BR112012027900A2 - Anticorpos anti-c5a e métodos para usar os anticorpos - Google Patents

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L. Sheridan Douglas
P. Tamburini Paul
Zhang Yuchun
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Alexion Pharmaceuticals, Inc.
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Abstract

anticorpos anti-c5a e métodos para usar os anticorpos. a presente invenção diz respeito, inter alia, a anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, que ligam a c5a, e ao uso dos anticorpos em métodos para tratar ou prevenir distúrbios associados ao complemento, tais como, mas sem limitações, síndrome urêmica hemolítica atípica, degeneração macular relacionada a idade, artrite reumatóide, sepse, queimadura grave, síndrome antifosfolipídio, asma, nefrite lúpica, síndrome de goodpasture, e doença pulmonar obstrutiva crônica.

Description

ANTICORPOS ANTI-C5A E MÉTODOS PARA USAR OS ANTICORPOS
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001 ]Este pedido reivindica prioridade e o benefício para o pedido de patente provisório U.S. no. de série: 61/330.260, depositado em 30 de abril de 2010, e 61/471.465, depositado em 4 de abril de 2011, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra.
Campo da Invenção
[002]O campo da invenção é medicina, imunologia, biologia molecular e química de proteína.
Antecedentes da Invenção
[003]O sistema complemento age junto com outros sistemas imunológicos do corpo para defender contra intrusão de patógenos celulares e virais. Existem pelo menos 25 proteínas do complemento, que são consideradas uma coleção complexa de cofatores de proteínas e membranas plasmáticas. As proteínas plasmáticas constituem cerca de 10 % das globulinas em soro de vertebrado. Componentes do complemento obtêm suas funções defensivas imunes interagindo em uma série de eventos de divagem enzimática complicada, mas precisa, e de ligação de membrana. A cascata do complemento resultante leva à geração de produtos com funções opsônicas, imunorreguladoras e líticas. Um sumário das atividades biológicas associadas com ativação do complemento é fornecido, por exemplo, em The Merck Manual, 16th Edition.
[004]A cascata do complemento progride através do caminho clássico, do caminho alternativo, ou do caminho de lectina. Esses caminhos compartilham muitos componentes e, embora eles difiram em suas etapas iniciais, eles convergem e compartilham os mesmos componentes do “complemento terminal” (C5 até C9) responsáveis pela ativação e destruição de células alvo.
[005]O caminho clássico (CP) é tipicamente iniciado pelo reconhecimento do
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 4/217
2/210 anticorpo de um sítio antigênico em uma célula alvo, e sua ligação nele. O caminho alternativo (AP) pode ser independente do anticorpo, e pode ser iniciado por certas moléculas nas superfícies do patógeno. Adicionalmente, o caminho de lectina é tipicamente iniciado com ligação de lectina de ligação a manose (MBL) em substratos de alta manose. Esses caminhos convergem no ponto onde o componente do complemento C3 é clivado por uma protease ativa para produzir C3a e C3b. Outros caminhos que ativam ataque do complemento podem agir mais tarde na sequência de eventos levando a vários aspectos de função do complemento.
[006]C3a é uma anafilatoxina. C3b liga a células bacterianas e outras, bem como a certos vírus e complexos imunes, e marca-os para remoção da circulação. (C3b neste papel é conhecido como opsonina). A função opsônica de C3b é no geral considerada a mais importante ação anti-infecciosa do sistema complemento. Pacientes com lesões genéticas que bloqueiam função de C3b são propensos a infecção por uma ampla variedade de organismos patogênicos, enquanto pacientes com lesões posteriores na sequência da cascata do complemento, isto é, pacientes com lesões que bloqueiam funções de C5 são considerados mais propensos somente a infecção de Neisseria, e então somente um pouco mais propensos.
[007]C3b também forma um complexo com outros componentes exclusivos para cada caminho para formar convertase C5 clássica ou alternativa, que diva C5 em C5a e C5b. C3 é assim considerada a proteína central na sequência de reação do complemento, uma vez que é essencial tanto para os caminhos alternativos quanto clássicos. Esta propriedade de C3b é regulada pelo Fator I de protease de soro, que age na C3b para produzir iC3b. Embora ainda funcional como opsonina, iC3b não pode formar uma convertase C5 ativa.
[008]C5 é uma beta globulina de 190 kDa encontrada em soro normal a uma concentração de aproximadamente 75 pg/mL (0,4 pM). C5 é glicosilada, com cerca de 1,5 a 3 porcento de sua massa atribuídos ao carboidrato. C5 maduro é um
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3/210 heterodímero de uma cadeia alfa 115 kDa do aminoácido 999 que é dissulfeto ligado a um cadeia beta 75 kDa do aminoácido 655. C5 é sintetizado como um produto da proteína precursora de cadeia única de um gene de única cópia (Haviland et al. (1991) J Immunol 146:362-368). A sequência de cDNA do transcrito deste gene prediz um precursor pro-C5 secretado de 1658 aminoácidos junto com uma sequência líder do aminoácido 18 (vide, por exemplo, patente U.S. No. 6.355.245).
[009]O precursor pro-C5 é clivado depois dos aminoácidos 655 e 659, para produzira cadeia beta como um fragmento do terminal amino (resíduos dos aminoácidos +1 a 655 da sequência supramencionada) e a cadeia alfa como um fragmento do terminal carboxila (resíduos dos aminoácidos 660 a 1.658 da sequência supramencionada), com quatro aminoácidos (resíduos dos aminoácidos 656-659 da sequência supramencionada) deletados entre os dois.
[010]C5a é clivado a partir de cadeia alfa de C5 tanto por convertase C5 alternativa quanto clássica como um fragmento do terminal amino compreendendo os primeiros 74 aminoácidos de cadeia alfa (isto é, resíduos dos aminoácidos 660-733 da sequência supramencionada). Aproximadamente 20 porcento da massa de 11 kDa de C5a são atribuídos ao carboidrato. O sítio de divagem para ação de convertase é no resíduo do aminoácido 733 da sequência supramencionada, ou imediatamente adjacente a ele. Um composto que ligaria a este sítio de divagem, ou adjacente a ele, teria o potencial para bloquear acesso das enzimas de convertase C5 no sítio de divagem e por meio disso agir como um inibidor do complemento.
[011 ]C5 pode também ser ativado por meios sem ser atividade C5 convertase. Digestão de tripsina limitada (vide, por exemplo, Minta and Man (1997) J Immunol 119:1597-1602 and Wetsel and Kolb (1982) J /mmuno/ 128:2209-2216), trombina, e tratamento ácido (Yamamoto and Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 and Damerau et al. (1989) Molec /mmuno/26:1133-1142) podem também clivarC5 e produzir C5b ativo.
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[012]Clivagem de C5 libera C5a, uma anafilatoxina potente e fator quimiotático, e C5b que através de uma série de interações de proteína leva à formação do complexo terminal do complemento lítico, C5b-9. C5a e C5b-9 também têm célula pleiotrópica que ativa as propriedades, amplificando a liberação de fatores inflamatórios à jusante, tais como enzimas hidrolíticas, espécie de oxigênio reativo, metabólitos do ácido aracdônico e várias citocinas.
[013]C5b combina com C6, C7 e C8 para formar o complexo C5b-8 na superfície da célula alvo. Mediante ligação de diversas moléculas de C9, é formado o complexo de ataque à membrana (MAC, C5b-9, complexo terminal do complementoTCC). Quando números suficientes de MACs inserem nas membranas da célula alvo, as aberturas que elas criam (poros MAC) mediam lise osmótica rápida das células alvo. Concentrações não líticas mais baixas de MACs podem produzir outros efeitos. Em particular, inserção da membrana de pequenos números dos complexos C5b-9 nas células e plaquetas endoteliais pode causar ativação celular deletéria. Em alguns casos, a ativação pode preceder lise celular.
[014]Conforme mencionado anteriormente, C3a e C5a são anafilatoxinas. Estes componentes do complemento ativados podem disparar desgranulação da célula mast, que libera histamina de basófilos e células mast, e outros mediadores de inflamação, resultando em contração do músculo macio, maior permeabilidade vascular, ativação do leucócito, e outros fenômenos inflamatórios incluindo proliferação celular que resulta em hipercelularidade. C5a também funciona como um peptídeo quimiotático que serve para atrair granulócitos proinflamatórios para o sítio de ativação do complemento.
[015]Receptores de C5a são encontrados nas superfícies de células epiteliais bronquiais e alveolares e células do músculo macio bronquial. Receptores de C5a também foram observados nos eosinófilos, células mast, monócitos, neutrófilos e linfócitos ativados.
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Sumário da Invenção
[016]A presente revelação diz respeito, inter alia, à geração pelos inventores de uma série de anticorpos monoclonais humanizados que ligam especificamente a proteína C5a livre (ou seja, C5a que foi proteoliticamente clivado da proteína C5), mas não nos fragmentos C4a livre ou C3a livre da proteína paralog [os anticorpos são, frequentemente, referidos aqui como anticorpos anti-C5a ou anticorpos neopítopos anti-C5a]. Conforme aqui descrito e exemplificado nos exemplos funcionais, os anticorpos anti-C5a gerados exibem uma alta afinidade com C5a livre. Por exemplo, todos os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos ligam a C5a livre com uma Kd que é menor que 1,35 nanomolar. Muitos dos anticorpos ligam a C5a livre (por exemplo, C5a de humano livre) com uma Kd que é menor que 300 picomolares; diversos dos anticorpos ligam a C5a livre com uma Kd que é menor que 100 picomolares. Além do mais, os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos também inibem sinalização mediada por C5a. Propriedades estruturais e funcionais adicionais dos anticorpos aqui descritos são elaboradas em seguida e exemplificadas nos exemplos funcionais.
[017]Os inventores também demonstraram, usando um modelo animal de artrite reumatóide (RA) e um anti-C5a substituto de anticorpo de camundongo com propriedades similares às contrapartes do anticorpo humanizado, a eficácia dos anticorpos anti-C5a no tratamento RA. Também mostrados nos exemplos funcionais estão experimentos demonstrando o efeito terapêutico positivo de um anticorpo anti-C5a humanizado em um modelo animal de neutropenia induzida por C5a de humano.
[018]Dessa maneira, os inventores acreditam que os anticorpos anti-C5a, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, aqui descritos são usados em um hospedeiro de métodos de diagnósticos e terapêuticos relacionados a distúrbios nos quais a sinalização mediada por C5a contribui para a patogênese. Por exemplo, os inventores declaram que os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos são usados para tratar ou prevenir RA e outros distúrbios associados ao complemento incluindo, mas
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6/210 sem limitações: síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), degeneração macular relacionada a idade (AMD), sepse, queimadura (por exemplo, queimadura grave), síndrome antifosfolipídio (APS), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), dor relacionada a inflamação, asma, nefrite lúpica, restrição ao crescimento intrauterino (IUGR), síndrome de HELLP (anemia Hemolítica, enzimas do Fígado Elevado e contagem de Plaqueta Baixa), síndrome de Goodpasture, e doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Distúrbios adicionais que são particularmente acessíveis para tratamento com um anticorpo anti-C5a humanizado, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, são conhecidos na técnica e relatados aqui.
[019]Os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos caracterizam inúmeras vantagens, por exemplo, em relação aos agentes que ligam a C5 de comprimento total ou maduro e inibem sua divagem. Como tais gentes, os anticorpos anti-C5a (e seus fragmentos de ligação de antígeno) aqui descritos podem inibir os efeitos anafilatóxicos à jusante de ativação de C5 mediado através de C5a do fragmento de C5. Ou seja, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem inibir a resposta inflamatória mediada por C5a, que é conhecida para desempenhar uma parte integral na patogênese de distúrbios associados ao complemento tais como, mas sem limitações, sepse, RA, e asma. Entretanto, as a concentração de C5 em humano soro é aproximadamente 0,37 μΜ (Rawal and Pangburn (2001) J Immunol 166(4):2635-2642), o uso de altas concentrações e/ou administração frequente de anticorpos anti-C5 é frequentemente necessário inibir efetivamente C5, e por meio disso inibira resposta inflamatória mediada porC5a, em um humano. Ao contrário de C5, C5a está presente em sangue a concentrações muito mais baixas e é frequentemente restrito às áreas específicas de ativação do complemento local tais como, por exemplo, os pulmões em pacientes com asma, as juntas de pacientes com RA, ou a drusa nos olhos de pacientes com AMD. Assim, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem ser administrados (por exemplo, localmente administrados aos sítios de ativação do complemento) a um
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7/210 humano em uma dose muito maior e/ou menos frequentemente que, por exemplo, um anticorpo anti-C5, e efetivamente fornecer a mesma ou maior inibição de C5a em um humano. A capacidade de administrar uma dose mais baixa do anticorpo anti-C5a, comparada com a dose exigida de um anticorpo anti-C5, também permite vias de distribuição adicionais tais como, por exemplo, administração subcutânea, intramuscular administração, distribuição intrapulmonar, e administração por meio do uso de microesferas biologicamente degradáveis. Uma concentração mais baixa de antígeno C5a versos C5 também favorece uma meia vida maior do anticorpo anti-C5a, comparada com, por exemplo, a meia vida de um anticorpo terapêutico que alveja o complemento terminal, devido a uma menor contribuição de depuração do anticorpo mediada por antígeno.
[020]Além do mais, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem também ser distinguidos dos agentes terapêuticos que inibem o complemento terminal (tais como inibidores de C5) por seu perfil de segurança. Uma consequência notável de inibir componentes do complemento terminal tais como C5, C5b, C6, C7, C8, ou C9 é proteção diminuída pelo sistema imune do hospedeiro contra as bactérias encapsuladas que lisam ordinariamente o complemento terminal- por exemplo, Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. Vide, por exemplo, Haeney et al. (1980) Clin Exp Immunol 40:16-24 and Brodsky (2009) Blood 113(26):6522-6527. Uma vez que os anticorpos anti-C5a inibem a resposta inflamatória mediada por C5a, mas não previnem a formação do complexo terminal do complemento que lisa as bactérias encapsuladas, pacientes que recebem um anticorpo terapêutico anti-C5a aqui descrito não precisarão de uma vacinação protetora, por exemplo, uma vacinação contra Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae.
[021]Dessa maneira, em um aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que liga a C5a livre. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a de
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8/210 humano livre (hC5a; por exemplo, um proteína C5a de humano compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligar a uma forma desarginada de C5a livre, por exemplo, a forma desarginada de C5a de humano compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:2. O anticorpo pode ligara um neopítopo de C5a livre, cujo epítopo não está presente no C5 não clivado ou está presente somente em uma fração menor de C5 não clivado total.
[022]Embora a revelação não seja de maneira nenhuma limitada a nenhuma teoria ou mecanismo de ação particular, em algumas modalidades, o anticorpo antiC5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a livre (por exemplo, hC5a livre) e pode também ligar a uma subpopulação de C5 processado, não clivado (por exemplo, plasma C5) constituindo menos que 10 (por exemplo, menor que 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1,0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou menos que 0,1) % da população total de C5 de comprimento total em uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue ou plasma ou uma amostra compreendendo C5 de comprimento total recombinante), cuja subpopulação é, no todo ou em parte, desnaturada de maneira tal que um neopítopo de C5a de outra forma ocluso, no qual o anticorpo anti-C5a ou fragmento liga, é exposto. Assim, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito, em algumas modalidades, pode ligara C5a livre, mas não a proteína C5 não clivada dos 90 % ou mais da população de C5 nativo não clivado. Em algumas modalidades, a subpopulação de C5 parcial ou completamente desnaturada supradescrita é inativa ou tem atividade reduzida (por exemplo, menos que 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 % da atividade de proteína C5 de comprimento total completamente funcional) em qualquer número de ensaios adequados usados para testar atividade C5, por exemplo, um ensaio hemolítico ou um ensaio CH50eq (vide a seguir). Métodos adequados para testar a atividade da menor subpopulação nos quais um anticorpo anti-C5a aqui descrito, em
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9/210 algumas modalidades, pode ligar são conhecidos na técnica e aqui descritos.
[023]Em algumas modalidades, nenhum dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos inibe atividade C5 em um ensaio de hemólise in vitro ou um ensaio CH50eq in vitro mesmo na presença de pelo menos, igual, ou maior que um excesso 5 vezes (por exemplo, 5,6, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200) do anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno com C5 não clivado (por exemplo, C5 nativo não clivado). Em algumas modalidades, nenhum dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos inibe atividade C5 em um ensaio de hemólise in vitro ou um ensaio CH50eq in vitro mesmo na presença entre cerca de um 5 vezes a 200 vezes o excesso (por exemplo, entre cerca de 5 vezes e 100 vezes, entre cerca de 10 vezes e 100 vezes, entre cerca de 20 vezes e 100 vezes, ou entre cerca de 10 vezes e 150 vezes) do anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno com C5 nativo não clivado. Inibição, por exemplo, uma vez que pertence a atividade C5, inclui pelo menos 5 % de diminuição (por exemplo, pelo menos um 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ou 60) na atividade de C5 nativo não clivado em, por exemplo, um ensaio hemolítico ou ensaio CH50eq comparado com o efeito de um anticorpo controle (ou fragmento de ligação ao antígeno deste) em condições similares e a uma concentração equimolar. Inibição substancial, da maneira aqui usada, refere-se a inibição de uma dada atividade (por exemplo, da atividade C5) em pelo menos 40 %. (por exemplo, pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) Em algumas modalidades, o C5 é obtido do plasma (por exemplo, purificado de plasma ou presente nele, por exemplo, plasma de humano).
[024]Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a uma proteína C5a (por exemplo, um proteína C5a de humano) com uma Kd que é menor que 2 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu
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10/210 fragmento de ligação ao antígeno liga a uma proteína C5a com uma Kd que é menor que 1 nM [também referido aqui como “afinidade subnanomolar”].
[025]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a livre com uma afinidade subnanomolar [por exemplo, uma Kd menor ou igual a 9,9 x 1O’10 (por exemplo, menor ou igual a 9 x 10’10, 8x10’ 10, 7 x 10'1 °, 6 x 10'10, 5 x 10'10, 4 x 10'10, 3 x 10'10, 2,5 x 10'10, 2 x 10'10, 1 x 10'10, 8,0 x W11, 7,0 x W11, 6,0 x W11, 5,0 x W11, 4,0 x W11, ou 3,0 x 10'11) M] na presença de um excesso molar de C5 nativo não clivado (por exemplo, C5 purificado e/ou recombinante). Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos têm pelo menos uma afinidade 100 vezes (por exemplo, pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 ou 10.000) maior (por exemplo, representado por seu KD) com C5a livre do que com proteína C5 nativo não clivado.
[026]Assim, em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que (a) liga a C5a livre (por exemplo, hC5a) com uma afinidade subnanomolar e (b) liga a C5a livre com uma afinidade que é pelo menos 100 vezes (por exemplo, pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 ou 10.000) maior que sua afinidade correspondente com a proteína C5 nativo não clivado. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito, em algumas modalidades, pode ligar a hC5a livre com uma Kd de 100 nM e a pelo menos uma subpopulação de proteína C5 de humano não clivada com uma Kd que é pelo menos 100 vezes maior (por exemplo, pelo menos 10 nM).
[027]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que liga a um polipeptídeo de C5a livre de
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11/210 humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga ao polipeptídeo de C5a de humano com uma Kd que é menor que 1,35 x 10-9 M na presença de um excesso molar (por exemplo, um 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 vezes o excesso molar) de C5 de humano nativo não clivado com relação ao C5a de humano (hC5a). Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a um polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (por exemplo, qualquer um dos Kd’s subnanomolares aqui citados) na presença de pelo menos, ou maior que, um excesso molar 2 vezes, mas não maior que ou menor que um 500 (por exemplo, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, ou 15) vezes o excesso molar de C5 nativo não clivado com relação a hC5a livre. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a um polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (por exemplo, qualquer um dos Kd’s subnanomolar relatados aqui) na presença entre 2 vezes e 20 vezes o excesso molar de C5 nativo não clivado com relação a hC5a livre. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a um polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (por exemplo, qualquer um dos Kd’s subnanomolar relatados aqui) na presença entre 10 vezes e 20 vezes o excesso molar de C5 nativo não clivado com relação a hC5a livre. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a um polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (por exemplo, qualquer um dos Kd’s subnanomolar relatados aqui) na presença entre 5 vezes e 15 vezes o excesso molar de C5 nativo não clivado com relação a hC5a livre. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a um polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (por exemplo, qualquer um dos Kd’s subnanomolar aqui citados) na presença de pelo menos 2 vezes, mas não mais que 20 vezes o excesso molar de C5 nativo não clivado
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12/210 com relação a hC5a livre. Tais medições podem ser medições in vitro usando, por exemplo, técnicas de determinação de afinidade padrão, muitas das quais são relatadas e/ou descritas aqui.
[028]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que liga a um polipeptídeo de C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga ao polipeptídeo de C5a de humano com uma Kd que é menor que 1,35 x 10'9 M e em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno não inibe substancialmente, comparado com uma quantidade equimolar de um anticorpo controle ou fragmento de ligação ao antígeno deste, atividade C5 mesmo na presença menor que, ou igual a, 10 vezes o excesso molar do anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno em C5 nativo não clivado.
[029]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a de humano livre e é reativo cruzado com C5a livre de pelo menos uma espécie de mamífero não humano. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a (ou fragmento de ligação ao antígeno deste) liga a C5a livre de humano (por exemplo, com afinidade subnanomolar) e também liga a C5a livre de um primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo, macaco raso, macaco, babuíno, chimpanzé, orangotango, ou gorila), um roedor (por exemplo, camundongo, rato, hamster, porquinho-da-índia, ou coelho), vaca, cabra, burro, porco, cão, gato, ou cavalo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito liga a hC5a livre com uma Kd menor ou igual a 9,9 x 10’1° (por exemplo, menor ou igual a 9 x 10-10, 8 x 10’1°, 7 x 10-10, 6x10’ 10, 5 x 10’1 °, 4 x 1010, 3 x 1010, 2,5 x 10’10, 2 x10’1°, 1 x 1O’10, 8,0 x IO’11, 7,0 x 10’11, 6,0 x 10’11, 5,0 x 10’11, 4,0 x 10’11, ou 3,0 x 10’11) M e também liga a C5a livre de
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13/210 macaco cinomolgo (ou uma espécie outra de primata não humano), em que a afinidade (por exemplo, representada por seu KD) para C5a de humano não é mais que 500 (por exemplo, não mais que 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 475) vezes maior que a afinidade com macaco cinomolgo (ou outra espécie de primata não humano) C5a. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a liga a hC5a livre com uma afinidade que não é mais que 50 vezes maior que a afinidade correspondente ao anticorpo para C5a de primata não humano (por exemplo, uma Kd para hC5a livre de 100 nM e uma Kd para C5a de primata não humano de não mais que 5 nM). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito liga a hC5a livre com uma Kd menor ou igual a 9,9 x 10’10 (por exemplo, menor ou igual a 9 x 10’10, 8x10’ 10, 7 x 10’1 °, 6 x 1010, 5 x IO’10, 4 x 1010, 3 x 1010, 2,5 x 1010, 2 x 1010, 1 x 1010, 8,0 x 10’11, 7,0 x 10’11, 6,0 x 10’11, 5,0 x 1011, 4,0 x 10’11, ou 3,0 x 10’11) M e também liga a C5a de um roedor (por exemplo, camundongo, rato, ou coelho), em que a afinidade (por exemplo, representada por seu KD) para C5a de humano não é mais que 1,000 (por exemplo, não mais que 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 975) vezes maior que a afinidade com roedor C5a. Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos ligam com afinidade subnanomolar tanto a C5a de humano quanto a C5a de um mamífero não humano (por exemplo, um roedor ou um primata não humano tal como macaco cinomolgo). Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em algumas modalidades, pode ligar a C5a de humano e C5a de primata não humano com igual afinidade (por exemplo, uma Kd equivalente).
[030]Por exemplo, a revelação caracteriza um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que liga a C5a de humano livre com afinidade subnanomolar [por exemplo, uma Kd menor ou igual a 9,9 x 10’10 (por exemplo, menor ou igual a 9x10’
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14/210 10, 8 x 10’10, 7 x ΙΟ’10, 6 x 1010, 5 x 1010, 4 x 10’10, 3 x 1O’10, 2,5 x 1010, 2 x 1010, 1 x 10-10, 8,0 x 10’11, 7,0 x 10’11, 6,0 x 10’11, 5,0 x 10’11, 4,0 x 10’11, ou 3,0 x 10’11) M] e é reativo cruzado com C5a livre de macaco cinomolgo (ou outro primata não humano), o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a de macaco cinomolgo (ou outro primata não humano) com uma Kd menor que 10 x 10-9, 9 x 10-9, 8 x 10-9, 7 x 10'9, 6 x 10'9, 5 x 10'9, 4 x 10'9, 3 x 10'9, 2x10'9, 1 x 10'9, 9,9 x 10'1° (por exemplo, menos que 9 x 10'1°, 8 x 10'1°, 7 x 10'1°, 6 x 10'1°, 5 x 10'1°, 4 x 10'1°, 3 x 10'1°, 2,5 x 10'1°, 2 x 10'10, 1 x 10'1°, ou 8,0 x 10'11) M], em que a afinidade com C5a de humano não é mais que 500 (por exemplo, não mais que 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 475) vezes maior que a afinidade com C5a de macaco cinomolgo (ou primata não humano) (por exemplo, Kd para C5a de humano de 100 nM e uma Kd para C5a de primata não humano de não mais que 50 nM). Métodos adequados para determinar a afinidade de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno para um dado antígeno são conhecidos na técnica e descritos e exemplificado aqui.
[031 ]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a reativo cruzado ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe funcionalmente tanto hC5a livre quanto o C5a de mamífero não humano no qual ele liga. Por exemplo, um anticorpo inibe em pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % da ativação de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno:C5a) e inibe em pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % da ativação de neutrófilo dependente de C5a de mamífero não humano (os neutrófilos sendo da mesma espécie do C5a de mamífero não humano nos quais o anticorpo se liga) a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno:C5a).
[032]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que liga a um polipeptídeo hC5a livre com a
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15/210 sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga ao polipeptídeo de C5a de humano com uma Kd que é menor que 1,35 x 10-9 M e em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga tanto a hC5a quanto a C5a de uma espécie de mamífero não humano. A espécie de mamífero não humano pode ser, por exemplo, um primata não humano tais como macaco cinomolgo, macaco reso, ou babuíno. Em algumas modalidades, a espécie de mamífero não humano é um roedor tais como um camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia, gerbo, ou hamster. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a hC5a com uma afinidade não mais que 100 vezes maior que a afinidade correspondente a C5a da espécie de mamífero não humano. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno inibe em pelo menos 50 % a ativação de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno: C5a).
[033]Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a livre de um primata não humano (por exemplo, um macaco cinomolgo ou macaco reso), a proteína C5a livre com uma sequência de aminoácidos compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:179 ou SEQ ID NO:180.
[034]Conforme descrito nos exemplos funcionais, o inventores também descobriram um anticorpo anti-C5a bivalente, BNJ383, que liga a C5a livre (neste caso C5a de humano) com alta afinidade e, com uma afinidade muito menor, C5 de humano não clivado (hC5), em que, em uma composição (por exemplo, uma solução aquosa) em condições fisiológicas em equilíbrio, e na presença de um excesso molar de C5 de humano não clivado comparado com a quantidade molar dos sítios de ligação de antígeno dos anticorpos, pelo menos 95 % da pluralidade dos anticorpos cada qual liga não mais que uma molécula de hC5. O segundo sítio de ligação ao antígeno dos pelo menos 95 % da pluralidade dos anticorpos permanece (por exemplo,
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16/210 substancialmente disponível) para ligar a C5a livre. Embora a revelação não esteja ligada a nenhuma teoria ou mecanismo de ação particular, os inventores acreditam que o anticorpo anti-C5a bivalente liga a C5 não clivado de uma tal maneira (por exemplo, a um epítopo como esse) que o impedimento estérico evita ou pelo menos inibe substancialmente, a ligação do segundo sítio de ligação ao antígeno do anticorpo antiC5a a uma segunda proteína C5 não clivado, embora o anticorpo possa facilmente acomodar a ligação a duais moléculas de hC5a. Assim, o anticorpo, mesmo em um excesso molar de C5 não clivado, retém a capacidade de ligar a C5a livre com alta afinidade e retém por meio disso, mesmo neste excesso molar, a capacidade de inibir a atividade proinflamatória de C5a.
[035]Versados na técnica perceberão fácil e rapidamente que o benefício terapêutico inumerável de um anticorpo anti-C5a como esse. Por exemplo, conforme notado anteriormente, a concentração de C5 circulante em soro de humano é muito alta. Assim, quando introduzido em um mamífero, um anticorpo anti-C5a que pode ligar simultaneamente a duas moléculas de C5 não clivado, será rapidamente inativado no excesso molar de C5 e então não poderá mais ligar a C5a livre no evento de ativação do complemento. E, como com anticorpos anti-C5, uso de altas concentrações e/ou administração frequente deste tipo de anticorpo anti-C5a será necessário para inibir efetivamente C5a, no evento que é produzido, ao contrário, o anticorpo antiC5a aqui descrito que retém a capacidade de ligar a C5a livre, mesmo em um excesso molar de C5 não clivado, pode assim ser administrado a um humano a uma dose muito maior e/ou menos frequentemente que, por exemplo, um anticorpo anti-C5 e efetivamente fornecer a mesma ou maior inibição de C5a no humano.
[036]Dessa maneira, ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que, em uma solução aquosa
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17/210 compreendendo: (i) uma pluralidade dos ditos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 comparado com a quantidade molar dos sítios de ligação de antígeno, em equilíbrio e em condições fisiológicas, pelo menos 95 (por exemplo, pelo menos 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, ou 97,7) % da dita pluralidade dos anticorpos ligam não mais que uma molécula de hC5, isto é, não mais que 5 % dos anticorpos são ligação de duas moléculas de hC5 em equilíbrio.
[037]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que, em equilíbrio e em condições fisiológicas, em uma solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos ditos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 comparado com a quantidade molar dos sítios de ligação de antígeno (ou anticorpos), pelo menos 95 % da dita pluralidade dos anticorpos retêm pelo menos um sítio de ligação ao antígeno disponível para ligar hC5a livre.
[038]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que, em equilíbrio e em condições fisiológicas, em uma solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos ditos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 comparado com a quantidade molar dos sítios de ligação de antígeno (ou anticorpos), cada sítio de ligação ao antígeno de não mais que 5 % da dita pluralidade dos anticorpos são ligados a uma molécula de hC5.
[039]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o excesso molar é pelo menos um duas vezes (por exemplo, pelo menos um 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, ou mesmo 10 vezes) o excesso molar.
[040]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos isolados aqui
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18/210 descritos, a condição fisiológica é NaH2PO4 3,9 mM, Na2HPO4 6,1 mM, e NaCI 150 mM, a pH7,0.
[041 ]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a hC5a livre com uma Koque é menor que 1,35 x 10-9 M. Em algumas modalidades, cada sítio de ligação ao antígeno pode independentemente ligara hC5a livre com uma afinidade subnanomolar (vide anteriormente).
[042]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o anticorpo isolado compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ IDNO:45.
[043]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos, o anticorpo isolado compreende: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; (iv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47.
[044]Em algumas modalidades, o anticorpo isolado pode compreender qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia leve aqui descritos, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve aqui descritas (por exemplo, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve humanizada), qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada aqui descritos, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada aqui
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19/210 descritas (por exemplo, qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada humanizada), ou qualquer uma de suas combinações adequadas. Vide, por exemplo, Tabelas 1 ou 2.
[045]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a), em que o método inclui administrar ao humano qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos em uma quantidade suficiente para tratar o distúrbio associado ao complemento.
[046]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento C5a, em que o método compreende administrar ao humano pelo menos 0,6 (por exemplo, pelo menos 0,7, 0,8, 0,9, ou 1) mg de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos por kg de peso corpóreo do humano para ligar e sequestrar por meio disso parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por mais que, igual, ou pelo menos por 12 dias (por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23, 24, ou 25).
[047]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento C5a, em que o método compreende administrar ao humano pelo menos 10 mg de qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos por kg de peso corpóreo do humano para ligar e sequestrar por meio disso parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 24 dias.
[048]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento C5a, em que o método compreende administrar ao humano qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos (ou por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos) em uma quantidade suficiente (a) para obter valores do Cmax molar iguais ou menores que a concentração molar fisiológica de hC5
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20/210 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis patofisiológicos de C5a livre.
[049]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, um anticorpo é administrado a um sujeito (por exemplo, um humano) em uma quantidade suficiente para obter um valor do Cmax molar que é substancialmente menor que a concentração molar fisiológica de C5 não clivado (por exemplo, hC5).
[050]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o valor do Cmax é, por exemplo, não mais que 80 nM (ou aproximadamente 0,6 mg/kg). Em algumas modalidades, os níveis do Cmax são não mais que 70 (por exemplo, 60, 50, 40, 30, ou 20) nM. Em algumas modalidades, o valor do Cmax não é mais que aproximadamente 100 nM. Em algumas modalidades, o valor do Cmax não é mais que 200 nM. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o valor do Cmax é, por exemplo, não mais que 400 nM (ou aproximadamente 3 mg/kg). Em algumas modalidades, o valor do Cmax não é mais que 400 (por exemplo, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10) nM.
[051 ]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento C5a, em que o método compreende administrar ao humano qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos (ou por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos isolados aqui descritos) em uma quantidade suficiente (a) para obter valores do Cmax molar iguais, menores que, ou substancialmente menores que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 12 dias (por exemplo, pelo menos 24 dias). Valores do Cmax adequados são descritos anteriormente.
[052]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o distúrbio associado ao complemento C5a pode ser, por exemplo, um selecionado do grupo que consiste em sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS),
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21/210 choque séptico, síndrome antifosfolipídio, síndrome antifosfolipídio catastrófica, coagulação intravascular disseminada, nefrite lúpica, síndrome de Goodpasture, queimadura ou queimadura grave, asma, síndrome de HELLP (anemia Hemolítica, enzimas do Fígado Elevado e contagem de Plaqueta Baixa), dor induzida por inflamação, neutropenia mediada porCõa, degeneração macular relacionada a idade (AMD), doença pulmonar obstrutiva crônica, e artrite reumatóide.
[053]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de C5 de humano (hC5) e em condições fisiológicas, não mais que 5 % dos anticorpos da pluralidade em equilíbrio compreendem dois sítios de ligação de antígeno simultaneamente ligados a hC5 não clivado.
[054]Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui descritas, a porcentagem da pluralidade em qualquer configuração de ligação particular pode ser avaliada usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em algumas modalidades, as condições fisiológicas nas quais os anticorpos são avaliados compreendem as seguintes condições: incubação de hC5 (por exemplo, um excesso molar (por exemplo, um excesso molar 2 vezes) de hC5) com a pluralidade dos anticorpos a 4 °C por 84 horas em uma solução aquosa compreendendo NahtePO 3,9 mM, Na2HPO46,1 mM, e NaC1150 mM, a pH7,0. Para o propósito desta revelação, a solução obtida a 84 horas a 4 °C é considerada em equilíbrio.
[055]Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui descritas, não mais que 5 % dos anticorpos da pluralidade compreendem dois sítios de ligação de antígeno simultaneamente ligados a hC5 não clivado em condições fisiológicas e ao anticorpo na presença de pelo menos um excesso molar 2 vezes de hC5.
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[056]Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui descritas, não mais que 5 % dos anticorpos da pluralidade compreendem dois sítios de ligação de antígeno simultaneamente ligados a moléculas de hC5 não clivado conforme avaliado usando HPLC após a incubação da pluralidade dos anticorpos com hC5 a 4 °C por 84 horas em uma solução aquosa compreendendo NaH2PO4 3,9 mM, Na2HPO46,1 mM, e NaC1150 mM, a pH7,0.
[057]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que não mais que 5 % dos anticorpos da pluralidade compreendem dois sítios de ligação de antígeno simultaneamente ligados a hC5 não clivado conforme avaliado (por exemplo, usando HPLC) após a incubação da pluralidade dos anticorpos com hC5 a 4 °C por 84 horas em uma solução aquosa compreendendo NaH2PO43,9 mM, Na2HPO46,1 mM, e NaC1150 mM, a pH7,0.
[058]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno e um segundo sítio de ligação ao antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente ao polipeptídeo hC5a livre com uma Kd que é menor que 1,35 x 10'9 M, e em que, na presença de C5 de humano (hC5) e conforme avaliado (por exemplo, usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)) em condições fisiológicas, os dois sítios de ligação de antígeno de pelo menos 95 % da pluralidade dos anticorpos são ocupados por hC5 não clivado nas seguintes configurações: (i) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado e o segundo sítio de ligação ao antígeno não é ligado; ou (ii) o primeiro
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23/210 sítio de ligação ao antígeno não é ligado e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado.
