BR112012031861B1 - uso de 5a-androstano-3ß,5,6ß-triol - Google Patents
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Abstract
uso de 5a-androstano-3ß,5,6ß-triol é descrito o uso de 5a-androstano-3ß,5,6ß-triol na preparação de drogas neuroprotetoras. o composto tem efeito protetor significativo contra danos aos neurônios causados por isquemia cerebral, isquemia da medula espinal ou hipoxia e não tem reação tóxica óbvia dentro de sua dose eficaz.
Description
USO DE 5α-ΑΝΕΗΟ8ΤΑΝΟ-3β,5,6β-ΤΗΙΟΕ
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a um novo uso clínico do composto 5a-androstano-3e,5,63-triol (daqui em diante abreviado como YC-6).
HISTÓRICO DA INVENÇÃO [002] Acidente vascular cerebral isquêmico (AVCI) agudo é convencionalmente tratado principalmente por trombólise ou neuroproteção. A neuroproteção refere-se ao medicamento ou medidas, durante o tratamento de AVCI, que são capazes de inibir reações patológicas e bioquímicas do tecido cerebral causadas por isquemia, interferir em vários caminhos da cascata isquêmica e sobrevivência prolongada dos neurônios.
[003] A neuroproteção tem se tornado um dos focos de pesquisa no campo de tratamento de AVCI. Vários neuroprotetores estão em desenvolvimento clínico, o mecanismo dos quais é prevenir ou limitar danos cerebrais resultantes de isquemia através do bloqueio de vários processos patológicos prejudiciais devido à isquemia, de modo a reduzir a morte do tecido cerebral e promover a recuperação da função. Os neuroprotetores podem reduzir a dimensão do infarto cerebral; não resultam em complicação da hemorragia que pode ocorrer durante a terapia de trombolíticos ou anticoagulantes; e podem ser usados sem confirmação de etiologia, tornando-se possível o tratamento precoce. O efeito terapêutico dos neuroprotetores é, portanto, promissor.
[004] Ainda não há neuroprotetor, entretanto, que tenha sido provado seguro e eficaz. As drogas que estão
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2/17 em ensaios clínicos e têm valor potencial de aplicação clínica incluem bloqueadores do canal de cálcio (BCC), moduladores do canal de cálcio, inibidores de liberação de glutamato, agonistas do receptor de ácido γ-aminobutírico (GABA), sequestrantes de radical livre, anticorpos de molécula de adesão anti-intercelular, e assim por diante.
[005] Dentre vários compostos, os esteroides neuroativos atraem preocupação crescente devido ao seu efeito abrangente em neuroproteção. Os níveis de esteroides neuroativos estão correlacionados com o desenvolvimento e progressão de algumas doenças do sistema nervoso central (SNC), e desempenham um papel significativo na modulação de dano neuronal, morte e aquelas doenças do SNC. Esses hormônios esteroides, quer naturais ou sintéticos, com atividade nos tecidos nervosos, foram chamados esteroides neuroativos (NAS) desde 1980. Esses hormônios esteroides foram usados clinicamente como terapia de substituição. O estrogênio é conhecido por ser um dos NAS que têm o efeito neuroprotetor mais forte. Os ovários das mulheres na menopausa não produzem estrogênio novamente, levando provavelmente à deposição de proteína beta-amiloide (Άβ) e então à doença de Alzheimer (DA). A administração de estrogênio pode significativamente reduzir os níveis de Λβ no cérebro. Clinicamente, o tratamento com estrogênio de AD tem alcançado bons resultados. Foi demonstrado que alopregnanolona protege os neurônios do hipocampo cultivados in vitro contra insulto neurotóxico irreversível por hipoxia ou glutamato. 5a-androstano-3e,5,6e-triol (YC-6) é um composto, encontrado como tendo efeito neuroprotetor durante a pesquisa nos neuroesteroides, com a seguinte fórmula
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3/17 estrutural. Recuperação de informação até agora não revelou nenhum relatório sobre o efeito farmacológico de YC-6 ou sua neuroatividade/efeito neuroprotetor.
