JP6093345B2 - ヒトgdnfの変異体 - Google Patents
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Description
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI(配列番号23)
(配列中、
i)Xaa84はKまたはAであり、
ii)Xaa88はRまたはKであり、
iii)Xaa90はRまたはKであり、
iv)Xaa125はKまたはEであり、
v)Xaa130はRまたはEである)
を含むヒトGDNF変異体を提供する。
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号:9)、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号:12)、および
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(配列番号:15)
からなる群から選択されるヒトGDNF変異体を提供する。
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
に示すようなアミノ酸配列を含むヒトGDNF変異体を提供する。
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI(配列番号23)
のアミノ酸配列を含み、この配列は、シグナル分泌ペプチドを有し、N末端で伸長される。多数のシグナル分泌ペプチド配列が本願明細書において使用され得る。例示的なシグナル分泌ペプチド配列は、METDTLLLWVLLLWVPGSTG(配列番号25)の配列を有するマウスカッパリーダーシグナル分泌ペプチド、及びMATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(配列番号32)の配列を有するヒト成長ホルモンシグナル分泌ペプチドを含む。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号28);または
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号35)
のアミノ酸配列を有する。
MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI。野生型GDNF完全長DNA配列は、配列番号2のように示される:
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGAACAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGACAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC。
タンパク質発現、精製及び免疫原性分析
a.大腸菌発現GDNFvのサブクローニング、変異、発現、アンフォールディング、リフォールディング、及び精製
サブクローニング
プラスミドpET−30a(+)/rhGDNFを保有する大腸菌(E.Coli)株BL21−CodonPlus(DE3)−RIPLを、37℃で一晩、30μg/mLの最終濃度でカナマイシンを含有するLuria−Bertani肉汁培地中で増殖させる。細胞を遠心分離によって収集後、プラスミドベクターを、製造業者のプロトコルに従ってQIAquick Spin Miniprep kit(Qiagen)を用いて単離する。次いで、単離プラスミドDNAを、Δ31−GDNFタンパク質(成熟ヒトGDNFのN末端から切断した31残基)及びΔ31−N38Q−GDNFタンパク質(成熟ヒトGDNFのN末端から切断した31残基であって、38位でアスパラギン残基はグルタミンに置換されている)をそれぞれコードするΔ31−GDNF及びΔ31−N38Q−GDNF遺伝子のプライマー伸長反応に用いる。これは、遺伝子の5’及び3’末端までアニールするように設計されたNdeI及びXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する、オリゴヌクレオチドプライマーΔ31−for、Δ31−rev、Δ31−N38Q−for、及びΔ31−N38Q−rev(それぞれ配列番号6、7、39、及び40)を用いて達成され得る。センス及びアンチセンスプライマーの5’末端で導入されたNdeI及びXhoI制限部位は、Δ31−GDNF及びΔ31−N38Q−GDNFをベクターpET−30a(+)の対応部位中にクローニングさせる。プライマー伸長反応を、80ngのテンプレートDNAと順方向及び逆方向プライマーとPCR Supermix(Invitrogen #10572−014)を用いることにより、全量100μlにおいて、94℃で3分間実施し、その後、94℃で1分間、55℃で0.5分間、そして72℃で1分間という3ステップサイクルを16回実施し、72℃で最後の10分間実施する。得られた単位複製配列は、アガロースゲル電気泳動で確認し、製造業者のプロトコルに従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて洗浄する。
