С1у Ьуз С1п Агд С1у Суз Уа! Ьеи ТЬг А1а Не ΗΪ3

Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи

Не РЬе Агд Туг Суз Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и ТЬг ТЬг Туг

Азр Ьуз Не Ьеи А1а Азп Ьеи Зег Ьуз Азп Ьуз Агд Ьеи Уа1 Зег С1и

Ьуз Уа1 31у С1п А1а Суз Суз Агд Рго Не А1а РЬе Азр Азр Азр Ьеи

Зег РЬе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг Ηίδ Не Ьеи Агд С1и Ηίί Зег <210> 16 <211> 633 <212> ΟΝΑ <213> АгбхПсха! Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеЫс СопзЫисб <400> 16 абдаадссдс дддасд£дд£ ддссдсдСдс ссддсдсРдс сдсасассдс садсдсБССс ссасСдссад ссддсаадад асссссадад дссссадссд аддасадаад ссСдддсадд сддадддссс са£ЬсдсссС дадсадсдас адсаасаСдс сададдас£а ссссдассад £Ссдасдасд ЕсаРддасН саСссаддсс ассабсаада ддсидаадад д£сасссдас аадсадаСдд ссдСдсСдсс саддсдддад аддаасаддс аддсссссдс сдссаассса дадаасссса ддддсааддд садааддддС саасддддса адсададддд сСдсдСдсСд ассдссассс асссдаасдС дассдасссд ддсссдддсС асдадассаа ддаддадсСд аСсССсаддс асСдсадсдд садссдсдас дссдссдада ссассСасда саадаСссСд дссаассСда дсаадаасаа дсддсСддСс Сссдадаадд Сдддссаддс сСдсСдсадд сссаСсдссС Ссдасдасда ссСдадсССс сСддасдаса ассСдаСдса ссасаСссСд

120

180

240

300

360

420

480

540

600

- 27 025129

С1у Суз Не 210 <210> 18 <211> 57 <212> ΟΝΑ <213> Ногтю зариепз <400 18 аЕдаадсЬдЬ дддасдСддЬ ддссдсдсдс сСддбдсСдс Ьдсасассдс садсдсь <210> 19 <211> 366 <212> 0ΝΑ <213> ΑΓίΐίϊοίθΙ Зедиепсе <220>

<223> 5упсЬеС.1с СопзСгисб <400> 19 аСдаадсСдС дддасдкддЬ ддссдЕдЕдс сЕддсдсбдс ьдсасассдс садсдсьадд 60 ддСсаасддд дсаадсадад дддс^дсдед сСдассдсса сссассСдаа сдСдассдас 120 сСдддсссдд дссасдадас сааддаддад сСдаСсССса ддсасСдсад сддсадсбдс 180 дасдссдссд адассассСа сдасаадаСс сСдаадаасс Сдадсаддаа саддсддсСд 240 дСссссдада аддсдддсса ддссСдссдс аддсссаСсд ссССсдасда сдассСдадс 300 сссссддасд асаассСддС дсассасаСс сСдаддаадс асадсдссаа дадаСдсддс 360

СдсаСс 366 <210> 20 <211> 122 <212> РКТ <213> ΑΓύίίίσίθΙ Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеСЬс СопзСгисС <400> 20

МеС Ьуз Ьеи Тгр Азр Уа1 Уа1 А1а Уа1 Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи ΗΪ5 ТЬг

А1а Зег А1а Агд 61у С1п Агд С1у Ьуз <31п Агд 61у Суз Уа1 Ьеи ТЬг

А1а 11е НЬз Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр Ьеи С1у Ьеи С1у Туг С1и ТЬг Ьуз

С1и С1и Ьеи 11е РЬе Агд Туг Суз Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и 50 55 60

