KR101463477B1

KR101463477B1 - 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올의 신경보호 약물 제조에서의 용도

Info

Publication number: KR101463477B1
Application number: KR1020127032524A
Authority: KR
Inventors: 광메이 얀; 하이얀 후; 티안동 렝; 한페이 상; 징시아 장; 펭신 퀴우; 수지아 조우; 지에시 첸; 시우후아 유
Original assignee: 광저우 셀프로텍 파머수티컬 리미티드
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2014-11-19
Also published as: AU2011276800A1; US9320743B2; CN101884638B; ES2620754T3; WO2012003802A1; EP2591785A1; HUE032159T2; JP5681931B2; RS55845B1; BR112012031861B1; LT2591785T; SI2591785T1; SG186135A1; CN101884638A; RU2541093C2; JP2013529657A; KR20130038286A; US20140329790A1; CY1118789T1; AU2011276800B2

Abstract

본 발명은 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올의 신경보호 약물 제조에서의 용도를 개시한다. 상기 화합물은 뇌허혈, 척수 허혈 및 저산소증에 의한 뉴런(neuron) 손상에 대한 보호작용이 뚜렷하고 유효 약제량에서 뚜렷한 독성 부작용이 나타나지 않는다.

Description

5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올의 신경보호 약물 제조에서의 용도{USE OF 5a-ANDROSTANE (ALKYL)-3β,5,6β-TRIOL IN PREPARATION OF NEUROPROTECTIVE DRUGS}

본 발명은 화합물 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올(이하 'YC-6'으로 약칭함)의 새 약물 용도에 관한 것이다.

급성 허혈성 뇌졸중의 치료는 주로 혈전융해 및 신경보호라는 두 가지 방식이 있다. 후자는 급성 허혈성 뇌졸중의 치료에서 허혈에 의한 뇌조직의 일련의 병리 및 생화학 반응을 저지하고 허혈 증폭 반응의 각 고리를 간섭하여 뉴런의 생존을 연장시키는 약물 또는 조치를 가리킨다.

현재 급성 허혈성 뇌졸중의 신경보호 치료제에 의한 치료는 이미 뇌졸중 치료에서 매우 각광받는 연구 과제에 속하여 많은 신경보호제가 현재 임상 개발 시험에 있다. 그 작용 기전은 허혈에 의한 각종 유해한 병리 과정의 발생을 저지함으로써 허혈에 의한 뇌손상을 방지하거나 국한하고, 뇌조직의 사망을 감소시키고 기능 회복을 촉진시킨다. 신경보호제가 뇌경색에 의한 경색 면적을 줄이고 출혈을 일으키지 않아서 혈전융해나 항응고 치료 과정에서 나타나는 출혈 합병증이 없고, 사용하기 전에 상세한 질병 원인 감별진단을 실시할 필요가 없어서 초기 치료를 가능하도록 한다. 따라서 신경보호제의 치료 효과 및 전망은 매우 고무적이라고 할 수 있다.

그러나, 여태까지 안전하고 유효하다고 증명된 신경보호제가 발견되지 않았고, 현재 임상시험을 진행 중이거나 잠재적으로 임상에서 응용할 전망이 있는 약물은 칼슘통로차단제(CCB：calcium channel blockers), 칼슘통로조절제, 글루타민 방출 억제제, 감마아미노뷰티르산(GABA) 수용체 길항제(receptor agonists), 유리기 제거제(free radical scavengers), 안티 세포간부착분자 항체(anti-intercellular adhesion molecule antibodies) 등이 있다.

