CN103635201A - 人gdnf的变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的新型变体及其使用方法。

Description

人GDNF的变体
本发明涉及医药领域，特别是治疗性蛋白的领域。具体地，本发明涉及人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的新型变体。GDNF的新型变体可用于帕金森氏病的治疗。
GDNF是公知的神经营养因子，据报道，其在体外和体内向多巴胺能神经元提供营养支持。此外，已报道，GDNF在帕金森氏病的啮齿动物和灵长类动物模型中提供功能性改善并具有神经保护作用。已将来自大肠杆菌(E. coli)的野生型GDNF蛋白经中枢给药至患有帕金森氏病的患者，并获得了混合的结果。在两个小型开放标签研究(open labeled studies)中报道，野生型GDNF产生了对运动功能的长期改善。然而，在34名患者的随机、安慰剂对照、IIa期试验中，GDNF的壳内递送(intra-putamenal delivery)在6个月没有显示症状改善。生物标记物信号的增加仅明显可见于输注部位周围的近邻组织。一个近期的报道指出，GDNF可能是有望挽救垂死神经的分子；然而，将此分子递送至正确的脑区域仍是严峻的挑战(Nature, Vol 466:19，2010年8月)。
WO97/11964 (PCT/US96/14915)中报道了截短的GDNF蛋白；然而，仍需要具有期望的药理学性质、稳定性和生物-分布特性的新GDNF变体。需要变体形式的GDNF，其在递送装置中稳定，并且有利于期望的脑部生物-分布，同时展示期望的效力和可接受的免疫原性性质。提供一种或多种这些期望性质的GDNF变体可以成为在药学上有用的新药物疗法，特别是用于帕金森氏病的治疗中。
本发明提供了缺少N-末端的前31个氨基酸的成熟人GDNF结构域的新型截短的GDNF变体(“Δ31-N-末端截短的GDNF”)，并具有引入的某些氨基酸取代，以提供稳定、效力适合，提供期望的生物-分布特性和药学可接受的免疫原性概况的GDNF变体。本发明提供了给出超过成熟人野生型GDNF的一个或多个优点的人GDNF的某些变体，包括与人野生型GDNF相比，具有改进的药物稳定性，以及改进的生物分布，减少的肝素结合，减少的脱酰胺化，对琥珀酰亚胺形成的敏感性降低，以及免疫原性潜力降低的变体。某些新GDNF变体可能成为对帕金森氏病患者有用的新治疗选择。
本发明提供了人GDNF变体，其包含SEQ ID NO: 23：
Figure 318966DEST_PATH_IMAGE001
i) Xaa84是K或A；
ii) Xaa88是R或K；
iii) Xaa90是R或K；
iv) Xaa125是K或E；和
v) Xaa130是R或E。
本发明进一步提供了人GDNF变体，其中，所述变体选自：
Figure 476300DEST_PATH_IMAGE004
Figure 352989DEST_PATH_IMAGE005
。
一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO: 9中所示氨基酸序列的人GDNF变体：
Figure 175451DEST_PATH_IMAGE006
Figure 504801DEST_PATH_IMAGE007
。
本发明进一步提供了可用于制备成熟人GDNF的Δ31-N-末端截短的变体的中间体。所述中间体包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23：
Figure 703701DEST_PATH_IMAGE008
Figure 434897DEST_PATH_IMAGE009
 其在N-末端具有分泌信号肽的延伸。本发明中可使用多种分泌信号肽序列。示例性的分泌信号肽序列包括具有序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 25)的鼠κ前导分泌信号肽，和具有序列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 32)的人生长激素分泌信号肽。
具有这些分泌信号肽的中间体能够以超过具有其他前导序列的截短GDNF构建体的提高产量产生本发明要求保护的人GDNF变体。因此，所公开的包含分泌信号肽的中间体具有以下的氨基酸序列：
Figure 428261DEST_PATH_IMAGE010
Figure 244907DEST_PATH_IMAGE011
Figure 44236DEST_PATH_IMAGE012
。
本发明提供了药物组合物，其包含本发明要求保护的人GDNF的变体和一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。本发明提供了人GDNF的变体，其作为药物使用。本发明进一步提供了人GDNF的变体，其用于帕金森氏病的治疗。本发明提供了GDNF的变体，其用作治疗剂。
优选其中Xaa84是A，Xaa88是K，且Xaa90是K的变体。
优选其中Xaa84是K，Xaa88是R，且Xaa90是R的变体。
优选其中Xaa125是K且Xaa130是R的变体。
优选其中Xaa84是A，Xaa88是K，且Xaa90是K，Xaa125是E且Xaa130是E的变体。
发明详述
已报道，野生型GDNF很可能通过定位于N-末端1-31个氨基酸残基中的正电荷而结合肝素和细胞外基质，由此限制了GDNF在递送后在脑部中的分布(Lin等人，J Neurochem 63, 758-768, 1994；Rickard等人，Glycobiology 13, 419-426, 2003；Piltonen等人，Experimental Neurology 219, 499-506, 2009)。还有报道，GDNF在帕金森氏病的啮齿动物和灵长类动物模型中提供功能性改善并具有神经保护作用(Tomac等人，1995；Gash等人，1996)。已将来自大肠杆菌的野生型GDNF蛋白经中枢给药至患有帕金森氏病的患者，并获得了混合的结果。在两个小型开放标签研究中，GDNF产生了对运动功能的长期改善(Gill等人，2003；Slevin等人，2005)。此外，在死于无关病因(心肌梗塞)的一位患者中明显可见多巴胺能神经元萌发(sprouting)增加(Love等人，2005)。然而，在由Amgen实施的34名患者的随机、安慰剂对照、IIa期试验中，GDNF (Liatermin)的壳内递送在6个月没有显示症状改善(Lang等人，2006)。与此前测试的来自大肠杆菌的野生型GDNF蛋白相比，本发明要求保护的GDNF变体显示出改进的性能。
包含信号肽(前19个氨基酸，SEQ ID NO: 4)、前结构域(斜体，SEQ ID NO: 5)和成熟肽(下划线，SEQ ID NO: 3)的野生型GDNF全长构建体序列(211aa)如SEQ ID NO: 1所示：
Figure 567621DEST_PATH_IMAGE013
Figure 59782DEST_PATH_IMAGE014
。野生型GDNF的全长DNA序列如SEQ ID NO: 2所示：
Figure 301408DEST_PATH_IMAGE015
。
本发明变体的氨基酸位置由成熟人野生型GDNF的134个氨基酸的多肽(SEQ ID NO: 3)确定。突变的名称依次为原始氨基酸、该氨基酸位置的编号、替换的氨基酸。各变体的数字名称是基于截短前的野生型成熟序列(“成熟WT GDNF”)。例如，将第84位的Lys (K) (即K84)取代为Ala (A)，命名为K84A。以类似的方式，将第84位的Lys (K)取代为Ala (A)、将第88位的Arg (R)取代为Lys (K)、将第90位的Arg (R)取代为Lys (K)，并将第95位的Asp (D)取代为Glu (E)的多个取代命名为K84A/R88K/R90K/D95E。如本文使用的缩写“KAKKE”是指K84A-R88K-R90K-D95E。
本文使用的“全长GDNF”是指完整的蛋白序列，包括信号肽、前结构域和成熟结构域。
本文使用的“成熟GDNF”或“全长成熟GDNF”是指完整的GDNF成熟结构域(切除了信号肽和前结构域)。
