BR102018011843A2 - Método para produção de produtos químicos finos com o uso de um corynebacterium que secreta a-1,6-glicosidases modificadas - Google Patents

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Abstract

método para produção de produtos químicos finos com o uso de um corynebacterium que secreta ?-1,6-glicosidases modificadas. a presente invenção se refere a polinucleotídeos que codificam novos polipeptídeos de fusão compostos essencialmente por um peptídeo sinal para translocação membranar e um polipeptídeo que fornece atividade de a-1,6-glicosidase e a bactérias contendo os ditos polinucleotídeos. a invenção se refere adicionalmente a métodos para produzir produtos químicos finos com o uso de meios contendo isomaltose e/ou panose como fonte de carbono.

Description

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS QUÍMICOS FINOS COM O USO
DE UM CORYNEBACTERIUM QUE SECRETA A-1,6-GLICOSIDASES MODIFICADAS” [0001] A presente invenção se refere a polinucleotídeos que codificam novos polipeptídeos de fusão compostos essencialmente por um peptídeo sinal para translocação membranar e um polipeptídeo que fornece atividade de α-1,6glicosidase e a bactérias contendo os ditos polinucleotídeos. A invenção se refere adicionalmente a métodos para produzir produtos químicos finos com o uso de meios contendo isomaltose e/ou panose como fonte de carbono.
[0002] Cepas do gênero Corynebacterium, em particular, a espécie Corynebacterium glutamicum, são produtores conhecidos de L-aminoácidos, como aminoácidos proteinogênicos, por exemplo, L-lisina, L-treonina, Lvalina ou L-isoleucina, e de outros produtos químicos finos, como vitaminas, nucleosídeos e nucleotídeos. Devido à grande importância econômica desses produtos químicos, tem-se trabalhado continuamente para melhorar os métodos de produção. Os melhoramentos podem dizer respeito à constituição genética do microrganismo, à tecnologia de fermentação aplicada ou à finalização até a forma de produto desejada. Os métodos usados para melhorar a constituição genética são aqueles dentre mutagênese, seleção e escolha de mutantes. Os métodos de tecnologia de DNA recombinante também foram usados por diversos anos para melhoramento de cepas desse grupo de bactérias. Resumos de antecedentes referentes ao Corynebacterium, em particular,
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Corynebacterium glutamicum, podem ser encontrados em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005), A. Burkovski (Corynebacteria Genomics and Molecular Biology, Caister Academic Press, 2008) ou H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnology, Springer Verlag, 2013) .
[0003] Uma das principais fontes de carbono usadas para propagação desse grupo de bactérias e para formação de um produto químico desejado é a glicose. A glicose usada na indústria de fermentação é tipicamente produzida a partir de amido por hidrólise enzimática. O amido é uma mistura de dois polissacarídeos diferentes, sendo que cada um consiste em cadeias de unidades de glicose repetidas ligadas. A mistura consiste principalmente em dois polissacarídeos separados, amilose e amilopectina. A amilose é um polissacarídeo quase linear com unidades de glicose conectadas quase exclusivamente pelas ligações glicosídicas α-1,4. As unidades de glicose em amilopectina são adicionalmente ligadas através de ligações glicosídicas α1,6. O teor de amilose em amido em espécies de plantas como maís, trigo ou arroz é de cerca de 20 a 30 % e o teor de amilopectina é de cerca de 80 a 70 %. Informações detalhadas sobre amido podem ser encontradas em J. Bemiller e R. Whistler (Starch: Chemistry and Technology, 3. ed., Elsevier, 2009).
[0004] A hidrólise enzimática de amido em glicose envolve duas etapas principais. Na primeira etapa, também denominada liquefação, o amido é tratado com α-amilase (4α-D-glucano glucano-hidrolase; EC 3.2.1.1). Os produtos dessa reação são oligômeros ligados em α-1,4 de glicose,
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3/116 também denominados maltodextrina, que compreendem moléculas como maltotriose (O-a-D-Glcp-(1^4)-O-a-D-Glcp-(1^4)-D-Glcp) e malto-hexaose (o hexâmero de D-glicose ligado em a-(1^4) respectivo), e oligômeros de glicose contendo uma ligação α-1,6 também denominados dextrina-limite. Na segunda etapa, também denominada sacarificação, essa mistura é tratada com glicoamilase, também denominada amiloglicosidase na técnica (4-a-D-glucano glico-hidrolase; EC 3.2.1.3). Essa enzima hidrolisa a ligação a-1,4 rapidamente. Também hidrolisa a ligação α-1,6, porém a uma taxa mais lenta. A técnica também descreve o uso de pululanase (pululano 6-a-glucanohidrolase) a fim de hidrolisar a ligação α-1,6 contida nas dextrinas-limite. O produto dessa segunda etapa é uma solução de glicose contendo, entre outros, maltose residual (4-O-(a-D-Glicopiranosil)-D-Glicopiranose), isomaltose (6O-(α-D-Glicopiranosil)-D-Glicopiranose) e panose (O-a-DGlcp-(1^6)-O-a-D-Glcp-(1^4)-D-Glcp) como subprodutos. Esses subprodutos são o resultado de reações enzimáticas inversas devido à alta concentração de glicose que se acumula durante a etapa de sacarificação. A reação inversa de glicoamilase produz maltose e isomaltose. Já que preparações enzimáticas comerciais podem conter transglicosidase (1,4-a-glucano 6-a-glicosiltransferase; EC 2.4.1.24) a presença dessa enzima também contribui para a formação de isomaltose e panose. Muitas variações desse procedimento básico existem devido às enzimas disponíveis, misturas das mesmas e condições de reação.
[0005] Resumos referentes à hidrólise enzimática de amido em glicose e aos subprodutos formados podem ser encontrados em P. H. Blanchard (Technology of Corn Wet
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Milling and Associated Processes, Elsevier, 1992), M.W. Kearsley e S.Z. Dziedzic: Handbook of Starch Hydrolysis Products and their Derivatives, Chapmann & Hall, 1995), B. H. Lee (Fundamentals of Food Biotechnology, VCH Publishers, 1996) ou H. Uhlig (Industrial Enzymes and their Application, John Wiley & Sons 1998) .
[0006] Os dados referentes à composição de hidrolisados de amido fabricados desse modo podem ser encontrados nos documentos A. Converti (starch/stârke 46 (7), 260-265, 1994), M. Chaplin e C. Bucke (Enzyme Technolgy, Cambridge University Press, 1990), Amarakone, P. et al (Journal of the Japanese Society of Starch Science, 31(1), 1-7, 1984), WO9927124 A1 e WO2005100583 A2. O teor de glicose de tais hidrolisados de amido é de aproximadamente 85 a 97 % (com base em um teor de matéria seca).
[0007] Para produção fermentativa industrial de produtos químicos finos tipo commodity, como L-aminoácidos, por exemplo, L-lisina, não é econômico purificar primeiramente a glicose proveniente de hidrolisado de amido e, então, usá-la no processo de fermentação. Em vez disso, o próprio hidrolisado de amido é usado como uma matéria-prima contendo glicose de baixo custo.
[0008] Corynebacterium glutamicum é incapaz de usar isomaltose ou panose como uma fonte de carbono. Consequentemente, esses compostos se acumulam no caldo de fermentação durante um processo de produção quando o dito hidrolisado de amido é usado como matéria-prima. A presença desses açúcares, por sua vez, é desfavorável já que são uma carga adicional para a água servida de plantas. Além disso, podem gerar perdas de produto durante as etapas de
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5/116 processamento para fabricar o produto final. Por exemplo, sabe-se que a extremidade redutora de uma molécula de açúcar pode reagir com o grupo amino de L-aminoácidos, por exemplo, L-lisina, para produzir produtos de reação de Maillard (M.W. Kearsley e S.Z. Dziedzic: Handbook of Starch Hydrolysis Products and their Derivatives, Chapmann & Hall, 1995) .
[0009]
A fim de evitar essas desvantagens, foram desenvolvidos métodos para converter isomaltose e/ou panose em glicose durante um processo de fermentação.
Os documentos WO2005100583 A2, WO2014093312 A1 e WO2015061289
A1 descrevem a adição de transglicosidase ao caldo de fermentação contendo hidrolisado de amido ou xarope de açúcar como fonte de carbono. Essa abordagem tem a desvantagem de que a enzima deve ser produzida separadamente, aumentando, desse modo, os custos de produção.
[0010] Uma abordagem diferente foi adotada no documento EP2241632 A1. Sugere-se conferir a um microrganismo uma atividade de isomaltase. Como microrganismos, são apresentadas Enterobacteriaceae, incluindo E.coli e bactérias corineformes, incluindo exemplos específicos desse grupo de bactérias. O documento EP2241632 A1 ensina ainda que uma isomaltase intracelular ou uma isomaltase extracelular pode ser usada. Caso uma isomaltase intracelular seja conferida e a célula não possui uma atividade para absorver a isomaltose, é preferencial conferir tanto a atividade de isomaltase intracelular quando a atividade para absorver isomaltose na célula. Como exemplos para um gene de isomaltase, os genes malL e glvA
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6/116 de Bacillus subtilis e homólogos desses são mostrados. Como genes de transportador de isomaltose, o gene glvC de Bacillus subtilis e outros genes que desempenham uma função similar de várias origens são mostrados. Durante os procedimentos de examinação, um exemplo experimental foi apresentado, em que os genes glvA e glvC de Bacillus subtilis foram expressos em uma cepa excretora de L-lisina de C. glutamicum. A cepa construída mostrou consumo favorável de isomaltose e formação de L-lisina em comparação à referência. No entanto, o documento EP2241632 A1 não menciona se esse sistema permitirá que uma célula de C. glutamicum consuma panose.
[0011] O documento EP2241632 A1 ainda propõe, em geral, que um gene extracelular de isomaltase possa ser obtido ligando a região de codificação do gene de isomaltase a uma sequência que codifica um peptídeo sinal para secretar a proteína em uma camada de superfície de célula ou para fora da célula. Como peptídeo sinal, a proteína A de Staphylococcus aureus é sugerida. Um exemplo técnico é dado para E. coli fundindo o dito peptídeo sinal da proteína A à MalL isomaltase de Bacillus subtilis. O documento não esclarece se essa isomaltase secretada também ataca panose. Ademais, o documento não menciona peptídeos sinais adequados para Corynebacterium glutamicum ou como eleger um peptídeo sinal adequado que corresponda à isomaltase.
[0012] O documento EP2241632 A1 também apresenta duas listas de genes putativos de isomaltase de vários microrganismos. A Tabela 1 do documento EP2241632 A1 apresenta isomaltases potenciais como homólogos de MalL que têm a função, entre outros, de G-amilase multifuncional
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7/116 produtora de oligossacarídeo, oligo-1,6-glicosidase, região catalítica de alfa-amilase ou trealose-6-fosfato hidrolase. A Tabela 2 apresenta genes de isomaltase potenciais como homólogos que têm a função de maltose-6'-fosfato glicosidase ou 6-fosfo-alfa glicosidase.
[0013] Similarmente, S. Jiang e L. Ma revelaram a sequência de nucleotídeos de um gene de oligo-1,6glicosidase de Bacillus subtilis, cepa HB002 (disponível no Centro Nacional para Informações sobre Biotecnologia (NCBI) sob número de acesso de GenBank AY008307.1). O registro não menciona a atividade da proteína codificada em relação à isomaltose e panose.
[0014] A técnica ensina sobre várias a-1,6-glicosidases intracelulares (EC 3.2.1.10) que têm a habilidade de atacar a ligação α-1,6 de isomaltose e/ou panose.
[0015] A sequência de nucleotídeos do gene IMA1 de Saccharomyces cerevisiae, cepa S288c, que codifica uma oligo-1,6-glicosidase está disponível no NCBI sob número de acesso de GenBank NC_001139 que tem o locus_tag YGR287C. O registro revela a proteína codificada como uma isomaltase. O registro não menciona sua atividade em relação à panose.
[0016] O gene dexB de Streptococcus mutans codifica uma glucano 1,6-alfa-glicosidase intracelular (Whiting et al, Journal of General Microbiology 139, 2019-2026, 1993) que tem a habilidade de hidrolisar a ligação α-1,6 em isomaltose e panose.
[0017] O documento WO2004018645 A2 se refere ao sequenciamento do genoma de Bifidobacterium breve ATCC 15700 e, em particular, à identificação de genes que codificam enzimas que têm a habilidade de hidrolisar a
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8/116 ligação α-1,6 em isomaltose e panose.
[0018] Pokusaeva et al (Applied and Environmental Microbiology 75, 1135-1143, 2009) descrevem dois genes agll e agl2 de Bifidobacterium breve UCC2003 que codificam as enzimas Agl1 e Agl2, sendo que ambas têm a atividade de α1,6-glicosidases. As enzimas foram capazes de hidrolisar a ligação α-1,6 em panose e isomaltose. Pokusaeva et al. Não fizeram nenhuma declaração explícita a respeito da localização intra- ou extracelular das duas enzimas. No entanto, em um artigo de revisão por Pokusaeva et al. (Genes and Nutrition 6, 285-306, 2011), as duas enzimas Agl1 e Agl2 são classificadas como enzimas citoplasmáticas” (consultar página 299-300).
[0019] Em C. glutamicum, existem duas vias para a secreção de proteínas. Uma é denominada via de Sec e media a translocação de pré-proteínas em um estado desdobrado através da membrana. A outra é denominada via de Tat e media a transferência de pré-proteínas em seu estado dobrado. O peptídeo sinal da pré-proteína é clivado a partir da pré-proteína por uma peptidase durante o processo de secreção e a proteína madura é liberada no meio de cultura. Resumos referentes à secreção de proteína em Corynebacterium glutamicum foram apresentados por A. A. Vertes contidos em H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013) e Liu et al (Critical Reviews in Biotechnology 1-11, 2016).
[0020] Há diversos relatos de secreção bem-sucedida de diferentes proteínas de diferentes espécies ou origens em C. glutamicum. No entanto, a maioria dessas proteínas é secretada por seus hospedeiros naturais, indicando que
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9/116 essas proteínas têm uma habilidade intrínseca de ser secretável.
[0021] Liebl et al. (Journal of Bacteriology 174, 18541861, 1992) relatou a expressão e a secreção bem-sucedidas de uma nuclease estafilocócica, uma enzima extracelular de Staphylococcus aureus em C. glutamicum com o uso do peptídeo sinal do hospedeiro original.
[0022] Billman-Jacobe et al. (Applied and Environmental Microbiology 61, 1610-1613, 1995) relataram a expressão e a secreção da protease básica de Dichelobacter nodosus e a subtilisina de Bacillus subtilis em C. glutamicum. Embora a secreção de subtilisina tenha sido direcionada por seu próprio peptídeo sinal, o peptídeo sinal natural da protease básica não facilitou a secreção. Após a substituição da sequência sinal natural pela sequência sinal de subtilisina, a protease básica foi secretada por C. glutamicum.