수많은 화합물 중에서 신경활성 스테로이드는 신경 보호에 대해 광범위한 효과를 구비하기 때문에 갈수록 주목을 받고 있다. 이러한 신경활성 스테로이드 레벨은 중축신경계통 질병의 발생 및 발전과 관련되어 있어서, 뉴런 손상, 사망 및 여러 가지 중축신경게통 질병에 대해 뚜렷한 조절 작용을 한다. 20세기 80년대에 과학자들은 천연적으로 존재하거나 인공적으로 합성되어 신경조직에서 활성을 지니는 스테로이드 호르몬를 신경활성 스테로이드(NAS, neuroactive steroids)로 명명했다. 현재 임상에서는 이미 이러한 스테로이드 호르몬을 대체요법으로서 임상에 응용하고 있다. 여성호르몬은 기존에 알려진 신경보호작용이 가장 강한 NAS 중의 하나로서, 폐경 부녀자의 난소에서 여성호르몬의 생성을 중단하면 베타 아밀로이드 단백질 축적(beta-amyloid protein (Aβ) deposition)을 일으키고 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 야기할 수 있다. 여성호르몬을 투여하면 대뇌의 Aβ 레벨을 현저하게 내릴 수 있어서 임상에서 여성호르몬을 AD 치료에 응용하여 좋은 효과를 얻고 있다. 연구에 따르면, 알로프레그나놀론은 산소결핍 및 글루타민에 의한 체외 배양 해마 뉴런의 불가역적인 신경독성 손상을 보호할 수 있다. 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올(YC-6)은 우리가 신경 스테로이드를 연구하는 과정에서 발견한 신경보호작용을 구비한 화합물로서, 그 화학적 구조는 아래 그림과 같다. 우리가 문헌 검색을 한 결과에 따르면, 현재까지 YC-6의 약리작용에 대한 보고를 발견하지 못했으며 YC-6이 신경조직에 대한 활성이나 신경보호작용을 구비했다는 보고를 발견하지 못했다.

5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올(YC-6)의 구조식

본 발명의 목적은 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올의 신경보호 약물 제조에서의 용도를 제공함으로서 뉴런(neuron) 질병의 치료에 새로운 약물을 제공하는데에 있다.

우리의 연구에 따르면, 5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올(이하 'YC-6'd으로 약칭함)은 글루타민 유래 소뇌 과립 뉴런, 피질 뉴런 및 척수 운동 뉴런의 흥분독성 손상을 뚜렷하게 억제하여 뉴런의 생존률을 높이고 젖산 탈수소효소의 방출을 저하시키고 또한 투여량 의존적인 형태로서 최저 유효 농도는 1μM이다. YC-6은 산소결핍에 의한 대뇌 피질 뉴런의 손상을 뚜렷하게 억제하며 투여량 의존적인 형태로서 최저 유효 농도는 2.5μM이다.

YC-6이 체내에서 신경을 보호하는 작용을 구비하는지를 입증하기 위해 우리는 1) 국소뇌허혈 모델 및 2) 복부 대동맥 차단에 의한 척수손상 모델을 사용하여 쥐 대뇌 허혈 및 토끼 척수 허혈 유래 뉴런 손상에 대한 YC-6의 보호작용을 연구했다.

YC-6군은 쥐 대뇌 허혈 30분 전에 꼬리정맥을 통해 1 mg.Kg^-1의 YC-6을 정맥주사하였으며 신경 기능 평점이 상기 처리를 하지 않은 대조군보다 현저하게 높고, 뇌경색 부피가 상기 처리를 하지 않은 대조군보다 현저하게 작았다. 이것은 YC-6이 뇌신경손상에 대한 보호작용이 뚜렷하다는 것을 나타낸다.

척수 허혈을 실행하기 30분 전에 2 mg.Kg^-1의 YC-6을 사전 주사하였으며 신경 기능 평점이 상기 처리를 하지 않은 대조군보다 현저하게 높고, 마비가 나타난 동물이 없었다. 대조군의 동물들은 모두 마비를 나타냈다. 조직 병리학에 따르면, YC-6군의 정상 척수 앞뿔 운동뉴런의 수량이 대조군보다 현저하게 많아서 YC-6이 척수 뉴런 손상에 대한 보호작용이 뚜렷하다는 것을 나타낸다.

상술한 바와 같이, YC-6은 뇌허혈, 척수 허혈 및 저산소증에 의한 뉴런손상에 대한 보호작용을 한다. 현재까지 YC-6이 신경조직에 대해 활성을 구비하거나 신경보호작용을 갖추었다는 연구 보고가 없다.