本文使用的“Δ31-N-末端截短的GDNF”是指缺少了N-末端的前31个氨基酸的GDNF成熟结构域。本文使用的“Δ31-N-末端截短的GDNF”和“人GDNF变体” (或“GDNFv”)可互换地使用。
在HEK293细胞中转染超过5天时，全长GDNF构建体主要产生全长成熟GDNF。在将全长GDNF构建体在CHO细胞中转染较长一段时间时，以及在稳定细胞系生成期间，截短形式的GDNF是主要的形式(Lin等人，Science 260, 1130-1132, 1993)。Delta31 (“Δ31”)，即，其中N-末端编号1至31的氨基酸残基已被缺失的截短变体形式的成熟人GDNF，具有SEQ ID NO: 8，并可从混合物纯化。
可通过在DNA水平缺失前结构域肽序列和成熟GDNF肽的前31个氨基酸残基，并使用多种分泌信号肽序列，例如天然GDNF分泌信号肽(SEQ ID NO: 4：MKLWDVVAVCLVLLHTASA)；鼠κ前导分泌信号肽(SEQ ID NO: 25：METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；和人生长激素分泌信号肽(SEQ ID NO: 32：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)，在哺乳动物或细菌表达系统中产生N-末端截短的Δ31 GDNF变体。这些构建体可产生单种类的同质的Δ31-N-末端截短的GDNF变体。
本领域普通技术人员可理解，本发明要求保护的GDNF变体不排除糖基化的可能性。本发明要求保护的GDNF变体可以适当地糖基化，这依赖于所使用的表达系统。例如，哺乳动物表达的GDNF变体在N49位糖基化，而细菌表达的变体则没有。
在表达期间使用全长天然序列构建体(SEQ ID NO: 2)时，产生具有各种N-末端截短的GDNF种类的混合物，以及带有或没有前结构域区域的成熟形式(未截短的)。
可使用基本如下文所述实施的以下实施例以评估本发明的人GDNF变体的某些特征。
实施例1
蛋白表达、纯化和免疫原性分析
a. 大肠杆菌表达的GDNFv的亚克隆、突变、表达、去折叠、再折叠和纯化
亚克隆：在37℃，将带有质粒pET-30a(+)/rhGDNF的大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL，在包含30 μg/ml终浓度的卡那霉素的Luria-Bertani液体培养基上培养过夜。通过离心收集细胞后，根据制造商的方案，通过使用QIAquick Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒载体。随后，将分离的质粒DNA用于Δ31-GDNF和Δ31-N38Q-GDNF基因的引物延伸反应，所述Δ31-GDNF和Δ31-N38Q-GDNF基因分别编码Δ31-GDNF蛋白(从成熟人GDNF的N-末端截短31个残基)和Δ31-N38Q-GDNF蛋白(从第38位的天冬酰胺被谷氨酰胺取代的成熟人GDNF的N-末端截短31个残基)。这可以使用包含设计用于退火至所述基因的5'和3'末端的NdeI和XhoI限制性内切核酸酶位点的寡核苷酸引物Δ31-for、Δ31-rev、Δ31-N38Q-for和Δ31-N38Q-rev (分别为SEQ ID NO:6、7、39和40)完成。引入至有义和反义引物5'-末端的NdeI和XhoI限制性位点允许将Δ31-GDNF和Δ31-N38Q-GDNF克隆至载体pET-30a(+)的对应位点。通过在100 μl的总体积中使用80 ng模板DNA、正向和反向引物和PCR Supermix (Invitrogen #10572-014)，进行在94℃ 3分钟，随后为94℃ 1分钟，55℃ 0.5分钟和72℃ 1分钟的16个3步循环，以及在72℃ 10分钟的最后步骤的引物延伸反应。在琼脂糖凝胶电泳上核实所得扩增子，并根据制造商的方案，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)净化。
使用NdeI和XhoI，将扩增的Δ31-GDNF或Δ31-N38Q-GDNF基因和pET-30a(+)载体在37℃消化2小时，随后使用QIAquick凝胶提取试剂盒通过琼脂糖凝胶电泳纯化DNA。随后，使用T4 DNA连接酶并根据制造商的方案，将Δ31-GDNF或Δ31-N38Q-GDNF连接到pET-30a(+)质粒。根据制造商的方案(Agilent #230280)，使用2-5 μl连接反应混合物直接转化50-100 μl的大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL的化学感受态细胞。通过使用标准T7启动子和T7终止子寡核苷酸引物对所提取质粒在两个方向上进行测序，在通过平铺在包含30 μg/ml终浓度的卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板上而获得的所得转化体菌落中，筛选正确构建体的存在。
突变：使用QuikChange多定点诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)进行定点诱变，以制备Δ31-N38Q-D95E-GDNF和Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF。此方法使用插入到pET-30a(+)中的Δ31-N38Q-GDNF作为模板，并使用Δ31-N38Q-D95E-for和Δ31-N38Q-D95E-rev寡核苷酸(表1，SEQ ID NO:41和42)分别作为正向和反向引物。随后，使用插入到pET-30a(+)中的成功突变的Δ31-N38Q-D95E基因作为模板，并使用Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-for和Δ31-K84A-R88K-R90K-D95E-D95E-rev寡核苷酸(表1，SEQ ID NO:43和44)分别作为正向和反向引物，从而产生Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-GDNF。确认DNA序列，并将质粒转入大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL的化学感受态细胞。
蛋白表达：在37℃，使用带有质粒pET-30a(+)/GDNFv的大肠杆菌细胞BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL的永久冷冻储液(Permanent frozen stocks)接种50 ml包含30 μg/ml终浓度的卡那霉素的2xTY液体培养基。9小时后，在37℃，使用5 ml起始培养物接种6 × 2升相同的液体培养基。当培养物在600 nm的光密度达到0.8至1.4之间时(通常在16小时后)，添加IPTG至1 mM的终浓度，并将培养温度降低至27℃至30℃，持续5小时。通过在4℃，以10,000g离心20分钟收集细胞，并在-80℃贮存。
溶解-再折叠：将细胞糊(cell paste)悬浮在2-3体积的0.2 mg/ml溶菌酶、5mM MgCl2和50 mM Tris-Cl (pH 8)的溶液中，并使其在搅拌下在冰上孵育30分钟。将所得浆料在冰上超声处理10分钟(5秒脉冲，2秒间隔，30-40%的幅度)。此后，回收包涵体形式的GDNFv，通过以20,000g离心20分钟将其从细胞裂解物分离并溶解在4M胍、90 mM半胱氨酸、20 mM Tris-Cl (pH 8.5)中。通过使用0.2 M胍、2M尿素、20 mM Tris-Cl (pH 8.75)的10倍稀释，使所述蛋白再折叠成活性形式。将再折叠的混合物在4℃保持2天。
纯化：通过3步柱色谱将再折叠的GDNFv纯化至同质：
1. SP柱上的阳离子交换色谱(CEX)
2. 苯基柱上的疏水相互作用色谱(HIC)
3. Superdex-75柱上的尺寸排阻色谱(SEC)。
