JP2024522938A - 脳－脂肪回路を介してｉｌｃ２および肥満度を制御する神経－間葉単位 - Google Patents

脳－脂肪回路を介してｉｌｃ２および肥満度を制御する神経－間葉単位 Download PDF

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Abstract

本開示は、グループ2自然リンパ球(ILC2)、脂肪組織の生理学、代謝、および肥満を制御する神経-間葉シグナル伝達軸を提供する。このシグナル伝達軸は、トランスフェクション中に再構成された(RET)ILC2受容体、β2アドレナリン受容体(ADRB2)を有する間葉系間質細胞(MSC)、および視床下部室傍核(PVH)を包含する高次脳領域を包含する。

Description

背景
交感神経ニューロンは脂肪細胞と相互作用し、免疫細胞は脂肪組織生物学に寄与する。神経系と免疫系との間の相互作用は、最近、宿主防御および炎症の主要な調節因子として浮上している1-4。それにもかかわらず、神経細胞および免疫細胞が脳-体軸において協働して代謝を統合するかどうかは不明である。
概要
本開示は、脳-脂肪組織回路を介してグループ2自然リンパ球(ILC2)、脂肪組織の生理学、代謝、および肥満を制御する神経-間葉シグナル伝達軸の発見に基づく。脂肪組織中の交感神経ニューロンは、β2アドレナリン受容体(ADRB2)を介して隣接する脂肪間葉系間質細胞(MSC)に作用して、グリア由来神経栄養因子(GDNF)の発現および性腺脂肪組織(GAT)ILC2の活性を制御する。神経-間葉シグナル伝達軸はまた、視床下部室傍核(PVH)を包含する高次脳領域に接続することによって性腺脂肪組織(GAT)ILC2を調節する。したがって、本開示は、エネルギー消費、インスリン抵抗性、および肥満傾向をもたらすILC2シグナル伝達を操作するための方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ILC2を、トランスフェクション中に再構成された(rearranged during transfection:RET)アゴニストと接触させることを包含する、グループ2自然リンパ球(ILC2)の活性または増殖を増加させる方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、間葉系間質細胞(MSC)をβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させることを包含する、ILC2の活性を増加させる方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、脂肪ILC2をRETアゴニストと接触させること、および/またはMSCをADRB2アゴニストと接触させることを包含する、ILC2によるインターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-13(IL-13)、および/またはMet-エンケファリン(Met-Enk)の産生を増加させるための方法を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、肥満に対する感受性を減少させるための方法、および/または脂肪恒常性を増加させるための方法であって、(a)脂肪組織においてILC2と接触するRETアゴニストを対象に投与すること、(b)脂肪組織においてMSCと接触するADRB2アゴニストを対象に投与すること、あるいは、(c)それらの組合せを包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪恒常性の増加は、耐糖能の増加および/または性腺脂肪組織(GAT)脂肪量の減少である。
いくつかの態様において、本開示は、ILC2の活性または増殖の減少に伴う障害を治療する方法であって、(a)脂肪組織においてILC2と接触するRETアゴニストを対象に投与すること、(b)脂肪組織においてMSCと接触するADRB2アゴニストを対象に投与すること、またはそれらの組合せを包含する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、(a)ILC2に接触するRETアゴニストを対象に投与すること、(b)ADRB2アゴニストを対象に投与すること、または(c)それらの組合せを包含する、寒冷曝露を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、RETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストを投与することは、対象の体温を増加させる。
いくつかの実施形態では、RETアゴニストは、(1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは(2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片を包含する。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRαおよびGFRαリガンドまたはその類似体模倣体の組合せは、(1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せを包含する。
いくつかの実施形態では、ADRB2アゴニストは、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アルブテロール、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである。
いくつかの態様において、本開示は、ILC2の活性または増殖の増加に伴う障害を治療する方法であって、(a)脂肪組織においてILC2と接触するRETアンタゴニストを対象に投与すること、(b)脂肪組織においてMSCと接触するADRB2アンタゴニストを対象に投与すること、または(c)(a)と(b)との組合せを包含する方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、低体温、悪液質、アレルギー、蠕虫感染、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、腸炎症性疾患、またはそれらの組合せである。
いくつかの実施形態では、RETアンタゴニストは、(1)(a)RETチロシンキナーゼ活性、(b)GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)、あるいは(c)GFRαリガンド、またはその抗原結合断片に特異的に結合し、阻害する抗体;(2)RET、GFRαまたはGFRαリガンドの発現、転写または翻訳を低下させる阻害性核酸分子;あるいは(3)RETチロシンキナーゼ阻害剤、任意でAST487、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブである。いくつかの実施形態では、GFRαは、GFRα1、GFRα2、GFRα3若しくはGFRα4であるか、またはGFRαリガンドはグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NTRN)、アルテミン(ARTN)若しくはペルセフィン(PSPN)である。いくつかの実施形態では、阻害性核酸分子は、sRNA、shRNA、またはアンチセンス核酸分子である。
いくつかの実施形態では、ADRB2アンタゴニストは、ブトキサミン、ICI-118,551、プロプラノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール、チモロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、またはそれらの組合せである。
いくつかの実施形態では、接触させることはin vitroである。いくつかの実施形態では、接触させることはin vivoである。いくつかの実施形態では、RETアゴニスト、ADRB2アゴニスト、RETアンタゴニストおよび/またはADRB2アンタゴニストは、対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCは、脂肪組織中にあるか、または脂肪組織に由来する。いくつかの実施形態では、脂肪組織は性腺脂肪組織(GAT)である。
図1A～1L.交感神経-間葉相互作用は性腺脂肪組織(GAT)におけるILC2を制御する。図1Aは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH、上部パネル)および内皮細胞(CD31、下パネル)で交感神経線維を染色したGATを示す。スケールバー:300μm。図1Bは、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)投与後のILC2機能を示す。n＝5。図1Cは、ペグ化ジフテリア毒素(PegDT)処置後のILC2機能を示す。R26/DTRflは、floxedマウス(Fl)においてROSA26遺伝子座に挿入されたジフテリア毒素受容体(DTR)であり、R26/DTRThは、交感神経細胞(Th)のROSA26遺伝子座に挿入されたDTRである。n＝4。 図1Dは、クレンブテロール投与後のILC2機能を示す。n＝5。図1Eは、クロザピンN-オキシド(CNO)投与後のILC2機能を示す。R26/3Dflは、n＝5であるfloxedマウスのROSA26遺伝子座に挿入されたDREADD担持アデノ随伴ウイルスであり、R26/3DΔThは、n＝4であるTHノックアウトマウスのROSA26遺伝子座に挿入された、DREADD担持アデノ随伴ウイルスである。図1Fは、n＝7である野生型β2アドレナリン受容体(Adrb2WT)を有する細胞およびn＝8であるリンパ系細胞からADRB2が欠失した細胞(Adrb2ΔIl7ra)におけるGAT ILC2活性を示す。図1Gは、6-OHDA投与後のILC2機能を示す。Adrb2WT n＝13;Adrb2ΔIl7ra n＝15。図1Hは、GAT細胞集団を示す。n＝6。PDGFRA＋MSCは、血小板由来増殖因子受容体アルファ陽性間葉系幹細胞であり、PDGFRA-MSCは、血小板由来成長因子受容体アルファ陰性間葉系幹細胞である。 図1Iは、交感神経線維(TH、緑色)、グリア細胞(GFAP、赤色)および細胞核(DAPI、青色)を示す。スケールバー:50μm。図1Jは、交感神経線維(TH、緑色)およびMSC(血小板由来増殖因子受容体アルファ、PDGFRA)を示す。スケールバー:20μm。図1Kは、ADRB2野生型(Adrb2fl)細胞(n＝6)およびグリア細胞からADRB2が欠失した細胞(Adrb2ΔGfap)(n＝8)におけるGAT ILC2を示す。図1Lは、ADRB2野生型(Adrb2fl)細胞(n＝10)およびMSCからADRB2が欠失した細胞(Adrb2ΔPdgfra)(n＝8)におけるGAT ILC2を示す。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:平均の標準誤差(s.e.m.)対応のない両側スチューデントt試験(b-g)。一元配置ANOVA(h)。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.005;＊＊＊＊p＜0.001;ns有意ではない。 図2A～2O.交感神経キューは、間葉由来グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)および先天性2型サイトカインを統合する。図2A～2Cは、6-OHDA処置の効果を示す。図2Aは、血小板由来成長因子受容体アルファ陽性間葉系幹細胞(PDGFRA＋MSC)のRNAseqを示す。上:ビヒクル対6-OHDAの平均差プロット;下:下方制御されている遺伝子のヒートマップ。ビヒクルn＝4、6-OHDA n＝5。図2Bは、総GAT RNA(n＝5)におけるGdnf発現を示す。図2Cは、GAT細胞集団におけるGdnf発現を示す(n＝4)。図2D～2Eは、クレンブテロール投与を示す。図2Dは、総GAT RNAにおけるGdnf発現を示す(n＝5)。図2Eは、GAT細胞集団におけるGdnf発現を示す(n＝5)。 図2Fは、ADRB2野生型細胞(Adrb2fl、n＝9)およびMSCからADRB2が欠失した細胞(Adrb2ΔPdgfra)における総GAT RNAにおけるGdnf発現を示す。図2Gは、GAT細胞集団におけるGdnf発現を示す。Adrb2fl n＝6、Adrb2ΔPdgfra n＝4。図2Hは、MSCにおけるGDNF蛍光強度中央値(MFI)を示す。n＝4。図2Iは、PDGFRA(左)およびGDNF(右)のGAT染色を示す。スケールバー:50μm。 図2Jは、ILC2細胞、T細胞(T)、ナチュラルキラー細胞(NK)、B細胞(B)およびマクロファージ(Mφ)におけるトランスフェクションで再構成された(RET)発現を示す。n＝7。図2Kは、野生型RET(Retfl)および造血幹細胞から欠失したRet(RetΔVav1)を発現するマウスにおけるGATにおけるILC2活性を示す。n＝5。図2Lは、野生型Retを発現するRag1ノックアウト(Rag1-/-)ノックアウトマウス(RetWT)またはIL-5陽性細胞からRetをノックアウトしたマウス(RetΔIl5)におけるGATのILC2活性を示す。n＝6。図2M～2Nは、GDNFによるin vitro刺激を示す。図2Mは、GAT ILC2におけるサイトカイン発現を示す。n＝4。図2Nは、MFI先天性2型サイトカインを示す。UNは未処置であり、GDNFはGDNFで刺激される;n＝6。図2Oは、骨髄(BM)キメラ由来のGATにおけるILC2活性を示す。Rag1ノックアウト、RET野生型＝Rag1-/-、RetWT(n＝5)、Rag1ノックアウト、RET機能獲得＝Rag1-/-、RetMEN2B;n＝4。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt試験(b-h、k-o)。一元配置ANOVA(j)。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.005;ns 有意ではない。 図3A～3O.ILC2固有のRETキューは、脂肪組織の生理学および肥満を制御する。図3A～図3Mは、Ret野生型(Retfl;RetWT)、Retノックアウト(RetΔVav1;RetΔ)またはRet機能獲得型(RetMEN2B)マウスにおける高脂肪食(HFD)レジメンでの16週間後の測定値を示す。図3Aは、重量増加を示し、n＝6である。図3Bは、耐糖能試験を示し、n＝6である。図3Cは、GAT重量を示し、n＝6である。図3D～図3Hは、ILC2 RET野生型(RetWT)移植またはRETノックアウト(RetΔ)移植を有するILC2キメラを示す。図3I～図3Mは、ILC2 RetWTまたはRetMEN2B移植を示す。図3Dは、RetWTマウス(n＝5)およびRetΔマウス(n＝6)における重量増加を示す。図3Eは、RetWT(n＝4)およびRetΔ(n＝6)における耐糖能試験を示す。図3Fは、RetWT(n＝4)およびRetΔ(n＝6)におけるGAT重量を示す。 図3Gは、RetWT(n＝4)、RetΔ(n＝6)、背景:白色200μm2の範囲間隔、灰色1000μm2の範囲間隔における脂肪細胞面積を示す。図3HはGATを示す。スケールバー:100μm。図3IはGAT重量を示す。n＝5。図3Jは耐糖能試験を示す。n＝5。図3KはGAT重量を示す。n＝5。 図3Lは脂肪細胞領域を示す。背景:白色300μm2の範囲間隔;灰色1000μm2。n＝5。図3MはGATを示す。スケールバー:100μm。図3Nは、GATにおける脱共役タンパク質1発現(Ucp1)、シトクロムcオキシダーゼサブユニット8B(Cox8b)、およびエフェクターAのような細胞死誘導DFFA(Cidea)発現を示す。Rag1-/-RetMEN2B BMキメラ。Rag1-/-、RetWT n＝4、Rag1-/-,RetMEN2B n＝5。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.反復測定ANOVA(図3A、3B、3D、3E、3I、および3J)および相互作用(Int)、時間および遺伝子型(Gen)の試験が報告された(図3A、3D、3I)。対応のない両側スチューデントt試験(図3C、3F、3K)。マン・ホイットニー検定(図3Nおよび3O)。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.005;＊＊＊＊p＜0.001;ns有意ではない。 図4A～4N.脳に接続し、ILC2を調節する大動脈腎-脂肪回路。図4A～4Fは、ウイルストレーシング(VT、右パネル)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH、左パネル)を示す。スケールバー:50μm。図4AはGATを示す。図4Bは、GAT交感神経線維を示す。図4Cは、陰部大腿(GF)神経線維(矢印)を示す。図4Dは、陰部大腿神経のTH陽性線維を示す。 図4Eは、大動脈腎動脈神経節(ARG、丸)を示す。図4Fは、大動脈腎動脈神経節におけるTH陽性神経細胞体を示す。図4Gは、左:冠状断面の脳アトラススキームおよび右:左の強調表示された領域に対応するGATからのPRV-RFPウイルストレーシングを示す。PVHは視床下部室傍核である。図4Hは、左:冠状断面の脳アトラススキーム、および右:左の強調表示領域に対応する大動脈腎動脈神経節(ARG)からのPRV-RFPウイルストレーシングを示す。スケールバー200μm(図4G、4H)。 図4Iは、外科的陰部大腿神経(GF)アブレーション(GFx)スキーム(左)およびGAT Gdnf発現(右)を示す。n＝4。図4Jは、対照(偽)および陰部大腿神経アブレーション(GFx)におけるGAT ILC2活性を示す。n＝5。図4Kは、左:アデノ随伴ウイルス4D(AAV 4D)を用いた化学遺伝学的阻害スキームおよび右:GAT Gdnf発現を示す。n＝5。図4Lは、AAV 4Dによって阻害されたGdnf発現を有するマウスにおけるGAT ILC2活性を示す。n＝5。図4Mは、左:アデノ随伴ウイルス3D(AAV 3D)を用いた化学遺伝学的活性化スキームおよび右:GAT Gdnf発現(右)を示す。n＝4。図4N、AAV 3Dによって活性化されたGdnf発現を有するマウスにおけるGAT ILC2活性。n＝4。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt試験。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.005;nsは有意ではない。 図5A～5D.GATおよびILC2機能における交感神経系。図5Aは、染色された交感神経線維(TH)および内皮細胞(CD31)を有するGATを示す。スケールバー:300μm。図5Bは、6-OHDA投与後のGAT ILC2由来Met-Enk産生を示す。n＝5。図5Cは、6-OHDA投与後のCD4 T細胞およびTH陽性CD4 T細胞を示す。n-4.図5Dは、クレンブテロール投与後のGAT ILC2由来Met-Enkを示す。n＝5。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt検定。＊P＜0.05;＊＊＊P＜0.005。 図6A～6E.GAT間葉系幹細胞(MSC)の交感神経調節。図6Aは、6-OHDA投与時のMSCにおける上方制御および下方制御されている遺伝子のヒートマップを示す。ビヒクルn＝4、6-OHDA n＝5。 図6Bは、6-OHDA処置後の総GAT Il33発現を示す。n＝5。図6Cは、クレンブテロール投与後のGAT Il33発現を示す。n＝5。図6Dは、6-OHDAおよびクレンブテロール投与後のPDGFRA＋MSCにおけるMSC由来Il33発現を示す。n＝6。図6Eは、6-OHDAおよびクレンブテロール投与後のPDGFRA＋MSCにおけるMSC由来Il25発現を示す。n＝6。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt試験。nsは有意ではない。 図7A～7L.ILC2自律的RETシグナルは、GAT中の2型先天性サイトカインを制御する。図7A～図7Cは、GDNFファミリ受容体アルファ(GFRa)マウスにおけるGAT ILC2機能を示す。図7Aは、GFR1α陽性(Gfra1＋/＋)およびノックアウト(Gfra1-/-)胎児肝臓キメラにおけるGAT ILC2機能を示す。n＝5。図7Bは、GFR2α陽性(Gfra2＋/＋、n＝10)マウスおよびノックアウト(Gfra2-/-n＝5)マウスを示す。図7Cは、GFR3α陽性(Gfra3＋/＋n＝8);およびノックアウト(Gfra3-/-.n＝8)マウスを示す。図7Dは、Rag1ノックアウトマウス、インターロイキン2受容体ガンマノックアウト(Rag1-/-,Il2rg-/-)マウスおよびRetΔVav1マウスの混合骨髄(BM)キメラを作製するためのスキームを示す。