도 1은 글루타민 유래 소뇌 과립 뉴런, 피질 뉴런 및 척수 운동 뉴런의 흥분독성 손상에 대한 YC-6의 보호 작용도다. 이 중에서, A는 소뇌 과립 뉴런, B는 척수 운동 뉴런, C는 대뇌 피질 뉴런, D는 LDH 방출률, E는 뉴런 생존률이다; *와 **는 각각 소뇌 과립 뉴런 YC-6군이 글루타민(Glu)군과 비교할 때 현저한 차이가 존재하는 것을 나타내고, *P<0.05, **P<0.01이다; #와 ##는 각각 척수 운동 뉴런 YC-6군이 글루타민(Glu)군과 비교할 때 현저한 차이가 존재하는 것을 나타내고, #P<0.05, ##P<0.01이다; $와 $$는 각각 대뇌 피질 뉴런YC-6군이 글루타민(Glu)군과 비교할 때 현저한 차이가 존재하는 것을 나타내고, ^$P<0.05, ^$$P<0.01이다.
도 2는 산소결핍 유래 피질 뉴런 손상에 대한 YC-6의 보호 작용도다. 이 중에서, A는 위상차현미경 결과, B는 뉴런 생존률, C는 LDH 방출률이다; ##는 산소결핍군이 Control군과 비교할 때 현저한 차이가 존재하는 것을 나타내고, P<0.01이다; *와 **는 각각 YC-6군이 산소결핍과 비교할 때 현저한 차이가 존재하는 것을 나타내고, *P<0.05, **P<0.01이다.
도 3은 복부 대동맥 차단에 의한 토끼 척수손상 모델에 대한 신경보호 작용도다. 이 중에서, A는 신경 기능 평점이고, B는 병리조직학적 슬라이드이고, C는 정상 척수 앞뿔 운동뉴런의 수량이다.
도 4는 쥐 국소뇌허혈 모델에 대한 YC-6의 보호 작용도다. 이 중에서, A는 신경 기능 평점이고, B는 뇌경색 슬라이드도이고, C는 뇌경색 부피 비교다.

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명할 것이나, 이로 인해 본 발명을 하기의 실시예에 국한하는 것은 아니다.

실시예 1 : 뉴런 세포 배양

1. 쥐 소뇌 과립 뉴런

생후 7~8일이고 몸무게가 대략 15~20g인 쥐의 뇌막과 혈관을 제거한 소뇌를0.25 g/L의 췌장 효소로 소화한 후, 0.05 g/L DNase I의 액체로 세포를 단세포 현탁액으로 분산시키고 원심 시켜서 침전을 취하고, 10% (v/v)의 FBS와 25 mM의 KCl을 함유하는 BME 배양기로 희석시키고 폴리리신으로 프리 코팅된 배양 접시에 접종한다. 접종 24시간 후 10 μM Ara-C를 첨가하여 비 뉴런 세포의 생장 및 증식을 억제함으로써 소뇌 과립 뉴런의 순도가 95% 이상이 되도록 한다. 배양 시 포도당을 첨가하여 세포 대사에 필요한 에너지를 보충한다. 8일 째 되는 날에 실헌을 진행하였다.

2, 쥐 척수 운동 뉴런

임신 15일 된 SD 쥐의 척수를 분리하여 크리스타막(cristae membrane)과 혈막(blood film)을 제거하고, 태아 쥐 척수 조직을 0.125%의 췌장 효소로 소화한 후, 원심 시켜서 운동 뉴런이 풍부한 중층을 취하고, 세포 잔해들을 원심 분리 제거한 후, 차동속도로 벽에 1h동안 부착하도록 하고, 부착속도가 느리고 현탁된 척수 운동 뉴런을 취한다. 접종 24시간 후 사이타라빈(cytarabine)을 첨가하고, 3일째에는 액체를 전부 교체하고 L-15 무혈청배양기로 계속 배양하고, 매 2~3일 마다 절반의 액을 교체한다. 3~5일째에 실험을 진행하였다.

3. 쥐 피질 뉴런

생후 1일 된 쥐의 뇌막과 혈관을 제거한 피질을 취하고 0.25 g/L의 췌장 효소로 소화한 후, 0.05 g/L DNase I의 액체로 세포를 단세포 현탁액으로 분산시키고 원심 시켜서 침전을 취하고, 5% (v/v)의 FBS와2%의 B27을 함유하는 DMEM-F12 배양기로 희석시키고 폴리리신으로 프리 코팅된 배양 접시에 접종한다. 접종 24시간 후 10 μM의 Ara-C를 첨가하여 비 뉴런 세포의 생장 및 증식을 억제하고, 이 후에는 매주 2~3번 절반의 액을 교체한다. 10일째에 실험을 진행하였다.