Estrutura de 5a-androstano-3e,5,6e-triol
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Um objetivo da presente invenção é prover o uso de 5a-androstano-3e,5,63-triol na preparação de drogas neuroprotetoras, de modo a prover uma nova droga para o tratamento de doenças relacionadas aos neurônios.
[007] A pesquisa mostrou que 5a-androstano3β,5,ββ-triol (YC-6) inibe significativamente o dano excitotóxico induzido por glutamato nos neurônios granulares cerebelares, neurônios corticais e neurônios motores vertebrais, aumenta a taxa de sobrevivência dos neurônios e reduz a liberação de lactato desidrogenase em uma maneira dependente de dose com concentração mínima eficaz de 1 pM. YC-6 também inibe significativamente o dano aos neurônios corticais cerebrais causados por isquemia em uma maneira dependente de dose com concentração mínima eficaz de 2,5 pM.
[008] Para confirmar o efeito neuroprotetor de YC-6 in vivo, um modelo isquêmico cerebral focal e um modelo de lesão da medula espinal induzido por bloqueio da aorta abdominal foram usados para explorar o efeito protetor de YC6 contra dano neuronal causado por isquemia cerebral em ratos
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4/17 e isquemia da medula espinal em coelhos.
[009] Foi administrado 1 mg.Kg-1 de YC-6 através de injeção na veia caudal em ratos do grupo YC-6 30 minutos antes da isquemia cerebral. Os animais no grupo YC-6 têm pontuação neurológica muito maior e volume de infarto cerebral muito menor do que aquele no grupo de controle não tratado, indicando que YC-6 tem efeito protetor significativo contra dano neuronal.
[010] Os coelhos receberam 2 mg.Kg-1 de YC-6 30 minutos antes de a isquemia da medula espinal ter pontuação neurológica significativa maior que aquela no grupo de controle não tratado. Não foi observada paralisia no grupo YC-6, enquanto todos os animais no grupo de controle mostraram paralisia. Foi demonstrado histopatologicamente que lá permaneceu uma maior quantidade de neurônios motores da extremidade anterior da medula espinal normal nos animais do grupo YC-6 do que aqueles do grupo de controle, ainda indicando que YC-6 tem efeito protetor significativo contra dano neuronal da medula espinal.
[011] Considerando as evidências acima, YC-6 tem efeito protetor contra dano neuronal causado por isquemia cerebral, isquemia da medula espinal ou hipoxia. Nenhuma outra pesquisa relatou a neuroatividade/efeito neuroprotetor de YC-6 até agora.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [012] Figura 1. O efeito protetor de YC-6 contra excitotoxicidade induzida por glutamato de neurônios granulares cerebelares, neurônios motores vertebrais, e neurônios corticais cerebrais. A morfologia de (A) neurônios granulares cerebelares, (B) neurônios motores vertebrais, e
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5/17 (C) neurônios corticais cerebrais; (D) taxa de liberação de
LDH e (E) taxa de sobrevivência dos neurônios.
significativamente diferente vs. grupo Glutamato (Glu) de neurônios granulares cerebelares, *P < 0,05 e **P < 0,01; # e ##: significativamente diferente vs. grupo Glutamato (Glu) de neurônios motores vertebrais, #P < 0,05 e ##P < 0,01; $ e $$: significativamente diferente vs. grupo Glutamato (Glu) de neurônios corticais cerebrais, $P < 0,05 e $$P < 0,01.
[013] Figura 2. O efeito protetor de YC-6 contra dano neuronal cortical induzido por hipoxia. (A) o resultado do microscópio de contraste de fase; (B) taxa de sobrevivência dos neurônios; (C) taxa de liberação de LDH. ##: significativamente diferente vs. grupo de controle, P < 0,01; * e **: significativamente diferente vs. grupo hipoxia, *P < 0,05, **P < 0,01.
[014] Figura 3. O efeito neuroprotetor de YC-6 em isquemia da medula espinal em coelhos induzida por bloqueio da aorta abdominal. (A) pontuação da função neurológica; (B) as fatias histopatológicas (coloração HE) ; (C) o número de neurônios motores vertebrais normais.
