ES2475211T3

ES2475211T3 - N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método de prevención y/o de tratamiento de enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina

Info

Publication number: ES2475211T3
Application number: ES09720199.0T
Authority: ES
Inventors: Jean Durlach
Original assignee: TRI-INOV; TRI INOV
Current assignee: TRI-INOV; TRI INOV
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2014-07-10
Anticipated expiration: 2029-02-25
Also published as: US9029419B2; WO2009112758A2; WO2009112758A3; FR2927809B1; EP2254567A2; FR2927809A1; EP2254567B1; CA2716764C; CA2716764A1; US20110003891A1

Abstract

Uso del N-acetil-taurinato de cinc para la preparacion de medicamentos utiles para prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas con la acumulacion de lipofuscina

Description

N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método de prevención y/o de tratamiento de enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina 5 La presente invención se refiere a un nuevo uso del N-acetil-taurinato de cinc.

El N-acetil-taurinato de cinc pertenece a la familia de los derivados de la taurina con actividad neuromuscular reforzada, que se describen en la patente de Francia FR 2 384 751. En la actualidad, se ha descubierto de forma

10 sorprendente que el N-acetil-taurinato de cinc (ATA-Zn) se puede usar para prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina.

En particular, la acumulación de lipofuscina se puede deber al envejecimiento o a un estr�s oxidativo.

15 El envejecimiento est� constituido por un conjunto de modificaciones funcionales que disminuyen progresivamente la capacidad de la persona para asegurar su equilibrio fisiológico. Una de las manifestaciones del envejecimiento es la acumulación en los tejidos de lipofuscina, que es una sustancia auto-fluorescente y no degradable; ésta constituye el signo principal del envejecimiento.

20 El estr�s oxidativo (o estr�s oxidante) es una agresión de las células y de los tejidos que resulta de una alteración de las reacciones de oxidación en las células que provoca la formación de sustancias tóxicas, tales como los radicales libres (o especies reactivas del oxígeno llamadas "Especies Reactivas del Oxígeno (ROS)") en las publicaciones anglosajonas). El estr�s oxidativo puede afectar a todos los tejidos y al metabolismo, puede participar en el envejecimiento y en un gran número de patologías tales como enfermedades cardiovasculares (aterotrombosis),

25 c�nceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas (diabetes mellitus, obesidad) y enfermedades degenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, cataratas o degeneración macular relacionada con la edad. La degeneración macular relacionada con la edad (DMLA) es la primera causa de discapacidad visual en adultos que tienen más de 55 años en los países industrializados. Se manifiesta por un engrosamiento de la zona macular de la retina o por una atrofia de esta zona y en ocasiones por hemorragias.

30 (Opthal. Physiol. Opt. 2003, 23 : 383-399 y Optometry in practice, volumen 5 (2004) 15-32).

El cinc est� muy concentrado en los tejidos oculares, en particular en la retina y en el epitelio pigmentario. Actúa como un cofactor para las enzimas antioxidantes (deshidrogenasa y catalasa retiniana).

35 Los antioxidantes, tales como las vitaminas C y E, los carotenoides y el cinc pueden limitar los riesgos de progresión de la degeneración macular asociada con la edad.

En particular, se ha demostrado que el cinc desempeña un papel importante en el mantenimiento de la función ocular normal y que el uso del cinc como un suplemento dietético puede disminuir el proceso de envejecimiento en

40 los ratones (Journal of the American college of nutrition, 2001, volumen 20, n� 2, 106-118). Del mismo modo se sabe que el cinc parece tener un papel fundamental en la prevención de la diabetes mellitus y de sus complicaciones (Li X et al. Diabetes and methallothionein. Mini-Reviews in Medical Chemistry 2007; 7: 761-768.) Sin embargo, se debe considerar el uso del cinc como suplemento alimenticio con precaución debido a que un exceso de cinc puede causar efectos tóxicos.

45 Además, los estudios han demostrado que la taurina interact�a estrechamente con el cinc en el desarrollo de la retina en ratas (J. Nutr. 1997, Jun; 127 (6) : 1206-13) y que la taurina en un suplemento dietético, aumenta la absorción del cinc por los fibroblastos (Biometals, 1994, 7, 237-243).

50 En la actualidad se ha encontrado de forma sorprendente que el N-acetil-taurinato de cinc puede prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina debida en particular al envejecimiento o a un estr�s oxidativo, en particular las enfermedades de la retina, especialmente la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopat�a diab�tica.