실시예 2: 초대배양된 뉴런 세포에 대한 YC-6의 보호작용

1. 글루타민 유래 소뇌 과립 뉴런 흥분독성 손상에 대한YC-6의 보호작용

배양 8일째인 소뇌 과립 뉴런을 각각 정상 대조군, 글루타민군, MK801+글루타민군, YC-6+글루타민군으로 나눈다. 정상 대조군은 어떠한 처리도 하지 않으며, 글루타민군은 200 μM의 글루타민을 첨가하며, 기타 군은 MK801(10 μM) 및 농도가 각각 다른 YC-6을 미리 첨가하여 37 ℃에서 30분동안 배양(incubation)한 후 클루타민을 첨가하며, 24시간 후에 위상차현미경으로 신경세포의 형태를 관찰한다; FDA로 염색하고 도립현미경으로 관찰하여 세포수를 카운트하여 뉴런의 생존률을 계산한다. 그리고 각 군의 젖산 탈수소효소의 활성을 측정한다.

생존률 = 각 군의 살아 있는 세포수 / 대조군의 살아 있는 세포수 x 100%

이 결과, YC-6+글루타민군과 MK801+글루타민군에서 대부분의 소뇌 과립 뉴런은 체세포(soma)와 돌기(process)의 완전성(integrity)을 유지할 수 있고 세포 생존률이 증가하며 LDH 방출치가 낮아지고 글루타민군과 비교할 때 현저한 차이가 나타난다. 그리고 YC-6 투여량 의존적인 형태를 나타낸다. 첨부도면 도 1-A, D, E를 참조한다. 그리고 상기 투여량 범위에서 YC-6은 정상 신경세포의 생존률에 영향을 주지 않는다.

2. 글루타민 유래 척수 운동 뉴런 흥분독성 손상에 대한YC-6의 보호작용

배양 5일째인 척수 운동 뉴런을 각각 정상 대조군, 글루타민군, MK801+글루타민군, YC-6+글루타민군으로 나눈다. 정상 대조군은 어떠한 처리도 하지 않으며, 글루타민군은 200 μM의 글루타민을 첨가하며, 기타 군은 MK801(10 μM) 및 농도가 각각 다른 YC-6을 미리 첨가하여 37 ℃에서 30분동안 배양(incubation)한 후 클루타민을 첨가하며, 24시간 후에 위상차현미경으로 신경세포의 형태를 관찰한다; FDA로 염색하고 도립현미경으로 관찰하여 세포수를 카운트하여 뉴런의 생존률을 계산한다. 그리고 각 군의 젖산 탈수소효소의 활성을 측정한다.

이 결과, 도립현미경으로 관찰할 때 대조군에서 생존한 척수 운동 뉴런의 수량이 많고 체세포가 풍만하여 삼각형, 다각형을 이루고 입체감이 강하며 광륜이 있고 분기와 돌기가 보인다; 글루타민군에서 생존한 척수 운동 뉴런의 수량이 적지만 돌기가 형성되었고 세포는 심각하게 손상되었다; YC-6+글루타민군과 MK801+글루타민군에서 척수 운동 뉴런의 수량은 뚜렷하세 증가하였고 돌기가 많이 있으나 여전히 소량의 사망 세포가 있다. 대조군과 비교할 때 나머지 3개 군의 척수 운동 뉴런 생존률은 정도는 다르지만 모두 저하되었으며, 글루타민군과 비교할 때 YC-6+글루타민군의 생존률이 뚜렷하게 제고되었고 또한 YC-6과 투여량 의존적인 형태를 나타낸다. 첨부도면 도 1-B, D, E를 참조한다. 그리고 상기 투여량 범위에서 YC-6은 정상 신경세포의 생존률에 영향을 주지 않는다.

3. 글루타민 유래 피질 뉴런 흥분독성 손상에 대한 YC-6의 보호작용

배양 10일째인 피질 뉴런을 각각 정상 대조군, 글루타민군, MK801+글루타민군, YC-6+글루타민군으로 나눈다. 정상 대조군은 어떠한 처리도 하지 않으며, 글루타민군은 200 μM의 글루타민을 첨가하며, 기타 군은 용매, MK801(10 μM) 및 농도가 각각 다른 YC-6을 미리 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 배양(incubation)한 후 클루타민을 첨가하며, 24시간 후에 위상차 현미경으로 신경세포의 형태를 관찰한다; FDA로 염색하고 도립현미경으로 관찰하여 세포수를 카운트하여 뉴런의 생존률을 계산한다. 그리고 각 군의 젖산 탈수소효소의 활성을 측정한다.