[059]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, cada anticorpo da pluralidade compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de C5 de humano (hC5) e conforme avaliado (por exemplo, usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)) em condições fisiológicas, pelo menos 95 % dos anticorpos da pluralidade compreendem pelo menos um sítio de ligação ao antígeno que pode ligara hC5a livre.
[060]Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui descritas, a pluralidade dos anticorpos é avaliada na presença de pelo menos um excesso molar 2 vezes de hC5:anticorpo. Em algumas modalidades de qualquer uma das composições aqui descritas, a pluralidade dos anticorpos é avaliada na presença de pelo menos um excesso molar 2 vezes de sítios de ligação hC5:antígeno.
[061]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que o anticorpo liga a C5a livre ou C5 não clivado, e em que um dos sítios de ligação de antígeno do anticorpo permanece disponível para ligar C5a livre na presença de um excesso molar (por exemplo, pelo menos ou maior que um excesso molar 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, ou mesmo um 20 vezes) de C5 não clivado.
[062]Em algumas modalidades, os sítios de ligação de antígeno têm a mesma especificidade (por exemplo, as CDRs de cada qual os dois sítios de ligação de antígeno compartilham sequências de aminoácidos idênticas). Em algumas modalidades, C5a livre é C5a de humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é reativo cruzado entre C5a de humano e C5a de uma espécie de mamífero não humano. O anticorpo, em algumas modalidades, pode ligar a C5a livre com uma afinidade subnanomolar.
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Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma afinidade com C5a que é pelo menos 100 vezes maior que sua afinidade correspondente a C5 não clivado.
[063]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno independentemente liga a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, em qualquer concentração de hC5 não clivado (por exemplo, em um excesso molar de hC5 não clivado com relação a hC5a), pelo menos um dos sítios de ligação de antígeno do anticorpo permanece disponível para ligar a hC5a livre (por exemplo, em condições fisiológicas humanas, por exemplo, em sangue ou soro de humano).
[064]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, a uma razão molar de 1:1 (anticorpo:hC5), não maior que, ou menor que, 5 (por exemplo, não maior que, ou menor que 4,9, 4,8,
4.7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9,
2.8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,3, 1,1, ou 1) % dos anticorpos da pluralidade compreendem dois sítios de ligação de antígeno simultaneamente ligados a hC5 não clivado. Em algumas modalidades, cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a hC5a livre com uma Kd que é menor que 1,35 x 10'9 M (ou, por exemplo, com afinidade subnanomolar).
[065]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5
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25/210 não clivado, os anticorpos da pluralidade podem ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por mais que, igual, ou pelo menos por 12 dias (por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) quando administrados a um humano em doses de 1 mg/kg ou maiores.
[066]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5 não clivado, os anticorpos da pluralidade podem ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por mais que, igual, ou pelo menos por 12 dias (por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25) quando administrados a um humano em doses de 10 mg/kg ou maiores.
[067]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5 não clivado, os anticorpos da pluralidade ligam e sequestram parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por mais que, igual, ou pelo menos por 12 dias (por exemplo, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, ou 25) quando administrados em doses obtendo valores Cmax molar substancialmente menores do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado.
[068]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou
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C5 de humano não clivado (hC5), e em que, na presença de níveis fisiológicos de hC5 não clivado, os anticorpos da pluralidade podem ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis patofisiológicos de C5a livre quando administrados em doses obtendo valores do Cmax molar substancialmente menores do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado.
[069]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno e um segundo sítio de ligação ao antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, quando ambos sítios de ligação de antígeno são completamente ocupados (e, por exemplo, em condições fisiológicas humanas, por exemplo, em sangue ou soro de humano), as configurações de ligação seguintes são possíveis: (i) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado; (ii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre; ou (iii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre.
[070]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno e um segundo sítio de ligação ao antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a hC5a livre com uma Kd que é menor que 1,35 x 10'9 M (ou, por exemplo, com afinidade subnanomolar), e em que, em uma solução fisiológica contendo uma pluralidade dos anticorpos, pelo menos 95 % dos anticorpos são nas seguintes configurações: (i) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado; (ii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre; (iii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno
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27/210 liga hC5 não clivado e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5a livre; (iv) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado e o segundo sítio de ligação ao antígeno não é ligado; (v) o primeiro sítio de ligação ao antígeno liga hC5a e o segundo sítio de ligação ao antígeno não é ligado; (vi) o primeiro sítio de ligação ao antígeno não é ligado e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5 não clivado; (vii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno não é ligado e o segundo sítio de ligação ao antígeno liga hC5a; e (viii) o primeiro sítio de ligação ao antígeno não é ligado e o segundo sítio de ligação ao antígeno não é ligado.
[071 ]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação de antígeno, em que cada sítio de ligação ao antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, em um excesso molar de hC5 não clivado com relação a hC5a, o anticorpo inibe em pelo menos 50 % a ativação de neutrófilo de humano dependente de hC5a a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno: hC5a).
[072]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos aqui descritos, as configurações são possíveis em condições fisiológicas humanas com, proteínas C5a e C5 de humano nativo, completamente dobradas.
[073]Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos aqui descritos, o anticorpo liga a hC5a livre com uma Kd que é menor que 1,35 x 10’9 M (ou, por exemplo, com afinidade subnanomolar).
[074]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo que (a) liga a C5a livre (por exemplo, hC5a) com uma afinidade subnanomolar e (b) liga a C5a livre com uma afinidade que é pelo menos 100 (por exemplo, pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 ou 10.000) vezes maior que sua afinidade correspondente com proteína C5 não clivado. Em uma composição fisiológica compreendendo uma pluralidade dos anticorpos, para pelo
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28/210 menos 95 % dos anticorpos, somente um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo liga a proteína C5 não clivado, ao passo que o segundo sítio de ligação ao antígeno permanece disponível para ligar a C5a livre. (O hC5a pode ter a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1).
[075]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento C5a, o método compreendendo administrar ao humano uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que pelo menos 1 mg dos anticorpos por kg de peso corpóreo do humano é administrado ao humano, e em que a administração dos anticorpos é efetiva para ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 12 dias.
[076]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a), o método compreendendo administrarao humano uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que pelo menos 10 mg dos anticorpos por kg de peso corpóreo do humano é administrado ao humano, e em que a administração dos anticorpos é efetiva para ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 24 dias.
[077]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a), o método compreendendo administrar ao
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29/210 humano uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) obter valores do Cmax molar substancialmente menores do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 12 dias.
[078]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a), o método compreendendo administrarão humano uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) obter valores do Cmax molar substancialmente menores do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 24 dias.
[079]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a), o método compreendendo administrarão humano uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos isolados, em que cada anticorpo da pluralidade compreende dois sítios de ligação de antígeno, em que cada qual dos sítios de ligação de antígeno pode ligar independentemente a C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), em que os anticorpos são administrados a uma dose suficiente para: (a) obter valores do Cmax molar
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30/210 substancialmente menores do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis patofisiológicos de C5a livre.
[080]Entende-se que qualquer uma das composições (por exemplo, compreendendo uma pluralidade de anticorpos) ou anticorpos isolados (por exemplo, que retêm, na presença de C5 ou excesso molar de C5, um braço de Fab livre que pode ligar a C5a livre) aqui descritos podem ser: (a) formulados como composições farmacêuticas de acordo com a revelação, (b) incluídos em estojos terapêuticos (aqui descritos), ou (c) incluídos nas seringas pré-cheias aqui descritas.
[081]Conforme descrito nos exemplos funcionais fornecidos aqui, os inventores também descobriram um anticorpo, BNJ383 (vide a seguir), que não somente liga com alta afinidade (afinidade subnanomolar) a hC5a livre, mas em concentrações em excesso de C5 não clivado também inibem a formação do complexo terminal do complemento (TCC) em uma maneira dependente da dose. Mesmo a concentrações do anticorpo anti-C5a em 6,5 vezes maior que o excesso de C5, entretanto, a inibição de TCC não é completa. Embora a revelação não seja por nenhum meio limitada por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, o anticorpo pode inibir formação de TCC ligando a pelo menos uma fração de C5 não clivado impedindo sua divagem e/ou de outra forma impedindo a associação com êxito de C5 com componentes de TCC adicionais. Os inventores perceberam que um esse é usado para tratar distúrbios associados ao complemento, por exemplo, nos quais C5a desempenha um papel significativo e o TCC contendo C5b pode desempenhar um papel menos substancial. Tais distúrbios podem incluir, por exemplo, sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), choque séptico, síndrome antifosfolipídio, síndrome antifosfolipídio catastrófica, coagulação intravascular disseminada, nefrite lúpica, síndrome de Goodpasture, queimadura ou queimadura grave, asma, síndrome de HELLP (anemia Hemolítica, enzimas do Fígado Elevado e contagem de Plaqueta Baixa), dor induzida por
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31/210 inflamação, neutropenia mediada por C5a, degeneração macular relacionada a idade (AMD), doença pulmonar obstrutiva crônica, e artrite reumatóide.
[082]Os inventores também perceberam que o uso de um anticorpo anti-C5a como esse para tratar essas condições, entre outros, pode fornecer um mesmo perfil de segurança mais benéfico comparado com o uso de medicamentos inibitórios do complemento terminal. Conforme notado anteriormente, uma consequência notável de inibir componentes do complemento terminal tais como C5, C5b, C6, C7, C8, ou C9 é proteção diminuída pelo sistema imune do hospedeiro contra as bactérias encapsuladas que lisam ordinariamente o complemento terminal - por exemplo, Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. Uma vez que os anticorpos anti-C5a descritos nesta seção inibem a resposta inflamatória mediada por C5a, mas não inibem completamente a formação do complexo terminal do complemento que lisa as bactérias encapsuladas, pacientes que recebem um anticorpo terapêutico anti-C5a aqui descrito podem não precisar de uma vacinação protetora, por exemplo, um vacinação contra Neisseria meningitides e Neisseria gonorrhoeae. Inibição parcial do TCC, embora não anulando completamente a resposta antimicrobiana do complemento terminal, pode de fato reduzir a inflamação induzida por TCC como lesão do tecido. Acredita-se que a inibição do TCC parcial, em combinação com inibição de C5a, torne o anticorpo anti-C5a um mesmo composto antiinflamatório mais potente.
[083]Dessa maneira, em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que liga a C5a livre, em que o C5a livre é C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, em que o anticorpo inibe a ligação de C5a no receptor de C5a, e em que o anticorpo parcialmente inibe a formação do complexo terminal do complemento (TCC). Inibição parcial por um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode ser, por exemplo, uma atividade do complemento ou seja, na presença do anticorpo, até, ou não mais que, 80 (por exemplo, 75, 70, 65, 60, 55,
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50, 45, 40, 35, 30, ou 25) % da atividade do complemento na ausência do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a C5a livre (por exemplo, hC5a livre) com uma afinidade subnanomolar. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno tem uma afinidade com C5a livre que é pelo menos 100 vezes maior que a afinidade correspondente ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno para C5 não clivado. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe em pelo menos 50 % a formação de TCC a concentrações que excedem 200 (por exemplo, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ou 400 ou mais) pg/mL medido usando um ensaio CH50eq. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe em pelo menos 50 % a ativação do caminho do complemento clássica a concentrações que excedem 200 (por exemplo, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, ou 400 ou mais) pg/mL medido usando o Estojo do Complemento do Caminho Clássico Wieslab® conforme descrito nos exemplos funcionais.
[084]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar um humano que sofre de um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio associado ao complemento C5a ou um distúrbio inflamatório associado ao complemento). O método inclui administrarao humano uma quantidade efetiva de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que inibe a ligação de C5a no receptor de C5a, e em que o anticorpo parcialmente inibe a formação do complexo terminal do complemento (TCC). Vide anteriormente. O distúrbio pode ser qualquer um daqueles conhecidos na técnica ou aqui descritos.
[085]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que liga a um polipeptídeo de C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, mas não liga à
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33/210 cadeia alfa de C5 nativo não clivado, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga ao polipeptídeo de C5a de humano com uma Kd que é menor que 1,35x10’9 M.
[086]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que liga a um polipeptídeo de C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, mas não liga à cadeia alfa de C5 nativo não clivado, em que o anticorpo inibe em pelo menos 50 % a ativação de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno:C5a). Em algumas modalidades, o anticorpo inibe em pelo menos 50 % a migração de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano em um ensaio no qual 0,4 nM de anticorpo é usado para inibira atividade de ativação de neutrófilo de 2 nM de C5a de humano conforme descrito no exemplo 5. Em algumas modalidades, o anticorpo não compreende 3 pareamentos de CDR exemplares representados na tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo não é BNJ371.
[087]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a um polipeptídeo de C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:2.
[088]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo: uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22.
[089]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo: uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos
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34/210 representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:38; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22.
[090]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:29; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:30.
[091 ]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:30.
[092]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47.
[093]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:36.
[094]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada
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35/210 compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:33.
[095]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27.
[096]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:36 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33.
[097]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:17.
[098]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27 ou SEQ ID NO:25.
[099]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:19 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27.
[0100]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve
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36/210 compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:25.
[0101]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 ou SEQ ID NO:40.
[0102]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27 ou SEQ IDNO:33.
[0103]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27.
[0104]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:40 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33.
[0105]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33.
[0106]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de
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37/210 ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:49.
[0107]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:19 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45.
[0108]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:44.
[0109]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49.
[0110]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:36.
[0111]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45 ou SEQ IDNO:49.
[0112]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de
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38/210 ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45.
[0113]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:36 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49.
[0114]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 ou SEQ ID NO:40.
[0115]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:49.
[0116]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45.
[0117]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:40 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49.
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[0118]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 7x10’ 10 M.
[0119]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 5x10’ 10 M.
[0120]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 3x10' 10 M.
[0121]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 2,5 x 10'1°M.
[0122]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 1,5 x IO’10 M.
[0123]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 1,0 x IO’10 M.
[0124]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito liga a hC5a com uma Kd que é menor que 8,0 x 10'11 M.
[0125]Em algumas modalidades, um anticorpo inibe em pelo menos 70 (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, ou 95 ou mais) % a ativação de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano a uma razão molar de 1:1 (sítio de ligação ao antígeno:C5a). Em algumas modalidades, o anticorpo não compreende 3 pareamentos de CDR exemplares representados na tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo não é BNJ371.
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[0126]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende um conjunto de CDR de cadeia leve apresentado na tabela 3 ou tabela 7. Por exemplo, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste pode compreender um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:140; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142; (ii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:156; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 157; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 158; (iii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:164; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:165; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:166; (iv) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:172; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:173; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:174; (v) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:86; (vi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de
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41/210 aminoácidos representada na SEQ ID NO:93; (vii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:88; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:90; (viii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97; (ix) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:99; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 100; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:101; (x) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 103; (xi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 106; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:107; (xii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 108; (xiii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 110; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos
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42/210 representada na SEQ ID NO:111; ou (xiv) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo o conjunto de CDR de cadeia leve também compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada apresentados na tabela 8.
[0127]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que compreende um conjunto de CDR de cadeia pesada apresentado na tabela 3 ou tabela 8. Por exemplo, em algumas modalidades um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo: (i) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (ii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:30; (iii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 160; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:161; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 162; (iv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:168; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada
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43/210 na SEQ ID NO:169; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:170; (v) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:176; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:177; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 178; (vi) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:116; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (vii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:120; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 121; (viii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (ix) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:124; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (x) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:126; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:127; (xi) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma
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CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:129; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 131; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:132; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 133; (xiii) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47; ou (xiv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 136; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:137; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:138. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo o conjunto de CDR de cadeia pesada também compreende um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia leve apresentados na tabela 7.
[0128]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreendendo um conjunto de CDR de cadeia leve da tabela 7 e seu conjunto de CDR de cadeia pesada cognato apresentado na tabela 8. Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreendendo um conjunto de CDR de cadeia leve e cadeia pesada pareado apresentado na tabela 3 ou tabela 9. Por exemplo, em algumas modalidades um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito compreende: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:140; uma CDR2 de cadeia leve
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45/210 compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (ii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:67; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:30; (iii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:156; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 157; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:158; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 160; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:161; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:162; (iv) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 164; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:165; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:166; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 168; uma
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CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:169; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:170; (v) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 172; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 173; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:174; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:176; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:177; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:178; (vi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:88; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:90; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 120; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:121; (vii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:106; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:107; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:124; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (viii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada
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47/210 na SEQ ID NO:84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:86; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:116; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 117; (ix) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:110; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:111; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:136; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 137; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 138; (x) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47; (xi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:99; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:100; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 101; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada
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48/210 na SEQ ID NO:119; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:126; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:127; (xii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xiii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 140; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xiv) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:105; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:106; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 107; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xv) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a
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49/210 sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:108; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 117; (xvi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:93; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 117; (xvii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:93; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xviii) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:103; uma CDR1 de cadeia pesada
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50/210 compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:129; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xix) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; (xx) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:103; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 144; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; ou (xxi) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113; uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:131; uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 132; e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 133.
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[0129]Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende um conjunto de CDR de cadeia leve e um conjunto de CDR de cadeia pesada pareados apresentados na tabela 3. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende um conjunto de CDR de cadeia leve e um conjunto de CDR de cadeia pesada pareados apresentados na tabela 2. Por exemplo, a revelação caracteriza um anticorpo compreendendo: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; (iv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47.
[0130]Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve apresentada na tabela 2, cuja cadeia leve é pareada com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada apresentadas na tabela 2. Por exemplo, a revelação caracteriza um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno deste) compreendendo: (a) uma região variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e (b) uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45.
[0131]Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito compreende: (i) uma região 1 da estrutura da região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:68 ou SEQ ID NO:69; (ii) uma região 2 da estrutura da região variável de cadeia
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52/210 pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:70 ou SEQ ID NO:71; e uma região 3 da estrutura da região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs:72 a 74. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região 4 da estrutura da região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:75. Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs:76 a 80. A cadeia pesada do anticorpo pode compreender qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada aqui descritos. A região variável de cadeia pesada pode ser, em algumas modalidades, pareada com o polipeptídeo da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:16.
[0132]Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga a uma proteína C5a de não humano. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ligara C5a de camundongo e/ou proteína C5a de camundongo desarginado. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste pode ligar a C5a de camundongo (e/ou C5a de camundongo desarginado) e compreender: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:54; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:55; (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:56; (iv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:62; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:63; e (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:64. Em algumas modalidades, o anticorpo C5a
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53/210 anticamundongo pode compreender um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:59; e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:66.
[0133]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito inibe a interação entre C5a e um receptor de C5a. O receptor de C5a pode ser, por exemplo, C5aR1 ou C5L2.
[0134]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito não inibe substancialmente hemólise mediada por complemento de células do sangue vermelho in vitro e/ou in vivo.
[0135]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado (e dessa maneira qualquer fragmento de ligação ao antígeno deste) é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo completamente humano.
[0136]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo recombinante, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, um intracorpo, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo de humano desumanizado, um fragmento Fv, um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, e um fragmento F(ab’)2.
[0137]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito é multiespecífico (por exemplo, biespecífico) em que o anticorpo ou fragmento liga a pelo menos dois diferentes epítopos. Os dois diferentes epítopos podem ser, por exemplo, dois diferentes epítopos da mesma proteína (por exemplo, C5a) ou o anticorpo podem ligar a um primeiro epítopo de uma primeira proteína (por exemplo, C5a) e um segundo epítopo de uma segunda proteína.
[0138]Em algumas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito compreende uma fração heteróloga. A fração
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54/210 heteróloga pode ser, por exemplo, um açúcar. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser glicosilado. A fração heteróloga pode ser, por exemplo, um rótulo detectável tais como, mas sem limitações, um rótulo fluorescente, um rótulo luminescente, um rótulo de metal pesado, um rótulo radioativo ou um rótulo enzimático.
[0139]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito é modificado com uma fração que melhora a estabilização e/ou retenção do anticorpo em circulação. Por exemplo, a modificação pode ser PEGylação ou hesilação. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-C5a pode conter uma região constante alterada que tem função efetora reduzida (ou nenhuma), comparada com a função efetora de sua região constante não alterada correspondente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a contém uma região constante alterada que tem entre cerca de 0 a cerca de 20 % da função efetora da região constante não alterada. Modalidades exemplares de anticorpos de menor função efetora como esses são aqui descritos.
[0140]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que bloqueia em forma cruzada a ligação de qualquer um dos anticorpos estranhos.
[0141]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais de qualquer um dos anticorpos isolados ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos e um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[0142]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza: (i) um ácido nucléico que codifica um ou mais de qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito; (ii) um vetor compreendendo o ácido nucléico; (iii) um vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico; e/ou (iv) uma célula compreendendo o vetor ou o vetor de expressão. Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um
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55/210 método para produzir um polipeptídeo (tal como qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos). O método compreende cultivar a célula supramencionada (compreendendo o vetor de expressão) em condições e por um tempo suficiente para permitir expressão pela célula do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno codificado pelo ácido nucléico no vetor. O método pode também incluir isolar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da célula ou do meio no qual a célula é cultivada.
[0143]Em um outro aspecto, a revelação caracteriza um ácido nucléico isolado que codifica qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui descritas ou um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos compreendendo, ou consistindo em, qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas aqui. O ácido nucléico pode ser incluído em um vetor, por exemplo, um vetor de expressão, e/ou pode estar presente em uma célula.
[0144]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um estojo terapêutico compreendendo: (i) um ou mais do anticorpos isolados ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos (por exemplo, um ou mais de qualquer um dos anticorpos humanizados ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos); e (ii) dispositivos para distribuição do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito. O meio pode ser adequado para, por exemplo, distribuição subcutânea, distribuição intraocular, ou distribuição intra-articular do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno ao sujeito. O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa, uma seringa de cilindro duplo, ou duas seringas separadas incorporadas para uso na administração de um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno deste, extraindo ao mesmo tempo fluido do joelho (por exemplo, para análise) em um modo puxa e empurra. Em algumas modalidades, o dispositivo é para distribuição ocular e compreende um enxerto transescleral ou uma lente de contato, cada qual compreendo anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o
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56/210 dispositivo é adequado para distribuição intrapulmonar. Por exemplo, o meio pode ser um inalador ou um nebulizador. Em algumas modalidades, o dispositivo é uma seringa pré-cheia tal como um dispositivo de caneta. A seringa pré-cheia pode conter, por exemplo, pelo menos uma forma de dosagem unitária farmacêutica de um ou mais dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno providos aqui.
[0145]Em algumas modalidades, os estojos terapêuticos aqui descritos podem conter pelo menos um agente ativo adicional para usar no tratamento de um distúrbio associado ao complemento em um sujeito. O agente ativo adicional pode ser, por exemplo, qualquer um dos agentes adicionais aqui descritos.
[0146]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um método para tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento. O método inclui administrar a um humano que necessita deste um anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito em uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio associado ao complemento que aflige o humano. O método pode também incluir identificar o sujeito que tem um distúrbio associado ao complemento. O distúrbio associado ao complemento pode ser, por exemplo, um distúrbio inflamatório, síndrome urêmica hemolítica atípica, degeneração macular relacionada a idade, artrite reumatóide, sepse, ou síndrome antifosfolipídio associados ao complemento. Em algumas modalidades, o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio pulmonar associado ao complemento. Por exemplo, o distúrbio pulmonar associado ao complemento pode ser, por exemplo, asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica. Outros distúrbios associados ao complemento acessíveis para tratamento ou prevenção apresentados no método são aqui descritos. O modo de administração, que pode variar dependendo do tipo de distúrbio associado ao complemento a ser tratado, pode ser, por exemplo, administração intravenosa, administração intrapulmonar, administração intraocular, administração subcutânea, ou administração intra-articular.
[0147]Em algumas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao
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57/210 antígeno é administrado ao humano em uma quantidade e com uma frequência suficiente para manter um baixo nível de atividade de C5 assistêmica para a duração do tratamento. Em algumas modalidades, os métodos podem incluir após a administração, monitorar o humano para uma melhoria em um ou mais sintomas do distúrbio associado ao complemento.
[0148]Em algumas modalidades, os métodos podem incluir administrar ao humano um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[0149]Ainda em um outro aspecto, a revelação caracteriza um artigo de fabricação, que compreende: (i) um recipiente com um rótulo e (ii) uma composição compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito. O rótulo pode indicar que a composição deve ser administrada a um humano com um distúrbio associado ao complemento, com suspeita de tê-lo ou com risco de desenvolvê-lo. O artigo de fabricação pode também incluir um ou mais agentes ativos adicionais.
[0150]Conforme usado em toda a presente revelação, o termo “anticorpo” refere-se a uma molécula do anticorpo total ou intacto (por exemplo, IgM, IgG, IgA, IgD, ou IgE) que é gerado por qualquer um de uma variedade de métodos que são conhecidos na técnica e aqui descritos. O termo “anticorpo” inclui um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de humano desumanizado, e um anticorpo completamente humano. O anticorpo pode ser feito em qualquer de uma variedade de espécie ou derivado dela, por exemplo, mamíferos tais como humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, babuínos, ou chipanzés), cavalos, gado, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, porquinhos-da-índia, gerbos, hamsters, ratos, e camundongos. O anticorpo pode ser um anticorpo purificado ou um recombinante.
[0151 ]Da maneira aqui usada, os termos “fragmento do anticorpo”, “fragmento de ligação ao antígeno”, ou termos similares referem-se a um fragmento de um
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58/210 anticorpo que retém a capacidade de ligar a um antígeno (por exemplo, um epítopo presente em C5a, mas não na cadeia alfa de proteína C5 nativo não clivado), por exemplo, um anticorpo de cadeia única (scFv), um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, ou um fragmento F(ab’)2. Um scFv é uma cadeia de polipeptídeo única que inclui as regiões variáveis tanto de cadeia leve quanto pesada do anticorpo das quais o scFv é derivado. Além do mais, diacorpos (Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123: Hudson etal. (1999) J/mmuno/Métodos 23(1-2): 177-189. cujas revelações de ambas estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra), minicorpos, triacorpos (Schoonooghe et al. (2009) BMC Biotech not 9:70), anticorpos do domínio (também conhecidos como “imunoglobulinas de cadeia pesada” ou camelídeos; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol 21(11):484-490): e intracorpos (Huston et al. (2001) HumAnf/bod/es 10(3-4):127-142: Wheeleretal. (2003) Mol Tber8(3):355-366: Stocks (2004) Drug Discov Today 9(22): 960-966, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra) são incluídos na definição de fragmentos do anticorpo e podem ser incorporados nas composições, e usados nos métodos aqui descritos.
[0152]A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica aos quais esta a revelação diz respeito. No caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, prevalecerá. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais similares ou equivalentes esses aqui descritos possam também ser usados na prática ou teste dos métodos e composições atualmente revelados. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui estão incorporados pela referência na sua íntegra.
[0153]Outros recursos e vantagens da presente revelação, por exemplo, métodos para tratar distúrbios associados ao complemento em um sujeito, ficarão aparentes a partir da descrição, dos exemplos, e das reivindicações seguintes.
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Descrição Resumida dos Desenhos
[0154]A figura 1 é um diagrama de Venn representando o grau de sobreposição dos epítopos em C5a de humano ligado por um conjunto seleto de anticorpos C5a anti-humano murino: 5an101ME, 5an180ME, 5anO48ME, 5an179ME, e 5an178ME.
[0155]A figura 2 é um gráfico linear representando o antagonismo de sinalização que media C5a in vitro usando um ensaio de ativação de neutrófilo. O eixo Y representa a medição de densidade ótica (OD) de um substrato cromogênico em função de liberação de mieloporoxidase por neutrófilos de humano recém isolados. O eixo X representa a concentração de anticorpo incubado com as células. Os anticorpos humanizados testados - BNJ367, BNJ369, BNJ371, BNJ378, BNJ381, BNJ383, e um anticorpo anti-C5 humanizado - são identificados na legenda em anexo.
[0156]A figura 3 é um gráfico linear representando o efeito de diversos anticorpos terapêuticos em inflamação da junta em um modelo de camundongo de artrite reumatóide. O eixo Y representa a espessura da junta do joelho inicialmente inflamado em milímetros. O eixo X representa os dias depois do início de ação da doença. Os anticorpos terapêuticos testados - 5an195ME (um anticorpo C5a anticamundongo camundongo) e um anticorpo controle com a mesma região Fc do anticorpo anti-C5a são identificados na legenda inserida.
[0157]A figura 4 é um gráfico linear representando o efeito de diversos anticorpos terapêuticos na gravidade de doença geral em um modelo de camundongo de artrite reumatóide. O eixo Y representa o índice de artrite. O eixo X representa os dias depois do início de ação da doença. Os anticorpos terapêuticos testados - 5an195ME (um anticorpo C5a anticamundongo camundongo) e um anticorpo controle com a mesma região Fc do anticorpo anti-C5a - são identificados na legenda inserida.
[0158]A figura 5 apresenta uma série de sequências de região variável de cadeia pesada humanizada. Na ordem mais alta para mais baixa: a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ345 (SEQ ID NO:76); a região
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60/210 variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado (BNJ346 SEQ ID NO:77); a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ347 (SEQ ID NO:78); a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ354 (SEQ ID NO:79); e a região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a humanizado BNJ350 (SEQ ID NO:80). Versados na técnica perceberão a delineação entre regiões da estrutura de cadeia pesada 1, 2, 3, e 4 e as CDRs de cadeia pesada 1, 2, e 3. Tais delineações definidas por Kabat et al. {infra) são mostradas na figura. “HC FR1” refere-se a região 1 da estrutura da região variável de cadeia pesada, “HC FR2” refere-se a região 2 da estrutura da região variável de cadeia pesada, “HC FR3” refere-se a região 3 da estrutura da região variável de cadeia pesada, e “HC FR4” refere-se a região 4 da estrutura da região variável de cadeia pesada. “HC CDR1” refere-se a região determinante de complementariedade da região variável de cadeia pesada (CDR) 1, “HC CDR2” refere-se a região variável de cadeia pesada CDR2, e “HC CDR3” refere-se a região variável de cadeia pesada CDR3.
[0159]A figura 6 é um gráfico linear representando a porcentagem de neutrófilos circulantes no sangue de camundongos após a administração de hC5a aos camundongos. no eixo Y, contagens de neutrófilo são expressas como um a de “linha de base”, que é a contagem do neutrófilo no tempo 0 (ou 100 % de neutrófilos). O eixo X representa tempo em minutos. Camundongos coortes foram administrados intravenosamente com um anticorpo controle [antígeno protetor Anti-antrax 63, isotipo lgG2/G4] (“controle”; cinco camundongos) ou o anticorpo C5a anti-humano BNJ383 a uma das seguintes doses: 24 mg/kg (cinco camundongos); 12 mg/kg (cinco camundongos); 6 mg/kg (cinco camundongos); e 3 mg/kg (cinco camundongos) e então posteriormente foram administrados hC5a. Vide Exemplo 13. Seis camundongos, “sham”, não foram administrados com C5a de humano.
[0160]A figura 7 é um gráfico de barras representando o nível de mieloporoxidase (MPO) no plasma de camundongos antes e após a administração de C5a de
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61/210 humano aos camundongos. O eixo Y representa a concentração (ng/mL) de MPO no plasma do camundongo. O eixo X representa tempo em minutos. Camundongos coortes foram administrados intravenosamente com um anticorpo controle [antígeno protetor Anti-antrax 63, isotipo lgG2/G4] (oito camundongos “controle”) ou o anticorpo C5a anti-humano BNJ383 a uma das seguintes doses: 24 mg/kg (cinco camundongos); 12 mg/kg (cinco camundongos); 6 mg/kg (cinco camundongos); e 3 mg/kg (cinco camundongos) e então posteriormente foram administrados com hC5a. Quatro camundongos, “sham”, não foram administrados com C5a de humano.
[0161 ]A figura 8 é um gráfico linear representando a mudança no nível de C5a de humano no plasma de camundongos (administrados com C5a de humano) na presença ou ausência de diferentes concentrações de um anticorpo anti-hC5a (BNJ383). O eixo Y representa a concentração (ng/mL) de hC5a no plasma do camundongo. O eixo X representa tempo em minutos. Camundongos coortes foram administrados intravenosamente com um anticorpo controle [antígeno protetor Anti-antrax 63, isotipo lgG2/G4] (“controle”; seis camundongos) ou o anticorpo C5a anti-humano BNJ383 a uma das seguintes doses: 24 mg/kg (três camundongos); 12 mg/kg (três camundongos); 6 mg/kg (três camundongos); e 3 mg/kg (três camundongos) e então posteriormente foram administrados com hC5a. Quatro camundongos, “sham”, não foram administrados com C5a de humano.
[0162]A figura 9 é um gráfico linear representando a competição para ligar a C5a de humano in vitro. 250 pM de anticorpo anti-C5a marcado com rutênio (BNJ383) foram incubados com hC5 abioltinilado 1 nM, junto com várias concentrações (por exemplo, 400, 133, 44,4, 14,8, 4,9, 1,6, e 0,5 nM) de um dos seguintes: (a) proteína C5a desarg de humano em salina tamponada com fosfato, (b) plasma de humano, (c) plasma de macaco cinomolgo, (d) plasma de Balb/C (camundongo), ou (e) plasma de DBA/2J (camundongo). Com relação aos componentes do plasma (b), (c), (d), e (e), a concentração refere-se à concentração final aproximada de antígeno de C5 na
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62/210 mistura da incubação. O eixo Y representa unidades de fluorescência arbitrária em função da quantidade detectada de anticorpo anti-C5a marcado com rutênio. O eixo X representa concentração (nM) do competidor antígeno.
[0163]A figura 10 é um gráfico linear representando o efeito de diversas proteínas inibitórias do complemento no caminho alternativo (AP) do complemento. O eixo Y representa a porcentagem de atividade AP do complemento comparado com a linha de base (BL; o nível de atividade na ausência de um inibidor do complemento). O eixo X representa a concentração de um dado inibidor do complemento (μΜ). Os efeitos do anticorpo anti-hC5a, BNJ383, junto com um anticorpo anti-C5 na atividade AP foram cada qual avaliado.
[0164]A figura 11 é um gráfico linear representando o efeito de diversas proteínas inibitórias do complemento no caminho clássico (CP) do complemento. O eixo Y representa a porcentagem de atividade CP do complemento comparado com a linha de base (BL; o nível de atividade na ausência de um inibidor do complemento). O eixo X representa a concentração de um dado inibidor do complemento (μΜ). Os efeitos do anticorpo anti-hC5a, BNJ383, junto com um anticorpo anti-C5 na atividade CP foram cada qual avaliado.
[0165]As figuras 12A, 12B, 12C, e 12D são uma série de cromatografias representando o tempo de retenção do anticorpo anti-C5a (BNJ383) e um anticorpo antihC5 na presença ou ausência de proteína de hC5. Para todos os painéis, o eixo X representa tempo de retenção em minutos e o eixo Y representa as unidades de absorbância a comprimento de onda de 214 nm. Em cada painel, o subpainel em camadas representa um vista melhor dos picos caracterizados.
[0166]A figura 12A representa a tempo de retenção para BNJ383 na ausência de proteína de hC5.
[0167]A figura 12B representa o tempo de retenção para o anticorpo anti-C5 na ausência de proteína de hC5.
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[0168]A figura 12C representa o tempo de retenção para BNJ383 na presença de hC5 (2,1 vezes o excesso molar de hC5 com relação a BNJ383). Da direita para a esquerda, os picos enumerados representam: (a) BNJ383 ou hC5 não complexado; (b) BNJ383 com um sítio de ligação ao antígeno ligado a hC5 não clivado; e (c) uma fração inferior consistente com dupla ocupação de BNJ383 com hC5 não clivado.
[0169]A figura 12D representa o tempo de retenção para o anticorpo anti-C5 na presença de uma quantidade equimolar de hC5. Da direita para a esquerda, os picos enumerados representam: (a) anticorpo anti-C5 ou hC5 não complexado; (b) o anticorpo anti-C5 com um sítio de ligação ao antígeno ligado a hC5 não clivado; e (c) o anticorpo anti-C5 ligado a duas moléculas de C5 não clivados.
[0170]A figura 13 é um gráfico linear representando a ligação do anticorpo anti-C5a BNJ383 a hC5a desarg na presença de hC5 usando um ELISA. O eixo X representa a concentração (ng/mL) do anticorpo. O eixo Y representa a densidade ótica a comprimento de onda de 450 nm.
[0171 ]A figura 14 é um gráfico de dispersão representando a concentração de C5a livre/C5a desarg presente no plasma de macacos cinomolgos em função da concentração plasmática de anticorpo anti-C5a (BNJ383). O eixo Y representa a concentração (pg/mL) de C5a/C5a desarg detectada nas amostras de plasma dos macacos cinomolgos em pontos de tempo variando de 1 dia a 30 dias após uma administração intravenosa de dose única de BNJ383 a 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg, ou 400 mg/kg de peso corpóreo dos animais. O eixo X representa a concentração do BNJ383 (pg/mL) em cada uma das amostras.
[0172]A figura 15A é um gráfico de dispersão representando a porcentagem de atividade hemolítica em amostras de soro com relação aos valores de linha de base (eixo Y) iniciado por meio do caminho clássico em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo X).