図7Eは、Ret floxed(Retfl)、Rag1-/-、Il2rg-/-混合BMキメラおよびRetノックアウト(RetΔVav1)、Rag1-/-、Il2rg-/-混合BMキメラからのGAT ILC2活性を示す。Retfl n＝6;RetΔVav1 n＝7。図7Fは、インターロイキン5細胞におけるRag1ノックアウト、Ret野生型(Rag1-/-、RetWT n＝6)およびRag1ノックアウト、Retノックアウ(Rag1-/-.RetΔIl5 n＝6)トを有するマウスにおけるILC2活性を示す。 図7Gは、マウスにおけるILC2活性を示す。RetWT n＝10およびRetΔIl5(n＝8)。図7Hは、Rag1ノックアウトマウス、インターロイキン2受容体ガンマノックアウト(Rag1-/-、Il2rg-/-)マウスおよびRetΔIl5マウスの混合骨髄(BM)キメラを作製するためのスキームを示す。図7Iは、Ret野生型(RetWT、n＝4)混合BMキメラおよびRetノックアウトIL5細胞(RetΔIl5 n＝4)におけるILC2活性を示す。図7Jは、Rag1-/-、Ret野生型(RetWT)およびRet機能獲得型(RetMEN2B)混合骨髄(BM)キメラにおけるGAT ILC2を示す。Rag1-/-,RetWT n＝5,Rag1-/-.RetMEN2B n＝6.図7Kは、RetMEN2B混合BMキメラを産生するための混合骨髄(BM)キメラスキームを示す。図7Lは、Rag1ノックアウトマウスおよびRet野生型マウス(Rag1-/-、RetWT;n＝6)および(Rag1-/-.RetMEN2B;n＝7)における混合BMキメラにおけるILC2活性を示す。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt試験。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;＊＊＊P＜0.005;nsは有意ではない。 図8A～8E.ILC2固有のRETシグナル伝達は、脂肪細胞の生理学および肥満を制御するのに十分である。図8Aは、6-OHDA投与後のGAT ILC2機能を示す。RetWT n＝8およびRetΔIl5 n＝7。図8B、図8Cは、Ret野生型(Rag1-/-.RetWT;RetWT)およびRetノックアウト(Rag1-/-.RetΔIl5;RetΔIl5)における高脂肪食(HFD)レジメンでの16週間後の測定値を示す。図8Bは、16週間のHFDレジメン中の重量増加を示す。Rag1-/-.RetWT n＝4,Rag1-/-.RetΔIl5 n＝5.図8Cは、16週間のHFDレジメン中の重量増加を示す。RetWT n＝5,RetΔIl5 n＝5. 図8Dは、Ucp1、Cox8bおよびCideaの総GAT RNA発現を示す。n＝5。図8Eは、グリア由来神経栄養因子(GDNF)で刺激したRetWTおよびRetノックアウト(RetΔ)細胞とのGAT外植片共培養におけるUcp1のGAT RNA発現を示す。平均およびエラーバー:s.e.m.両側対応のないスチューデントt検定(図8A);反復測定ANOVA(図8B、8C);マン・ホイットニー検定(図8D、8E)。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01;ns有意でない;非刺激はGDNFで刺激されない。 図9A～9G.大動脈腎-脂肪回路は脳に接続する。図9Aは、後根神経節(DRG)T13ウイルストレーシング(VT)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)染色を示す。スケールバー:100μm。 図9Bは、左:冠状断面の脳アトラススキームを示す。右:左の強調表示された領域に対応するGATからの多シナプストレーシング。図9Cは、左:冠状断面の脳アトラススキームを示す。右:左の強調表示された領域に対応する大動脈腎動脈神経節(ARG)からの多シナプストレーシング。図9B～9C、扁桃体中心核(CA)、不確帯(ZI)、中脳水道周囲灰白質(PAG)および青斑核(SubCD)。 図9Dは、PVHの電解質病変(エレクトロアブレーション)を示す。スケールバー500μm。図9Eは、対照(偽)マウスおよびPVHアブレーション(Abl)マウスにおけるGAT ILC2を示す。偽n＝5;PVHアブレーションn＝6。図9Fは、CNO投与後の対側性対照と比較したAAV(4D)におけるGAT Il33発現を示す。n＝5。図9Gは、CNO投与後の対側性対照と比較したAAV(3D)におけるGAT Il33発現を示す。n＝4。データは3回の独立した実験の代表である。nは生物学的に独立した動物を表す。平均およびエラーバー:s.e.m.対応のない両側スチューデントt試験。＊P＜0.05;＊＊P＜0.01。 図10.交感神経大動脈腎-脂肪回路は脳に接続し、ILC2を調節する。GAT神経-間葉単位は、交感神経キューを神経栄養因子発現に変換する。次に、神経栄養因子は、神経調節受容体RETを介して脂肪ILC2を制御し、宿主代謝、エネルギー消費および肥満を形成する。PVH-視床下部室傍核;SNS-交感神経系;ARG-大動脈腎動脈神経節。
詳細な記載
肥満は、脂質貯留槽の過剰な蓄積に起因し、これらの脂肪貯留層は、食事制限の期間中に高エネルギー源として使用することができる。交感神経ニューロンのキューは食事制限中の脂肪分解を促進し5-7、およびILC2は、2型先天性サイトカインおよびMet-Enkephalin(Met-Enk)の産生を介して内臓脂肪組織代謝に寄与する8-13。これは、神経系およびILC2がこれまでに認識されていない機構によって協働して代謝ストレスを感知し、高次脳相互作用を介して脂肪生理学を推進するという仮説を提起する。
脳-脂肪回路を介してILC2、脂肪組織の生理学、代謝、および肥満を制御する新規に発見された神経-間葉単位が本明細書において記載される。この脳-脂肪回路における交感神経ニューロンは、β2アドレナリン受容体(ADRB2)を介して隣接する脂肪間葉細胞に作用し、グリア由来神経栄養因子(GDNF)の発現および性腺脂肪ILC2の活性を制御する。したがって、GDNF受容体機構のILC2自律的操作は、ILC2機能、エネルギー消費、インスリン抵抗性および肥満傾向の変化をもたらす。逆行性トレーシング、化学的、外科的および化学的操作により、性腺脂肪ILC2を調節し、視床下部室傍核(PVH)を包含する高次脳領域に接続する、認識されていない交感神経大動脈腎回路が同定された。
したがって、本明細書において提供される方法は、長距離神経回路のキューを脂肪常在性ILC2機能に変換し、宿主代謝および肥満を形成する新たに発見された神経-間葉系ユニットを操作する。
使用方法
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、ILC2を、トランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストと接触させること、間葉系間質細胞(MSC)をβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させること、またはILC2をRETアゴニストと接触させること、および、MSCをADRB2アゴニストと接触させることによって、グループ2自然リンパ球(ILC2)の活性、増殖、または、活性および増殖を増加させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ILC2の活性または増殖を増加させる方法を提供する。ILC2は、組織の恒常性を維持し、リンパ組織の発達、組織修復および脂肪代謝を調節するのに重要な自然リンパ球のサブセットである。ILC2は、脂肪組織、肺、小腸、大腸、腸間膜リンパ節、骨髄、脾臓、肝臓および腎臓の粘膜バリアに豊富に存在し、2型炎症および組織修復の重要な開始剤として作用する。これらは、インターロイキン-25(IL-25)、インターロイキン-33(IL-33)および胸腺間質性リンホポエチンを包含するサイトカインによって活性化される。
ILC2の任意の活性は、本明細書において提供される方法によって増加される場合がある。増加される場合があるILC2活性の非限定的な例は、脂肪組織代謝、組織恒常性、寄生虫に対する防御、組織修復、炎症、および2型免疫に関連する免疫病理学を包含する。ILC2活性は、限定するものではないが、ILC2細胞によって産生されたタンパク質の定量的PCR測定および蛍光定量(例として、サイトカイン)を包含する当技術分野で公知の任意の方法によって測定する場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、脂肪組織代謝におけるILC2の活性を増加させる。ILC2活性(例として、脂肪組織代謝)は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2活性は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、RETアゴニストと接触していないILC2、またはRETアゴニストと接触する前の同じILC2である場合がある。
いくつかの実施形態では、ILC2増殖は、RETアゴニストとの接触後に増加する。ILC2増殖は、ILC2の増殖および複製を指す。ILC2増殖は、ILC2表面タンパク質の免疫組織化学およびILC2特異的タンパク質の定量的PCR(例として、RET受容体、神経ペプチド受容体Nmur1、インターロイキン-33受容体ST2、IL-17A/IL-17B受容体)を包含するがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。ILC2増殖は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2増殖は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、RETアゴニストと接触していないILC2、またはRETアゴニストと接触する前の同じILC2である場合がある。
RETアゴニスト
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ILC2を、トランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストと接触させることを包含する。RETは、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)ファミリのメンバーのための受容体チロシンキナーゼである。機能突然変異のRET喪失は、ヒルスプリング病の発症に関連し、機能突然変異のRET獲得は、甲状腺髄様癌、多発性内分泌新生物2A型および2B型、褐色細胞腫、ならびに副甲状腺過形成を包含する様々なタイプのヒト癌の発症に関連する。
RETは、カドヘリンファミリメンバー12、カドヘリン関連ファミリメンバー16、CDHF12、CDHR16、HSCR1、ヒドロキシアリール-プロテインキナーゼ、MEN2A、MEN2B、MTC1、PTC、ret癌原遺伝子、RET-ELE1、RET/PTC、RET51、およびRET-HUMANとしても知られている。RETのアミノ酸配列は、例としてUniProtKB P07949に見出すことができ、それは2つのアイソフォーム、P07949-1(アイソフォーム1)およびP07949-2(アイソフォーム2)を有する。ヌクレオチド配列は、例としてAK291807(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
RETアゴニストは、対照と比較してRETタンパク質に結合し、その活性を増加させる化合物である。対照は、RETアゴニストと接触させる前にILC2から採取した測定値、RETアゴニストと接触させていない同じ試料(例として、in vitroまたはin vivo)中のILC2から採取した測定値、またはRETアゴニストと接触させていない試料である場合がある。RETアゴニストは、対照と比較して、RETタンパク質の活性を少なくとも10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、またはそれ以上増加される場合がある。
本明細書においておけるRETアゴニストは、当技術分野で公知の任意のRETアゴニストである場合がある。RETアゴニストの非限定的な例は、(1)可溶性グリア由来神経栄養因子(GDNF)ファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)との組合せまたはその類似体若しくは模倣体;または(2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片を包含する。
RETアゴニストは、RETに完全に特異的である場合があるか、他のチロシンキナーゼと比較してRETを優先的にアゴニストし得るか、またはRETおよび他のチロシンキナーゼの両方をアゴニストし得る。これらのアゴニストは、RETが他のチロシンキナーゼよりもあまりアゴナイズされない場合でも有用である場合があるが、本明細書において記載される方法において使用されるアゴニストは、RETを他のチロシンキナーゼよりも大きくアゴナイズすることが好ましい。本明細書において使用される場合、(他のチロシンキナーゼと比較して)RETを優先的にアゴナイズすることは、アゴニストがRETを他のチロシンキナーゼよりも少なくとも10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれ以上アゴナイズすることを意味する。
可溶性GFRαとGFLまたはその類似体若しくは模倣体との組合せは、当技術分野で公知の任意の可溶性GFRαまたはGFL(またはその類似体若しくは模倣体)を包含する場合がある。可溶性GFRαおよびGFLの非限定的な例は、可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せを包含する。
可溶性のGFRα分子およびGFLは、当該分野で公知であり、本明細書において記載される任意のGFRαおよびGFL、例として、GFRα1、GFRα2、GFRα3およびGFRα4を包含する。およびそれらのそれぞれのリガンドGDNF、ニュールツリン(NRTN)、アルテミン(ARTN)およびペルセフィン(PSPN)である。GFRαおよびGFLの類似体、模倣体、誘導体およびコンジュゲートは、天然の(例として、内因性)GFRαおよびGFL配列と比較してアミノ酸配列に変異を有するが、RETを活性化する機能を保持するGFRαおよびGFL類似体を包含する。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRα分子はGFRα1である。GFRα1は、GDNF受容体、GDNFR、GDNFRA、GFR-アルファ-1、RETIL、RETL1、TRNR1、およびGDNFファミリ受容体アルファ1としても知られている。GFRα1のアミノ酸配列は、例としてUniProtKB P56159に見出すことができ、それは2つのアイソフォーム、P56159-1(アイソフォーム1)およびP56159-2(アイソフォーム2)を有する。ヌクレオチド配列は、例として、AF042080.1(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRα分子はGFRα2である。GFRα2は、ニュールツリン受容体、GFRA2、GDNFRB、NRTNR-ALPHA、NTNRA、RETL2、TRNR2、およびGDNFファミリ受容体アルファ2としても知られている。GFRα2のアミノ酸配列は、例としてUniProtKB O00451に見出すことができ、それは3つのアイソフォーム、O00451-1(アイソフォーム1)、O00451-2(アイソフォーム2)、およびO00451-3(アイソフォーム3)を有する。ヌクレオチド配列は、例としてAY326396(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRα分子はGFRα3である。GFRα3は、アルテミン受容体、GFRA3、GDNFR3およびGDNFファミリ受容体アルファとしても知られている。GFRα3のアミノ酸配列は、例としてUniProtKB O60609に見出すことができ、それは2つのアイソフォーム、O60609-1(アイソフォーム1)およびO60609-2(アイソフォーム2)を有する。ヌクレオチド配列は、例としてAK297693(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、可溶性GFRα分子はGFRα4である。GFRα4は、ペルセフィン受容体およびGFRA4としても知られている。GFRα4のアミノ酸配列は、例として、UniProtKB Q9GZZ7に見出すことができ、それは3つのアイソフォーム、Q9GZZ7-1(アイソフォームGFRα4b)、Q9GZZ7-2(アイソフォームGFRα4a)、およびQ9GZZ703(アイソフォームGFRα4c)を有する。ヌクレオチド配列は、例として、AF253318に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、GFLは、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)である。GDNFは、ATF1、ATF2、HFB1-HSCR3、およびグリア細胞由来神経栄養因子としても知られている。アミノ酸配列は、例として、UniProtKB P39905に見出すことができる。それは3つのアイソフォーム、P39905-1(アイソフォーム1)、P39905-2(アイソフォーム2)、P39905-3(アイソフォーム3)、P39905-4(アイソフォーム4)、およびP39905-5(アイソフォーム5)を有する。ヌクレオチド配列は、例としてCR541923(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、GFLは、ニュールツリン(NRTN)である。アミノ酸配列は、例としてUniProtKB Q99748に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例としてBC137399(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、GFLはアルテミン(ARTN)であり、これはエノビン、ニューブラスチン、EVNおよびNBNとしても知られている。アミノ酸配列は、例として、UniProtKB Q5T4W7に見出すことができ、それは3つのアイソフォーム、Q5T4W7-1(アイソフォーム1)、Q5T4W7-2(アイソフォーム2)、およびQ5T4W7-3(アイソフォーム3)を有する。ヌクレオチド配列は、例として、AF109401(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、GFLはペルセフィン(PSPN)である。アミノ酸配列は、例としてUniProtKB O60542に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例として、AF040962(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
GFLの類似体、誘導体およびコンジュゲートの例は、米国特許第9,133,441号に記載されているGDNF受容体アゴニスト機能を保持するGDNFの変異体;米国特許第9,243,046号に記載のGDNFの変異体;RETを効率的に活性化するが、ヘパリン結合部位を欠き、米国特許第8,034,572号に記載される細胞外マトリックス中のHSPGと相互作用しないGFL変異体(例として、ΔN-GDNF);ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヘパラン硫酸プロテオグリカン結合能は低下しているが、米国特許第8,445,432号、第9,127,083号および第9,469,679号に記載されているRETタンパク質のリン酸化を誘導する能力を保持しているニュールツリン分子;米国特許第8,138,148号に記載のGDNF由来ペプチド;米国特許第7,276,580号、第7,598,059号および第7,655,463号に記載されるニューブラスチン分子および二量体化タンパク質;ならびに米国特許第6,866,851号に記載されているGFRα/RETを活性化するキメラGDNFファミリリガンドを包含する。
GFLの類似体、誘導体およびコンジュゲートの他の例は、国際公開第2012/151476号、欧州特許第2440581号、およびそれらにおいて参照される他の特許公開公報に記載されているGDNF類似体、GDNFのアイソフォーム、前駆体、断片およびスプライスバリアント、例えば国際公開第2009/053536号、米国特許出願公開第2009/0069230号、国際公開第2008/069876号、国際公開第2007/019860号および米国特許出願公開第2006/0258576号に記載されているものを包含する。