首先，将复性的蛋白上样至在20 mM乙酸钠(pH 5)中平衡的SP Sepharose快速流动柱。使用20 mM乙酸钠(pH 5)中从0.3至1 M NaCl的线性递增盐梯度洗脱GDNFv。向CEX主流合并物(mainstream pool)补充NaCl至2.5 M的终浓度，随后上样至20 mM柠檬酸钠(pH 5)中的苯基Sepharose HP疏水相互作用色谱柱。使用20 mM柠檬酸钠(pH 5)中从2.5至0 M NaCl的线性递减盐梯度洗脱HIC柱。GDNFv与HIC柱紧密结合。随后，浓缩HIC主流合并物，并最后上样至Superdex-75柱，并使用PBS (pH 7.4)洗脱蛋白。浓缩最后的合并物，通过0.22微米膜过滤并在-80℃贮存。
b. GDNFv在哺乳动物细胞中的表达和纯化
可在CMV启动子驱动的哺乳动物表达载体中，使用标准的分子生物学技术或通过基因合成制备编码GDNF变体的基因。使用重组质粒瞬时转染人胚肾293EBNA (HEK293)细胞，并在5天后收获培养基。在另一种方法中，生成稳定的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以表达GDNF变体。根据制造商的说明，将编码变体蛋白的基因亚克隆至包含谷氨酰胺合成酶(GS)的表达质粒骨架(基于pEE12.4的质粒，Lonza Biologics, Slough, UK)中，与带有前-结构域的天然GDNF信号序列的读框相符合(in frame)。将基于pEE12.4的载体中的全长GDNF构建体(SEQ ID NO.2)转染到CHO中，并产生截短形式的GDNF，其中，Δ31是主要形式并可从混合物中纯化。在除去前-结构域和N-末端的前31个氨基酸时，随后在哺乳动物表达系统中有效且清洁地产生出Δ31-N-末端截短的GDNF变体，而无需如此前报道的从全长和截短产物的混合物中进行纯化。还可将天然GDNF分泌信号肽替换为多种分泌信号肽，包括鼠κ前导分泌信号肽或人生长激素分泌信号肽。使用所有公开的分泌信号肽仍有效且清洁地产生所述Δ31-N-末端截短的GDNF变体，但具有不同的表达水平。将引入了期望突变的GDNF变体亚克隆至适合的表达载体(例如pEMK-NF2，Lonza)，与鼠κ信号序列的读框相符合。
纯化：通过4个步骤的珠色谱纯化GDNFv至同质：
1. SP柱上的阳离子交换色谱(CEX)
2. 苯基柱上的疏水相互作用色谱(HIC)
3. 多模式Capto MMC柱上的阳离子交换色谱(CEX)
4. Superdex-75柱上的尺寸排阻色谱(SEC)。
简要而言，首先，将收获的包含GDNF变体蛋白的培养基上样至在20 mM乙酸钠(pH 5)中平衡的SP Sepharose快速流动柱。使用20 mM乙酸钠(pH 5)中从0至1 M NaCl的线性盐梯度洗脱GDNFv。向CEX主流合并物补充NaCl至2.5 M的终浓度，随后上样至20 mM乙酸钠(pH 5)中的苯基Sepharose HP疏水相互作用色谱柱。使用20 mM乙酸钠(pH 5)中从2.5至0 M NaCl的反向线性盐梯度洗脱HIC柱。GDNFv与HIC柱微弱结合。随后，将流过物和早期洗脱级分的合并物上样至Capto MMC柱的多模式树脂(pH 5)。使用50 mM Tris-Cl (pH 8)洗柱，并且，随后使用50 mM Tris-Cl (pH 8)中0至1 M NaCl的线性盐梯度洗脱GDNFv。最后，将Capto MMC主流上样至Superdex-75柱，并使用PBS (pH 7.4)洗脱蛋白。将最后的合并物通过0.22微米膜过滤并在2-8℃贮存。
免疫原性潜力的Epivax分析
制备所选择的结合HLA-DR的可能性降低的人GDNF变体(SEQ ID NO: 12和15)，并在GFRα和肝素结合测试中与野生型GDNF比较。
实施例2
GDNF野生型和Δ31 GDNF变体的稳定性
可使用多种分析技术，例如RP-HPLC、SE-HPLC、阳离子交换HPLC和质谱评估全长成熟GDNF野生型和Δ31-N-末端截短的GDNF变体的稳定性，以鉴定这些分子中的任何降解位点。随后，进行突变以除去所述化学降解位点，从而改进人GDNF变体的稳定性。
分析性反相色谱(RP-HPLC)：在60℃加热的Zorbax C8 SB-300?，3.5微米，4.6 x 50 mm柱(Agilent Technologies # 865973-909)上。流动相是H2O中的0.1% TFA。通过30分钟期间5至50%的线性乙腈梯度，以1 ml/min的流速进行35分钟，洗脱出作为214 nm的单峰，具有19-20分钟的保留时间的GDNFv。
分析性尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)：在TSK-G-2000-SW-XL，5微米，7.8 x 300 mm柱(TOSOH BIOSEP #08540)上。流动相：PBS + 350 mM NaCl，pH 7.4；流速0.5 ml/min，进行35分钟。洗脱出作为214 nm的单峰，具有~16-17分钟的保留时间的GDNFv。
分析性阳离子交换色谱(CEX-HPLC)：在Dionex，Propac WCX-10，4 x 250 mm柱(Dionex #054993)上。流动相是20 mM磷酸钠，10%乙腈，pH 7。通过45分钟期间0.15至0.6 M NaCl的线性盐梯度，以1 ml/min的流速进行52分钟，洗脱出作为复合峰(complex peak)，具有25-30分钟的保留时间的GDNFv。
野生型(全长细菌GDNF)相比于野生型CHO GDNFv (N-末端Δ31截短的GDNF)的化学稳定性分析(LC-MS)
对野生型(全长细菌GDNF)相比于野生型CHO GDNFv (N-末端Δ31截短的GDNF)在37℃胁迫处理4周，以鉴定可能与化学不稳定性相关的氨基酸。
样品
1- 在4℃处理4周的野生型大肠杆菌全长GDNF，1.0 mg/mL
2- 在37℃处理4周的野生型大肠杆菌全长GDNF，1.0 mg/mL
3- 在4℃处理4周的野生型CHOΔ31-GDNFv，1.0 mg/mL
4- 在37℃处理4周的野生型CHOΔ31-GDNFv，1.0 mg/mL。
完好和部分的分子分析：将各样品的10 μL等分试样(将溶液与20 μL水或各溶液的10 μL等分试样混合)与40 μL的100 mM tris-HCl缓冲剂(pH 8)、1.0 μL的50 mg/mL DTT在室温下混合30分钟。对各样品进行LC/MS分析。
Lys-C消化 ：将各样品溶液的20 μL等分试样在快速真空系统下冻干至干燥，并且，随后将材料复溶在0.5 μL的50 mg/mL DTT和4.5 μL的6 M胍-HCl、0.5 M tris-HCl缓冲剂(pH 8)中。将此混合物在37℃孵育30分钟，并且，随后将各溶液用93 μL的水稀释，并使用2 μL的0.2 mg/mL Lys-C (Wako)在37℃处理2小时。对于CHO GDNFv，使用0.5 μL的PNGase F在37℃处理30 μL的胰蛋白酶消化物，持续1小时(以评估碳水化合物概况)。在LC/MS分析前，使用2 μL在H2O中的10% TFA酸化消化物。
LC/MS分析 ：通过与Waters Acquity UPLC联用的Waters SYNAPT质谱仪，或与Waters 2795 HPLC联用的Water LCT Premier质谱仪分析样品溶液。
自上而下分析 ：通过对部分还原的GDNF的LC-MS分析获得了野生型GDNF的切割产物。鉴定了多种切割产物，并且在表2中显示了那些切割物的定量数据。多种切割物(N15/R16、N22/P23、N25/S26和N38/R39之间的切割)具有与通过琥珀酰亚胺形成的脱酰胺化类似的降解途径。对于野生型CHOΔ31-GDNFv，从N-末端切除前31个氨基酸残基。尽管CHO GDNFv每条链具有2个潜在的N-糖基化位点，但只有一个位点是N-糖基化的。所见的主要聚糖是带有不同半乳糖苷化的二-或三-天线寡糖。有趣的是，没有检测到显著唾液酸化的聚糖(表3)。
自下而上分析(肽作图) ：还原的GDNF稳定性样品的Lys-C消化物的UV色谱图显示，除GDNF肽126-129之外，检测到了所有预期的肽。对于CHO材料，没有检测到N-末端肽(R32之前)。包含N49的肽38-60是糖基化的，并且占据了大于95%的Asn49。包含N85的肽85-96没有糖基化。这些结果与还原的GDNF样品的LC/MS分析一致。