[0173]A figura 15B é um gráfico de dispersão representando a porcentagem
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64/210 de formação do complexo terminal do complemento iniciado por meio do caminho clássico em amostras de soro medido por um ensaio CH50eq com relação aos valores de linha de base (eixo Y) em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo X).
[0174]A figura 15C é um gráfico de dispersão representando a porcentagem de formação do complexo terminal do complemento iniciado por meio do caminho clássico em amostras de soro medido por um ensaio CCP com relação aos valores de linha de base (eixo Y) em função da concentração de anticorpo anti-C5a (BNJ383) em circulação (eixo X).
Descrição Detalhada da Invenção
[0175]A presente revelação diz respeito a anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam a C5a livre (por exemplo, C5a de humano livre), composições contendo os anticorpos ou seus fragmentos, e métodos para usar qualquer um dos anteriores para tratar ou prevenir distúrbios associados ao complemento tais como, mas sem limitações, aHUS, macular degeneração (por exemplo, AMD), RA, sepse, síndrome antifosfolipídio, queimadura (por exemplo, queimadura grave), síndrome de Goodpasture, nefrite lúpica, ou um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). A revelação também diz respeito a anticorpos anti-C5a (e seus fragmentos) que são reativos cruzados entre C5a de humano e C5a livre de uma espécie de mamífero não humano tal como um primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo ou macaco reso). Embora não devam de maneira nenhuma ser limitantes, anticorpos exemplares (e fragmentos de ligação de antígeno), composições (por exemplo, composições e formulações farmacêuticas), e métodos para usar as composições são elaboradas em seguida e exemplificadas nos exemplos funcionais.
[0176]Anticorpos anti-C5a e Seus Fragmentos de Ligação de Antígeno
[0177]A revelação diz respeito a anticorpos que ligam a componente do
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65/210 complemento C5a. Conforme discutido anteriormente, a proforma de C5, uma proteína precursora do resíduo do aminoácido 1676, é processada por uma série de eventos de divagem proteolítica. Os primeiros 18 peptídeos (numerados -18 a -1) constituem um peptídeo sinal que é clivado da proteína precursora. A proteína do aminoácido 1658 remanescente é clivada em dois locais para formar as cadeias alfa e beta. O primeiro evento de divagem ocorre entre os resíduos dos aminoácidos 655 e 656. A segunda divagem ocorre entre os resíduos dos aminoácidos 659 e 660. Os dois eventos de divagem resultam na formação de três fragmentos de polipeptídeo distintos: (i) um fragmento compreendendo aminoácidos 1 a 655, que é referido como a cadeia beta; (ii) um fragmento compreendendo aminoácidos 660 a 1658, que é referido como a cadeia alfa; e (iii) um fragmento tetrapeptídeo que consiste em aminoácidos 656 a 659. Os fragmentos de polipeptídeo da cadeia alfa e a cadeia beta são conectados uns nos outros por meio de ligação de dissulfeto e constituem a proteína madura de C5. A convertase C5 de CP ou AP ativa o C5 maduro clivando a cadeia alfa entre os resíduos 733 e 734, que resulta na liberação do fragmento de C5a (aminoácidos 660 a 733). A porção remanescente de C5 maduro é fragmento de C5b, que contém os resíduos 734 a 1658 da cadeia alfa de dissulfeto ligada a cadeia beta.
[0178]/n vivo, C5a é rapidamente metabolizado por uma enzima sérica, carboxipeptidase B, em uma forma do aminoácido 73 denominada “C5a desarg”, que perdeu o resíduo de arginina carboxiterminal. Dessa maneira, em algumas modalidades, um anticorpo que liga a C5a livre também liga a C5a desarginado. Em algumas modalidades, um anticorpo que liga a C5a não liga a C5a desarginado.
[0179]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a liga a um neopítopo presente em C5a, isto é, um epítopo que fica exposto mediante a liberação de C5a a partir de fragmento da cadeia alfa de C5 maduro. Ou seja, em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito liga a C5a e/ou C5a desarg, mas não a C5 não clivado, nativo (completamente dobrado).
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[0180]Conforme descrito anteriormente, em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a uma subpopulação de C5 processado, não clivado (por exemplo, plasma C5) constituindo menos que 10 (por exemplo, menos que 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou menor que 0,1) % da população total de C5 de comprimento total em uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue ou plasma ou uma amostra compreendendo C5 de comprimento total recombinante), cuja subpopulação é no todo, ou em parte, desnaturada de maneira tal que um neopítopo de C5a de outra forma ocluso seja exposto. Assim, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito, em algumas modalidades, pode ligara C5a livre, mas não a C5 dos 90 % ou mais da população de C5 nativo não clivado. Em algumas modalidades, a subpopulação desnaturada parcial ou completamente é inativa ou tem atividade reduzida (por exemplo, menos que 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 % da atividade da proteína C5 de comprimento total completamente funcional) em qualquer número de ensaios adequados usados para testar atividade C5, por exemplo, um ensaio hemolítico ou um ensaio CH50eq. Métodos adequados para testar a atividade da menor subpopulação nos quais um anticorpo anti-C5a aqui descrito, em algumas modalidades, pode ligar são conhecidos na técnica e aqui descritos.
[0181 ]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a liga a uma proteína C5a de mamífero (por exemplo, humano). Por exemplo, o anticorpo anti-C5a pode ligar a uma proteína C5a de humano com a seguinte sequência de aminoácidos:
TLQKKIEEIAAKYKHSWKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFT ECCVVASQLRANISHKDMQLGR (SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a pode ligara um proteína C5a de humano desarginada com a seguinte sequência de aminoácidos:
TLQKKIEEIAAKYKHSWKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCW
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ASQLRANISHKDMQLG (SEQ ID NO:2). Um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar tanto a C5 de comprimento total de humano quanto a C5a desarginado de humano.
[0182]Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligara C5a de humano em um epítopo dentro ou sobrepondo um fragmento estrutural da proteína com a sequência de aminoácidos: TLQKKIEEIAAKYK (SEQ ID NO:3); HSWKKCCYDGAC (SEQ ID NO:4); VNNDE (SEQ ID NO:5); TCEQRAAR (SEQ ID NO:6); ISLG (SEQ ID NO:7); PRCIKAFTECCWASQLRANIS (SEQ ID NO:8); HKDMQLG (SEQ ID NO:9); ou HKDMQLGR (SEQ ID NO: 10). Vide, por exemplo, Cook et al. (2010) Acta Cryst D66:190-197. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligara C5a em um epítopo dentro ou sobrepondo a sequência de aminoácidos de um fragmento do peptídeo de C5a compreendendo pelo menos dois dos resíduos de cisteína pareados. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a pode ligar a fragmento compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos: CCYDGACVNNDETC (SEQ ID NO:11); CYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTEC (SEQ ID NO:12; e CEQRAARISLGPRCIKAFTECC(SEQ ID NO: 13), em que, em cada qual dos fragmentos do peptídeo, o resíduos de cisteína primeiro e final são pareados por ligações de dissulfeto. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar a uma proteína C5a de humano em um epítopo dentro ou sobrepondo a sequência de aminoácidos: YDGACVNNDETCEQRAAR (SEQ ID NO:14) ou
CYDGACVNNDETCEQRAA (SEQ ID NO:15). Em algumas modalidades, um anticorpo pode ligar a uma proteína C5a de humano ou seu fragmento contendo uma sequência de aminoácidos que contém, ou consiste em, pelo menos quatro (por exemplo, pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 ou mais) aminoácidos consecutivos representados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 15. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito liga a um epítopo ternário compreendendo dois ou mais (por exemplo, pelo menos dois, três, ou
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68/210 quatro) regiões de peptídeo descontínuo de proteína C5a, por exemplo, dois ou mais regiões de peptídeo C5a descontínuo unidas entre si por meio de um ligação de dissulfeto.
[0183]Métodos para identificar o epítopo no qual um anticorpo particular liga (por exemplo, um anticorpo anti-C5a) são também conhecidos na técnica. Por exemplo, o epítopo de ligação em C5a (ou C5a desarginado) no qual um anticorpo anti-C5a liga pode ser identificado medindo a ligação do anticorpo para diversos (por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, 15, 20, ou 30 ou mais) fragmentos do peptídeo de sobreposição de um componente da proteína C5a do complemento (por exemplo, diversos fragmentos de sobreposição de uma proteína C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2). Cada qual dos diferentes peptídeos sobrepostos é então ligado a um endereço exclusivo em um suporte sólido, por exemplo, poços separados de uma placa de ensaio multipoços. Em seguida, o anticorpo anti-C5a é interrogado colocando cada um dos peptídeos em contato com a placa de ensaio por um período de tempo e em condições que permitem que o anticorpo se ligue a seu epítopo. Anticorpo anti-C5a não ligado é removido lavando cada um dos poços. Em seguida, um anticorpo secundário marcado detectavelmente que liga ao anticorpo anti-C5a, se presente em um poço da placa, é colocado em contato com cada um dos poços, e o anticorpo secundário não ligado é removido lavando as etapas. A presença ou quantidade do sinal detectável produzido pelo anticorpo secundário marcado detectavelmente em um poço é uma indicação de que o anticorpo anti-C5a liga ao fragmento do peptídeo particular associado com o poço. Vide, por exemplo, Harlow and Lane (supra), Benny K. C. Lo {supra), e publicação de pedido de patente U.S. No. 20060153836, cuja revelação está incorporada pela referência na sua íntegra. Um epítopo particular no qual um anticorpo liga pode também ser identificado usando técnicas cromatográficas BIAcore (vide, por exemplo, Pharmacia BIAtechnology Handbook, “Epitope Mapping”, Section 6.3.2 (May 1994);
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69/210 and Johne etal. (1993) J Immunol Methods 160:20191-8).
[0184]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito contém um conjunto específico de regiões determinante de complementariedade de cadeia leve (CDRs) e/ou um conjunto específico de CDRs de cadeia pesada. Por exemplo, em algumas modalidades um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia leve obtido de um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs:19, 37, ou 42. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia pesada obtido de um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27 ou 45. Conjuntos exemplares de CDR de cadeia leve e cadeia pesada obtidos das regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada supramencionadas são descritos a seguir com mais detalhes (vide Tabela 1).
[0185]Os limites exatos de CDRs, e regiões da estrutura, foram definidos diferentemente de acordo com diferentes métodos. Em algumas modalidades, as posições dos CDRs ou regiões da estrutura em um domínio variável de cadeia leve ou pesada podem ser definidas por Kabat et al. [(1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”. NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD], Em tais casos, as CDRs podem ser referidas como “CDRs Kabat” (por exemplo, “LCDR2 Kabat” ou “HCDR1 Kabat”). Em algumas modalidades, as posições das CDRs de uma região variável de cadeia leve ou pesada podem ser definidas por Chothia etal. (1989) Λ/ature 342:877-883. Dessa maneira, essas regiões podem ser referidas como “CDRs Chothia” (por exemplo, “LCDR2 Chothia” ou “HCDR3 Chothia”). Em algumas modalidades, as posições das CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada podem ser definidas por uma definição combinada Kabat-Chothia. Em tais modalidades, essas regiões podem ser referidas como “CDRs
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Kabat-Chothia combinadas”. Em algumas modalidades, as posições das CDRs e/ou regiões da estrutura em um domínio variável de cadeia leve ou pesada podem ser definidas por Honneggerand Plückthun (2001) J Mol Biol 309: 657-670. Identificação das CDRs em uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada usando as definições supramencionadas é bem conhecida na técnica de engenharia de anticorpo. Por exemplo, Thomas et al. [(1996) Mo//mmuno/33(17/18): 1389-14011 exemplifica a identificação de limites de CDR de cadeia leve e cadeia pesada de acordo com definições Kabat e Chothia.
[0186]Dessa maneira, em algumas modalidades um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia leve definido por Kabat, um definido por Chothia, ou um combinado definido por Kabat-Chothia obtido de um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada em qualquer uma das SEQ ID NOs:19, 37, ou 42. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode compreender um conjunto de CDR de cadeia pesada definido por Kabat, um definido por Chothia, ou um combinado definido por KabatChothia obtido de um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27 ou 45.
[0187]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NQ:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASNLES (SEQ ID NO:21); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo cada qual de uma CDR1 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte
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71/210 sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASNLES (SEQ ID NO:21); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Anticorpos exemplares anti-C5a compreendendo um domínio variável de cadeia leve como esse incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, e BNJ383 aqui descritos (vide infra·, Tabela 2).
[0188]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: WASTRES (SEQ ID NO:38); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia leve contendo cada qual de uma CDR1 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO:20); uma CDR2 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: WASTRES (SEQ ID NO:38); e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQSNEDPYT (SEQ ID NO:22). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um domínio variável de cadeia leve como esse incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5aBNJ371 e BNJ381 aqui descritos (vide infra-, Tabela 2).
[0189]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou
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72/210 consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID NO:29); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada qual de uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYNQKFKD (SEQ ID NO:29); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo um domínio variável de cadeia pesada como esse incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a BNJ364, BNJ367, BNJ371, e BNJ378 aqui descritos (vide infra-, Tabela 2).
[0190]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID NO:46); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: GFYDGYSPMDY (SEQ ID NO:47). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada qual de uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AIHLNTGYTNYNQKFKG (SEQ ID NO:46); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: GFYDGYSPMDY (SEQ ID NO:47). Anticorpos anti-C5a exemplares compreendendo
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73/210 um domínio variável de cadeia pesada como esse incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a de BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 aqui descritos (vide infra] Tabela 2).
[0191]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode conter uma região CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO:67). Por exemplo, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode compreender uma região variável de cadeia pesada contendo uma ou mais de: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO:67); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende uma região variável de cadeia pesada contendo cada qual de uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYSMD (SEQ ID NO:28); uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: AINPNSGGTNYSQKFKD (SEQ ID NO:67); e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: SGSYDGYYAMDY (SEQ ID NO:30). Um exemplo de um anticorpo anti-C5a aqui descrito, que contém um polipeptídeo de cadeia pesada como esse e liga a C5a de humano com uma Kd que é menor que 1 nM é o anticorpo 5an101ME descrito a seguir.
[0192]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito contém um do conjunto exemplar de pareamentos do conjunto de CDR de cadeia leve e conjunto de CDR de cadeia pesada 1 a 4 representados na tabela 1.
Tabela 1. Pareamentos de CDR de Cadeia Pesada e Leve Exemplares
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Pareamen tos de CDR Exemplares Cadeia leve Cadeia pesada Anticorpos exempiares com tais pareamentos
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
1 SIN:20 SIN:21 SIN:22 SIN:28 SIN:29 SIN:30 BNJ364, BNJ367, BNJ378
2 SIN:20 SIN:21 SIN:22 SIN:28 SIN:46 SIN:47 BNJ366, BNJ369, BNJ383
3 SIN:20 SIN:38 SIN:22 SIN:28 SIN:29 SIN:30 BNJ371
4 SIN:20 SIN:38 SIN:22 SIN:28 SIN:46 SIN:47 BNJ381
“SIN” refere-se a “SEQ ID NO”.
[0193]As sequências de aminoácidos representadas pelo SEQ ID NOs na tabela 1 são apresentadas na tabela 2.
[0194]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a não compreende 3 pareamentos de CDR exemplares. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a não é BNJ371.
[0195]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ser um polipeptídeo de cadeia leve λ (por exemplo, um polipeptídeo de cadeia leve λ completamente humano ou humanizado). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia leve de um anticorpo anti-C5a aqui descrito é um polipeptídeo de cadeia leve κ (por exemplo, um polipeptídeo de cadeia leve k completamente humano ou humanizado). As sequências de aminoácidos de inúmeros polipeptídeos de cadeia leve κ (por exemplo, inúmeros polipeptídeos de cadeia leve de humano) são bem conhecidas na técnica e apresentada, por exemplo, em Kabat et al. (1991), supra. As sequências de aminoácidos de polipeptídeo de cadeia leve κ exemplares são apresentadas na tabela 2.
[0196]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode compreender uma região constante de cadeia leve. Por exemplo, a região constante de cadeia leve pode ser uma região constante de polipeptídeo de cadeia leve λ ou uma região constante de cadeia leve κ. A sequência de aminoácidos para inúmeras regiões constantes de cadeia leve λ e κ de humano são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Kabat et al. (1991), supra. As sequências de aminoácidos de
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75/210 polipeptídeo de cadeia leve κ exemplares são apresentadas na tabela 2.
[0197]O polipeptídeo de cadeia pesada pode compreender uma região constante (por exemplo, uma região constante de cadeia pesada 1 (CH1), região constante de cadeia pesada 2 (CH2), região constante de cadeia pesada 3 (CH3), uma região constante de cadeia pesada 4 (CH4), ou uma combinação de qualquer uma das anteriores). O polipeptídeo de cadeia pesada pode compreender uma porção Fede uma molécula de imunoglobulina. A região Fc pode ser, por exemplo, uma região Fc de uma molécula de imunoglobulina IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, ou IgD ou um combinação de porções de cada uma dessas. Para ser claro, os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem ser, por exemplo, de isotipo IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, ou IgD. As sequências de aminoácidos para inúmeras regiões constantes de cadeia pesada de humano são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Kabat et al. (1991), supra.
[0198]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode compreender uma região constante híbrida, ou uma porção desta, tal como uma região constante híbrida G2/G4 (vide, por exemplo, Burton et al. (1992) Adv Immun 51:1-18; Canfield etal. (1991) JExp/Vfed 173:1483-1491; and Mueller et al. (1997) Mol Immunol 34(6):441-452). Por exemplo, (e de acordo com numeração Kabat), as regiões constantes IgGI e lgG4 compreendem resíduos G249G250 ao passo que a região constante lgG2 não compreende resíduo 249, mas não compreende G250. Em uma região constante híbrida G2/G4, onde a região 249-250 vem da sequência G2, a região constante pode ser adicionalmente modificada para introduzir um resíduo de glicina na posição 249 para produzir um fusão de G2/G4 com G249/G250. Outros híbridos do domínio constante que compreendem G249/G250 podem também ser parte de anticorpos modificados por engenharia de acordo com a revelação. Sequências de aminoácidos de polipeptídeo de cadeia pesada exemplares são apresentadas na tabela 2.
[0199]O anticorpo anti-C5a pode ser, por exemplo, um dos anticorpos
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76/210 específicos exemplificados nos exemplos funcionais: BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ383, BNJ371, ou BNJ381. As sequências de aminoácidos para esses anticorpos anti-C5a exemplificados, que podem ser usadas junto com qualquer um dos métodos aqui descritos, são apresentadas na tabela 2.
Tabela 2. Sequências de Aminoácidos oara Selecionar Anticorpos anti-C5a
Humanizados
SIN Ab Descrição Sequência de aminoácidos
16 BNJ364 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISS LQAE DVAVYYCQQS N E DPY TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
17 BNJ364 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ364 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MVLQTQVFISLLLWISGAYG
19 BNJ364 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KR
20 BNJ364 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
21 BNJ364 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ364 LCDR3 Kabat da sequência de QQSNEDPYT
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região variável de cadeia leve
23 BNJ364 Região constante de cadeia leve sequência TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
24 BNJ364 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAINPNSGGTNYNQKFKDRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGSYDGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLT WHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
25 BNJ364 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
26 BNJ364 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
27 BNJ364 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSS
28 BNJ364 HCDR1 Kabat da DYSMD
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sequência da região variável de cadeia pesada
29 BNJ364 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AINPNSGGTNYNQKFKD
30 BNJ364 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada SGSYDGYYAMDY
31 BNJ364 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR WSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
16 BNJ367 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISS LQAE DVAVYYCQQS N E DPY TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
17 BNJ367 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ367 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MVLQTQVFISLLLWISGAYG
19 BNJ367 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KR
20 BNJ367 LCDR1 Kabat da sequência de RASESVDSYGNSFMH
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região variável de cadeia leve
21 BNJ367 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ367 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ367 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
32 BNJ367 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAINPNSGGTNYNQKFKDRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGSYDGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGK
33 BNJ367 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK
26 BNJ367 Peptídeo sinal da sequência da MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
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região variável de cadeia pesada
27 BNJ367 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSS
28 BNJ367 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
29 BNJ367 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AINPNSGGTNYNQKFKD
30 BNJ367 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada SGSYDGYYAMDY
34 BNJ367 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
35 BNJ371 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDP YTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
36 BNJ371 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ371 Peptídeo sinal da sequência de MVLQTQVFISLLLWISGAYG
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região variável de cadeia leve
37 BNJ371 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEIKR
20 BNJ371 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
38 BNJ371 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve WASTRES
22 BNJ371 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ371 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
32 BNJ371 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAINPNSGGTNYNQKFKDRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGSYDGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGK
33 BNJ371 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF
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NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK
26 BNJ371 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
27 BNJ371 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSS
28 BNJ371 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
29 BNJ371 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AINPNSGGTNYNQKFKD
30 BNJ371 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada SGSYDGYYAMDY
34 BNJ371 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
39 BNJ378 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASESVDSYGNSFM HWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNE DPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
40 BNJ378 Sequência de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVD
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cadeia leve total sem peptídeo sinal SYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQSNEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
41 BNJ378 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
42 BNJ378 Sequência de região variável de cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVD SYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQSNEDPYTFGGGTKVEIKR
20 BNJ378 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
21 BNJ378 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ378 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ378 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
32 BNJ378 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAINPNSGGTNYNQKFKDRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGSYDGYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDK TVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGK
33 BNJ378 Sequência de QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 86/217
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cadeia pesada total sem peptídeo sinal TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL GK
26 BNJ378 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
27 BNJ378 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAINPNSGG TNYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSGSYDGYYAMDYWGQGT TVTVSS
28 BNJ378 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
29 BNJ378 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AINPNSGGTNYNQKFKD
30 BNJ378 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada SGSYDGYYAMDY
34 BNJ378 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
16 BNJ366 Sequência de MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 87/217
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cadeia leve total com peptídeo sinal AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISS LQAE DVAVYYCQQS N E DPY TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
17 BNJ366 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ366 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MVLQTQVFISLLLWISGAYG
19 BNJ366 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KR
20 BNJ366 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
21 BNJ366 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ366 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ366 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
43 BNJ366 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAIHLNTGYTNYNQKFKGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR G FYDGYS P M DYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 88/217
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TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTW HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKT KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
44 BNJ366 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDG YS P M DY WGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPE NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26 BNJ366 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
45 BNJ366 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDG YS P M DY WGQGTTVT VSS
28 BNJ366 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
46 BNJ366 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AIHLNTGYTNYNQKFKG
47 BNJ366 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada GFYDGYSPMDY
31 BNJ366 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 89/217
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VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR WSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
16 BNJ369 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISS LQAE DVAVYYCQQS N E DPY TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
17 BNJ369 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ369 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MVLQTQVFISLLLWISGAYG
19 BNJ369 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEI KR
20 BNJ369 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
21 BNJ369 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ369 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ369 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
48 BNJ369 Sequência de cadeia pesada total MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 90/217
88/210
com peptídeo sinal APGQGLEWMGAIHLNTGYTNYNQKFKGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR G FYDGYS P M DYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM Η E ALH N H YTQKS LS LS LG K
49 BNJ369 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDGYS P M DY WGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
26 BNJ369 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
45 BNJ369 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDGYS P M DY WGQGTTVT VSS
28 BNJ369 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
46 BNJ369 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AIHLNTGYTNYNQKFKG
47 BNJ369 HCDR3 Kabat da sequência da GFYDGYSPMDY
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 91/217
89/210
região variável de cadeia pesada
34 BNJ369 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
35 BNJ381 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSL AVSLGERATINCRASESVDSYGNSFMHWY QQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDP YTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
36 BNJ381 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
18 BNJ381 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MVLQTQVFISLLLWISGAYG
37 BNJ381 Sequência de região variável de cadeia leve DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVY YCQQSNEDPYTFGGGTKVEIKR
20 BNJ381 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASESVDSYGNSFMH
38 BNJ381 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve WASTRES
22 BNJ381 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de QQSNEDPYT
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 92/217
90/210
cadeia leve
23 BNJ381 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
48 BNJ381 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAIHLNTGYTNYNQKFKGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR G FYDGYS P M DYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGK
49 BNJ381 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDGYS P M DY WGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
26 BNJ381 Peptídeo sinal da sequência da região variável de cadeia pesada MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
45 BNJ381 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDGYS P M DY WGQGTTVT VSS
28 BNJ381 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de DYSMD
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cadeia pesada
46 BNJ381 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AIHLNTGYTNYNQKFKG
47 BNJ381 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada GFYDGYSPMDY
34 BNJ381 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
39 BNJ383 Sequência de cadeia leve total com peptídeo sinal MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASESVDSYGNSFM HWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNE DPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C
40 BNJ383 Sequência de cadeia leve total sem peptídeo sinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVD SYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQSNEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC
41 BNJ383 Peptídeo sinal da sequência de região variável de cadeia leve MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
42 BNJ383 Sequência de região variável de cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVD SYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQSNEDPYTFGGGTKVEIKR
20 BNJ383 LCDR1 Kabat da sequência de região variável de RASESVDSYGNSFMH
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cadeia leve
21 BNJ383 LCDR2 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve RASNLES
22 BNJ383 LCDR3 Kabat da sequência de região variável de cadeia leve QQSNEDPYT
23 BNJ383 Sequência da região constante de cadeia leve TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYS LSSTLTLS KADYE KH KVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
48 BNJ383 Sequência de cadeia pesada total com peptídeo sinal MDWTWRVFCLLAVAPGAHSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMDWVRQ APGQGLEWMGAIHLNTGYTNYNQKFKGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR G FYDGYS P M DYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGK
49 BNJ383 Sequência de cadeia pesada total sem peptídeo sinal QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDGYS P M DY WGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDH KPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
26 BNJ383 Peptídeo sinal da sequência da região variável de MDWTWRVFCLLAVAPGAHS
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cadeia pesada
45 BNJ383 Sequência da região variável de cadeia pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TDYSMDWVRQAPGQGLEWMGAIHLNTGYT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS E DTAVYYCAR G FYDG YS P M DY WGQGTTVT VSS
28 BNJ383 HCDR1 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada DYSMD
46 BNJ383 HCDR2 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada AIHLNTGYTNYNQKFKG
47 BNJ383 HCDR3 Kabat da sequência da região variável de cadeia pesada GFYDGYSPMDY
34 BNJ383 Sequência da região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
“SIN” refere-se a SEQ ID NO.
[0200]“Ab” na tabela 2 refere-se à designação alfanumérica projetada para um dado anticorpo. Cada qual dos anticorpos é exemplificado nos exemplos funcionais.
[0201 ]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreende um conjunto de CDR de cadeia leve definido por Chothia ou um conjunto de CDR de cadeia leve combinado definido por Kabat-Chothia obtido de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve descritas nas tabelas 2 ou 3. Em alguma modalidade, um anticorpo anti-C5a, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito compreende um conjunto de CDR de cadeia pesada definido por Chothia ou um do conjunto CDR de cadeia pesada combinado, definido por Kabat-Chothia obtido de qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada descritas nas tabelas 2 ou 3.
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[0202]Em modalidades preferidas, um anticorpo anti-C5a aqui descrito liga a C5a, mas não a C5 de comprimento total nativo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a liga a C5a, mas não liga à cadeia alfa de C5 nativo não clivado. Da maneira aqui usada, “C5 não clivado” refere-se a uma proteína C5 que não foi clivada nos fragmentos de C5a e C5b por um convertase C5 AP ou CP. Uma sequência de aminoácidos exemplar para uma cadeia alfa de C5 de humano é apresentada em Haviland et al. (1991), supra, cuja sequência está incorporada aqui pela referência na sua íntegra.
[0203]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito não liga a paralogs de C5 de humano tal como humano C3a ou humano C4a.
[0204]A revelação também caracteriza anticorpos que bloqueiam de forma cruzada a ligação de um anticorpo anti-C5a aqui descrito (por exemplo, bloqueia de forma cruzada qualquer uma das BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ371, BNJ381, ou BNJ383). Da maneira aqui usada, os termos “anticorpo de bloqueio de forma cruzada” referem-se a um anticorpo que diminui a quantidade de ligação (ou previne ligação) de um anticorpo anti-C5a a um epítopo em uma proteína C5a do componente do complemento com relação à quantidade de ligação do anticorpo anti-C5a ao epítopo na ausência do anticorpo de bloqueio de forma cruzada. Métodos adequados para determinar se um primeiro anticorpo bloqueia em forma cruzada a ligação de um segundo anticorpo a um epítopo são conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos de bloqueio de forma cruzada podem ser identificados comparando a ligação do anticorpo anti-C5a monoclonal BNJ364 na presença e ausência de um anticorpo teste. Menor ligação do anticorpo BNJ364 na presença do anticorpo teste comparado com ligação do anticorpo BNJ364 na ausência do anticorpo teste indica que o anticorpo teste é um anticorpo de bloqueio de forma cruzada.
[0205]Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a atividade biológica de C5a. Métodos para medir atividade de C5a incluem, por
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95/210 exemplo, ensaios de quimiotaxia, radioimunoensaios (RIAs), ou ensaios imunoespecíficos ligados a enzima (ELISA) (vide, por exemplo, Ward and Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3):606-16 and Wurzner et al. (1991) Complement Inflamm 8:328-340). Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno a C5a pode inibir ativação de neutrófilo mediada porCõa in vitro. Métodos adequados para determinar se um anticorpo anti-C5a inibe a ativação de neutrófilo mediada por C5a in vitro, ou até que ponto o anticorpo inibe a ativação, são conhecidos na técnica e exemplificados nos exemplos funcionais a seguir. Por exemplo, neutrófilos de humano obtidos de doadores saudáveis podem ser isolados e colocados em contato com C5a de humano isolado na presença ou ausência de um anticorpo anti-C5a teste. Ativação de neutrófilos de humano dependente de C5a pode ser medida em função de liberação de mieloporoxidase (MPO) das células na presença de C5a. Uma inibição da quantidade de MPO liberada das células na presença de C5a e o anticorpo teste, comparada com a quantidade de MPO liberada das células na presença de C5a e um anticorpo controle, indica que o anticorpo teste inibe a ativação de neutrófilo mediada porCõa.
[0206]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno não inibe (ou não inibe substancialmente) a atividade de componente do complemento C5, comparado com o nível de inibição (caso haja) observado por um anticorpo controle correspondente ou fragmento de ligação ao antígeno deste (isto é, um anticorpo que não liga a C5a livre ou C5). Atividade C5 pode ser medida em função de sua capacidade de lisar célula em um fluido corpóreo sujeito. A capacidade de lisar célula, ou uma redução desta, de C5 pode ser medida por bem métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, por um ensaio hemolítico convencional tal como o ensaio de hemólise descrito por Kabat and Mayer (eds), “Experimental Immunochemistry, 2nd Edition”, 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), pages 135-139, ou um variação convencional deste ensaio tal como o método de hemólise
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96/210 de eritrócito de galinha conforme descrito, por exemplo, em Hillmen et al. (2004) Λ/ EngIJMed 350(6):552.
[0207]Em algumas modalidades, atividade C5, ou inibição desta, é quantificada usando um ensaio CH50eq. O ensaio CH50eq é um método para medir a atividade do complemento clássico total em soro. Este teste é um ensaio lítico, que usa eritrócitos sentetizados por anticorpo como o ativador do caminho do complemento clássico e várias diluições do soro teste para determinar a quantidade exigida para dar 50 % de lise (CH50). A porcentagem de hemólise pode ser determinada, por exemplo, usando um espectrofotômetro. O ensaio CH50eq fornece uma medida indireta de formação do complexo terminal do complemento (TCC), uma vez que o TCC por si mesmo é diretamente responsável pela hemólise que é medida.
[0208]0 ensaio é bem conhecido e comumente praticado pelos versados na técnica. Resumidamente, para ativar o caminho do complemento clássico, amostras de soro não diluído (por exemplo, amostras de soro de humano) são adicionadas aos poços do microensaio contendo os eritrócitos sensibilizados por anticorpo para gerar por meio disso TCC. Em seguida, os soros ativados são diluídos em poços do microensaio, que são revestidos com um reagente de captura (por exemplo, um anticorpo que liga a um ou mais componentes do TCC). O TCC presente nas amostras ativadas ligam aos anticorpos monoclonais revestindo a superfície dos poços do microensaio. Os poços são lavados e, a cada poço, é adicionado um reagente de detecção que é detectavelmente marcado e reconhece o TCC ligado. O rótulo detectável pode ser, por exemplo, um rótulo fluorescente ou um rótulo enzimático. Os resultados do ensaio são expressos em equivalentes da unidade de CH50 por mililitro (CH50 U Eq/mL).
[0209]Métodos adicionais para detectar e/ou medir atividade C5 in vitro são apresentados e exemplificados nos exemplos funcionais.
[0210]Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a interação entre C5a e C5aR1. Métodos adequados para detectar e/ou medir a
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97/210 interação entre C5a e C5aR1 (na presença e ausência de um anticorpo) são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Mary and Boulay (1993) EurJ Haematol 51(5):282-287: Kaneko et al. (1995) Imunologia 86(1):149-154: Giannini et al. (1995) J Biol Chem 270(32):19166-19172: e publicação de pedido de patente U.S. No. 20060160726. Por exemplo, a ligação de C5a detectavelmente marcado (por exemplo, marcado radioativamente) a células mononucleares de sangue periférico que expressam C5aR1 pode ser avaliada na presença e ausência de um anticorpo. Uma diminuição na quantidade de C5a detectavelmente marcado que liga a C5aR1 na presença do anticorpo, comparada com a quantidade de ligação na ausência do anticorpo, é uma indicação de que o anticorpo inibe a interação entre C5a e C5aR1.
[0211]Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo a C5a pode inibir a interação entre C5a e C5L2. Métodos para detectar e/ou medir a interação entre C5a e C5L2 são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Ward (2009) J Mol Med 87(4):375-378 and Chen et al. (2007) Nature 446(7132):203-207. Métodos adicionais para avaliar o efeito biológico de um anticorpo anti-C5a aqui descritos são exemplificados nos exemplos funcionais a seguir.
[0212]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a liga especificamente a uma proteína C5a do componente do complemento de humano (por exemplo, a proteína C5a de humano com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2). Os termos “ligação específica”, “liga especificamente”, e termos gramaticais similares, da maneira aqui usada, referem-se a duas moléculas formando um complexo (por exemplo, um complexo entre um anticorpo e uma proteína C5a do componente do complemento) que é relativamente estável em condições fisiológicas. Tipicamente, ligação é considerada específica quando o constante de associação (ka) é maior que 106M’1s’1. Assim, um anticorpo pode especificamente ligara uma proteína C5a com uma Ka de pelo menos (ou maior que) 106 (por exemplo, pelo menos ou maior que 107, 108, 109, 101°, 1011, 1012, 1013, 1014, ou 1015ou maior) M’1s’1. Em
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98/210 algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma constante de dissociação (kd) menor ou igual a 10’3 (por exemplo, 8 x 10-4, 5 x 10-4, 2 x 10-4, 10-4, ou 10-5) s_1.
[0213]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd menor que 10-8,10 ®, 10-10, 10’11, ou 10’12 Μ. A constante de equilíbrio Kd é a razão das constantes da taxa cinética - kd/ka. Em algumas modalidades, um anticorpo antiCõaaqui descrito tem uma Kd menor que 1,35x 10'9 M. Exemplos dos anticorpos antiC5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 1,35 x 10'9 M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a de BNJ364, BNJ367, BNJ371, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381 e BNJ383.
[0214]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd menor que 1 x 10’9 M. Exemplos dos anticorpos anti-C5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 10-9 M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a de BNJ364, BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
[0215]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd menor que 5 x 10’1° M. Exemplos dos anticorpos anti-C5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 5 x 10-10 M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a de BNJ367, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
[0216]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd menor que 2 x 10’1° M. Exemplos dos anticorpos anti-C5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 2 x 10'1° M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a de BNJ367, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
[0217]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma Kd menor que 1 x 10'1° M. Exemplos dos anticorpos anti-C5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 1 x 10’1° M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a BNJ369, BNJ381, e BNJ383.
[0218]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito tem uma
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Kd menor que 7,5 x 10’11 M. Exemplos dos anticorpos anti-C5a que ligam a C5a com uma Kd que é menor que 7,5 x 10’11 M incluem, por exemplo, os anticorpos anti-C5a BNJ369 e BNJ383.
[0219]Métodos para determinara afinidade de um anticorpo com um antígeno da proteína são conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo com uma antígeno da proteína pode ser quantificada usando uma variedade de técnicas tais como, mas sem limitações, método Western blot, dot blot, Biolayer Interferometry, Suface Plasmon Resonance (SPR) (por exemplo, sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J)., ou ensaios imunoespecificos ligados a enzima (ELISA). Vide, por exemplo, Harlow and Lane (1988) “Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny K. C. Lo (2004) “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Human Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) “Antibody Engineering, A Practical Guide”, W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) “Antibody Engineering”, 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993) J Immunol Meth 160:191198; Jonsson et al. (1993) Ann Biol Clin 51:19-26; and Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627.