ТЬг ТЬг Туг Азр Ьуз Не Ьеи Ьуз Азп Ьеи Зег Агд Азп Агд Агд Ьеи 65 70 75 80

Уа1 Зег С1и Ьуз Уа1 С1у С1п А1а Суз Суз Агд Рго Не А1а РЬе Азр 85 90 95

Азр Азр Ьеи Зег РЬе Ьеи Азр Азр Азп Ьеи Уа1 Туг Низ Не Ьеи Агд 100 105 110

Ьуз Ηΐ3 Зег А1а Ьуз Агд Суз С1у Суз Не 115 120 <210> 21 <211> 366 <212> ЬЫА <213> АгСЛНсхаЬ Зециепсе <220>

<223> ЗупсЬеСлс СопзСгисС <400> 21

аСдаадссдС	дддасдсддс	ддссдСдСдс	ссддедссдс	сдсасассдс	садсдсСадд	60
ддСсаасддд	дсаадсадад	дддссдсдсд	сСдассдсса	СссассСдаа	сдСдассдас	120
сСдддссСдд	дсСасдадас	сааддаддад	ссдассССса	ддсасСдсад	сддсадсСдс	180
дасдссдссд	адассассСа	сдасаадаСс	сСддссаасс	сдадсаадаа	саадсддссд	240
дСсСссдада	аддсдддсса	ддссСдсСдс	аддсссаСсд	сссссдасда	сдассСдадс	300
ССссСддасд	асаассСддС	дСассасаСс	сСдаддаадс	асадсдссаа	дадасдсддс	360
сдсасс						366

<210> 22 <211> 122 <212> РРТ <213> АгЫ£1с1а1 Зедиепсе <220>

<223> ЗупСЬеПс СопзСгисС <400> 22

МеС Ьуз Ьеи Тгр Азр Уа1 Уа1 А1а Уа1 Суз Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи Ηίί ТЬг 1 5

Claims (14)

1. Вариант ΟΌΝΕ (нейротрофического фактора глиальных клеток) человека, содержащий последовательность аминокислот 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 23

КОСКОКОКСтСХЧ.ТАТШ.КУТОЬСЬОУЕТКЕЕЫРКУСЯСгЗСОААЕТТУОКЕЬХаа^МЬЗХ аа₈вМХаа₉₀ВЬУЗЕКУ(ЮАСС1и>1АГОООЬ5РЬООМЬУУН1ЬКХаа125Н5АКХаа₁зоСОС1, где

ί) Хаа₈₄ представляет собой К или А; ίί) Хаа₈₈ представляет собой К или К; ίίί) Хаа₉₀ представляет собой К или К; ίν) Хаа1₂₅ представляет собой К или Е; ν) Хаа1₃₀ представляет собой К или Е.

2. Вариант ΟΌΝΕ человека по п.1, отличающийся тем, что указанный вариант выбран из группы, состоящей из

КСОКОКрКОС¥ЬТА1НЬМУТОЬОье¥ЕТКЕЕЫРК.УС808СОААЕТГГОК1ЬКМЬ8КМК ЕЬУ8ЕКУООАССКР1АРОЬЬЬ8РЬОЬМЬУУН1ЬЕКН8АККСОС1 ($ЕС) ГО N0:9), КООКОКОКОСУЬТА1НЬХУТОЬОЬОУЕТКЕЕЫРКУС808СПААЕТТУОК1ЬАНЬ8КНК КЬУ8ЕКУСОАССЕР1АРОООЬ8РЬООМЬУУН1ЬККН8АКК.ССС1 (8ЕО ГО ΝΟ: 12) и КООКОКОК.ОСУЬТА1НЬОТТОЬОЬОУЕТКЕЕиРКУС808СОААЕТТУОК1ЬАКЬ8К14К 1ФУ5екуооасскр1ароооь8Р1гоо^уун1ькен8акесос1 (.зео го νοη/

3. Вариант ΟΌΝΕ человека по п.2, отличающийся тем, что указанный вариант представляет собой

КС.0КОК0КОС\ЪТА1Н1Л'УТОЬОЬОУЕТКЕЕЫРК¥С5О5СОААЕТТУОК1ЬККЬ8КИК К1.УЗРК7СОАССКР1АРР001.3Р1.00НЬУУН1ЬККН8АККСОС1 (ЗЕ<). ГО: 9).