[0023] Salim et al. (Applied and Environmental Microbiology 63, 4392-4400, 1997) relataram a expressão e a secreção da proteína de antígeno 85 de Mycobacterium tuberculosis em C. glutamicum. Essa proteína é naturalmente encontrada nos filtrados de cultura de M. tuberculosis.
[0024] O documento EP1375664 A1 se refere à produção e à secreção de proteínas heterólogas, como a prótransglutaminase de Streptoverticillium mobarense ou o fator de crescimento epidérmico humano (hEGF) em Corynebacterium glutamicum fundindo as ditas proteínas com sequências de peptídeo sinal de proteínas de superfície celular de C. glutamicum ou C. ammoniagenes. A prótransglutaminase de Streptoverticillum mobarense é uma
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10/116 enzima que é secretada por seu hospedeiro natural (Pasternack et al; European Journal of Biochemistry 257, 570-576, 1998). O fator de crescimento epidérmico humano é um peptídeo secretado originalmente encontrado na urina humana por Cohen, S. e Carpenter, G. (Proceedings of National Academy of Sciences EUA 72(4), 1317-1321, 1975) .
[0025] O documento EP1748077 A1 se refere à produção e à secreção de proteínas heterólogas em bactérias corineformes que usam uma região de peptídeo sinal dependente de sistema Tat. Em particular, a isomalto-dextranase de Arthrobacter globiformis (uma 6-a-D-glucano isomalto-hidrolase) foi secretada por C. glutamicum com o uso da sequência sinal da isomalto-dextranase ou da sequência sinal da camada de superfície de célula proteína SlpA de C. ammoniagenes. A proteína glutaminase de Chryseobacterium proteolyticum foi secretada por C. glutamicum com o uso da sequência sinal de isomaltodextranase de A. globiformis, da sequência sinal SlpA de C. ammoniagenes ou da sequência sinal TorA de Escherichia coli. A isomalto-dextranase de Arthrobacter globiformis é uma enzima que é secretada por seu hospedeiro natural (Iwai et al; Journal of Bacteriology 176, 77307734, 1994). A proteína glutaminase de Chryseobacterium proteolyticum também é uma enzima que é secretada no meio de cultura por seu hospedeiro natural (Kikuchi et al; Applied Microbiology and Biotechnology 78, 67-74, 2008).
[0026] Watanabe et al. (Microbiology 155, 741-750, 2009) identificaram o N-terminal do produto de gene CgR0949 e outros produtos de gene de C. glutamicum R como peptídeos sinais direcionados para a via secretora de Tat para proteínas. As sequências sinais CgR0949 compreendem uma
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11/116 sequência de 30 resíduos de aminoácido. Após a adição dessa sequência sinal de aminoácidos à α-amilase de Geobacillus stearothermophilus da qual o peptídeo sinal natural foi removido, a enzima foi secretada pelo hospedeiro C. glutamicum no meio de cultura. A α-amilase de Geobacillus stearothermophilus é uma enzima que é secretada por seu hospedeiro natural (Fincan e Enez, Amido 66, 182-189, 2014) .
[0027] Breitinger, K. J. (Dissertação/Tese de Ph.D. Da Ulm University 2013) revelou a expressão de um polipeptídeo de fusão composto pela sequência sinal putativa da proteína codificada pelo gene cg0955 de C. glutamicum ATCC 13032 e a pululanase PulA de Klebsiella pneumoniae UNF5023 em uma cepa produtora de L-lisina de C. glutamicum. A atividade de pululanase foi detectada no lisado celular e na fração membranar das ditas células de C. glutamicum, porém não no sobrenadante de cultura da dita cepa. A pululanase PulA de Klebsiella pneumoniae UNF5023 é uma enzima que é secretada por seu hospedeiro natural (Kornacker e Pugsley, Molecular Microbiology 4, 73-85, 1990). Breitinger, K. J. declarou adicionalmente que o 5'-terminal do gene Cg0955 de C. glutamicum ATCC 13032 mostra uma homologia de 95 % à sequência sinal do gene cgR0949 de C. glutamicum R. A sequência sinal da proteína codificada pelo gene cgR0949 foi classificada como uma sequência sinal do tipo Tat por Watanabe et al. (Microbiology 155, 741-750, 2009).
[0028] Hyeon et al (Enzyme and Microbial Technology 48, 371-377, 2011) construíram pMT1s de vetor projetados para secreção de produtos de gene no meio de cultura com o uso da sequência de nucleotídeos cg0955 que codifica o peptídeo
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12/116 sinal de Tat. Então, foram capazes de alcançar a secreção da proteína de arcabouço de CbpA de Cellulomonas celluvorans e da endoglucanase CelE de Clostridium thermocellum em C. glutamicum para formar minicelulossomas. Essas proteínas são secretadas e mostradas na superfície celular em seus hospedeiros naturais.
[0029] Kim et al (Enzyme and Microbial Technology 66, 67-73, 2014) expressaram e secretaram de modo similar a endoglucanase CelE e a β-glicosidase BglA de C. thermocellum em C. glutamicum para mostrá-las na superfície celular. Em seu hospedeiro natural, essas enzimas são constituintes de celulossomas localizados na superfície celular de seu hospedeiro.
[0030] Matano et al (BMC Microbiology 16, 177, 2016) estudaram a expressão e a secreção de Nacetilglicosaminidase de diferentes microrganismos. Um gene denominado nagA2 foi identificado no cromossoma de C. glutamicum. Após sua expressão, atividade enzimática foi detectada na fração citoplasmática e no sobrenadante de cultura. Após a substituição do peptídeo sinal putativo de NagA2 com diferentes sequências sinais do tipo Tat, incluindo SP0955 (outro termo para o peptídeo sinal codificado por cg0955), a eficiência de secreção foi melhorada.
[0031] Matano et al. alcançaram adicionalmente a secreção da hexoquitinase ChiB de Serratia marcescens fundindo a sequência que codifica o peptídeo sinal de secreção de Tat do gene cg0955 de C. glutamicum a chiB. Observou-se que a hexoquitinase ChiB de Serratia marcescens é uma enzima que é exportada para o periplasma por seu
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13/116 hospedeiro natural (Brurberg et al, Microbiology 142, 15811589 (1996)). Matano et al. investigaram adicionalmente a secreção da N-acetilglicosaminidase de Bacillus subtilis codificada por nagZ em C. glutamicum. Essa enzima é secretada de modo ineficaz por seu hospedeiro natural. NagZ N-acetilglicosaminidase também foi expressa com vários peptídeos sinais de C. glutamicum para aumentar a quantidade de enzima no sobrenadante. No entanto, a fusão a esses peptídeos sinais, incluindo o peptídeo sinal de Cg0955, não teve nenhum efeito na quantidade de enzima secretada no sobrenadante de cultura. Em particular, observou-se que a fusão ao peptídeo sinal de Cg0955 aumentou drasticamente a quantidade de atividade enzimática intracelular.
[0032] Yim et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 98, 273-284, 2014) relataram a secreção de um fragmento de anticorpo variável recombinante de cadeia única contra toxina do antraz em C. glutamicum. O uso do peptídeo sinal de TorA que direciona a via de Tat resultou em secreção desprezível, enquanto o uso do sinal de peptídeo de PorB que direciona a via de Sec resultou em secreção mensurável. Os autores também declararam que o uso de uma sequência de genes com códon otimizado foi um dos componentes para a alta produção da proteína.
[0033] O documento WO2008049782 A1 se refere ao aumento da expressão genética em C. glutamicum ajustando-se o uso de códons de genes àquele de proteínas abundantes na célula hospedeira.
[0034] A proteína verde fluorescente (GFP) tem atraído muito interesse na biologia molecular como uma proteína
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14/116 modelo fácil de monitorar devido à sua fluorescência. É encontrada em águas-vivas, como Aequora victoria, onde está localizada em fotócitos especializados (J. M. Kendall e M. N. Badminton, Tibtech, 216-224, 1998).
[0035] Meissner et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 76, 633-642, 2007) investigaram a secreção de proteína com o uso da proteína verde fluorescente em três diferentes bactérias Gram-positivas Staphylococcus carnosus, Bacillus subtilis e Corynebacterium glutamicum. Em todos os três microrganismos, a fusão de um peptídeo sinal de Tat à GFP resultou em sua translocação através da membrana citoplasmática. No entanto, em S. carnosus, a GFP foi aprisionada totalmente na parede celular e não foi liberada no sobrenadante. Em Bacillus subtilis, a GFP foi secretada no sobrenadante em uma forma inativa. Em C. glutamicum, diferentes peptídeos sinais de Tat foram usados. O peptídeo sinal de TorA de E. coli, a sequência sinal de PhoD de C. glutamicum e a sequência sinal de PhoD de Bacillus subtilis. Embora a GFP tenha sido secretada em todos os três casos, a quantidade de proteína secretada era significativamente diferente. Surpreendentemente, a sequência sinal de PhoD de B. subtilis apresentou o melhor resultado.
[0036] Teramoto et al. (Applied Microbiology and Biotechnoogy 91, 677-687, 2011) usaram o peptídeo sinal de CgR0949 para alcançar uma secreção de alto rendimento de GFP em C. glutamicum.
[0037] Observou-se que Hemmerich et al. (Microbial Cell Factory 15(1), 208, 2016), após uma busca por um peptídeo sinal adequado para a secreção da cutinase de Fusarium
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15/116 solani pisi em Corynebacterium glutamicum, concluiu que o melhor peptídeo sinal para uma proteína-alvo específica tem que ser avaliado a cada vez a partir do início.
[0038] Isomaltose e/ou panose estão contidas em hidrolisado de amido em quantidades comparativamente pequenas. Consequentemente, para um programa de pesquisa que tem como objetivo uma cepa de C. glutamicum que produz um produto químico fino, por exemplo, L-lisina, a um alto rendimento e com o uso das quantidades comparativamente pequenas desses açúcares como fonte de carbono adicional, não é desejável produzir e secretar uma enzima, hidrolisando a ligação glicosídica α-1,6 desses açúcares, a um alto rendimento. Ambos os compostos, o produto químico fino e a enzima, competiriam pela mesma fonte de carbono (ou fontes de carbono) e, então, o rendimento do composto de interesse comercial, que é o produto químico fino, seria negativamente afetado. A enzima produzida e secretada seria, então, uma carga metabólica para o produtor do produto químico fino.
[0039] Até o presente momento, o direcionamento de uma enzima intracelular de um microrganismo que tem a habilidade de hidrolisar a ligação glicosídica α-1,6 de isomaltose e/ou panose para a matriz extracelular, isto é, o sobrenadante de cultura, ainda não foi demonstrado para
Corynebacterium glutamicum.
[0040] No entanto, é desejável fornecer um processo fermentativo para um produto químico fino com base em um material bruto de fermentação de baixo custo contendo panose e/ou isomaltose, como hidrolisado de amido, com o uso de um Corynebacterium, em particular uma
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Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de hidrolisar a ligação glicosídica α-1,6 de panose e/ou isomaltose, tornando disponível, desse modo, esses oligômeros de glicose para propagação e formação de produto químico fino.
[0041] É um objeto da presente invenção fornecer um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem atividade de α-1,6 glicosidase e sendo que tal polipeptídeo pode ser secretado por um Corynebacterium, preferencialmente por Corynebacterium glutamicum.
[0042] Um objetivo adicional da presente invenção é a provisão de um Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum que compreende o dito polinucleotídeo.
[0043] Além disso, é um objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir u produto químico fino, como L-aminoácidos, vitaminas, nucleosídeos e nucleotídeos, a partir de uma fonte de carbono que compreende oligossacarídeos que consistem em pelo menos dois monômeros de glicose a-1-6-glicosidicamente ligados, como panose (Oa-D-Glcp-(1^6)-O-a-D-Glcp-(1^4)-D-Glcp) ou isomaltose (O-αD-Glcp-(1^6)-O-a-D-Glcp), com o uso do dito Corynebacterium.
[0044] Para alcançar o objetivo descrito acima, a presente invenção disponibiliza polinucleotídeos que codificam novos polipeptídeos de fusão que compreendem essencialmente o peptídeo sinal de Tat de CgR0949 ou Cg0955 e os polipeptídeos Agl2 ou Agl1 de Bifidobacterium breve UCC2003 e variantes dos mesmos que fornecem atividade de α1,6-glicosidase.
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17/116 [0045] A presente invenção disponibiliza adicionalmente bactérias do gênero Corynebacterium e Escherichia que portam os ditos polinucleotídeos e métodos para a produção dos produtos químicos finos a partir de oligossacarídeos que consistem em pelo menos dois monômeros de glicose a-16-glicosidicamente ligados, como panose e/ou isomaltose com o uso das ditas bactérias.
[0046] Os objetos subjacentes à presente invenção foram solucionados por um polinucleotídeo isolado, preferencialmente desoxirribo-polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende as sequências de aminoácidos a), b) e c) com
a) sendo um peptídeo sinal de Tat no N-terminal que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de a1) posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 ou posições 1 a de SEQ ID NO:12 e a2) posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 com Ala na posição 13 ou posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12 com Ala na posição 13;
b) sendo um polipeptídeo no C-terminal que tem atividade de a-1,6-glicosidase que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de b1) pelo menos (>) 95 % idêntica, preferencialmente > 99 % idêntica, à sequência das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 e b2) pelo menos (>) 95 % idêntica, preferencialmente >
% idêntica, à sequência das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12, e
c) sendo 0 a no máximo 10 resíduos de aminoácido,
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18/116 preferencialmente 1 a 3 resíduos de aminoácido, de modo particularmente preferencial 3 resíduos de aminoácido, entre a) e b).
[0047] No caso em que a sequência de aminoácidos c) consiste em 3 resíduos de aminoácido, é preferencial que esses 3 aminoácidos tenham a sequência Met Thr Ser.
[0048] Poderia ser mostrado que o polinucleotídeo inventivo que combina a sequência de codificação para o peptídeo sinal de Tat específico de acordo com a1) ou a2) com a a-1,6-glicosidase específica de acordo com b1) ou b2) permite a ruptura de panose e isomaltose quando expresso em um produto químico fino que produzir uma bactéria do gênero Corynebacterium ou Escherichia. A expressão do polinucleotídeo de acordo com a invenção não impõe uma carga metabólica na produção do dito produto químico fino. A expressão do polinucleotídeo de acordo com a invenção melhora adicionalmente o rendimento de um produto químico fino produzido pelo produto químico fino que produz bactéria ao disponibilizar panose e isomaltose como fonte de carbono.