[0220]Qualquer da conjuntos de CDR de cadeia leve ou regiões variáveis de cadeia leve aqui descritos podem ser pareados com qualquer um dos conjuntos de CDR de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia pesada aqui descritas. É bem do conhecimento dos versados na técnica, por exemplo, confirmar (teste) que um anticorpo anti-C5a gerado por um pareamento como esse possui o afinidade ou atividade desejada. Métodos adequados para confirmar a atividade e/ou afinidade de um anticorpo anti-C5a são aqui descritos.
[0221 ]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam tanto a C5a de humano (hC5a) quanto a C5a de um mamífero não humano tal como um primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo). Em algumas
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100/210 modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito não liga a paralogs de C5a de humano tal como C3a ou C4a da mesma espécie de mamífero não humano.
[0222]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito liga a hC5a livre e um proteína C5a de macaco cinomolgo compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
MLQEKIEEIAAKYKHLVVKK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCWASQLRANNSHKDLQLGR (SEQ ID NO:179).
[0223]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito liga a hC5a livre e a uma proteína C5a de macaco reso compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQIDNO:179.
[0224]Em algumas modalidades, um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, pode ligar a uma forma desarginada de proteína C5a de uma espécie de mamífero não humano (por exemplo, uma espécie de primata não humano). Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ligar a um C5a livre-proteína desarg de macaco cinomolgo ou macaco reso, a proteína compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
MLQEKIEEIAAKYKHLVVKK CCYDGVRINH DETCEQRAAR ISVGPRCVKA FTECCWASQLRANNSHKDLQLG (SEQ ID NO:180).
[0225]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam a C5a de camundongo (isto é, o C5a livre de camundongo). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a aqui descritos ligam a C5a de camundongo, mas não a C5a de humano. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito não liga a C5 de camundongo não clivado, nativo (completamente dobrado). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito não liga a paralogs de C5a de camundongo tal como camundongo C3a ou camundongo C4a.
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[0226]Um anticorpo C5a anticamundongo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, pode ligara uma proteína C5a de camundongo compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
LRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNE CCTIANKIRKESPHKPVQLGR (SEQ ID NO:51). Vide também, por exemplo, Wetsel et al. (1987) Biochem 26:737-743. Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, pode ligara uma forma desarginada de proteína C5a de camundongo compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
LRQKIEEQAAKYKHSVPKKCCYDGARVNFYETCEERVARVTIGPLCIRAFNE CCTIANKIRKESPHKPVQLG (SEQ ID NO:52).
Em algumas modalidades, o anticorpo C5a anticamundongo liga tanto a proteína C5 de camundongo de comprimento total quanto a forma desarginada da proteína C5a de camundongo.
[0227]Um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode, por exemplo, conter um conjunto de CDR de cadeia leve obtido de um polipeptídeo da região variável de cadeia leve compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:
EIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKLWIYYTSN LAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGVGTKLELKR (SEQ ID NO:53).
[0228]Por exemplo, um anticorpo C5a anticamundongo pode conter: (i) uma CDR1 de cadeia leve definido por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: RASSSVNYIY (SEQ ID NO:54); (ii) uma CDR2 de cadeia leve definido por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: YTSNLAP (SEQ ID NO:55); e/ou (iii) uma CDR3 de cadeia leve definido por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: QQFTSSPLT (SEQ ID NO:56).
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[0229]O anticorpo C5a anticamundongo pode conter uma região constante de cadeia leve, por exemplo, a região constante de cadeia leve kappa de camundongo compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:57).
[0230]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode conter um peptídeo sinal amino-terminal, por exemplo, um peptídeo sinal compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:58).
[0231 ]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode conter um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
REIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKLWIYYTS NLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGVGTKLELKR ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWT DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:59) ou
MGWSCIILFLVATATGVHSREIVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQ KS DAS PKLWIYYTS N LAPGVPAR FSGSGSGNSYS LTISS M EG E DAATYYCQQFTSS PLTFGVGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NQ:60). Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo 2 a 214 aminoácidos da SEQ ID NO:59. Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo 1 a 19 e 21 a 233 aminoácidos da SEQ ID NO:60.
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[0232]Um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode, por exemplo, conter um conjunto de CDR de cadeia pesada obtido de uma polipeptídeo da região variável de cadeia pesada compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos: LEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYYINWVKQSHGKSLEWIGYIYPND GDTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYSDYGMDYWG QGTSVTVSS (SEQ ID NO:61). Por exemplo, um anticorpo C5a anticamundongo pode conter: (i) uma CDR1 de cadeia pesada definida por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: DYYYIN (SEQ ID NO:62); (ii) uma CDR2 de cadeia pesada definida por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: YIYPNDGDTNYNQKFKG (SEQ ID NO:63); e/ou (iii) uma CDR3 de cadeia pesada definida por Kabat compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: PYYSDYGMDY (SEQ ID NO:64).
[0233]O anticorpo C5a anticamundongo pode conter uma região constante de cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode conter um peptídeo sinal amino-terminal, por exemplo, um peptídeo sinal compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:65).
[0234]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito pode conter um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo na seguinte sequência de aminoácidos:
LEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYYINWVKQSHGKSLEWIG YIYPNDGDTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYSDYG MDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:66) ou
MGWSCIILFLVATATGVHSLEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYYINW VKQSHGKSLEWIGYIYPNDGDTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSA VYYCARPYYSDYGMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:67).
[0235]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui
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104/210 descrito contém um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo 2 a 121 aminoácidos da SEQ ID NO:66. Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo 1 a 19 e21 a 140 aminoácidos da SEQ ID NO:67. Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo da região constante de cadeia pesada compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos da sequência supradescrita.
[0236]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo: (i) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:54; (ii) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:55; e (iii) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:56; (iv) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:62; (v) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:63; e/ou (vi) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:64.
[0237]Em algumas modalidades, um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito contém um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:59 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo, ou consistindo na sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:66.
[0238]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ligar a C5a de humano e a C5a de camundongo.
Métodos para Produzir os Anticorpos anti-C5a e Seus Fragmentos de Ligação de Antígeno
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[0239]A revelação também caracteriza métodos para produzir qualquer um dos anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito. Em algumas modalidades, métodos para preparar um anticorpo aqui descrito podem incluir imunizar um sujeito (por exemplo, um mamífero não humano) com um imunógeno apropriado. Imunógenos adequados para gerar qualquer um dos anticorpos aqui descritos são apresentados aqui. Por exemplo, para gerar um anticorpo que liga a C5a, versados na técnica podem imunizar um sujeito adequado (por exemplo, um mamífero não humano tais como um rato, um camundongo, um gerbo, um hamster, um cão, um gato, um porco, uma cabra, um cavalo, ou um primata não humano) com um polipeptídeo C5a de comprimento tal como um polipeptídeo C5a de comprimento compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1 ou a forma desarginada de C5a (por exemplo, o C5a desarg de humano compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:2). Em algumas modalidades, o mamífero não humano é deficiente em C5, por exemplo, um camundongo deficiente em C5 descrito, por exemplo, em Levy and Ladda (1971) Λ/at Λ/ew 6/0/229(2):51-52: Crocker et al. (1974) J Clin Pathol 27(2): 122-124; Wetsel et al. (1990) J Biol Chem 265:24352440; and Jungi and Pepys (1981) Immunology 43(2):271-279. C5a de humano pode ser purificado a partir de soro de humano conforme descrito, por exemplo, em McCarthy and Henson (1979) J Immunol 123(6):2511-2517 and Manderino et al. (1982) J Immunol Methods 53(1):41-50. Vide também os exemplos funcionais. C5a de humano pode também ser gerado in vitro conforme descrito, por exemplo, em Vallota and Müller-Eberhard (1973) J Exp Med 137:1109. C5a de humano purificado é também comercialmente disponível, por exemplo, de Complement Technology, Inc. (catalog number A144; Tyler, Texas). C5a recombinante pode também ser gerado pelos versados na técnica conforme descrito, por exemplo, em Tothe et al. (1994) Prot Sei 3:1159-1168.
[0240]Um sujeito adequado (por exemplo, um mamífero não humano) pode
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106/210 ser imunizado com o antígeno apropriado junto com imunizações subsequentes de intensificação um número de vezes suficiente para elicitar a produção de um anticorpo pelo mamífero. O imunógeno pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, um mamífero não humano) com um adjuvante. Adjuvantes usados na produção de um anticorpo em um sujeito incluem, mas sem limitações, adjuvantes de proteína; adjuvantes bacterianos, por exemplo, todas as bactérias (BCG, Corynebacterium parvum ou Salmonella minnesota) e componentes bacterianos incluindo esqueleto da parede celular, trealose dimicolato, monofosforil lipídio A, resíduo extraível de metanol (MER) de tubérculo bacillus, adjuvante de Freund completo ou incompleto; adjuvantes virais; adjuvantes químicos, por exemplo, hidróxido de alumínio, e iodoacetato e colesteril hemisuccinato. Outros adjuvantes que podem ser usados nos métodos para induzir uma resposta imune incluem, por exemplo, proteínas de toxina colérica e parapoivírus. Vide também Bieg et al. (1999) Autoimmunidadey 31(1):15-24. Vide também, por exemplo, Lodmell et al. (2.000) Vaccine 18:1059-1066; Johnson et al. (1999) J Med Chem 42:4640-4649; Baldridge et al. (1999) Methods 19:103-107; and Gupta et al. (1995) Vaccine 13(14): 1263-1276.
[0241 ]Em algumas modalidades, os métodos incluem preparar uma linhagem celular hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal que liga ao imunógeno. Por exemplo, um mamífero adequado tal como um camundongo de laboratório é imunizado com um polipeptídeo C5a conforme descrito anteriormente. Células de produção de anticorpo (por exemplo, células B do baço) do mamífero imunizado podem ser isoladas dois a quatro dias depois de pelo menos uma imunização de intensificação do imunógeno e em seguida crescido resumidamente em cultura antes de fusão com células de uma linhagem celular de mieloma adequada. As células podem ser fundidas na presença de um promotor de fusão tais como, por exemplo, vírus vaccinia ou polietileno glicol. As células híbridas obtidas na fusão são clonadas, e clones da célula que secreta os anticorpos desejados são selecionados. Por exemplo, células do baço
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107/210 de camundongos Balb/c imunizados com um imunógeno adequado podem ser fundidas com células da linhagem celular de mieloma PAI ou da linhagem celular de mieloma Sp2/0-Ag 14. Depois da fusão, as células são expandidas em meio de cultura adequada, que é suplementada com um meio de seleção, por exemplo, meio HAT, em intervalos regulares a fim de impedir células de mieloma normais de sobrecrescer as células de hibridoma desejadas. As células híbridas obtidas são então classificadas para secreção dos anticorpos desejados, por exemplo, um anticorpo que liga a C5a e inibe a interação entre C5a e um receptor de C5a (por exemplo, C5aR1).
[0242]Em algumas modalidades, versados na técnica podem identificar um anticorpo anti-C5a de uma biblioteca predisposta não imune conforme descrito, por exemplo, na patente U.S. no. 6.300.064 (to Knappik et al.; Morphosys AG) and Schoonbroodt et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(9): e 81.
[0243]Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos podem envolver, ou ser usados junto, por exemplo, com tecnologias de exibição de fago, exibição bacteriana, exibição superficial de levedura, exibição viral eucariótica, exibição de célula de mamífero, e técnicas de classificação de anticorpo sem célula (por exemplo, exibição ribossomal) (vide, por exemplo, Etz etal. (2001/ J Bacteriol 183:6924-6935: Cornells (2000) Curr Opin Biotechnol 1J.:450-454; Klemm et al. (2.000) Microbiology 146:3025-3032: Kieke et al. (1997) Protein Eng 10:1303-1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol Prog 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328:430-444: Grabherret al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192; Michael etal. (1995) Gene Ther2:660-668; Pereboevetal. (2001) J Virol75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231.: 119-135; e Hanes et al. (2.000) Nat Biotechnol 18:1287-1292).
[0244]Métodos para identificar anticorpos usando vários métodos de exibição de fago são conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de fago, domínios do anticorpo funcional são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as
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108/210 sequências de polinucleotídeo que as codificam. Tal fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação de antígeno de anticorpos, tais como Fab, Fv, ou fragmentos do anticorpo de Fv estabilizado ligado a dissulfeto, expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpo combinatorial (por exemplo, humano ou murino). Fago usado nesses métodos são tipicamente fago filamentoso tais como fd e M13. Os domínios de ligação de antígeno são expressos como uma proteína recombinantemente fundida em qualquer uma das proteínas de revestimento de fago pill, pVIII, ou pIX. Vide, por exemplo, Shi et al. (2010) JMB 397:385-396. Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para produzir as imunoglobulinas, ou seus fragmentos, aqui descritos incluem aqueles revelados em Brinkman et al. (1995) J Immunol Methods 182:41-50: Ames et al. (1995) J Immunol Methods 184:177-186: Kettleborough et al. (1994) Eur J Immunol 24.952-958', Persic et al. (1997) Gene 187:9-18: Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; e publicação de PCT nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, e WO 95/20401. Métodos adequados são também descritos, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821,047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108.
[0245]Em algumas modalidades, as bibliotecas de anticorpo de exibição de fago podem ser geradas usando mRNA coletado das células B dos mamífero imunizados. Por exemplo, uma amostra de célula esplênica compreendendo células B pode ser isolada dos camundongos imunizados com polipeptídeo C5a conforme descrito anteriormente. mRNA pode ser isolado das células e convertido em cDNA usando técnicas moleculares de biologia padrões. Vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), supra; Benny K. C. Lo (2004), supra\ and Borrebaek (1995), supra. O cDNA que codifica para as regiões
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109/210 variáveis de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulinas são usados para construir a biblioteca de exibição de fago. Métodos para gerar uma biblioteca como essa são descritos, por exemplo, em Merz et al. (1995) J Neurosci Métodos 62(1-2):213-9: Di Niro et al. (2005) Biochem J 388(Pt 3):889-894: and Engberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51.:355-376.
[0246]Em algumas modalidades, uma combinação de seleção e classificação pode ser empregada para identificar um anticorpo de interesse, por exemplo, de uma população de anticorpos derivados de hibridoma ou uma biblioteca de anticorpo de exibição de fago. Métodos adequados são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnologya 15:62-70; Brinkman etal. (1995), supra\ Ames et al. (1995), supra-, Kettleborough et al. (1994), supra-, Persic et al. (1997), supra-, and Burton et al. (1994), supra. Por exemplo, uma pluralidade de vetores fagemídeos, cada qual codificando uma proteína de fusão de uma proteína de revestimento de bacteriófago (por exemplo, fago pill, pVIII, ou pIX de M13) e uma diferente região de combinação de antígeno são produzidos usando técnicas moleculares de biologia padrões e então introduzidos em uma população de bactérias (por exemplo, E. coli). Expressão do bacteriófago em bactérias pode, em algumas modalidades, exigir uso de um fago ajudante. Em algumas modalidades, nenhum fago ajudante é exigido (vide, por exemplo, Chasteen et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(21 ):e145). Fagos produzidos a partir das bactérias são recuperados e então colocados em contato, por exemplo, com um antígeno alvo ligado a um suporte sólido (imobilizado). Fago pode também ser colocado em contato com antígeno em solução, e o complexo é subsequentemente ligado a um suporte sólido.
[0247]Em algumas modalidades, o fago imobilizado é o fago de interesse. Dessa maneira, o fago não ligado é removido lavando o suporte. Em seguida da etapa de lavagem, fago ligado é então eluído do suporte sólido, por exemplo, usando um tampão de baixo pH ou um livre competidor antígeno alvo, e recuperado infectando
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110/210 as bactérias. Em algumas modalidades, o fago que não é imobilizado é o fago de interesse. Em tais modalidades, a população de fago pode ser colocada em contato com o antígeno duas ou mais vezes para depletar da população qualquer um dos fagos que ligam ao suporte. Fago não ligado é então coletado e usado para etapas de classificação subsequentes.
[0248]Para enriquecer a população de fago para partículas de fago que contêm anticorpos com uma maior afinidade com o antígeno alvo (reduzindo ao mesmo tempo a proporção de fago que pode ligar ao antígeno não especificamente), o fago eluído (descrito anteriormente) pode ser usado para reinfectar uma população de células hospedeiras bacterianas. O fago expresso é então isolado das bactérias e novamente colocado em contato com um antígeno alvo. A concentração de antígeno, pH, temperatura e inclusão de detergentes e adjuvantes durante o contato pode ser modulada para enriquecer para fragmentos do anticorpo de maior afinidade. O fago não ligado é removido lavando o suporte sólido. O número ou ciclos, duração, pH, temperatura e inclusão de detergentes e adjuvantes durante a lavagem pode também ser modulado para enriquecer para fragmentos do anticorpo de maior afinidade. Em seguida da etapa de lavagem, fago ligado é então eluído do suporte sólido. Em qualquer lugar de um a seis ciclos interativos de ciclagem repetida das etapas podem ser usados para enriquecer para fago contendo anticorpos com maior afinidade com o antígeno alvo. Em algumas modalidades, uma etapa de desseleção pode também ser realizada junto com qualquer uma das abordagens de ciclagem repetida das etapas aqui descritas.
[0249]Fago individual da população pode ser isolado infectando as bactérias e então plaqueando a uma densidade para permitir formação de anticorpos monoclonais.
[0250]Por exemplo, para identificar usando técnicas de exibição de fago um anticorpo que liga a C5a, mas não a C5, a seguinte abordagem de ciclagem repetida
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111/210 das etapas pode ser empregada. A população pode primeiro ser colocada em contato com uma superfície contendo C5 de comprimento total nativo de humano ligado. O processo pode ser repetido duas ou mais vezes, cada vez coletando o fago não ligado. A população pode também ser colocada em contato com um suporte sólido contendo proteínas C4 e/ou C3 ligadas na superfície. Fago não ligado das etapas anteriores é então colocado em contato com uma superfície contendo C5a ou C5a desarginado ligado. Fago que liga a C5a é eluído da superfície e recuperado infectando as bactérias. Rodadas interativas de seleção de fago podem ser realizadas. Depois de uma a seis rodadas de seleção, fagemídeo individual recuperado pode ser classificado para expressão de fragmentos do anticorpo com a especificidade e afinidade desejadas.
[0251 ]Uma subpopulação dos anticorpos classificada usando os métodos anteriores pode ser caracterizada para sua especificidade e afinidade de ligação com um imunógeno particular (por exemplo, C5a) usando qualquer método imunológico ou bioquímico conhecido na técnica. Por exemplo, ligação específica de um anticorpo a C5a, comparada com C5 de comprimento total nativo pode ser determinada, por exemplo, usando métodos imunológicos ou bioquímicos tais como, mas sem limitações, um ensaio ELISA, ensaios SPR, ensaio de imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, e diálise de equilíbrio conforme descrito anteriormente. Imunoensaios que podem ser usados para analisar ligação imunoespecífica e reatividade cruzada dos anticorpos incluem, mas sem limitações, sistemas de ensaio competitivo e não competitivo usando técnicas tais como Western blots, RIA, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), imunoensaios “sanduíches”, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A. Tais ensaios são de rotina e bem conhecidos na técnica.
[0252] Anti corpos podem também ser ensaiados usando qualquer ensaio baseado em SPR conhecido na técnica para caracterizar os parâmetros cinéticos da
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112/210 interação do anticorpo com C5a. Qualquer instrumento SPR comercialmente disponível incluindo, mas sem limitações, Instrumentos BIAcore (Biacore AB; Uppsala, Sweden); instrumentos lAsys (Afinidade Sensors; Franklin, Massachussete); sistema IBIS (Windsor Scientific Limited; Berks, UK), sistemas SPR-CELLIA (Nippon Laser and Electronics Lab; Hokkaido, Japão), e SPR Detector Spreeta (Texas Instruments; Dalas, Texas) pode ser usado nos métodos aqui descritos. Vide, por exemplo, Mullett et al. (2000) Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) Reviews in Mol Biotech 82: 303-323; Fivash et al. (1998) CurrOpin Biotechnol 9: 97-101; and Rich et al (2.000) CurrOpin Biotechnol 11.: 54-61.
[0253]Entende-se que os métodos anteriores podem também ser usados para determinar se, por exemplo, um anticorpo anti-C5a não liga a proteínas de C5, C3, e/ou C4 nativo de comprimento total. Os métodos anteriores podem também ser usados para determinar se um anticorpo que liga a C5a também inibe a interação entre C5a e um receptor de C5a. Os métodos anteriores podem também ser usados para determinar se um anticorpo que liga a C5a também inibe a atividade de C5a.
[0254]Conforme descrito nas referências anteriores, depois da seleção de fago, as regiões de codificação do anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos totais, incluindo anticorpos de humano, ou qualquer fragmento desejado, e s em qualquer hospedeiro desejado, incluindo célula de mamíferos, células de inseto, células de planta, levedura, e bactérias, por exemplo, conforme descrito com detalhes a seguir. Por exemplo, técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’)2 podem também ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles revelados na publicação de PCT no. WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) 5/oTec/?/?/'aues 12(6):864-869: and Sawai etal. (1995) AmJRepr Immunol 34:26-34; and Better etal. (1988) Science 240:1041-1043. Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas nas patentes U.S. nos. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al. (1991)
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Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc Nat Acad Sci USA 90:79957999; and Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1040.
[0255]Tecnologia de exibição de fago pode também ser usada, por exemplo, para aumentar a afinidade de um anticorpo com seu antígeno cognato. A tecnologia, referida como maturação de afinidade, pode empregar mutagênese ou CDR caminhante e resseleção para identificar anticorpos que ligam com maior afinidade a um antígeno comparado com o anticorpo inicial ou parental. Vide, por exemplo, Glaser et al. (1992) J Immunol 149:3903-3913. Bibliotecas que consistem em um agrupamento de clones variantes podem ser construídas, cada qual diferenciada por uma ou mais substituições de aminoácidos. Mutantes com maior afinidade de ligação com o antígeno podem ser selecionados para colocar em contato os mutantes imobilizados com antígeno marcado ou qualquer combinação de métodos descritos anteriormente. Qualquer método de classificação conhecido na técnica pode ser usado para identificar anticorpos mutantes com maior afinidade com o antígeno (por exemplo, técnicas SPR ou ELISA).
[0256]Em algumas modalidades, mapeamento do epítopo pode ser usado para identificar, por exemplo, a região de C5a que interage com um anticorpo, por exemplo, uma região de C5a que liga a C5aR1. Métodos para identificar o epítopo no qual um anticorpo particular liga são também conhecidos na técnica e são descritos anteriormente.
[0257]Os anticorpos e seus fragmentos identificados aqui podem ser ou pode ser feitos “quiméricos”. Anticorpos quiméricos e seus fragmentos de ligação de antígeno compreendem porções de duas ou mais espécies diferentes (por exemplo, camundongo e humano). Anticorpos quiméricos podem ser produzidos com regiões variáveis de camundongo de especificidade desejada fundidas nos domínios constantes de humano (por exemplo, patente U.S. No. 4.816.567). Desta maneira, anticorpos não humanos podem ser modificados para produzi-los mais adequados para aplicação
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114/210 clínica em humano (por exemplo, métodos para tratar ou prevenir um distúrbio mediado por complemento em um sujeito).
[0258]Os anticorpos monoclonais da presente revelação incluem formas “humanizadas” dos anticorpos não humanos (por exemplo, camundongo). mAbs humanizados ou enxertados com CDR são particularmente usados como agentes terapêuticos para humanos devido a eles não serem varridos da circulação tão rapidamente quanto os anticorpos de camundongo e tipicamente não provocarem uma reação imune adversa. No geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos dos aminoácidos introduzidos nele de uma fonte não humana. Esses resíduos dos aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos “import”, que são tipicamente tirados de um domínio variável “import”. Métodos de preparar anticorpos humanizados são no geral bem conhecidos na técnica. Por exemplo, humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (vide, por exemplo, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525: Riechmann etal. (1988) Nature 332:323-327: and Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), usando estruturas de roedor ou sequências de CDR em substituição das sequências correspondentes de um anticorpo de humano. Também vide, por exemplo, Staelens et al. (2006) Mol Immunol 43:1243-1257. Em algumas modalidades, formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, camundongo) são anticorpos de humano (anticorpo recipiente) nos quais os resíduos dos aminoácidos da região de CDR do anticorpo não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho, ou anticorpo de primata não humano) com a especificidade e afinidade desejadas, e capacidade de ligação são enxertados no andaime da estrutura de um anticorpo de humano. Métodos de humanização adicionais são descritos a seguir nos exemplos funcionais.
[0259]Métodos para enxertar sequências de CDR de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo não humano) nas regiões da estrutura de um anticorpo aceptor (por exemplo, um anticorpo de humano) são bem conhecidos na técnica e são
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115/210 descritos, por exemplo, em Jones et al. (1986) Nature 321:522-525: Verhoeyen et al. (1988) Science 239(4847):1534-1536: Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327: Queen et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:10029-10033; publicação de PCT no. WO 93/011237; Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering, Design and Selection 4:773-783; Benny K. C. Lo (2004) “Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) “Antibody Engineering, A Practical Guide”, W.H. Freeman and Co., NY; and Borrebaek (1995) “Antibody Engineering”, 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford. Por exemplo, CDRs de urn anticorpo doador pode ser enxertado nas regiões da estrutura de um anticorpo aceptor usando técnicas de reação de cadeia polimerase de extensão de sobreposição (PCR) conforme descrito, por exemplo, em Daugherty et al. (1991) Nucleic Acids Res 19(9):2471-2476: Roguska et al. (1996) Protein Engineering 9(10):895-904: and Yazaki et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection 17(5):481-489.
[0260]Em modalidades onde as sequências de aminoácidos de CDR selecionadas são sequências curtas (por exemplo, pouco mais que 10-15 aminoácidos em comprimento), ácidos nucléicos que codificam as CDRs podem serquimicamente sintetizados conforme descrito, por exemplo, em Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium series 51(1):129-130 e patente U.S. No. 6.995.259. Para um dado sequência de ácido nucléico que codifica um anticorpo aceptor, a região da sequência de ácido nucléico que codifica as CDRs pode ser substituída com os ácidos nucléicos quimicamente sintetizados usando técnicas moleculares de biologia padrões. As extremidades 5’ e 3’ dos ácidos nucléicos quimicamente sintetizados podem ser dimensionadas para compreender sítios de extremidade pegajosos de enzima de restrição para uso na clonagem dos ácidos nucléicos no ácido nucléico que codifica a região variável do anticorpo doador.
[0261 ]Em alguns exemplos, um ou mais resíduos dos aminoácidos da região da estrutura da imunoglobulina de humano são também substituídos por resíduos dos
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116/210 aminoácidos correspondentes do anticorpo não humano (assim denominados “retromutações”). Além do mais, bibliotecas de exibição de fago podem ser usadas para variar aminoácidos nas posições escolhidas na sequência do anticorpo. As propriedades de um anticorpo humanizado são também afetadas pela escolha da estrutura humana. Além disso, anticorpos humanizados e quimerizados podem ser modificados para compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador a fim de melhorar ainda mais as propriedades do anticorpo, tal como, por exemplo, afinidade ou função efetora.
[0262]Anticorpos completamente humanos são também providos na revelação. Os termos “anticorpo de humano” inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes (se presente) derivadas das sequências de imunoglobulina de humano, preferivelmente sequências linha germinal de humano. Anticorpos de humano podem incluir resíduos dos aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina linha germinal de humano (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). Entretanto, os termos “anticorpo de humano” não incluem os anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências da estrutura humana (isto é, anticorpos humanizados). Anticorpos de humano ou completamente humano podem ser derivados de camundongos transgênicos que carregam genes do anticorpo de humano (que carregam a variável (V), diversidade (D), união (J), e constante (C) exons) ou das células de humano. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que podem, mediante imunização, produzir um repertório completo de anticorpos de humano na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Vide, por exemplo, Jakobovits et al. (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90:2551; Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258: Bruggemann et al. (1993) Year in Immunol. 7:33; and Duchosal etal. (1992) Nature 355:258. Cepas de camundongo transgênico podem ser
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117/210 modificadas por engenharia para conter sequências genéticas de genes de imunoglobulina de humano não rearranjadas. Um exemplo de um camundongo como esse é o Mouse® HuMAb (Medarex, Inc)., que contém imunoglobulina de humano transgene miniloci que codifica as sequências de imunoglobulina cadeia μ pesada e rç leve de humano não rearranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam o loci de cadeia μ e rçendógena. Vide, por exemplo, Lonberg, etal. (1994) Nature 368(6474):856859. A preparação e uso de camundongos HuMab, e as modificações genômicas realizadas portais camundongos, são adicionalmente descritas em Tayloretal. (1992) Nucleic Acids Res 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:1 17-123; Tuaillon etal. (1994) J Immunol 152:2912-2920: Taylor et al. (1994) International Immunology 6:579-591; and Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnol 14:845-851. Um sistema de camundongo transgênico alternativo para expressar genes de imunoglobulina de humano é referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc), e é descrito, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584; e 6.162.963. Como o sistema HuMAb Mouse®, o sistema Xenomouse envolve ruptura de o genes de cadeia pesada e leve de camundongo endógeno e inserção no genoma dos transgenes de camundongo que carregam não rearranjado loci de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de humano que contêm sequências de região variável e constante de humano. Outros sistemas conhecidos na técnica para expressar genes de imunoglobulina de humano incluem o sistema KM Mouse®, descrito com detalhes na Publicação de PCT WO 02/43478 e o sistema de camundongo TC descrito em Tomizuka et al. (2.000) Proc NatlAcad Sci USA 97:722727.
[0263]As sequências de humano podem codificar tanto para as cadeias pesadas quanto leves de anticorpos de humano e podem funcionar corretamente nos camundongos, rearranjo em andamento para fornecer um amplo repertório de anticorpo
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118/210 similar ao dos humanos. Os camundongos transgênicos podem ser imunizados com o imunógeno da proteína alvo para criar um arranjo diverso de anticorpos específicos e seu RNA de codificação. Ácidos nucléicos que codificam os componentes da cadeia do anticorpo de tais como anticorpos podem então serclonados a partir do animal em um vetor de exibição. Tipicamente, populações separadas de ácidos nucléicos que codificam sequências de cadeia pesada e leve são clonadas, e as populações separadas então recombinadas na inserção no vetor, de maneira tal que qualquer dada cópia do vetor receba uma combinação aleatória de uma cadeia pesada e uma leve. O vetor é projetado para expressar cadeias do anticorpo de forma que ele possa ser montado e exibido na superfície externa de um pacote de exibição contendo o vetor. Por exemplo, cadeias do anticorpo podem ser expressas como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago da superfície externa do fago. A seguir, pacotes de exibição podem ser selecionados e classificados para exibição da ligação dos anticorpos a um alvo.
[0264]Além do mais, as bibliotecas de exibição de fago classificadas anteriormente podem incluir anticorpos de humano (Hoogenboom et al. (1992) J Mol Biol 227:381; Marks et al. (1991) J Mol 6/0/222:581 -597; and Vaughan etal. (1996) Nature Biotech 14:309). Bibliotecas de fago sintéticas podem ser criadas que usam combinações randomizadas de regiões V de anticorpo de humano sintético. Por seleção do antígeno, anticorpos completamente humanos podem ser feitos, em que as regiões V são muito similares às de humano em natureza. Vide, por exemplo, patentes U.S. Nos. 6.794.132; 6.680.209; 4.634.666; e Ostberg et al. (1983) Hybridoma 2:361-367, cujos teores estão incorporados aqui pela referência na sua íntegra.
[0265]Para a geração de anticorpos de humano, vide também Mendez et al. (1998) Nature Genetics 15:146-156 and Green and Jakobovits (1998) J Exp Med 188:483-495, cujas revelações estão por meio desta incorporadas pela referência na sua íntegra. Anticorpos de humano são adicionalmente discutidos e delineados nas
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119/210 patentes U.S. Nos.: 5.939.598; 6.673.986; 6.114.598; 6.075.181; 6.162.963; 6.150.584; 6.713.610; e 6.657.103 bem como publicação das patentes U.S. Nos. 20030229905 A1, 20040010810 A1, 20040093622 A1, 20060040363 A1, 20050054055 A1,20050076395 A1, e 20050287630 A1. Vide também publicação international Nos. WO 94/02602, WO 96/34096, e WO 98/24893, e patente européia No. EP 0 463 151 B1. Cujas revelações das patentes, pedidos, e referências supracitados estão por meio destas incorporados pela referência na sua íntegra.
[0266]Em um abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., têm utilizado um abordagem “minilocus”. Na abordagem minilocus, um locus Ig exógeno é mimetizado através da inclusão de peças (genes individuais) do locus Ig. Assim, um ou mais genes Vh, um ou mais genes Dh, um ou mais genes Jh, uma região constante mu, e uma segunda região constante (preferivelmente uma região constante gama) são formados em um construto para inserção em um animal. Estas abordagem é descrita, por exemplo, nas patentes U.S. Nos.: 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661,016, 5.770.429, 5.789.650 e 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, 5.643.763, 5.569.825, 5.877.397, 6.300.129, 5.874.299, 6.255.458 e 7.041.871, cujas revelações estão por meio destas incorporadas pela referência na sua íntegra. Vide também patente européia No. 0 546 073 B1, publicação de patentes internacionais Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, e WO 98/24884, cujas revelações estão por meio destas incorporadas pela referência na sua íntegra. Vide adicionalmente Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Res 20: 6287; Chen et al. (1993) Int Immunol 5: 647; Tuaillon et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 3720-4; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117; Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Taylor etal. (1994) International Immunology 6: 579-591; Tuaillon et al. (1995) J. Immunol 154: 6453-65; Fishwild et al. (1996) Nature Biotecnologia 14: 845; and Tuaillon et al. (2.000) Eur J Immunol. 10: 2998-3005, cujas
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120/210 revelações estão por meio destas incorporados pela referência na sua íntegra.
[0267]Em certas modalidades, são providas formas desimunizadas dos anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos. Anticorpos desimunizados ou seus fragmentos de ligação de antígeno são anticorpos que foram modificados de maneira a tornar o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno não imunogênico, ou menos imunogênico, a uma dada espécie. Desimunização pode ser obtida modificando o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno utilizando qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas pelos versados na técnica (vide, por exemplo, publicações de PCT Nos. WO 04/108158 e WO 00/34317). Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode serdesimunizado identificando epítopos da célula T e/ou epítopos da célula B potenciais na sequência de aminoácidos do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno e removendo um ou mais dos epítopos da célula T e/ou epítopos da célula B potenciais do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, usando técnicas recombinantes. O anticorpo modificado ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode então opcionalmente ser produzido e testado para identificar anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno que retiveram uma ou mais atividades biológicas desejadas, tal como, por exemplo, afinidade de ligação, mas têm baixa imunogenicidade. Métodos para identificar epítopos da célula T e/ou epítopos da célula B potenciais podem ser realizados usando técnicas conhecidas na tecnologia, tais como, por exemplo, métodos computacionais (vide, por exemplo, publicação de PCT No. WO 02/069232), técnicas in vitro ou in silico, e ensaios biológicos ou métodos físicos (tais como, por exemplo, determinação da ligação de peptídeos a moléculas de MHC, determinação da ligação de complexos peptídeo:MHC nos receptores da célula T da espécie para receber o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, teste de a partes de proteína ou peptídeo deste usando animais transgênicos com as moléculas de MHC da espécie para receber o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, ou teste com
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121/210 animais transgênicos reconstituídos com células do sistema imune da espécie para receber o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, etc.). Em várias modalidades, os anticorpos desimunizados aqui descritos incluem fragmentos de ligação de antígeno desimunizados, Fab, Fv, scFv, Fab’ e F(ab’)2, anticorpos monoclonais, anticorpos de murino, anticorpos completamente humanos, anticorpos modificados por engenharia (tais como, por exemplo, anticorpos quiméricos, de cadeia única, enxertados com CDR, humanizados, e artificialmente selecionados), anticorpos sintéticos e anticorpos semi-sintéticos.
[0268]Nas modalidades terapêuticas da presente revelação, anticorpos biespecíficos são contemplados. Bianticorpos específicos são monoclonais, anticorpos preferivelmente humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação por pelo menos dois diferentes antígenos. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para C5a, as outras são para qualquer outro antígeno.
[0269]Métodos para produzir anticorpo biespecíficos de acordo com o conhecimento dos versados na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é com base na coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde os dois pares de cadeia pesada/cadeia leve têm diferentes especificidades (Milstein and Cuello (1983) Nature 305:537-539). Domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) podem ser fundidos nas sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão da região variável de cadeia pesada preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo pelo menos parte das regiões hinge Ch2, e Ch3. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos nos vetores de expressão separados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes de métodos atualmente conhecidos ilustrativos para gerar anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al. (1986) Methods in
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Enzymology 121:210: publicação de PCT No. WO 96/27011; Brennan et al. (1985) Science 229:81: Shalaby et al., J Exp Med (1992) 175:217-225: Kostelny et al. (1992) J/mmuno/148(5):1547-1553: Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90:64446448; Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368: and Tutt et al. (1991) J Immunol 147:60. Bianticorpos específicos também incluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando qualquer método de reticulação conveniente. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são revelados na patente U.S. No. 4.676.980, junto com inúmeras técnicas de reticulação.