[015] Figura 4. O efeito neuroprotetor de YC-6 contra isquemia cerebral focal em ratos. (A) pontuação da função neurológica; (B) as fatias cerebrais (coloração TTC) ; (C) comparação do volume de infarto cerebral.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [016] A presente invenção será descrita em mais detalhes nos exemplos específicos. Ainda, a presente invenção não é limitada aos exemplos a seguir.
EXEMPLO 1. CULTURA DE NEURÔNIOS PRIMÁRIOS
1. Culturas primárias de neurônios granulares
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6/17 cerebelares de ratos [017] Cerebelo com meninges e vasos sanguíneos removidos foram obtidos de ratos com 7 a 8 dias com peso de 15 a 20g. 0,05 g/L de DNase I foi usado para pipetar a célula em uma suspensão de célula única seguindo 0,25 g/L de digestão de tripsina. A suspensão foi então centrifugada para coletar precipitação e ressuspensa com meio de BME contendo 10% (v/v) de FBS e KCl a 25 mM. As células foram então semeadas em placas pré-revestidas com polilisina. 24 horas após a semeadura, 10 pM de Ara-C foram adicionados para inibir o crescimento e a proliferação de células não neuronais, de modo que os neurônios granulares cerebelares tenham pureza não menos que 95%. Glicose foi adicionada durante a cultura para prover energia suplementar para o metabolismo celular. Os experimentos foram realizados em 8DIV.
2. Neurônios motores vertebrais de ratos [018] A medula vertebral foi obtida de ratas SD grávidas de 15 dias. A membrana de crista e o filme sanguíneo foram removidos. Os tecidos da medula espinal dos ratos fetais são digeridos com 0,125% de tripsina e então centrifugados para coletar a camada intermediária enriquecida com neurônios motores. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação e as células foram aderidas por técnica de aderência de velocidade diferencial por 1 hora. Os neurônios motores vertebrais suspensos com velocidade de aderência mais lenta foram coletados e semeados. 24 após a semeadura, Ara-C foi adicionado. O meio de cultura foi substituído no 3 DIV com meio de soro livre L-15, seguido por metade da alteração média a cada 2~3 dias. Os experimentos foram realizados no 3Petição 870190107063, de 22/10/2019, pág. 10/25
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DIV.
3. Neurônios Corticais de ratos [019] Córtex com meninges e vasos sanguíneos removidos foram obtidos de ratos recém-nascidos (com 1 dia). 0,05 g/L de DNase I foi usado para pipetar a célula para suspensão de célula única seguindo 0,25 g/L de digestão de tripsina. A suspensão foi então centrifugada para coletar precipitação e diluída com meio DMEM-F12 contendo 5% (v/v) de FBS e 2% de B27. A célula foi semeada em placas prérevestidas com polilisina. 24 horas após a semeadura, 10 pM de Ara-C foram adicionados para inibir o crescimento e proliferação de células não neuronais. A metade da alteração média foi realizada 2~3 vezes por semana. Os experimentos foram realizados em 10 DIV.
EXEMPLO 2. EFEITO PROTETOR DE YC-6 EM NEURÔNIOS PRIMARIAMENTE CULTIVADOS
1. Efeito protetor de YC-6 contra excitotoxicidade induzida por glutamato de neurônios granulares cerebelares [020] Os neurônios granulares cerebelares cultivados por 8 dias foram divididos em quatro grupos: grupo de controle, grupo glutamato, grupo MK801+glutamato e grupo YC-6+glutamato. O grupo de controle não recebeu tratamento. O grupo glutamato foi tratado com 200 pM de glutamato. O grupo MK801 e o grupo YC-6 foram pré-tratados com MK801(10 pM) e YC-6 com diferentes concentrações, respectivamente, seguido pela incubação a 37 °C por 30 minutos, então o glutamato foi adicionado. Após 24 horas, o microscópio de contraste de fase foi usado para observar as morfologias neuronais. As células foram tingidas por FDA e observadas em microscópio fluorescente invertido para contagem de célula para calcular
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8/17 a taxa de sobrevivência dos neurônios. A atividade de lactato desidrogenase (LDH) também foi determinada para cada grupo.