[0049] O polinucleotídeo inventivo de acordo com a invenção soluciona, então, os seguintes problemas:
- Fornecer uma α-1,6-glicosidase com uma especificidade que permite a despolimerização de isomaltose e panose sob condições de uma fermentação.
- Expressar a a-1,6-glicosidase em um produto químico fino que produz bactéria sem se tornar uma carga metabólica para a produção do produto químico fino.
- Alcançar a secreção da a-1,6-glicosidase no meio circundante do produto químico fino que produz bactéria
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19/116 ao combinar a sequência de codificação da α-1,6glicosidase a um peptídeo sinal adequado que é compatível com a a-1,6-glicosidase específica.
- Fornecer fonte de carbono metabolizável adicional para a produção do produto químico fino e aumentar o rendimento total do produto químico fino produzido pela bactéria garantindo que a expressão da a-1,6-glicosidase secretada não compita com a produção do produto químico fino para fonte de carbono.
[0050] Caso a sequência de aminoácidos de a) seja diretamente unida ou conectada resp. à sequência de aminoácidos de b), o número de resíduos de aminoácido de c) é 0 (zero).
[0051] Caso o número de resíduos de aminoácido de c) seja 3 (três) , é preferencial que a sequência dos ditos resíduos de aminoácido seja Met Thr Ser ou Ile Leu Val.
[0052] É preferencial que o peptídeo sinal de Tat no Nterminal de a) consista na sequência de aminoácidos de a1) que é a sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 ou posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12.
[0053] Além disso, é preferencial que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo no C-terminal de b1) seja selecionada a partir das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 e das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 mais um Met adicional na frente da posição 37, como mostrado na SEQ ID NO:6, de modo particularmente preferencial é a sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10.
[0054] O fragmento um Met adicional na frente da posição 37 como mostrado na SEQ ID NO:6” significa que o aminoácido Met está inserido na sequência de aminoácidos de
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SEQ ID NO:10 entre as posições 36 e 37.
[0055] Além disso, é preferencial que o polipeptídeo no C-terminal de b2) seja selecionado a partir das posições 39 a 643 de SEQ ID NO:12, posições 38 a 643 de SEQ ID NO:12 e posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12, de modo particularmente preferencial é a sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12.
[0056] Os detalhes referentes à bioquímica e à estrutura química de polinucleotídeos e polipeptídeos, como presente em seres vivos, como bactérias como Corynebacterium ou Escherichia, por exemplo, podem ser encontrados, entre outros, no livro Biochemie por Berg et al (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlim, Alemanha, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).
[0057] Os polinucleotídeos que consistem em monômeros de desoxirribonucleotídeo contendo as nucleobases ou bases resp. adenina (a), guanina (g), citosina (c) e timina (t) são denominados desoxirribopolinucleotídeos ou ácido desoxirribonucleico (DNA). Os polinucleotídeos que consistem em monômeros de ribonucleotídeo contendo as nucleobases ou bases adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são denominados ribo-polinucleotídeos ou ácido ribonucleico (RNA). Os monômeros nos ditos polinucleotídeos são covalentemente ligados entre si por uma ligação de 3',5'-fosfodiéster. Por convenção, polinucleotídeos de filamento único são escritos da direção 5' a 3'. Consequentemente, um polinucleotídeo tem uma extremidade 5' e uma extremidade 3'. Para o propósito desta invenção, desoxirribopolinucleotídeos são preferenciais. Em bactérias, por exemplo, Corynebacterium ou Escherichia, o
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DNA está tipicamente presente em forma de filamento duplo. Consequentemente, o comprimento de uma molécula de DNA é tipicamente dado em pares de bases (bp).
[0058] Os polipeptídeos consistem em monômeros de Laminoácido unidos por ligações peptídicas. Para a abreviação de L-aminoácidos, o código de uma letra e o código de três letras da IUPAC é usado. Devido à natureza da biossíntese de polipeptídeo, os polipeptídeos têm uma extremidade amino terminal e uma extremidade carboxil terminal também denominadas extremidade N-terminal e extremidade C-terminal. Os polipeptídeos também são denominados proteínas.
[0059] Os polipeptídeos de fusão também denominados proteínas de fusão ou proteínas químericas na técnica são polipeptídeos criados através da união de dois ou mais genes que originalmente codificaram polipeptídeos separados. A tradução de tal gene de fusão resulta em um polipeptídeo com propriedades funcionais de cada um dos polipeptídeos originais.
[0060] Durante o trabalho para a presente invenção, uma porção que compreende a extremidade 5' da sequência de nucleotídeos de vários genes que codificam a porção de Nterminal de polipeptídeos que têm a habilidade de serem translocados através da membrana citoplasmática de uma bactéria foi fundida a sequências de nucleotídeos de genes ou partes dos mesmos que codificam polipeptídeos que têm atividade enzimática de a-1,6-glicosidase, sendo que os ditos polipeptídeos constituem, desse modo, a porção de Cterminal ou o polipeptídeo no C-terminal resp. no polipeptídeo de fusão.
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22/116 [0061] Em bactérias como Corynebacterium e Escherichia, existem duas vias principais para secretar proteínas ou polipeptídeos resp. através da membrana citoplasmática. Uma é denominada via de Secreção geral ou via de Sec e a outra é denominada via de translocação de Dupla arginina ou via de Tat. Uma revisão geral dessas duas vias de translocação foi apresentada por Natale et al (Biochimica et Biophysica Acta 1778, 1735 -1756, 2008) e uma revisão específica de Corynebacterium glutamicum foi dada por Liu et al (Critical Reviews in Biotechnology 2016) e Freudl (Journal of Biotechnology http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.02.023).
[0062] Uma análise funcional da via de translocação de Dupla arginina em Corynebacterium glutamicum foi apresentada por Kikuchi et al (Applied and Environmental Microbiology 72, 7183 - 7192, 2006).
[0063] A sequência de nucleotídeos da região de codificação (cds) de cgR0949 de Corynebacterium glutamicum, cepa R, é mostrada na SEQ ID NO:3 e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo CgR0949 codificado é mostrada na SEQ ID NO:4 do protocolo de sequência. A sequência de nucleotídeos da região de codificação de cgR0949 também pode ser encontrada no NCBI sob a etiqueta de localização CGR_RS04950 da sequência genômica acessível sob NC_009342. A sequência de aminoácidos de CgR0949, também designada CgR_0949 na técnica, pode ser encontrada sob o número de acesso de GenBank BAF53923.1.
[0064] Watanabe et al (Microbiology 155, 741 - 750, 2009) identificaram a sequência de aminoácidos da posição 1 a 3 0 de SEQ ID NO:4 como uma sequência sinal ou peptídeo
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23/116 sinal, resp. direcionando a via de Tat e a sequência Leu Gly Ala mostrada nas posições 31 a 33 de SEQ ID NO:4 como um sítio de clivagem putativo.
[0065] A sequência de nucleotídeos da região de codificação (cds) de cg0955 de Corynebacterium glutamicum, cepa ATCC13032, é mostrada na SEQ ID NO:1 e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Cg0955 codificado é mostrada na SEQ ID NO:2 do protocolo de sequência. A sequência de nucleotídeos da região de codificação de cg0955 também pode ser encontrada no NCBI sob a etiqueta de localização NCgl0801 da sequência genômica acessível sob NC_003450. A sequência de aminoácidos de Cg0955 pode ser encontrada sob o número de acesso NP_600064.1.
[0066] Nesta invenção, o termo peptídeo sinal de CgR0949 ou peptídeo sinal de Tat de CgR0949 ou peptídeo sinal de Cg0955 ou peptídeo sinal de Tat de Cg0955 compreende a sequência de aminoácidos da sequência sinal e o sítio de clivagem putativo Leu Gly Ala como definido por Watanabe et al (consultar figura 3 na página 745 de Watanabe et al).
[0067] A sequência de aminoácidos da posição 1 a 33 de SEQ ID NO:2 é idêntica à sequência de aminoácidos da posição 1 a 33 de SEQ ID NO:4 com a exceção da posição 13. O aminoácido na posição 13 de SEQ ID NO:2 é Thr e o aminoácido na posição 13 de SEQ ID NO:4 é Ala.
[0068] A sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:2 é totalmente idêntica à sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 e totalmente idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12.
[0069] O termo α-1,6-glicosidase designa uma enzima que
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24/116 tem a atividade de hidrolisar a ligação α-1,6 em alguns oligossacarídeos produzidos a partir de amido ou glicogênio. Para o propósito desta invenção, a enzima tem pelo menos a habilidade de hidrolisar a ligação α-1,6 contida em isomaltose e/ou panose. De acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB), o nome aceito para a enzima é oligo-1,6-glicosidase e o nome sistemático oligossacarídeo a-1,6-glico-hidrolase. O número EC da enzima é EC 3.2.1.10. Instruções para medir a dita atividade enzimática podem ser encontradas em Pokusaeva et al (Applied and Environmental Microbiology 75, 1135-1143, 2009). A atividade da enzima também pode ser avaliada com o uso de um substrato cromogênico como para-nitrofenil-αglicosídeo, como, por exemplo, descrito por Deng et al (FEBS Open Bio 4, 200 - 212, 2014) .
[0070] Em um conjunto de modalidades preferenciais de acordo com a invenção, a porção de polipeptídeo no Cterminal ou polipeptídeo no C-terminal resp. do polipeptídeo de fusão é a a-1,6-glicosidase Agl2 de Bifidobacterium breve, cepa UCC2003 (consultar Pokusaeva et al), e variantes das mesmas. Esse grupo de polipeptídeos no C-terminal também é denominado polipeptídeos no C-terminal do tipo Agl2 doravante no presente documento. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de a-1,6-glicosidase Agl2 codificado de Bifidobacterium breve, cepa UCC2003, está publicamente disponível no banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional para Informações sobre Biotecnologia, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) sob o número de acesso FJ386390. Também é
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25/116 mostrada na SEQ ID NO:6 do protocolo de sequência. A sequência de aminoácidos das posições 2 a 604 de SEQ ID NO:6 é idêntica à sequência de aminoácidos da posição 37 a 63 9 de SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 representa o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão codificado mostrado na SEQ ID NO:10.
[0071] De acordo com a invenção, variantes do dito polipeptídeo no C-terminal podem ser usados, os quais têm uma sequência de aminoácidos > 95 % idêntica, preferencialmente > 99 %, de modo particularmente preferencial 100 % idêntica à sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10. Um exemplo de um polipeptídeo no C-terminal que tem uma sequência de aminoácidos > 99 % idêntica àquela das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 é mostrado na SEQ ID NO:6.
[0072] Constatou-se que, ao conectar o peptídeo sinal de Tat de Cg0955 às ditas a-1,6-glicosidases Agl2, alcança-se o objetivo da invenção de uma maneira eficiente.
[0073] Esses polipeptídeos no C-terminal do tipo Agl2 são preferencialmente conectados ao peptídeo sinal de Tat de Cg0955 mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 das posições 1 a 33. A sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:2 é idêntica à sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10. Podem ser diretamente conectados ou por uma sequência de no máximo 10 aminoácidos, preferencialmente 1 a 3, de modo particularmente preferencial 3 aminoácidos. É preferencial que esses 3 aminoácidos tenham a sequência Met Thr Ser.
[0074] Consequentemente, a invenção fornece um
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26/116 polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende, preferencialmente que consiste em, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 e que tem atividade de a-1,6-glicosidase. O polipeptídeo de fusão codificado mostrado na SEQ ID NO:10 foi designado Tat'Agl2.
[0075] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo no Cterminal do polipeptídeo de fusão mostrada na SEQ ID NO:10, a qual é a sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10, pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos das posições 4 a 1812 de SEQ ID NO:5, a qual é a sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene agl2 contido em Bifidobacterium breve UCC2003 sem o códon de início atg. A sequência de nucleotídeos das posições 4 a 1812 de SEQ ID NO:5 também é denominada 'agl2.
[0076] Sabe-se pela técnica que o código genético é degenerado, o que significa que um certo aminoácido pode ser codificado por diversos tripletos diferentes. O termo uso de códon se refere à observação de que um certo organismo não usará tipicamente cada códon possível para um certo aminoácido com a mesma frequência. Em vez disso, um organismo mostrará tipicamente certas preferências por códons específicos, o que significa que esses códons são encontrados mais frequentemente na sequência de codificação de genes transcritos de um organismo. Se um certo gene estranho a seu futuro hospedeiro, isto é, de uma espécie diferente, for expresso no futuro organismo hospedeiro, a sequência de codificação do dito gene seria, então, ajustada ao uso de códon do dito futuro organismo hospedeiro. Na presente invenção, o dito gene estranho a
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27/116 seu futuro hospedeiro é agl2 de Bifidobacterium breve UCC2003 ou variantes do mesmo e o dito futuro hospedeiro é Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum. Os ensinamentos quanto à otimização do uso de códon podem ser encontrados em Fath et al (PLos ONE, 6(3), e17596, 2011) e no documento WO2008049782.
[0077] De acordo com uma modalidade adicional da invenção, a dita sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 é codificada por um polinucleotídeo isolado que tem uma sequência de nucleotídeos otimizada para o uso de códon de Corynebacterium glutamicum, sendo que a dita sequência de nucleotídeos é > 99,0 %, de modo particularmente preferencial > 99,5 %, de modo mais de modo particularmente preferencial 100 % idêntica à sequência de nucleotídeos da posição 109 a 1917 de SEQ ID NO:9.
[0078] A sequência de nucleotídeos da posição 109 a 1917 de SEQ ID NO:9 que tem uso de códon otimizado (cuo) para Corynebacterium glutamicum também é denominada 'agl2_cuo nesta invenção.
[0079] De acordo com a invenção, o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende a sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10, diretamente sucedida por uma sequência de três aminoácidos, preferencialmente a sequência de aminoácidos das posições 34 a 36 de SEQ ID NO:10, diretamente sucedida pela sequência de aminoácidos das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10, pode ser codificado pela sequência de nucleotídeos que compreende nucleotídeos 1 a 1917 de SEQ ID NO:9, preferencialmente que compreende SEQ ID NO: 9. Mais especificamente, a dita sequência de
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28/116 nucleotídeos pode consistir em nucleotídeos 1 a 1917 de SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:9.