[0270]Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente da cultura celular recombinante foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Vide, por exemplo, Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5):1547-1553. Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados nas porções Fab’ de dois diferentes anticorpos por fusão genética. Os homodímeros do anticorpo podem ser reduzidos na região hinge para formar monômeros e então reoxidados para formar o anticorpo heterodímeros. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia “diacorpo” descrita por Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90:6444-6448 tem provido um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Dessa maneira, os domínios Vh e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios VL e Vh complementares de um outro fragmento, formando por meio disso dois sítios de ligação de antígeno. Uma outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (scFv) foi também reportada. Vide, por exemplo, Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368.
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Alternativamente, os anticorpos podem ser “anticorpos lineares” conforme descrito, por exemplo, em Zapata etal. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Resumidamente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
[0271]Anticorpos com mais que duas valências (por exemplo, anticorpos triespecíficos) são contemplados e descritos, por exemplo, em Tutt etal. (1991) J Immunol 147::60.
[0272]A revelação também diz respeito a formas variantes de anticorpos multiespecíficos tais como as duplas moléculas de imunoglobulina do domínio variável (DVD-lg) descritas em Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297. As moléculas DVD-lg são projetadas de maneira tal que dois diferentes domínios variáveis de cadeia leve (VL) de dois diferentes anticorpos pais, são ligadas diretamente em tandem ou por meio de um ligante curto por técnicas de DNA recombinante, seguido pelo domínio constante de cadeia leve. Similarmente, a cadeia pesada compreende dois diferentes domínios variáveis de cadeia pesada (Vh) ligados em tandem, seguidos pela região Ch1 e Fc de domínio constante. Métodos para produzir moléculas DVD-lg de dois anticorpos pais são adicionalmente descritos, por exemplo, em publicações de PCT Nos. WO 08/024188 e WO 07/024715.
[0273]A revelação também diz respeito a anticorpos de camelídeo ou dromedário (por exemplo, anticorpos derivados de Camelus bactrianus, Calelus dromaderius, ou lama paccos). Tais anticorpos, ao contrário dos anticorpos típicos de duas cadeias (fragmento) ou de quatro cadeias (anticorpo total) da maioria dos mamíferos, no geral não têm cadeias leves. Vide patente U.S. no. 5.759.808; Stijlemans et al. (2004) J Biol Chem 279:1256-1261: Dumoulin etal. (2003) Nature 424:783-788: and Pleschberger et al. (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448.
[0274]Bibliotecas modificadas por engenharia de anticorpos de camelídeo e
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124/210 fragmentos do anticorpo são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Ablynx (Ghent, Belgium). Como com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de camelídeo pode ser alterada recombinantemente para obter uma sequência que parece mais estritamente uma sequência de humano, isto é, o nanocorpo pode ser “humanizado” para reduzir ainda mais por meio disso a imunogenicidade potencial do anticorpo.
[0275]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a aqui descritos compreendem uma região constante de cadeia pesada alterada que tem função efetora reduzida (ou nenhuma) com relação à sua região constante não alterada correspondente. Funções efetoras envolvendo a região constante do anticorpo anti-C5a podem ser moduladas alterando as propriedades da região constante ou Fc. Funções efetoras alteradas incluem, por exemplo, uma modulação em uma ou mais das seguintes atividades: citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (CDC), apoptose, ligação a um ou mais receptores Fc, e respostas proinflamatórias. Modulação refere-se a um aumento, diminuição, ou eliminação de uma atividade da função efetora exibida por um anticorpo em questão contendo uma região constante alterada comparado com a atividade da forma não alterada da região constante. Em modalidades particulares, modulação inclui situações nas quais uma atividade é abolida ou completamente ausente.
[0276]Uma região constante alterada com afinidade de ligação FcR alterada e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDC alterada é um polipeptídeo que tem uma atividade de ligação de FcR tanto aumentada quanto diminuída e/ou atividade ADCC e/ou atividade CDC comparada com a forma não alterada da região constante. Uma região constante alterada que exibe maior ligação a uma FcR liga pelo menos uma FcR com afinidade maior que o polipeptídeo não alterado. Uma região constante alterada que exibe menor ligação a uma FcR liga pelo menos uma FcR com afinidade menor que a forma não alterada da região constante. Tais variantes que exibem menor
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125/210 ligação a uma FcR podem possuir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, por exemplo, 0 a 50 % (por exemplo, menos que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17,16,15, 14,13,12,11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 %) da ligação a FcR comparada com o nível de ligação de uma região constante ou Fc de imunoglobulina da sequência nativa com o FcR. Similarmente, uma região constante alterada que exibe atividade ADCC e/ou CDC modulada pode exibir tanto maior quanto menor atividade ADCC e/ou CDC comparada com a região constante não alterada. Por exemplo, em algumas modalidades, o anticorpo anti-C5a compreendendo uma região constante alterada pode exibir aproximadamente 0 a 50 % (por exemplo, menos que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31,30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 %) da atividade ADCC e/ou CDC da forma não alterada da região constante. Um anticorpo anti-C5a aqui descrito compreendendo uma região constante alterada exibindo ADCC e/ou CDC reduzido pode exibir atividade ADCC e/ou CDC reduzida ou nenhuma conforme exemplificado aqui.
[0277]Em certas modalidades, a região constante alterada tem pelo menos uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácidos, comparada com uma região constante de sequência nativa ou com a região constante não alterada, por exemplo, de cerca de um a cerca de cem substituições, inserções, e/ou deleções de aminoácidos em uma região constante de sequência nativa ou na região constante do polipeptídeo pai. Em algumas modalidades, a região constante alterada aqui possuirá pelo menos cerca de 70 % de homologia (similaridade) ou identidade com a região constante não alterada e em alguns exemplos pelo menos cerca de 75 % e em outros exemplos pelo menos cerca de 80 % de homologia ou identidade com ela, e em outras modalidades pelo menos cerca de 85 %, 90 % ou 95 % de homologia ou identidade com ela. A região constante alterada pode também conter uma ou mais deleções ou
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126/210 inserções de aminoácidos. Adicionalmente, a região constante alterada pode conter uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos que resultam em modificações postranslacionais alteradas, incluindo, por exemplo, um padrão de glicosilação alterada (por exemplo, a adição de um ou mais componentes de açúcar, a perda de um ou mais componentes de açúcar, ou uma mudança na composição de um ou mais componentes de açúcar com relação à região constante não alterada).
[0278] Anti corpos com funções efetoras alteradas ou nenhuma função podem ser gerados por engenharia ou produção de anticorpos com regiões variantes constantes, Fc, ou de cadeia pesada; tecnologia de DNA recombinante e/ou condições de cultura celular e expressão podem ser usadas para produzir anticorpos com função e/ou atividade alterada. Por exemplo, tecnologia de DNA recombinante pode ser usada para construir uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos em regiões (tais como, por exemplo, regiões Fc ou constantes) que afetam a função do anticorpo incluindo funções efetoras. Alternativamente, mudanças em modificações postranslacionais, tais como, por exemplo, padrões de glicosilação, podem ser obtidas manipulando as condições de cultura celular e expressão pelas quais o anticorpo é produzido. Métodos adequados para introduzir uma ou mais substituições, adições, ou deleções em uma região Fc de um anticorpo são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, técnicas mutagênese de DNA padrões conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), supra·, Borrebaek (1992), supra·, Johne et al. (1993), supra·, publicação de PCT no. WO 06/53301; e patente U.S. no. 7.704.497.
[0279]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a aqui descrito exibe função efetora reduzida ou nenhuma função. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a compreende uma região constante híbrida, ou um porção desta, tal como uma região constante híbrida G2/G4 (vide, por exemplo, Burton et al. (1992) Adv
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Immun 51:1-18; Canfield et al. (1991) J Exp Med 173:1483-1491: and Mueller et al. (1997) Mol Immunol 34(6):441-452). Vide anteriormente.
[0280]Além de usar um construto G2/G4 conforme descrito anteriormente, um anticorpo anti-C5a aqui descrito com função efetora reduzida pode ser produzido introduzindo outros tipos de mudanças na sequência de aminoácidos de certas regiões do anticorpo. Tais mudanças na sequência de aminoácidos incluem, mas sem limitações, a mutação Ala-Ala descrita, por exemplo, na publicação de PCT nos. WO 94/28027 e WO 98/47531; e Xu et al. (2000) Cell Immunol 200:16-26. Assim, em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a com uma ou mais mutações na região constante incluindo a mutação Ala-Ala tem função efetora reduzida ou nenhuma função. De acordo com essas modalidades, a região constante do anticorpo pode compreender uma substituição para uma alanina na posição 234 ou uma mutação para uma alanina na posição 235. Adicionalmente, a região constante alterada pode conter uma mutação dupla: uma mutação para uma alanina na posição 234 e uma segunda mutação para uma alanina na posição 235. Em uma modalidade, um anticorpo antiC5a compreende uma estrutura de lgG4, em que a mutação Ala-Ala descrevería uma(s) mutação(s) de fenilalanina para alanina na posição 234 e/ou uma mutação de leucina para alanina na posição 235. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-C5a compreende um estrutura de lgG1, em que a mutação Ala-Ala descrevería um(s) mutação(s) de leucina para alanina na posição 234 e/ou uma mutação de leucina para alanina na posição 235. Um anticorpo anti-C5a pode alternativa ou adicionalmente carregar outras mutações, incluindo ο K322A mutação do ponto no domínio CH2 (Hezareh etal. (2001) J Virol75:12161-12168). Um anticorpo com a(s) dita(s) mutação(s) na região constante pode, além disso, ser um anticorpo de bloqueio ou de não bloqueio.
[0281 ]São apresentadas substituições adicionais que, quando introduzidas em uma região constante de cadeia pesada, resultam em menor função efetora, por
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128/210 exemplo, em Shields et al. (2001) J Biol Chem 276(9):6591 -6604. Vide particularmente Tabela 1 (“Ligação de variantes de lgG1 de humano com FcRn e FcyR de humano) de Shields et al., cuja revelação está incorporada aqui pela referência na sua íntegra. Classificando uma biblioteca de anticorpos anti-lgE, cada anticorpo da biblioteca diferenciando por uma ou mais substituições na região constante de cadeia pesada, para ligar a um painel de receptores Fc (incluindo FcRn, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, e FcyRIIIA), os autores identificaram inúmeras substituições que modulam interações do receptor de Fc-Fc específicas. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de lgG2a variante na qual o domínio de CH2 contém uma substituição de D265A (numeração aminoácidos de cadeia pesada de acordo com Kabat et al. (supra)) resulta em uma perda completa de interação entre a região constante variante e receptores FcyRIIB, FcyRIII, FcyRI, e FcyRIV Fede IgG. Shields etal. (2001) at page 6595, Tabela 1. Vide também Baudino et al. (2008) J Immunol 181:6664-6669 (supra).
[0282]Mudanças na região hinge também afeta as funções efetoras. Por exemplo, deleção da região hinge pode reduzir afinidade com receptores Fc e pode reduzir ativação do complemento (Klein et al. (1981) Proc Natl Acad Sei USA 78: 524528). A presente revelação portanto também diz respeito a anticorpos com alterações na região hinge.
[0283]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a pode conter uma região constante alterada exibindo maior ou menor citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Atividade CDC modulada pode ser obtida introduzindo uma ou mais substituições, inserções, ou deleções de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Vide, por exemplo, patente U.S. no. 6.194.551. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo por meio disso formação de ligação de dissulfeto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter maior ou menor capacidade de internalização e/ou maior ou menor matança celular mediada por complemento. Vide, por exemplo, Caron et al.
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129/210 (1992) J Exp Med 176:1191-1195 and Shopes (1992) /mmuno/148:2918-2922: publicação de PCT nos. WO 99/51642 e WO 94/29351; Duncan and Winter (1988) Nature 322:738-40: e patentes U.S. Nos. 5.648.260 e 5.624.821.
[0284]Um outro meio potencial de modularfunção efetora dos anticorpos inclui mudanças em glicosilação, que é sumarizado, por exemplo, em Raju (2003) BioProcess International 1 (4):44-53. De acordo com Wright and Morrison, a microeterogeneidade de oligossacarídeos de IgG de humano pode afetar funções biológicas tais como ligação de CDC e ADCC, a vários receptores Fc, e ligação a proteína Clq. (1997) TIBTECH 15:26-32. Padrões de glicosilação dos anticorpos podem diferir dependendo das condições da produção celular e da cultura celular (Raju, supra). Tais diferenças podem levar a mudanças tanto na função efetora quanto farmacocinética. Vide, por exemplo, Israel etal. (1996) Immunology 89(4):573-578: Newkirk et al. (1996) ClinExp Immunol 106(2):259-264. Diferenças na função efetora podem ser relacionadas com a capacidade de IgG de ligar aos receptores Fcy (FcyRs) nas células efetoras. Shields et al. mostrou que IgG, com alterações em sequência de aminoácidos que têm maior ligação a FcyR, pode exibir até 100 % de ADCC aumentado usando células efetoras de humano. (2001) J Biol Chem 276(9):6591-6604. Embora essas alterações incluam mudanças em aminoácidos não observadas na interface da ligação, tanto a natureza do componente de açúcar bem como seu padrão estrutural pode também contribuir para as diferenças observadas. Além do mais, a presença ou ausência de fucose no componente do oligossacarídeo de uma IgG pode aumentar a ligação e ADCC. Vide, por exemplo, Shields et al. (2002) J Biol Chem 277(30):26733-26740. Uma IgG que não teve um carboidrato fucosilado ligado a Asn297 exibiu ligação do receptor normal no receptor FcyRI. Ao contrário, ligação ao receptor FcyRIIIA foi maior 50 vezes e acompanhada por maior ADCC, especialmente em concentrações mais baixas do anticorpo.
[0285]Shinkawa et al. demonstrou que um anticorpo para o receptor de IL-5
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130/210 de humano produzido em um hibridoma de rato mostrou ADCC mais que 50 % maior quando comparado com o anticorpo produzido em células do ovário de hamster chinês (CHO) (Shinkawa et al. (2003) J Biol Chem 278(5):3466-73). Composição de perfilamento de monossacarídeo e oligossacarídeo mostrou que a IgG produzida por hibridoma de rato teve um teor mais baixo de fucose do que a proteína produzida por CHO. Os autores concluíram que a falta de fucosilação de uma lgG1 tem um papel crítico na melhoria de atividade ADCC.
[0286]Uma abordagem diferente foi feita por Umana et al. que mudou o padrão de glicosilação de chCE7, um anticorpo antineuroblastoma de lgG1 quimérico. (1999) Nat Biotechnol 17(2):176-180). Usando tetraciclina, ele regulou a atividade de uma enzima glicosiltransferase (GnTIlI) que bissecciona oligossacarídeos que foram implicados na atividade ADCC. A atividade ADCC do anticorpo pai foi ligeiramente acima do nível de fundo. Medição de atividade ADCC do chCE7 produzido em diferentes níveis de tetraciclina mostrou um faixa ideal de expressão de GnTIlI para atividade ADCC in vitro de chCE7 máximo. Esta atividade correlacionada com o nível de oligossacarídeo complexo bisseccionado associado a região constante. Newly otimizou atividade de variantes ADCC substancial exibida. Similarmente, Wright and Morrison produziram anticorpos em uma linhagem celular CHO deficiente em glicosilação e mostraram que anticorpos produzidos nesta linhagem celular foram incapazes da citólise mediada pelo complemento. (1994) J Exp Med 180:1087-1096. Assim, as alterações conhecidas que afetam a função efetora incluem modificações no padrão de glicosilação ou uma mudança no número de resíduos glicosilados, a presente revelação diz respeito a um anticorpo anti-C5a em que a glicosilação é alterada tanto para aumentar quanto para diminuir a(s) função(s) efetora(s) incluindo ADCC e CDC. Glicosilação alterada inclui uma diminuição ou aumento no número de resíduos glicosilados bem como uma mudança no padrão ou localização de resíduos glicosilados.
Ainda outras abordagens existem para alterara função efetora de anticorpos.
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Por exemplo, células de produção de anticorpo podem ser hipermutagênicas gerando, por meio disso, anticorpos com resíduos de polipeptídeo aleatoriamente alterados por toda uma molécula de anticorpo. Vide, por exemplo, publicação de PCT no. WO 05/011735. Células hospedeiras hipermutagênicas incluem células deficientes em reparo de pareamento irregular DNA. Anticorpos produzidos desta maneira podem ser menos antigênicos e/ou ter propriedades farmacocinéticas benéficas. Adicionalmente, tais anticorpos podem ser selecionados para propriedades tais como maior ou menor função(s) efetora(s). São apresentados a seguir detalhes adicionais de técnicas de biologia molecular usadas para preparar um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito.
Expressão e Purificação do Anticorpo Recombinante
[0287]Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na tecnologia de biologia molecular e química de proteína. Por exemplo, um ácido nucléico que codifica um ou ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de um anticorpo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém sequências regulatórias transcricionais e translacionais, que incluem, por exemplo, sequências promotoras, sítios de ligação ribossomal, sequências de início e parada transcricionais, sequências de início e parada translacionais, sinais terminadores de transcrição, sinais de poliadenilação, e sequências melhoradoras ou ativadoras. As sequências regulatórias incluem uma sequência de início e parada promotora e transcricional. Além do mais, o vetor de expressão pode incluir mais que um sistema de replicação de maneira tal que ele pode ser mantido em dois diferentes organismos, por exemplo, em células de mamífero ou de inseto para expressão e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação.
[0288]Diversos sistemas vetor possíveis são disponíveis para a expressão de polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve clonados de ácidos nucléicos em
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132/210 células de mamífero. Uma classe de vetores se baseia na integração das sequências genéticas desejadas no genoma da célula hospedeira. Células que têm DNA integrado estável podem ser selecionadas introduzindo simultaneamente genes de resistência a medicamento tal como E. coli gpt (Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sei USA 78:2072) ou Tn5 neo (Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327). O gene marcador selecionável pode ser ligado tanto nas sequências genéticas de DNA para ser expresso, quanto introduzido na mesma célula por cotransfecção (Wigleret al. (1979) Cell 16:77). Uma segunda classe de vetores utiliza elementos de DNA que conferem capacidades de replicação autonomamente a um plasmídeo extracromossomal. Esses vetores podem ser derivados de vírus de animal, tais como papilomavírus bovino (Sarver etal. (1982) Proc Natl Acad Sei USA, 79:7147), citomegalovírus, vírus polioma (Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81:1292), ou vírus SV40 (Lusky and Botchan (1981) Nature 293:791
[0289]Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células de uma maneira adequada para expressão subsequente do ácido nucléico. O método de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula alvejada, discutido a seguir. Métodos exemplares incluem precipitação de CaPO4, fusão de lipossomo, lipossomos catiônicos, eletroporação, infecção viral, transfecção mediada pordextrano, transfecção mediada porpolibreno, fusão de protoplasta, e microinjeção direta.
[0290]Células hospedeiras apropriadas para a expressão dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno incluem levedura, bactérias, inseto, planta, e células de mamífero. De particular interesse são bactérias tal como E. coli, fungos tais como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, células de inseto tal como SF9, linhagens celulares de mamífero (por exemplo, linhagens celulares de humano), bem como linhagens celulares primárias.
[0291 ]Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento pode ser expresso em animais transgênicos e purificado deles (por exemplo, mamíferos
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133/210 transgênicos). Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido em mamíferos transgênicos não humanos (por exemplo, roedores) e isolados de leite conforme descrito, por exemplo, em Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629: van Kuik-Romeijn et al. (2.000) Transgenic Res 9(2):155-159: and Pollock et al. (1999) J Immunol /Vfetaods 231 (1-2): 147-157.
[0292]Os anticorpos e seus fragmentos podem ser produzidos das células cultivando uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão contendo ácido nucléico que codifica os anticorpos ou fragmentos, em condições, e por um período de tempo, suficiente para permitir expressão das proteínas. Tais condições para expressão de proteína variarão com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira, e serão facilmente avaliada pelos versados na técnica através de experimentação de rotina. Por exemplo, anticorpos expressos em E. coli podem ser redobrados a partir dos corpos de inclusão (vide, por exemplo, Hou et al. (1998) Cytokine 10:31930). Sistemas e métodos de expressão bacteriana para seu uso são bem conhecidos na técnica (vide Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning-A Laboratory Manual -3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). A escolha de códons, vetores de expressão adequados e células hospedeiras adequadas variará dependendo de inúmeros fatores, e pode ser facilmente otimizada como necessário. Um anticorpo (ou seu fragmento) aqui descrito pode ser expresso em células de mamífero ou em outros sistemas de expressão incluindo, mas sem limitações, levedura, baculovírus, e sistemas de expressão in vitro (vide, por exemplo, Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220).
[0293]Após a expressão, os anticorpos e seus fragmentos podem ser isolados. O termo “purificado” ou “isolado” da maneira aplicada a qualquer uma das proteínas (anticorpos ou fragmentos) aqui descritas refere-se a um polipeptídeo que foi separado ou purificado dos componentes (por exemplo, proteínas ou outras moléculas biológicas ou orgânicas de ocorrência natural) que naturalmente o acompanham, por
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134/210 exemplo, outras proteínas, lipídios, e ácido nucléico em um procarioto que expressa as proteínas. Tipicamente, um polipeptídeo é purificado quando ele constitui pelo menos 60 (por exemplo, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, ou 99) % em peso da proteína total em uma amostra.
[0294]Um anticorpo ou seu fragmento pode ser isolado ou purificado em uma variedade de maneiras conhecidas pelos versados na técnica dependendo de quais outros componentes estiverem presentes na amostra. Métodos de purificação padrões incluem técnicas eletroforéticas, moleculares, imunológicas, e cromatográficas, incluindo troca iônica, hidrofóbica, afinidade, e cromatografia HPLC de fase reversa. Por exemplo, um anticorpo pode ser purificado usando uma coluna de anti-anticorpo padrão (por exemplo, uma coluna de proteína A ou proteína G). Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, junto com concentração de proteína, são também usadas. Vide, por exemplo, Scopes (1994) “Protein Purification, 3rd edition”, Springer-Verlag, New York City, New York. O grau de purificação necessário variará dependendo do uso desejado. Em alguns exemplos, não será necessário nenhuma purificação do anticorpo expresso ou seus fragmentos.
[0295]Métodos para determinar o rendimento ou pureza de um anticorpo purificado ou seu fragmento são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaio Bradford, espectroscopia UV, ensaio de proteína Biuret, ensaio de proteína Lowry, ensaio de proteína de amido preta, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), espectrometria de massa (MS), e métodos eletroforéticos de gel (por exemplo, usando uma mancha de proteína tal como Coomassie Blue ou mancha de prata coloidal).
[0296]Em algumas modalidades, endotoxina pode ser removida dos anticorpos ou fragmentos. Métodos para remover endotoxina e uma amostra de proteína são conhecidos na técnica e exemplificados nos exemplos funcionais. Por exemplo, endotoxina pode ser removida de uma amostra de proteína usando uma variedade de reagentes comercialmente disponíveis incluindo, sem limitação, os Endotoxin
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Removal Kits ProteoSpin™ (Norgen Biotek Corporation), Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel (Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), MiraCLEAN® Endotoxin Removal Kit (Minis), ou Acrodisc™ - Mustang® E membrane (Pall Corporation).
[0297]Métodos para detectare/ou medira quantidade de endotoxina presente em uma amostra (tanto antes quanto depois da purificação) são conhecidos na técnica e estojos comerciais estão disponíveis. Por exemplo, a concentração de endotoxina em uma amostra de proteína pode ser determinada usando o estojo QCL-1,000 Chromogenic (BioWhittaker), os estojos a base de lisato de amebócito de límulo (LAL) tais como os estojos Pyrotell®, Pyrotell®-T, Pyrochrome®, Chromo-LAL, e CSE disponíveis pela Associates de Cape Cod Incorporated.
[0298]Embora não devam de maneira nenhuma ser limitantes, métodos exemplares para gerar os anticorpos aqui descritos são apresentados nos exemplos funcionais.
[0299]Modificação dos Anticorpos ou seus Fragmentos de Ligação de Antígeno
[0300]0s anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno podem ser modificados após sua expressão e purificação. As modificações podem ser modificações covalentes ou não covalentes. Tais modificações podem ser introduzidas nos anticorpos ou fragmentos, por exemplo, reagindo resíduos dos aminoácidos alvejados do polipeptídeo com um agente de derivatização orgânico que pode reagir com cadeias laterais ou resíduos terminais selecionados. Sítios adequados para modificação podem ser escolhidos usando qualquer de uma variedade de critérios incluindo, por exemplo, análise estrutural ou análise de sequência de aminoácidos dos anticorpos ou fragmentos.
[0301 ]Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno podem ser conjugados com uma fração heteróloga. A fração heteróloga pode ser, por exemplo, um polipeptídeo heterológo, um agente terapêutico (por
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136/210 exemplo, uma toxina ou um medicamento), ou um rótulo detectável tais como, mas sem limitações, um rótulo radioativo, um rótulo enzimático, um rótulo fluorescente, um rótulo de metal pesado, um rótulo luminescente, ou uma etiqueta de afinidade tais como biotina ou estreptavidina. Polipeptídeos heterológos adequados incluem, por exemplo, uma etiqueta antigênica (por exemplo, FLAG (DYKDDDDK (SEQ ID NO:50)), poli-istidina (6-His; HHHHHH (SEQ ID NO:81), hemaglutinina (HA; YPYDVPDYA (SEQ ID NO:82)), glutationa-S-transferase (GST), ou proteína de ligação de maltose (MBP)) para uso na purificação dos anticorpos ou fragmentos. Polipeptídeos heterológos também incluem polipeptídeos (por exemplo, enzimas) que são usados como diagnóstico ou marcadores detectáveis, por exemplo, luciferase, um proteína fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), ou cloranfenicol acetil transferase (CAT). Rótulos radioativos adequados incluem, por exemplo, 32P, 33p, 14Q 125| 1311,35g, θ 3|_| Rótulos fluorescentes adequados incluem, sem limitação, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), proteína fluorescente verde (GFP), Dy Light™ 488, ficoeritrina (PE), iodeto de propídio (PI), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, aloficocianina, e Cy7. Rótulos luminescente incluem, por exemplo, qualquer de uma variedade de quelatos de lantanídeo luminescente (por exemplo, európio ou térbio). Por exemplo, adequado quelatos de európio incluem o quelato de európio de ácido dietileno triamina penta-acético (DTPA) ou ácido tetra-azaciclododecano1,4,7,10-tetra-acético (DOTA). Rótulos enzimáticos incluem, por exemplo, fosfatase alcalina, CAT, luciferase, e poroxidase de rábano silvestre.
[0302]Duas proteínas (por exemplo, um anticorpo e uma fração heteróloga) podem ser reticuladas usando qualquer de inúmeros reticuladores químicos conhecidos. Exemplos de tais reticuladores são aqueles que ligam dois resíduos dos aminoácidos por meio de uma ligação que inclui uma ligação de dissulfeto “impedida”. Nessas ligações, uma ligação de dissulfeto na unidade de reticulação é protegida (por grupos de impedimento em qualquer lado da ligação de dissulfeto) da redução pela
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137/210 ação, por exemplo, de glutationa reduzida ou da redutase de dissulfeto de enzima. Um reagente adequado, 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a(2-piridilditio) tolueno (SMPT), forma uma ligação como essa entre duas proteínas utilizando uma lisina terminal em uma das proteínas e uma cisteína terminal nas outras. Reagentes heterobifuncional que reticulam por uma fração de acoplamento diferente em cada proteína podem também ser usados. Outros usados reticuladores incluem, sem limitação, reagentes que ligam dois grupos amino (por exemplo, N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida), dois grupos sulfidrila (por exemplo, 1,4-bis-maleimidobutano), um grupo amino e um grupo sulfidrila (por exemplo, ésterm-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), um grupo amino e um grupo carboxila (por exemplo, 4-[p-azidosalicilamido]butilamina), e um grupo amino e um grupo guanidínio que está presente na cadeia lateral de arginina (por exemplo, p- monoidrato de azidofenil glioxal).
[0303]Em algumas modalidades, um rótulo radioativo pode ser diretamente conjugado com a espinha dorsal de aminoácidos do anticorpo. Alternativamente, o rótulo radioativo pode ser incluído como parte de uma molécula grande (por exemplo, 125l em meta-[125l]iodofenil-N-hidroxisuccinimida ([125l]mlPNHS) que liga a grupos amino livres para formar derivados de meta-iodofenila (mlP) de proteínas relevantes (vide, por exemplo, Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221 -1229) ou quelato (por exemplo, de DOTA ou DTPA) que é por sua vez ligado na espinha dorsal da proteína. Métodos de conjugar os rótulos radioativos ou moléculas grandes/quelatos contendoos nos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos são conhecidos na técnica. Tais métodos envolvem incubar as proteínas com o rótulo radioativo em condições (por exemplo, pH, concentração de sal, e/ou temperatura) quem facilitam a ligação do rótulo radioativo ou quelato na proteína (vide, por exemplo, patente U.S. No. 6.001.329).
[0304]Métodos para conjugar um rótulo fluorescente (algumas vezes referidos como um “fluoróforo”) com uma proteína (por exemplo, um anticorpo) são conhecidos
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138/210 na técnica de química de proteína. Por exemplo, fluoróforos podem ser conjugados com grupos amino livres (por exemplo, de lisinas) ou grupos sulfidrila (por exemplo, cisteínas) de proteínas usando frações de éster succinimidila (NHS) ou éster tetrafluorfenil (TFP) anexadas nos fluoróforos. Em algumas modalidades, os fluoróforos podem ser conjugados com uma fração do reticulador heterobifuncional tal como sulfoSMCC. Métodos conjugação adequados envolvem incubar uma proteína do anticorpo, ou seu fragmento, com o fluoróforo em condições que facilitam a ligação do fluoróforo na proteína. Vide, por exemplo, Welch and Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications”, John Wiley and Sons (ISBN 0471495603).
[0305]Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos podem ser modificados, por exemplo, com uma fração que melhora a estabilização e/ou retenção dos anticorpos em circulação, por exemplo, em sangue, soro, ou outros tecidos. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento pode ser PEGuilado conforme descrito, por exemplo, em Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485; and Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:·459-476 or HESylated (Fresenius Kabi, Germany; vide, por exemplo, Pavisic et al. (2010) Int J Pharm 387(1-2):110-119). A fração d estabilização pode melhorar a estabilidade, ou retenção do anticorpo (ou fragmento) em pelo menos 1,5 (por exemplo, pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, ou 50 ou mais) vezes.
[0306]Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos podem serglicosilados. Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode ser submetido a tratamento enzimático ou químico, ou produzidos a partir de uma célula, de maneira tal que o anticorpo ou fragmento tenha glicosilação reduzida ou ausente. Métodos para produzir anticorpos com glicosilação reduzida são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na patente U.S. no. 6.933.368; Wright et al. (1991) EMBO J
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10(10):2717-2723: and Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361.
[0307]Composições Farmacêuticas
[0308]Composições contendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito podem ser formuladas como uma composição farmacêutica, por exemplo, para administração a um sujeito para o tratamento ou prevenção de um distúrbio associado ao complemento. As composições farmacêuticas no geral incluirão um veículo farmaceuticamente aceitável. Da maneira aqui usada, um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a qualquer e todos os solventes, e os inclui, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. As composições podem incluir um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de adição ácida ou um sal de adição de base (vide, por exemplo, Berge et al. (1977) JPharm Sei 66: 1-19).
[0309]As composições podem ser formuladas de acordo com métodos padrões. Formulação farmacêutica é uma técnica bem estabelecida, e é adicionalmente descrita, por exemplo, em Gennaro (2.000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”, 7th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); and Kibbe (2.000) “Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association”, 3rd Edition (ISBN: 091733096X). Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada, por exemplo, como uma solução tamponada a uma concentração adequada e adequada para armazenamento a 2-8 °C (por exemplo, 4 °C). Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada para armazenamento a uma temperatura abaixo de 0°C (por exemplo, -20 °C ou -80 °C). Em algumas modalidades, a composição pode ser formulada para armazenamento para até 2 anos (por exemplo, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses,
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140/210 oito meses, nove meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 1½ ano, ou 2 anos) a 2-8 °C (por exemplo, 4 °C). Assim, em algumas modalidades, as composições aqui descritas são estáveis em armazenamento por pelo menos 1 ano a 2-8 °C (por exemplo, 4 °C).
[0310]As composições farmacêuticas podem ser em uma variedade de formas. Essas formas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semissólida e sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomos e supositórios. A forma preferida depende, em parte, do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. Por exemplo, composições contendo um anticorpo ou fragmento destinado a distribuição sistêmica ou local pode ser na forma de soluções injetáveis ou infundível. Dessa maneira, as composições podem serformuladas para administração por um modo parenteral (por exemplo, injeção, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, ou intramuscular). “Administração parenteral”, “administrado parenteralmente”, e outras frases gramaticalmente equivalentes, da maneira aqui usada, referem-se a modos de administração sem ser administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção intravenosa, intranasal, intraocular, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, infraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraporitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, epidural, intracerebral, intracranial, intracarótida e intrasternal e infusão.
[0311 ]As composições podem serformuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada para armazenamento estável a alta concentração. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um anticorpo (ou um fragmento do anticorpo) aqui descrito na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, da maneira exigida, seguido por esterilização filtrada. No geral, dispersões são preparadas incorporando um anticorpo ou
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141/210 fragmento aqui descrito em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos para preparação incluem secagem a vácuo e liofilização que rende um pó de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito mais qualquer ingrediente desejado adicional (vide a seguir) de uma solução filtrada previamente estéril deste. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensoativos. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um reagente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato, e gelatina.
[0312]Os anticorpos anti-C5a, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, aqui descritos pode também ser formulados em composições de imunolipossomo. Lipossomos contendo o anticorpo podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo, os métodos descritos em Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sei USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sei USA 77:4030; e patentes U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com melhor tempo de circulação são revelados, por exemplo, na patente U.S. No. 5,013,556.
[0313]Em certas modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste pode ser preparado com um veículo protegerá o composto contra liberação rápida, tais como uma liberação controlada formulação, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, J.R. Robinson (1978) “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, Marcel Dekker, Inc., New York.
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[0314]Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode ser formulado em uma composição adequada para administração intrapulmonar (por exemplo, para administração por meio de nebulizador; vide a seguir) a um mamífero tal como um humano. Métodos para preparar tais composições são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente U.S. no. 20080202513, patentes U.S. nos. 7.112.341 e 6.019.968 e publicação de pedido PCT nos. WO 00/061178 e WO 06/122257, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra. Formulações de inalador de pó seco e sistemas adequados para administração das formulações são descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente U.S. no. 20070235029, publicação de PCT No. WO 00/69887; e patente U.S. no. 5.997.848.
[0315]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode ser formulado em uma composição adequada para distribuição no olho. Em algumas modalidades, um ou mais dos anticorpos antiC5a (ou seus fragmentos de ligação de antígeno) aqui descritos podem ser administrados localmente, por exemplo, por meio de aplicação tópica ou injeção intravítrea. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a podem serformulados para administração por meio de uma gota no olho.
[0316]A preparação terapêutica para tratar o olho pode conter um ou mais dos anticorpos anti-C5a em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 1 % por peso, preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,5 % em uma solução, suspensão ou unguento farmaceuticamente aceitáveis. A preparação preferivelmente será na forma de uma solução aquosa estéril contendo, por exemplo, ingredientes adicionais tais como, mas sem limitações, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizantes, agentes umectantes ou clarificantes não iônicos, e agentes de aumento de viscosidade.
[0317]Conservantes adequados para uso em uma solução como essa incluem
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143/210 cloreto benzalcônio, cloreto benzethônio, clorobutanol, timerosal e similares. Tampões adequados incluem, por exemplo, ácido bórico, bicarbonato de sódio e potássio, sódio e boratos de potássio, carbonato de sódio e potássio, acetato de sódio, e bifosfato de sódio, em quantidades suficientes para manter o pH a entre cerca de pH 6 e pH 8, e preferivelmente, entre cerca de pH 7 e pH 7,5. Agentes de tonicidade adequados são dextrano 40, dextrano 70, dextrose, glicerina, cloreto de potássio, propileno glicol, e cloreto de sódio.
[0318]Antioxidantes e estabilizantes adequados incluem bissulfeto de sódio, metabissulfeto de sódio, tiossulfeto de sódio, e tiouréia. Agentes umectantes e clarificantes adequados incluem polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero 282 e tiloxapol. Agentes de aumento de viscosidade adequados incluem dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulose, hidroximetilpropilcelulose, lanolina, metilcelulose, petrolato, polietileno glicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, e carboximetilcelulose. A preparação pode ser administrada topicamente no olho do sujeito que necessita de tratamento (por exemplo, um sujeito que sofre de AMD) por métodos convencionais, por exemplo, na forma de gotas, ou banhando o olho em uma solução terapêutica, contendo um ou mais anticorpos anti-C5a.