部位特異的突然変異誘発を、QuikChange Multi Site−Directed Mutagenesis kit(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて実施し、Δ31−N38Q−D95E−GDNF及びΔ31−N38Q−K84A−R88K−R90K−D95E−GDNFを調製する。この方法は、テンプレートとしてpET−30a(+)中に挿入したΔ31−N38Q−GDNF、並びに順方向および逆方向プライマーとしてそれぞれΔ31−N38Q−D95E−forおよびΔ31−N38Q−D95E−revオリゴヌクレオチド(表1、配列番号41及び42)を使用する。続いて、pET−30a(+)へ挿入した首尾良く変異したΔ31−N38Q−D95E遺伝子をテンプレートとして用い、Δ31−N38Q−K84A−R88K−R90K−D95E−for及びΔ31−K84A−R88K−R90K−D95E−D95E−revオリゴヌクレオチド(表1、配列番号:43及び44)を順方向と逆方向プライマーとしてそれぞれ用いて、Δ31−N38Q−K84A−R88K−R90K−D95E−GDNFを生成する。DNA配列を確認し、プラスミドを大腸菌(E.Coli)株BL21−CodonPlus(DE3)−RIPL化学的コンピテント細胞へ形質転換する。
プラスミドpET−30a(+)/GDNFvを保有する大腸菌(E.Coli)細胞BL21−CodonPlus(DE3)−RIPLの永久凍結ストックを用いて、37℃で最終濃度30μg/mlにてカナマイシンを含有する50mlの2×TY肉汁培地中に植菌する。9時間後、5mlのスターター培養物を用いて、37℃で6×2lの同じ液体培養培地に植菌する。培養物が600nmで0.8から1.4の間の吸光度に達すると、典型的には16時間後に、IPTGを1mMの最終濃度まで加え、培養物の温度を5時間、27から30℃の間に下げる。細胞を10,000gで20分間4℃にて遠心分離することで収集し、−80℃に保存する。
細胞ペーストを、pH8で2〜3容量の0.2mg/mlのリゾチーム、5mMのMgCl2および50mMのTris−Clの溶液中に懸濁し、氷上で30分間攪拌しながらインキュベートさせる。得られたスラリーを10分間氷上で超音波処理する(5秒パルス、2秒インターバル、30〜40%振幅)。その後、GDNFvを、20,000gで20分間遠心分離することで細胞溶解物から単離する封入体の形態で回収し、4Mグアニジン、90mMシステイン、20mMのTris−Cl、pH8.5中に可溶化する。タンパク質を、0.2Mグアニジン、2M尿素、20mMのTris−Cl、pH8.75で10倍希釈することで活性形態までリフォールディングする。リフォールディングした混合物を2日間4℃で維持する。
リフォールディングしたGDNFvを、以下の3ステップのカラムクロマトグラフィーによって均質になるまで精製する。
1.SPカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)
2.フェニルカラムカラム上での疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
3.Superdex−75カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
最初に復元タンパク質を、20mM酢酸ナトリウム、pH5中で平衡化したSPセファロース高速流カラムに適用する。GDNFvを、20mM酢酸ナトリウム、pH5中で0.3から1MのNaClまで上昇する線形塩勾配で溶出する。CEXメインストリームプールに、最終濃度2.5MのNaClを補充し、次いで、20mMクエン酸ナトリウム、pH5中でフェニルセファロースHP疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用する。HICカラムを、20mMクエン酸ナトリウム、pH5中で2.5から0MのNaClまで下降する線形塩勾配で溶出する。GDNFvは、HICカラムにきつく結合する。次いで、HICメインストリームプールを濃縮し、最終的にSuperdex−75カラムに適用し、タンパク質をPBS、pH7.4で溶出する。最終プールを濃縮し、0.22ミクロン膜で濾過し、−80℃で保存する。
GDNF変異体をコードする遺伝子を、標準的な分子生物学技術を用いるか又はCMVプロモーター駆動哺乳類発現ベクター中の遺伝子合成により調製し得る。組み換えプラスミドを用いて、ヒト胚腎臓293EBNA(HEK293)細胞へ一過性にトランスフェクトし、培地を5日後に収集する。別の方法では、安定なチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を生成して、GDNF変異体を発現する。変異体タンパク質をコードする遺伝子を、製造業者の指示に従って、プロドメインを有する天然GDNFシグナル配列を有するフレーム中で、グルタミン合成酵素(GS)含有発現プラスミド骨格(pEE12.4ベースのプラスミド,Lonza Biologics,Slough,UK)へサブクローニングする。pEE12.4ベースのベクター中の完全長GDNF構築物(配列番号2)をCHOへトランスフェクトし、GDNFの切断型形態を生成する。ここで、Δ31は主要形態であり、混合物から精製し得る。プロドメイン及び最初のN末端の31個のアミノ酸を除去する場合、Δ31−N末端切断型GDNF変異体を、完全長及び上述した切断型生成物の混合物から精製する必要なく、哺乳類発現系において効率的かつ清潔に生成する。また、天然GDNF分泌シグナルペプチドを、マウスカッパリーダー分泌シグナルペプチド又はヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチドを含む、複数の分泌シグナルペプチドと置換し得る。Δ31−N末端切断型GDNF変異体は、開示された全ての分泌シグナルペプチドと共に効率的かつ清潔に生成し続けるが、発現の可変レベルを有する。所望の変異を組み込んだGDNF変異体を、マウスカッパシグナル配列を有するフレーム中で適切な発現ベクター(例えば、pEMK−NF2,Lonza)へサブクローニングする。