综上，对于野生型和CHO材料，同源二聚体都是主要的组分。早期洗脱的次要组分是单体。根据质谱分析，对于单体，GDNF Cys41与游离Cys残基形成二硫键。单体峰的相对百分比非常低，且通过紫外分析，对于CHO其<1%，且对于野生型则<0.5%。对于经过胁迫处理的材料，单体含量没有改变。
还从肽作图获得了降解的情况，例如氧化、脱酰胺化和异构化。结果显示在表4中。来自大肠杆菌的野生型全长GDNF包含2个Met残基：M(-1)和M6，且对那些位点的氧化相对较低。GDNF不包含任何Trp残基。对于全长单体，GDNF具有8个Asp残基。主要的脱酰胺化位点是N25和N38。由于脱酰胺化在高pH缓冲剂中发生得快得多，在pH 5或6的缓冲剂中进行胁迫时，那些位点的相对百分比应较低。鉴定了一个异构体肽(85-96)，但不清楚是由于Asp至异-Asp的异构化，还是由于氨基酸残基的外消旋化。公知高pH胁迫处理通常是外消旋化，而低pH胁迫处理则是Asp异构化。对于野生型全长GDNF，多个肽对于对照(4℃)和胁迫(37℃)样品二者都显示了不同的质量。它们最有可能是在大肠杆菌生物合成期间的错误引入。
Figure 682732DEST_PATH_IMAGE018
Figure 411654DEST_PATH_IMAGE019
Figure 552785DEST_PATH_IMAGE020
这些数据表明在37℃胁迫处理4周时，与大肠杆菌产生的全长野生型成熟人GDNF相比，由于缺失了包含显著的氧化和脱酰胺化热点的前31个氨基酸残基，在CHO细胞中产生的Δ31-N-末端截短的GDNF变体具有改进的化学稳定性。此外，如表5中所示，与全长野生型大肠杆菌GDNF或突变前的Δ31-N-末端截短的GDNF变体相比，在突变后，观察到两种突变的Δ31-N-末端截短的GDNF变体(分别为N38Q和D95E)的生物物理和生物化学性质的显著改进。
Figure 50763DEST_PATH_IMAGE021
Figure 822410DEST_PATH_IMAGE022
Figure 835365DEST_PATH_IMAGE023
实施例3
体外结合活性
以下测试证实了人GDNF的某些变体降低了肝素结合，同时保留了GFRα1受体结合，从而提供了多种差异性肝素和受体结合特征。
·GDNFv与GFR在Biacore上的结合动力学
GDNF变体(GDNFv：N-末端-Δ31-截短的)可在大肠杆菌(细菌)或哺乳动物细胞(CHO细胞或HEK293 EBNA细胞)中表达，并如实施例1中所述纯化。无论使用哪种表达系统，变体的一级序列保持相同。
使用Biacore? 2000仪器测量GDNFv与人和大鼠GDNF家族受体(GFRα1和GFRα2)的结合动力学。在25℃进行测量。将样品溶解在HBS-EP缓冲剂(150 mM氯化钠、3 mM EDTA、0.005% (w/v)表面活性剂P-20，pH 7.4)中。使用胺偶联化学，以~200个应答单位(RU)的水平，将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A固定在CM4传感器芯片(GE Healthcare #BR-1005-39)的流通池1至4上，以捕获GFR Fc嵌合体(重组人GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc嵌合体；重组人GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc嵌合体；重组大鼠GFRα-1/GDNF Rα-1 Fc嵌合体；重组小鼠GFRα-2/GDNF Rα-2 Fc嵌合体)。
使用多个循环评估结合。每个循环由以下步骤组成：1) 注射大约10 μL的GFR，浓度为~1.0 μg/mL，且流速为10 μL/min，目的在于120-150 RU的捕获；2) 以50 μL/min的流速注射250 μL的GDNFv，终浓度范围在10 nM和0.04 nM之间，随后解离20分钟；和3) 使用约30 μL的10 mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.5)再生。使用4.1版BIAevaluation软件中的“1:1 (朗缪尔)结合”模型评估每个循环的结合率和解离率。
结果显示在下表6-8中。
Figure 717870DEST_PATH_IMAGE024
Figure 132671DEST_PATH_IMAGE025
Figure 75219DEST_PATH_IMAGE026
·使用ELISA，人GDNF变体与GFRα1的结合
在ELISA测试中检验GDNF野生型和变体，其中，测量GDNF蛋白与板结合受体(GFRα1)的结合。使用“无GDNF”条件和/或“无关蛋白”条件作为阴性对照。
使用70 μl的碳酸盐缓冲剂(pH 9.6)中的1μg/ml的人GFRα1 (重组人GFRα1-Fc嵌合体，无载体)包被96孔板(Greiner 655081免疫结合ELISA板)的每个孔。如果包被无关受体，则该无关受体是无关的Fc嵌合体，并且以与GFRα1相同的浓度包被。将板密封并在4℃孵育过夜。使用自动板清洗器，对孔进行抽吸，并用清洗缓冲剂(20 mM Tris(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20)清洗2次。在室温下，使用每孔200 μl封闭缓冲剂(上述清洗缓冲剂中3%的Carnation速溶奶粉)封闭板至少1小时。用清洗缓冲剂清洗平板2次。
将GDNF蛋白在封闭缓冲剂中连续稀释到适当的浓度范围，通常从5 μg/ml开始并以1:10连续稀释。使用由单独的封闭缓冲剂组成的无GDNF对照。将50 μl的每种GDNF溶液添加到GFRα1包被的孔，一式三份。将板在室温下孵育1.5小时。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。
向每个孔添加在封闭缓冲剂中稀释至1 μg/ml浓度的生物素化抗人GDNF抗体(R&D Systems，生物素化山羊抗人GDNF多克隆抗体，目录号# BAF212)的50 μl等分试样，并在室温孵育45分钟。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。
向每个孔添加以1:1000稀释在封闭缓冲剂中的辣根过氧化物酶-缀合的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch，目录号# 016-030-084)的50 μl等分试样，并在室温孵育20-30分钟。或者，可以使用1:2000的稀释度，以及30-90分钟的孵育时间。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。向每个孔添加50 μl的显色底物(即，OPD底物)，并允许其在室温显色2-3分钟。通过向每个孔添加100 μl的1N HCl终止反应。在Molecular Devices SpectraMax250板读数器上读取所述孔在490 nm的吸光度。测定每种条件下重复三次的孔的平均吸光度，并将所得数值处理以使用Graph Pad Prism软件计算EC 50，从而提供95%的置信区间。那些区间总结在下表9中。
·使用ELISA，人GDNF变体与肝素的结合
在ELISA测试中检验GDNF野生型和变体，其中，测量GDNF蛋白与板结合肝素的结合。使用“无GDNF”条件作为阴性对照。
使用70 μl的PBS中5 μg/ml的肝素((来自Sigma的混合分子量肝素，来自猪肠粘膜(Porcine Intestinal Mucosa)的肝素钠盐，目录号# H-3149)包被96孔肝素结合板(BD BioSciences肝素结合板，目录号# 354676)的每个孔。将板密封并在室温下避光孵育过夜。使用自动板清洗器，对孔进行抽吸，并用清洗缓冲剂清洗3次。在37℃，使用每孔200 μl封闭缓冲剂封闭板90-120分钟(板在此孵育期间密封)。用清洗缓冲剂清洗板2次。