[0080] Em outro conjunto de modalidades de acordo com a invenção, a porção de polipeptídeo no C-terminal ou polipeptídeo no C-terminal resp. do polipeptídeo de fusão é a a-1,6-glicosidase Agl1 de Bifidobacterium breve, cepa UCC2003 (consultar Pokusaeva et al), e variantes das mesmas. Esse grupo de polipeptídeos no C-terminal também é denominado polipeptídeos no C-terminal do tipo Agl1 doravante no presente documento. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de a-1,6-glicosidase Agl1 codificado de Bifidobacterium breve, cepa UCC2003, está publicamente disponível no banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional para Informações sobre Biotecnologia, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) sob o número de acesso FJ386389. Também é mostrada na SEQ ID NO:8 do protocolo de sequência. A sequência de aminoácidos das posições 1 a 607 de SEQ ID NO:8 é idêntica à sequência de aminoácidos da posição 37 a 643 de SEQ ID NO: 12. A sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12 representa o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão codificado mostrado na SEQ ID NO:12. De acordo com a invenção, variantes do dito polipeptídeo no C-terminal podem ser usados, os quais têm uma sequência de aminoácidos > 95 % idêntica, preferencialmente > 99 %, de modo particularmente preferencial 100 % idêntica à sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12. Exemplos de polipeptídeos no C-terminal que têm uma sequência de aminoácidos > 99 % idêntica àquela das posições 37 a 643 de
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SEQ ID NO:12 são polipeptídeos no C-terminal que têm a sequência de aminoácidos de 38 a 643 de SEQ ID NO:12 ou de 39 a 643 de SEQ ID NO:12.
[0081] Esses polipeptídeos no C-terminal do tipo Agl1 são preferencialmente conectados ao peptídeo sinal de Tat de Cg0955 mostrado na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 das posições 1 a 33. A sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:2 é idêntica à sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12. Podem ser diretamente conectados ou por uma sequência de no máximo 10 aminoácidos, preferencialmente 1 a 3, de modo particularmente preferencial 3 aminoácidos. É preferencial que esses 3 aminoácidos tenham a sequência Ile Leu Val.
[0082] Consequentemente, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende, preferencialmente que consiste em, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12 e que tem atividade de a-1,6-glicosidase. O polipeptídeo de fusão codificado mostrado na SEQ ID NO:12 foi designado Tat-Agl1. [0083] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo no Cterminal do polipeptídeo de fusão mostrada na SEQ ID NO:12, a qual é a sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12, pode ser codificada pela sequência de nucleotídeos das posições 1 a 1821 de SEQ ID NO:7, a qual é a sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene agl1 contido em Bifidobacterium breve UCC2003.
[0084] Sabe-se pela técnica que o código genético é degenerado, o que significa que um certo aminoácido pode ser codificado por diversos tripletos diferentes. O termo uso de códon se refere à observação de que um certo
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30/116 organismo não usará tipicamente cada códon possível para um certo aminoácido com a mesma frequência. Em vez disso, um organismo mostrará tipicamente certas preferências por códons específicos, o que significa que esses códons são encontrados mais frequentemente na sequência de codificação de genes transcritos de um organismo. Se um certo gene estranho a seu futuro hospedeiro, isto é, de uma espécie diferente, for expresso no futuro organismo hospedeiro, a sequência de codificação do dito gene seria, então, ajustada ao uso de códon do dito futuro organismo hospedeiro. Na presente invenção, o dito gene estranho a seu futuro hospedeiro é agl1 de Bifidobacterium breve UCC2003 ou variantes do mesmo e o dito futuro hospedeiro é Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum.
[0085] De acordo com a invenção, é preferencial que a dita sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12 é codificada por um polinucleotídeo isolado que tem uma sequência de nucleotídeos otimizada para o uso de códon de Corynebacterium glutamicum, sendo que a dita sequência de nucleotídeos é > 99,0 %, de modo particularmente preferencial > 99,5 %, de modo mais de modo particularmente preferencial 100 % idêntica à sequência de nucleotídeos da posição 109 a 1929 de SEQ ID NO:11.
[0086] A sequência de nucleotídeos da posição 109 a 1929 de SEQ ID NO:11 que tem uso de códon otimizado (cuo) para Corynebacterium glutamicum também é denominada agl1_cuo nesta invenção.
[0087] De acordo com a invenção, também é preferencial que o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo
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31/116 de fusão que compreende a sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12, diretamente sucedida por uma sequência de três aminoácidos, preferencialmente a sequência de aminoácidos das posições 34 a 36 de SEQ ID NO:12, diretamente sucedida pela sequência de aminoácidos das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12, é codificado pela sequência de nucleotídeos que compreende nucleotídeos 1 a 1929 de SEQ ID NO:11, preferencialmente que compreende SEQ ID NO:11. Mais especificamente, é preferencial que a dita sequência de nucleotídeos consista em nucleotídeos 1 a 1929 de SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:11.
[0088] Devido à estrutura de filamento duplo do DNA, o filamento complementar ao filamento mostrado no protocolo de sequência, por exemplo, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:11, também é matéria da invenção.
[0089] A fim de alcançar a expressão dos polinucleotídeos da presente invenção, os ditos polinucleotídeos são funcionalmente ligados a um promotor.
[0090] Consequentemente, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão da invenção funcionalmente ligado a um promotor.
[0091] Um promotor denota um polinucleotídeo, preferencialmente desoxirribo-polinucleotídeo, que é funcionalmente ligado a um polinucleotídeo a ser transcrito e determina o ponto e a frequência de iniciação de transcrição do polinucleotídeo, permitindo, desse modo, a expressão do polinucleotídeo.
[0092] O termo funcionalmente ligado” denota neste contexto a disposição sequencial do promotor com um polinucleotídeo a ser expresso, resultando em transcrição
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32/116 do dito polinucleotídeo. Nessas disposições, a distância entre a extremidade 3' do promotor e a extremidade 5' da sequência de codificação tipicamente é de < 300 pares de bases, preferencialmente < 200 pares de bases, de modo particularmente preferencial < 100 pares de bases, de modo mais de modo particularmente preferencial < 60 pares de bases. No contexto da presente invenção, o dito polinucleotídeo a ser expresso codifica um polipeptídeo de fusão de acordo com a invenção, como, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:12.
[0093] O termo transcrição se refere ao processo pelo qual uma molécula de RNA complementar é produzida, tendo início por um modelo de DNA. Esse processo envolve proteínas específicas, por exemplo, RNA polimerase. O RNA sintetizado (RNA mensageiro) funciona, desse modo, como um modelo no processo de tradução que produz o polipeptídeo ou proteína resp. A transcrição termina tipicamente em uma sequência de nucleotídeos denominada terminador transcricional. Um exemplo de um terminador transcricional é o terminador transcricional do gene gap de Corynebacterium glutamicum identificado por Eikmanns, B. J. (Journal of Bacteriology 174(19), 6067 - 6068, 1992) e mostrado na SEQ ID NO:13 da listagem de sequências.
[0094] Demais detalhes referentes à expressão genética, à biossíntese de DNA e à biossíntese de RNA podem ser encontrados em livros de bioquímica e genética molecular, como é conhecido na técnica.
[0095] Os promotores para Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, M. Patek
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33/116 (Regulation of gene expression, in: L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005)) ou Patek et al (Microbial Biotechnology 6, 103 - 117, 2013).
[0096] Os promotores adequados incluem os promotores descritos no documento WO2002040679, preferencialmente os promotores mostrados na SEQ ID NO:4 a 22 dos mesmos, os promotores de tac descritos por De Boer et al (Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 80, 21 - 25, 1983; consultar também: Morinaga et al (Journal of Biotechnology 5, 305 - 312, 1987)), preferencialmente os promotores PtacI ou PtacII, de modo particularmente preferencial PtacI, como definido pela sequência de nucleotídeos das posições 1 a 75 de SEQ ID NO:14 da listagem de sequências, o promotor Peftu do fator de alongamento de tradução de proteína TU descrito no documento WO2005059093, preferencialmente o promotor mostrado na SEQ ID NO:1 do mesmo, o promotor Pgro, como descrito no documento WO2005059143, preferencialmente o promotor mostrado na SEQ ID NO:1 do mesmo, [0097] o promotor Psod descrito no documento WO2005059144, preferencialmente o promotor mostrado na SEQ ID NO:1 do mesmo, as variantes de promotor do gene gap, como descrito no documento WO 2013000827, preferencialmente os promotores Pgap3 mostrado na SEQ ID NO:3 e Pg3N3 mostrado na SEQ ID NO:34 do mesmo, e as variantes de promotor do gene dapB, como descrito no documento US8637295, preferencialmente o promotor PdapBN1 mostrado na SEQ ID NO:13 do mesmo.
[0098] Os promotores preferenciais são os promotores de tac, o promotor PdapBN1, o promotor Pgap3 e o promotor
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Pg3N3.
[0099] Em particular, são preferenciais o promotor PtacI mostrado na SEQ ID NO:14 posições 1 a 75 e o promotor PdapBN1 mostrado na SEQ ID NO:15 da listagem de sequências da presente invenção.
[0100] Os ditos promotores são unidos ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de fusão da invenção construindo uma unidade de expressão, a qual é um polinucleotídeo isolado, que compreende um promotor, preferencialmente um promotor como elaborado acima, de modo particularmente preferencial o promotor PdapBN1, e funcionalmente ligado ao dito promotor da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fusão de acordo com a presente invenção.
[0101] É preferencial que a dita unidade de expressão, a qual é um polinucleotídeo isolado, compreenda o promotor PdapBN1, como mostrado na SEQ ID NO:16 posições 32 a 91 do protocolo de sequência e funcionalmente ligado ao dito promotor, preferencialmente diretamente pela sequência de nucleotídeos das posições 92 a 121 de SEQ ID NO:16, uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fusão de SEQ ID NO:17, preferencialmente a sequência de nucleotídeos da posição 122 a 2038 de SEQ ID NO:16.
[0102] É de modo particularmente preferencial que a dita unidade de expressão, a qual é um polinucleotídeo isolado, compreenda a sequência de nucleotídeos da posição 32 a 2038 de SEQ ID NO:16, de modo mais de modo particularmente preferencial a sequência de nucleotídeos das posições 32 a 2041 de SEQ ID NO:16.
[0103] Em uma modalidade adicional, a unidade de
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35/116 expressão, a qual é um polinucleotídeo isolado, compreende a sequência de nucleotídeos da 32 a 2088 de SEQ ID NO:16, preferencialmente SEQ ID NO:16. A sequência de nucleotídeos das posições 2053 a 2088 de SEQ ID NO:16 é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 3 a 38 de SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:13, sendo o terminador transcricional do gene gap como descrito por B. J. Eickmanns (Journal of Bacteriology 174(19), 6076-6086, 1992). Para o trabalho da presente invenção, um terminador transcricional denominado Tgap* que tem a sequência de nucleotídeos das posições 3 a 38 de SEQ ID NO:13 foi usado.
[0104] A dita unidade de expressão pode ser inserida em um vetor de plasmídeo adequado. Do mesmo modo, a dita unidade de expressão pode ser criada por inserção de um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de fusão de acordo com a invenção a jusante de um promotor fornecido por um vetor de expressão disponível na técnica como definido abaixo.
[0105] Os vetores de plasmídeo adequados para Corynebacterium glutamicum são bem conhecidos na técnica. Um resumo de vetores de plasmídeo adequados, incluindo plasmídeos nativos, vetores de clonagem, vetores de expressão e vetores de plasmídeo que permitem integração cromossômica é dado por M. Patek e J. Nesvera: Promoters and Plasmid Vectors of Corynebacterium glutamicum (H. Yukawa e M. Inui: Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013) e L. Eggeling e O. Reyes: Experiments (L. Eggeling e M. Bott: Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press 2005).
[0106] Um exemplo de um vetor de plasmídeo adequado,
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36/116 preferencialmente vetor de expressão, é o pVWExl descrito por Peters-Wendisch et al (Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 3, 295 - 300, 2001) . A sequência de nucleotídeos de pVWExl está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso MF034723. O vetor de plasmídeo pVWExl tem a habilidade de ser replicado de modo autônomo por Corynebacterium glutamicum e por Escherichia coli. Portanto, também é denominado vetor do tipo ponte (shuttle). Fornece o promotor de PtacI e sítios de clonagem adequados, por exemplo, sítio de restrição de PstI e BamHI, na extremidade 3' ou a jusante em relação ao dito promotor de PtacI. Demais elementos e detalhes referentes a esse vetor de expressão podem ser encontrados em Peters-Wendisch et al. Após a inserção de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de fusão da presente invenção, por exemplo, o polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO:21, nos ditos sítios de clonagem, é funcionalmente ligado ao dito promotor de PtacI e sua expressão é controlada pelo dito promotor de PtacI consequentemente. Então, o vetor de plasmídeo resultante contém uma unidade de expressão como descrito acima.
[0107] Outro exemplo de vetores de plasmídeo adequados, preferencialmente vetores de plasmídeo que permitem a integração cromossômica, são pK*mob e pK*mobsacB, de modo particularmente preferencial pK18mobsacB, descrito por Schãfer et al (Gene 145, 69 - 73, 1994) . A sequência de nucleotídeos de pk18mobsacB está disponível no NCBI sob o número de acesso FJ437239. Esses vetores de plasmídeo são capazes de replicação autônoma em Escherichia coli, porém não em Corynebacterium. No entanto, devido a sua natureza
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37/116 móvel, podem ser transferidos de Escherichia coli para Corynebacterium glutamicum por conjugação. Devido à presença do sistema de seleção de gene sacB, conferir sensibilidade à sacarose a seu hospedeiro, o vetor de plasmídeo pK18mobsacB fornece o meio para selecionar eventos de recombinação dupla após recombinação homóloga. Permite, assim, o isolamento de cepas que portam o gene de interesse integrado em um sítio-alvo de seus cromossomas. Vetores de plasmídeo similares são descritos, por exemplo, nos documentos WO2002070685 e WO2003014362. No contexto da presente invenção, o termo gene de interesse se refere a polinucleotídeos isolados da presente invenção.
[0108] Um sítio-alvo neste contexto é uma sequência de nucleotídeos que é dispensável para crescimento e formação do produto químico fino pela cepa de Corynebacterium. Uma lista de sítios-alvo adequados que são sequências de codificação dispensáveis para formação de L-lisina, por exemplo, o gene aecD que codifica uma C-S liase (Rossol e Pühler, Journal of Bacteriology 174(9), 2968 - 2977, 1992) por Corynebacterium glutamicum é mostrada na tabela 3 do documento WO2003040373. Os sítios-alvo incluem, ainda, sequências de nucleotídeos que codificam fagos ou componentes de fagos, por exemplo, aqueles mostrados na tabela 13 do documento
WO2004069996.
Os sítios-alvo incluem, ainda, regiões intergênicas.
Uma região intergênica é uma sequência de nucleotídeos localizada entre duas sequências de codificação e não tem nenhuma função. Uma lista de regiões intergênicas adequadas é, por exemplo, mostrada na tabela 12 do documento WO2004069996.