[021] Taxa de sobrevivência = Número de células vivas para cada grupo/Número de células vivas no grupo de controle * 100% [022] Os resultados mostraram que a maioria dos neurônios granulares cerebelares no grupo YC-6+glutamato e no grupo MK801+glutamato poderia manter a integridade da soma e processos e tinham taxa de sobrevivência aumentada e liberação de LDH diminuída. As diferenças estatísticas foram observadas entre os grupos YC-6 e MK801 e o grupo glutamato. Conforme mostrado nas figuras 1-A, D e E, o efeito de YC-6 foi dependente da concentração. YC-6 não mostrou nenhum efeito na taxa de sobrevivência das células de neurônios normais dentro dos intervalos de dose indicados.
2. Efeito protetor de YC-6 contra excitotoxicidade induzida por glutamato de neurônios motores vertebrais.
[023] Os neurônios motores vertebrais cultivados primários em 5 DIV foram divididos em quatro grupos: grupo de controle, grupo glutamato, grupo MK801+glutamato e grupo YC-6+glutamato. O grupo de controle não recebeu tratamento. O grupo glutamato foi tratado com 200 gM de glutamato. O grupo MK801 e o grupo YC-6 foram prétratados com MK801(10 gM) e YC-6 com diferentes concentrações, respectivamente, seguido por incubação a 37 °C por 30 minutos, então o glutamato foi adicionado. Após 24 horas, o microscópio de contraste de fase foi usado para observar as morfologias neuronais. As células foram tingidas por FDA e observadas em microscópio fluorescente invertido para contagem de célula para calcular a taxa de sobrevivência
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9/17 dos neurônios. A atividade de lactato desidrogenase (LDH) também foi determinada para cada grupo.
[024] Taxa de sobrevivência = Número de células vivas para cada grupo/Número de células vivas no grupo de controle * 100% [025] A observação do microscópio de contraste de fase mostrou que um grande número de neurônios motores vertebrais vivos sobreviveu no grupo de controle com triângulo intacto ou soma em forma de polígono. As células foram estereoscópicas e tiveram neurites halo e visíveis. Poucos neurônios motores vertebrais sobreviveram no grupo glutamato, embora com neurites formados. As células nesse grupo foram severamente danificadas. O número de neurônios motores vertebrais no grupo MK801+glutamato e grupo YC6+glutamato foi significativamente aumentado e muitos neurites foram vistos, embora um pequeno número de células morreu. Comparadas com o grupo de controle, as taxas de sobrevivência dos grupos restantes foram diminuídas por graus diferentes. Comparada com o grupo glutamato, a taxa de sobrevivência do grupo YC-6+glutamato foi significativamente aumentada e dependente da concentração de YC-6, conforme mostrado nas figuras 1-B, D e E. YC-6 não mostrou nenhum efeito na taxa de sobrevivência das células neuronais normais dentro dos intervalos de dose indicados.
3. Efeito protetor de YC-6 contra excitotoxicidade induzida por glutamato de neurônios corticais.
[026] Os neurônios corticais cultivados primários em 10 DIV foram divididos em quatro grupos: grupo de controle, grupo glutamato, grupo MK801+glutamato e grupo YC-6+glutamato. O grupo de controle não recebeu tratamento. O
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10/17 grupo glutamato foi tratado com 200 μΜ de glutamato. O grupo MK801 e o grupo YC-6 foram pré-tratados com MK801(10 μΜ) e YC-6 com diferentes concentrações, respectivamente, seguido por incubação a 37 °C por 30 minutos, então o glutamato foi adicionado. Após 24 horas, o microscópio de contraste de fase foi usado para observar morfologias neuronais. As células foram tingidas por FDA e observadas em microscópio fluorescente invertido para contagem de célula para calcular a taxa de sobrevivência dos neurônios. A atividade de lactato desidrogenase (LDH) também foi determinada para cada grupo.