将GDNF蛋白在封闭缓冲剂中连续稀释到适当的浓度范围，通常从5 μg/ml开始并以1:10连续稀释。使用由单独的封闭缓冲剂组成的“无GDNF”对照。将每种GDNF溶液的50 μl等分试样添加到肝素包被的孔，一式三份。将板在室温下孵育1.5-2小时。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。
向每个孔添加在封闭缓冲剂中稀释至1 μg/ml浓度的生物素化抗人GDNF抗体的50 μl等分试样，并在室温孵育45分钟至1小时。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。
向每个孔添加以1:1000稀释在封闭缓冲剂中的辣根过氧化物酶-缀合的链霉亲和素的50 μl等分试样，并在室温孵育20-30分钟。或者，可以使用1:2000的稀释度，以及30-90分钟的孵育时间。随后，用清洗缓冲剂清洗孔3次。向每个孔添加显色底物(即，OPD底物)的50 μl等分试样，并允许其在室温显色2-3分钟。通过向每个孔添加100 μl的1N HCl终止反应。在板读数器上读取所述孔在490 nm的吸光度。测定每种条件下重复三次的孔的平均吸光度，并将所得数值处理以使用Graph Pad Prism软件计算EC 50，从而提供95%的置信区间。那些区间总结在下表9中。
表9
Figure 575471DEST_PATH_IMAGE027
*完成了2次单独实验，没有复合。
这些数据显示从野生型GDNF (名为“野生型大肠杆菌GDNF”)缺失N-末端31个氨基酸(名为“CHO Δ31 GDNF”的变体)能够显著减少肝素结合(约10倍)，同时保持GFRα1受体结合，并且，这些数据进一步表明，通过人GDNF的其他变体可获得各种差异性肝素和受体结合特征。
实施例4
体外活性
·NS-1神经突增生测试
使用大鼠Neuroscreen-1细胞(PC12亚克隆)评估GDNF对神经元分化的活性。在37℃，95%湿度下，将这些细胞培养在胶原蛋白包被烧瓶中的F-12K基础培养基、12.5%热灭活马血清、2.5%热灭活胎牛血清(FBS)、1X GlutaMAXTM (Invitrogen，目录号#35050061)和1X Anti-anti (Invitrogen, 目录号#15240)中。为了测量神经突增生，将Neuroscreen-1细胞以每孔2200个细胞接种到I型胶原蛋白96孔板的生长培养基中，仅使用内部60个孔。在细胞粘附24小时后，除去培养基，并向板添加包含1μg/ml GFRα1-Fc和在8点系列稀释中稀释的GDNF的新生长培养基，每个浓度重复3个孔或6个孔。对于测试中的细胞反应，包含作为阴性对照的加有1μg/ml GFRα1-Fc的培养基；并且包含作为阳性对照的加有25 ng/ml神经突生长因子的培养基。将板在37℃，95%湿度下孵育96小时，并且，随后通过向每个孔添加45μl固定溶液并在室温孵育1小时而固定。使用来自Neurite Outgrowth Hit KitTM (Cellomics, 目录号#K07-0001-1)的1X清洗缓冲剂清洗板2次，并且，随后使用来自该试剂盒的1X缓冲剂清洗2次。根据制造商的说明书，使用来自该试剂盒的神经突增生试剂对细胞进行免疫染色。将板加载到Arrayscan仪器，并使用Arrayscan软件和来自Cellomics的神经元概况分析(Neuronal Profiling)算法进行分析。将通过算法产生的数据处理以使用Graph Pad Prism软件计算EC50。
测试了多个变体在神经元分化中的活性，并且将对每个变体观察到的EC50列出在表10A中。
Figure 58405DEST_PATH_IMAGE029
本文中测试的所有GDNF样品在神经突增生测试中都具有不同程度的活性。Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E变体的剂量曲线在进行的两个实验中的最大剂量没有达到稳定水平，因此，不能计算EC50。其他4种GDNF变体的EC 50 95%置信区间在范围上重叠，证明了在此测试中的活性水平类似。
·C-Ret受体磷酸化
可使用c-Ret受体磷酸化测试证实诱导在Y1016位的cRet受体磷酸化。在来自经过稳定转染以过表达人c-Ret的人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y (ATCC)的细胞中评估GDNF的c-Ret受体磷酸化活性。将所述细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、10% FBS、3μg/ml杀稻瘟素中。对于c-Ret磷酸化，将所述细胞以5 x 105/孔接种到24孔胶原蛋白包被板中不含杀稻瘟素的生长培养基中，并允许其粘附过夜。将培养基更换成低葡萄糖的DMEM + 0.25% BSA (牛血清白蛋白)，培养24小时。除去饥饿培养基，并在37℃，将细胞在无葡萄糖的DMEM、0.25% BSA、1μg/ml GFRα1-Fc中，用GDNF处理30分钟。在多个浓度下检测每种GDNF变体。除去处理培养基，并在M-Per提取试剂 + 蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂1、磷酸酶抑制剂混合物2和磷酸酶抑制剂混合物3 (SigmaTM)的冰冷裂解缓冲剂中，从板表面刮下所述细胞。将细胞悬液涡旋至完全裂解，在14,000 x g离心以沉淀细胞碎片，并使用二喹啉甲酸(BCA)测试试剂量化上清液的蛋白浓度。对每份GDNF裂解物，通过4-12% NuPAGE? Novex? Bis-Tris凝胶(Invitrogen, 目录号#NP0322)分离10μg蛋白并转移至PVDF印迹。使用兔多克隆抗体和山羊抗兔HRP抗体检测酪氨酸1016磷酸-Ret；并使用小鼠单克隆抗体和山羊抗小鼠HRP抗体检测c-Ret。使用Supersignal West PicoTM (Thermo Scientific, 目录号#34081)试剂使印迹显色并曝光至X-射线底片。
在无葡萄糖DMEM、0.25% BSA培养基+ 1μg/ml GFRα1-Fc中检测5种GDNF变体(野生型大肠杆菌GDNF、CHO Δ31 GDNF、CHO Δ31-N38Q-D95E GDNF、CHO Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E GDNF和CHO Δ31-N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E-K125E-R130E GDNF)，在0.8、2.0、4.0、10、20、50和100 ng/ml的4种浓度下的c-Ret磷酸化活性。还测试了单独的培养基、培养基+ 1μg/ml GFRα1-Fc，和培养基+ 100ng/ml CHO Δ31 GDNF作为阴性对照。5种GDNF变体的每一种都以8-15ng/ml的EC 50诱导c-Ret磷酸化。这些数据证明所有5种GDNF变体都以剂量依赖的方式诱导Y1016位的c-Ret受体磷酸化。
如表10B中的总结，在37℃孵育4周后，显示出生物物理和生物化学性质的显著改善(表5、6、9和10A)的工程化Δ31-N-末端截短的GDNF变体，保持了优化的生物性质，例如相当的GFRα1受体结合、降低的肝素结合和相当的神经突增生。
实施例5
GDNF变体在DA转换测试(DA Turnover Assay)中的活性
使用异氟烷(O2中3%)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。对头部剃毛并用碘溶液消毒，然后将动物放置到带有温度控制垫的立体定位仪上。使用眼用凝胶保护眼部，并使用异氟烷(O2中1-2%)维持麻醉。
在动物头部做正中切口，折回头皮和皮下组织，并将头骨干燥至可见前囟。从前囟和硬脑膜表面测量尾状核的坐标，以用于GDNF输注。将28号输液套管缓慢降低至此位置，并在1分钟后，使用泵开始输注。在4分钟期间以0.5 μl/min向左脑半球推注2 μl的测试GDNF，并且一旦输注停止，将套管在原位进一步保留3分钟。一旦将套管取出，立即封闭切口位置，施用手术后止痛药，并允许动物在温度控制笼中恢复，然后转移到饲养笼。根据本地伦理准则，在手术后检查动物。在输注后的适当间隔，处死动物，取出脑并准确剖出尾状核，称重并冷冻以待进行多巴胺和代谢物的HPLC分析。