GDNFvを、以下の4ステップのビーズカラムクロマトグラフィーによって均質になるまで精製する。
1.SPカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)
2.フェニルカラムカラム上での疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
3.多数モデルCapto MMCカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)
4.Superdex−75カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
簡潔に言えば、最初に、収集したGDNF変異体タンパク質を含有する培養培地を、20mM酢酸ナトリウム、pH5で平衡化したSPセファロース高速流カラムへ適用する。GDNFvを、20mM酢酸ナトリウム、pH5中で0から1MのNaClまで線形塩勾配で溶出する。CEXメインストリームプールに、最終濃度2.5MのNaClを補充し、次いで、20mM酢酸ナトリウム、pH5中でフェニルセファロースHP疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに適用する。HICカラムを、20mM酢酸ナトリウム、pH5中で2.5から0MのNaClまで逆線形塩勾配で溶出する。GDNFvは、HICカラムに弱く結合する。次いで、フロースルー(flow through)と早期溶出画分のプールを、pH5でマルチモデル樹脂のCapto MMCカラムに適用する。カラムを50mMのTris−Cl、pH8で洗浄し、次いでGDNFvを、50mMのTris−Cl、pH8中で0から1MのNaClまで線形塩勾配で溶出する。最終的に、Capto MMCメインストリームをSuperdex−75カラムに適用し、タンパク質をPBS、pH7.4で溶出する。最終プールを0.22ミクロン膜で濾過し、2〜8℃で保存する。
減少した結合HLA−DRの可能性を有する選択したヒトGDNF変異体を作製し(配列番号12及び15)、GFRα及びヘパリン結合アッセイにおいて野生型GDNFと比較する。
GDNF野生型及びΔ31GDNF変異体の安定性
完全長成熟GDNF野生型及びΔ31−N末端切断型GDNF変異体の安定性を、複数の分析技術(例えば、RP−HPLC、SE−HPLC、陽イオン交換HPLC、及び質量分析)を用いて評価して、これらの分子中の任意の分解部位を特定し得る。次いで、変異を行い、化学分解部位を除去し、ヒトGDNF変異体の安定性を向上させる。
Zorbax C8 SB−300Å、3.5ミクロン、4.6×50mmカラム(Agilent Technologies #865973−909)において60℃で加熱する。移動相はH2O中で0.1%TFAである。GDNFvは、35分間、1ml/分の流速で、30分に亘って5から50%までの線形アセトニトリル勾配により、19〜20分の保持時間で、214nmでの単一ピークとして溶出する。
TSK−G−2000−SW−XL、5ミクロン、7.8×300mmカラム(TOSOH BIOSEP #08540)において。35分間、0.5ml/分の流速で、移動相:PBS+350mMのNaCl、pH7.4。GDNFvは、約16〜17分の保持時間で214nmでの単一ピークとして溶出する。
Dionex、Propac WCX−10、4×250mmカラム(Dionex #054993)において。移動相は、20mMリン酸ナトリウム、10%アセトニトリル、pH7である。GDNFvは、52分間、1ml/分の流速で、45分に亘って0.15から0.6MのNaClまでの線形塩勾配により、25〜30分の保持時間で、複合ピークとして溶出する。
野生型(完全長細菌GDNF)対野生型CHO GDNFv(N末端Δ31切断型GDNF)に、4週間、37℃でストレスを与えて、化学的非安定性に関連し得るアミノ酸を同定する。
1.4週間、4℃で1.0mg/mLの野生型大腸菌(E.Coli)完全長GDNF
2.4週間、37℃で1.0mg/mLの野生型大腸菌(E.Coli)完全長GDNF
3.4週間、4℃で1.0mg/mLの野生型CHOΔ31−GDNFv
4.4週間、37℃で1.0mg/mLの野生型CHOΔ31−GDNFv
10μLアリコートの各サンプル(溶液は20μLの水又は10μLアリコートの各溶液と混合する)を、40μLの100mMのtris−HClバッファー、pH8、1.0μLの50mg/mLのDTTと、周囲温度で30分間混合する。各サンプルをLC/MS分析に供する。
20μLアリコートの各サンプル溶液を、スピードバキュームシステム下で乾燥するために凍結乾燥し、次いで材料を、0.5μLの50mg/mLのDTT及び4.5μLの6Mグアニジン−HCl、0.5Mのtris−HClバッファー、pH8中で再構成する。混合物を37℃で30分間インキュベートし、次いで各溶液を93μLの水で希釈し、2μLの0.2mg/mLのLys−C(Wako)で37℃にて2時間処理する。CHO GDNFvに関して、30μLのトリプシン消化物を37℃で1時間(炭水化物プロファイルを評価するために)、0.5μLのPNGase Fで処理する。消化物を、LC/MS分析前にH2O中で2μLの10%TFAで酸性化する。