[027] Taxa de sobrevivência = Número de células vivas para cada grupo/Número de células vivas no grupo de controle * 100% [028] Os resultados mostraram que um grande número de neurônios corticais no grupo YC-6+glutamato e no grupo MK801+glutamato manteve intacto soma e neurites e teve as taxas de sobrevivência aumentadas e liberação de LDH diminuída. As diferenças estatísticas foram observadas entre os grupos YC-6 e MK801 e o grupo glutamato. Conforme mostrado na figuras 1-C, D, e E, o efeito de YC-6 foi dependente de concentração. YC-6 não mostrou nenhum efeito na taxa de sobrevivência das células de neurônios normais dentro dos intervalos de dose indicados.
4. Efeito protetor de YC-6 contra dano induzido por hipoxia dos neurônios corticais.
[029] Os neurônios corticais cultivados primários em 10 DIV foram divididos em quatro grupos: grupo de controle, grupo hipoxia, grupo hipoxia MK801+, e grupo hipoxia YC-6+. 3 cavidades duplicadas foram providas para cada grupo. O grupo de controle foi incubado em uma
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11/17 incubadora normóxica de CO2. O grupo hipoxia foi colocado em uma estação de trabalho de hipoxia (concentrado de oxigênio: 1%) . O grupo hipoxia MK801+ e o grupo hipoxia YC-6+ foram pré-tratados com MK801 (10 pM) e YC-6 com diferentes concentrações 30 minutos antes de serem substituídos para a estação de trabalho de hipoxia (concentrado de oxigênio: 1%). Após 12 horas, as células foram observadas e fotografadas em microscópio de contraste de fase.
[030] O tratamento foi realizado em placas de 96 cavidades. 200 pl de solução estoque MTT foram adicionados em cada cavidade e incubados por 4 h. Cristais coloridos de hiacintina foram formados em células vivas. O líquido em cada cavidade foi removido e substituído com 150 pl de DMSO para dissolver os cristais. Os cristais foram dissolvidos após meia hora e o valor OD foi detectado em 570 nm de comprimento de onda pelo Leitor de Microplacas. 50 pL do meio de cultura foram obtidos a partir de todos os grupos em diferentes pontos do tempo e a liberação de LDH foi determinada para cada cavidade de acordo com as instruções do fornecedor. Os dados foram apresentados como o meio ± SD, ANOVA de sentido único e estatisticamente analisados usando teste T de amostras pareadas e análise de variância entre os meios de múltiplas amostras. Veja as referências [1] e [2]. [1] Brewer G.J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Meth. 1997, 71:143-155. [2] Lee M.M., Hseih M.T. Magnolol protects cortical neuronal cells from chemical hypoxia in rats. Neuroreport 1998, 9:3451-3456.
[031] Os resultados mostraram neurônios corticais cultivados primários em ratos em 10 DIV e foram moldados em forma de cone ou multipolo com soma brilhante,
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12/17 limite claro e núcleo. As células tiveram refratividade muito alta e neurites foram conectadas para formar uma rede.
[032] Neurônios corticais expostos à hipoxia mostraram uma integridade interrompida e refratividade diminuída. Neurites foram quebradas ou desapareceram. O citoplasma sofreu degeneração granular. Alguns de soma estavam inchados ou desapareceram.
[033] Comparados com o grupo de controle, grupo hipoxia MK801+ e grupo hipoxia YC-6+ não mostraram diferença na morfologia das células neuronais corticais. O efeito de proteção neuronal de YC-6 foi dependente de concentração (Figura 2A). O método MTT mostrou que o tratamento de hipoxia significativamente diminuiu a taxa de sobrevivência dos neurônios (P < 0,05), enquanto YC-6 aumentou a taxa de sobrevivência dos neurônios em um modo dependente da concentração (Figura 2B). Os dados de liberação de LDH foram consistentes com os resultados do método MTT. O grupo prétratado YC-6 aliviou o neurônio danificado causado por hipoxia em um modo dependente da concentração (Figura 2-C, P < 0,05) .