[0109] Durante o trabalho para a presente invenção, um
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38/116 novo sítio-alvo adequado foi identificado.
[0110] Um sítio-alvo preferencial é a região intergênica entre as sequências de codificação identificadas pela etiqueta de localização NCgl2176 e a etiqueta de localização NCgl2177 do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, preferencialmente SEQ ID NO:18 da posição 1036 a 1593 e o sítio-alvo correspondente (homólogo) em diferentes cepas da espécie. A sequência de nucleotídeos do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 está disponível no NCBI sob o número de acesso NC_003450.
[0111] Sabe-se pela técnica que sequências de nucleotídeos homólogas, ou alelos resp. no cromossoma da espécie Corynebacterium glutamicum variam entre diferentes cepas de tipo selvagem e mutantes obtidos a partir das mesmas.
[0112] A sequência correspondente (homóloga) à SEQ ID NO:18 na cepa ATCC13869 é mostrada na SEQ ID NO:19. A região intergênica correspondente é localizada entre as sequências de codificação identificadas pela etiqueta de localização BBD29_10725 e pela etiqueta de localização BBD29_1730, preferencialmente SEQ ID NO:19 da posição 1036 a 1593. A SEQ ID NO:19 da posição 1036 a 1593 é > 98 % idêntica à SEQ ID NO:18 da posição 1036 a 1593. A sequência de nucleotídeos do cromossoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 está disponível no NCBI sob o número de acesso NZ_CP016335.1.
[0113] A sequência correspondente (homóloga) à SEQ ID NO:18 na cepa ATCC14067 é mostrada na SEQ ID NO:20. A região intergênica é preferencialmente localizada da
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39/116 posição 1036 a 1593 de SEQ ID NO:20. A SEQ ID NO:20 da posição 1036 a 1593 é > 97 % idêntica à SEQ ID NO:18 da posição 1036 a 1593.
[0114] Consequentemente, um sítio-alvo preferencial é > 95 %, preferencialmente > 97 %, de modo particularmente preferencial > 98 %, de modo muito particularmente preferencial > 99 % idêntica, do modo mais particularmente preferencial 100% idêntica à SEQ ID NO:18 da posição 1036 a 1593.
[0115] Para realizar a integração dos polinucleotídeos isolados da invenção, preferencialmente aqueles funcionalmente ligados a um promotor, em um sítio-alvo por recombinação homóloga, sua extremidade 5' e sua extremidade 3' são ligadas a polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos a montante e a jusante do sítioalvo. A técnica também se refere a essas sequências como sequências flanqueadoras, em particular como a sequência flanqueadora 5' e sequência flanqueadora 3'. Uma sequência flanqueadora tem tipicamente um comprimento de > 200 a < 2000 pares de bases.
[0116] Um vetor de plasmídeo para realizar a integração de um polinucleotídeo desejado no cromossoma de um Corynebacterium desejado contém um polinucleotídeo que compreende a direção 5' a 3': uma sequência flanqueadora 5', o polinucleotídeo desejado e uma sequência flanqueadora 3'.
[0117] Consequentemente, um vetor de plasmídeo para realizar a integração de um polinucleotídeo da invenção no cromossoma de um Corynebacterium adequado contém um polinucleotídeo que compreende da direção 5' a 3': uma
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40/116 sequência flanqueadora 5', um polinucleotídeo de acordo com a invenção e uma sequência flanqueadora 3'.
[0118] Após dois eventos de recombinação homóloga que compreende um evento de recombinação na sequência flanqueadora 5' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossoma de Corynebacterium e um evento de recombinação na sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossoma Corynebacterium, o polinucleotídeo da invenção é integrado no cromossoma de Coryne-bacterium.
[0119] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.
[0120] Em uma modalidade preferencial, as ditas sequências flanqueadoras são escolhidas a partir de sequências de nucleotídeos contidas na SEQ ID NO:18, a qual contém a região intergênica entre a etiqueta de localização NCgl2176 e a etiqueta de localização NCgl2177 ou de sequências de nucleotídeos > 95 %, preferencialmente > 97 %, de modo particularmente preferencial > 98 %, de modo muito particularmente preferencial > 99 % idêntica à SEQ ID NO:18.
[0121] Do mesmo modo, as ditas sequências flanqueadoras podem ser escolhidas a partir de sequências de nucleotídeos contidas na SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO:20, sendo que ambas têm uma identidade de > 99 % a SEQ ID NO:18.
[0122] Consequentemente, a invenção fornece vetores de plasmídeo contendo os polinucleotídeos isolados da presente invenção.
[0123] Os ensinamentos e informações referentes à síntese, análise e manuseio de polinucleotídeos podem ser
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41/116 encontrados, entre outros, no livro de P. Fu e S. Panke (Systems Biology and Synthetic Biology, Wiley, 2009), o livro de S. Narang (Synthesis and Applications of DNA and RNA Academic Press, 1987), o livro de J. Sambrook et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o livro de C. R. Newton e A. Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, 1994) e o livro de D. Rickwood e B. D. Hames (Gel eletroforese of nucleic acids, a practical approach, IRL Press, 1982).
[0124] A análise de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos, por exemplo, alinhamentos de sequência, pode ser feita com o uso de software público, como o CLC Genomics Workbench (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o programa MUSCLE fornecido pelo Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI, Hinxton, Reino Unido).
[0125] Os polinucleotídeos isolados da invenção são transferidos para cepas de Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, ou Escherichia, preferencialmente Escherichia coli, por meio de transformação com o uso de métodos físico-químicos ou por conjugação com o uso de vetores de plasmídeo contendo os ditos polinucleotídeos. Para a transformação físicoquímica de Corynebacterium, os métodos de eletroporação de Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067 - 1070, 1989) ou Ruan et al (Biotechnology letters, 2015, DOI 10.1007/s10529-015-1934-x) ou o método de transformação de esferoplasto ou protoplasto de Thierbach et al (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356 -362, 1988) podem ser usados. Para transferência conjugacional ou conjugação resp. de Escherichia coli para Corynebacterium, o método de
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Schâfer et al (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) pode ser usado. Para seleção de cepas de Corynebacterium que portam o polinucleotídeo da invenção em um sítio-alvo do cromossoma após dois eventos de recombinação homóloga, o método de Schâfer et al pode ser usado. Detalhes técnicos para vários sítios-alvo podem ser encontrados, por exemplo, nos documentos WO2003040373 e WO2004069996. Demais detalhes também podem ser encontrados no artigo Experiments por L. Eggeling e O. Reyes contido em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005).
[0126] Para o propósito da presente invenção, os termos transformação e conjugação podem ser resumidos sob o termo transformação.
[0127] A transferência dos polinucleotídeos da invenção pode ser confirmada por hibridização de Southern com o uso de uma sonda complementar ao polinucleotídeo da invenção ou uma parte do mesmo, por amplificação em cadeia de polimerase (PCR) do polinucleotídeo da invenção ou uma parte do mesmo, preferencialmente sucedida por análise de sequência de nucleotídeos do produto de amplificação, ou medindo a atividade de a-1,6-glicosidase.
[0128] Durante o trabalho da presente invenção, encontrou-se que, após a transformação de bactérias do gênero Corynebacterium, preferencialmente bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum, com o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção, preferencialmente ligado a um promotor, os transformantes obtidos tinham a habilidade de secretar um polipeptídeo que tem atividade de a-1,6-glicosidase em um
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43/116 meio .
[0129] Encontrou-se, ainda, que o polipeptídeo codificado Tat-'Agl2 mostrado na SEQ ID NO:10, após ser secretado no meio pelo dito Corynebacterium glutamicum, tinha a sequência de aminoácidos das posições 31 a 639 de SEQ ID NO:10 ou a sequência de aminoácidos das posições 38 a 639 de SEQ ID NO:10.
[0130] O dito polipeptídeo ou polipeptídeos resp. secretados no meio pelo dito Corynebacterium hidrolisa isomaltose para produzir glicose e hidrolisa panose para produzir glicose e maltose. Então, o dito Corynebacterium tem a habilidade de usar panose e/ou isomaltose como fonte de carbono.
[0131] Consequentemente, a presente invenção fornece uma bactéria selecionada a partir do gênero Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, ou Escherichia, preferencialmente Escherichia coli, que compreende o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção, preferencialmente ligado a um promotor, em que a dita bactéria tem a habilidade de secretar um polipeptídeo que tem atividade de a-1,6-glicosidase codificada pelo dito polinucleotídeo isolado.
[0132]
Consequentemente, a presente invenção fornece, ainda, um Corynebacterium, preferencialmente
Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de secretar um polipeptídeo que tem atividade de α-1,6glicosidase e que tem a sequência de aminoácidos das posições 31 a 639 de SEQ ID NO:10 ou a sequência de aminoácidos das posições 38 a 639 de SEQ ID NO:10.
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44/116 [0133] Os polinucleotídeos isolados da invenção podem estar contidos em um vetor de plasmídeo replicado de modo autônomo no Corynebacterium ou podem estar contidos no cromossoma do Corynebacterium. Caso o polinucleotídeo isolado da invenção esteja contido no cromossoma, é replicado como parte do cromossoma. É preferencial que o dito polinucleotídeo isolado seja contido no cromossoma da bactéria. É particularmente preferencial que o dito polinucleotídeo isolado esteja contido em uma sequência do cromossoma (sítio-alvo) que é > 95 % idêntica à SEQ ID NO:18 da posição 1036 a 1593 como definido acima.
[0134] O número de cópias (cópias por célula de Corynebacterium) de uma unidade de expressão que compreende o polinucleotídeo isolado da invenção ligado a um promotor tipicamente não excede 40. É preferencial que o dito número de cópias seja < 10, de modo particularmente preferencial < 5, de modo muito particularmente preferencial < 2, do modo mais particularmente preferencial 1.
[0135] Uma descrição do gênero Corynebacterium e a espécie compreendida nesse gênero pode ser encontrada no artigo “Corynebacterium por K. A. Bernard e G. Funke em Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (Bergey's Manual Trust, 2012).
[0136] No gênero Corynebacterium, a espécie Corynebacterium glutamicum é preferencial. As cepas adequadas são, por exemplo, cepas ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869, cepas também denominadas cepas de tipo selvagem na técnica, e cepas que excretam produto químico fino obtidas das mesmas.
[0137] A cepa ATCC13032 (também disponível como
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DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. A cepa ATCC14067 (também disponível como DSM20411) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium flavum. A cepa ATCC13869 (também disponível como DSM1412) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium lactofermentum. Um estudo taxonômico desse grupo de bactérias baseado em hibridização de DNA-DNA foi feito por Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260, 1991). Uma análise comparativa de várias cepas da espécie Corynebacterium glutamicum baseada em análise de sequência foi fornecido por Yang e Yang (BMC Genomics 18(1) :940) .
[0138] Uma multitude de cepas que excretam produto químico fino do gênero Corynebacterium foram obtidas na técnica durante as últimas décadas, tendo início em cepas como ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 e similares. Foram obtidas como resultado de programas de desenvolvimento de cepa com o uso, entre outros, de métodos como mutagênese clássica, seleção para resistência antimetabólito, bem como amplificação e modificação de promotor de genes da via biossíntética do produto químico fino em questão por métodos de engenharia genética. Resumos podem ser encontrados em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) ou H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013) .
[0139] Cepas de Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, adequadas para as medições da presente invenção têm uma via de Tat (translocação de dupla
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46/116 arginina) funcional para secreção de proteína. As proteínas da via de Tat de Corynebacterium glutamicum são codificadas por genes tatA, tatB, tatC e tatE e descritas por Kikuchi et al (Applied and Environmental Microbiology 72(11), 7183 - 7192, 2006).
[0140] O termo produto químico fino inclui Laminoácidos, vitaminas, nucleosídeos e nucleotídeos, sendo que L-aminoácidos são preferenciais.
[0141] O termo vitamina inclui riboflavina.
[0142] O termo L-aminoácido inclui os L-aminoácidos proteinogênicos e também L-ornitina e L-homoserina. Os Laminoácidos proteinogênicos devem ser compreendidos como os L-aminoácidos presentes em proteínas naturais, ou seja, em proteínas de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Os L-aminoácidos proteinogênicos compreendem ácido L-aspásrtico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido Lglutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, Larginina, L-prolina e, em alguns casos, L-selenocisteína e L-pirrolisina.
[0143] O produto químico fino é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em L-aminoácido proteinogênico, L-ornitina e L-homoserina. É dada preferência particular aos L-aminoácidos proteinogênicos selecionados a partir de L-lisina, L-treonina, L-valina e L-isoleucina, sendo que L-lisina é muito particularmente preferencial.
[0144] O termo L-aminoácidos, quando mencionado no presente contexto de formação de produto, também compreende
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47/116 seus sais, por exemplo, monocloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina no caso da L-lisina de L-aminoácido.
[0145] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, Blombach et al (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem a cepa DM1933, a qual está depositada sob o número de acesso DSM25442; O documento WO2008033001 descreve a cepa KFCC10881-C14, a qual está depositada sob o número de acesso KCCM10770P e o documento EP0841395 se refere à cepa AJ11082, a qual está depositada sob o número de acesso NRRL B-1147. Além disso, a cepa DM2031 de Corynebacterium glutamicum que excreta L-lisina, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514, pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvido posteriormente a partir de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de Llisina.
[0146] Resumos referentes ao melhoramento de cepas que excretam L-lisina de Corynebacterium glutamicum podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005), V. F. Wendisch (Amino Acid Biosynthesis - Pathways, Regulation and Metabolic Engineering, Springer Verlag, 2007), H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013), e Eggeling e Bott (Applied Microbiology and Biotechnology 99 (9), 3387-3394, 2015).
[0147] As cepas que excretam L-treonina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e
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48/116 podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento EP0385940 descreve a cepa DM368-2, a qual está depositada sob DSM5399.
[0148] As cepas que excretam L-valina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento US5188948 descreve a cepa AJ12341, a qual está depositada sob FERM BP-1763 e o documento EP2811028 descreve a cepa ATCC14067_PprpD2-ilvBN.
[0149] As cepas que excretam L-isoleucina da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, o documento US4656135 descreve a cepa AJ12152, a qual está depositada sob Ferm BP-760.
[0150] As cepas que excretam riboflavina da espécie Corynebacterium glutamicum são descritas no documento EP2787082.
[0151] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo KCCM denota o depositório Korean Culture Center of Microorganisms localizada em Seoul, Coreia. O termo NRRL denota o depositório Agricultural Research Service Culture Collection localizado em Peoria, Illinois, EUA. O termo ATCC denota o depositório American Type Culture Collection localizado em Manasass, Virginia, EUA. O termo FERM denota o depositório National Institute of Technology and Evaluation (NITE) localizado em Tóquio, Japão.