サンプル溶液を、Waters Acquity UPLCに連結されたWaters SYNAPT質量分析、又はWaters 2795 HPLCに連結されたWater LCTプレミア質量分析により分析する。
野生型GDNFについての開裂生成物を、部分的に減少したGDNFについてのLC−MS分析により取得する。複数開裂生成物を同定し、これらの開裂に関する定量的データを表2に示す。いくつかの開裂(N15/R16、N22/P23、N25/S26、及びN38/R39の間の開裂)は、スクシンイミド形成を介する脱アミドと類似する分解経路を有する。野生型CHOΔ31−GDNFvに関して、最初の31個のアミノ酸残基をN末端から切断する。CHO GDNFvは、1つの鎖あたり2つの潜在的なN−グリコシル化部位を有しているが、1つの部位のみがNグリコシル化される。観察された主要グリカンは、異なるガラクトシル化を有するジ−又はトリ−アンテナリーオリゴ糖である。興味深いことに、有意なシアル化グリカンは何も検出されない(表3)。
減少したGDNF安定性サンプルのLys−C消化物のUVクロマトグラフは、GDNFペプチド126〜129を除いて、全ての期待されたペプチドが検出されることを示している。CHO材料について、N末端ペプチド(R32より前)は検出されない。N49を含有するペプチド38〜60はグリコシル化され、95%より多くのAsn49で占められる。N85を含有するペプチド85〜96はグリコシル化されない。これらの結果は、減少したGDNFサンプルについてのLC/MS分析と一致している。
インビトロ結合活性
以下のアッセイは、ヒトGDNFの特定の変異体が、GFRα1レセプター結合を維持しながらヘパリン結合を減少させて、種々の異なるヘパリン及びレセプター結合特性を提供することを実証する。
GDNF変異体(GDNFv:N末端−Δ31−切断型)は、大腸菌(E.coli)(細菌)又は哺乳類細胞(CHO細胞又はHEK293EBNA細胞)中で発現し、実施例1に記載されるように精製し得る。変異体のプライマー配列は、用いられる発現系とは関係なく同じままである。
GDNF野生型及び変異体をELISAアッセイで試験する。この試験において、プレートに結合したレセプター(GFRα1)に対するGDNFタンパク質の結合を測定する。「GDNF無し」状態及び/又は「無関係タンパク質」状態をネガティブコントロールとして使用する。
GDNF野生型及び変異体をELISAアッセイで試験する。この試験において、プレートに結合したヘパリンに対するGDNFタンパク質の結合を測定する。「GDNF無し」状態をネガティブコントロールとして使用する。
インビトロ活性
NS−1神経突起伸長
神経分化についてのGDNF活性を、ラット神経スクリーン−1細胞(PC12サブクローン)を用いて評価する。細胞を、コラーゲンでコーティングしたフラスコ内で95%湿度で37℃にてF−12K基礎培地、12.5%の加熱不活性化したウマ血清、2.5%の加熱不活性化したウシ胎仔血清(FBS)、1×GlutaMAX(商標)(Invitrogen、カタログ番号35050061)、及び1×抗−抗(Invitrogen、カタログ番号15240)中で維持する。神経突起伸長を測定するため、神経スクリーン−1細胞を、内部60ウェルのみを用いて、増殖培地中でウェル当たり2200個の細胞にてコラーゲンI96−ウェルプレートへと播種する。細胞接着の24時間後、培地を除去し、8点希釈シリーズ中に希釈したGDNFを加えた1μg/mlでGFRα1−Fcを含有する新規成長培地を、1つの濃度当たり3連のウェルまたはの6つのウェルのいずれかでプレートに加える。1μg/mlのGFRα1−Fcを加えた培地をネガティブコントロールとして含み、25ng/mlの神経突起成長因子を加えた培地をアッセイにおける細胞反応についてのポジティブコントロールとして含む。プレートを37℃、95%湿度で96時間インキュベートし、次いで各ウェルに対して45μlの固定液を加え、そして1時間室温でインキュベートすることで固定する。プレートを、Neurite Outgrowth Hit Kit(商標)(Cellomics、カタログ番号K07−0001−1)からの1×洗浄バッファーで2度洗浄し、次いでキットからの1×バッファーで2度洗浄する。細胞を製造業者の指示書に従ってキットからの神経突起成長試薬を用いて免疫染色する。プレートをアレイスキャン装置上にロードし、アレイスキャンソフトウェア及びCellomicからの神経プロファイリングアルゴリズムを用いて分析する。アルゴリズムにより生成されたデータを、Graph Pad Prismソフトウェアを用いてEC50計算のために処理する。