RETの更に他のアゴニストは、GDNFファミリリガンド(GFL)および模倣体またはRETシグナル伝達経路活性化因子および直接RET活性化因子を包含し、これらは米国特許第8,901,129号に記載されている。
RETの別のアゴニストは、可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035)である。Tokugawa et al.(Neurochem Int.2003 Jan;42(1):81-6)によって示されるように、XIB4035は、GDNFと同様に、RET自己リン酸化を誘導した。XIB4035の化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000002
RETの別のアゴニストは、可溶性GFRαおよびBT化合物である。BT化合物は、国際公開第2011/070177号パンフレットに記載されている。
RETの別のアゴニストは、可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、二量体化する抗体である。GFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体は、一組のGFRα結合抗体の中でこの活性をスクリーニングすることによって得ることができる。
RETの更なるアゴニストは、RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはそのような抗体の抗原結合断片である。RET結合抗体は、米国特許第6,861,509号に記載されているもの等、当技術分野で公知であり、様々な市販の抗体が知られている。RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体は、一組のRET結合抗体の中でこの活性についてスクリーニングすることによって得ることができる。
RETの更なるアゴニストは、限定されないが、カボザニチブ、レバチニブ、スニチニブおよびアレクチニブを包含するマルチキナーゼ阻害剤を包含する。RETのまた更なるアゴニストは、選択的RET阻害剤であるセルペルカチニブ(LOXO-292)、プラルセチニブ(BLU-667)、BOS 172738(Boston Pharmaceuticals)、HM06(Helsinn)、TPX-0046(Turning Point Therapeutics)、LOX-18228(イーライリリー)、オシメルチニブ、RXDX-105(Hoffmann-La Roche)、レゴラフェニブ、RPI 1およびGSK 3352589を包含する。
ILC2細胞は、2つ以上のRETアゴニストと接触される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2細胞を、1個～10個、2個～9個、3個～8個、4個～7個または5個～6個のRETアゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、ILC2細胞を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のRETアゴニストと接触させる。ILC2を複数の(例として、2つ以上)RETアゴニストと接触させる実施形態では、ILC2を複数のRETアゴニストと同時にまたは順次接触される場合がある。
間葉系間質細胞
いくつかの態様において、本明細書において提供される本開示の方法は、間葉系間質細胞(MSC)をβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させることを包含する。MSCは、in vitroでの多能性分化能を有する、骨髄、脂肪および他の組織源から単離された紡錘状の線維芽細胞様細胞である。MSCは、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および他の細胞型に分化し得る。MSCは、アドレナリン作動性受容体(α1A、α1B、α2A、α2B、β1、β2、β3)、CD90、CD105およびCD73を表面上に発現するが、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19およびHLA-DRを発現しない。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される本開示の方法は、MSCの活性を増加させること、MSCの増殖を増加させること、またはMSCの活性および増殖を増加させることを包含する。MSCの任意の活性が、本明細書において提供される方法によって増加させられる場合がある。増加される場合があるMSC活性の非限定的な例は、他の細胞型(例として、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、および他の細胞型)への分化、細胞外コラーゲン産生およびアルカリホスファターゼ活性を包含する。MSC活性は、限定されないが、MSCによって産生されるタンパク質の定量的PCR測定(例として、限定されないが、AP-1、KLF4、KLF6、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ、STAT5A、SREBP-1を包含する脂肪生成タンパク質)、分化中の細胞形態変化(例として、円形脂肪細胞に変化する紡錘状MSC)、および分化中の細胞骨格再構築を包含する、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、脂肪細胞分化におけるMSCの活性を増加させる。MSC活性は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、MSC活性は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、ADRB2アゴニストと接触していないMSC、またはADRB2アゴニストと接触する前の同じMSCである場合がある。
いくつかの実施形態では、MSC増殖は、ADRB2アゴニストとの接触後に増加する。MSC増殖は、限定されないが、MSC表面タンパク質(例として、アドレナリン作動性受容体(α1A、α1B、α2A、α2B、β1、β2、β3)、CD90、CD105およびCD73)の免疫組織化学、MSC特異的タンパク質(例として、アドレナリン作動性受容体(α1A、α1B、α2A、α2B、β1、β2、β3)、CD90、CD105およびCD73)の定量的PCR、ならびに細胞増殖マーカー(例として、Ki67、PCNA)の定量化を包含する、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。MSC増殖は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、MSC増殖は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、ADRB2アゴニストと接触していないMSC、またはADRB2アゴニストと接触する前の同じMSCである場合がある。
β2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニスト
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、MSCをβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させることを包含する。ADRB2は、エピネフリンに結合する細胞膜貫通型β-アドレナリン作動性受容体であり、平滑筋弛緩および気管支拡張等の下流の生理学的応答を媒介する。ADRB2は、ヒトの筋肉系、循環系、光学系、消化系、免疫系、呼吸系において機能する。ADRB2は、パーキンソン病のリスクに関連すると考えられており、この遺伝子の異なる多型形態、点変異、および/または下方制御は、夜間喘息、肥満、2型糖尿病、および心血管疾患に関連する。
ADRB2は、アドレナリン受容体ベータ2、B2AR、ベータ2アドレナリン受容体、ベータ2アドレナリン受容体、およびカテコールアミン受容体としても知られている。ADRB2のアミノ酸配列は、例としてUniProtKB P07550-1に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例として、X04827(mRNA/cDNA配列)に見出すことができる。
ADRB2アゴニストは、対照と比較してADRB2タンパク質に結合し、その活性を増加させる化合物である。対照は、ADRB2アゴニストと接触させる前にMSCから採取した測定値、ADRB2アゴニストと接触させていない同じ試料(例として、in vitroまたはin vivo)中のMSCから採取した測定値、またはADRB2アゴニストと接触させていない試料である場合がある。ADRB2アゴニストは、MSCタンパク質の活性を、対照と比較して、少なくとも10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、またはそれ以上増加する場合がある。
いくつかの実施形態では、ADRB2アゴニストは、短時間作用型βアゴニスト(SABA)である。SABAは、アゴニストに応じて4時間～6時間持続する効果を有する。SABAは、急性治療のための第一選択薬であり、一般に他の化合物(例として、長時間作用型βアゴニスト(LABA)、コルチコステロイド)と組み合わせて使用される。SABAの非限定的な例は、ビトルテロール(トルナラート)、フェノテロール(ベロテック)、イソプレオテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン(Yutopar)、アルブテロール(ベントリン/プロベンチル)およびテルブタリン(ブリカニル)を包含する。
いくつかの実施形態では、ADRB2アゴニストは、長時間作用型βアゴニスト(LABA)である。LABAは、ステロイドと組み合わせて最も一般的に使用され、アゴニストに応じて12時間～24時間持続する効果を有する。LABAの非限定的な例は、アルフォモテロール(Brovana)、バンブテロール(Bambec/Oxeol)、クレンブテロール(Dilaterol/Spiropent)、ホルモテロール(Foradil/Oxis/Perforomist)、およびサルメテロール(Serevent)を包含する。
いくつかの実施形態では、ADRB2アゴニストは、超長時間作用型βアゴニスト(ULABA)である。ULABAは24時間より長く持続する効果を有し、それらの効果の持続時間はアゴニストに依存する。ULABAの非限定的な例は、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール(Arcapta Neohaler)、オロダテロール(Striverdi Respimat)、およびビランテロールを包含する。
いくつかの実施形態では、ADRB2アゴニストは、未知の作用持続時間を有する。作用持続時間が不明なADRB2アゴニストの非限定的な例は、イソクスプリン、マブテロールおよびジルパテロールを包含する。
MSCは、2つ以上のADRB2アゴニストと接触される場合がある。一部の実施形態では、MSCを、1個～10個、2個～9個、3個～8個、4個～7個または5個～6個のADRB2アゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、MSCを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれを超えるADRB2アゴニストと接触させる。MSCを複数(例として、2つ以上)のADRB2アゴニストと接触させる実施形態では、MSCを複数のADRB2アゴニストと同時にまたは連続して接触される場合がある。
サイトカイン産生
いくつかの態様において、サイトカイン産生を増加させるための方法が本明細書において提供される。サイトカイン産生は、ILC2、MSC、またはサイトカインを産生する任意の他の細胞(例として、T細胞、B細胞、マクロファージ、肥満細胞、内皮細胞、線維芽細胞)に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるRETアゴニストは、ILC2細胞からのサイトカイン産生を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるADRB2アゴニストは、MSCからのサイトカイン産生を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるRETアゴニストは、ILC2細胞からのサイトカイン産生を増加させ、本明細書において提供されるADRB2アゴニストは、MSCからのサイトカイン産生を増加させる。
サイトカインは、標的細胞上の受容体に結合することによって細胞シグナル伝達に使用される小さな(約5～20キロダルトン)ペプチドである。サイトカインは、感染、炎症、外傷、敗血症、癌および生殖に対する宿主免疫応答において重要である。サイトカインは、細胞応答を増強する1型サイトカイン(例として、TNFα、IFNγ)および抗体応答を増強する2型サイトカイン(例として、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13)である場合がある。サイトカイン産生は、サイトカインの免疫蛍光染色、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素結合免疫吸着スポット(ELIspot)アッセイ、抗体アレイアッセイ、およびビーズベースのアッセイを包含するがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。
本明細書において開示される方法によって増加される場合があるサイトカインの非限定的な例は、インターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-13(IL-13)、Met-エンケファリン(Met-Enk)、アンフィレグリン、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-9(IL-9)、エオタキシン、インターフェロンγ誘導タンパク質10(IP-10)、血管内皮増殖因子(VEGF)、TIMPメタロペプチダーゼ阻害剤1(TIMP1)、脂肪細胞脂質結合タンパク質(ALBP)および脂肪酸トランスロカーゼ(FAT/CD36)を包含する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、サイトカイン産生を増加させる。サイトカイン産生は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、サイトカイン産生は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、RETアゴニストと接触していないILC2、ADRB2アゴニストと接触していないMSC、またはRETアゴニストと接触していないILC2、ならびにRETアゴニストと接触する前にADRB2アゴニストまたは同じICL2と接触していないMSC、および/またはADRB2アゴニストと接触していないMSCである場合がある。
治療方法
肥満および脂肪恒常性
いくつかの態様において、肥満に対する感受性を減少させる方法、脂肪恒常性を増加させる方法、または肥満に対する感受性を減少させ、脂肪恒常性を増加させる方法が、それを必要とする対象において本明細書において更に提供される。肥満に対する感受性を減少させるおよび/または脂肪恒常性を増加させる方法は、対照と比較して、ILC2(例として、対象において)を本明細書において提供した任意のRETアゴニストと接触させること、MSCを本明細書において提供した任意のADRB2アゴニストと接触させること、またはそれらの組合せを包含する場合がある。対照は、RETアゴニストと接触させないILC2を有する対象、ADRB2アゴニストと接触させるMSCを有する対象、または、RETアゴニストと接触させる前のICL2および/またはADRB2アゴニストと接触させる前のMSCを有する同じ対象である場合がある。
それを必要とする対象は、肥満または肥満に対する感受性の増加を有する任意の対象である場合がある。肥満は、それだけに限らないが、心血管疾患、糖尿病、高血圧および高コレステロールを包含する健康問題のリスクを増加させる過剰な体脂肪に関与する障害である。肥満は、人の肥満度指数(BMI)が30以上の場合に生じる。BMIは、18歳以上の成人については、重量(キログラム)を身長(メートル)の平方で除し(米国疾病管理センター(United States Center for Disease Control))、18歳未満の小児については、性別および年齢を考慮して計算される。肥満は、一般に、BMIを計算することによって自己診断され、肥満を有する対象は、それだけに限らないが、背中または関節の痛み、過食、疲労、睡眠時無呼吸、および過剰な体脂肪を包含する任意の症候を有する場合がある。肥満の従来の治療は、運動、低脂肪食(1日のカロリー消費量が30％未満)、および行動療法を包含するが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、肥満の対象における感受性を減少させる。肥満に対する感受性は、行動、環境、および遺伝的要因の評価を包含する、当技術分野で公知の任意のメトリックによって決定される場合がある。肥満に対する感受性を増加させる行動リスク因子は、飽和脂肪およびトランス脂肪が多い(1日のカロリー消費量の30％超)食物を摂取すること、および不活動性である(日常生活の身体活動を超えて身体活動がない)ことを包含する。肥満に対する感受性を増加させる環境リスク因子は、飽和脂肪およびトランス脂肪が少ない(1日のカロリー消費量の30％以下)食物の入手可能性、身体的に活動的であることができないこと、ならびに出生前および出生後(生後1年以内)の母体の影響を包含する。肥満に対する感受性を増加させる遺伝的危険因子としては、ホルモンレプチン、レプチン受容体、プロオピオメラノコルチンおよびメラノコルチン-4受容体をコードする遺伝子における変異;脂肪量;ならびに肥満関連タンパク質(FTO)、膜貫通タンパク質18(TMEM18)、グルコサミン6-リン酸デアミナーゼ2(GNPDA2)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長調節因子1(NEGR1)、SH2Bアダプタータンパク質1(SH2B1)、ETS変異体転写因子5(ETV5)、ミトコンドリアキャリア2(MTCH2)、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有15(KCTD15)、Fasアポトーシス阻害分子2(FAIM2)、SEC相同性B(SEC16B)、TNNI3相互作用キナーゼ(TNNI3K)、ロイシンリッチリピートタンパク質、ニューロン6C(LRRN6C)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-coAレダクターゼ(HMGCR)、プロテインキナーゼD1(PRKD1)、胃阻害性ポリペプチド受容体(RBJ/GIPR)、溶質担体ファミリ39メンバー8(SLC39A8)、膜貫通タンパク質160(TMEM160)、ファンコーニ貧血相補群L(FANCL)、細胞接着分子2(CADM2)、LDL受容体タンパク質1B(LRP1B)、ポリピリミジントラクト結合タンパク質2(PTBP2)、ミトコンドリア翻訳開始因子3(MTIF3)、ジンクフィンガー608(ZNF608)、およびタンパク質ホモログ(TUB)をコードする遺伝子における変異を包含する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、肥満に対する感受性を減少させる。肥満に対する感受性は、体脂肪(例として、脂肪組織)減少、飽和脂肪およびトランス脂肪消費の減少、ならびに身体活動の増加を包含するがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。肥満に対する感受性は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上減少される場合がある。いくつかの実施形態では、肥満に対する感受性は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれ以上減少する。対照は、本明細書において提供される方法で治療されない対象である場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、それを必要とする対象の脂肪恒常性を増加させる。本明細書において使用される場合、脂肪組織恒常性は、過剰カロリーをトリグリセリドとして白色脂肪細胞に貯蔵することと、カロリー引き出し中に白色脂肪細胞から貯蔵された過剰カロリーを利用することとの間のバランスを指す。脂肪恒常性の不均衡は、過剰なカロリーが必要以上にトリグリセリドとして貯蔵されている場合、カロリー離脱が起こらない場合、または過剰なカロリーが必要以上にトリグリセリドとして貯蔵され、カロリー離脱が起こらない場合に生じる。脂肪恒常性の不均衡の非限定的な症状は、耐糖能の減少、性腺脂肪組織量の減少、および高血糖症の増加を包含する。