[0152] Para obter uma bactéria que excreta produto químico fino do gênero Corynebacterium, preferencialmente
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Corynebacterium glutamicum que tem a habilidade de secretar um polipeptídeo que tem atividade de α-1,6-glicosidase codificada pelo polinucleotídeo isolado da invenção, uma bactéria que excreta produto químico fino do gênero
Corynebacterium é transformada com um polinucleotídeo isolado da invenção, preferencialmente um polinucleotídeo isolado ligado a um promotor (unidade de expressão).
[0153] Então, uma bactéria que excreta produto químico fino do gênero Corynebacterium, preferencialmente
Corynebacterium glutamicum que tem a habilidade de usar panose e/ou isomaltose como uma fonte de carbono para crescimento e excreção de produto químico fino, é obtida. [0154] Do mesmo modo, é possível obter uma bactéria que excreta produto químico fino de acordo com a invenção ao transformar primeiramente uma cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, como, por exemplo, ATCC13032, ATCC13869 ou
ATCC14067, com o polinucleotídeo da invenção e, então, usar o transformante obtido como ponto de partida para um programa de desenvolvimento de cepa que tem como objetivo o produto químico fino desejado.
[0155] Consequentemente, a presente invenção fornece um Corynebacterium que excreta produto químico fino, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, que compreende um polinucleotídeo isolado da invenção que tem, então, a habilidade de usar panose e/ou isomaltose para crescimento e excreção e produção de produto químico fino.
[0156] A invenção fornece, ainda, um processo fermentativo para produzir um produto químico fino com o uso do Corynebacterium de acordo com a presente invenção.
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50/116 [0157] O processo fermentativo pode ser um processo contínuo ou um processo descontínuo, como um processo em bateladas ou um processo de batelada alimentada. Um resumo referente à natureza geral de processos de fermentação está disponível no livro por H. Chmiel (Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, 2011), no livro de C. Ratledge e B. Kristiansen (Basic Biotechnology, Cambridge University Press, 2006) ou no livro de V.C. Hass e R. Portner (Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag, 2011).
[0158] No processo fermentativo, o Corynebacterium da invenção é cultivado em um meio adequado.
[0159] Um meio adequado usado para a produção de um produto químico fino por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário. Os componentes empregados no processo fermentativo também são denominados materiais de entrada na técnica.
[0160]
Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, um
Corynebacterium, preferencialmente
Corynebacterium glutamicum, que compreende o polinucleotídeo isolado da invenção e que tem a habilidade de excretar um produto químico fino é cultivado em um meio adequado para produzir e acumular o dito produto químico fino com o uso de uma fonte de carbono que compreende pelo menos um oligômero de a-D-glicose que consiste em pelo menos dois monômeros de glicose a-1-6-glicosidicamente ligados, como isomaltose e panose, preferencialmente contendo glicose e pelo menos um oligômero de glicose
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51/116 selecionado a partir de isomaltose e panose.
[0161] Em modalidades adicionais da invenção, a dita fonte de carbono contém glicose e isomaltose ou contém glicose e panose ou contém glicose, isomaltose e panose.
[0162] De acordo com as necessidades econômicas, uma fonte de carbono pode conter, ainda, outros compostos, além de glicose, isomaltose e panose, os quais são usados por Corynebacterium, preferencialmente Corynebacterium glutamicum, para crescimento e excreção e produção de produto químico fino. Esses compostos incluem açúcares como maltose, sacarose ou frutose ou ácidos orgânicos, como ácido láctico.
[0163] O teor de isomaltose na dita fonte de carbono é > 0,1 %, preferencialmente > 0,2 % por matéria seca. O teor de isomaltose na dita fonte de carbono não excede (<) 50 % por matéria seca, não excede (<) 40 % por matéria seca, não excede (<) 30 % por matéria seca, não excede (<) 20 % por matéria seca ou não excede (<) 10 % por matéria seca quando misturas de compostos que funcionam como fonte de carbono são alimentadas.
[0164] O teor de panose na dita fonte de carbono é de > 0,1 %, preferencialmente > 0,2 % por matéria seca. O teor de panose na dita fonte de carbono não excede (<) 50 % por matéria seca, não excede (<) 40 % por matéria seca, não excede (<) 30 % por matéria seca, não excede (<) 20 % por matéria seca ou não excede (<) 10 % por matéria seca quando misturas de compostos que funcionam como fonte de carbono são alimentadas.
[0165] O teor de glicose na dita fonte de carbono é de > 30 %, preferencialmente > 40 % por matéria seca, de modo
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52/116 particularmente preferencial > 50 % por matéria seca. O teor de glicose na dita fonte de carbono não excede (<) 99,9 % por matéria seca, não excede (<) 99,8 % por matéria seca, não excede (<) 99,6 % por matéria seca ou não excede (<) 99 % por matéria seca quando misturas de compostos que funcionam como fontes de carbono são alimentadas.
[0166] É evidente para uma pessoa de habilidade comum na técnica que a soma de todos os componentes na matéria seca que funcionam como fonte de carbono não excede 100 %.
[0167] Um exemplo de uma fonte de carbono contendo glicose e um oligômero de glicose selecionado a partir de isomaltose e panose são hidrolisados de amido.
[0168] Hidrolisados de amido são obtidos por hidrólise de amido tipicamente fabricado a partir de grãos de milho, trigo, cevada ou arroz ou dos tubérculos de batata ou raízes de mandioca. Devido ao regime de hidrólise de amido, vários produtos tipicamente com um componente principal, por exemplo, glicose ou maltose e diferentes subcomponentes, por exemplo, maltose, isomaltose, panose ou maltotriose, são obtidos.
[0169] Para o propósito desta invenção, um hidrolisado de amido é definido como o produto obtido por hidrólise, preferencialmente hidrólise enzimática, de amido fabricado a partir dos grãos de milho, trigo, cevada ou arroz ou dos tubérculos de batata ou raízes de mandioca, preferencialmente dos grãos de milho, trigo ou arroz e que tem a seguinte composição em matéria seca (peso em peso): glicose > 80 %, preferencialmente > 90 %, não excedendo (<) 99 % ou não excedendo (<) 98 %; isomaltose > 0,1 %, preferencialmente > 0,2 %, não excedendo (<) 4 %; panose >
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0,1 %, preferencialmente > 0,2 %, não excedendo (<) 3 %. O hidrolisado de amido usado para o propósito da presente invenção contém, ainda, tipicamente maltose a > 0,1 % ou > 0,2 % não excedendo (<) 5 % por matéria seca. Além disso, o hidrolisado de amido usado para o propósito da presente invenção pode conter outros oligômeros de glicose, bem como íons inorgânicos e proteínas. É evidente para uma pessoa de habilidade comum na técnica que a soma de todos os componentes na matéria seca não excede 100 %. A matéria seca de hidrolisados de amido líquidos comerciais está usualmente na faixa de 55 a 75 % (peso por peso). Ensinamentos referentes à análise de hidrolisados de amido podem ser encontrados em M.W. Kearsley e S.Z. Dziedzic (Handbook of Amido Hydrolysis Products and their Derivatives, Chapmann & Hall, 19 95) .
[0170] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.
[0171] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.
[0172] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.
[0173] Outros compostos orgânicos representam fatores de
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54/116 crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou
L-aminoácidos, por exemplo, Lhomoserina.
[0174]
Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.
[0175]
Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade do produto químico fino desejado suficiente para ser recuperado tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais
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55/116 longos de cultivo são possíveis.
[0176]
Exemplos de meios e condições de cultura adequados podem ser encontrados, entre outros, em L.
Eggeling e
M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum,
CRC Press,
2005) e nos documentos de patente US5770409,
US5990350,
US 5275940, US5763230
US6025169.
[0177]
Devido à habilidade do Corynebacterium da invenção de excretar e produzir produto químico fino no meio durante o processo fermentativo, a concentração do produto químico fino aumenta e se acumula no meio.
[0178]
Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém o produto químico fino desej ado, preferencialmente L-aminoácido.
Um produto contendo o produto químico fino é, então, recuperado em forma líquida ou sólida.
[0179]
Um caldo de fermentação significa um meio em que um Corynebacterium da invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.
[0180]
Quando o processo fermentativo é concluído, caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:
a) a biomassa (massa celular) do Corynebacterium da invenção, sendo que a dita biomassa foi produzida devido à propagação das células do dito Corynebacterium,
b) o desejado produto químico fino acumulado durante o processo fermentativo,
c) os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo e
d) os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.
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56/116 [0181] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pelo Corynebacterium da invenção durante o processo fermentativo além da produção do produto químico fino desejado.
[0182] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado quando adequado e usado para fornecer um produto contendo o produto químico fino, preferencialmente um produto contendo L-aminoácido, em forma líquida ou sólida. A expressão recuperar o produto contendo produto químico fino também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo produto químico fino, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.
[0183] O caldo de fermentação pode ser subsequentemente submetido a uma ou mais das medições selecionadas a partir do grupo que consiste em:
a) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou
quase completa (> 80 %, > 90 %, > %, > 95 %, > 96 %, > %, > 97 o, %,
> 98 %, > 99 %) da água,
b) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou
quase completa (> 80 %, > 90 %, > %, > 95 %, > 96 %, > %, > 97 o, %,
> 98 %, > 99 %) da biomassa, sendo que a última é opcionalmente inativada antes da remoção,
c) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou quase completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) dos subprodutos orgânicos formados durante o processo fermentativo, e
d) remoção parcial (>0 %) a completa (100 %) ou quase completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98
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57/116 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) dos componentes residuais do meio empregado ou dos materiais de entrada residuais resp., os quais não foram consumidos no processo fermentativo.
[0184] Uma grande quantidade de instruções técnicas para medições a), b), c) e d) está disponível na técnica.
[0185] A remoção de água (medição a) ) pode ser alcançada, entre outros, por evaporação, com o uso, por exemplo, de um evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou nanofiltração. Os concentrados então obtidos podem ser adicionalmente finalizados por secagem por aspersão ou granulação por aspersão. Do mesmo modo, é possível secar o caldo de fermentação diretamente com o uso de secagem por aspersão ou granulação por aspersão.
[0186] A remoção da biomassa (medição b)) pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.
[0187] A remoção dos subprodutos orgânicos (medição c)) ou remoção de componentes residuais do meio (medição d) pode ser alcançada, entre outros, por cromatografia, por exemplo, cromatografia por troca de íons, tratamento com carbono ativado ou cristalização. Caso os subprodutos orgânicos ou componentes residuais do meio estejam presentes no caldo de fermentação como sólidos, podem ser removidos pela medição b).
[0188] Instruções gerais sobre métodos de separação, purificação e granulação podem ser encontradas, entre outros, no livro de R. Ghosh Principles of Bioseperation Engineering” (World Scientific Publishing, 2006), o livro de F. J. Dechow Seperation and Purification Techniques in
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Biotechnology (Noyes Publications, 1989), o artigo Bioseparation de Shaeiwitz et al (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2012) e o livro de P. Serno et al Granulieren (Editio Cantor Verlag, 2007) .
[0189] Um esquema de processamento a jusante para produtos de L-lisina pode ser encontrado no artigo Llysine Production de R. Kelle et al (L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005)). O documento US5279744 ensina a fabricação de um produto de L-lisina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US4956471 ensina a fabricação de um produto de Lvalina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US5431933 ensina a fabricação de produtos de Laminoácido secos, por exemplo, um produto de L-lisina ou um produto de L-valina, contendo a maioria dos constituintes do caldo de fermentação.
[0190] Então, uma concentração ou purificação do produto químico fino desejado é alcançada e um produto que tem o teor desejado do dito produto químico fino é fornecido.
[0191] A análise de L-aminoácidos para determinar a concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se os L-aminoácidos por meio de cromatografia por troca de íons, preferencialmente cromatografia por troca de cátions, com derivatização póscoluna subsequente com o uso de ninhidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninhidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia por troca de íons pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic
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Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al.
(Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)) . A detecção realizada fotometricamente (absorção, fluorescência).
Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro
Bioanalytik por
Lottspeich e Zorbas (Spektrum
Heidelberg, Alemanha 1998)
Akademischer Verlag,
SEÇÃO EXPERIMENTAL A) MATERIAIS e MÉTODOS [0192]
Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.
1. Produtos químicos
a. IPTG (Isopropil e-D-1-tiogalactopiranosida) foi adquirida junto à Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha, Cat. n° 2316.4.)
b. Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus foi adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, Cat. n° K0254).
c. Sal de sódio de ácido nalidíxico foi adquirido junto à
Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, Cat. n° N4382).
d. Peptona de farinha de soja foi adquirida junto à Merck
KGaA (Darmstadt, Alemanha, Cat. n° 1.017212.0500).
e.Sal de hemicálcio de ácido propiônico (C3H5O2 x Ca)
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60/116 foi adquirida junto à Sigma Chemical CO. (St. Louis, EUA, Cat. n° P-2005).
f. SOLULYS® 048K - MILHOCINA (CSL) com um teor de substância seca entre 48 % e 52 % em peso foi adquirido junto à ROQUETTE AMERICA INC (Keokuk, IA, EUA).
g. Hidrolisado de amido Clearsweet® 95 % de Xarope de Milho com Dextrose Líquida Não Refinada foi adquirido junto à Cargill, Incorporated (Minneapolis, MN, EUA). Tem um teor de sólidos total de 70,5 - 71,5 % em peso.
h. Se não for declarado de outro modo, todos os outros produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).
2. Cultivo [0193] Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo / incubação foram realizados como descrito a seguir:
a. Caldo de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha, Cat. n° 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubada no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors AG (Bottmingen, Suíça) a 37 °C e 200 rpm.
b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha Cat. n° 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placa de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 37 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA).
c. Caldo de infusão cérebro-coração (BHI) da Merck
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61/116 (Darmstadt, Alemanha; Cat. n° 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubada no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors AG (Bottmingen, Suíça) a 33°C e 200 rpm.
d. Ágar cérebro-coração (ágar BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; Cat. n° 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).
3. Determinação de densidade óptica
a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburg, Alemanha).
b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação BioLector® (FlowerPlate® de 48 cavidades) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Mânnedorf, Suíça).
4. Centrifugação a Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml [0194] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R por 5 min a 13000 rpm.
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b.Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml [0195] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml FalconTM ) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4000 rpm.
5. Isolamento de DNA
a. O DNA plasmidial foi isolado de células de E. coli com o uso do Kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen (Hilden, Alemanha, Cat. n° 27106) seguindo as instruções do fabricante.
b. O isolamento de plasmídeo de C. glutamicum foi realizado com o mesmo kit descrito na seção a., porém as células foram pré-incubada em 600 pl de tampão P1 suplementado com 12,5 mg de lisozima e 10 U de mutanolisina (de Streptomyces globisporus ATCC 21553, Sigma Aldrich, St. Louis, EUA, Cat. n° M4782) por 2 h a 37 °C.
c.O DNA total de C. glutamicum foi isolado com o uso do método de Eikmanns et al. (Microbiology 140, 1817-1828,
1994) .