[0319]Além do mais, uma variedade de dispositivos foi desenvolvida para introduzir medicamentos na cavidade vítrea do olho. Por exemplo, publicação de pedido de patente U.S. no. 20020026176 descreve um tampão contendo substância farmacêutica que pode ser inserido através da esclerótica de maneira tal que ele projete na cavidade vítrea para distribuir o agente farmacêutico na cavidade vítrea. Em um outro exemplo, patente U.S. no. 5.443.505 descreve um dispositivo implantável para introdução em um espaço supracoroidal ou uma região avascular para liberação sustentada do medicamento no interior do olho. Patentes U.S. nos. 5.773.019 e 6.001.386 cada qual revela um dispositivo de distribuição de medicamento implantável anexável na superfície esclerótica de um olho. O dispositivo compreende um núcleo interno
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144/210 contendo uma quantidade efetiva de um agente de baixa solubilidade coberto por um polímero não biodegradável que é permeável pelo agente de baixa solubilidade. Durante a operação, o agente de baixa solubilidade permeia a cobertura do polímero biodegradável para liberação sustentada fora do dispositivo. Métodos e dispositivos adicionais (por exemplo, um emplasto transesclerótico e distribuição por meio de lentes de contato) para distribuição de um agente terapêutico no olho são descritos, por exemplo, em Ambati and Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151: Ranta and Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11): 1164-1181; Barocas and Balachandran (2008) Export Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10): Gulsen and Chauhan (2004) Invest Opthalmol Vis Sc/45:2342-2347; Kim et al. (2007) Ophthalmic Res 39:244-254; e publicação de PCT no. WO 04/073551, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra.
[0320]Ácidos nucléicos que codificam um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno deste) podem ser incorporados em um construto genético para ser usado como uma parte de um protocolo de terapia genética para distribuir ácidos nucléicos que podem ser usados para expressar e produzir agentes nas células (vide a seguir). Construtos de expressão de tais componentes podem ser administrados em qualquer veículo terapeuticamente efetivo, por exemplo, qualquer formulação ou composição capaz de distribuir efetivamente o gene do componente nas células in vivo. Abordagens incluem inserção do gene em questão em vetores virais incluindo retrovirus recombinantes, adenovirus, vírus adeno-associado, lentivírus, e vírus-1 herpes simplex (HSV-1), ou plasmídeos bacterianos ou eucarióticos recombinantes. Vetores virais podem transfectar células diretamente; plasmídeo DNA pode ser distribuído com a ajuda de, por exemplo, lipossomos catiônicos (lipofectina) ou derivatizados (por exemplo, anticorpos conjugados), conjugados de polilisina, gramicidina S, envelopes virais artificiais ou outros veículos intracelulares como esses, bem como injeção direta do construto genético ou precipitação de CaPO (vide, por exemplo, W004/060407)
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145/210 realizados in vivo. (Vide também, “Ex vivo Approaches”, a seguir). Exemplos de retrovirus adequados incluem pLJ, pZIP, pWE e pEM que são conhecidos pelos versados na técnica (vide, por exemplo, Eglitis et al. (1985) Science 230:1395-1398: Danos and Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Humano Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10892-10895; Hwu etal. (1993) J Immunol. 150:4104-4115; patentes U.S. Nos. 4.868.116 e 4.980.286; publicações de PCT Nos. WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, e WO92/07573). Um outro sistema de distribuição de gene viral utiliza vetores derivados de adenovirus (vide, por exemplo, Berkneretal. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld etal. (1991) Science 252:431-434: and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155). Vetores adenovirais adequados derivado da cepa do adenovirus tipo Ad 5 dl324 ou outras cepas de adenovirus (por exemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) são conhecidos pelos versados na técnica. Ainda um outro sistema vetor viral usado para distribuição do gene em questão é o vírus adeno-associado (AAV). Vide, por exemplo, Flotte et al. (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 7:349-356; Samulski et al. (1989) J Virol 63:3822-3828; and McLaughlin etal. (1989) J Virol62:1963-1973.
[0321 ]Em algumas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito pode ser formulado com um ou mais agentes ativos adicionais usados para tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento em um sujeito. Agentes adicionais para tratar um distúrbio associado ao complemento em um sujeito variarão dependendo do distúrbio particular sendo tratado, mas pode incluir, sem limitação, um anti-hipertensivo (por exemplo, um inibidor de enzima de conversão de angiotensina), um anticoagulante, um corticoesteróide (por exemplo, prednisona),
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146/210 ou um agente imunossupressor (por exemplo, vincristina ou ciclosporina A). Exemplos de anticoagulantes incluem, por exemplo, varfarina (Cumadina), heparina, fenindiona, fondaparinux, idraparinux, e inibidores de trombina (por exemplo, argatrobano, lepirudina, bivalirudina, ou dabigatrano). Um anticorpo ou seu fragmento aqui descrito pode também ser formulado com um agente fibrinolítico (por exemplo, ancrod, ácido ε-aminocapróico, antiplasmina-ai, prostaciclina, e desfibrótido) para o tratamento de um distúrbio mediado por complemento. Em algumas modalidades, um anticorpo pode ser formulado com um agente de diminuição de lipídio tal como um inibidor de hidroximetilglutaril CoA redutase. Em algumas modalidades, um anticorpo pode ser formulado com, ou para uso com, um agente anti-CD20 tal como rituximab (Rituxan™; Biogen Idee, Cambridge, MA). Em algumas modalidades, por exemplo, para o tratamento de RA, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser formulado com um ou ambos de infliximab (Remicade®; Centocor, Inc), e metotrexato (Rheumatrex®, Trexall®). Em algumas modalidades, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito pode ser formulado com um medicamento anti-inflamatório não esteroidal (NSAID). Muitos diferentes NSAIDS são disponíveis, alguns sobre ou contra incluindo ibuprofeno (Advil ®, Motrin®, Nuprin ®) e naproxeno (Alleve®) e muitos outros são disponíveis por prescrição incluindo meloxicam (Mobic®), etodolac (Lodine®), nabumetona (Relafen®), sulindac (Clinoril®), tolementina (Tolectin®), salicilato de colina magnésio (Trilasate®), diclofenac (Cataflam®, Voltaren®, Arthrotec®), Diflusinal (Dolobid®), indometicina (Indocin®), Ketoprofen (Orudis®, Oruvail®), oxaprozina (Daypro®), e piroxicam (Feldene®). Em algumas modalidades um anticorpo ou um seu fragmento pode ser formulado para uso com um anti-hipertensivo, um agente anticonvulsivo (por exemplo, sulfato de magnésio), ou um agente antitrombótico. Anti-hipertensivos incluem, por exemplo, labetalol, hidralazina, nifedipina, antagonistas do canal de cálcio, nitroglicerina, ou nitroprussiato de sódio. Vide, por exemplo, Mihu et al. (2007) J Gasrointestin Liver Dis 16(4):419-424. Agentes
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147/210 antitrombóticos incluem, por exemplo, heparina, antitrombina, prostaciclina, ou dose baixa de aspirina.
[0322]Em algumas modalidades, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser formulado para administração a um sujeito junto com terapia de globulina gama intravenosa (IVIG), plasmaferese, ou troca plasmática. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser formulado para uso antes, durante, ou depois, uma transplante de rim.
[0323]Quando um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é para ser usado em combinação com um segundo agente ativo, os agentes podem ser formulados separadamente ou juntos. Por exemplo, as composições farmacêuticas respectivas podem ser misturadas, por exemplo, imediatamente antes da administração, e administrado juntas ou podem ser administradas separadamente, por exemplo, ao mesmo ou em tempos diferentes (vide a seguir).
[0324]Conforme descrito anteriormente, uma composição pode ser formulada de maneira tal que ela inclua uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito. Em algumas modalidades, uma composição pode ser formulada para incluir uma quantidade subterapêutica do anticorpo (ou fragmento) e uma quantidade subterapêutica de um ou mais agentes ativos adicionais de maneira tal que os componentes no total sejam terapeuticamente efetivos para tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento. Métodos para determinar uma dose terapeuticamente efetiva de um agente tal como um anticorpo terapêutico são conhecidos na técnica e aqui descritos.
Aplicações
[0325]Os anticorpos, seus fragmentos de ligação de antígeno, conjugados e composições de qualquer um dos anteriores podem ser usados em inúmeras aplicações de diagnóstico e terapêutico. Por exemplo, anticorpos anti-C5a detectavelmente marcados (por exemplo, anticorpo anti-C5a de humano ou anticorpo C5a
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148/210 anticamundongos) podem ser usados em ensaios para detectar a presença ou quantidade de C5a presente em uma amostra biológica. Determinação da quantidade de C5a em uma amostra, por exemplo, uma amostra de sangue do paciente, pode ser usada para avaliar o nível de ativação do complemento na amostra. Métodos adequados para usar os anticorpos em ensaios de diagnóstico são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, ELISA, aplicações de transferência de energia de ressonância por fluorescência, técnicas Western blot, e dot blot. Vide, por exemplo, Sambrook et al., supra and Ausubel et al., supra.
[0326]Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos podem ser usados como controles positivos em ensaios projetados para identificar compostos inéditos adicionais para tratar distúrbios mediados por complemento. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a que inibe atividade de C5a pode ser usado como um controle positivo em um ensaio para identificar compostos adicionais (por exemplo, moléculas pequenas, aptâmeros, ou anticorpos) que inibem sinalização do receptor dependente de C5a ou C5a de C5a.
[0327]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-C5a reativos cruzados ou seus fragmentos de ligação de antígeno (por exemplo, reativo cruzado com C5a de humano e, por exemplo, C5a de macaco cinomolgo) aqui descritos podem ser usados para teste pré-clínico em mamíferos não humanos, por exemplo, estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos em primatas não humanos. Dessa maneira, um pesquisador que deseja avaliar a eficácia de um anticorpo anti-C5a no tratamento de um distúrbio de interesse associado ao complemento (por exemplo, RA ou sepse) pode usar um anticorpo anti-C5a reativo cruzado aqui descrito em um modelo primata não humano apropriado da doença. Se o pesquisador, por exemplo, estabelecer eficácia do anticorpo no modelo primata não humano, esses resultados podem fornecer suporte de validação do conceito suficiente para aprovação regulatória para uso do anticorpo nos tratamentos de humano. Alternativamente, ou além disso, um pesquisador
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149/210 pode administrar o anticorpo reativo cruzado a um primata não humano para estudar, por exemplo, depuração e/ou propriedades farmacodinâmicas do anticorpo. Com base em tais estudos usando o anticorpo reativo cruzado, o pesquisador pode aproximar melhor a dose exigida para tratar doença de humano.
[0328]Em algumas modalidades, os anticorpos C5a anticamundongo ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos, bem como os anticorpos que reagem cruzados com C5a de humano e de camundongo, podem ser usados como um anticorpo substituto em modelos de camundongo de doença de humano. Isto pode ser especialmente usado onde um anticorpo C5a de anti-humano humanizado não reage cruzado com C5a de camundongo e/ou provavelmente causar uma resposta do anticorpo anti-humano em um camundongo no qual o anticorpo humanizado é administrado. Dessa maneira, um pesquisador que deseja estudar o efeito de um anticorpo anti-C5a no tratamento de uma doença (por exemplo, lesão de isquemia-reperfusão) pode usar um anticorpo C5a anticamundongo aqui descrito em um modelo de camundongo apropriado da doença. Se o pesquisador puder estabelecer a eficácia no modelo de camundongo da doença usando o anticorpo C5a anticamundongo, os resultados podem estabelecer validação do conceito para uso de um anticorpo C5a antihumano no tratamento da doença em humanos. Os exemplos funcionais revelam um estudo exemplar usando um anticorpo C5a anticamundongo substituto em um modelo de camundongo de RA estabelecendo validação do conceito para o uso de um anticorpo C5a anti-humano para tratar RA em homem.
[0329]Os anticorpos anti-C5a aqui descritos podem também ser usados em métodos para purificação C5a de uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a pode ser imobilizado em um suporte de fase sólida usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma amostra contendo o antígeno a ser purificado, neste caso C5a, é colocada em contato com o anticorpo no suporte sólido em condições e por um tempo suficiente para permitir que o antígeno
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150/210 ligue no anticorpo. O suporte sólido é então lavado uma ou mais vezes com um tampão adequado para remover material não ligado. O suporte sólido pode ser então colocado em contato com um segundo tampão que resulta na liberação do antígeno do anticorpo. O antígeno liberado é então coletado e caracterizado (por exemplo, para pureza e atividade) usando métodos bem conhecidos na técnica.
[0330]0s anticorpos anti-C5a e seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos podem também ser usados em métodos terapêuticos da maneira elaborada a seguir
Métodos para Tratamento
[0331]As composições supradescritas são usadas, inter alia, nos métodos para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios associados ao complemento em um sujeito. As composições podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, usando uma variedade de métodos que depende, em parte, da via de administração. A via pode ser, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa (IV), injeção subcutânea (SC), injeção intraporitoneal (IP), ou injeção intramuscular (IM).
[0332]A administração pode ser obtida por, por exemplo, infusão local, injeção, ou por meio de um implante. O implante pode ser de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. O implante pode ser configurado para liberação sustentado ou periódica da composição para o sujeito Vide, por exemplo, publicação de pedido de patente U.S. No. 20080241223, patentes U.S. Nos. 5.501.856, 4.863.457 e 3.710.795; EP488401 e EP 430539, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra. A composição pode ser distribuída ao sujeito por meio de um dispositivo com base implantável, por exemplo, em sistemas difusivos, erodíveis, ou convectivos, por exemplo, bombas osmóticas, implantes biodegradáveis, sistemas de eletrodifusão, sistemas de eletro-osmose, bombas de pressão a vapor, bombas eletrolíticas, bombas efervescentes, bombas piezoelétricas, sistemas a base de erosão, ou sistemas
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151/210 eletromecânicos.
[0333]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é terapeuticamente distribuído a um sujeito por meio de administração local. Da maneira aqui usada, “administração local” ou “distribuição local”, refere-se a distribuição que não se baseia no transporte da composição ou agente no seu tecido ou sítio alvo visado por meio do sistema vascular. Por exemplo, a composição pode ser distribuída por injeção ou implantação da composição ou agente ou por injeção ou implantação de um dispositivo contendo a composição ou agente. Após a administração local na proximidade de um tecido ou sítio alvo, a composição ou agente, ou um ou mais de seus componentes, pode difundir no tecido ou sítio alvo visado.
[0334]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser localmente administrado em uma junta (por exemplo, uma junta articulada). Por exemplo, em modalidades onde o distúrbio associado ao complemento é artrite, o inibidor do complemento pode ser administrado diretamente em uma junta (por exemplo, em um espaço da junta) ou na proximidade de uma junta. Exemplos de juntas intra-articulares nas quais um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser localmente administrado incluem, por exemplo, o quadril, joelho, cotovelo, pulso, esternoclavicular, temperomandibular, carpo, tarso, tornozelo, e qualquer outra junta sujeitas a condições artríticas. Um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode também ser administrado na bursa tais como, por exemplo, acromial, bicipitoradial, cubitoradial, deltóide, infrapatelar, isquial, e qualquer outra bursa conhecida na técnica de medicina.
[0335]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser localmente administrado no olho. Da maneira aqui usada, o termo “olho” refere-se a qualquer e todos os tecidos anatômicos e estruturas associadas com um olho. O olho tem uma parede composta de três camadas distintas:
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152/210 a esclerótica externa, a camada coróide do meio, e a retina interna. A câmara atrás da lente é cheia com um fluido gelatinoso referido como o humor vítreo. Atrás do olho fica a retina, que detecta luz. A córnea é um tecido oticamente transparente, que transmite imagens para trás do olho. A córnea inclui um caminho para a permeação de medicamentos no olho. Outras estruturas de tecido anatômico associadas com o olho incluem o sistema de drenagem lacrimal, que inclui um sistema secretório, um sistema distributive e um sistema excretório. O sistema secretório compreende secretores que são estimulados por piscar e mudança de temperatura devido a evaporação da lágrima e reflete secretores que têm um suprimento de nervo parassimpatético eferente e secreta lágrimas em resposta ao estímulo físico ou emocional. O sistema distributive inclui as pálpebras e o menisco da lágrima em torno das bordas da pálpebra de um olho aberto, que espalha lágrimas na superfície ocular pelo piscar, reduzindo assim desenvolvimento de áreas secas.
[0336]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é administrado na câmara posterior do olho. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é administrado intravitreamente. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é administrado transescleroticamente.
[0337]Em algumas modalidades, por exemplo, em modalidades para tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como COPD ou asma, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito pode também ser administrado a um sujeito por meio do pulmão. Distribuição de medicamento pulmonar pode ser obtida por inalação, e administração por inalação aqui pode ser oral e/ou nasal. Exemplos de dispositivos farmacêuticos para distribuição pulmonar incluem inaladores de dose medida, inaladores de pó seco (DPIs), e nebulizadores. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste pode ser administrado nos pulmões de um sujeito por meio de um
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153/210 inalador de pó seco. Esses inaladores são dispositivos sem propelente que distribuem formulações de pó seco dispersíveis e estáveis para os pulmões. Inaladores de pó seco são bem conhecidos na técnica de medicina e incluem, sem limitação: o TurboHaler® (AstraZeneca; Londres, Inglaterra) o inalador AR® (Alkermes®; Cambridge, Massachusetts); Rotahaler® (GlaxoSmithKline; Londres, Inglaterra); e Eclipse™ (Sanofi-Aventis; Paris, França). Vide também, por exemplo, publicações de PCT Nos. WO 04/026380, WO 04/024156, e WO 01/78693. Dispositivos DPI foram usados para administração pulmonar de polipeptídeos tais como insulina e hormônio do crescimento. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste pode ser administrado intrapulmonarmente por meio de um inalador de dose medida. Esses inaladores se baseiam em um propelente para distribuir uma dose discreta de um composto para os pulmões. Exemplos de compostos administrados por inaladores de dose medida incluem, por exemplo, Astovent® (Boehringer-Ingelheim; Ridgefield, Connecticut) e Flovent® (GlaxoSmithKline). Vide também, por exemplo, patentes U.S. Nos. 6.170.717, 5.447.150 e 6.095.141.
[0338]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode ser administrado nos pulmões de um sujeito por meio de um nebulizador. Nebulizadores usam ar comprimido para distribuir um composto como um aerossol liquefeito ou névoa. Um nebulizador pode ser, por exemplo, um nebulizador a jato (por exemplo, nebulizadores a jato de ar ou líquido) ou um nebulizador ultrasônico. Dispositivos adicionais e métodos de administração intrapulmonar são apresentados, por exemplo, na publicação de pedido de patentes U.S. Nos. 20050271660 e 20090110679, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra.
[0339]Em algumas modalidades, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno providos aqui estão presentes em forma de dosagem unitária, que pode ser particularmente adequada para autoadministração. Um produto formulado da
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154/210 presente revelação pode ser incluído em um recipiente, tipicamente, por exemplo, um frasco, cartucho, seringa pré-cheia ou caneta descartável. Um dosador tal como o dispositivo dosador descrito na patente U.S. No. 6.302.855 pode também ser usado, por exemplo, com um sistema de injeção da presente revelação.
[0340]Um sistema de injeção da presente revelação pode empregar uma caneta de distribuição conforme descrito na patente U.S. No. 5.308.341. Dispositivos de caneta, mais comumente usados para autodistribuição de insulina a pacientes com diabetes, são bem conhecidos na técnica. Tais dispositivos podem compreender pelo menos uma agulha de injeção (por exemplo, uma agulha bitola 31 de cerca de 5 a 8 mm de comprimento), são tipicamente precheios com uma ou mais doses unitárias terapêuticas de uma solução terapêutica, e são usados para distribuir rapidamente a solução a um sujeito com mínima dor possível.
[0341 ]Uma caneta de distribuição de medicação inclui um suporte do frasco no qual um frasco de insulina ou outra medicação pode ser recebida. O suporte do frasco é uma estrutura tubular no geral alongado com extremidades proximal e distai. A extremidade distal do suporte do frasco inclui dispositivos de montagem para encaixar uma cânula de agulha de ponta dupla. A extremidade proximal também inclui dispositivos de montagem para encaixar um corpo da caneta que inclui um acionador e aparelho de ajuste da dose. Uma medicação descartável (por exemplo, uma solução de alta concentração de um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno) contendo frasco para uso com o suporte do frasco da tecnologia anterior inclui uma extremidade distal com um septo elastomérico perfurável que pode ser perfurado por uma extremidade de uma cânula de agulha de ponta dupla. A extremidade proximal deste frasco inclui uma rolha deslizável disposta em encaixe firme do fluido com a parede cilíndrica do frasco. Esta caneta de distribuição de medicação é usada inserindo o frasco de medicação no suporte do frasco. Um corpo da caneta então é conectado na extremidade proximal do suporte do frasco. O corpo da caneta inclui um
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155/210 aparelho de ajuste da dose para designar uma dose de medicação a ser distribuída pela caneta e um aparelho de acionamento para impelira rolha do frasco distalmente para uma distância correspondente à dose selecionada. O usuário da caneta monta uma cânula de agulha de ponta dupla na extremidade distal do suporte do frasco de maneira tal que o ponto proximal da cânula da agulha fura o septo no frasco. O paciente então seleciona uma dose e opera a caneta para impelira rolha distalmente para distribuir a dose selecionada. O aparelho de seleção de dose retorna para zero mediante injeção da dose selecionada. O paciente então remove e descarta a cânula da agulha, e mantém a caneta de distribuição de medicação em uma localização conveniente para a administração de medicação exigida seguinte. A medicação no frasco ficará esgotada depois de diversas tais administrações de medicação. O paciente então separa o suporte do frasco do corpo da caneta. O frasco vazio pode então ser removido e descartado. Um frasco novo pode ser inserido no suporte do frasco, e o suporte do frasco e corpo da caneta podem ser remontado e usado como explicado anteriormente. Dessa maneira, uma caneta de distribuição de medicação no geral tem um mecanismo de acionamento para a dosagem precisa e facilidade de uso.
[0342]Um mecanismo de dosagem tais como um botão giratório permite que o usuário ajuste precisamente a quantidade de medicação que será injetada pela caneta de um frasco pré-embalado de medicação. Para injetar a dose de medicação, o usuário insere a agulha sob a pele e pressiona o botão uma até o ponto em que ele pode ser pressionado. A caneta pode ser um dispositivo totalmente mecânico ou ela pode ser combinada com sistemas de circuito eletrônico para ajustar precisamente e/ou indicar a dosagem de medicação que é injetada no usuário. Vide patente U.S. No. 6.192.891.
[0343]Em algumas modalidades, a agulha do dispositivo de caneta é descartável e os estojos incluem uma ou mais agulhas de substituição descartáveis. Dispositivos de canetas adequados para distribuição de qualquer um dos anticorpos
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156/210 atualmente caracterizados ou seus fragmentos de ligação de antígeno são também descritos, por exemplo, nas patentes U.S. nos. 6.277.099; 6.200.296; e 6.146.361, cujas revelações estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra. Um dispositivo de caneta a base de microagulha é descrito, por exemplo, na patente U.S. no. 7.556.615, cuja revelação está incorporada aqui pela referência na sua íntegra. Vide também o dispositivo Precision Pen Injector (PPI), Molly™, fabricado por Scandinavian Health Ltd.
[0344]A presente revelação também apresenta formulações de liberação controlada ou liberação prolongada adequadas para administração crônica e/ou autoadministração de uma medicação tal como um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito. As várias formulações podem ser administradas a um paciente que precisa de tratamento com a medicação como um bolo ou por infusão contínua por um período de tempo.
[0345]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a de alta concentração (ou fragmento de ligação ao antígeno deste) aqui descrito é formulado para administração de liberação sustentada, liberação prolongada, liberação com tempo controlado, liberação controlada, ou liberação contínua. Em algumas modalidades, formulações de depósito são usadas para administrar o anticorpo ao sujeito que necessita deste. Neste método, o anticorpo é formulado com um ou mais veículos fornecendo uma liberação gradual de agente ativo por um período de inúmeras horas ou dias. Tais formulações são frequentemente baseadas em uma matriz de degradação que dispersa gradualmente no corpo para liberar o agente ativo.
[0346]Em algumas modalidades, um fragmento de ligação de C5a (por exemplo, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, ou um fragmento Fab’) de um anticorpo anti-C5a aqui descrito é administrado por meio de administração intrapulmonar a um sujeito que necessita deste. Por exemplo, uma forma de anticorpo de cadeia única de qualquer um dos anticorpos anti-C5a aqui descritos podem ser distribuído
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157/210 por meio de um nebulizador ou um inalador a um sujeito (por exemplo, um humano) que sofre de um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como asma ou COPD.
[0347]Uma dose adequada de um anticorpo ou seu fragmento aqui descrito, cuja dose é capaz de tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento em um sujeito, pode depender de uma variedade de fatores incluindo, por exemplo, a idade, sexo, e peso de um sujeito a ser tratado e o composto inibidor particular usado. Por exemplo, uma dose diferente de um anticorpo anti-C5a total pode ser exigida para tratar um sujeito com RA comparado com a dose de um fragmento do anticorpo Fab’ de ligação de C5a exigida para tratar o mesmo sujeito. Outros fatores que afetam a dose administrada ao sujeito incluem, por exemplo, o tipo ou gravidade do distúrbio mediado por complemento. Por exemplo, um sujeito com RA pode exigir administração de uma dosagem diferente de um anticorpo anti-C5a de um sujeito com AMD. Outros fatores podem incluir, por exemplo, outros distúrbios médicos afetando simultânea ou previamente o sujeito, a saúde geral do sujeito, a disposição genética do sujeito, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de medicamento, e quaisquer outros produtos terapêuticos adicionais que são administrados ao sujeito. Deve-se também entender que uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer sujeito particular dependerá também do julgamento dos versados na técnica de tratamento (por exemplo, médico ou enfermeira).
[0348]Um anticorpo aqui descrito pode ser administrado como uma dose fixa, ou em uma dose de miligrama por quilograma (mg/kg). Em algumas modalidades, a dose pode também ser escolhida para reduzir ou evitar produção dos anticorpos ou outras respostas imunes do hospedeiro contra um ou mais dos anticorpos ativos na composição. Embora não devam de maneira nenhuma ser limitantes, dosagens exemplares de um anticorpo, tal como um anticorpo anti-C5a incluem, por exemplo, 11,000 pg/kg, 1-100 pg/kg, 0,5-50 pg/kg, 0,1-100 pg/kg, 0,5-25 pg/kg, 1-20 pg/kg, e 1
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158/210 pg/kg, 1-100 mg/kg, 0,5-50 mg/kg, 0,1-100 mg/kg, 0,5-25 mg/kg, 1-20 mg/kg, 0,100 mg/kg a 1 mg/kg, e 1-10 mg/kg. Dosagens exemplares de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito inclui, sem limitação, 0,1 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1,0 pg/kg, 2.0 pg/kg, 4 pg/kg, e 8 pg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, e 20 mg/kg.
[0349]Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito. Tais quantidades efetivas podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica baseados, em parte, no efeito do anticorpo administrado, ou no efeito combinatorial do anticorpo e um ou mais agentes ativos adicionais, se mais que um agente for usado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou seu fragmento aqui descrito pode também variar de acordo com fatores tais como a estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo (e um ou mais agentes ativos adicionais) para elicitar uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, melhora de pelo menos um parâmetro da condição, por exemplo, melhora de pelo menos um sintoma do distúrbio mediado por complemento. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo anti-C5a pode inibir (reduzir a gravidade de ou eliminar a ocorrência de) e/ou prevenir um distúrbio particular, e/ou qualquer um dos sintomas do distúrbio particular conhecido na técnica ou aqui descrito. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou detrimentals da composição são salientados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[0350]Doses para humano adequadas de qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos aqui descrito podem adicionalmente ser avaliadas, por exemplo, nos estudos de escalação de dose da Fase I. Vide, por exemplo, van Gurp et al. (2008) Am J Transplantation 8(8): 1711-1718; Hanouska et al. (2007) Clin Cancer Res 13(2, parte 1):523-531; and Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy
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50(10): 3499-3500.
[0351 ]Os termos “quantidade terapeuticamente efetiva” ou “dose terapeuticamente efetiva”, ou termos similares usados aqui devem significar uma quantidade de um agente (por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste) que elicitará a resposta biológica ou médica desejada (por exemplo, uma melhoria em um ou mais sintomas de um distúrbio associado ao complemento). Em algumas modalidades, uma composição aqui descrita contém uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que liga especificamente a um neoepítopo presente em C5a. Em algumas modalidades, a composição contém qualquer um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descritos e um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10, ou 11 ou mais) agentes terapêuticos adicionais de maneira tal que a composição como um todo é terapeuticamente efetiva. Por exemplo, uma composição pode conter um anticorpo anti-C5a aqui descrito e um agente imunossupressor, em que o anticorpo e agente estão cada qual a uma concentração que quando combinados são terapeuticamente efetivos para tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, um distúrbio inflamatório associado ao complemento tais como COPD, asma, sepse, ou RA) em um sujeito.
[0352]Toxicidade e eficácia terapêutica de tais composições podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos em culturas celulares ou animais experimentais (por exemplo, modelos de animal de qualquer um dos distúrbios mediados por complemento aqui descritos). Uso de um anticorpo anti-C5a em um modelo animal de RA é exemplificado nos exemplos funcionais. Esses procedimentos podem ser usados, por exemplo, para determinar a LDso (a dose letal em 50 % da população) e a EDso (a dose terapeuticamente efetiva em 50 % da população). A razão da dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e ela pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que
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160/210 exibe um alto índice terapêutico é preferido. Embora composições que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usadas, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de distribuição que alveja tais compostos no sítio de tecido afetado e para minimizar dano potencial para células normais e, por meio disso, reduzir efeitos colaterais.
[0353]Os dados obtidos dos ensaios da cultura celular e estudos de animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno fica no geral em uma faixa de concentrações circulantes dos anticorpos ou fragmentos que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nesta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para um anticorpo anti-C5a aqui descrito, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios da cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos de animal para obter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a ICso (isto é, a concentração do anticorpo que obtém uma meia inibição máxima de sintomas) como determinado na cultura celular. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses usadas em humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, porcromatografia líquida de alto desempenho. Em algumas modalidades, por exemplo, onde a administração local (por exemplo, no olho ou uma junta) é desejada, cultura celular ou modelamento animal pode ser usado para determinar uma dose exigida para obter um concentração terapeuticamente efetiva no sítio local.
[0354]Em algumas modalidades, os métodos podem ser realizados junto com outras terapias para distúrbios associados ao complemento. Por exemplo, a composição pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo, antes ou depois de plasmaferese, terapia IVIG, ou troca plasmática. Vide, por exemplo, Appel et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16:1392-1404. Em algumas modalidades, a composição pode ser administrada a um sujeito ao mesmo tempo, antes ou depois de um transplante de
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161/210 rim.
[0355]Um “sujeito”, da maneira aqui usada, pode ser qualquer mamífero. Por exemplo, um sujeito pode ser um humano, um primata não humano (por exemplo, macaco, babuíno, ou chimpanzé), um cavalo, um vaca, um porco, uma ovelha, uma cabra, um cão, um gato, um coelho, um porquinho-da-índia, um gerbo, um hamster, um rato, ou um camundongo. Em algumas modalidades, o sujeito é um bebê (por exemplo, um bebê humano).
[0356]Da maneira aqui usada, um sujeito “que precisa de prevenção”, “que precisa de tratamento”, ou “que precisa deste”, refere-se a um, que pelo julgamento dos versados na medicina apropriado (por exemplo, um médico, uma enfermeira, ou uma enfermeira prática no caso de humanos; um veterinário no caso de mamíferos não humanos), se beneficiaria razoavelmente de um dado tratamento (tal como tratamento com uma composição compreendendo um anticorpo anti-C5a).
[0357]O termo “prevenir” é reconhecido pela técnica, e quando usado em relação a uma condição, é bem entendido na técnica, e inclui administração de uma composição que reduz a frequência ou atrasa o início de ação de sintomas de uma condição médica em um sujeito com relação a um sujeito que não recebe a composição. Assim, prevenção de um distúrbio associado ao complemento tal como asma inclui, por exemplo, reduzir a extensão ou frequência de tosse, ofegância, ou dor no peito em uma população de pacientes que recebe um tratamento profilático com relação a um população controle não tratada e/ou atrasara ocorrência de tosse ou ofegância em uma população tratada versos um população controle não tratada, por exemplo, por uma quantidade estatística e/ou clinicamente significativa.
[0358]Conforme descrito anteriormente, os anticorpos e fragmentos biologicamente ativos aqui descritos podem ser usados para tratar uma variedade de distúrbios associados ao complemento tais como, mas sem limitações: artrite reumatóide (RA); nefrite lúpica; lesão isquemia-reperfusão; síndrome urêmica hemolítica atípica
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162/210 (aHUS); síndrome urêmica hemolítica típica ou infecciosa (tHUS); doença do depósito denso (DDD); hemoglobinúria noturna paroxística (PNH); esclerose múltipla (MS); degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada a idade (AMD)); hemólise, enzimas hepáticas elevada, e síndrome plaquetas baixas (HELLP); sepse; dermatomiosite; retinopatia diabética; púrpura trombocitopênica trombótica (TTP); perda fetal espontânea; vasculite Pauci-imune; epidermólise bulhosa; perda fetal recorrente; esclerose múltipla (MS); e lesão cerebral traumática. Vide, por exemplo, Holers (2008) Immunological Reviews 223:300-316 and Holers and Thurman (2004) Molecular Immunology 41.:147-152. Em algumas modalidades, o distúrbio mediado por complemento é um distúrbio vascular mediado pelo complemento tais como, mas sem limitações, um distúrbio cardiovascular, miocardite, um distúrbio cerebrovascular, um distúrbio vascular periférico (por exemplo, musculoesquelético), um distúrbio renovascular, um distúrbio vascular mesentérico/entérico, revascularização de transplantes e/ou reimplantes, vasculite, nefrite púrpura Henoch-Schõnlein, vasculite associada a lupos eritomatoso sistêmico, vasculite associada com artrite reumatóide, vasculite do complexo imune, doença de Takayasu, síndrome da queda capilar, cardiomiopatia dilatada, angiopatia diabética, aneurisma aórtica toráxica abdominal, doença de Kawasaki (arterite), Eembolo de gás venoso (VGE), e restenose após colocação de stent, aterectomia rotacional, e angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA). (Vide, por exemplo, publicação de pedido de patente U.S. no. 20070172483). Em algumas modalidades, o distúrbio associado ao complemento é miastenia grave, doença de aglutinina por frio (CAD), hemoglobinúria por frio paroxística (PCH), dermatomiosite, escleroderma, anemia hemolítica autoimune quente, doença de Graves, teroidite de Hashimoto, diabetes tipo I, psoríase, pênfigo, anemia hemolítica autoimune (AlHA), púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), síndrome de Goodpasture, síndrome antifosfolipídio (APS), doença de Degos, e APS catastrófico (CAPS).
[0359]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de
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163/210 ligação ao antígeno aqui descrito, sozinho ou em combinação com um segundo agente anti-inflamatório, pode ser usado para tratar um distúrbio inflamatório tais como, mas sem limitações, RA (anteriormente), doença do intestino inflamatório, sepse (anteriormente), choque séptico, lesão pulmonar aguda, coagulação intravascular disseminada (DIC), ou doença de Crohn. Em algumas modalidades, o segundo agente anti-inflamatório pode ser um selecionado do grupo que consiste em NSAIDs, corticoesteróides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tais como etanercept e infliximab, um agente de esgotamento da célula B tal como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente de bloqueio costimulatório da célula T tais como abatacept.
[0360]Em algumas modalidades, o distúrbio associado ao complemento é um distúrbio neurológico associado ao complemento tais como, mas sem limitações, esclerose amiotrófica lateral (ALS), lesão cerebral, doença de Alzheimer, e neuropatia desmielinante inflamatória crônica.
[0361 ]Distúrbios associados ao complemento também incluem distúrbios pulmonares associados ao complemento tais como, mas sem limitações, asma, bronquite, uma doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), um doença pulmonar intersticial, deficiência de a-1 anti-tripsina, enfisema, bronquiectasia, bronquiolite obliterante, alveolite, sarcoidose, fibrose pulmonar, e distúrbios vasculares de colágeno.