いくつかの実施形態では、脂肪恒常性が減少した本明細書の対象は、耐糖能が減少している。耐糖能の減少は、対象が75g耐糖能試験において2時間後に140から199mg/デシリットル(mg/dL)(7.8から11.0mmol)のグルコースレベルを有することを意味する。未治療の耐糖能減少は、前糖尿病としても知られており、介入なしに2型糖尿病に進行する可能性が高い。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、耐糖能を増加させる。耐糖能は、75グラム耐糖能試験を包含するがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。耐糖能は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、耐糖能は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、本明細書において提供される方法で治療されない対象である場合がある。
いくつかの実施形態では、脂肪恒常性が減少した本明細書の対象は、脂肪組織量が増加している。脂肪組織は、皮下脂肪組織(SAT)または内臓脂肪組織(VAT)である場合がある。VATは、対象の内部器官を取り囲み、性腺脂肪組織(GAT)、大網脂肪組織(OAT)、後腹膜脂肪組織(RAT)、腸間膜脂肪組織(MAT)または心膜脂肪組織(PAT)である場合がある。いくつかの実施形態では、脂肪組織量の増加は、GAT量の増加である。GAT塊は、雄の精巣周囲(精巣上体)および雌の卵巣周囲(卵巣周囲)に見られる。GATは、SATと比較して、PPARγおよびSREBP1Cならびに脂肪生成転写因子CCAATエンハンサー結合タンパク質アルファ(C/EBP-アルファ)遺伝子をより多く発現する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供した方法は、脂肪組織(例として、GAT)量を減少させる。脂肪組織量は、対象の重量測定、脂肪組織特異的遺伝子(例として、PPARγ、SREBP1Cおよび/またはCEBP-α)の発現の測定、および脂肪組織特異的タンパク質(例として、PPARγ、SREBP1Cおよび/またはCEBP-α)の免疫蛍光染色を包含するがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。脂肪組織質量は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上減少される場合がある。いくつかの実施形態では、脂肪組織量は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、またはそれを超えて減少する。対照は、本明細書において提供される方法で治療されない対象である場合がある。
ILC2および/またはMSC細胞を、2つ以上のRETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストと接触される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1～10個、2～9個、3～8個、4～7個または5～6個のRET/ADRB2アゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超えるRET/ADRB2アゴニストと接触させる。ILC2および/またはMSCを複数(例として、2つ以上)のRET/ADRB2アゴニストと接触させる実施形態では、ILC2および/またはMSCを複数のRET/ADRB2アゴニストと同時にまたは連続して接触される場合がある。
ILC2発現または活性の減少に関連する障害
いくつかの態様では、対象におけるILC2活性または増殖の減少に関連する障害を治療する方法も本明細書において提供される。ILC2の活性または増殖の減少に関連する障害を治療する方法は、対照と比較して、ILC2(例として、対象において)を本明細書において提供される任意のRETアゴニストと接触させること、MSCを本明細書において提供される任意のADRB2アゴニストと接触させること、またはそれらの組合せを包含する場合がある。対照は、RETアゴニストと接触させないILC2を有する対象、ADRB2アゴニストと接触させるMSCを有する対象、または、RETアゴニストと接触させる前のICL2および/またはADRB2アゴニストと接触させる前のMSCを有する同じ対象である場合がある。
対象におけるILC2の活性または増殖の減少に関連する障害は、ILC2の活性または増殖の減少に関連する任意の障害である場合がある。ILC2活性または増殖の減少に関連する障害の非限定的な例は、重量増加、肥満、糖尿病、メタボリックシンドロームまたはそれらの組合せを包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の減少に関連する障害は重量増加である。重量増加は、脂肪組織、体液、または筋肉量の増加によって起こり得る。脂肪組織の増加は、対象が日常的な身体活動によって消費されるカロリーよりも多くのカロリーを定期的に消費する場合に生じる。体液の増加は、薬物、体液および塩の保持、静脈内輸液、腎不全、または心不全に起因し得る。筋肉量の増加は、運動時に一般的に見られる。いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の減少に関連する障害は、脂肪組織(例として、GAT)の増加による重量増加である。重量増加のための従来の治療(例として、脂肪組織の増加に起因する)は、それだけに限らないが、日常身体活動の増加、飽和脂肪およびトランス脂肪が少ない食品の消費増加、および利尿薬(例として、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、ヒドロクロロチアジド、メトラゾン、スピロノラクトン)による治療を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の減少に関連する障害は肥満である。肥満は、任意の方法によって診断される場合があり、本明細書において記載される任意の症状とともに起こる場合がある。
いくつかの実施形態では、ILC2の活性または増殖の減少に関連する障害は糖尿病である。糖尿病は、インスリンを産生または応答する対象の能力が損なわれ、血液および尿中のグルコースレベルが200mg/dL以上になる障害である。糖尿病は、1型糖尿病(若年性糖尿病)または2型糖尿病(成人発症糖尿病)である場合がある。いくつかの実施形態では、糖尿病は2型糖尿病である。2型糖尿病では、対象は十分なインスリンを産生しないか、またはインスリンに応答せず、高血糖をもたらす。2型糖尿病の症状は、それだけに限らないが、口渇の増加、頻繁な排尿、空腹、疲労およびかすみ目を包含する。糖尿病の従来の治療は、それだけに限らないが、日常身体活動の増加、飽和脂肪およびトランス脂肪の少ない食物の消費の増加、血糖値のモニタリング、抗糖尿病薬(例として、メトホルミン、スルホニル尿素、グリニド、チアゾリジンジオン、DDP-4阻害剤、GLP-1受容体アゴニスト、SGLT2阻害剤)による治療、およびインスリン療法を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2の活性または増殖の減少に関連する障害は、メタボリックシンドローム(インスリン抵抗性症候群としても知られる)である。代謝症候群は、メタボリックシンドロームを有さない対象と比較して、心疾患、脳卒中および糖尿病(例として、2型糖尿病)のリスクを増加させる状態の一群である。代謝症候群は、典型的には、対象が以下の3つ以上を有する場合に診断される:高血圧(例として、収縮期は135mmHg以上であり、拡張期は85mmHg以上である)、高血糖(例として、100mg/dL以上の空腹時血糖)、ウエスト周囲の過剰な体脂肪(例として、男性では40インチを超え、女性では35インチを超える胴周り)、および異常なコレステロールレベル(総コレステロール200mg/dL超、非高比重リポタンパク質130mg/dL超、低比重リポタンパク質100mg/dL超、および/または高比重リポタンパク質50mg/dL未満)。メタボリックシンドロームの従来の治療は、それだけに限らないが、日常身体活動の増加、飽和脂肪およびトランス脂肪が少ない食品の消費増加、禁煙、ストレスの軽減、高血圧薬(例として、ACE阻害剤、アンジオテンシンII受容体アブレーション薬、利尿薬、βアブレーション薬)、コレステロール薬(例として、スタチン、ナイアシン、胆汁酸樹脂)、糖尿病薬(メトホルミン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン)、および低用量アスピリンを包含する。
ILC2活性は、限定するものではないが、ILC2細胞によって産生されたタンパク質の定量的PCR測定および蛍光定量(例として、サイトカイン)を包含する当技術分野で公知の任意の方法によって測定する場合がある。ILC2増殖は、ILC2表面タンパク質の免疫組織化学およびILC2特異的タンパク質の定量的PCR(例として、RET受容体、神経ペプチド受容体Nmur1、インターロイキン-33受容体ST2、IL-17A/IL-17B受容体)を包含するがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。
ILC2活性は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2活性は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。ILC2増殖は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2増殖は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて増加する。対照は、RETアゴニストと接触していないILC2、またはRETアゴニストと接触する前の同じILC2、MSCをADRB2アゴニストと接触させない細胞におけるILC2またはADRB2アゴニストと接触させる前の細胞における同じILC2である場合がある。
ILC2および/またはMSC細胞を、2つ以上のRETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストと接触される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1～10個、2～9個、3～8個、4～7個または5～6個のRET/ADRB2アゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超えるRET/ADRB2アゴニストと接触させる。ILC2および/またはMSCを複数(例として、2つ以上)のRET/ADRB2アゴニストと接触させる実施形態では、ILC2および/またはMSCを複数のRET/ADRB2アゴニストと同時にまたは連続して接触される場合がある。
ILC2活性または増殖の増加に関連する障害
いくつかの態様では、対象におけるILC2活性または増殖の増加に関連する障害を治療する方法も本明細書において提供される。ILC2の活性または増殖の増加に関連する障害を治療する方法は、対照と比較して、ILC2(例として、対象において)をRETアンタゴニストと接触させること、MSCをADRB2アンタゴニストと接触させること、またはそれらの組合せを包含する場合がある。対照は、RETアンタゴニストと接触させないILC2を有する対象、ADRB2アンタゴニストと接触させるMSCを有する対象、または、RETアンタゴニストと接触させる前のICL2および/またはADRB2アンタゴニストと接触させる前のMSCを有する同じ対象である場合がある。
対象におけるILC2の活性または増殖の増加に関連する障害は、ILC2の活性または増殖の増加に関連する任意の障害である場合がある。ILC2活性または増殖の増加に関連する障害の非限定的な例は、体温、悪液質、アレルギー、蠕虫感染、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、腸炎症性疾患、またはそれらの組合せを包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2の活性または増殖の増加に関連する障害は、低体温症である。本明細書において使用される場合、低体温症は、体温の有意で潜在的に危険な低下を意味する。ヒト対象の正常体温は約98.6°F(37℃)であり、低体温症は、ヒト対象の体温が95°F(35℃)を下回ると発生する。低体温症は、寒冷への曝露または冷水への浸漬によって引き起こされることが多い。低体温症のための従来の治療は、対象(例として、ヒト)を通常の体温に戻すための方法を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の増加に関連する障害は悪液質である。悪液質は、対象が重量を減らそうとしておらず、既知の疾患または疾患を有する場合、12ヶ月またはそれ未満にわたる重量の5％超の減少であり、対照と比較して、筋力低下、疲労、食欲不振、除脂肪マス指数の低下、血液検査によって特定される炎症の上昇、貧血、または低レベルのタンパク質アルブミンの少なくとも3つを伴う。悪液質は、がん、うっ血性心不全、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性腎臓疾患、嚢胞性線維症、および関節リウマチ等の疾患で起こる。悪液質の症状を緩和するための従来の治療は、食欲刺激薬(例として、酢酸メゲストロール、Megace);悪心、食欲および気分を改善するためのドロナビノール(マリノール)等の薬物;炎症を減少させる薬剤;食事内容の変更;栄養補助食品;ならびに適応運動を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の増加に関連する障害はアレルギーである。アレルギーは、有害ではない外因性物質に対する免疫系応答である。アレルギーのカテゴリーは、それだけに限らないが、食物(例として、牛乳、大豆、卵、小麦、ピーナッツ、ナッツ、魚、甲殻類)、季節性(例として、花粉、カビ、ブタクサ)、ラテックス、薬物(例として、ペニシリン)、虫刺症または咬傷(例として、スズメバチ、ハチ、スズメバチ、アリ、蚊、ダニ)および毒素(例として、ツタウルシ、ツタウルシ、西洋ウルシ、ウルシウルシ)を包含する。アレルギーの症状は、それだけに限らないが、充血した眼、かゆみを伴う発疹、くしゃみ、鼻水、息切れ、腫脹、および蕁麻疹を包含する。アレルギーを緩和するための従来の治療は、薬物療法(例として、抗ヒスタミン薬、グルココルチコイド、エピネフリン、肥満細胞安定剤、抗ロイコトリエン剤、抗コリン作動薬、うっ血除去薬)、免疫療法(例として、注射免疫療法、舌下免疫療法)、および代替医療(例として、生理食塩水による鼻灌注、バターバー)を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の増加に関連する障害は、蠕虫感染である。蠕虫は、生きている宿主に生息し、生きている宿主に餌を与える寄生虫である。蠕虫のカテゴリーは、環形動物(例として、環状ワーム、分割型ワーム)、扁形動物(例として、サナダムシ(tapeworm)、インフルエンザ(fluke)、血液インフルエンザ(blood fluke))、線虫(例として、回虫)、および鉤頭動物(例として、ハリガネムシ)を包含するが、これらに限定されない。蠕虫感染の症状は、腹痛、重量減少、悪心、嘔吐、発熱、咳、呼吸困難、蕁麻疹、筋痛、肺臓炎、リンパ節症、肝脾腫および痙攣を包含するが、これらに限定されない。蠕虫感染の従来の治療は、メベンダゾール、アルベンダゾール、ニクロサミド、プラジカンテル、およびステロイド(例として、デキサメタゾン、プレドニゾロン)を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2の活性または増殖の増加に関連する障害は、アレルギー性喘息である。アレルギー性喘息は、肺の気道の長期にわたる炎症性疾患である。アレルギー性喘息は、チリダニ、ゴキブリ、動物のふけおよびカビを包含するがこれらに限定されない任意の既知のアレルゲンへの曝露によって起こる場合がある。アレルギー性喘息の非限定的な症状は、喘鳴、咳、胸部圧迫および息切れを包含する。アレルギー性喘息の従来の治療は、アレルゲン、吸入コルチコステロイド、および抗ロイコトリエン剤の回避を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の増加に関連する障害は、アトピー性皮膚炎である。アトピー性皮膚炎(アトピー性湿疹)は、皮膚の長期にわたる炎症であり、その結果、かゆみ、発赤、腫脹、およびひび割れが生じる。アトピー性皮膚炎は、典型的には、対象が以下のうちの3つ以上を有する場合に診断される:皮膚のしわが関与している(例として、足の前、肘窩、膝窩、目、首および頬の周りの皮膚の曲げ皮膚炎)、喘息またはアレルギー性鼻炎の病歴(または対象が4歳未満である場合は家族歴)、2歳前から始まる症状、乾燥皮膚の病歴(過去1年以内)、ならびに屈曲面または頬、額、および伸展面に見える皮膚炎。患部の皮膚領域から透明な流体が生じる場合がある。アトピー性皮膚炎の原因は不明であるが、遺伝、免疫系の機能不全、環境暴露、および皮膚の透過性の問題が関与していると考えられている。アトピー性皮膚炎の従来の治療は、誘因(例として、ウールウェア、石鹸、香水、塩素、埃、タバコの煙)を避けること、毎日入浴し、その後保湿クリームを塗布すること、ステロイドクリーム、およびかゆみを軽減する薬物を包含する。
いくつかの実施形態では、ILC2活性または増殖の増加に関連する障害は腸炎症性疾患である。腸炎症性疾患(炎症性腸疾患(IBD)としても知られる)は、腸管の全部または一部の進行中の炎症である。腸炎症性疾患は、小腸または大腸(腸)で起こる場合がある。腸炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を包含するがこれらに限定されない任意の腸炎症性疾患を包含する包括的な用語である。腸炎症性疾患の症状は、下痢、疲労、腹痛および痙攣、血便、食欲不振、および意図しない重量減少を包含する。腸炎症性疾患の従来の治療は、抗炎症薬(例として、コルチコステロイド、アミノサリチラート)、免疫系抑制薬(例として、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサート)、生物製剤(例として、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ベドリズマブ、ウステキヌマブ)、抗生物質(例として、シプロフロキサシン、メトロニダゾール)、下痢止め薬(例として、オオバコ粉末、メチルセルロース、ロペラミド)、鎮痛薬(例として、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセンナトリウム、ジクロフェナクナトリウム)、およびビタミンを包含するが、これらに限定されない。
RETアンタゴニストは、当技術分野で公知の任意のRETアンタゴニストである場合がある。RETのアンタゴニストは、ペプチドアンタゴニスト(修飾ペプチドおよびコンジュゲートを包含する)、阻害性抗体分子、阻害性核酸分子および小分子を包含する。RETアンタゴニストのいくつかは、RETに完全に特異的である場合があるか、(他のチロシンキナーゼと比較して)RETに優先的に拮抗し得るか、またはRETと他のチロシンキナーゼ(以下に記載される小分子RETチロシンキナーゼ阻害剤のいくつか等)の両方に拮抗し得る。そのようなアンタゴニストは、RETが他のチロシンキナーゼよりも弱く拮抗する場合であっても有用である場合があるが、本明細書において記載される方法において使用されるアンタゴニストは、RETを他のチロシンキナーゼよりも大きく拮抗することが好ましい。本明細書において使用される場合、(他のチロシンキナーゼと比較して)RETを優先的にアンタゴナイズすることは、アンタゴニストがRETを他のチロシンキナーゼよりも少なくとも10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれ以上アンタゴナイズすることを意味する。
RETのアンタゴニストは、(a)RETチロシンキナーゼ活性、(b)GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)、または(c)GFRαリガンド、またはその抗原結合断片に特異的に結合し阻害する抗体を包含する。例は、ヒトGFRα3に結合する米国特許第8,968,736号、米国特許第9,522,185号および米国特許出願公開第2017/0096488号に記載されている抗体を包含する。RET結合抗体は、米国特許第6,861,509号に記載されているもの等、当技術分野で公知であり、様々な市販の抗体が知られている。(a)RETチロシンキナーゼ活性、(b)GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)または(c)GFRαリガンドに特異的に結合して阻害する抗体は、RET、GFRαまたはGFRαリガンドに結合する抗体のセットの中でこれらの活性の1つをスクリーニングすることによって得ることができる。