6. Síntese genética [0196] As moléculas de DNA foram sintetizadas pela empresa GeneArt (Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH,
Regensburg, Alemanha) com o uso do processo de sua propriedade GeneAssemble.
O método compreende de novo síntese de oligonucleotídeo e automontagem dos oligonucleotídeos complementares sobrepostos com amplificação por PCR subsequente. O método é resumido no
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63/116 artigo Rationales of Gene Design and De Novo Gene Construction” por Graf et al. in: Systems Biology and Synthetic Biology por P. Fu e S. Panke eds. (John Wiley, 411-438, 2009).
7. Reação em cadeia de polimerase (PCR)
a. Kit Taq PCR Core (Kit Taq) da Qiagen (Hilden, Alemanha, Cat. n° 201203) foi usado para amplificar um segmento desejado de DNA a fim de confirmar sua presença ou para verificação de sequência pelo método de Sanger. O kit foi usado de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 1).
Tabela 1: Condições de termociclagem para PCR com Kit Taq
PCR Core (Kit Taq) da Qiagen.
Programa PCR
Etapa Tempo [min] T [°C] Descrição
1 05 : 00 94 Etapa de desnaturação inicial
2 00:30 94 Etapa de desnaturação
3 00:30 50-57 Etapa de recozimento Aproximadamente 5 °C abaixo da Tm de iniciadores
4 00:30 72 Etapa de alongamento 1 min por kb de DNA
Repetir etapa 2 a 4: 30 x
5 04 : 00 72 Etapa de alongamento final
6 Aguardar 4 Etapa de resfriamento
b. SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) da Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-enLaye, France; n° de Cat. n° RR3 50A/B) foi usado como uma
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64/116 alternativa para confirmar a presença de um segmento desejado de DNA em células obtidas de colônias de E. coli ou C. glutamicum de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 2).
Tabela 2: Condições de termociclagem para PCR com SapphireAmp® Fast PCR Master Mix (Sapphire Mix) da Takara Bio Inc.
Programa PCR
Etapa Tempo [min] T [°C] Descrição
1 01: 00 94 Etapa de desnaturação inicial
2 00 : 05 98 Etapa de desnaturação
3 00 : 05 55 Etapa de recozimento
4 00:05 - 00:30 72 Etapa de alongamento: 10 s por kb de DNA
Repetir etapa 2 a 4: 30 x
5 04 : 00 72 Etapa de alongamento final
6 Aguardar 4 Etapa de resfriamento
c. Iniciador [0197] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) com o uso do método de fosforamidita descrito por McBride e Caruthers (Tetrahedron Lett. 24, 245-248, 1983) .
d. Modelo [0198] Como modelo de PCR, uma solução adequadamente diluída de DNA plasmidial isolado ou o DNA total contido em uma colônia foi usado (PCR de colônia). Para a dita PCR de colônia, o modelo foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e
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65/116 colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogerãte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, a mistura inicial de PCR de Takara Bio Inc foi adicionada ao modelo no tubo de reação de PCR.
e. Ciclizador de PCR [0199] PCRs foram realizadas em ciclizadores de PCR do tipo Mastercycler ou Mastercycler nexus gradient da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).
8. Digestão de enzima de restrição de DNA [0200] As endonucleases de restrição FastDigest (FD) e o tampão associado da ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA) foram usados para digestão de restrição de DNA plasmidial. As reações foram realizadas de acordo com as instruções do manual do fabricante.
9. Ligação de fragmentos de DNA [0201] Para ligação de DNA de vetor restrito com fragmentos de DNA desejados, a Ready-To-Go T4 DNA Ligase da Amersham Biosciences Corp (adquirida junto à GE Healthcare, Chalfont St Giles, Grã-Bretanha, Cat. n° 27036101) foi usada acordo com as instruções do fabricante.
10. Determinação do tamanho de fragmentos de DNA [0202] Dependendo do número e do tamanho dos fragmentos de DNA a serem investigados, eletroforese capilar automatizada ou eletroforese em gel de agarose foi usada: a. Eletroforese capilar [0203] O tamanho de fragmentos de DNA foi determinado por eletroforese capilar automatizada com o uso do QIAxcel da Qiagen (Hilden, Alemanha).
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b. Eletroforese em gel de agarose [0204] Para separar fragmentos de DNA após digestão de restrição ou PCR, géis de agarose com agarose a 0,8 % (Biozym LE Agarose, Hess. Oldendorf, Alemanha) em 1x TAE (tampão de Tris-Acetato-EDTA; Solução de estoque: 50 x tampão de TAE (Applichem, Darmstadt, Alemanha)) foram usados. A separação foi realizada com equipamento de eletroforese Mini-sub Cell GT da BioRad (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemanha) a 100 V por 45 min. O O'GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo scientific, Schwerte, Alemanha) foi usado como uma referência para determinar o tamanho do fragmento. Após 20 min, a incubação do gel em um banho de cor contendo corante de ácido nucleico GelRedTM da Biotrend (Cologne, Alemanha. Diluição de acordo com o produtor: 1:10000) os fragmentos de DNA foram visualizados por radiação UV com o uso de um Gel iX20 Imager da Intas (Gottingen, Alemanha).
11. Purificação de amplificados de PCR e fragmentos de restrição [0205] Os amplificados de PCR e fragmentos de restrição foram limpos com o uso do QIAquick PCR Purification Kit da Qiagen (Hilden, Alemanha, Cat. n° 28106), acordo com as instruções do fabricante.
[0206] Após eletroforese em gel e excisão do fragmento de DNA desejado, o Qiagen MinElute Gel Extraction Kit (Hilden, Alemanha, Cat. n° 28604) foi usado acordo com as instruções do fabricante.
12. Determinação de concentração de DNA [0207] A concentração de DNA foi medida com o uso do Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 da PEQLAB Biotechnologie
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GmbH, desde 2015 com a marca VWR (Erlangen, Alemanha).
13. Montagem de Gibson [0208] Vetores de expressão e integração foram feitos com o uso do método de Gibson et al. (Science 319, 1215—20, 2008) . O Kit de Montagem de Gibson da New England BioLabs Inc. (Ipswich, EUA, Cat. n° E2611) foi usado para esse propósito. A mistura de reação, contendo o vetor restrito e pelo menos um inserto de DNA, foi incubada a 50 °C por 60 min. 0,5 pl da mistura de Montagem foram usados para um experimento de transformação.
14. Transformação química de E. coli
a. Células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes foram adquiridas junto à Clontech Laboratories Inc. (Mountain View, EUA, Cat. n° 636763) e transformadas de acordo com o protocolo do fabricante (PT5055-2).
[0209] Essas células foram usadas como hospedeiros de transformação para misturas de reação após Montagem de Gibson. As bateladas de transformação foram cultivadas de um dia para o outro por aproximadamente 18 h a 37 °C e os transformantes contendo plasmídeos foram selecionados em ágar de LB suplementado com 50 mg/l de canamicina.
b. A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos com base em pK18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC47055.
[0210] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco de
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Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 pl suspensão bacteriana de cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 pl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 30 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 pl e armazenada a -80 °C.
[0211] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.
15. Transformação de C. glutamicum por eletroporação [0212] Os vetores plasmidiais com base em pVWEx1 foram transferidos para células de C. glutamicum com o uso de um método de eletroporação modificada por Van der Rest et al. (Appl Microbiol Biotechnol 52, 541-545, 1999).
[0213] Para produzir células competentes de C. glutamicum, as cepas foram propagadas em meio de BHIS (37 g/l de BHI, 91 g/l de sorbitol (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA)) por uma pré-cultura e uma cultura principal subsequente. A pré-cultura consistia em 10 ml de meio de BHIS contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3
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69/116 defletores. Foi inoculada com 100 μΐ de uma cultura de estoque de glicerol e incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 33 °C e 200 rpm. A cultura principal consistia em 250 ml de meio de BHIS contido em um frasco Erlenmeyer de 1 l com 4 defletores. Foi inoculada com 5 ml da pré-cultura e incubada por 4 h a 33 °C e 150 rpm a um OD600 de aprox. 1,8.
[0214] A etapas de trabalho a seguir foram realizadas no gelo com o uso de tampões estéreis gelados ou soluções resp. A cultura principal foi centrifugada por 20 min a 4 °C e 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado, o pélete celular ressuspenso em 2 ml de tampão TG (Tris(hidroximetil)-aminometano 1 mM, glicerol a 10 %, ajustado a pH 7,5 com HCl) e mais 2 0 ml de tampão TG adicionado à suspensão celular. Essa etapa de lavagem foi repetida duas vezes. As ditas etapas de lavagem foram sucedidas por mais duas etapas de lavagem em que o tampão TG foi substituído por uma solução de glicerol a 10 % (v/v). Após a etapa de centrifugação final, 2 ml de glicerol a 10 % (v/v) foram adicionados ao pélete celular. A suspensão celular obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 100 μl e armazenada a -80 °C.
[0215] A eletroporação das cepas de C. glutamicum foi realizada como descrito por Van der Rest et al. Desviando desse procedimento, a temperatura de cultivo era de 33 °C e o meio para culturas de placa de ágar era ágar de BHI. Transformantes foram selecionados em placas de ágar de BHI suplementadas com 25 mg/l de canamicina.
16. Conjugação de C. glutamicum [0216] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por
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Schâfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossoma de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schâfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.
[0217] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes resultantes de um primeiro evento de recombinação foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 3), a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.
Tabela 3: Composição do ágar de EM8.
Componentes Concentração (g/l)
Glicose (estéril-filtrada) 23
CSL (milhocina) 30
Peptona de farinha de soja (Merck, Alemanha) 40
(NHJ2SO4 8
Ureia 3
KH2PO4 4
MgSO4 · 7 H2O 0,5
FeSO4 · 7 H2O 0,01
CuSO4 · 5 H2O 0,001
ZnSO4 · 7 H2O 0,01
Pantotenato de cálcio, D(+) 0,01
Tiamina 0,001
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Componentes Concentração (g/l)
Inositol 0,1
Ácido nicotínico 0,001
Biotina (estéril-filtrada) 0,005
CaCO3 (autoclavada separadamente) 1,6
Ágar-Ágar (Merck, Alemanha) 14
[0218] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Para isolar clones que encontraram um segundo evento de recombinação, uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 pl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. A colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para a fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferilo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones de transconjugante que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado no cromossoma por meio de PCR.
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17. Determinação de sequências de nucleotídeos [0219] Sequências de nucleotídeos de moléculas de DNA foram determinadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) por sequenciamento de ciclo, com o uso do método de terminação de cadeia de didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 74, 5463 - 5467, 1977), em Analisadores de DNA 3730xl da Applied Biosystems® (Carlsbad, CA, EUA) . O software Clonemanager Professional 9 da Scientific & Educational Software (Denver, EUA) foi usado para visualizar e avaliar as sequências.
18. Estoques de glicerol de cepas de E.coli e C. glutamicum [0220] Para um armazenamento de longo período de cepas de E.coli- e C. glutamicum, estoque de glicerol foram preparados. Os clones de E. coli selecionados foram cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi,
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73/116 então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.
19. Sistema de cultivo BioLector® [0221] O sistema de microfermentação BioLector® (m2p labs GmbH, Baseweiler, Alemanha) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas.
[0222] Para esse propósito, uma FlowerPlate® de 48 cavidades (m2p labs GmbH, Baseweiler, Alemanha, Cat. n° MTP-48-BO) preenchida com 1 ml de meio por cavidade foi usada. As cavidades da FlowerPlate® são equipadas com um optodo para analisar o teor de oxigênio dissolvido do líquido. O BioLector® é adicionalmente equipado com um dispositivo óptico para medir a intensidade de luz difusa causada pelas partículas de célula de uma cultura microbiana contida em uma cavidade de uma FlowerPlate®. Esse denominado sinal retrodifundido (Samorski et al., Biotechnol Bioeng. 92(1):61-8, 2005) é correlacionado à concentração das partículas de célula. Permite um rastreamento online não invasivo do crescimento de uma cultura microbiana.
[0223] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. No caso de cepas contendo plasmídeo (pVWEx1 e derivados do mesmo), o meio foi suplementado com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.
[0224] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.
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74/116 [0225] As culturas principais foram feitas inoculando-se as cavidades contendo 1 ml de meio da FlowerPlate® de 48 cavidades com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.
[0226] Como meio para a cultura principal, modificações do meio de CGXII descrito por Keilhauer et al. (J. Bacteriol. 1993 Sep; 175(17): 5595-5603) foram usadas. Por conveniência, a composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 4.
Tabela 4: Composição do meio de CGXII de Keilhauer.
Componentes Concentração (g/l)
MOPS (ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico) 42
(NH4)2SO4 20
Ureia 5
KH2PO4 1
K2HPO4 1
MgSO4 · 7 H2O 0,25
CaCl2 0,01
FeSO4 · 7 H2O 0,01
MnSO4 H2O 0,01
ZnSO4 · 7 H2O 0,001
CuSO4 · 5 H2O 0,0002
NiCl2 6 H2O 0,00002
Biotina (estéril-filtrada) 0,0002
Ácido protocatecuico (estérilfiltrado) 0,03
Fonte de carbono (estéril-filtrado) variável]
ajustar o pH a 7 com NaOH
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75/116 [0227] O meio denominado CGXII_CSL contém adicionalmente licor de milhocina a uma concentração de 7,5 g/l. O meio denominado CGXII_YE contém adicionalmente extrato de levedura a uma concentração de 7,5 g/l.
[0228] No caso de cepas contendo plasmídeo (pVWEx1 e derivados do mesmo), o meio foi adicionalmente suplementado com 25 mg/l de canamicina e IPTG 0,3 mM para induzir expressão pelo promotor de PtacI.
[0229] Essas culturas principais foram incubadas por até 48 h a 33 °C e 800 rpm no sistema BioLector® até o consumo completo de glicose.
[0230] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).
[0231] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de cavidade profunda. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, por exemplo, L-lisina ou L-valina, e da fonte de carbono residual, como panose, foi analisada no sobrenadante.
20. Cultivo em frascos de 2 l [0232] A produção de L-lisina com o uso de hidrolisado de amido como fonte de carbono foi feita em frascos de 2 l como a seguir:
[0233] Pré-culturas das cepas de C. glutamicum foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de
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76/116 estoque de glicerol. A cultura foi, então, incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm. Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.