使冷冻组织快速解冻，并在0.5ml的匀浆缓冲剂(0.1 M高氯酸(PCA)、0.1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2.5mg/L抗环血酸)中匀浆，此后，在20,000g离心15分钟。取出上清液并过滤通过非注射式过滤装置。使用与电化学检测联用的HPLC进行多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的分析。注入每种样品的20μl等分试样，并相对外部校准曲线(LC4C，BAS，USA)定量。流动相由100 mM NaH2PO4、100 mM H3PO4、2 mM OSA、1mM EDTA、13%甲醇(MeOH) (pH 2.8)组成，在40℃，使用Hypersil BDS (碱钝化硅石) (Thermo Scientific, 目录号#28105) 150 x 3.0 mm C18 3μ颗粒柱。使用Empower色谱软件收集数据。在表示为ng/g湿重组织之前，对所有数据进行4-参数逻辑斯蒂拟合(logistic fit)。多巴胺转换测量值表示为(DOPAC+HVA)/DA，并进行左脑半球(经处理)相比于右脑半球(完好)的比较。
表11
Figure 706741DEST_PATH_IMAGE032
数值为平均值 ± s.e.m. 每组n =5
与完好一侧相比** p< 0.01或*** p<0.001。
所述数据证实了与完好的脑半球相比，表11中指出的每种GDNF变体都显著地提高了经处理的脑半球的多巴胺转换。
实施例6
体内测试
· 6-羟基多巴胺(6-OHDA)-诱导的逆行损伤模型
使用异氟烷(O2中3%)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。对头部剃毛并用碘溶液消毒，然后将动物放置到带有温度控制垫的立体定位仪上。使用眼用凝胶保护眼部，并使用异氟烷(O2中1-2%)维持麻醉。
在动物头部做正中切口，折回头皮和皮下组织，并将头骨干燥至可见前囟。从前囟和硬脑膜表面测量尾状核的坐标，以用于10ug 6-羟基多巴胺(6-OHDA)的输注。将28号输液套管缓慢降低至此位置，并在1分钟后开始输注。在4分钟期间以0.5 μl/min向左脑半球推注2 μl的6-OHDA，并且一旦输注停止，将套管在原位进一步保留3分钟。
在6-OHDA输注后30分钟，使用相同的方案输注测试GDNF。GDNF输注的坐标是从上文所述前囟和硬脑膜表面向前后(Anterior-Posterior) +1.0，LM -2.5, DV -4.5mm。
一旦将套管取出，立即封闭切口位置，施用手术后止痛药，并允许动物在温度控制笼中恢复，然后转移到饲养笼。根据本地伦理准则，在手术后检查动物。在输注后的适当间隔，处死动物，取出脑并准确剖出尾状核和黑质，称重并冷冻以待进行多巴胺和代谢物的HPLC分析。
使冷冻组织快速解冻，并在0.5ml的匀浆缓冲剂(0.1 M PCA、0.1 mM EDTA、2.5mg/L抗环血酸)中匀浆，此后，在20,000 xg离心15分钟。取出上清液并过滤通过非注射式过滤装置。使用与电化学检测联用的HPLC进行多巴胺(DA)、DOPAC和HVA的分析。注入每种样品的20μl等分试样，并相对外部校准曲线定量。流动相由100 mM NaH2PO4、100 mM H3PO4、2 mM OSA、1mM EDTA、13% MeOH (pH 2.8)组成，在40℃，使用BDS Hypersil 150 x 3.0 mm C18 3μ颗粒柱。使用Empower色谱软件收集数据。在表示为ng/g湿重组织之前，对所有数据进行4-参数逻辑斯蒂拟合。进行左脑半球(经处理)相比于右脑半球(完好)的比较。
表12：尾状核
Figure 631971DEST_PATH_IMAGE033
数值为平均值 ± s.e.m. 每组n = 8
与完好一侧相比*** p<0.001。
表13：黑质
Figure 918596DEST_PATH_IMAGE034
数值为平均值 ± s.e.m. 每组n = 8
与完好一侧相比*p<0.05，** p< 0.01或*** p<0.001
与媒介物(处理一侧)相比，# p<0.05，## p<0.01。
向尾状核施用6-OHDA导致经处理一侧的多巴胺水平与完好一侧相比显著降低(表12)。在黑质中也观察到显著的缺陷(表13)，其通过施用GDNF而得到预防。通过比较经处理一侧，本文测试的所有GDNF变体均显著不同于媒介物。
·大鼠脑中的急性生物分布
使用异氟烷(O2中3%)麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠。对头部剃毛并用碘溶液消毒，然后将动物放置到带有温度控制垫的立体定位仪上。使用眼用凝胶保护眼部，并使用异氟烷(O2中1-2%)维持麻醉。
在动物头部做正中切口，折回头皮和皮下组织，并将头骨干燥至可见前囟。从前囟和硬脑膜表面测量尾状核的坐标(前后 + 0.5，外内 -3.0，背腹 -5.5 mm)，以用于GDNF的输注。将30号输液套管缓慢降低至此位置，并在1分钟后开始输注(使用泵)。在4分钟期间以0.5 μl/min向左脑半球推注2 μl的测试GDNF，并且一旦输注停止，将套管在原位进一步保留3分钟。一旦将套管取出，立即封闭切口位置，施用手术后止痛药，随后允许动物在温度控制笼中恢复。在输注后的适当间隔，处死动物，取出脑并冷冻以待进行用于免疫组织化学的低温切片。
·大鼠脑中的GDNF免疫组织化学(IHC)
在免疫组织化学测试中检测输注的GDNF的生物分布，其中，在大鼠脑中测量抗体与输注抗原(GDNF和GDNF变体)的结合。使用同种型对照抗体作为阴性对照。
在-20℃的低温保持器内的同时，从修剪小脑开始冷冻大鼠脑的低温切片，使用大鼠脑模具以产生平整表面。将最佳切削温度TM (Optimal Cutting TemperatureTM，OCT，Sakura或其他类似的厂家)放在冷却的低温恒温器标本夹盘上。在OCT开始冷冻时，使用冷却至-20℃的钳子将大鼠脑的平尾侧表面放在标本夹盘上，以便OCT将脑钉在原位并使最前端脑(rostral-most brain)背向标本夹盘。将标本夹盘放在物品支架中并紧固。在将切片机刀片插入到刀架后，使用低温恒温器上的修剪功能弃去输注痕迹前端(rostral to the infusion track)的嗅球和大脑，以300 μm间隔获取厚8um的切片，并放在带正电的载玻片上。对每个大鼠脑，在每个载玻片上放2或3个相邻间隔的切片。随后，在室温下，将玻片在4%多聚甲醛中放置20分钟，并在Tris-缓冲盐水Tween-20 (TBST)清洗缓冲剂中冲洗。使用室温下的染色溶液，将玻片与双重内源性酶封闭物一起孵育10分钟，用TBST清洗缓冲剂冲洗，与抗生物素蛋白和生物素封闭物中每种孵育15分钟，用TBST清洗缓冲剂冲洗，使用蛋白封闭物封闭60分钟，并使用气刀吹出玻片。将生物素化的抗人GDNF或生物素化的山羊IgG在带有背景降低试剂的抗体稀释液中稀释至2 μg/ml，并在玻片上孵育60分钟，随后使用TBST清洗缓冲剂冲洗3次。将玻片与标记的链霉亲和素生物素2 (LSAB2) (Dako, 目录号#K0609)一起孵育10分钟，并使用TBST清洗缓冲剂冲洗。将玻片与DAB+ (DAB稀释剂中的2滴DAB)一起孵育5分钟，随后，使用TBST清洗缓冲剂冲洗，随后，使用蒸馏水冲洗。将玻片从自动染色仪取出后，将其使用HematoxylinTM复染，并使用Cytoseal XYLTM (Stephens Scientific, 目录号#8312-4)封片。使玻片干燥，并使用Aperio XT分析以量化生物分布。
·GDNF在大鼠脑中生物分布的量化
在Aperio ScanScope XT (运行v10.00.00.1805版的Controller软件)上的20X放大倍数设置下，获取玻片的图像。关于玻片的元数据(Meta data)储存在基于Aperio网络的软件Spectrum (v10.0.1346.1806)中。