EXEMPLO 3. EFEITO NEUROPROTETOR DE YC-6 CONTRA ISQUEMIA DA MEDULA ESPINAL EM COELHOS INDUZIDA POR BLOQUEIO DA AORTA ABDOMINAL [034] 40 coelhos brancos machos da Nova Zelândia foram agrupados em 4 grupos (n = 10): Grupo de controle para estabelecimento do modelo de isquemia da medula espinal em coelhos; grupo YC-6, com 2 mg.Kg-1 de esteroide YC-6 intravenosamente injetado através da veia marginal da orelha do coelho 30 minutos antes da isquemia da medula espinal; grupo veículo, com capacidade equivalente de
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13/17 hidroxipropil ciclodextrinas (1 ml.Kg-1) injetada da mesma maneira 30 minutos antes da isquemia da medula espinal; grupo simulado, com apenas exposição da aorta abdominal, mas sem bloqueio.
[035] O processo de estabelecimento do modelo de isquemia da medula espinal em coelhos foi realizado de acordo com as referências [3] e [4] e o relatório anterior [5]. [3] Celik M. et al. Erythropoietin prevents motor neuron apopotosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99: 2258-2263. [4] Johnson SH, Kraimer J.M., Graeber G.M. Effects of flunarizine on neurological recovery and spinal cord blood flow in experimental spinal cord ischemia in rabbits. Stroke, 1993, 24: 1547-1553. [5] Sang H., Cao L., Qiu P., Xiong L., Wang R., Yan G. Isoflurane produces delayed preconditioning against spinal cord ischemic injury via release of free radicals in rabbits. Anesthesiology, 2006, 105: 953-960.
[036] Os parâmetros fisiológicos foram obtidos para cada grupo imediatamente antes da isquemia, 10 minutos após a isquemia e 20 minutos após a reperfusão. A pontuação Tarlov [5] foi usada para obter pontuações funcionais para cada grupo: pontuação 0, paralisia completa dos membros inferiores; pontuação 1, movimento visível da articulação do membro inferior; pontuação 2, livre movimento da articulação do membro inferior, mas incapaz de se levantar; pontuação 3, capaz de se levantar, mas incapaz de andar; pontuação 4, completa recuperação da função de movimento do membro inferior e capaz de andar normalmente.
[037] Após a pontuação da função neurológica, os coelhos foram submetidos à anestesia e tecidos da medula
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14/17 espinal em segmentos lombares (L5-L7) foram obtidos. Os tecidos foram embebidos em parafina, fatiados e então submetidos à coloração HE. Mudanças patológicas foram observadas em um microscópio óptico por um observador que não sabia como os coelhos foram agrupados e neurônios motores normais da extremidade anterior da medula vertebral foram contados. A contagem dos neurônios motores normais da extremidade anterior da medula vertebral para cada animal foi apresentada como valor médio de 3 lâminas.
[038] Os resultados não mostraram nenhuma diferença estatística (P > 0,05) nos parâmetros fisiológicos obtidos imediatamente antes da isquemia, 10 minutos após a isquemia e 20 minutos após a reperfusão. A pontuação da função neurológica foi determinada e mostrada na figura 3-A. A função neurológica do membro inferior dos coelhos no grupo simulado foi completamente normal durante toda a observação (pontuação 4); nenhum dos coelhos nos grupos de controle e veículo puderam se levantar; 7 dos coelhos no grupo YC-6 grupo puderam se levantar (pontuação 3 ou maior). As pontuações da função neurológica dos grupos YC-6 e simulado foram significativamente maiores que aquelas dos grupos de controle e veículo (P < 0,05).
[039] Nos grupos de controle e veículo, os tecidos da medula espinal nos segmentos lombares foram severamente danificados, incorporados com desaparecimento substancial de neurônios motores normais e degeneração vacuolar extensa. No grupo YC-6, entretanto, o dano da medula espinal foi substantivamente aliviado e os neurônios motores normais foram observados (Figura 3-B) . O número de neurônios motores normais da extremidade anterior da medula vertebral
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15/17 nos grupos YC-6 e simulados foi significativamente aumentado (Figura 3-C).