RETのアンタゴニストは、RET、GFRαまたはGFRαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる阻害性核酸分子を包含する。適切な阻害性核酸分子は、RET特異的、GFRα特異的またはGFRαリガンド特異的阻害性核酸、例として、RET、GFRαまたはGFRαリガンドに特異的に標的化されるsiRNA、アンチセンス、アプタマーまたはリボザイムを包含する。
RETのアンタゴニストは、RETチロシンキナーゼ阻害剤を包含する。例示的なRETチロシンキナーゼ阻害剤は、AST487、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブおよびアレクチニブを包含する。
AST 487(NVP-AST487;630124-46-8;UNII-W34UO2M4T6としても知られている);IUPAC名:1-［4-［(4-エチルピペラジン-1-イル)メチル］-3-(トリフルオロメチル)フェニル］-3-［4-［6-(メチルアミノ)ピリミジン-4-イル］オキシフェニル］尿素)は、RET、受容体型チロシン-プロテインキナーゼFLT 3、キナーゼインサートドメイン受容体(KDR;VEGFR2)、アベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(c-ABL)、およびRET自己リン酸化および下流エフェクターの活性化を阻害することが示されている幹細胞因子受容体(c-KIT)の阻害剤である(Akeno-Stuart et al.,Cancer Res.2007 Jul 15;67(14):6956-64)。AST 487の化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000003
モテサニブ(AMG-706としても知られている;IUPAC名:N-(3,3-ジメチル-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-6-イル)-2-［(ピリジン-4-イルメチル)アミノ］ピリジン-3-カルボキサミド)は、RET、VEGFR、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)およびc-KITの阻害剤である。モテサニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000004
カボザンチニブ(CABOMETYX;COMETRIQ;XL-184;BMS-907351としても知られている;IUPAC名:N-(4-((6,7-ジメトキシキノリン-4-イル)オキシ)フェニル)-N'-(4-フルオロフェニル)シクロプロパン-1,1-ジカルボキサミド)は、RET、肝細胞増殖因子受容体(MET)、AXL受容体チロシンキナーゼ(AXL;チロシン-プロテインキナーゼ受容体UFO)、およびVEGFR2を包含する血管内皮増殖因子受容体受容体(VEGFR)の阻害剤である。カボザンチニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000005
バンデタニブ(CAPRELSA;ZACTIMA;ZD-6474としても知られている;IUPAC名:N-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-6-メトキシ-7-((1-メチルピペリジン-4-イル)メトキシ)キナゾリン-4-アミン)は、RET、VEGFR2を包含するVEGFR、および上皮成長因子受容体(EGFR)の阻害剤である。バンデタニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000006
ポナチニブ(ICLUSIG;AP24534としても知られている;IUPAC名:3-(2-イミダゾ［1,2-b］ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-［4-［(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル］-3-(トリフルオロメチル)フェニル］ベンズアミド)は、RETおよび線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)の阻害剤である。ポナチニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000007
スニチニブ(SUTENTとしても知られている;SU11248;IUPAC名:N-(2-ジエチルアミノエチル)-5-［(Z)-(5-フルオロ-2-オキソ-1 H-インドール-3-イリデン)メチル］-2,4-ジメチル-1 H-ピロール-3-カルボキサミド)は、RET、PGFR、VEGFR、c-KIT、顆粒球コロニー刺激因子受容体(GCSFR)およびFLT 3の阻害剤である。スニチニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000008
ソラフェニブ(NEXAVARとしても知られている;IUPAC名:4-［4-［［4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］-N-メチル-ピリジン-2-カルボキサミド)は、RET、VEGFR、PDGFRおよびRafファミリキナーゼの阻害剤である。ソラフェニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000009
アレクチニブ(ALECENSAとしても知られている;IUPAC名:9-エチル-6,6-ジメチル-8-［4-(モルホリン-4-イル)ピペリジン-1-イル］-11-オキソ-6,11ジヒドロ-5 H-ベンゾ［b］カルバゾール-3-カルボニトリル)は、RETおよび未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)の阻害剤である。アレクチニブの化学構造を以下に示す:
Figure 2024522938000010
他の適切なRETアンタゴニストは、米国特許第6,235,769号、米国特許第7,504,509号、米国特許第8,067,434号、米国特許第8,426,437号、米国特許第8,629,135号、米国特許第8,937,071号、米国特許第8,999,973号、米国特許第9,035,063号、米国特許第9,382,238号、米国特許第9,297,011号、米国特許出願公開第2015/0238477号、米国特許出願公開第2015/0272958号、米国特許出願公開第2016/0271123号、米国特許出願公開第20160354377号、米国特許出願公開第2017/0096425号、および米国特許出願公開第2017/0121312号、ならびに世界中の関連特許出願に記載されている分子を包含する。
ADRB2アンタゴニストは、当技術分野で公知の任意のADRB2アンタゴニストである場合がある。ADRB2アゴニストは、ベータ1およびβ2アドレナリン受容体の両方に結合する非選択的なベータアドレナリン作動性受容体アンタゴニストである場合があり、プロプラノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロールおよびチモロールを包含する。ADRB2アンタゴニストは、(他のβ-アドレナリン受容体と比較して)ADRB2に特異的である場合がある。ADRB2特異的アンタゴニストの非限定的な例は、ブタキサミンおよびICI-118,551を包含する。本明細書の方法で使用するための他の可能なADRB2アンタゴニストは、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、メトプロロール、ネビボロール、エスモロールおよびSR 59230Aを包含する。
ILC2活性は、限定するものではないが、ILC2細胞によって産生されたタンパク質の定量的PCR測定および蛍光定量(例として、サイトカイン)を包含する当技術分野で公知の任意の方法によって測定する場合がある。ILC2増殖は、ILC2表面タンパク質の免疫組織化学およびILC2特異的タンパク質の定量的PCR(例として、RET受容体、神経ペプチド受容体Nmur1、インターロイキン-33受容体ST2、IL-17A/IL-17B受容体)を包含するがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の方法によって測定される場合がある。
ILC2活性は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上減少される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2活性は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて減少する。ILC2増殖は、対照と比較して5％～50％、10％～100％、25％～150％、50％～200％、75％～250％、100％～300％、150％～350％、200％～400％、250％～450％、300％～500％、350％～550％またはそれ以上減少される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2増殖は、対照と比較して少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％またはそれを超えて減少する。対照は、RETアンタゴニストと接触していないILC2、またはRETアンタゴニストと接触する前の同じILC2、MSCをADRB2アンタゴニストと接触させない細胞におけるILC2またはADRB2アンタゴニストと接触させる前の細胞における同じILC2である場合がある。
ILC2および/またはMSC細胞を、2つ以上のRETアンタゴニストおよび/またはADRB2アンタゴニストと接触される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1～10個、2～9個、3～8個、4～7個または5～6個のRET/ADRB2アンタゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超えるRET/ADRB2アンタゴニストと接触させる。ILC2および/またはMSCを複数(例として、2つ以上)のRET/ADRB2アンタゴニストと接触させる実施形態では、ILC2および/またはMSCを複数のRET/ADRB2アンタゴニストと同時にまたは連続して接触される場合がある。
寒冷曝露
いくつかの態様では、寒冷曝露を治療する方法も本明細書において提供される。寒冷曝露を治療する方法は、対照と比較して、ILC2(例として、対象において)をRETアゴニストと接触させること、MSCをADRB2アゴニストと接触させること、またはそれらの組合せを包含する場合がある。対照は、RETアゴニストと接触させないILC2を有する対象、ADRB2アゴニストと接触させるMSCを有する対象、または、RETアゴニストと接触させる前のICL2および/またはADRB2アゴニストと接触させる前のMSCを有する同じ対象である場合がある。
寒冷曝露は、湿気、風、および/または寒冷な天候の屋外、あるいは寒冷曝露を防ぐのに十分に加熱されていない住居の屋内で起こり得る。治療せずに放置した場合、寒冷曝露は、軽い凍傷、凍傷、塹壕足、凍瘡および低体温症を包含するがこれらに限定されない損傷をもたらす場合がある。軽い凍傷は、短時間ではしびれや青白い肌を引き起こすが、温めると通常の感触や色に戻る。凍傷は、皮膚および皮膚下の組織の凍結であり、加温時に正常な感覚または色に戻らない。塹壕足は、皮膚が実際に凍らない低温に数日間さらされて徐々に発生する損傷であり、2～7日後に赤くなる皮膚、しびれまたは灼熱痛、下肢痙攣、および水疱または潰瘍の発生を特徴とする。凍瘡(凍瘡)は、低温に対する反応であり、局所的な発赤および腫脹、皮膚の隆起、感覚の変化、再加温後に生じる柔らかい青色の隆起、ならびに水疱および潰瘍を特徴とする。低体温については上で論じた。
寒冷曝露による損傷の危険因子は、乳児(1歳未満)であること;高齢者(65歳以上)であること;アルコールを摂取すること、標高の高い屋外にいること、強風、湿った天候、または冷水に浸されていること;疲労または脱水しており、職場で低温にさらされている;糖尿病、HIV、癌、または心疾患等の状態を有する;抗凝固剤、免疫抑制剤等の特定の医薬品を服用すること;手術または怪我等の最近の健康上の事象を有することを包含するが、これらに限定されない。
対象の体温は、本明細書において提供される寒冷曝露を治療する方法によって、対照と比較して1°F～45°F、5°F～40°F、10°F～35°F、15°F～30°F、20°F～25°F、または1℃～25℃、5℃～20℃、10℃～15℃以上増加される場合がある。いくつかの実施形態では、対象の温度は、対照と比較して、少なくとも1°F、2°F、3°F、4°F、5°F、6°F、7°F、8°F、9°F、10°F、11°F、12°F、13°F、14°F、15°F、16°F、17°F、18°F、19°F、20°F、21°F、22°F、23°F、24°F、25°F、26°F、27°F、28°F、29°F、30°F、31°F、32°F、33°F、34°F、35°F、36°F、37°F、38°F、39°F、40°F、41°F、42°F、43°F、44°F、45°F、またはそれ以上増加される。いくつかの実施形態では、対象の温度は、少なくとも1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃または25℃増加される。対照は、RETアゴニストと接触していないILC2、またはRETアゴニストと接触する前の同じILC2、MSCをADRB2アゴニストと接触させない細胞におけるILC2またはADRB2アゴニストと接触させる前の細胞における同じILC2である場合がある。
ILC2および/またはMSC細胞を、2つ以上のRETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストと接触される場合がある。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1～10個、2～9個、3～8個、4～7個または5～6個のRET/ADRB2アゴニストと接触させる。いくつかの実施形態では、ILC2および/またはMSCを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超えるRET/ADRB2アゴニストと接触させる。ILC2および/またはMSCを複数(例として、2つ以上)のRET/ADRB2アゴニストと接触させる実施形態では、ILC2および/またはMSCを複数のRET/ADRB2アゴニストと同時にまたは連続して接触される場合がある。
投与方法
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法は、細胞(例として、ILC2、MSC)をRETアゴニスト、RETアンタゴニスト、ADRB2アゴニスト、またはADRB2アンタゴニストと接触させることを含む。接触は、化合物(例として、RETアゴニスト、RETアンタゴニスト、ADRB2アゴニスト、ADRB2アンタゴニスト)または化合物を含む医薬組成物を細胞に提供することを意味する。
本明細書において提供される方法で接触させる細胞は、in vitroまたはin vivoである場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法で接触させる細胞はin vitroである。in vitro細胞は、in vivo環境(例として、細胞培養において)を模倣する条件下で維持される場合がある。in vitro細胞は、細胞の集団の単一または一部である場合がある。細胞の集団は、2個の細胞、1,000個の細胞、500個の細胞～10,000個の細胞、5,000個の細胞～100,000個の細胞、50,000個の細胞～1,000,000個の細胞、500,000個の細胞～10,000,000個以上の細胞を含む場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法で接触させる細胞はin vivoである。細胞をin vivoで接触させる場合、RETアゴニスト、RETアンタゴニスト、ADRB2アゴニスト、ADRB2アンタゴニスト、またはそれらの組合せを対象に投与する場合がある。対象は、ヒト、げっ歯類(例として、マウス、ラット、ハムスター)、非ヒト霊長類(例として、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン)、家庭用ペット(例として、イヌ、ネコ、ウサギ)、または家畜動物(例として、ウマ、ウシ、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ)を包含するがこれらに限定されない、それを必要とする任意の対象である場合がある。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、in vitro細胞(例として、ILC2、MSC)は、対象の組織に由来する。対象における組織は、対象において生じる任意の組織である場合がある。組織に由来するとは、組織からのin vitro細胞の単離を指す。組織からin vitro細胞を誘導することは、化学的消化(例として、トリプシン)または機械的組織消化(例として、均質化)を包含するがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法を使用する場合がある。in vitro細胞が由来する場合がある可能な組織の非限定的な例は、脂肪、骨格筋、平滑筋、心筋、神経、血液、腎臓、膵臓、胃、小腸、大腸、直腸、脳、脊髄、骨、軟骨、皮膚、毛髪、肝臓、卵巣、子宮、精巣、前立腺、心臓、肺、気管、舌および唾液腺を包含する。いくつかの実施形態では、in vitro細胞は脂肪組織に由来する。
いくつかの実施形態では、アゴニスト(例として、RETアゴニスト、ADRB2アゴニスト)、アンタゴニスト(例として、RETアンタゴニスト、ADRB2アンタゴニスト)またはそれらの組合せを、それを必要とする対象に投与する。投与は、注射(例として、静脈内、筋肉内、動脈内、脳室内)、吸入および摂取(例として、経口、直腸)を包含するがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によるものである場合がある。
アゴニスト(例として、RETアゴニスト、ADRB2アゴニスト)、アンタゴニスト(例として、RETアンタゴニスト、ADRB2アンタゴニスト)またはそれらの組合せが対象に投与される場合、アゴニストおよび/またはアンタゴニストのそれぞれの用量が投与される。絶対量は、同時治療、投与回数、ならびに年齢、身体状態、サイズおよび重量を包含する個々の患者パラメータを包含する様々な要因に依存する。これらは当業者に周知の因子であり、日常的な実験のみで対処することができる。一般的には、最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最も高い安全用量が使用されることが好ましい。それを必要とする対象に複数回投与される場合がある。
本発明の活性薬剤(例として、本明細書において記載の化合物および細胞)は、疾患を治療するための有効量で対象に投与される。本発明のいくつかの態様によれば、有効量は、治療されている疾患に応じて、アゴニスト(例として、RETアゴニスト、ADRB2アゴニスト)、アンタゴニスト(例として、RETアンタゴニスト、ADRB2アンタゴニスト)を単独で、または別の医薬と組み合わせて、疾患に対する治療応答をもたらす量である。生物学的効果は、疾患または疾患に起因する症状の改善および/または絶対的排除である場合がある。別の実施形態では、生物学的効果は、例えば、疾患の症状がないことによって証明される、疾患の完全な抑止である。
本明細書において記載の疾患の治療における本発明の方法で使用される化合物(すなわち、アゴニスト、アンタゴニスト、またはそれらの組合せのいずれか)の有効量は、使用される特定の化合物、化合物の送達様式、およびそれが単独でまたは組み合わせて使用されるかどうかに応じて変化する場合がある。任意の特定の適用のための有効量はまた、治療される疾患、投与される特定の化合物、対象のサイズ、または疾患若しくは状態の重症度等の要因に応じて変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに、当技術分野で公知の日常的および許容される方法を使用して、本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書において提供される教示と組み合わせると、様々な活性化合物の中から選択し、効力、相対バイオアベイラビリティ、患者の重量、有害な副作用の重症度および好ましい投与様式等の重要な因子を検討することによって、実質的な毒性を引き起こさず、なおかつ特定の対象を治療するために有効である有効な治療の治療レジメンが計画され得る。