이 결과, YC-6+글루타민군과 MK801+글루타민군에서 대부분의 피질 뉴런은 체세포(soma)와 돌기(process)의 완전성(integrity)을 유지할 수 있고 세포 생존률이 증가하며 LDH 방출치가 낮아지고 글루타민군과 비교할 때 현저한 차이가 나타난다. 그리고 YC-6과 투여량 의존적인 형태를 나타낸다. 첨부도면 도 1-C, D, E를 참조한다. 그리고 상기 투여량 범위에서 YC-6은 정상 신경세포의 생존률에 영향을 주지 않는다.

4. 산소결핍에 의한 피질 뉴런 흥분독성 손상에 대한YC-6의 보호작용

배양 10일째인 일차배양 피질 뉴런을 각각 정상 대조군, 산소결핍군, MK801+산소결핍군, YC-6+산소결핍군으로 나눈다. 각 군에 3개의 서브 웰(accessory wells)을 설치한다. 정상 대조군은 이산화탄소 인큐베이터에 넣어서 정상적으로 배양하고, 산소결핍군은 산소결핍 스테이션(산소 농도 1%)에 넣는다. MK801+산소결핍군, YC-6+산소결핍군은 산소결핍 스테이션(산소 농도 1%)에 넣기 30분 전에 MK801(10 μM) 및 농도가 각각 다른 YC-6로 미리 처리한다. 12시간 후에 위상차 현미경으로 관찰하고 촬영한다.

96웰플레이트에서 위에서 언급한 바와 같이 군을 나누고 처리한 후, MTT 저장액 200μl을 첨가하여 4h동안 작용시키며 생존한 세포에서 히아신스(Hyacinthine)색 결정이 형성된다. 각 웰의 액체를 제거하고 150μl의 DMSO를 첨가하여 히아신스색 결정을 융해 시킨다. 반 시간 후 결정이 완전히 융해되면 enzyme　linked analyzer로 570nm 파장에서 OD값을 측정한다. 손상군과 대조군은 각 시간점에 50 μL의 배양액을 취하고 제조업체의 설명서에 따라 각 웰 배양액 LDH 함량을 측정한다. 각 군의 데이터는 mean±SD로 표시하고 여러 샘플의 평균 분산분석(analysis of variance among means of multiple samples) 및 대응표본 t-검정(paired-samples t-test)으로 통계학적 분석을 실시한다. 참고문헌은 [1]과 [2]다. [1] Brewer G.J. Isolation and culture of aldut rat hippocampal neurons. J. Neurosci . Meth . 1997, 71:143-155. [2] Lee M.M., Hseih M.T. Magnolol protects cortical neuronal cells from chemical hypoxia in rats. Neuroreport 1998, 9:3451-3456.

이 결과, 쥐 피질 뉴런은 배양 10일 후 세포가 뿔 모양이나 다극 모양을 나타내고 체세포가 선명하고 밝으며 경계가 명확하여 굴절성이 매우 강하고 뉴런 돌기가 서로 교차하여 망을 이루고 세포핵이 뚜렷하다. 산소결핍 처리된 피질 뉴런의 완전성이 파괴되고 굴절성이 저하되고 신경 접합부가 절단, 또는 사라지고 세포질의 과립성이 변하여 일부분의 체세포가 부어오르고 심지어 사라졌다. MK801+ 프리 처리군과 YC-6 프리 처리군을 정상 대조군과 비교했을 때 피질 뉴런은 형태학적 차이가 기본적으로 존재하지 않는다. 신경 보호작용은 YC-6과 투여량 의존적인 형태를 나타낸다(도 2A). MTT법의 결과에 따르면, 산소결핍 처리함으로써 뉴런의 생존률이 현저하게 저하되고(P < 0.05), YC-6은 투여량 의존적인 형태를 보이면서 산소결핍에 의하여 저하된 뉴런 생존률을 높였다(도 2B). LDH 방출 결과는 MTT법과 부합하고, YC-6 프리 처리군은 농도 의존적인 형태로 산소결핍에 의한 뉴런 손상을 낮췄다(도 2-C, P < 0.05).