55 Por lo tanto, la presente invención se refiere al N-acetil-taurinato de cinc de fórmula:

para su uso en un método para prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina 60 debida en particular al envejecimiento o a un estr�s oxidativo, en particular, las enfermedades de la retina, en particular para prevenir y/o retrasar la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopat�a diab�tica.

Del mismo modo, la invención se refiere al uso del N-acetil-taurinato de cinc de fórmula:

para la preparación de medicamentos útiles para prevenir y/o tratar las enfermedades relacionadas con la acumulación de lipofuscina debida especialmente al envejecimiento o a un estr�s oxidativo, en particular, las 5 enfermedades de la retina, especialmente para prevenir y/o retrasar la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopat�a diab�tica.

El N-acetil-taurinato de cinc se prepara por reacción del anh�drido acético con la taurina en presencia de acetato de cinc según un procedimiento análogo al que se ha descrito para la preparación del N-acetil-taurinato de sodio por M. 10 TERAKOA (Hoppe-Seyler Zeitschrift f�r Physiologische Chemie, 145, 242 (1925)).

Preferentemente, se usa el N-acetil-taurinato de cinc dihidratado.

Para la administración a los pacientes que padecen enfermedades relacionadas con la acumulación de lipofuscina

15 debida al envejecimiento o a un estr�s oxidativo, especialmente tales como las enfermedades de la retina, en particular la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopat�a diab�tica, el N-acetil-taurinato de cinc se mezcla como principio activo con un excipiente farmac�uticamente aceptable usado normalmente para la preparación de composiciones farmacéuticas que se pueden administrar por vía oral, parenteral o local.

20 De forma ventajosa, el N-acetil-taurinato de cinc se puede presentar bajo las formas que se pueden administrar:

-: por vía oral, tales como comprimidos, grageas, cápsulas, cápsulas de gelatina, soluciones en bolsitas, que contienen el principio activo en la dosificación unitaria de 0,06 a 1 g y, para las soluciones de 0,6 a 5 g por 10 ml; -por vía parenteral, tales como soluciones inyectables envasadas en ampollas, que contienen de 0,1 a 2 g de 25 principio activo por ampolla; -por vía local, tales como lociones, cremas, pomadas, solutos, colirios, etc...

La dosis a administrar diariamente es por lo general de 0,06 a 10 g y preferentemente de 1 a 2 g.

30 La actividad del ATA-Zn sobre el envejecimiento se ha medido mediante la determinación de la cantidad de lipofuscina en determinados tejidos en ratas de edad avanzada (retina, pr�stata e hipocampo).

La actividad antioxidante del N-acetil-taurinato de cinc se ha demostrado usando la línea de células del epitelio pigmentario de la retina ARPE-19, que constituye una herramienta usada normalmente para el estudio de la 35 fisiología y de la patología de la retina. Esta línea celular se ha descrito en:

a) Dunn KC et al., "a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties". Exp Eye Res. 1996;

62: 155-169; b) Alizadeh M et al., "Downregulation of differentiation specific gene expression by oxidative stress in ARPE-19

40 cells". Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 2706-13, c) Hui Cai et al. "Gene expression profile of cultured adult compared to immortalized human retinal pigment epithelium" Molecular Vision 2006, 12: 1-14. d) Ishida BY et al. High density lipoprotein mediated lipid efflux from retinal pigment epithelial cells in culture. Br J Ophtalmol 2006; 90: 616-620.

45 Los ensayos realizados que se presentan a continuación muestran que solamente el N-acetil-taurinato de cinc tiene un efecto sobre la producción del trifosfato de adenosina (ATP) por las células ARPE-19 tratadas con ATA-Zn, expuestas a continuación al agua oxigenada (H2O2).

50 Sin embargo, el cinc solo o la taurina sola no tienen ningún efecto.

Otros ensayos han mostrado que el efecto del N-acetil-taurinato de cinc sobre la producción de ATP por las células ARPE-19 es casi idéntico o incluso mayor que el de las células antioxidantes de referencia, tales como el ácido docosahexanoico (DHA), la lute�na y la zeaxantina. La lute�na y la zeaxantina son pigmentos naturales de la familia

55 de los carotenoides que se concentran en la mácula y que la protegen de los daños causados por la oxidación o por la luz. La lute�na y la zeaxantina son suplementos alimentarios naturales usados en el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad.