[0362]No caso de distúrbios hemolíticos associados ao complemento tais como PNH, CAD, e PCH, versados na medicina perceberão que fragmento de C5 C5b (por meio do complexo terminal do complemento) contribui significativamente para a patogênese desses distúrbios. Vide, por exemplo, Kaplan (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(7):1017-23; Hill (2005) Clin Adv Hematol Oncol 3(11):849-50: and Rother et al. (2007) Nature Biothecnology 25(11): 1256-1488. Dessa maneira, versados na medicina podem eleger administrar um ou mais dos anticorpos anti-C5a aqui descritos junto com uma ou mais terapias adicionais para o distúrbio hemolítico tais como um
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164/210 inibidor do complemento que previne formação do complexo terminal do complemento de C5b-9. Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o distúrbio associado ao complemento não é um distúrbio hemolítico associado ao complemento. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste é administrado a um sujeito para tratar, prevenir, ou melhorar pelo menos um sintoma de uma resposta inflamatória associada ao complemento (por exemplo, o aspecto de resposta inflamatória associada ao complemento de um distúrbio associado ao complemento) em um sujeito. Por exemplo, um anticorpo anti-C5a aqui descrito pode ser usado para tratar, prevenir, e/ou melhorar um ou mais sintomas associados com uma resposta inflamatória associada ao complemento tais como rejeição a enxerto/enxerto-versos- doença hospedeira (GVHD), lesões de reperfusão (por exemplo, após desvio cardiopulmonar ou um transplante de tecido), e dano do tecido após outras formas de lesão traumática tais como uma queimadura (por exemplo, uma queimadura grave), trauma contuso, lesão espinhal, ou ulceração pelo frio. Vide, por exemplo, Park et al. (1999) Anesth Analg 99(1):42-48: Tofukuji et al. (1998) J Thorac Cardiovasc Surg 116(6):1060-1068: Schmid et al. (1997) Shock 8(2):119-124: and Bless etal. (1999) Am J Physiol 276(1 ):L57-L63.
[0363]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito pode ser administrado a um sujeito como uma monoterapia. Alternativamente, conforme descrito anteriormente, o anticorpo ou seu fragmento pode ser administrado a um sujeito como uma terapia de combinação com um outro tratamento, por exemplo, um outro tratamento para um distúrbio associado ao complemento ou uma resposta inflamatória associada ao complemento. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir administrar ao sujeito (por exemplo, um paciente humano) um ou mais agentes adicionais (por exemplo, medicamentos anti-coagulantes, anti-hipertensivos, ou anti-i nflamatórios (por exemplo, esteróides)) que fornece um benefício terapêutico a um sujeito que tem, ou corre o risco de desenvolver,
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165/210 sepse. Em um outro exemplo, a terapia de combinação pode incluir administrar ao sujeito um ou mais agentes adicionais (por exemplo, um anticorpo anti-lgE, um anticorpo anti-IL-4, um anticorpo anti-IL-5, ou um anti-histamina) que fornecem benefício terapêutico a um sujeito que tem, corre o risco de desenvolver, ou é suspeito de ter um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como COPD ou asma. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-C5a e o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados ao mesmo tempo. Em outras modalidades, o anticorpo anti-C5a é administrado em primeiro lugar e o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados em segundo lugar. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes ativos adicionais são administrados em primeiro lugar e o anticorpo anti-C5a é administrado em segundo lugar.
[0364]Um anticorpo anti-C5a ou um fragmento de ligação ao antígeno deste aqui descrito pode substituir ou aumentar uma terapia administrada previamente ou simultaneamente. Por exemplo, mediante tratamento com um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno, administração do um ou mais agentes ativos adicionais pode cessar ou diminuir, por exemplo, ser administrado a níveis mais baixos. Em algumas modalidades, administração da terapia prévia pode ser mantida. Em algumas modalidades, uma terapia prévia será mantida até que o nível do anticorpo anti-C5a atinja um nível suficiente para fornecer um efeito terapêutico. As duas terapias podem ser administradas em combinação.
[0365]Monitoramento de um sujeito (por exemplo, um paciente humano) para uma melhoria em um distúrbio associado ao complemento (por exemplo, sepse, queimadura grave, RA, nefrite lúpica, síndrome de Goodpasture, ou asma), da maneira aqui definida, significa avaliar o sujeito para uma mudança em um parâmetro da doença, por exemplo, uma melhoria em um ou mais sintomas de um dado distúrbio. Os sintomas de distúrbios associados ao complemento são bem conhecidos na técnica de medicina. Em algumas modalidades, a avaliação é realizada pelo menos uma (1)
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166/210 hora, por exemplo, pelo menos 2, 4, 6, 8, 12, 24, ou 48 horas, ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 4 dias, 10 dias, 13 dias, 20 dias ou mais, ou pelo menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 10 semanas, 13 semanas, 20 semanas ou mais, depois de uma administração. O sujeito pode ser avaliado em um ou mais dos seguintes períodos: antes do início do tratamento; durante o tratamento; ou depois de um ou mais elementos do tratamento serem administrados. Avaliação pode incluir avaliar a necessidade de tratamento adicional, por exemplo, avaliar se uma dosagem, frequência de administração, ou duração de tratamento deve ser alterada. Pode-se também incluir avaliar a necessidade de adicionar ou retirar uma modalidade terapêutica selecionada, por exemplo, adição ou remoção de qualquer um dos tratamentos para um distúrbio associado ao complemento aqui descrito.
Estojos Terapêuticos e de Diagnósticos
[0366]A revelação também diz respeito a estojos terapêuticos e de diagnósticos contendo, entre outras coisas, um ou mais dos anticorpos anti-C5a, e/ou seus fragmentos de ligação de antígeno, aqui descritos. Os estojos terapêuticos podem conter, por exemplo, um dispositivo adequado para distribuição do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito. Em algumas modalidades, o dispositivo é adequado para distribuição subcutânea do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno ao sujeito O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa ou uma bomba osmótica. Ou seja, um estojo terapêutico aqui descrito pode conter uma seringa précheia com um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um dispositivo de caneta contendo o anticorpo ou fragmento) aqui descrito ou o estojo pode conter uma bomba (por exemplo, uma bomba osmótica) e um ou mais cassetes descartáveis configurados para uso com a bomba, os cassetes pré-cheios com um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, pré-cheios com uma solução aquosa contendo o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno). Em um outro exemplo, o estojo pode conter um
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167/210 dispositivo de distribuição transesclerótico ou implantável (por exemplo, um plugue) que é pré-cheio com (ou de outra forma contém) uma solução contendo um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito.
[0367]Em algumas modalidades, o dispositivo para distribuir um anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um dispositivo de caneta para distribuição de medicamento.
[0368]Em algumas modalidades, o dispositivo é adequado para distribuição intrapulmonar do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito, por exemplo, para uso no tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento tal como, mas sem limitações, COPD ou asma. Dessa maneira, o dispositivo pode ser, por exemplo, um inalador oral ou nasal (vide anteriormente). O inalador pode ser, por exemplo, um inalador de dose medida (MDI), inalador de pó seco (DPI), ou um nebulizador. Um estojo como esse pode também, opcionalmente, incluir instruções para administrar (por exemplo, autoadministração de) o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito.
[0369]Os estojos terapêuticos podem incluir, por exemplo, um ou mais agentes ativos adicionais para tratar ou prevenir um distúrbio associado ao complemento e/ou melhorar um sintoma deste. Por exemplo, estojos terapêuticos projetados para uso no tratamento ou prevenção de um distúrbio pulmonar associado ao complemento podem incluir um ou mais agentes ativos adicionais incluindo, mas sem limitações, um outro anticorpo terapêutico (por exemplo, um anticorpo anti-lgE, um anticorpo anti-IL4, ou um anticorpo anti-IL-5), um inibidor anti-lgE de molécula pequena (por exemplo, montelucaste de sódio), um simpatomimético (por exemplo, albuterol), um antibiótico (por exemplo, tobramicina), um deoxiribonuclease (por exemplo, pulmozima), um medicamento anticolinérgico (por exemplo, brometo de ipratrópio), um corticoesteróide (por exemplo, dexametasona), um agonista α-adrenoreceptor, um inibidor de leucotrieno (por exemplo, zileuton), um inibidor 5-lipoxigenase, um inibidor fosfodiesterase
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168/210 (PDE), um antagonista de CD23, um antagonista de IL-13, um inibidor de liberação de citocina, um antagonista do receptor H1 da histamina, um anti-histamina, um agente anti-inflamatório (por exemplo, cromolina de sódio ou qualquer outro agente anti-inflamatório conhecido na técnica ou aqui descrito), ou um inibidor de liberação da histamina.
[0370]Em algumas modalidades, o dispositivo pode ser adequado para administração intraocular de um anticorpo anti-C5a, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito a um sujeito que necessita deste, por exemplo, um sujeito que sofre de AMD ou qualquer outro distúrbio ocular associado ao complemento. O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa, um enxerto transescleral, ou mesmo uma lente de contato contendo o anticorpo ou fragmento. O dispositivo pode, em algumas modalidades, serum gotejadorpara olhos, em que o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado para tal comodministração. Tais estojos terapêuticos podem também incluir, por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos adicionais para uso no tratamento de distúrbio associado ao complemento do olho. Os agentes terapêuticos podem ser, por exemplo, bevacizumab ou o fragmento Fab de bevacizumab, ranibizimab, ambos vendidos pela Roche Pharmaceuticals, Inc., ou pegaptanib de sódio (Mucogen®; Pfizer, Inc).. Um estojo como esse pode também, opcionalmente, incluir instruções para administrar os anticorpos anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito.
[0371]Em algumas modalidades, o dispositivo pode ser adequado para administração intra-articular de um anticorpo anti-C5a, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, aqui descrito a um sujeito que necessita deste, por exemplo, um sujeito que sofre de RA. O dispositivo pode ser, por exemplo, uma seringa ou uma seringa de cilindro duplo. Vide, por exemplo, patentes U.S. Nos. 6,065.645 e 6.698.622. Uma seringa de cilindro duplo é usada para administrar a uma junta duas diferentes composições com somente uma injeção. Duas seringas separadas podem ser
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169/210 incorporadas para uso na administração do agente terapêutico extraindo ao mesmo tempo fluido do joelho para análise (punção) em um modo puxa e empurra. Agentes terapêuticos adicionais que podem ser administrados com os anticorpos anti-C5a ou fragmentos junto com a seringa de cilindro duplo, ou que podem de outra forma ser no geral incluídos nos estojos terapêuticos aqui descritos, incluem, por exemplo, NSAIDs, corticoesteróides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tais como etanercept e infliximab, um agente de esgotamento da célula B tal como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente de bloqueio costimulatório da célula T tal como abatacept. Um estojo como esse pode também, opcionalmente, incluir instruções para administrar o anticorpo anti-C5a ou seu fragmento de ligação ao antígeno a um sujeito. Será percebido que a revelação engloba estojos compreendendo um ou mais dos anticorpos anti-C5a aqui descritos e um ou mais agentes antiinflamatórios selecionados do grupo que consiste em NSAIDs, corticoesteróides, metotrexato, hidroxicloroquina, agentes anti-TNF tais como etanercept e infliximab, um agente de esgotamento da célula B tais como rituximab, um antagonista de interleucina-1, ou um agente de bloqueio costimulatório da célula T tal como abatacept. Os anticorpos e agentes podem ser, por exemplo, formulados separadamente ou juntos. Os estojos podem ser usados para tratar uma condição inflamatória tais como RA, doença de Crohn, doença do intestino inflamatório, ou qualquer outro distúrbio inflamatório conhecido na técnica ou relatado aqui.
[0372]Também caracterizados são estojos de diagnóstico contendo os anticorpos anti-C5a ou seus fragmentos de ligação de antígeno aqui descrito. Por exemplo, os estojos podem conter uma forma detectavelmente marcada de um anticorpo anti-C5a (por exemplo, um anticorpo anti-C5a ou um anticorpo C5a anticamundongo) aqui descrito para uso na detecção e quantificação da quantidade de C5a em uma amostra biológica. Em algumas modalidades, os estojos podem conter proteína C5a isolada (por exemplo, tanto proteína C5a de humano quanto de camundongo) e/ou
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170/210 uma amostra controle compreendendo uma ou tanto proteína C5a de humano quanto de camundongo. Em algumas modalidades, o estojo contém uma placa multipoços revestida com um primeiro anticorpo anti-C5a com uma primeira especificidade. O estojo também contém um segundo anticorpo anti-C5a (por exemplo, um segundo anticorpo anti-C5a detectavelmente marcado) com uma segunda especificidade. Um estojo como esse projetado para uso na captura, com o primeiro anticorpo ligado na placa, da proteína C5a (por exemplo, proteína C5a de humano) em uma amostra (por exemplo, uma amostra biológica) colocada em contato com a placa e então detectar o proteína C5a capturada usando o segundo anticorpo. Em algumas modalidades, estojos de diagnóstico incluem tanto um anticorpo C5a anticamundongo quanto um anticorpo C5a anti-humano aqui descrito. Em algumas modalidades, os estojos de diagnóstico incluem um anticorpo anti-C5a que liga tanto a C5a de camundongo quanto C5a de humano.
[0373]Os exemplos seguintes visam ilustrar, não limitar, a invenção.
Exemplos
Exemplo 1. Métodos de Imunização
[0374]Os anticorpos anti-C5a atualmente descritos são formas humanizadas de anticorpos de murino gerados de acordo com o seguinte protocolo de imunização. Imunizações para aumentar anticorpos contra C5a de humano desarginado foram realizadas em quatro camundongos incluindo dois camundongos da cepa DBA/2J e dois camundongos da cepa A/J. Essas cepas foram selecionadas devido a elas carregarem o alelo Hc°, que as tornam deficiente em C5 endógeno. Todas as imunizações foram repetidas em intervalos de 14 dias para um total de três imunizações. Todos os animais receberam uma imunização subcutânea de intensificação de aproximadamente 50 pg de C5a purificado em 200 pl_ de emulsão adjuvante aproximadamente 14 dias depois da última imunização e 5 a 7 dias antes da colheita. Titulação de soro dos camundongos imunizados, usando um ensaio ELISA, mostrou que os
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171/210 camundongos exibiram uma forte resposta ao anticorpo contra o imunógeno de C5a de humano desarginado.
Exemplo 2. Determinação de especificidade dos anticorpos de camundongo oara C5a de humano
[0375]Um subconjunto de cinco C5a de camundongo anti-humano Fabs que foram representativos de Fabs seletivos neopítopo foram convertidos em anticorpos de lgG2a de camundongo de comprimento total designados como - 5anO48ME, 5an101ME, 5an178ME, 5an179ME, e 5an180ME. Esses anticorpos foram avaliados para especificidade usando Biolayer Interferometry em um Octet (ForteBio Inc).. (As sequências de aminoácidos de conjuntos de CDR de cadeia leve e cadeia pesada de cada anticorpo, definidas por Kabat, são apresentadas na tabela 3). Resumidamente, C5a de humano, C5a de humano des Arg, C5 de humano de comprimento total, ou paralogs de C5a de humano C3a e C4a de humano foram conjugados com biotina a uma estoiquiometria de < 1 (biotina):1 (anticorpo) através de grupos amina e imobilizados em uma estreptavidina ponta de estreptavidina. As pontas carregadas foram então expostas a uma solução contendo 20 nM de anticorpo IgG anti-C5a. Cada qual dos anticorpos ligado a C5a e C5a desarginado. Nenhum dos anticorpos IgG anti-C5a ligados a C3a ou a C4a. Entretanto, 5an178ME e 5an179ME cada qual ligado a C5 de comprimento total de humano. Uma pequena quantidade de ligação foi observada entre 5anO48ME e C5 de comprimento total de humano. Entretanto, a ligação de 5anO48ME em C5 foi muito menor que a ligação observada em C5a.
[0376]Esse resultados confirmaram que anticorpo C5a de camundongo antihumano - 5anO48ME, 5an101 ME, e 5an180ME - ligado a um neopítopo em C5a que foi ocluso em C5 de comprimento total nativo ou gerado depois da divagem de C5 nos fragmentos de C5a e C5b. Os resultados também indicaram que os três anticorpos foram seletivos para C5a de humano comparado com paralogs C3a ou C4a.
Tabela 3. Sequências de Aminoácidos para Cinco Anticorpos C5a Murino
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Anti-Humano
Ab SIN: Descrição Sequência de aminoácidos
5anO48M E 151 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVS SSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGV PARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYC QQYSGYPLTFGGGTKLEIKR
140 CDR1 de Cadeia Leve RASSSVSSSYLH
96 CDR2 de cadeia leve STSNLAS
142 CDR3 de Cadeia Leve QQYSGYPLT
152 Sequência de Aminoácidos Vh EVRLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFN DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
144 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an101M E 153 Sequência de Aminoácidos Vl DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVD SYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE SGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATY YCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKR
20 CDR1 de Cadeia Leve RASESVDSYGNSFMH
21 CDR2 de Cadeia Leve RASNLES
22 CDR3 de Cadeia Leve QQSNEDPYT
154 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFT DYSMDWVKQSHGKSLEWIGAINPNSGGTN YSQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSE DSAVYYCASSGSYDGYYAMDYWGQGTSV TVSS
28 CDR1 de Cadeia Pesada DYSMD
67 CDR2 de Cadeia Pesada AINPNSGGTNYSQKFKD
30 CDR4 de Cadeia Pesada SGSYDGYYAMDY
5an180M E 155 Vl Sequência de aminoácidos DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYS YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPS RFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQH HYGTPYTFGGGTKLEIKR
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Ab SIN: Descrição Sequência de aminoácidos
156 CDR1 de Cadeia Leve RASENIYSYLA
157 CDR2 de Cadeia Leve NAKTLAE
158 CDR3 de Cadeia Leve QHHYGTPYT
159 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQPGAEIVRPGASVKLSCRASGYTFT DYWMNWVKQRPGQGLEWIGTIDPSDSYTI YNQKFKGKATLTVDTSSTTAYIQLSSLTSED SAVYFCARGEDYDVSSYTMDYWGQGTSV TVSS
160 CDR1 de Cadeia Pesada DYWMN
161 CDR2 de Cadeia Pesada TIDPSDSYTIYNQKFKG
162 CDR4 de Cadeia Pesada GEDYDVSSYTMDY
5an178M E 163 Vl Sequência de aminoácidos EIVLTQSPASLAVSLGQRATISCSASESVEY FGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVES GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMY FCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR
164 CDR1 de Cadeia Leve SASESVEYFGTSLMQ
165 CDR2 de Cadeia Leve AASNVES
166 CDR3 de Cadeia Leve QQSRKVPWT
167 Sequência de Aminoácidos Vh EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTF SDYGMVWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSNI YYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMNSLRS EDTAIYYCGRAFSFYYGYDYWGQGTTLTVS S
168 CDR1 de Cadeia Pesada DYGMV
169 CDR2 de Cadeia Pesada FISSGSSNIYYADTVKG
170 CDR4 de Cadeia Pesada AFSFYYGYDY
5an179M E 171 Vl Sequência de aminoácidos DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLV HSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGV YFCSQSTHVPLTFGAGTKLELKR
172 CDR1 de Cadeia Leve RSSQSLVHSNGNTYLH
173 CDR2 de Cadeia Leve KVSNRFS
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174/210
Ab SIN: Descrição Sequência de aminoácidos
174 CDR3 de Cadeia Leve SQSTHVPLT
175 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKASGYTF TSYLIHWVKQKPGQGLEWIGYIYPFNDGTK NNENFKGKATLTSDKSSSTVYMEVSSLTSE DSAVYYCARSHGPHYYGGSYGYHFDYWG QGTTLTVSS
176 CDR1 de Cadeia Pesada SYLIH
177 CDR2 de Cadeia Pesada YIYPFNDGTKNNENFKG
178 CDR4 de Cadeia Pesada SHGPHYYGGSYGYHFDY
“SIN” na tabela refere-se a “SEQ ID NO”.
•CDR sequência de aminoácidos definida de acordo com Kabat et al. (supra).
[0377]Uma série de ensaios sanduíche foi realizada por Octet no selecionado subconjunto de anticorpos lgG2a de C5a de camundongo anti-humano para determinar o grau de sobreposição dos epítopos C5a para cada um dos cinco anticorpos lgG2a representativos. Resumidamente, um primeiro anticorpo foi bioltinilado e imobilizado em uma ponta de estreptavidina revestida na plataforma Octet. Em seguida, C5a de humano foi capturado de uma solução 20 nM no anticorpo imobilizado. A ponta que carrega o complexo anticorpo-C5a foi então exposta a uma solução contendo 20 nM de um segundo anticorpo IgG anti-C5a não marcado. A elicitação de um perfil de associação adicional na sensograma indicaria que os dois anticorpos ligam C5a simultaneamente em um complexo ternário e que os epítopos de ligação com os dois anticorpos foram não sobrepostos. Uma falha na obtenção de um segundo perfil de associação mediante adição do segundo anticorpo indicaria que os dois anticorpos ligam C5a de uma maneira competitiva, isto é, o epítopo em C5a no qual o segundo anticorpo se liga, foi ocluso depois da ligação pelo primeiro anticorpo. Ao contrário da ligação não competitiva, ligação competitiva não indica necessariamente que o primeiro e segundo anticorpos reconheceram o mesmo, ou mesmo sobrepuseram, epítopos em C5a de humano. Usando esta abordagem os sítios de ligação dos cinco
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175/210 anticorpos anti-C5a representativos foram atribuídos a 4 epítopos distintos em C5a de humano (Figura 1). Anticorpos 5anO48ME, 5an180ME, e 5an101ME competem um com o outro. Embora 5an048 e 5an180 também compitam com o 5an179ME seletivo não neopítopo, o 5an101ME não, que indicou que 5anO48ME e 5an180ME reconhecem um neopítopo que é diferente do epítopo reconhecido por 5an101ME. Além do mais, embora o 5an178ME anticorpo seletivo não neopítopo do tenha competido com 5an179ME seletivo não neopítopo, somente o último competiu com 5an180ME e 5anO48ME, mostrando que5an179ME e5an178ME ligam diferentes epítopos que são acessíveis tanto em C5 quanto em C5a. Os resultados também indicaram que algumas combinações dos anticorpos poderíam ser usadas em ensaios baseados em sanduíche para detectar e/ou quantificar a quantidade de C5a em uma amostra.
Exemplo 3. Humanização de anticorpo C5a de camundonqo anti-humano seleto
[0378]As regiões variáveis de dois anticorpos C5a de camundongo anti-humano relacionados - 5an101ME e 5an185ME - foram selecionadas para humanização como anticorpos IgG de comprimento total. Humanização das regiões variáveis de cadeia leve e pesada foi com base em identificar regiões da estrutura individual dos anticorpos de humano (com uma preferência dada a genes v da linha germinal) com um alto grau de identidade de sequência para o anticorpo pai murino original. Métodos adequados para identificar regiões da estrutura candidatas são descritos na patente U.S. no. 7.393.648 de Rother and Wu. Definições de estrutura (FW) e regiões determinante de complementariedade (CDRs) foram realizadas de acordo com métodos descritos por Kabat, Chothia e IMGT® (International ImmunoGenetics Information System; França). Resumidamente, consultas na base de dados foram realizadas independentemente para as regiões variáveis tanto de cadeia leve quanto pesada com uma variedade de fragmentos do anticorpo incluindo: região variável de murino intacta da FW1 através de FW4, regiões variáveis de murino intactas excluindo CDRs e todos
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176/210 possíveis fragmentos de regiões variáveis de murino incluindo um, dois ou três estruturas com ou sem seus CDRs de flanco. Estruturas de humano foram selecionadas de seu agrupamento candidato com base em sua identidade de sequência geral para os anticorpos de murino originais e seus fragmentos. Métodos biológicos moleculares de rotina foram empregados para montar bibliotecas combinatoriais pequenas, menores que 103 elementos, nas quais cada conjunto de CDRs de murino foi flanqueado por todas combinações possíveis de estruturas de humano selecionadas. Esses anticorpos humanizados foram expressos como Fabs solúveis e avaliados para ligar a C5a desarginado usando ELISA. Fabs que ligou a C5a foram então submetidos a análise de sequência de DNA.
[0379]A partir desses ligantes um subconjunto de seis Fabs humanizados foi reformatado como IgGs de comprimento total (lgG2 de humano ou lgG2/G4 de humano). Humanização adicional foi realizada em dois anticorpos (BNJ371 e BNJ381) substituindo resíduos de murino em CDR2 de cadeia leve com seus aminoácidos da linha germinal de humano correspondentes. As sequências de aminoácidos dos anticorpos anti-C5a humanizados - BNJ364, BNJ367, BNJ371, BNJ378, BNJ366, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 - são apresentada na tabela 2 a seguir.
Exemplo 4. Determinar a afinidade do anticorpo anti-C5a de humano humanizado oara C5a
[0380]0s anticorpos humanizados foram submetidos a análise BIAcore para quantificar suas respectivas afinidades para C5a de humano. Vide, por exemplo, Karlsson and Larsson (2004) Metods Mol Biol 248:389-415. Resumidamente, cada qual dos anticorpos humanizados foi classificado com 3-4 concentrações de C5a de humano (antígeno) usando uma técnica de captura. Os anticorpos foram capturados por um Anti-Fc (humano) diretamente imobilizado em um chipe sensor CM5 com várias concentrações na faixa de 0,6 nM a 5,9 nM de C5a de humano passadas sobre a superfície do chipe sensor. A superfície foi regenerada com HCI 20 mM, 0,02 % de
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P20 depois de cada ciclo para remover anticorpo e antígeno ligados. Os dados foram avaliados usando software Biacore BIAevaluation usando um Langmuir Model Fit 1:1 (Rmax:Global Fit; RI local Fit). Informação cinética tais como (ka: Constante da Taxa de Associação), (kdOonstante da Taxa de Dissociação) e Kd (Constante de Dissociação de Equilíbrio) foi obtida a partir do ajuste. Os resultados das análises são apresentados na tabela 4. Esses experimentos foram com propósito de classificação com um número mínimo de concentrações de análito (3 a 4) com 1 duplicata. Portanto, os valores cinéticos aproximados são reportados na tabela 4.
Tabela 4. Medições de Afinidade para Selecionar Anticorpos Anti-C5a Humanizados
Designação do Anticorpo ka (1/Ms) (x106) kd (1/s) (x10-4) Kd (M) (x10-12) X2
BNJ364 0,991 6,38 644 0,819
BNJ367 3,94 7,78 198 0,848
BNJ371 2,38 28,2 1180 9,52
BNJ378 1,93 5,76 298 3,63
BNJ366 1,05 1,58 150 1,33
BNJ369 4,19 2,23 53,1 0,642
BNJ381 2,57 2,09 81,5 1,93
BNJ383 2,12 1,5 70,4 2,52
[0381 ]Todos os anticorpos humanizados ligam especificamente a C5a de humano com uma Kd menor que 1,30 nanomolar. Todos os anticorpos com a exceção de BNJ371 ligam a C5a de humano com uma Kd menor que 1 nanomolar. Três dos anticorpos, BNJ369, BNJ381, e BNJ383 ligam a C5a de humano com uma Kd menor que 100 picomolares.
Exemplo 5. Anticorpos anti-C5a inibem sinalização mediada por C5a in vitro
[0382]Um ensaio in vitro de ativação de neutrófilo foi usado para avaliar a atividade dos anticorpos humanizados. O ensaio é no geral descrito, por exemplo, em Paczkowski etal. (1999) Br J Pharmacol 128(7):1461-1466, e serve para quantificara quantidade de mieloporoxidase (MPO) produzida por neutrófilos como uma medida de ativação de neutrófilo. Resumidamente, células polimorfonucleares, a maioria das
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178/210 quais sendo neutrófilos, foram isoladas usando centrifugação de densidade (meio de resolução mono-poli número do catálogo: 91698049; MP Biochemicals; Solon, Ohio) de sangue total de um doador saudável. As células foram lavadas uma vez com salina tamponada com fosfato (PBS) e as células do sangue vermelho (RBC) removidas da população celular por lise em uma solução hipotônica (tampão de lise ACK número do catálogo 10-548E; Lonza). Depois de mais duas lavagens com PBS, as células sem RBC foram ressuspensas a uma concentração de 4 x 106 células/mL em Solução de Sal Balanceada de Hank (HBSS; Mediatech, número do catálogo: 21- 023-CV), que foi suplementada com cálcio e magnésio e adicionalmente suplementada com 0,1 % de gelatina (Sigma Aldrich; St. Louis, Missouri) [a seguir o ensaio tampão],
Citocalasina B (Sigma Aldrich) foi adicionada na suspensão celular em uma quantidade suficiente para atingir uma concentração de 10 pg/mL. A suspensão foi então incubada por 10 minutos a 37 °C. 100 pL de células foram adicionados aos poços de 96 poços com base em forma de U. Os poços da placa foram agrupados em diversos conjuntos diferentes. Cada qual dos diversos conjuntos diferentes dos poços conteve um anticorpo anti-C5a: cada poço do conjunto 1 conteve um anticorpo humanizado que liga a C5 nativo não clivado, mas não a C5a livre; cada poço do conjunto 2 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ367; cada poço do conjunto 3 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ369; cada poço do conjunto 4 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ371; cada poço do conjunto 5 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ378; cada poço do conjunto 6 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ381; e cada poço do conjunto 7 conteve o anticorpo anti-C5a humanizado BNJ383. Cada poço de um oitavo conjunto de poços conteve no anticorpo. Uma faixa de concentrações do anticorpo foi avaliada em cada conjunto de poços, a faixa incluindo 0,08 nM, 0,4 nM, 2 nM, e 10 nM de anticorpo.
2C5a (obtido de Complement Technologies, Inc) foi avaliado a uma concentração de 2 nM. Uma concentração funcional 10X de 20 nM foi preparada no tampão
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179/210 de ensaio supramencionado e 20 pL foram adicionados a cada poço. Depois da adição de C5a nos poços, a placa foi incubada por 10 minutos a 37 °C. Após a incubação, 60 pl_ de PBS foram adicionados a cada poço da placa. As placas foram submetidas a centrifugação a 1.200 rpm (aproximadamente 335 x g) por 10 minutos à temperatura ambiente.
[0383]100 pL do sobrenadante de cada poço foram transferidos para o poço correspondente de uma segunda placa. 25 pL de substrato (Sigma Aldrich número do catálogo T0440) foram adicionados a cada poço da segunda placa e a reação poroxidase desenvolveu naturalmente por aproximadamente dois a cinco minutos. A reação foi terminada pela adição de 25 pL de HC11 N. O OD a 450 nM foi registrado.
[0384]Conforme mostrado na figura 2, todos os anticorpos anti-C5a humanizados inibiram a ativação de neutrófilo in vitro. Esses resultados indicam que os anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos são inibidores potentes de sinalização mediada por C5a in vitro e suportam a conclusão pelos inventores que os anticorpos são usados para tratar uma variedade de distúrbios associados ao complemento (por exemplo, distúrbios inflamatórios associados ao complemento) em humanos.
Exemplo 6. Caracterização de um anticorpo C5a de camundongo anticamundongo substituto
[0385]Uma série de ensaios sanduíche foram realizados em um selecionado anticorpo IgG de C5a de camundongo anticamundongo - 5an195ME - para determinara especificidade do anticorpo para C5a. Resumidamente, os poços de uma placa de ensaio foram revestidos com o anticorpo 5an195ME. A placa foi lavada completamente para remover anticorpo não ligado. Em seguida, poços contendo 5an195ME foram colocados em contato com C5a de camundongo por um tempo e em condições suficientes para permitir que o antígeno ligue ao anticorpo. Proteína não ligada foi removida com lavagem. Em seguida da etapa de lavagem, os poços foram adicionalmente colocados em contato com uma solução contendo um segundo anticorpo anti
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C5a bioltinilado. Os poços foram novamente lavados para remover qualquer segundo anticorpo não ligado. A quantidade de ligação do segundo anticorpo no poço foi quantificada usando poroxidase de rábano silvestre conjugada com estreptavidina (HRP). A quantidade de ligação do segundo anticorpo foi função da ligação de C5a a 5an195ME.
[0386]Em um experimento paralelo, um conjunto de poços revestidos com 5an195ME foi incubado com proteína C5 de camundongo de comprimento total, sem ser C5a. Após uma etapa de lavagem, os poços foram colocados em contato com uma solução contendo um segundo anticorpo: um anticorpo C5 anticamundongo bioltinilado. A quantidade de ligação do segundo anticorpo, em função da quantidade de C5 ligado por 5an195ME, foi quantificada usando o construto HRP conjugado com estreptavidina. Uma falta de ligação do segundo anticorpo indica que 5an195ME não liga a C5 de camundongo de comprimento total.
[0387]Apesar do 5an195ME ligado a C5a de uma maneira dependente da dose, não foi detectada nenhuma ligação entre o anticorpo e C5 de camundongo de comprimento total usando este ensaio. Esse resultados indicam que 5an195ME liga a um neoepítopo presente em C5a.
[0388]A afinidade relativa de ligação de 5an195ME para C5a de camundongo foi adicionalmente quantificada usando BIAcore. A cinética de 5an195ME foi medida usando uma técnica de captura. O anticorpo foi capturado por um Anti-Fc (camundongo) diretamente imobilizado em um chipe sensor CM5 com várias concentrações entre e inclusive de 0,4 nM e 25 nM de C5a de camundongo passadas sobre a superfície do chipe sensor. Duplicatas de cada concentração foram também corridas. A superfície do chipe foi regenerada com HCI glicina 10 mM pH 1,7 depois de cada ciclo para remover anticorpo e antígeno ligados. Os dados foram avaliados usando software Biacore BIAevaluation usando um 1:1 Langmuir Model Fit (Rmax:Global Fit; RI:Local Fit). Informação cinética tais como ka (Constante da Taxa de Associação), kd
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181/210 (Constante da Taxa de Dissociação) e Kd (Constante de Dissociação de Equilíbrio) foi obtida a partir do ajuste. Os resultados das análises cinéticas são mostrados na tabela 5.
Tabela 5. Cinética Medida de 5an195ME oara C5a d e Camundongo
Parâmetro: ka (1/Ms) kd (1/s) Kd(M) X2
5an195ME 8,47x105 1,37x10-3 1,5 x10’9 1,17
[0389]Esses resultados indicam que o anticorpo C5a de camundongo anticamundongo não é somente específico para C5a, comparado com C5 de camundongo de comprimento total, mas também que o anticorpo liga com alta afinidade a C5a de camundongo.
Exemplo 7. Uso do 5an195ME do C5a anticorpo de anticamundongo substituto em um modelo animal de RA
[0390]0 5an195ME do anticorpo C5a anticamundongo foi avaliado em um modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno. Camundongos DBA/1 LacJ machos (9 a 12 semanas de idade) foram imunizados por injeção intradérmica na base da cauda com 300 pg de colágeno tipo II de bovino emulsificados com volumes iguais de adjuvante de completo de Freund. O procedimento foi repetido duas semanas depois da primeira imunização. Camundongos foram inspecionados diariamente para identificar inflamação inicial em uma junta do joelho. Uma vez que a inflamação inicial foi identificada, camundongos foram intraporitoneamente administrados três vezes/semana com o 5an195ME do anticorpo C5a anticamundongo (40 mg/kg) ou um anticorpo controle (40mg/kg). A espessura da junta inicialmente inflamada (em mm) foi medida diriamente por dia 12.
[0391]Conforme mostrado na figura 3, 5an195ME reduziu a espessura da junta do joelho comparada com o anticorpo controle. 5an195ME pareceu fornecer o benefício de manter uma espessura da junta do joelho abaixo de 4,5 mm.
[0392]Além de avaliara capacidade de o anticorpo 5an195ME reduzir inchaço
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182/210 da junta do joelho inicialmente inflamado, a capacidade de o anticorpo 5an195ME antiC5a prevenir migração de inflamação para novas juntas foi também avaliada. O número de juntas recém recrutadas foi medido diriamente a partir do dia 1 ao dia 12. Os resultados do experimento são apresentados na tabela 6.
Tabela 6. Eficácia de 5an195ME em Modelo RA
Tratamento Número de Camundongos Número de juntas inflamadas no dia 1 Número de juntas recém inflamadas no dia 12 Número médio de juntas recém inflamadas por camundongo
Ab Controle 6 7 12 2
5an195ME 6 7 2 0,3
[0393]Conforme mostrado na tabela 6, camundongos tratados com 5an195ME tiveram notavelmente menos juntas recém inflamadas comparadas com animais tratados com Ab controle por dia 12. Camundongos tratados com 5an195ME também tiveram uma média notável de menos juntas recém-inflamadas.
[0394]A artrite nos camundongos foi também monitorada e definida usando um pontuação/índice clínico de artrite. Cada membro foi graduado diriamente de acordo com um sistema de pontuação estabelecido (0, junta normal; 1, eritema e inchaço visíveis brando/moderado; 2, eritema e inchaço severos afetando um pata ou junta completa; 3, pata ou junta deformada com anquilose)., com um pontuação máxima de vinte-quatro por animal. Vide, por exemplo, Wang et al. (2,000) J Immunol 164:4340-4347. Conforme mostrado na figura 4, camundongos tratados com o 5an195ME do anticorpo C5a anticamundongo exibiram um redução marcada em pontuação clínica (pontuação média menor que 1), comparada com camundongos tratados com o anticorpo controle (pontuação média acima de 6), no curso do estudo.