c−Retレセプターリン酸化アッセイを、Y1016位でのcRetレセプターリン酸化の誘導を示すために用い得る。c−Retレセプターリン酸化についてのGDNF活性を、ヒトc−Retを過剰発現させるために安定的にトランスフェクトしたヒト神経芽腫細胞株SH−SY5Y(ATCC)由来の細胞中で評価する。細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%のFBS、3μg/mlのブラストサイジン中で維持する。c−Retリン酸化について、細胞を、ブラストサイジンを含まない増殖培地中で24ウェルコラーゲンでコーティングしたプレート内にウェル当たり5×105で播種し、一晩付着させる。培地を、24時間、低グルコースDMEM+0.25%BSA(ウシ血清アルブミン)に変更する。飢餓培地を除去し、細胞を、グルコース無しのDMEM、0.25%のBSA、1μg/mlのGFRα1−Fc中で30分間37℃にてGDNFで処理する。各GDNF変異体を複数濃度で試験する。処理培地を除去し、細胞を、M−Per抽出試薬+プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤1、ホスファターゼ阻害剤カクテル2、及びホスファターゼ阻害剤カクテル3(Sigma(商標))の氷冷溶解バッファー中のプレート表面から擦り取る。細胞懸濁液を完全に溶解するためボルテックスし、細胞ペレット残屑まで14,000×gで遠心分離し、上清を、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ試薬を用いてタンパク質濃度について定量化する。各GDNF溶解物について、10μgタンパク質を、4〜12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis−Trisゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0322)により分離し、PVDFブロットに移す。チロシン1016ホスホ−Retを、ウサギポリクローナル抗体及びヤギ−抗−ウサギ−HRP抗体で検出し、c−Retをマウスモノクローナル抗体及びヤギ−抗−マウス−HRP抗体で検出する。ブロットを、Supersignal West Pico(商標)(Thermo Scientific、カタログ番号34081)試薬で展開し、x線フィルムに曝す。
DAターンオーバーアッセイにおけるGDNF変異体活性
オスのSprague−Dawleyラットを、イソフルラン(O2中3%)を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン(O2中1〜2%)を用いて維持する。
インビボアッセイ
6−ヒドロキシドーパミン(6−OHDA)により誘導される逆行性損傷モデル
オスのSprague−Dawleyラットを、イソフルラン(O2中3%)を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン(O2中1〜2%)を用いて維持する。
オスのSprague−Dawleyラットを、イソフルラン(O2中3%)を用いて麻酔する。頭を剃り、ヨード溶液で殺菌した後、動物を、温度制御マットを備えた定位固定フレーム上に置く。眼を眼科用ゲルで保護し、麻酔をイソフルラン(O2中1〜2%)を用いて維持する。
注入したGDNFの生体内分布を、免疫組織化学アッセイにおいて試験し、この試験において、注入した抗原(GDNF及びGDNF変異体)に対する抗体の結合をラット脳中で測定する。アイソタイプコントロール抗体をネガティブコントロールとして使用する。
スライドの画像を、Aperio ScanScope XT(Controllerソフトウェアのv10.00.00.1805で稼動する)上で20倍の倍率設定にて取得する。スライドについてのメタデータをAperioのウェブベースのソフトウェア、Spectrum(v10.0.1346.1806)内に保存する。
<配列番号1;PRT1;ホモサピエンス>
MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGAACAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGACAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
SPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
MKLWDVVAVCLVLLHTASA
FPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKR
TATACATATGCGTGGACAACGTGGTAAAAACCGTGGTTGTGTGCTG
GGTGCTCGAGTTATTAAATGCAGCCGCAACGTTTCGCGCT
RGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSDKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTTTCCCACTGCCAGCCGGCAAGAGACCCCCAGAGGCCCCAGCCGAGGACAGAAGCCTGGGCAGGCGGAGGGCCCCATTCGCCCTGAGCAGCGACAGCAACATGCCAGAGGACTACCCCGACCAGTTCGACGACGTCATGGACTTCATCCAGGCCACCATCAAGAGGCTGAAGAGGTCACCCGACAAGCAGATGGCCGTGCTGCCCAGGCGGGAGAGGAACAGGCAGGCCGCCGCCGCCAACCCAGAGAATTCCAGGGGCAAGGGCAGAAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGGAGCACAGCGCCAAGGAGTGCGGCTGCATC
MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGRRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCT
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MKLWDVVAVCLVLLHTASARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGAAGCTGTGGGACGTGGTGGCCGTGTGCCTGGTGCTGCTGCACACCGCCAGCGCTAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MKLWDVVAVCLVLLHTASARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI
(配列中:
i)Xaa84はKまたはAであり、
ii)Xaa88はRまたはKであり、
iii)Xaa90はRまたはKであり、
iv)Xaa125はKまたはEであり、
v)Xaa130はRまたはEである)
MKLWDVVAVCLVLLHTASARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI
(配列中:
i)Xaa84はKまたはAであり、
ii)Xaa88はRまたはKであり、
iii)Xaa90はRまたはKであり、
iv)Xaa125はKまたはEであり、
v)Xaa130はRまたはEである)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCTACCGGT
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCTACCGGTAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCTACCGGTAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI
(配列中:
i)Xaa84はKまたはAであり、
ii)Xaa88はRまたはKであり、
iii)Xaa90はRまたはKであり、
iv)Xaa125はKまたはEであり、
v)Xaa130はRまたはEである)
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCC
ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCCAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGAAGAACCTGAGCAGGAACAGGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
ATGGCTACCGGCAGCAGGACCTCTCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCCTGGCTGCAGGAAGGCAGCGCCAGGGGTCAACGGGGCAAGCAGAGGGGCTGCGTGCTGACCGCCATCCACCTGAACGTGACCGACCTGGGCCTGGGCTACGAGACCAAGGAGGAGCTGATCTTCAGGTACTGCAGCGGCAGCTGCGACGCCGCCGAGACCACCTACGACAAGATCCTGGCCAACCTGAGCAAGAACAAGCGGCTGGTCTCCGAGAAGGTGGGCCAGGCCTGCTGCAGGCCCATCGCCTTCGACGACGACCTGAGCTTCCTGGACGACAACCTGGTGTACCACATCCTGAGGAAGCACAGCGCCAAGAGATGCGGCTGCATC
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa84NLSXaa88NXaa90RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa125HSAKXaa130CGCI
(配列中:
i)Xaa84はKまたはAであり、
ii)Xaa88はRまたはKであり、
iii)Xaa90はRまたはKであり、
iv)Xaa125はKまたはEであり、
v)Xaa130はRまたはEである)
TATACATATGCGTGGACAACGTGGTAAACAACGTGGTTGTGTGCTG
GGTGCTCGAGTTATTAAATGCAGCCGCAACGTTTCGCGCT
GTCTGGTGAGCGAGAAAGTGGGTCAG
CTGACCCACTTTCTCGCTCACCAGAC
CCTATGATAAAATCCTGGCAAACCTGAGCAAGAACAAACGTCTGGTGAGCGAGAAAG
CTTTCTCGCTCACCAGACGTTTGTTCTTGCTCAGGTTTGCCAGGATTTTATCATAGG
配列番号1:AA−ヒトGDNF野生型完全長
配列番号2:DNA−ヒトGDNF野生型完全長
配列番号3:AA−ヒト成熟野生型GDNF
配列番号4:AA−ヒトGDNF天然分泌シグナルペプチド
配列番号5:AA−ヒトGDNFプロドメイン
配列番号6:DNA−Δ31−順方向プライマー
配列番号7:DNA−Δ31−逆方向プライマー
配列番号8:AA−変異体1:Δ31GDNF
配列番号9:AA−GDNF変異体2:Δ31+N38Q+D95E(クローンD9)タンパク質(103aa)