A continuación, la invención se va a describir con más detalle para la preparación y los ensayos que siguen a 60 continuación.

PREPARACI�N

Se mezclaron 20,25 g de taurina y 17,5 g de acetato de cinc puro seco y se añadieron 50 g de agua pura. 65 La suspensión resultante se calentó a una temperatura comprendida entre 65 y 75 �C y a esta suspensión se añadieron 45 g de anh�drido acético y a continuación se calentó a 100-105 �C. A continuación se añadieron 100 ml de etanol anhidro a la mezcla de reacción resultante a una temperatura comprendida entre 70 y 75 �C.

5 Por último, se obtuvieron 30 � 3 g del producto esperado en forma de un polvo de color blanco soluble en agua y poco soluble en etanol (rendimiento en peso : 36,25 %).

An�lisis (en porcentajes)

10 ENSAYOS FARMACOL�GICOS

An�lisis: Calculado Encontrado

C: 24,16 22,75

H: 4,05 4,60

N: 7,04 5,73

Zn*: 16,4 16,7

* dosificación de Zn por EDTA

I) Ensayo in vivo

a) Efecto del ATA-Zn sobre la acumulación intracelular de lipofuscina en la retina, la pr�stata y el hipocampo de 15 ratas de edad avanzada.

Ratas Sprague-Dawley albinas macho, de 16 meses de edad, se colocaron en jaulas de plástico convencional, en grupos de 5, con agua y alimento a voluntad. Las condiciones de vida de los animales eran las siguientes: Ciclo de luz día:noche, 12:12 h, temperatura constante de 22 � 2 �C y humedad relativa de un 60 %.

20 Para el tratamiento crónico, se administr� a las ratas el ATA-Zn por vía oral, una vez al día durante 4 semanas, con una dosis de 40 mg/kg (n = 6). Los animales de control recibieron solamente agua (vehículo) con la misma duración (n = 6). 24 horas después del fin del tratamiento, las ratas se anestesiaron con equitesina (2,5 mg/kg, i.p.) y se perfundieron por vía transcardiaca con un 1 % de paraformaldeh�do y un 1,25 % de glutaraldeh�do en un tampón de

25 un cacodilato de sodio al 0,1 % (pH 7,4) obtenido a partir de anh�drido arsenioso y de acetato de potasio.

Las muestras de los tejidos recogidos (retina, pr�stata e hipocampo) se cortaron enseguida con un criostato en trozos pequeños (1 mm3) y se fijaron en una mezcla de formaldeh�do y de glutaraldeh�do en un tampón de cacodilato durante dos horas. A continuación, las muestras se fijaron en tetra�xido de osmio deshidratado en concentración

30 ascendente de acetona y tolueno y finalmente se incluyeron en bloques de resina (resina EPON). Los trozos de tejido tratados de este modo se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia BX-60 de Olympus. La retina, la pr�stata y el hipocampo mostraron una acumulación clara y significativa de lipofuscina.

La fluorescencia en todos los tejidos se cuantific� usando un sistema de análisis de imagen (KS 300, Carl Zeiss). El

35 análisis se realizó mediante la medición de porcentaje de superficie oscurecida por la presencia de fluorescencia y se compar� con un área convencional de 2000 �m2 (fluorescencia de la lipofuscina expresada en % de superficie con respecto a la zona convencional) usando un objetivo con un aumento de X40 y un microscopio con cámara de vídeo digital Vision Sound de Zeiss (aumento total en la pantalla del ordenador de 7500X). Los valores medidos en las superficies en ausencia de fluorescencia de los trozos de tejido se restaron como ruido de fondo de la imagen

40 binaria resultante. El análisis se realizó tomando cinco trozos diferentes por tejido (retina, pr�stata e hipocampo) por animal y eligiendo tres campos diferentes, al azar, para cada pieza. Los resultados expresados como media � desviación estándar y analizados con el ensayo t se representan en las figuras 1, 2 y 3 que son histogramas que expresan la fluorescencia de la lipofuscina (% de superficie) en los tejidos de la retina (Figura 1) de la pr�stata (Figura 2) y del hipocampo (Figura 3) después de la administración de vehículo o de ATA-Zn.