[0395]Resumidamente, esse resultados indicam que o C5a anti-camundongo substituto é efetivo no tratamento de RA-tanto em uma junta inicial quanto na migração de inflamação para juntas secundárias - no modelo de camundongo de doença. Os resultados também sugerem fortemente que um anticorpo C5a anti-humano
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183/210 terapêutico, tal como qualquer um dos anticorpos anti-C5a humanizados aqui descritos, é usado para tratar humanos com RA.
Exemplo 8. Uso de um anticorpo anti-C5a para tratar artrite reumatóide
[0396]Um paciente humano é identificado pelos versados na medicina com artrite reumatóide em uma única junta articulada. O paciente é logo a seguir administrado intra-articularmente ou intraporitoneamente com uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado aqui descrito em uma quantidade suficiente para reduzir sinalização de C5aR1 mediado porC5a localmente no espaço da junta. O paciente e versados na medicina observam uma melhoria substancial em pelo menos dois sintomas conhecidos de artrite reumatóide após o tratamento. O paciente recebe “doses de manutenção” administradas intravenosamente do anticorpo a cada mês para prevenir reocorrência dos sintomas, para prevenira progressão de RA na única junta, ou para prevenira migração de sintomas de RA para uma segunda junta.
Exemplo 9. Uso de um anticorpo anti-C5a para tratar sepse
[0397]Um paciente humano é identificado pelos versados na medicina com sepse. O paciente é logo a seguir administrado com uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado aqui descrito a uma dose de aproximadamente 600 a 900 mg por meio de infusão intravenosa. O paciente e versados na medicina observam uma melhoria substancial em pelo menos dois sintomas conhecidos de sepse durante o tratamento. O paciente recebe “doses de manutenção” administradas intravenosamente do anticorpo a cada duas semanas até que o paciente deixe o hospital.
Exemplo 10. Uso de um anticorpo anti-C5a para tratar distúrbios pulmonares inflamatórios associados ao complemento
[0398]Um paciente humano é identificado pelos versados na medicina com uma forma severa de COPD. Uma vez a cada duas semanas por quatro semanas o paciente é administrado com uma composição contendo um anticorpo anti-C5a humanizado a uma dose de aproximadamente 600 mg a 900 mg por infusão intravenosa.
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O paciente e versados na medicina observam um melhoria substancial em pelo menos dois sintomas conhecidos de COPD durante o tratamento inicial. Por exemplo, o paciente que recebe o anticorpo anti-C5a tem uma frequência e/ou gravidade reduzida de exacerbações relacionadas a COPD. O paciente continua a receber “doses de manutenção” administradas intravenosamente do anticorpo a cada duas semanas para manter a frequência e/ou gravidade reduzida de exacerbações relacionadas a COPD.
[0399]Um paciente humano é identificado pelos versados na medicina com uma forma severa de asma. Ao paciente é prescrito um anticorpo anti-C5a humanizado terapêutico a ser administrado por meio de um inalador. Durante o ataque seguinte de broncoespasmos, o paciente autoadministra o anticorpo anti-C5a em uma quantidade suficiente para reduzir a resposta inflamatória mediada por C5a nos pulmões do paciente. O paciente continua a usar o inalador como necessário para prevenir ou diminuir a gravidade de ataques de asma.
Exemplo 11. Anticorpos anti-C5a adicionais identificados a partir dos camundonqos imunizados
[0400]Diversos anticorpos adicionais foram obtidos dos camundongos imunizados (vide Exemplo 1) e adicionalmente identificados por ELISA as que pode ligar a C5a de humano. Os anticorpos adicionais incluem 15 conjuntos de CDR de cadeia leve exclusivos (apresentados na tabela 7) e 14 conjuntos de CDR de cadeia pesada exclusivos (apresentados na tabela 8).
Tabela 7. Sequências de Aminoácidos de Diversas Sequências de CDR de
Cadeia leve definida por Vl e Kabat Exclusivas de Anticorpo C5a Murino Anti-humano
Adicional
Ab SIN: Descrição Sequência de aminoácidos^
5an110 83 Sequência de Aminoácidos Vl DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNV GTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPFTFGSGTKLEIKR
84 CDR1 de Cadeia Leve KASQNVGTNVA
85 CDR2 de Cadeia SASYRYS
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Leve
86 CDR3 de Cadeia Leve QQYNSYPFT
5an177 87 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQ WSSNPLTFGAGTKLELKR
88 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
90 CDR3 de Cadeia Leve QQWSSNPLT
5anG12 91 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISY MHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQR SSYPWTFGGGTKLEIKR
92 CDR1 de Cadeia Leve SASSSISYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
93 CDR3 de Cadeia Leve HQRSSYPWT
5an052 94 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSS SYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISTVEAEDAASYFCH QWSSYPPTFGGGTKLEIKR
95 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSSSYLY
96 CDR2 de Cadeia Leve STSNLAS
97 CDR3 de Cadeia Leve HQWSSYPPT
5an107 98 Sequência de Aminoácidos Vl DIQMTQSPAPMLVSVGETVTITCRGSENIYS NLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPS RFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQ HFWGTPRTFGGGTKLEIKR
99 CDR1 de Cadeia Leve RGSENIYSNLA
100 CDR2 de Cadeia Leve AATNLAD
101 CDR3 de Cadeia Leve QHFWGTPRT
5anE11 102 Sequência de Aminoácidos Vl DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNV GTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPWTFGGGTKLEIKR
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84 CDR1 de Cadeia Leve KASQNVGTNVA
85 CDR2 de Cadeia Leve SASYRYS
103 CDR3 de Cadeia Leve QQYNSYPWT
5an054 104 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSASSSVS YMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPV R FSGSGSGTSYS LTIS R Μ EAE DAATYYCQQ WSSYPPTFGAGTKLELKR
105 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSYMY
106 CDR2 de Cadeia Leve DTSNLAS
107 CDR3 de Cadeia Leve QQWSSYPPT
5anG10 141 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISY MHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQR RSYPWTFGGGTKLEIKR
92 CDR1 de Cadeia Leve SASSSISYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
108 CDR3 de Cadeia Leve HQRRSYPWT
5an188 109 Sequência de Aminoácidos Vl DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATY YCQQNNEDPLTFGAGTKLELKR
20 CDR1 de Cadeia Leve RASESVDSYGNSFMH
110 CDR2 de Cadeia Leve LASNLES
111 CDR3 de Cadeia Leve QQNNEDPLT
5an185 112 Sequência de Aminoácidos Vl DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYY CQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
20 CDR1 de Cadeia Leve RASESVDSYGNSFMH
21 CDR2 de Cadeia Leve RASNLES
113 CDR3 de Cadeia Leve QQSNEDPLT
“SIN” na tabela refere-se a “SEQ ID NO”.
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187/210 •sequências de aminoácidos de CDR são definidas de acordo com Kabat et al. {supra).
Tabela 8. Sequências de Aminoácidos de Diversas Sequência de CDR de Cadeia Pesada Definidas oor Vh e Kabat Exclusivas do Anticorpo C5a de Murino AntimmanosAdicional
Ab SIN: Descrição Sequência de aminoácidos*
5an110 114 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT NYSQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
116 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTNYSQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an177 118 Sequência de Aminoácidos Vh EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGITFS SYYMAWVRQTPDKRLEWVATISSGGSYTY YPDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSE DTAMYYCTRYYEDDAMDYWGQGTSVTVS S
119 CDR1 de Cadeia Pesada SYYMA
120 CDR2 de cadeia pesada TISSGGSYTYYPDNVKG
121 CDR3 de Cadeia Pesada YYEDDAMDY
5an055 122 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT NYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de cadeia pesada DYYYMN
123 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTNYNQRFKG
117 CDR3 de cadeia pesada GPFAY
5an054 145 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFT DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPNTGGT TYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
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115 CDR1 de cadeia pesada DYYYMN
124 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPNTGGTTYNQRFKG
117 CDR3 de cadeia pesada GPFAY
5an107 125 Sequência de Aminoácidos Vh EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFS SYYMAWVRQTPDKRLEWVATISSGGSYTY YRDNVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSE DTAMYYCTRYFEDYPMDYWGQGTSVTVS S
119 CDR1 de Cadeia Pesada SYYMA
126 CDR2 de cadeia pesada TISSGGSYTYYRDNVKG
127 CDR3 de Cadeia Pesada YFEDYPMDY
5an111 128 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELGKPGASGKISCKASGYTFT DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPNTGGT SYNQRFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
129 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPNTGGTSYNQRFKD
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an183 130 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQPGSVLVRPGATVKLSCKASGFTFT SSWMHWAKQRPGQGLEWIGEIHTSGHTNY NEKFKGKATLTLDTSSSTAYVDISSLTSEDS AVYYCARGGLRRGYAMDYWGQGTSVTVS S
131 CDR1 de cadeia pesada SSWMH
132 CDR2 de Cadeia Pesada EIHTSGHTNYNEKFKG
133 CDR3 de Cadeia Pesada GGLRRGYAMDY
5an185 134 Sequência de Aminoácidos Vh EVQPQQSGPELVKPGSSVKISCKASGYTFT DYSMDWVKQSHGKSLEWIGAIHLNTGYTN YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSE DSAVYYCARGFYDGYSPMDYWGQGTSVT VSS
28 CDR1 de Cadeia DYSMD
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Pesada
46 CDR2 de cadeia pesada AIHLNTGYTNYNQKFKG
47 CDR3 de Cadeia Pesada GFYDGYSPMDY
5an188 135 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFT SYWMHWVKQRPGQGLEYIGEIHPSSGHTN YHEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSE DSAVYYCARAS LLRAI GAM DYWGQGTSVT VSS
136 CDR1 de Cadeia Pesada SYWMH
137 CDR2 de Cadeia Pesada EIHPSSGHTNYHEKFKS
138 CDR3 de Cadeia Pesada AS LLRAI OAMDY
“SIN” na tabela refere-se a “SEQ ID NO”.
•sequências de aminoácidos de CDR são definidas de acordo com Kabat et al. (supra).
[0401]Pareamento de Vl e Vh dando origem aos anticorpos 5an177ME, 5anO54ME, 5an110ME, 5an188ME, 5an185ME, e 5an107ME são evidentes na tabelas 7 e 8. Pareamento exemplar adicional de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve e/ou conjuntos de CDR é apresentado na tabela 9 a seguir.
Tabela 9. Sequências de aminoácidos para Conjuntos de CDR de anticorpos
C5a camundongo anti-humano adicionais
Ab SIN: Descricão Sequência de aminoácidos*
5an047 139 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVS SSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGV PARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYC QQYSGYPLTFGAGTKLELKR
140 CDR1 de Cadeia Leve RASSSVSSSYLH
96 CDR2 de Cadeia Leve STSNLAS
142 CDR3 de Cadeia Leve QQYSGYPLT
143 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia DYYYMN
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190/210
Pesada
144 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an181 139 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVS SSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGV PARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYC QQYSGYPLTFGAGTKLELKR
140 CDR1 de Cadeia Leve RASSSVSSSYLH
96 CDR2 de Cadeia Leve STSNLAS
142 CDR3 de Cadeia Leve QQYSGYPLT
122 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT NYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
123 CDR2 de cadeia pesada YIFPKTGGTNYNQRFKG
117 CDR3 de cadeia pesada GPFAY
5an109 146 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSY MYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQ WSSYPPTFGGGTKLEIKR
105 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSYMY
106 CDR2 de Cadeia Leve DTSNLAS
107 CDR3 de Cadeia Leve QQWSSYPPT
122 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT NYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
123 CDR2 de cadeia pesada YIFPKTGGTNYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5anG10 141 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISY MHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 193/217
191/210
FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQR RSYPWTFGGGTKLEIKR
92 CDR1 de Cadeia Leve SASSSISYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
108 CDR3 de Cadeia Leve HQRRSYPWT
147 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFN DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
144 CDR2 de cadeia pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an053 148 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPVIMSASPGEKVTMICSASSSISY MHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISIMEAEDAATYYCHQR SSYPWTFGGGTKLEIKR
92 CDR1 de Cadeia Leve SASSSISYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
93 CDR3 de Cadeia Leve HQRSSYPWT
149 Sequência de Aminoácidos Vh EVQMQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTF SDYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGG TNYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLT SEDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
123 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTNYNQRFKG
117 CDR3 de cadeia pesada GPFAY
5anG12 91 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISY MHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQR SSYPWTFGGGTKLEIKR
92 CDR1 de Cadeia Leve SASSSISYMH
89 CDR2 de Cadeia Leve DTSKLAS
93 CDR3 de Cadeia HQRSSYPWT
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 194/217
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Leve
147 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFN DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
144 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an052 94 Sequência de Aminoácidos Vl QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSS SYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISTVEAEDAASYFCH QWSSYPPTFGGGTKLEIKR
95 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSSSYLY
96 CDR2 de Cadeia Leve STSNLAS
97 CDR3 de Cadeia Leve HQWSSYPPT
147 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFN DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
144 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an111 102 Sequência de Aminoácidos Vl DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNV GTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPWTFGGGTKLEIKR
84 CDR1 de Cadeia Leve KASQNVGTNVA
85 CDR2 de Cadeia Leve SASYRYS
103 CDR3 de Cadeia Leve QQYNSYPWT
128 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELGKPGASGKISCKASGYTFT DYYYMNWVKQSHGKSLEWIGYIFPNTGGT SYNQRFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de cadeia pesada DYYYMN
Petição 870200044856, de 08/04/2020, pág. 195/217
193/210
129 CDR2 de Cadeia Pesada YIFPNTGGTSYNQRFKD
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an055 150 Sequência de Aminoácidos Vl EIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSS SYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCH QWSSYPPTFGGGTKLEIKR
95 CDR1 de Cadeia Leve SASSSVSSSYLY
96 CDR2 de Cadeia Leve STSNLAS
97 CDR3 de Cadeia Leve HQWSSYPPT
122 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT NYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
123 CDR2 de cadeia pesada YIFPKTGGTNYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5anE11 102 Sequência de Aminoácidos Vl DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNV GTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYNSYPWTFGGGTKLEIKR
84 CDR1 de Cadeia Leve KASQNVGTNVA
85 CDR2 de Cadeia Leve SASYRYS
103 CDR3 de Cadeia Leve QQYNSYPWT
143 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFS DYYYMNWVKKSHGKSLEWIGYIFPKTGGT HYNQRFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTS EDSAVYYCASGPFAYWGQGTLVTVSA
115 CDR1 de Cadeia Pesada DYYYMN
144 CDR2 de cadeia pesada YIFPKTGGTHYNQRFKG
117 CDR3 de Cadeia Pesada GPFAY
5an183 112 Sequência de Aminoácidos Vl DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDS YGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYY
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CQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
20 CDR1 de Cadeia Leve RASESVDSYGNSFMH
21 CDR2 de Cadeia Leve RASNLES
113 CDR3 de Cadeia Leve QQSNEDPLT
130 Sequência de Aminoácidos Vh EVQLQQPGSVLVRPGATVKLSCKASGFTFT SSWMHWAKQRPGQGLEWIGEIHTSGHTNY NEKFKGKATLTLDTSSSTAYVDISSLTSEDS AVYYCARGGLRRGYAMDYWGQGTSVTVS S
131 CDR1 de Cadeia Pesada SSWMH
132 CDR2 de Cadeia Pesada EIHTSGHTNYNEKFKG
133 CDR3 de Cadeia Pesada GGLRRGYAMDY
“SIN” na tabela refere-se a “SEQ ID NO”.
•sequências de aminoácidos de CDR são definidas de acordo com Kabat et al. {supra).
Exemplo 12. Anticorpos de C5a anti-humano humanizado adicionais
[0402]Diversas regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo anti-C5a adicionais humanizada foram geradas, todas as quais quando pareadas com uma região variável de cadeia leve comum (a cadeia leve com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:16) ligadas a C5a de humano com uma Kd menor que 1 nM conforme determinado por análise Biacore (vide anteriormente para metodologia). Todos esses anticorpos humanizados adicionais ligam especificamente a C5a de humano, mas não ligam a C5 C4a ou C3a de humano nativo completamente dobrado, conforme determinado por análise Octet (vide anteriormente para metodologia). Os anticorpos adicionais humanizados contiveram: (i) uma região 1 da estrutura da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:68) ou QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:69); (ii) uma região 2 da estrutura da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes
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195/210 sequências de aminoácidos: WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO:70) ou WVRQASGKGLEWVG (SEQ ID NO:71); (iii) uma região 3 da estrutura da região variável de cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos:
RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:72); RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:73); ou RVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO:74); e uma região 4 da estrutura da região variável de cadeia pesada contendo a seguinte sequência de aminoácidos: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:75).
Regiões variáveis de cadeia pesada humanizada adicionais exemplares compreendendo um ou mais dos conjuntos da estrutura humanizada adicionais descritos nesta seção são apresentados na figura 5.
Exemplo 13. Uso de um anticorpo C5a anti-humano em um modelo de neutropenia em camundongo
[0403]Um modelo murino de neutropenia C5a foi utilizado para avaliar a eficácia de um anticorpo C5a anti-humano livre in vivo. Para induzir neutropenia, purificado, C5a de humano nativo (hC5a) foi administrado por meio de injeção intravenosa na veia cauda em camundongos Balb/c. O número de neutrófilos circulantes foi avaliado até cinco minutos depois da administração de hC5a.
[0404]Administração de 300 pg/kg de hC5a foram consistentemente observados para induzir ativação de neutrófilo medido pelo ensaio de liberação de mieloporoxidase (MPO) (vide Exemplo 5 para uso com soro comparado com sobrenadante de cultura celular, supra) e redução de neutropenia (um no número de neutrófilos circulantes). Além do mais, níveis plasmáticos de hC5a e o BNJ383 do anticorpo anti-C5a de humano (quando administrados aos camundongos, infra) foram também medidos para estabelecera resposta farmacodinâmica (vide a seguir).
[0405]Contagens de sangue periférico de neutrófilo foram examinadas antes do desafio com hC5a ou controle veículo. Comparado a camundongos controle
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196/210 tratados com falso tratamento (1,37 ± 0,09 x106 /mL), contagens de neutrófilo em camundongos tratados com anticorpo C5a anti-humano livre (1,32 ± 0,13x106 pormL a 24 mg/kg; P > 0,05) ou controle de isotipo de mAb (1,31 ± 0,10 x106 por mL a 24 mg/kg; P>0,05) permaneceram os mesmos. Esses resultados indicaram que anticorpo sozinho não induz mudanças em contagens de neutrófilo circulante.
[0406]Para avaliar a eficácia de um anticorpo anti-C5a para inibir neutropenia induzida por hC5a em camundongos, diferentes dosagens (24 mg/kg, 12 mg/kg, 6 mg/kg, e 3 mg/kg) do BNJ383do anticorpo C5a anti-humano foram administradas a camundongos Balb/c 24 horas antes de injeção de hC5a. Administração do anticorpo anti-C5a 24 horas antes de hC5a permitiu que as propriedades farmacodinâmicas do anticorpo fossem estudadas durante o fase β de eliminação do anticorpo dos camundongos.
[0407]Conforme mostrado na figura 6, contagens de neutrófilo depois do tratamento são expressas como uma porcentagem de “linha de base” (onde a contagem no tempo 0 iguais 100 %). Em camundongos controle tratados com falso tratamento, as contagens de neutrófilo foram 79,02 ± 5,71 %, 67,42 ± 3,23 %, e 59,54 ± 2,11 % da linha de base a 1, 3 e 5 minutos após administração de hC5a, respectivamente. O camundongos tratados com anticorpo controleisotipo do isotipo demonstraram um redução significativa (P<0,01) na contagem do neutrófilo para 6,76 ± 0,81 % a 1 minuto, 6,68 ± 0,81 % a 3 minutos, e 8,29 ± 0,79 % a 5 minutos depois da injeção intravenosa de hC5a. O anticorpo anti-C5a exibiu um efeito dependente da dose em neutropenia induzida por hC5a. Em doses mais altas, 24 mg/kg, o anticorpo anti-C5a bloqueou completamente a neutropenia. Contagens de neutrófilo foram 70,35 ± 8,64 % a 1 minuto, 63,35 ± 6,08 % a 3 minutos, e 59,65 ± 6,51 % a 5 minutos, que foi comparável aos níveis de neutrófilo em animais controle tratados com falso tratamento nos mesmos pontos de tempo. As doses mais baixas de 12 mg /kg ou 6 mg/kg do anticorpo anti-C5a também inibiram significativamente depleção de neutrófilo (12 mg/kg: 42,61
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197/210 ± 5,12 % a 1 minuto, 45,33 ± 8,29 % a 3 minutos, e 41,02 ± 7,08 % a 5 minutos, P<0,01; 6 mg/kg: 18,00 ± 3,8 a 1 minuto, 26,20 ± 4,44 % a 3 minutos, e 28,03 ± 4,51 % a 5 minutos, P<0,05) após a administração de hC5a, comparado com o grupo anticorpo controle de isotipo (6,76 ± 0,81 % a 1 minuto, 6,68 ± 0,81 % a 3 minutos, e 8,29 ± 0,79 % a 5 minutos). O anticorpo controle de isotipo é um anticorpo que liga antígeno protetor de antrax 63 e contém uma IgG2 de humano/região Fc de isotipo 4. Administração de a dose mais baixa do anticorpo anti-C5a (3 mg/kg) não reduz significativamente neutropenia (6,28 ± 0,88 % a 1 minuto, 6,71 ± 2,14 % a 3 minutos, e 8,75 ± 2,98 % a 5 minutos, P>0,05). Vide Figura 6.
[0408]Anti-anticorpo C5a de humano inibe liberação in vivo de MPO inibida por hC5a
[0409]Conforme discutido anteriormente, C5a de humano ativa neutrófilos através de ligação reativa cruzada do receptor de C5a de camundongo. Liberação de mieloporoxidase (MPO) é uma consequência de ativação de neutrófilo através de ligação de C5a a C5aR. Vide Darren et al. (2004) Mol Pharm 65(4):868-879. Injeção intravenosa de C5a recombinante de humano no camundongo pode induzir neutropenia e ativar neutrófilos em circulação. A capacidade de um anticorpo C5a anti-humano livre de inibir liberação de MPO devido a ativação de neutrófilo in vivo foi avaliada usando o anticorpo anti-C5a para ligar hC5a livre e prevenir ligação a C5aR de murino.
[0410]Um experimento in vivo (no qual C5a de humano foi administrado a camundongos) foi realizado conforme descrito anteriormente. O nível de plasma MPO no tempo 0 foi 79,25 ± 22,88 ng/mL no grupo controle tratado com falso tratamento. Cinco minutos depois da injeção intravenosa de tampão veículo, níveis de MPO não mudaram significativamente (77,46 ± 21,31 ng/mL, P>0,05). Antes da injeção intravenosa de hC5a, níveis de MPO em animais controle tratado com anticorpo isotipo (75,17 ± 14,66 ng/mL) ou tratado com anticorpo anti-C5a (87,57 ± 14,86 ng/mL) foram comparáveis com os níveis observados nos animais controle tratados com falso
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198/210 tratamento. Depois da injeção intravenosa de hC5a, níveis de MPO tosas as doses de C5a aumentaram e permaneceram em níveis significativamente mais altos a 5 minutos (Figura 7).
[0411]Quando comparados aos animais tratados com anticorpo controle isotipo (221,00 ± 51,02 ng/mL), os animais tratados com anticorpo anti-hC5a mostraram redução de níveis de MPO dependente da dose (114,83 ± 23,26 ng/mL, P<0,05, em 24 mg/kg de coort; 104,80 ± 29,83 ng/mL, P<0,05, em 12 mg/kg de coort; e 126,90 ± 36,40 ng/mL, P=0,08, em 6 mg/kg de coort). Os níveis de MPO de dose baixa (3 mg/kg) animais tratados com anticorpo anti-C5a (176,55 ± 23,05 ng/mL) foram não significativamente diferentes dos animais tratados com anticorpo controle isotipo (P>0,05).
[0412]Um anticorpo anti-C5a reduz níveis de hC5a circulante em camundongos
[0413]Conforme notado anteriormente, C5a é um potente peptídeo inflamatório com diversas funções biológicas. Esses estudos anteriores demonstraram que C5a de humano reage cruzado com C5aR de murino em neutrófilos uma vez que injeção intravenosa de C5a recombinante de humano pode induzir neutropenia. Embora esta revelação não seja a título de limitação por qualquer teoria ou mecanismo de ação particular, o anticorpo anti-C5a pode ter inibição de neutropenia induzida por C5a de humano formando complexos com hC5a impedindo hC5a de ligar ao C5aR de murino expresso na superfície celular. Níveis de hC5a foram medidos no plasma de camundongos antes e 1, 3, e 5 minutos depois da administração intravenosa de hC5a para confirmar que os efeitos do anticorpo anti-hC5a in vivo foram devido a sua inibição de hC5a dependente da ligação.
[0414]Um experimento foi realizado conforme descrito anteriormente usando o modelo de neutropenia induzido porhC5a de camundongo. hC5a foi não detectado no plasma em qualquer grupo de camundongos antes de administração de hC5a no
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199/210 tempo 0, usando um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). O nível de hC5a no plasma, entretanto, aumentou para um pico a 1 minuto (7783,50 ± 327,73 ng/mL), então reduzidos to 4788.38 ± 260,51 ng/mL a 3 minutos, e então a 3.855,75 ± 298,99 ng/mL a 5 minutos depois da injeção intravenosa de hC5a (em camundongo tratado com mAb controle de isotipo). Comparado aos camundongos tratados com anticorpo controle, o nível de hC5a em camundongos tratados com 24 mg/kg do anticorpo anti-C5a exibiu um declínio 43, 30, e 23 vezes a 1 minuto (178,4 ± 14,14 ng/mL), 3 minutos (158,4 ± 10,43 ng/mL), e 5 minutos (167,2 ±15,61 ng/mL), respectivamente. O nível de hC5a no plasma dos 12 mg/kg e 6 mg/kg de coortes foram 235,00 ± 22,33 e 609,20 ± 78,75 ng/mL a 1 minuto, 210,80 ± 19,59 e 527,60 ± 52,25 ng/mL a 3 minutos, 192,20 ± 7,40 e 505,00 ± 45,96 ng/mL a 5 minutos, respectivamente. O camundongos tratados com anti-C5a exibiram níveis de hC5a significativamente menores de uma maneira dependente da dose durante neutropenia após a injeção intravenosa de hC5a (P <0,001). Embora os camundongos que recebera a dose mais baixa de anticorpo anti-C5a (3 mg/kg) não tenham sido dispensados da neutropenia induzida por hC5a, os camundongos no entanto tiveram uma redução significativa no hC5a plasmático (3.130,40 ± 433,58 ng/mL a 1 minuto; 1.932,00 ± 268,92 ng/mL a 3 minutos; 1.593,00 ± 169,68 ng/mL a 5 minutos) comparado com níveis plasmáticos de hC5a observados em camundongos tratados com anticorpo controle do isotipo (P <0,05). Vide Figura 8. Esses dados indicaram que administração de anticorpo anti-C5a a camundongos diminuiu significativamente a concentração de hC5a livre em plasma, resultando em neutropenia induzida por hC5a bastante melhorada.
[0415]Considerados juntos, esses resultados apresentados nesta seção indicaram que um anticorpo C5a anti-humano aqui descrito pode inibir o efeito biológico de C5a de humano em um quadro de doença in vivo e fornecer forte evidência de que os anticorpos (e seus fragmentos de ligação de antígeno) são usados, entre outras coisas, no tratamento ou prevenção de distúrbios associados ao complemento tais
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200/210 como qualquer daqueles relatados aqui.
Exemplo 14. Anti-anticorpo C5a de humano reage cruzado com C5a de primatas não humanos
[0416]Diversos anticorpos anti-hC5a humanizados foram testados para sua capacidade de reagir cruzado com C5a de uma ou mais espécies de mamífero não humano. Conforme notado anteriormente, os benefícios de um anticorpo anti-C5a como esse são inúmeros, por exemplo, a capacidade de uma pesquisa ou versados na medicina de modelar a eficácia de um anticorpo anti-C5a terapêutico em uma doença de modelo não humano antes de administrar o anticorpo a humanos. Testes em mamíferos não humanos podem também permitira determinação ou aproximação da dosagem apropriada de um anticorpo anti-C5a exigido para eficácia em humanos.
[0417]Resumidamente, BNJ369, BNJ366, BNJ364, e BNJ383 (descritos anteriormente) foram avaliados para determinar se eles poderíam coimunoprecipitar proteína C5a no soro ativado de diversos primatas não humanos incluindo babuíno, macaco reso, e macaco cinomolgo. O soro foi ativado por adição de zimosano. Após uma noite inteira de incubação de cada anticorpo com soro ativado, os anticorpos foram separados da fase de solução usando microesferas de agarose conjugadas com proteína A. As microesferas foram lavadas completamente e então fervidas em tampão de amostra de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) contendo β-mercaptoetanol. As amostras fervidas foram então submetidas a SDS-PAGE. C5a de primata não humano foi detectado por western blot usando o #2942 anticorpo de neopítopo de anti-C5a comercialmente disponível (Abeam, Cambridge, MA). Cada qual dos anticorpos testado foi capaz de imunoprecipitar C5a (ou C5a desarg) de babuíno, macaco reso, e macaco cinomolgo indicando que o anticorpo é reativo cruzado com C5a dessa espécie bem como com C5a de humano.
[0418]A determinação dos parâmetros de afinidade de ligação a C5a de macaco cinomolgo foi determinada conforme descrito anteriormente. Resumidamente, o

Claims (26)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a um polipeptídeo C5a livre, CARACTERIZADO pelo fato de que o C5a livre é um polipeptídeo de humano (hC5a) com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, e em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao polipeptídeo hC5a livre in vitro com uma KD que é menor que 1,25 x 10-9 M na presença de um excesso molar de C5 de humano nativo não clivado.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de C5 de humano nativo não clivado é entre 2 vezes e 20 vezes maior que a concentração de hC5a livre.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao C5a livre de uma espécie de mamífero não humano.
4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a espécie de mamífero não humano é um primata não humano.
5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o primata não humano é um macaco cinomolgo, macaco reso, ou babuíno.
6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao hC5a livre com uma afinidade não superior a 100 vezes sua afinidade correspondente para C5a livre da espécie de mamífero não humano.
7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:
(a) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo:
(i) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; ou (ii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:38; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; e (b) um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo:
2/14 (i) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:29; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:30; ou (ii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47.
8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende:
(a) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27;
(b) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:36 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33;
(c) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:19 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27;
(d) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:25;
(e) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:27;
(f) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:40 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33;
(g) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:33;
(h) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:19 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45;
(i) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a se
3/14 quência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:44;
(j) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:17 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49;
(k) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:37 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45; ou (l) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:36 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49.
9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste compreende:
(i) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45;
(ii) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:40 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:49; ou (iii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47.
10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao hC5a com uma KD que é menor que 8,0 x 10-11 M.
11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo inibe em pelo menos 90 % a ativação de neutrófilo de humano dependente de C5a de humano a uma razão molar de 1:1 - sítio de ligação ao antígeno: C5a.
12. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe a interação entre C5a e um receptor de C5a.
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13. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo completamente humano, um anticorpo recombinante, um anticorpo biespecífico, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, um intracorpo, um anticorpo quimerizado ou quimérico, um anticorpo de humano desimunizado, um fragmento Fv, um fragmento Fd, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, e um fragmento F(abj2.
14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a um polipeptídeo C5a livre, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo C5a livre é um polipeptídeo de humano (hC5a) com a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao polipeptídeo C5a de humano com uma KD que é menor que 1,25 x 10-9 M, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao polipeptídeo hC5a livre com uma afinidade que é pelo menos 100 vezes maior que sua afinidade correspondente para C5 de humano não clivado.
15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) se liga a um polipeptídeo C5a livre de humano e (b) se liga a um polipeptídeo C5a livre de espécie não humana, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao polipeptídeo hC5a livre com uma KD que é menor que 1,25 x 10'9 M.
16. Anticorpo isolado compreendendo dois sítios de ligação ao antígeno, CARACTERIZADO pelo fato de que cada sítio de ligação ao antígeno pode independentemente se ligar ao C5a de humano livre (hC5a) ou C5 de humano não clivado (hC5), e em que, em uma solução aquosa compreendendo: (i) uma pluralidade dos ditos anticorpos e (ii) um excesso molar de hC5 comparado com a quantidade molar dos sítios de ligação ao antígeno, em equilíbrio e em condições fisiológicas:
(a) pelo menos 95 % da dita pluralidade de anticorpos se ligam a não mais que uma molécula de hC5;
(b) pelo menos 95 % da dita pluralidade de anticorpos retêm pelo menos um sítio de ligação ao antígeno disponível para se ligar ao hC5a livre; ou (c) os dois sítios de ligação de antígeno de não mais que 5 % da dita pluralidade de anticorpos são completamente ocupados por moléculas de hC5.
17. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que cada sítio de ligação ao antígeno pode se ligar independentemente ao hC5a livre com um afinidade subnanomolar.
18. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo isolado compreende:
5/14 (A) (i) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; (ii) um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e (iii) um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; (iv) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; (v) um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e (vi) um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47; ou (B) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:42 e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:45.
19. Anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, CARACTERIZADO pelo fato de que bloqueia de forma cruzada a ligação do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ao hC5a.
20. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
21. Ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO por ser para uso no tratamento de um humano afetado por um distúrbio de complemento associado ao C5a.
23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que:
(i) pelo menos 1 mg do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste por kg de peso corpóreo do humano deve ser administrado ao humano para assim ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis nanogramétricos de C5a livre por pelo menos 12 dias, ou (ii) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deve ser administrado ao humano em uma quantidade suficiente para (a) obter valores molares de Cmax substancialmente mais baixos do que a concentração fisiológica molar de hC5 não clivado e (b) ligar e sequestrar parcial ou completamente níveis patofisiológicos de C5a livre.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio de complemento associado
6/14 ao C5a é selecionado do grupo consistindo em síndrome urêmica hemolítica atípica, degeneração macular relacionada à idade, queimadura grave, artrite reumatóide, sepse, nefrite lúpica, um distúrbio pulmonar associado ao complemento, e síndrome antifosfolipídica.
25. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga ao C5a de camundongo, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende:
(A) (i) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:54; (ii) um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:55; e (iii) um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:56; (iv) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:62; (v) um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:63; e (vi) um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:64; ou (B) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:59; e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:66.
26. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno deste, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
(A) um polipeptídeo de cadeia leve compreendendo:
(i) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:140; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142;
(ii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:156; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:157; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:158;
(iii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:164; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:165; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:166;
(iv) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:172; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de ami
7/14 noácidos representada na SEQ ID NO:173; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:174;
(v) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:86;
(vi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:93;
(vii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:88; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:90;
(viii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97;
(ix) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:99; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:100; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:101;
(x) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:103;
(xi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:105; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:106; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:107;
(xii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:108;
(xiii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:110; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a
8/14 sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:111; ou (xiv) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113; e um polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo:
(i) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(ii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:67; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:30;
(iii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:160; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:161; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:162;
(iv) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:168; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:169; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:170;
(v) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:176; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:177; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:178;
(vi) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:116; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(vii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:120; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:121;
(viii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e um CDR3 de cadeia pesada compreen
9/14 dendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(ix) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:124; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(x) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:126; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:127;
(xi) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:129; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:131; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:132; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:133;
(xiii) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47; ou (xiv) um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:136; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:137; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:138;
(B) um conjunto pareado de sequências CDR de cadeia leve e sequências CDR de cadeia pesada tal como emparelhadas na tabela 3 ou tabela 9; ou (C) (i) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:140; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
10/14 (ii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; e um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:22; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:67; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:30;
(iii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:156; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:157; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:158; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:160; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:161; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:162;
(iv) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:164; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:165; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:166; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:168; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:169; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:170;
(v) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:172; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:173; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:174; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:176; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:177; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:178;
(vi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:88; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:90; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; um CDR2 de
11/14 cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:120; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:121;
(vii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:105; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:106; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:107; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:124; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(viii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:86; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:116; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(ix) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:110; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:111; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:136; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:137; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:138;
(x) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:28; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:46; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:47;
(xi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:99; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de ami
12/14 noácidos representada na SEQ ID NQ:100; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:101; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:119; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:126; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:127;
(xii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xiii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:140; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:142; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xiv) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:105; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:106; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:107; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xv) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:108; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos repre-
13/14 sentada na SEQ ID NO:117;
(xvi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:93; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xvii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:92; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:89; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:93; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xviii) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:103; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:129; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xix) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:95; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:97; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:123; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117;
(xx) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:84; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:85; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:103; um CDR1 de cadeia pesada
14/14 compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:115; um CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:144; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:117; ou
5 (xxi) um CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NQ:20; um CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21; um CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:113; um CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:131; um CDR2 10 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:132; e um CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:133.
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