실시예 3: 복부 대동맥 차단에 의한 토끼 척수 허혈 모델에 대한 YC-6의 신경 보호작용

뉴질랜드 흰 토끼 수컷 40마리를 4개의 군으로 나눈다(n=10): Control군은 토끼 척수 허혈 모델을 제작하고; YC-6군은 척수 허혈하기 30분 전에 연변 정맥을 통해 2 mg.Kg^-1의 스테로이드 YC-6을 투여하고; Vehicle군은 척수 허혈하기 30분 전에 동일한 방식으로 동일한 용량의 하이드록시프로필 시클로덱스트린(hydroxypropyl cyclodextrins)(1 ml.Kg^-1)을 투여하고; Sham군은 복부 대동맥만 노출 시키고 차단하지 않는다.

토끼 척수 허혈 모델의 제작은 문헌 보고[3, 4] 및 우리가 기존에 진행한 연구[5]를 참조한다. [3] Celik M. et al . Erythropoietin prevents motor neuron apopotosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99: 2258-2263. [4] Johnson SH, Kraimer J.M., Graeber G.M. Effects of flunarizine on neurological recovery and spinal cord blood flow in experimental spinal cord ischemia in rabbits. Stroke, 1993, 24: 1547-1553. [5] Sang H., Cao L., Qiu P., Xiong L., Wang R., Yan G. Isoflurane produces delayed preconditioning against spinal cord ischemic injury via release of free radicals in rabbits. Anesthesiology, 2006, 105: 953-960.

허혈하기 바로 전, 허혈 후 10분 및 재관류(reperfusion) 후 20분에 각 군의 각 생리학적 파라미터를 측정한다. Talov평점법(Talov scoring method)[5]으로 각 군의 토끼에 대한 기능 평점을 실시한다: 0점, 뒷다리가 완전히 마비됨; 1점, 뒷다리의 관절 운동을 관찰할 수 있음; 2점, 뒷다리가 자유 운동할 수 있으나 일어설 수 없음; 3점, 일어설 수 있으나 걸을 수 없음; 4점, 뒷다리 운동 기능이 완전히 회복되고 정상적으로 걸을 수 있음.

신경 기능에 대한 평점을 완료한 후 마취 상태에서 요수(lumbar segments)의 척수 조직(L₅-L₇)을 취하여 파라핀 장입 후 절편하고 HE 염색하여, 광학 현미경에서 군 나눔 상황을 모르는 관찰자에 의해 척수 병리학적 변화를 관찰하고 또한 척수 앞뿔 운동뉴런의 수량을 카운트한다. 각 동물의 척수 앞뿔 운동뉴런 카운트는 3개의 절편에 대한 카운트의 평균치다.

이 결과, 허혈하기 바로 전, 허혈 후 10분 및 재관류(reperfusion) 후 20분에 측정한 각 군의 각 생리학적 파라미터는 뚜렷한 차이가 없다(P > 0.05). 각 군의 동물의 신경 기능 평점 결과의 상세한 내용은 도 3-A에 나타내었다. Sham군의 토끼의 뒷다리 신경기능은 전체 관찰기간에 완전히 정상(4점)이었고; Control군과 Vehicle군의 토끼는 한 마리도 일어설 수 없었고; YC-6군에서는 7마리의 토끼가 일어설 수 있었다(3점보다 크거나 같음). YC-6군과 Sham군의 신경 기능 평점은 Control군과 Vehicle군보다 현저하게 높았다(P < 0.05).

Control군과 Vehicle군에서 요수(lumbar segments)의 척수는 심각한 손상을 보였고, 정상적인 운동뉴런이 기본적으로 사라지고 대규모의 공포(空胞)가 발생했다; 그러나 YC-6군에서는 요수의 척수 손상이 현저하게 감소되었고 정상적인 운동뉴런을 볼 수 있다(도 3-B). YC-6군과 Sham군의 척수 앞뿔 정상 운동뉴런의 수량은 현저하게 증가하였다(P < 0.05)(도 3-C).

상술한 바와 같이, YC-6은 척수 허혈에 대한 보호작용이 뚜렷하다.