45 La administración crónica del Zn-ATA a una dosis de 40 mg/kg por vía oral produjo una reducción significativa en el porcentaje de la superficie ocupada por la fluorescencia (positivo) de lipofuscina en la retina, la pr�stata y el hipocampo, en las ratas de edad avanzada, en comparación con los animales de control.

50 Este ensayo muestra que el Zn-ATA puede inhibir la acumulación de lipofuscina asociada con el envejecimiento en los tejidos de la retina, el hipocampo y la pr�stata.

II) Ensayos in vitro

55 a) Materiales y métodos

En los ensayos que siguen a continuación, se ha usado la línea de células del epitelio pigmentario de la retina humana ARPE-19.

Para evaluar el papel protector del ATA-Zn, con respecto a un estr�s oxidativo del epitelio de la retina, se ha usado 5 el modelo experimental que sigue a continuación.

Las células ARPE-19 cultivadas en un medio apropiado [medio de mezcla DMEM (medio de Eagle modificado con Dulbecco) y medio de Ham F12] que contiene (un 10 % de suero bovino fetal inactivado por el calor; glutamina 2 mM; 0,1 mM de medio esencial mínimo [referencia ?]; una solución de amino�cidos no esenciales y de sulfato de gentamicina, en microplacas con 96 pocillos, se expusieron a diferentes concentraciones de agua oxigenada (H2O2) que son tóxicas para estas células. Los niveles celulares de ATP se midieron usando el ensayo disponible en el mercado que mide la producción de ATP � ATPLite-M � fabricado por PERKIN ELMER con la ayuda de un lector de multiplacas de PERKIN ELMER Life Sciences, Boston, MA. Este ensayo se basa en el principio de que la producción de ATP depende de la viabilidad celular y del hecho de que la disminución o el aumento de ATP refleja una

15 alteración correspondiente de la viabilidad celular.

El efecto protector del ATA-Zn se ha sometido ensayo tratando las células ARPE-19 con el ATA-Zn y exponiendo las posteriormente al agua oxigenada. Se han usado diferentes tiempos de exposición y diferentes dosis. Del mismo modo se realizaron ensayos comparativos. Los resultados de estos ensayos se indican en las figuras 5 a 9 que son gráficos que proporcionan la producción de ATP, expresados en porcentaje con respecto a la producción de ATP de las células de control (que han recibido solamente el vehículo) en función de las concentraciones de H2O2, de ATA-Zn o de sustancias de comparación.

b) Ensayo 1: determinación de las dosis eficaces del ATA-Zn y de su toxicidad.

25 Las células ARPE-19 se trataron con diferentes concentraciones de ATA-Zn (de 10-3 a10-9 M) disuelto en un vehículo constituido por un medio de cultivo sin suero y que contenía un 0,01 % de DMSO (concentración conocida por que no afecta a la viabilidad celular). La producción de ATP por las células ARPE-19 tratadas de este modo se determin� 24 horas después de la adición de ATA-Zn. Además, se determin� la producción de ATP de las células de control tratadas solamente con el medio de cultivo sin suero y que contenía un 0,01 % de DMSO (vehículo). Los resultados obtenidos, indicados en la figura 4, muestran que las concentraciones bajas de ATA-Zn (10-9 M, 10-8 M y 10-7 M) son capaces de inducir un aumento de la viabilidad celular mientras que las concentraciones más elevadas (10-3 M) son tóxicas para estas células.

35 c) Ensayo 2 : efecto citoprotector anti-estr�s oxidativo

En este ensayo se usaron las concentraciones de ATA-Zn que inducen una producción significativa de ATP por las células ARPE-19, y después de 1,5 horas, se sometió a estas células a un tratamiento con H2O2 a la dosis tóxica de 700 �M. Los resultados obtenidos, recogidos en la figura 5, muestran que el ATA-Zn es capaz de proteger las células de un estr�s oxidativo, solamente a la concentración de 10-8 M mientras que a la concentración de 10-9 M, el ATA-Zn no es eficaz, y que a la concentración de 10-7 M, incluso potencia el efecto tóxico del H2O2.

d) Ensayo 3 : efecto citoprotector del ATA-Zn sobre las células sometidas a un estr�s oxidativo.

45 Las células ARPE-19 se expusieron a diferentes concentraciones de H2O2 (expresadas en �M) en presencia o en ausencia de ATA-Zn a 10-8 M (tratamiento de una hora y media antes de la exposición al H2O2). Los resultados recogidos en la figura 6 muestran que el ATA-Zn es capaz de proteger las células ARPE-19 de un estr�s oxidativo inducido por diferentes concentraciones de H2O2. De hecho, las concentraciones tóxicas de H2O2 no fueron capaces de afectar de manera significativa a la viabilidad celular cuando se trataron previamente con el ATA-Zn.