使用Aperio的图像浏览软件ImageScope (v10.0.36.1805)，手工绘制每个脑切片的轮廓。对于第一个研究，绘制具有最少量的可见切片人为痕迹(artifact)的完整脑切片的轮廓。对于第二个研究，绘制最接近玻片标记的完整脑切片的轮廓。使用Aperio的“阳性像素计数”算法(v9) [所有参数保持其默认设置，只是图片放大 = .01 且强度阈值 WEAK(上限) = 235]分析每个绘制区域。
通过计算来自阳性像素算法的阳性和强阳性面积输出的总和，计算每只大鼠的GDNF分布面积(以mm2计)。使用配对的Student's t-检验测定统计显著性。
肝素结合的ELISA数据(表9)证明了与大肠杆菌-WT GDNF相比，对野生型GDNF的修饰能够降低肝素结合。这些数据，与表14中显示的以上生物分布数据一起，确认了降低肝素结合的变体能够导致大鼠脑中的生物分布增加。与大肠杆菌-WT-GDNF相比，以上表格中列出的N38Q-D95E和N38Q-K84A-R88K-R90K-D95E变体具有增加的生物分布。
本发明的新型GDNF变体优选配制成通过多种途径给药的药物组合物。最优选地，此类GDNF变体用于胃肠外或颅内给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域公知的。参见，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro等人编辑，第19版，Mack Publishing Co., 1995)。
治疗有效量是赋予患者治疗益处所必需的本发明新型GDNF变体的量。可理解，实际给药的GDNF变体的量可由医师根据相关情况确定，包括待治疗的病症、所选择的给药途径、实际给药的活性剂、患者个体的年龄、体重和反应，以及患者症状的严重性。
序列表
<SEQ ID NO: 1；PRT1；智人>
<SEQ ID NO: 2；DNA；智人>
Figure 742217DEST_PATH_IMAGE037
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Figure 770216DEST_PATH_IMAGE038
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<SEQ ID NO: 8；PRT1；智人>
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Figure 634639DEST_PATH_IMAGE049
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Figure 881129DEST_PATH_IMAGE051
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<SEQ ID NO: 19；DNA；人工序列>
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<SEQ ID NO: 22；PRT1；人工序列>
Figure 445894DEST_PATH_IMAGE057
<SEQ ID NO: 23；PRT1；人工序列>
Figure 695610DEST_PATH_IMAGE058
其中：
i) Xaa84是K或A；
ii) Xaa88是R或K；
iii) Xaa90是R或K；
iv)Xaa125是K或E；和
v) Xaa130是R或E。  
<SEQ ID NO: 24；PRT1；人工序列>
Figure 743200DEST_PATH_IMAGE059
其中：
i) Xaa84是K或A;
ii) Xaa88是R或K;
iii) Xaa90是R或K;
iv)Xaa125是K或E；和
v) Xaa130是R或E。  
<SEQ ID NO: 25；PRT1；小鼠>
Figure 52959DEST_PATH_IMAGE060
<SEQ ID NO: 26；DNA；小鼠>
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<SEQ ID NO: 28；PRT1；人工序列>
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<SEQ ID NO: 29；DNA；人工序列>
Figure 622163DEST_PATH_IMAGE064
<SEQ ID NO: 30；PRT1；人工序列>
Figure 976921DEST_PATH_IMAGE065
<SEQ ID NO: 31；PRT1；人工序列>
Figure 834019DEST_PATH_IMAGE066
其中：
i) Xaa84是K或A；
ii) Xaa88是R或K；
iii) Xaa90是R或K；
iv)Xaa125是K或E；和
v) Xaa130是R或E。  
<SEQ ID NO: 32；PRT1；智人>
<SEQ ID NO: 33；DNA；智人>
<SEQ ID NO: 34；DNA；人工序列>
Figure 349817DEST_PATH_IMAGE069
<SEQ ID NO: 35；PRT1；人工序列>
Figure 745026DEST_PATH_IMAGE070
<SEQ ID NO: 36；DNA；人工序列>
Figure 359065DEST_PATH_IMAGE071
<SEQ ID NO: 37；PRT1；人工序列>
Figure 447107DEST_PATH_IMAGE072
<SEQ ID NO: 38；PRT1；人工序列>
Figure 776457DEST_PATH_IMAGE073
其中：
i) Xaa84是K或A；
ii) Xaa88是R或K；
iii) Xaa90是R或K；
iv)Xaa125是K或E；和
v) Xaa130是R或E。  
<SEQ ID NO: 39；DNA；引物>
Figure 975358DEST_PATH_IMAGE074
<SEQ ID NO: 40；DNA；引物>
Figure 440974DEST_PATH_IMAGE075
<SEQ ID NO: 41；DNA；引物>
Figure 699917DEST_PATH_IMAGE076
<SEQ ID NO: 42；DNA；引物>
Figure 516563DEST_PATH_IMAGE077
<SEQ ID NO: 43；DNA；引物>
Figure 253575DEST_PATH_IMAGE078
<SEQ ID NO: 44；DNA；引物>
SEQ ID NO: 1：AA-野生型全长人GDNF
SEQ ID NO: 2：DNA-野生型全长人GDNF
SEQ ID NO: 3：AA-人成熟野生型GDNF
SEQ ID NO: 4：AA-人GDNF天然分泌信号肽
SEQ ID NO: 5：AA-人GDNF前-结构域
SEQ ID NO: 6：DNA-Δ31-for引物
SEQ ID NO: 7：DNA-Δ31-rev引物
SEQ ID NO: 8：AA-变体1：Delta-31 GDNF
SEQ ID NO: 9：AA-GDNF变体2：Δ31+N38Q+D95E (克隆D9)蛋白(103aa)
SEQ ID NO: 10：DNA构建体序列 - GDNF变体2: Δ31+N38Q+D95E (克隆D9) DNA (pEE12.4)
SEQ ID NO: 11：AA-GDNF变体2：Δ31+N38Q+D95E (克隆D9)蛋白构建体(211aa).
SEQ ID NO: 12：AA-GDNF变体3：Δ31 + N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (克隆F2.1)蛋白序列(103aa)
SEQ ID NO: 13：DNA构建体序列-GDNF变体3：Δ31 + N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (克隆F2.1) DNA序列