配列番号10:DNA構造配列−GDNF変異体2:Δ31+N38Q+D95E(クローンD9)DNA(pEE12.4)
配列番号11:AA−GDNF変異体2:Δ31+N38Q+D95E(クローンD9)タンパク質構造物(211aa).
配列番号12:AA−GDNF変異体3:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(クローンF2.1)タンパク質配列(103aa)
配列番号13:DNA構造配列−GDNF変異体3:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(クローンF2.1)DNA配列
配列番号14:AA−GDNF変異体3:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(クローンF2.1)タンパク質構造物(211aa)
配列番号15:AA−GDNF変異体4:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E+K125E+R130E(クローン4.3)タンパク質配列(103aa):
配列番号16:DNA構造配列−GDNF変異体4:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E+K125E+R130E(クローン4.3)DNA配列
配列番号17:AA−GDNF変異体4:Δ31+N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E+K125E+R130E(クローン4.3)タンパク質構造物
配列番号18:DNA−ヒトGDNF天然分泌シグナルペプチド
配列番号19:DNA−天然ペプチド−Δ31N38Q+D95E構造物
配列番号20:AA−天然ペプチド−Δ31N38Q+D95E(122aa):
配列番号21:DNA−天然ペプチド−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E
配列番号22:AA−天然ペプチド−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(122aa):
配列番号23:変異体のAA−コンセンサス配列
配列番号24:変異体のAA−天然ペプチド−コンセンサス配列
配列番号25:AA−マウスκリーダー分泌シグナルペプチド(MKL)
配列番号26:DNA−マウスκリーダー分泌シグナルペプチド(MKL)
配列番号27:DNA−MKL−Δ31N38Q+D95E構造物
配列番号28:AA−MKL−Δ31N38Q+D95E(123aa):
配列番号29:DNA−MKL−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E構造物
配列番号30:AA−MKL−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(123aa):
配列番号31:変異体のAA−マウスκリーダー−コンセンサス配列
配列番号32:AA−ヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチド(hGH)
配列番号33:DNA−ヒト成長ホルモン分泌シグナルペプチド(hGH)
配列番号34:DNA−hGH−Δ31N38Q+D95E構造物
配列番号35:AA−hGH−Δ31N38Q+D95E(129aa):
配列番号36:DNA−hGH−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E構造物
配列番号37:AA−hGH−Δ31N38Q+K84A−R88K−R90K−D95E(123aa):
配列番号38:変異体のAA−hGH−コンセンサス配列
配列番号39:DNA−Δ31−N38Q−順方向プライマー
配列番号40:DNA−Δ31−N38Q−逆方向プライマー
配列番号41:DNA−Δ31−N38Q−D95E−順方向プライマー
配列番号42:DNA−Δ31−N38Q−D95E−逆方向プライマー
配列番号43:DNA−Δ31−N38Q−KAKKE−順方向プライマー
配列番号44:DNA−Δ31−N38Q−KAKKE−逆方向プライマー
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1] 配列番号23:
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILXaa 84 NLSXaa 88 NXaa 90 RLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRXaa 125 HSAKXaa 130 CGCI
(配列中、
i)Xaa 84 はKまたはAであり、
ii)Xaa 88 はRまたはKであり、
iii)Xaa 90 はRまたはKであり、
iv)Xaa 125 はKまたはEであり、
v)Xaa 130 はRまたはEである)
のアミノ酸配列を含む、ヒトGDNF変異体。
[2] 前記変異体が、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号9)、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号12)、および
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(配列番号15)