Los ensayos anteriores muestran que el ATA-Zn puede ejercer un papel terapéutico potencial en el tratamiento de diferentes patologías del epitelio de la retina sometido a un estr�s oxidativo.

e) Ensayo comparativo n� 1: determinación de las dosis eficaces de taurina y de ZnSO4.

55 En este ensayo, se compar� el efecto de la taurina sola o N-acetilada y del sulfato de cinc sobre la proliferaci�n de las células ARPE-19. La taurina se us� en dos concentraciones (2 mM y 10-8 M) y el sulfato de cinc se us� a las concentraciones que siguen a continuación: 30 �M y 10-8 M. Los resultados recogidos sobre la figura 7 muestran que ni el sulfato de cinc ni la taurina a las diferentes concentraciones usadas fueron capaces de inducir un efecto proliferativo significativo sobre las células ARPE-19.

f) Ensayo comparativo n� 2: determinación del efecto citoprotector en medio oxidante.

Con el fin de determinar el efecto antioxidante del sulfato de cinc, de la taurina sola o N-acetilada y del ATA-Zn, se

65 trataron previamente las células ARPE-19 con diferentes concentraciones de ZnSO4, de taurina sola o N-acetilada y del ATA-Zn. A continuación, las células se sometieron durante 24 horas a un tratamiento con agua oxigenada a 700 μM. los resultados obtenidos, que se recogen en la figura 8, confirman la capacidad del ATA-Zn para proteger las células ARPE-19 de un exceso oxidativo. Se observar� que el sulfato de cinc a la concentración de 10-8 M indujo un efecto protector inferior al del ATA-Zn. La taurina y el sulfato de cinc a la concentración de 30 �M no fueron capaces de proteger las células contra el exceso oxidante inducido por el H2O2.

g) Ensayo comparativo n� 3: comparación con los antioxidantes conocidos DHA, lute�na y zeaxantina.

En este ensayo, se compar� el efecto del ATA-Zn con el obtenido con el DHA, la lute�na y la zeaxantina, que se usan comúnmente en los estudios cl�nicos y precl�nicos en particular por sus propiedades antioxidantes y en el

10 tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad. Los resultados de la figura 9 muestran que el ATA-Zn tiene un efecto comparable con el de los antioxidantes conocidos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso del N-acetil-taurinato de cinc para la preparación de medicamentos útiles para prevenir y/o tratar las

enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina. 5
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos útiles para prevenir y/o tratar las enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina debida al envejecimiento.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos útiles para prevenir y/o tratar las 10 enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina debida a un estr�s oxidativo.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de medicamentos útiles para prevenir y/o retrasar la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopat�a diab�tica.

15 5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que el N-acetilo-taurinato est� dihidratado.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de medicamentos para la

administraci�n por vía oral. 20
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de medicamentos en forma de cápsulas de gelatina, sobrecitos, comprimidos o soluciones que contienen de 0,06 a 1 g por dosis unitaria o de 0,6 a 5 g/10 ml de solución.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de medicamentos para la 25 administración por vía parenteral.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, para la preparación de medicamentos en forma de ampollas inyectables que contienen de 0,1 a 2 g por ampolla.

30 10. Composición farmacéutica para uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina, caracterizada por que contiene N-acetil-taurinato de cinc en forma de principio activo en combinación con un excipiente farmac�uticamente aceptable.
11. Composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por que se presenta en

35 forma de cápsulas de gelatina, sobrecitos, comprimidos o soluciones que contienen de 0,06 a 1 g por dosis unitaria o de 0,6 a 5 g/10 ml de solución.
12. Composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada por que se presenta en

forma de ampollas inyectables que contienen de 0,1 a 2 g por ampolla. 40
13. N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con la acumulación de lipofuscina.
14. N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades 45 relacionadas con la acumulación de lipofuscina debida al envejecimiento.
15. N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con la acumulación de lipofuscina debida a un estr�s oxidativo.

50 16. N-acetil-taurinato de cinc para su uso en un método para prevenir y/o retrasar la degeneración macular relacionada con la edad o la retinopat�a diab�tica.