SEQ ID NO: 14：AA-GDNF变体3：Δ31 + N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (克隆F2.1)蛋白构建体(211aa)
SEQ ID NO: 15：AA-GDNF变体4: Δ31 + N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E + K125E + R130E (克隆4.3)蛋白序列(103aa):
SEQ ID NO: 16：DNA构建体序列- GDNF变体4: Δ31 + N38Q+ K84A-R88K-R90K-D95E + K125E + R130E (克隆4.3) DNA序列
SEQ ID NO: 17：AA-GDNF变体4: Δ31 + N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E + K125E + R130E (克隆4.3)蛋白构建体
SEQ ID NO: 18：DNA-人GDNF天然分泌信号肽
SEQ ID NO: 19: DNA-天然肽-Δ-31 N38Q+D95E构建体
SEQ ID NO: 20：AA-天然肽-Δ-31 N38Q+D95E (122aa):
SEQ ID NO: 21：DNA-天然肽-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E
SEQ ID NO: 22：AA-天然肽-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (122aa):
SEQ ID NO: 23：AA-变体的共有序列
SEQ ID NO: 24：AA-天然肽-变体的共有序列
SEQ ID NO: 25：AA-鼠κ前导分泌信号肽(MKL)
SEQ ID NO: 26：DNA-鼠κ前导分泌信号肽(MKL)
SEQ ID NO: 27：DNA- MKL-Δ-31 N38Q+D95E构建体
SEQ ID NO: 28：AA- MKL-Δ-31 N38Q+D95E (123aa):
SEQ ID NO: 29：DNA-MKL-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E构建体
SEQ ID NO: 30：AA-MKL-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (123aa):
SEQ ID NO: 31：AA-变体的鼠κ前导-共有序列
SEQ ID NO: 32：AA-人生长激素分泌信号肽(hGH)
SEQ ID NO: 33：DNA-人生长激素分泌信号肽(hGH)
SEQ ID NO: 34：DNA- hGH-Δ-31 N38Q+D95E构建体
SEQ ID NO: 35：AA- hGH-Δ-31 N38Q+D95E (129aa):
SEQ ID NO: 36：DNA- hGH-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E构建体
SEQ ID NO: 37：AA- hGH-Δ-31 N38Q+K84A-R88K-R90K-D95E (123aa):
SEQ ID NO: 38：AA-hGH-变体的共有序列
SEQ ID NO: 39：DNA - Δ31-N38Q-for引物
SEQ ID NO: 40：DNA - Δ31-N38Q-rev引物
SEQ ID NO: 41：DNA - Δ31-N38Q-D95E-for引物
SEQ ID NO: 42：DNA - Δ31-N38Q-D95E-rev引物
SEQ ID NO: 43：DNA - Δ31-N38Q-KAKKE-for引物
SEQ ID NO: 44：DNA - Δ31-N38Q-KAKKE-rev引物
Figure IDA0000394066770000011
Figure IDA0000394066770000021
Figure IDA0000394066770000031
Figure IDA0000394066770000041
Figure IDA0000394066770000051
Figure IDA0000394066770000061
Figure IDA0000394066770000081
Figure IDA0000394066770000091
Figure IDA0000394066770000101
Figure IDA0000394066770000111
Figure IDA0000394066770000121
Figure IDA0000394066770000131
Figure IDA0000394066770000141
Figure IDA0000394066770000161
Figure IDA0000394066770000171
Figure IDA0000394066770000181
Figure IDA0000394066770000191
Figure IDA0000394066770000201

Claims (14)

1.人GDNF变体，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中：
i) Xaa84是K或A；
ii) Xaa88是R或K；
iii) Xaa90是R或K；
iv) Xaa125是K或E；且
v) Xaa130是R或E。
2.如权利要求1所述的人GDNF变体，其中所述变体选自以下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
3.如权利要求2所述的人GDNF变体，其中所述变体是：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
4.如权利要求2所述的人GDNF变体，其中所述变体是：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
5.如权利要求2所述的人GDNF变体，其中所述变体是：
Figure 256370DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
6.用于制备Δ31-N-末端截短的GDNF变体的中间体，其包含选自以下的氨基酸序列：
Figure 78833DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
7.如权利要求6所述的中间体，其中所述氨基酸序列是：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
Figure 170865DEST_PATH_IMAGE016
。
8.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体和一种或多种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
9.治疗帕金森氏病的方法，其包括将有效量的权利要求8的组合物施用于需要其的人患者。
10.如权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体，其作为药物使用。
11.如权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体，其用于帕金森氏病的治疗。
12.治疗哺乳动物中的帕金森氏病的方法，包括向所述哺乳动物施用权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体的步骤。
13.如权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体，其用作治疗剂。
14.治疗帕金森氏病的方法，其包括将有效量的权利要求1-5中任一项所述的人GDNF变体施用于需要其的哺乳动物。
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