からなる群から選択される、[1]に記載のヒトGDNF変異体。
[3] 前記変異体が、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号9)
である、[2]に記載のヒトGDNF変異体。
[4] 前記変異体が、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号12)
である、[2]に記載のヒトGDNF変異体。
[5] 前記変異体が、
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILREHSAKECGCI(配列番号15)
である、[2]に記載のヒトGDNF変異体。
[6] METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号28)および
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号35)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Δ31−N末端切断型GDNF変異体を調製するための中間体。
[7] 前記アミノ酸配列が、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号35)である、[6]に記載の中間体。
[8] [1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体と、1つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
[9] 有効量の[8]に記載の組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む、パーキンソン病のための治療方法。
[10] 医薬として使用するための[1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体。
[11] パーキンソン病の治療に使用するための[1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体。
[12] [1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病を治療するための方法。
[13] 療法として使用するための[1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体。
[14] 有効量の[1]〜[5]のいずれかに記載のヒトGDNF変異体を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、パーキンソン病を治療する方法。
Claims (10)
- RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号9)、および
RGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILANLSKNKRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号12)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトGDNF変異体。 - METDTLLLWVLLLWVPGSTGRGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号28)および
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号35)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Δ31−N末端切断型GDNF変異体を調製するための中間体。 - 前記アミノ酸配列が、MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSARGQRGKQRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDAAETTYDKILKNLSRNRRLVSEKVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI(配列番号35)である、請求項2に記載の中間体。
- 請求項1に記載のヒトGDNF変異体と、1つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- パーキンソン病を治療するための、請求項4に記載の医薬組成物。
- 医薬として使用するための請求項1に記載のヒトGDNF変異体。
- パーキンソン病の治療に使用するための請求項1に記載のヒトGDNF変異体。
- 請求項1に記載のヒトGDNF変異体を哺乳動物(ただし、ヒトを除く)に投与する工程を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病を治療するための方法。
- 療法として使用するための請求項1に記載のヒトGDNF変異体。
- 有効量の請求項1に記載のヒトGDNF変異体を、それを必要とする哺乳動物(ただし、ヒトを除く)に投与することを含む、パーキンソン病を治療する方法。
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