他の実施形態では、化合物を単離される場合がある。本明細書において使用される場合、単離されているとは、参照される材料がその天然の環境、例として細胞から除去されることを意味する。したがって、単離された生物学的材料は、いくつかまたは全ての細胞成分、すなわち天然材料が天然に存在する細胞の成分を含まなくてもよい(例として、細胞質または膜成分)。核酸分子の場合、単離された核酸は、PCR産物、単離されたRNA、合成的に(例として、化学的に)産生されたRNA、例としてsiRNA、アンチセンス核酸、アプタマー等を包含する。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、または他のベクターに挿入されてキメラ組換え核酸構築物の一部を形成するか、またはそれをコードする核酸の発現によって産生される配列を包含する。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞内で会合する他のタンパク質若しくは核酸、またはその両方と会合される場合があり、または膜結合タンパク質である場合は細胞膜と会合していてもよく、または合成的に(例として、化学的に)産生される場合があり、またはそれをコードする核酸の発現によって産生される場合がある。単離された細胞(例えば、ILC2細胞またはMSC等)は、それが生物において見出される解剖学的部位から取り出される場合があるか、または単離された細胞若しくは細胞集団のin vitro拡大によって作製される場合がある。単離された物質は、精製される場合があるが、精製される必要はない。
精製されたとは、タンパク質、核酸、または細胞若しくは細胞集団を指し、施術者が所望の目的のために精製された物質を使用することを可能にするのに十分な程度まで、夾雑物から所望の物質を分離することを指す。好ましくは、これは、出発物質または天然物質の少なくとも1桁の精製、より好ましくは2または3桁の精製、最も好ましくは4または5桁の精製が達成されることを意味する。特定の実施形態では、精製RETアゴニスト、RETアンタゴニスト、ADRB2アゴニスト、ADRB2アンタゴニスト、またはそれらの組合せは、場合により、重量で、総タンパク質または核酸または細胞集団の少なくとも60％、少なくとも80％、または少なくとも90％である場合がある。特定の実施形態では、精製RETアゴニスト、RETアンタゴニスト、ADRB2アゴニスト、ADRB2アンタゴニスト、またはそれらの組合せは、標準的な関連する実験室プロトコルによってアッセイした場合に均一になるまで精製される。
いくつかの実施形態では、アゴニスト(例として、RETアゴニスト、ADRB2アゴニスト)、アンタゴニスト(例として、RETアンタゴニスト、ADRB2アンタゴニスト)またはそれらの組合せを医薬組成物中の対象に投与する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は無菌である。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された有効量の1つ以上の薬剤を含む。薬学的または薬理学的に許容され得るとは、必要に応じて、例えばヒト等の動物に投与した場合に有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。更に、動物(例として、ヒト)投与の場合、製剤は、関連する政府規制機関によって要求される無菌性、発熱原性、一般的な安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。化合物は、一般に、ヒトへの投与に適している。この用語は、化合物または組成物が非毒性であり、ヒトへの投与前に化合物または組成物の更なる操作が必要とされないように十分に純粋であることを必要とする。
薬学的に許容される担体は、当業者に知られているように(例えば、参照により本明細書において組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences(1990)を参照されたい)、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例として、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、例として同様の材料およびそれらの組合せを包含する。任意の従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、治療用または医薬組成物におけるその使用が企図される。
例
例1:神経-間葉シグナルはGAT ILC2細胞を調節する
マウスの性腺脂肪組織(GAT)の分析により、交感神経ニューロン線維の密集したネットワークの存在が明らかになった(図1A、5A)。アドレナリン作動性キューが局所ILC2細胞(「ILC2」および「ILC2s」とも呼ばれる)に影響を及ぼすかどうかを調べるために、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を使用してドーパミン作動性およびノルアドレナリン作動性ニューロンを除去した。これらのニューロンの全身的なアブレーションは、ILC2由来インターロイキン(IL-)5、IL-13およびMet-Enkの顕著な低下をもたらし(図1B、5B)、CD4 T細胞のパーセンテージの変化をもたらさなかった(図5C)。続いて、ROSA26.DTR(ジフテリア毒素受容体)マウスをチロシンヒドロキシラーゼ-Cre(Th-Cre、R26/DTRTh)マウスに交配し、続いてペグ化ジフテリア毒素(PegDTR)を得られたR26/DTRTh動物に投与することによって、末梢交感神経ニューロンが選択的にアブレーションされた14。末梢交感神経ニューロンの選択的アブレーションは、ILC2活性の障害をもたらした(図1C)。対照的に、クレンブテロールによるβ2アドレナリン受容体(ADRB2)の全身活性化は、GATにおけるILC2由来サイトカインの増加をもたらした(図1D、5D)。一致して、交感神経ニューロン上のデザイナードラッグ(DREADD)によって排他的に活性化されたデザイナー受容体を有するマウス(R26/3DTh)におけるニューロンの化学遺伝学的活性化は、ILC2機能の増加をもたらした(図1E)。交感神経緊張が脂肪ILC2をどのように調節するかを調べるために、Il7ra-CreマウスをAdrb2fl/flマウス(Adrb2ΔIl7ra)に交配することによって、リンパ系細胞においてAdrb2が欠失された。脂肪ILC2機能はAdrb2ΔIl7raマウスでは乱されず(図1F)、交感神経キューが脂肪ILC2を間接的に調節することを示唆した。この仮説を裏付けて、Adrb2ΔIl7raマウスにおける化学的交感神経アブレーションは依然としてILC2サイトカイン産生を障害した(図1G)。交感神経ニューロンのキューとILC2活性との間の細胞リンクを解明するために、非免疫脂肪常在細胞型におけるAdrb2の発現が調査された。血小板由来成長因子受容体アルファ(PDGFRA)を発現する間葉系間質細胞(MSC)は、最高レベルのAdrb2を示し、グリア細胞、内皮細胞、脂肪細胞および他の間葉系対応物がこれに続いた(図1H)。興味深いことに、グリア細胞およびMSCは、GAT交感神経ニューロンに近接している(図1I、1J)。したがって、Gfap-CreマウスまたはPdgfra-CreマウスをAdrb2fl/flマウスに交配することによって、ADRB2の発現をグリア細胞およびMSCにおいて破壊した(それぞれAdrb2ΔGfapおよびAdrb2ΔPdgfra)。ADRB2のグリア自律性欠失を有するマウスはILC2機能が乱されていなかったが、Adrb2ΔPdgfraマウスは、その同腹仔対照と比較した場合、脂肪ILC2由来サイトカインの減少を示した(図1K、1L)。まとめると、これらのデータは、神経-間葉シグナルがGAT ILC2を調節することを示している。
例2:神経-間葉相互作用が神経栄養因子受容体RETを介して脂肪ILC2を調整する
神経-間葉相互作用がどのようにGAT常在ILC2の活性化をもたらすかを調べるために、6-OHDA治療マウス由来のPDGFRA陽性MSCのゲノムワイド転写プロファイリングをその同腹仔対照と比較した。この分析により、227個の調節された転写物が明らかにされ、そのうち35個が下方制御された(図2A、6A)。注目すべきことに、ILC2活性化アラルミンIL-33およびIL-25の発現は、6-OHDAまたはクレンブテロールのいずれかで治療したマウスでは乱されなかった(図2A、図6A～6E)。変化した遺伝子の中で、グリア由来神経栄養因子(GDNF)はPDGFRA陽性MSCによって高度に発現され、6-OHDA治療はその発現を有意に減少させた(図2A)。重要なことに、化学的交感神経アブレーションまたはADRB2刺激時に、GdnfはGATで調節され、PDGFRA＋MSCで選択的に調節されたが、他の間葉系対応物、脂肪細胞および内皮細胞では乱されなかった(図2B～2E)。一致して、Adrb2ΔPdgfraから精製されたGATおよびMSCは、低下したGdnf発現を有していた(図2F、2G)。これらの知見と一致して、精製MSCにおけるADRB2の刺激は、GDNFと共局在化したMSC由来GDNFおよびPDGFRA＋GAT細胞の増加をもたらした15,16(図2H、2I)。GDNFファミリリガンドおよびそれらの好ましい共受容体(GFRa)は、神経系、腎臓および造血細胞のサブセットにおいてトランスフェクション中に再構成されたチロシンキナーゼ受容体(RET)を活性化することが示された16～20。GAT免疫細胞サブセットの分析により、GAT ILC2が高レベルのRetを発現することが明らかになった(図2J)。脂肪ILC2におけるキナーゼ受容体RETの役割を調べるために、最初に、Vav1-CreをRetfl/flマウス(RetΔVav1)に交配することによって、造血細胞においてRetを欠失させた。RetΔVav1マウスは、GATにおいてILC2由来IL-5およびIL-13の減少を示した(図2K)。この知見と一致して、RET共受容体単一ノックアウトの分析により、優先的なGDNF共受容体であるGfra1がILC2機能に選択的に必要であることが明らかになった(図7A～7C)。続いて、第3部分の野生型競合体に対するRetコンピテント(Retfl)またはRet欠損(RetΔVav1)BMをリンパ球様宿主(図7D)に移入することによって、混合骨髄(BM)キメラを利用した。これらのキメラマウスの分析は、細胞固有のRETシグナルがGATにおける先天性2型サイトカインに必要であることを示唆した(図7E)。RETのILC2自律的効果を更に確認するために、Il5-CreマウスをRetfl/flマウス(RetΔIl5)に交配し、続いてRetΔIl5マウスをRag1-/-マウスに交配して、推定されるTヘルパー細胞効果を除外した。Rag1-/-RetΔIl5マウスの分析により、RETがILC2自律的様式で作動して、GATにおける先天性2型サイトカインおよびMet-Enkを制御することが確認された(図2L、図7F、図7I)。マウスにおけるILC2活性を更に評価するために、RetWTマウスおよびRetΔIl5マウスならびにRag1-/-、Il2rg-/-ノックアウトマウスの混合骨髄(BM)キメラを作製した(図7H)。IL-5およびIL-13産生の減少によって示されるように、RetΔIl5 Rag1-/-マウス、Il2rg-/-マウスは、RetWT Rag1-/-マウス、Il2rg-/-マウスと比較してILC2活性が低下していた(図7I)。これと一致して、精製されたILC2のGDNFファミリリガンドによるin vitro活性化は、増加した先天性サイトカイン産生をもたらし、機能獲得型RetMEN2B骨髄キメラの分析は、増加したILC2由来IL-5、IL-13およびMet-Enkを明らかにした(図2M～2O、図7J～7L)。最後に、RetΔIl5マウスにおける化学的交感神経アブレーションは、乱されないILC2サイトカイン産生をもたらし、交感神経緊張を統合するためにILC2自律的RETシグナルが必要であることを示している(図8A)。まとめると、これらのデータは、神経-間葉相互作用が神経栄養因子受容体RETを介して脂肪ILC2を統合することを示している。
例3:ILC2内因性神経栄養因子キューは脂肪ホメオスタシスおよび肥満を制御するために必要である
ILC2固有のRETシグナルが脂肪組織生理学を調節するかどうかを決定するために、様々な程度のRETシグナルを試験して、肥満の傾向および関連する耐糖能機能不全を設定した21。最初に、RetΔVav1マウスに高脂肪食(HFD)を与えた。それらの同腹仔対照と比較した場合、RetΔVav1およびRetΔIl5は、HFD誘発肥満に対する感受性の増加、耐糖能の減少およびGAT重量の増加を有していた(図3A～3C、8B、8C)。ILC2、GDNF-RETシグナル伝達、および肥満傾向の間の関連性をより具体的に定義するために、RET十分およびRET欠損ILC2のキメラを、好気性宿主マウスにおいて作製した。RET欠損ILC2-キメラは、HFD誘導性肥満に対する感受性の増加、耐糖能の減少および脂肪細胞サイズの頻度の変化を有していた(図3D～3H)。対照的に、機能獲得型RetMEN2BマウスからILC2を用いて作製されたキメラは、HFD誘発肥満に対する抵抗性、耐糖能の改善および小型脂肪細胞の頻度の増加を示した(図3I～3M)。2型サイトカインおよびMet-Enkは、脂肪組織を介したエネルギー消費を促進することが示されている9、11、12、22。このプロセスにおけるILC2および神経調節キューの寄与を定義するために、脱共役タンパク質1(UCP1)の発現をRET機能喪失モデルおよび機能獲得モデルにおいて評価した。それらの同腹仔対照と比較した場合、RetΔVav1マウスおよびRetΔIl5マウスは、GATにおけるUcp1、Cox8bおよびCidea発現を減少させたが、RetMEN2BBMキメラは、増加したUcp1レベルを示した(図3N、3O、8D)。ILC2自律的GDNF-RETキューがUcp1発現に必要であるという更なる証拠が、Rag1-/-Il2rg-/-マウス由来のGAT外植片培養物のILC2相補によって提供された(図3P、図8E)。注目すべきことに、GAT外植片/ILC2共培養物へのGDNFの添加は、RET依存的様式でUcp1発現を効率的に誘導した(図3Q、8E)。まとめると、これらのデータは、ILC2内因性神経栄養因子のキューが脂肪恒常性および肥満を制御するために必要であることを示している。
例4:個別の脳領域に接続し、GAT ILC2機能を制御する新規な副腎脂肪回路
局所交感神経線維が局所および高次回路をどのように統合するかを調べるために、GATニューロンの接続を特徴付けた。最初に、逆行性緑色蛍光タンパク質(GFP)標識アデノ随伴ウイルス(AAV)をGATに注射することによって、ウイルストレーシング(VT)を行った。そのようなマウスの分析により、脂肪組織においてチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性ニューロン、および、腰筋の腹側に長手方向に走る陰部大腿神経の交感神経TH陽性線維の感染が明らかにされた(図4A～4D)。重要なことに、別個の神経細胞体を、椎骨前大動脈腎動脈神経節(ARG)および後根神経節(DRG)までトレーシングした(図4E、4F、9A)。それにもかかわらず、大動脈腎動脈神経節のGFP標識細胞体はドーパミン作動性であったが、それらのDRG対応物はTH陰性であり、腎神経節がGATの遠心性交感神経支配の細胞体を有することを示している(図4E、4F、9A)。GAT-大動脈腎軸が高次回路に接続しているかどうかを調べるために、蛍光タンパク質産生仮性狂犬病ウイルス(PRV)を使用して多シナプストレーシングを実施した。GATまたは大動脈腎動脈神経節からのPRVによる逆行性トレーシングは、脳幹、中脳、扁桃体および視床下部の重複する個別の脳領域への多シナプス結合を明らかにした(図4G、4H、9B、9C)。注目すべきことに、視床下部室傍核(PVH)は、GATおよび大動脈腎動脈神経節から一貫してトレーシングされ、GATがこの視床下部核に多シナプス的に接続することを示している(図4G、4H)。興味深いことに、PVHは、末梢体組織への脳交感神経流出を調節することが以前に報告されており23、24、これは、外科的定位PVHアブレーションを有するマウスにおいて観察された脂肪先天性2型サイトカイン障害と一致する(図9D、9E)。
GAT ILC2に対する大動脈腎神経回路の影響を更に分析するために、片側外科的アブレーションを陰部大腿神経(GFx)に対して行った。偽対側対照と比較すると、GFx GATは、GDNF発現の減少に関連する機能障害を有するILC2を保有していた(図4I、4J)。交感神経大動脈腎ニューロンを神経支配するGATとILC2機能との間の関連性をより明確にするために、これらのニューロンの活性を化学遺伝学的アプローチを使用して調節した。したがって、阻害剤または活性化剤であるDREADD担持アデノ随伴ウイルス(AAV)(それぞれAAV(4D)およびAAV(3D))をGATに片側注射した。続いて、DREADDを保有するニューロンのニューロン阻害または刺激をもたらすデザイナードラッグ(クロザピン-N-オキシド(CNO))を注射した。それぞれの偽対側対照と比較した場合、AAV(4D)発現ニューロンの阻害はGDNFおよび先天性2型サイトカインの減少をもたらしたが、AAV(3D)担持ニューロンの活性化はGDNFおよびILC2機能の増加をもたらした(図4K～4N)。対照的に、AAV(4D)発現ニューロンの阻害およびAAV(3)D発現ニューロンの活性化は、インターロイキン-33(Il33)発現に影響を及ぼさなかった(図9F、9G)。まとめると、これらのデータは、個別の脳領域に接続し、GAT ILC2機能を制御する新規な大動脈腎-脂肪回路を明らかにする。
例5:考察
神経回路および免疫細胞が協働して器官間コミュニケーションを推進するかどうかを定義することは、生物生理学および全身性疾患を理解するために重要である。この研究は、神経細胞および間葉由来のシグナルを統合してILC2機能および肥満を統合する、認識されていない臓器間および多組織通信回路を確立する。ILC2を調節する交感神経大動脈腎臓-脂肪界面に伝達する脳-体軸が存在する。特に、神経-間葉単位は、交感神経緊張をGATにおける神経栄養因子発現に変換する。次に、神経栄養因子は、神経調節受容体RETを介して脂肪ILC2を制御し、宿主代謝、エネルギー消費および肥満を形成する(図10)。
脂肪間葉系細胞は、IL-33の発現を介して局所免疫細胞の恒常性を調節することが示された25-27。ここでは、間葉系細胞が、GDNFの産生を介して、神経キューを脂肪ILC2機能に結び付けることが実証された。交感神経キューは感染中に肺ILC2を直接阻害することが示されたが28、アドレナリン作動性シグナルはGAT ILC2を間接的に活性化し、交感神経性シグナルがILC2を文脈依存的および器官依存的に活性化または抑制する二重機構を網羅する場合があることを示している。
神経交感神経性キューの合図は、神経脂肪接続の状況で脂肪分解を直接媒介する7。この研究は、交感神経キューが、ILC2由来サイトカイン産生をもたらす神経-間葉相互作用を介してエネルギー消費を間接的に調節することを示している。このように、これらの直接的および間接的な交感神経効果を組み合わせてエネルギー恒常性を調節することにより、食事チャレンジに対する効率的かつ統合された多組織応答が保証される場合がある。全身代謝キューを統合する際の脳PVHの重要性24、交感神経流出物23、24、および大動脈腎脂肪回路(図4、10)へのその接続を調節する際の脳PVHを考慮すると、PVHが代謝性身体状態をエネルギー恒常性を確実にする末梢免疫機能に変換する中心ハブとして作用すると仮定するように誘導する。最後に、このデータはまた、異常なニューロンおよび免疫機能がどのようにヒトの肥満および代謝障害と関連するかについてのより良好な知識を与える場合がある9、29、30。
例6:材料および方法ならびに参考文献
材料および方法