실시예 4: 쥐 국소뇌허혈 모델(MCAO)에 대한 YC-6의 신경 보호작용

SD 쥐 수컷 30마리를 임의적으로 3개의 군으로 나눈다(n=10): Control군은 쥐 국소뇌허혈 모델을 제작하고; YC-6군은 뇌허혈하기 30분 전에 꼬리정맥을 통해 1mg.Kg^-1의 YC-6을 투여하고; Vehicle군은 척수 허혈하기 30분 전에 동일한 방식으로 동일한 용량의 하이드록시프로필 시클로덱스트린(2 ml.Kg^-1)을 투여한다.

시술 전에 12h 동안 금식하나 물을 자유 복용한다. intraluminal thread technique으로 중대뇌동맥폐색(MCAO) 모델을 제작한다[6]. [6] Wang Q., Peng Y., Chen S., Gou X., Hu B., Du J., Lu Y., Xiong L. Pretreatment with electroacupuncture induces rapid tolerance to focal cerebral ischemia through regulation of endocannabinoid system. Stroke, 2009, 40(6): 2157-2164. 폐색 120분 후 나일론선을 빼내고 재관류를 실시한다. 레이저 도플러 혈류계로 국소 뇌혈류를 모니터링한다. 수술 후 마취에 깨어난 후 동물을 쥐 우리에 돌려 보내서 음식을 자유로 취하도록 한다. 뇌허혈 재관류 후 72h에 군 나눔 상황을 모르는 관찰자가 Longa 평점법에 따라 관찰한다[7]. [7] Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91. 신경 기능 평점을 평가 및 기록한다: 0급, 기능 장애가 없음; 1급, 좌측 앞다리를 스트레칭할 수 없음; 2급, 좌측으로 회전할 수 있음; 3급, 좌측으로 경사질 수 있음; 4급, 자주 활동이 없고 의식 억제가 수반됨; 5급, 사망.

신경 기능에 대한 평점을 완료한 후 쥐의 머리를 절단하여 사망하도록 하여 쥐의 뇌를 신속하게 빼내고 절편하여 재빨리 TTC 용액으로 30분 동안 염색한 후, 파라포름알데히드 버퍼로 고정 시킨다. 24h 후 디지털 카메라로 촬영하여 컴퓨터에 입력하고 이미지 처리 프로그램(ADOBE, PHOTOSHOP 8.0)으로 경색 면적을 계산한다(분홍색 구역은 정상 뇌조직이고 흰색 구역은 경색 구역임). 뇌수종에 의한 경색 용적 편차를 보정하기 위해, 반대편 정상 용적에 대한 백분률로 경색 용적을 표시한다.

경색 용적 백분률 = (반대편 정상 조직 용적 - 동일편 정상조직의 용적) / 반대편 정상 조직 용적 x 100%

신경 행위학 평점(NBS)은 비모수적 검증(Kruskal-Wallis)을 사용한다. 각 군 간에 차이가 존재하면 Mann-Whitney U test 및 Bonferroni 보정으로 두 개씩 비교한다. 경색 용적과 생리학적 파라미터는 mean±SD error으로 표시하고 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 사용하며 여러 군 간에서 두 개씩 비교하는 것은 SNK(Post hoc Studeng-Newman-Keuls) 검정을 사용한다. *P <0.05는 현저한 통계학적 차이가 존재한다는 것을 나타낸다.

각 군의 동물의 신경 기능 평점결과는 도 5에 자세히 나타냈다. Control군 및 Vehicle군과 비교할 때 YC-6군의 신경 기능이 뚜렷하게 개선되었고 뇌 경색 용적도 현저하게 감소되었다(*P <0.05).

상술한 바와 같이, YC-6, 즉 안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올은 저산소, 뇌 허혈, 척수 허혈에 의한 뉴런 손상에 대해 보호작용을 한다.

Claims

5a-안드로스탄(알킬)-3β,5,6β-트리올을 신경보호 약물 제조에 사용하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 신경보호 약물이 뇌허혈을 치료하는 약물인 방법.
제1항에 있어서,
상기 신경보호 약물이 척수 허혈을 치료하는 약물인 방법.
제1항에 있어서,
상기 신경보호 약물이 산소결핍에 의한 뉴런 손상을 치료하는 약물인 방법.