4. Вариант ΟΌΝΕ человека по п.2, отличающийся тем, что указанный вариант представляет собой

КО0КСК0КОСУЕТА1НЬИУТОЕОЕОУЕТКЕЕЕ1РКУС8ОЗСОААЕТТУОК1ЬА^8К1Ж 1ФУЗЕКУСОАССКР1АРОООЬЗРЬОР^УУН1ЕККНЗАК1<СОС1 (8Е<> ГО ΝΟ: 12)

5. Вариант ΟΌΝΕ человека по п.2, отличающийся тем, что указанный вариант представляет собой

КООКОКОКОС\ЪТАШЬЛУТОЬОЬОУЪТКЕЕЕ[РКУС308СОААЕТТУОК1ГАИЬЗКМ< КЬУ8ЕКУСК)АССКР1АРОПОЬЗРЬООМЕУУН1ЕКЕН8АКЕСОС1 (ЗЕО ГО N0:15).

6. Промежуточное соединение, используемое в получении Δ31-N-укороченного варианта ΟΌΝΕ, содержащее последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из

- 29 025129

МЕТОТЬЬЬУ/УЪЕЬУ/УРОЗТОКСЦКОКСЖОСУЪТМНЬХУТОЬОЬОУЕТКЕЕиРКУСЗ О5СОА ΑΕΤΤΥΕ>ΚΤΕΚΝΕ5Κ.ΝΚΚΤ.ν5ΕΚνίϊΟΑΓ(^-;Κ.ΡΙΛΡΟΟΟΕ3ΡΕΟΟΝΕνΥΗΙΕΚΚΗ5Λ ККССС1 (8Εζ> ГО ΝΟ: 28); и

ΜΑΤΟ3ΚΊ3ΕΕΕΑΓΟΙ,ΙΧΙΕΡ\νΕ0ΕΟ5ΑΚΟ0ΚΟΚ0ΚΟ0νΕΤΑΙΗΕΝνΤΟΕΟΕΟΥΕΤΚΕΕΕΙ ΡΚΥΤ3080ΟΑΑΕΤΤΥηΚΙ[.ΚΝΙ,5ΚΝΚΚ.Εν8ΕΚνθρΛ0€ΚΡ1ΑΡΟΟΟΕ8ΡΕΟΟΝΕνΥΗΙΕΚ КН8АККСОС1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 35).

7. Промежуточное соединение по п.6, отличающееся тем, что последовательность аминокислот представляет собой

ΜΑΤΟ8ΚΤ5ΕΕΕΑΡΟΕΕ0ΕΡ\νΤ.0ΕΟ5ΑΚ(.Κ)Κ(}Κ0ΚΟθνΕΤΑΙΗΕΝνΤΟΕΟΕ(.ίΥΕΤΚΕΕΕΙ ΡΚ.Υ⁷03Ο80ΟΑΑΕΊΓΥϋΚΙΕΚΝΕ3ΕΝΚΕΕν8ΕΚ\'Ό0Α€€ΚΡΙΑΡΟϋΟΕ3ΡΕΟΟΝΕνΥΉΙΕΚ. КН8АККСОС1 (5Ер ГО ΝΟ: 35).

8. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант ΟΌΝΡ человека по любому из пп.1-5 и один или более фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или вспомогательных веществ.

9. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение эффективного количества композиции по п.8 нуждающемуся в этом пациенту - человеку.

10. Вариант ΟΌΝΡ человека по любому из пп.1-5 для применения в качестве лекарственного средства.

11. Вариант ΟΌΝΡ человека по любому из пп.1-5 для применения для лечения болезни Паркинсона.

12. Способ лечения болезни Паркинсона у млекопитающего, включающий этап введения млекопитающему варианта ΟΌΝΡ человека по любому из пп.1-5.

13. Вариант ΟΌΝΡ человека по любому из пп.1-5 для применения в качестве терапевтического средства.

14. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества варианта ΟΌΝΡ человека согласно любому из пп.1-5.