マウス:C57BL/6JマウスをCharles Riverから購入し、C57BL/6 Ly5.1/Ly5.2(CD45.1/CD45.2)を得るためにC57BL/6J Ly5.1と交配した。Gfap-Cre31、Pdgfra-Cre32、Vav1-Cre33、Il7ra-Cre34、Il5-Cre35、Th-Cre36、Adrb2fl/fl37、Rag1-/-38、Il2rg-/-39、RetMEN2B40、ROSA26.RFP41、ROSA26.3D42、ROSA26.DTR43、Retfl/fl44、Gfra1-/-45、Gfra2-/-46、およびGfra3-/-47は、完全なC57BL/6Jバックグラウンドにあった。マウスを、Champalimaud Centre for the Unknown(CCU)動物施設で、特定の病原体のない条件下で飼育および維持した。特に明記しない限り、マウスを、共収容された同腹仔対照と体系的に比較した。8～9週齢の雌をこの試験に使用した。パワー解析を行って、実験マウスの数を推定した。全ての動物実験は、それぞれ国および機関の倫理委員会、Direcao Geral de VeterinariaおよびCCUの倫理委員会によって承認された。特に明記しない限り、無作為化および盲検化は使用しなかった。
細胞単離:脂肪組織細胞の単離のために、組織をPBSに回収し、小片に切断し、リベラーゼTM(2.5μg/ml、Roche)およびDNase I(20U/ml;Roche)と共に37℃で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。単一細胞懸濁液を100μmセルストレーナー(Thermo Fisher Scientific)に通して得て、遠心分離を使用して間質血管画分を脂肪細胞画分から分離した。赤血球を赤血球溶解緩衝液(eBioscience)で溶解し、遠心分離によって除去した。
フローサイトメトリーおよび細胞選別:ex vivoでのサイトカイン分析のために、特に明記しない限り、細胞を、細胞内染色の前に4時間、完全RPMI(10％ウシ胎仔血清(FBS)、1％HEPES、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリン(Corning)を添加)中のPMA(50ng/ml)、イオノマイシン(500ng/ml)(Sigma)およびブレフェルジンA(eBioscience)と共にインキュベートした。IC固定/透過化キット(eBioscience)を用いて細胞内染色を行った。細胞懸濁液を、eBiosciencesからの、抗CD45(30-F11;1:200);抗CD45.1(A20;1:200);抗CD45.2(104;1:200);抗CD11c(N418;1:200);抗CD11b(Mi/70;1:400);抗CD8α(53-6.7;1:200);抗CD19(eBio1D3;1:200);抗NK1.1(PK136;1:100);抗CD3ε(eBio500A2;1:200);抗TER119(TER-119;1:200);抗Gr1(RB6-8C5;1:400);抗CD4(RM4-5;1:200);抗CD90.2(Thy1.2;53-2.1;1:200);抗TCRβ(H57-595;1:200);抗TCRγδ(GL3;1:200);抗B220(RA3-6B2;1:200);抗KLRG1(2F1/KLRG1;1:200);antiLy-6A/E(Sca1;D7;1:200);抗CD16/CD32(93;1:50);抗gp38(eBio8.1.1;1:100);抗F4/80(BM8;1:200);抗IL-4(11B11;1:100)で染色した。Biolegend製の抗PDGFRA(APA 5;1:400)および抗CD31(MEC 13.3;1:200)。BD Biosciencesからの抗IL-5(TRFK5;1:200)。抗GDNF(B-8;1:200)は、Santa Cruz biotechnologyから購入した。Bioss製の抗Met-Enk(bs-1759 R-A680;1:400)。LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(1:50)および抗IL-13(eBio13A;1:200)をInvitrogenから購入した。細胞集団を生細胞でゲーティングし、ILC2:CD45＋Lin-Thy1.2＋Sca-1＋KLRG1＋として定義し、系統をCD3ε、CD8α、TCRβ、TCRγδ、CD19、Gr1、CD11c、CD11bおよびTER119;グリア細胞:CD45-CD31-GFAP＋、MSC:CD45-CD31-PDGFRA＋gp38＋、内皮細胞:CD45-CD31＋によって構成した。フローサイトメトリー分析および細胞選別を、FACSFusion、LSRFortessaおよびLSRFortessa X-20(BD Biosciences)を使用して行った。選別された集団は＞95％純粋であった。FlowJo v10ソフトウェア(Tristar)を使用してデータ分析を行った。
交感神経操作:分析の3日前および1日前に、200mg/kgの6-OHDA(Sigma)を腹腔内注射することによって化学的交感神経アブレーションを行った。対照マウスに、6-OHDAのビヒクルとして使用したPBS0.4％アスコルビン酸(Sigma)を同じ日に注射した。以前に記載されたように、ペグ化ジフテリア毒素をR26/DTRThマウスに投与することによっても交感神経アブレーションを行った14。ADRB2の活性化のために、そのアゴニストクレンブテロール(Sigma)を、4％スクロースを含む飲料水中で、10mg/kg/日の最終濃度まで8日間投与した。対照動物には、4％スクロースを含む水を8日間与えた。R26/3 DThマウスにおける交感神経ニューロンの化学遺伝学的活性化のために、4 mg/kgのCNO(Sigma)、4％スクロースを含む飲料水中2 mg/kg、およびPBS中2 mg/kgを腹腔内投与した48。
定量的RT-PCR:選別または培養した細胞からの全RNAを、RNeasyマイクロキットまたはRNeasyミニキット(Qiagen)を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。示される場合、総脂肪組織または脂肪細胞画分をTrizol(Invitrogen)に収集し、続いて製造業者のプロトコルに従ってクロロホルムおよびイソプロパノールRNA抽出を行った。RNA濃度を、Nanodrop Spectrophotometer(Nanodrop Technologies)を使用して決定した。HprtおよびGapdhをハウスキーピング遺伝子として使用して、StepOneおよびQuantStudio 5リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で定量的リアルタイムPCRを行った。手短に言えば、High Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems)を使用してRNAを逆転写し、続いてTaqMan PreAmp Master Mix(Applied Biosystems)を使用して前増幅PCRを行った。TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)をリアルタイムPCRに使用した。TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)は以下の通りであった:Hprt Mm00446968＿m1;Gapdh Mm99999915＿g1;Il5 Mm00439646＿m1;Il13 Mm00434204＿m1;Areg Mm01354339＿m1;Penk Mm01212875＿m1;Ret Mm00436304＿m1;Gdnf Mm00599849＿m1;Ucp1 Mm01244861＿m1;Adrb2 Mm02524224＿s1;Il25 Mm00499822＿m1;and Il33 Mm00505403＿m1.。比較CT法(2-ΔCT)を用いて分析を行った。試料間の比較または倍率変化が必要な場合、比較ΔCT法(2-ΔΔCT)を適用した。
RNA配列決定およびデータ分析:前述のように、6-OHDAまたはビヒクルで治療したマウス由来のPDGFRA＋MSCを単離し、RNAを抽出および精製した。RNAの質を、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)を使用して評価した。配列決定をHiSeq4000プラットフォーム(PE100、Illumina)で行った。FastQC(バージョン0.11.9)を使用して、生のRNAシーケンシングリードを有するFASTQファイルの全体的な品質を分析した49。Trimmomatic-0.39を使用して、最初の10塩基対(HEADCROP＝10)を除去した50。アライメントおよびリード処置が、STAR 2.7.3a(https://github.com/alexdobin/STAR/releases)51を使用して行われ、配列がMus musculusゲノムアセンブリGRCm38.p6の参照ファイルおよび対応するゲノムアノテーションファイル(http://www.ensembl.org/Mus＿musculus/Info/Index)にアライメントされた。示差的に発現された遺伝子のボルケーノプロットが、EdgeR(バージョン3.30.3)(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)を使用して得られた52。DeSeq2(version 1.28.1)(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)を使用して、全ての遺伝子の統計を得た53。10個未満の平均リード、0.05を上回る偽発見率(FDR)および-2を上回る2未満のlog2(群間の差)を有する遺伝子は、更なる分析から除外した。このようにして、6-OHDA群において227個の上方制御された遺伝子および35個の下方制御された遺伝子を含む示差的に発現された遺伝子のリストが得られた。調節された遺伝子のヒートマップを、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software、カリフォルニア州ラホーヤ)を使用してzスコア(遺伝子当たりの正規化されたリードカウント)をプロットすることによって得た。
in vitroおよびin vivoMSC活性化:in vitro実験のために、精製GAT PDGFRA＋MSCを完全DMEM(10％FBS、1％HEPES、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリン(Corning)を補充した。)中37℃で培養した。FBSを含まない完全DMEM中で2時間静置した後、MSCを10μg/mlのクレンブテロールで16時間刺激した。RNA分析のために、MSCを、RLT緩衝液(Qiagen)を使用して溶解した。GDNFタンパク質分析のために、MSCを、細胞内染色の前に、クレブテロール刺激の期間中にブレフェルジンA(eBioscience)とインキュベーションした。
in vitroおよびin vivoILC2活性化:in vitro実験のために、精製GAT ILC2を37℃の完全RPMI中で培養した。FBSを含まないRPMI中で2時間静置した後、ILC2を50ng/mlのGDNFファミリリガンド(R&D Systems)で3時間刺激した。RNA分析のために、RLT緩衝液(Qiagen)を使用してILC2を溶解した。ex vivoでのサイトカインタンパク質分析のために、刺激したILC2をPMA(50ng/mL)、イオノマイシン(500ng/mL)(Sigma)およびブレフェルジンA(eBioscience)と共に4時間インキュベートした後、細胞内染色を行った。
骨髄および胎児肝臓キメラ:Rag1-/-.RetMEN2BおよびRetDVav1マウスならびにそれらのそれぞれの同腹仔対照の大腿骨および脛骨から抽出された骨髄細胞。胎児肝臓を、E13.0 Gfra1-/-マウスおよびそれらのそれぞれの同腹仔対照から得た。Dynabeads Biotin Binder(Invitrogen)を製造者の説明書に従って使用して、骨髄および胎児肝細胞をCD3枯渇した。各遺伝子型(CD45.2)の106個の細胞を、単独で、または第三者WT競合体(CD45.1/CD45.2)と1:1の比で直接競合して、非致死的に照射された(3Gy)Rag1-/-Il2rg-/-マウス(CD45.1)に静脈内注射した。マウスを移植後10～12週間で分析した。
高脂肪食:特に明記しない限り、動物をHFD(60Kj％脂肪(ラード)E15742-3407,Ssniff GmbH)に16週間置いた。HFD投与開始14週後に耐糖能試験を行った。8時間絶食させたマウスに、PBS中グルコース(Sigma)を2 mg/kgで投与し、ACCU-CHECK Avivaグルコメーター(Roche)を用いてグルコースを測定した。
ILC2養子移入:RetMEN2B,RetDマウスおよびそれらのそれぞれの同腹仔対照からのILC2を養子移入のために内臓脂肪組織から精製した。精製したILC2を、組換えマウスIL-2、IL-7(10ng/mL;Peprotech)およびIL-33(10ng/mL;R&D Systems)の存在下で8日間、補足RPMI中でin vitroで増殖させた。2×105個のILC2をRag1-/-Il2rg-/-レシピエントに腹腔内注射した。養子移入の2週間後にマウスをHFDに置いた。
外植片培養:GATをRag1-/-Il2rg-/-から得て、2mm片に切断し、37℃の完全RPMI中で4時間インキュベートした。次いで、RetWTマウスまたはRetΔマウスから約104個の単離されたGAT ILC2を、GAT外植片および50ng/mLのGDNFファミリリガンドと16時間共培養した。外植片をTrizol(Invitrogen)に回収し、RNA分析のために超音波処置によって破壊した。
ウイルス投与:10μlの仮性狂犬病ウイルス(PRV)-614(ウイルスゲノムのgG遺伝子座に挿入されたCMV-mRFPレポーター遺伝子カセットを含有するPRV-Bartha)またはpAAV-Ef1a-mCherry-IRES-Cre(Addgene viral prep＃55632-AAVrg)を性腺脂肪パッドに注射することによって、Hamilton(登録商標)シリンジ(Hamilton)を使用してウイルストレーシング実験を行った。Nanoject III Programmable Nanoliter Injector(Drummond Scientific)を用いて、1μl(PRV)-614-RFPの副腎皮質腎神経節注射を行った。PRV注射の6日後、固定および更なる処置のためにPBSおよび4％PFAで灌流した後、脳を収集した。AAVトレーシングのために、GATおよび大動脈腎動脈神経節を注射3週間後に収集し、更なる処置のために4％PFAに固定した。ニューロン機能操作のために、rAAV-PGA-hM3DqDREADD-GFP(AAV(3D))またはrAAV-PGA-hM4DqDREADD-GFP(AAV(4D))(Addgene)を1つの性腺脂肪パッドに注射し、反対側の脂肪パッドにPBSを注射し、反対側の対照として使用した。4mg/kgのCNOを上記のように投与した。局所ニューロンの活性化のために、CNOを注射4週間後に投与し、局所ニューロンの不活性化のために、CNOを注射の6週間後に投与した。
PVHエレクトロアブレーション:先に記載したように、定位脳手術を使用して、9～12週齢のC57BL/6Jマウスにおいて、電気的損傷によってPVHの両側アブレーションを行った54。イソフルランおよび酸素の混合物(1l/分で1～3％イソフルラン)を使用して、マウスを深い麻酔下に保った。定位固定装置(Kopf)を用いて手術を行った。ブレグマを同定した後、病変電極を脳に挿入するための穴を開けた。電極は、先端の0.5mmを除いて、熱収縮性ポリエステル管で0.25mmのステンレス鋼昆虫ピンを隔離することによって作製した。電極先端は、脳室傍視床下部核、ブレグマの前-0.35mm、正中線の外側0.25mm、および頭蓋骨頂部の腹側5.8mm(Paxinos Mouse Brain Atlas,Franklin 2001)に向けた。左右で別々に、0.75mAの電流を3秒間電極に流すことによって、両側性病変を作製した。偽病変マウスに同じ手順を行ったが、電極に電流を流さなかった。手術後、動物に食物および水を自由に摂取させ、1週間回復させた。成功した病変マウスを組織病理分析に基づいて選択した。10～12週間後にマウスを分析した。
免疫蛍光および顕微鏡法:PRV-614-RFPを注射した動物からの脳を、ミクロトームを用いて50μmのスライス片に切断し、Mowiol(Sigma)にマウントした。脳画像およびH&E染色脂肪組織画像を、Zeiss AxioScan Z1スライドスキャナ(20x Plan Apochromat dry 0.80 0.55対物レンズ)で得た。R26/RFPDGfap、R26/RFPDPdgfraおよびC57BL/6Jマウスから性腺脂肪組織を得た。超顕微鏡画像化のために、全性腺脂肪パッドを収集し、共焦点画像化のために、4％PFAを用いて4℃で一晩固定した組織から約1×1mmの切片を得た。試料をブロッキングし、0.6％Triton X-100(Sigma)および2％BSA(Sigma)を含有するPBSで透過処置し、以下の抗体と室温で1～2日間インキュベートした:抗TH(P40101;Pel-Freez);抗GDNF(B-8;Santa-Cruz);またはCD31(390、FITC;Abcam)。Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギおよびAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ(Invitrogen)を二次抗体として室温で一晩使用した。性腺組織の除去は、それぞれ24時間の漸増濃度の一連のエタノール溶液(20％、40％、60％、80％および100％)中での脱水から開始し、続いて桂皮酸エチルに浸漬して染色した後に行った55。清澄化された全組織イメージングのために、試料を桂皮酸エチルにマウントし、LightSheet Zeiss Z.1(Plan Apochromat 20x/1.0,2.4対物レンズ)で取得した。共焦点画像化のために、試料をMowiolに取り付け、Pl-Apochromat 25x/0.8 M27浸漬対物レンズおよびPl-Apochromat 63x/1.4油浸対物レンズを使用してZeiss LSM 710共焦点顕微鏡で取得した。ウイルストレーシング感染の確認のために、Leica DFC 7000 Tカメラ(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)に連結されたLeica M205実体顕微鏡を使用した。画像は、ImageJ 1.53(NIH)、Zen Blue 3.0(Zeiss)およびImaris 9.6(Oxford Instruments)を使用して処置した。
統計:結果を平均±s.e.m.として示す。統計分析を、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software,La Jolla,Calif)を用いて行った。スチューデントt検定を等分散性集団に対して行った。特に明記しない限り、Welchの補正t検定を異なる分散を有する試料に適用した。対t検定を対側の対照試料に適用した。結果をP＜0.05で有意とみなした。
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等価物
いくつかの本発明の実施形態を本明細書において記載および例示してきたが、当業者は、本明細書において記載される機能を実行し、ならびに/あるいは結果および/または1つ以上の利点を得るための様々な他の手段および/または構造を容易に想像するものと思われ、そのような変形および/または修正の各々は、本明細書において記載される本発明の実施形態の範囲内にあると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される1つまたは複数の特定の用途に依存するものであることを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される特定の発明の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確かめることができるものと思われる。したがって、前述の実施形態は、単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載および特許請求されたものとは別の方法で実施される場合があることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書において記載される個々の特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法に関する。更に、2つ以上のそのような特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法のいずれかの組合せは、そのような特徴、系、物品、材料、キット、および/または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に包含される。