[040] Em conclusão, YC-6 é neuroprotetor contra isquemia da medula espinal.
EXEMPLO 4. EFEITO NEUROPROTETOR DE YC-6 CONTRA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL EM RATOS (MCAO) [041] 30 ratos SD macho foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n = 10) : grupo de controle, para estabelecimento de modelo isquêmico cerebral focal em ratos; grupo YC-6, com 1 mg.Kg-1 YC-6 intravenosamente injetado através da veia da cauda 30 minutos antes da isquemia cerebral; grupo veículo, com capacidade equivalente de hidroxipropil ciclodextrinas (2 ml.Kg-1) injetada da mesma maneira 30 minutos antes da isquemia cerebral.
[042] Os ratos foram submetidos a jejum pósoperatório por 12 horas e enquanto autorizados a beber livremente. O modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) foi estabelecido através da técnica de fio intraluminal [6]. [6] Wang Q., Peng Y., Chen S., Gou X., Hu B., Du J., Lu Y., Xiong L. Pretreatment with electroacupuncture induces rapid tolerance to focal cerebral ischemia through regulation of endocannabinoid system. Stroke, 2009, 40(6) : 2157-2164. Após oclusão por 120 minutos, o fio foi liberado e seguido por reperfusão continuada. O fluxo sanguíneo cerebral regional foi monitorado por um medidor de fluxo sanguíneo Doppler a laser os animais foram devolvidos à gaiola quando acordados e autorizados a beber e comer livremente. 72 horas de reperfusão depois da isquemia cerebral, método de pontuação Longa [7] foi usado para avaliar e pontuar a função neurológica através de um
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16/17 observador que não sabia como os ratos foram agrupados: grau 0, sem disfunção; grau 1, incapaz de esticar o membro esquerdo; grau 2, rotação para a esquerda; grau 3, caindo para a esquerda; grau 4, sem atividades autonômicas acompanhada por inibição consciente; grau 5, morte. [7] Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.
[043] Depois da pontuação da função neurológica, os ratos foram sacrificados e os cérebros foram rapidamente tirados. Depois de fatiadas, as seções do cérebro foram imediatamente tingidas em solução TTC por 30 minutos, seguidas pela fixação de paraformaldeído. Depois de 24 horas, as fatias foram fotografas usando uma câmera digital e as imagens forma importadas para o computador. O programa de processamento de imagem (ADOBE, PHOTOSHOP 8.0) foi usado para calcular o volume do infarto (tecido cerebral normal mostrado em rosa e área com infarto mostrada em branco) . A fim de calibrar o desvio no volume de infarto causado por edema cerebral, o volume de infarto foi apresentado como porcentagem de volume normal no lado oposto.
[044] Volume de infarto = (volume de tecido normal do lado oposto - volume de tecido normal de lado correspondente) / volume de tecido normal do lado oposto * 100% [045] A pontuação do comportamento neurológico (NBS) foi testada usando o teste de Kruskal-Wallis. Havendo diferença entre os grupos, o teste Mann-Whitney U e a calibração Bonferroni eram usados para comparação pareada. O volume do infarto e os parâmetros fisiológicos foram
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17/17 apresentados como erro meio ± SD e analisados usando ANOVA em sentido único seguindo o teste Post hoc Studeng-Newman-Keuls (SNK) para comparação pareada dentre múltiplos grupos. *F<0,05 indica diferença estatística.
[046] As pontuações da função neurológica para animais em cada grupo foram mostradas na figura 5. Comparado aos grupos de Controle e Veículo, o grupo YC-6 tem melhora significativa na função neurológica e volume de infarto reduzido (*P<0,05).
[047] Considerando as evidências acima, YC-6, isto é, 5a-androstano-3p,5,6p-triol, tem efeito protetor contra lesões neuronais causadas por hipoxia, isquemia cerebral ou isquemia da medula espinal.
Claims (2)
1. USO DE 5a-ANDROSTANO-3p,5,6p-TRIOL, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratamento de uma doença selecionada de um grupo consistindo de acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmico agudo, isquemia cerebral e isquemia medular.
isquêmico agudo.
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