本明細書において定義および使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および/または定義された用語の通常の意味を制御すると理解されるべきである。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される「および/または」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「1つ以上」と解釈されるべきである。「および/または」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素に関連するか否かにかかわらず、他の要素が任意選択的に存在する場合がある。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「含む」等のオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Aのみ(B以外の要素を任意選択的に包含する)、別の実施形態では、Bのみ(任意選択的にA以外の要素を包含する)、更に別の実施形態では、AおよびBの両方に(任意選択的に他の要素を包含する)等を指し得る。
本明細書においておよび特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上で定義された「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および/または」は、包括的であると判断されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも1つを包含するが、2つ以上も包含し、任意選択的に、追加の列挙されていない項目も包含する。「～のうちの1つのみ(only one of)」または「～のうちの正確に1つ(exactly one of)」、または特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる(consisting of)」等の反対のことが明確に示された用語のみが、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に1つの要素の包含を指す。一般に、本明細書において使用される「または」という用語は、特許請求の範囲で使用される場合、「いずれか」、「～のうちの1つ」、「～のうちの1つのみ」、または「～のうちの正確に1つ」、「～から本質的になる」等の排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢(すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」)を示すものとしてのみ判断されるものとし、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書においておよび特許請求の範囲で使用される場合、1つ以上の要素のリストに関連して「少なくとも1つ」という語句は、要素のリスト内の要素のいずれか1つ以上から選択される少なくとも1つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素の少なくとも1つを必ずしも包含せず、要素のリスト内の要素のいずれかの組合せを除外しないことを理解されたい。この定義はまた、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、「少なくとも1つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意選択的に存在する場合があることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または、同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に、「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、一実施形態では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してAを指し、Bが存在しない(およびB以外の要素を任意選択的に包含する);別の実施形態では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してBを指し、Aが存在しない(およびA以外の要素を任意選択的に包含する);更に別の実施形態では、少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してA、および少なくとも1つ、任意選択的に2つ以上を包含してB(他の要素を任意選択的に包含する)等を指し得る。
また、そうでないことが明確に示されていない限り、2つ以上の工程または行為を包含する本明細書において特許請求されるいずれかの方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。
特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「関与する(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」等の全ての移行句は、オープンエンドであり、すなわち、包含するが限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧セクション2111.03に記載されているように、「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句のみが、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。

Claims (45)

  1. グループ2自然リンパ球(ILC2)の活性または増殖を増加させるための方法であって、ILC2を、トランスフェクション中に再構成された(rearranged during transfection:RET)アゴニストと接触させること、および/または間葉系間質細胞(MSC)をβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させることを含む、方法。
  2. RETアゴニストが、
    (1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは
    (2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片
    を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンドまたはその類似体若しくは模倣体の組合せが、
    (1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは
    (2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せ
    を含む、請求項2に記載の方法。
  4. ADRB2アゴニストが、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 接触させることがin vitroである、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 接触させることがin vivoである、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  7. RETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストが対象に投与される、請求項1～4または6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 対象がヒトである、請求項7に記載の方法。
  9. ILC2および/またはMSCが、脂肪組織中にあるか、または脂肪組織に由来する、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 脂肪組織が性腺脂肪組織(GAT)である、請求項9に記載の方法。
  11. グループ2自然リンパ球(ILC2)によるインターロイキン-5(IL-5)、インターロイキン-13(IL-13)および/またはMet-エンケファリン(Met-Enk)の産生を増加させるための方法であって、脂肪ILC2を、トランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストと接触させること、および/または間葉系間質細胞(MSC)をβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストと接触させることを含む、方法。
  12. RETアゴニストが、
    (1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは
    (2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片
    を含む、請求項11に記載の方法。
  13. 可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンドまたはその類似体若しくは模倣体の組合せが、
    (1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは
    (2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せ
    を含む、請求項12に記載の方法。
  14. ADRB2アゴニストが、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである、請求項11～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 接触させることがin vitroである、請求項11～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 接触させることがin vivoである、請求項11～14のいずれか一項に記載の方法。
  17. RETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストが対象に投与される、請求項11～14または16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 対象がヒトである、請求項17に記載の方法。
  19. ILC2および/またはMSCが、脂肪組織中にあるか、または脂肪組織に由来する、請求項11～18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 脂肪組織が性腺脂肪組織(GAT)である、請求項19に記載の方法。
  21. 肥満に対する感受性を減少させるおよび/または脂肪恒常性を増加させるための方法であって、
    (a)脂肪組織中のグループ2自然リンパ球(ILC2)と接触するトランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストを対象に投与すること、
    (b)脂肪組織中の間葉系間質細胞(MSC)と接触するβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストを対象に投与すること、または
    (c)それらの組合せ
    を含む、方法。
  22. 脂肪恒常性の増加が、耐糖能の増加および/または性腺脂肪組織(GAT)脂肪量の減少である、請求項21に記載の方法。
  23. RETアゴニストが、
    (1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは
    (2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片
    を含む、請求項21または請求項22に記載の方法。
  24. 可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンドまたはその類似体若しくは模倣体の組合せが、
    (1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは
    (2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せ
    を含む、請求項23に記載の方法。
  25. ADRB2アゴニストが、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである、請求項21～24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 対象がヒトである、請求項21～25のいずれか一項に記載の方法。
  27. グループ2自然リンパ球(ILC2)の活性または増殖の減少に関連する障害を治療する方法であって、
    (a)脂肪組織中のILC2と接触するトランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストを対象に投与すること、
    (b)脂肪組織中の間葉系間質細胞(MSC)と接触するβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストを対象に投与すること、または
    (c)それらの組合せ
    を含む、方法。
  28. 障害が、重量増加、肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、またはそれらの組合せである、請求項27に記載の方法。
  29. RETアゴニストが、
    (1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは
    (2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片
    を含む、請求項27または請求項28に記載の方法。
  30. 可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンドまたはその類似体若しくは模倣体の組合せが、
    (1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは
    (2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せ
    を含む、請求項29に記載の方法。
  31. ADRB2アゴニストが、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである、請求項27～30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 対象がヒトである、請求項27～31のいずれか一項に記載の方法。
  33. グループ2自然リンパ球(ILC2)の活性または増殖の増加に関連する障害を治療する方法であって、
    (a)脂肪組織中のILC2と接触するトランスフェクション中に再構成された(RET)アンタゴニストを対象に投与すること、
    (b)脂肪組織中の間葉系間質細胞(MSC)と接触するβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アンタゴニストを対象に投与すること、または
    (c)(a)と(b)との組合せ
    を含む、方法。
  34. 障害が、低体温、悪液質、アレルギー、蠕虫感染、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、腸炎症性疾患、またはそれらの組合せである、請求項33に記載の方法。
  35. RETアンタゴニストが、(1)(a)RETチロシンキナーゼ活性、(b)GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)、または(c)GFRαリガンド、またはその抗原結合断片に特異的に結合し、阻害する抗体;(2)RET、GFRαまたはGFRαリガンドの発現、転写または翻訳を低下させる阻害性核酸分子;あるいは(3)RETチロシンキナーゼ阻害剤、任意でAST487、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブである、請求項33または請求項34に記載の方法。
  36. GFRαが、GFRα1、GFRα2、GFRα3若しくはGFRα4であるか;またはGFRαリガンドが、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(NTRN)、アルテミン(ARTN)若しくはペルセフィン(PSPN)である、請求項35に記載の方法。
  37. 阻害性核酸分子が、sRNA、shRNA、またはアンチセンス核酸分子である、請求項35に記載の方法。
  38. ADRB2アンタゴニストが、ブトキサミン、ICI-118,551、プロプラノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール、チモロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、またはそれらの組合せである、請求項33～37のいずれか一項に記載の方法。
  39. 対象がヒトである、請求項33～38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 寒冷曝露を治療する方法であって、
    (a)グループ2自然リンパ球(ILC2)と接触するトランスフェクション中に再構成された(RET)アゴニストを対象に投与すること、
    (b)ILC2と接触するβ2アドレナリン受容体(ADRB2)アゴニストを対象に投与すること、または
    (c)それらの組合せ
    を含む、方法。
  41. RETアゴニストが、
    (1)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンド(GFL)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;あるいは
    (2)RETに特異的に結合し、RETチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片
    を含む、請求項40に記載の方法。
  42. 可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ(GFRα)およびGFRαリガンドまたはその類似体若しくは模倣体の組合せが、
    (1)(a)可溶性GDNFファミリ結合受容体アルファ1(GFRα1)およびグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)またはその類似体若しくは模倣体の組合せ;(b)可溶性GFRα2およびニュールツリン(NTRN)またはその類似体若しくは模倣体;(c)可溶性GFRα3およびアルテミン(ARTN)またはその類似体若しくは模倣体;(d)可溶性GFRα4およびペルセフィン(PSPN)またはその類似体若しくは模倣体;(e)可溶性GFRαおよびN(4)-(7-クロロ-2-［(E)-2-(2-クロロ-フェニル)-ビニル］-キノリン-4-イル)-N(1),N(1)-ジエチル-ペンタン-1,4-ジアミン(XIB4035);(f)可溶性GFRαおよびBT化合物;(g)可溶性GFRαおよびGFRαに特異的に結合し、GFRαを二量体化する抗体;あるいは
    (2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)および(g)のうちの2つ以上の組合せ
    を含む、請求項41に記載の方法。
  43. ADRB2アゴニストが、クレンブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソプロテレノール、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブテロール、テルブタリン、アホルモテロール、バンブテロール、ホルモテロール、サルメテロール、アベジテロール、カルモテロール、インダカテロール、オロダテロール、バイランテロール、イソクスプリン、マブテロール、ジルパテロール、またはそれらの組合せである、請求項40～42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 対象がヒトである、請求項40～43のいずれか一項に記載の方法。
  45. RETアゴニストおよび/またはADRB2アゴニストを投与することが、対象の体温を増加させる、請求項40～44のいずれか一項に記載の方法。
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