[0234] As culturas principais foram feitas inoculando-se 200 ml de meio contendo hidrolisado de amido (esterilizado separadamente em um esterilizador contínuo) como fonte de carbono contido em frascos Erlenmeyer de 2 l que têm 4 defletores com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,5. As culturas foram incubadas por 57 h s 33 °C e 150 rpm.
21. Analisador de aminoácido [0235] A concentração de L-lisina e outros Laminoácidos, por exemplo, L-valina, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia por troca de íons com o uso de um analisador de aminoácido SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninhidrina através
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77/116 de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.
22. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS) [0236] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-FosfatoDesidrogenase) por formação de NADH.
23. Análise de panose e isomaltose [0237] Um sistema compacto de CLAE (cromatografia líquida de alta pressão) da Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, EUA) foi usado para determinar a concentração de panose e isomaltose no sobrenadante de uma cultura. A separação é realizada por cromatografia de partição em um gel de sílica amino-modificado com característica de troca de íons (YMC Poliamina II S-5pm Coluna de Amino 250*4,6 mm; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) com um eluente composto por 30 % de água e 70 % de acetonitrila (v/v). A detecção ocorre por meio de um detector de RI (índice de refração) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA).
24. Preparação de um sobrenadante de cultura para análise da proteína de fusão a-1,6-glicosidase secretada [0238] A pré-cultura da cepa de C. glutamicum foi feita em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 pl de uma cultura de estoque de glicerol. A cultura
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78/116 foi, então, incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.
[0239] Após o dito período de incubação, a densidade óptica OD600 da pré-cultura foi determinada.
[0240] As culturas principais consistiam em 2x 50 ml de meio de CGXII_CSL (consultar tabela 5), suplementado com 25 mg/l de canamicina e IPTG 0,3 mM contido em frascos Erlenmeyer de 500 ml com 4 defletores. Foi inoculado com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,8 e incubada por 24 h a 33 °C e 150 rpm.
[0241] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das culturas principais eram 41. As culturas foram centrifugadas por 10 min a 4000 rpm. O sobrenadante obtido foi filtrado com um Filtro de Seringa de Alto Fluxo Minisart® (0,22 pm) da Sartorius (Gottingen, Alemanha, Cat. n° 16532) . O filtrado foi concentrado por meio de uma unidade de Filtro para Centrífuga Amicon Ultra - 15 (30K) da Merck Millipore Ltd. (Cork, Irlanda, Cat. n° UFC903024) para aumentar o teor de proteína. Para tanto, o sobrenadante (12 ml no máx.) foi pipetado sobre o dispositivo de filtro e colocado no tubo de centrífuga fornecido. A unidade de filtro de centrífuga foi centrifugada por 45 min a 10 °C e 4000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante na unidade de filtro foi pipetado em um tubo separado.
[0242] O teor de proteína do concentrado foi determinado de acordo com Bradford (Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976) com o uso do Reagente de Corante de Ensaio de Proteína BioRad da BioRad (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemanha, Cat. n° 5000006) de acordo com as instruções do fabricante. Como soro bovino padrão, albumina foi usada. A concentração
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79/116 de proteína no concentrado era de 0,8 mg/ml.
25. Detecção do sítio de clivagem da proteína de fusão [0243] O sobrenadante de uma cultura celular que expressa polipeptídeo de fusão foi investigado por LC-MS (cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa) com o uso de ionização por eletroaspersão (electrospray) (ESI). Como instrumento, um Accela 1250 UPLC acoplado a Orbitrap elite da Thermo Fisher (Scientific Inc., Waltham, EUA) com um Poroshell SB300-C18, coluna de 75 x 2,1 mm da Agilent (Santa Clara, EUA) foi usado. Como eluente A, uma solução aquosa de TFA (ácido trifluoroacético) a 0,1 % e, como eluente B, TFA a 0,1 % dissolvido em Acetonitrila/1Propanol (60/40) foi usada. Para separação, o gradiente mostrado na tabela 5 foi usado com uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min a 70 °C. Antes da medição, a amostra foi diluída 1:20 em tampão aquoso de Tris 50 mM (pH 7,5). O volume de injeção da amostra era de 15 pl.
Tabela 5: Gradiente de eluição.
Tempo [min] % de eluente A % de eluente B
0 100 0
1 100 0
2 80 20
17 35 65
20 5 95
25 5 95
26 100 0
35 100 0
[0244] Com o uso do método de ESI, proteínas são ionizadas como múltiplos íons moleculares protonados
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80/116 [M+nH]n+. Isso permite a detecção até mesmo de compostos com alto peso molecular em uma janela de faixa de massa limitada. O peso molecular da proteína não carregada pode ser recalculado pelo software de deconvolução de carga Promass 2.8 para Xcalibur da Novatia, LLC (New Jersey, EUA). As frações de proteína eluem na área de tempo de retenção entre 8 e 12 min.
26. Medição de atividade enzimática de a-1,6-glicosidase [0245] A atividade de a-1,6-glicosidase em sobrenadantes de cultura foi determinada com o uso de para-nitrofenil-αglicosídeo como substrato cromogênico como descrito por Deng et al. (FEBS Open Bio 4, 200 - 212, 2014) .
[0246] Os sobrenadantes de cultura usados para o ensaio foram preparados por centrifugação das culturas e filtração subsequente dos sobrenadantes com o uso de um Filtro de Seringa de Alto Fluxo Minisart® (0,22 pm) da Sartorius (Gottingen, Alemanha, Cat. n° 16532) .
[0247] O ensaio foi realizado a 34 °C em uma mistura de reação que tem um volume final de 1500 pl. 750 pl de tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7), 150 pl de 10 mg/ml de BSA (soro bovino albumina) e 150 pl de para-nitrofenil-αglicosídeo 40 mM foram pipetados em um tubo de reação e a reação foi iniciada com a adição de 450 pl de sobrenadante de cultura. Após 2, 4, 6 e 8 minutos, amostras de 200 pl foram removidas da mistura de reação e pipetadas sobre 800 pl de uma solução de carbonato de sódio 1 M. A concentração de p-nitrofenol foi determinada a 405 nm com o uso de um espectrofotômetro U-3200 da Hitachi Scientific Instruments (Nissel Sangyo GmbH, Düsseldorf, Alemanha). O coeficiente de extinção molar para p-nitrofenol foi determinado como ε=
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17,6 cm2/ mmol a 405 nm em uma solução de carbonato de sódio 0,8 M que tem pH 11 e a 34 °C. Uma unidade (U) é definida como a quantidade de enzima que catalisa a conversão de 1 pmol de substrato por min.
B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Exemplo 1
Identificação de uma a-1,6-glicosidase adequada
Exemplo 1.1
Projeto experimental [0248] Genes de diferentes origens que codificam glicosidases que hidrolisam ligações α-1,6 em oligômeros de glicose foram testados quanto à sua habilidade de conferir a característica de degradação de panose a C. glutamicum. Os detalhes bibliográficos dos genes estão resumidos na tabela 6.
Tabela 6: Origem de funções de a-1,6-glicosidase testadas e peptídeo sinal de Tat usado.
origem designação de gene/cds acesso em NCBI outra referência descrição
Bifidobacterium breve UCC2003 agl2 FJ386390 Pokusaeva et al . 1 a-1,6- glicosidase
Bifidobacterium breve UCC2003 agl1 FJ386389 Pokusaeva et al . 1 a-1,6- glicosidase
Saccharomyces cerevisiae S288c IMA1 NC_001139; locus tag: YGR287C oligo-1,6glicosidase IMA1
Bacillus subtilis HB002 AY008307.1 oligo-1,6glicosidase
Corynebacterium cg0955 NC_006958 1; Breitinger2 Cg0955
glutamicum old_locus_ tag:
ATCC13032 cg0955 3
1 (Applied and Environmental Microbiology 75, 1135-1143,
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2009) 2 (Dissertation Ulm University 2013) 3 (locus_tag: CGTRNA_RS04205); sob o número de acesso NC_003450.3; o mesmo cds está disponível sob locus_tag NCgl0801) [0249] Em essência, as sequências de codificação dos genes listados na tabela 6 que codificam polipeptídeos que fornecem a função enzimática foram adaptadas para o uso de códon de Corynebacterium glutamicum (cuo = com otimização de uso de códon) e fundidas à sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinal de Tat de Cg0955 descrito por Breitinger (Dissertation Ulm University 2013). A sequência de aminoácidos do peptídeo sinal de Tat de Cg0955 e a sequência de nucleotídeos que a codifica são mostradas na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:1 da listagem de sequências. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de fusão resultantes foram clonados no vetor de expressão pVWEx1 descrito por Peters-Wendisch et al. (Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 3, 295 - 300, 2001) . A sequência de nucleotídeos de pVWEx1 está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso MF034723. Um mapa de plasmídeo pVWEx1 é mostrado na figura 1.
[0250] Uma cepa produtora de L-lisina de Corynebacterium glutamicum foi transformada com os vetores de expressão construídos e os transformantes resultantes foram testados quanto à sua habilidade de degradar panose.
Exemplo 1.2
Projeto e síntese das fusões de gene [0251] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de fusão foram projetados e sintetizados com
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83/116 um sítio de restrição de endonuclease PstI (CTGCAG) na extremidade 5' e o terminador transcricional Tgap* (consultar SEQ ID NO:13) e um sítio de restrição de endonuclease BamHI (GGATCC) na extremidade 3' da sequência de nucleotídeos. Os sítios de restrição PstI e BamHI permitem a clonagem no vetor do tipo ponte pVWEx1 de E. coli - C. glutamicum.
Fusão de gene tat-'agl2_cuo:
[0252] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo sintetizado e contendo a sequência de codificação da fusão de gene tat-'agl2_cuo é mostrada na SEQ ID NO:21. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão Tat-'Agl2 é mostrada na SEQ ID NO:22. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 1 a 33 é idêntica à sequência de aminoácidos de Cg0955 mostrada na SEQ ID NO:2 da posição 1-33. Essa parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão também é denominada peptídeo sinal de Tat no N-terminal.
[0253] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:22 é idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Agl2 mostrado na SEQ ID NO:6 da posição 2-604. A ausência do aminoácido de partida metionina (Met) de Agl2 no polipeptídeo de fusão é indicada pela ' na designação do polipeptídeo de fusão.
[0254] O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão ('agl2_cuo) mostrado na SEQ ID NO:21 posição 122 a 1930 é de 58,2 %. O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Agl2 de Bifidobacterium breve UCC2003 sem o códon de início atg
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84/116 ('agl2) mostrado na SEQ ID NO:5 posição 4 a 1812 é de 65,6 o, % .
[0255] O polinucleotídeo tat-‘agl2_cuo mostrado na SEQ ID NO:21 foi clonado no vetor do tipo ponte pVWEx1. Para esse propósito, o polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO:21 foi cortado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI e ligado no vetor tratado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI. O plasmídeo obtido foi denominado pVWEx1_tat‘agl2_cuo. Um mapa de plasmídeo pVWEx1_tat-‘agl2_cuo é mostrado na figura 2.
Fusão de gene tat-agl1_cuo:
[0256] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo sintetizado e contendo a sequência de codificação da fusão de gene tat-agl1_cuo é mostrada na SEQ ID NO:23. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão Tat-Agl1 é mostrada na SEQ ID NO:24. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 1 a 33 é idêntica à sequência de aminoácidos de Cg0955 mostrada na SEQ ID NO:2 da posição 1-33. Essa parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão também é denominada peptídeo sinal de Tat no N-terminal.
[0257] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:24 é idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo Agl1 mostrado na SEQ ID NO:8.
[0258] O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão (agl1_cuo) mostrado na SEQ ID NO:23 posição 122 a 1942 é de 58,1 %. O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo Agl1 de
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Bifidobacterium breve UCC2003 (agll) mostrado na SEQ ID NO:7 posição 1 a 1821 é de 58,6 %.
[0259] O polinucleotídeo tat-agl1_cuo mostrado na SEQ ID NO:23 foi clonado no vetor do tipo ponte pVWEx1. Para esse propósito, o polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO:23 foi cortado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI e ligado no vetor tratado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI. O plasmídeo obtido foi denominado pVWEx1_tatagl1_cuo.
Fusão de gene tat-'IMA1_cuo:
[0260] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo sintetizado e contendo a sequência de codificação da fusão de gene tat-'IMA1_cuo é mostrada na SEQ ID NO:25. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão Tat-'IMA1 é mostrada na SEQ ID NO:26. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 1 a 33 é idêntica à sequência de aminoácidos de Cg0955 mostrada na SEQ ID NO:2 da posição 1-33. Essa parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão também é denominada peptídeo sinal de Tat no N-terminal.
[0261] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 37 a 624 de SEQ ID NO:26 é idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo IMA1 mostrado sob o número de acesso NP_11803 da posição 2-589. A ausência do aminoácido de partida metionina (Met) de IMA1 no polipeptídeo de fusão é indicada pela ' na designação do polipeptídeo de fusão.
[0262] O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão ('IMA1_cuo) mostrado na SEQ ID NO:25 posição 122 a
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1885 é de 53,2 %. O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo IMA1 de Saccharomyces cerevisiae S288c sem o códon de partida atg ('IMA1) é de 42,4 %.
[0263] O polinucleotídeo tat-‘IMA1_cuo mostrado na SEQ ID NO:25 foi clonado no vetor do tipo ponte pVWEx1. Para esse propósito, o polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO:25 foi cortado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI e ligado no vetor tratado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI. O plasmídeo obtido foi denominado pVWEx1_tat‘IMA1_cuo.
Fusão de gene tat-'AY008307_cuo:
[0264] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo sintetizado e contendo a sequência de codificação da fusão de gene tat-'AY008307_cuo é mostrada na SEQ ID NO:27. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão Tat'AY008307 é mostrada na SEQ ID NO:28. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 1 a 33 é idêntica à sequência de aminoácidos de Cg0955 mostrada na SEQ ID NO:2 da posição 1-33. Essa parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão também é denominada peptídeo sinal de Tat no N-terminal.
[0265] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão das posições 37 a 596 de SEQ ID NO:28 é idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de oligo-1,6glicosidase mostrado sob o número de acesso AAG23399 da posição 2-561. A ausência do aminoácido de partida metionina (Met) no polipeptídeo de fusão é indicada pela ' na designação do polipeptídeo de fusão.
[0266] O teor de G + C da sequência de nucleotídeos que
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87/116 codifica o polipeptídeo no C-terminal do polipeptídeo de fusão ('AY008307_cuo) mostrado a 1801 é de 53,1 %. O teor nucleotídeos que codifica o Bacillus subtilis HB002 sem ('AY008307) é de 44,0 %.
na SEQ ID NO: 27 posição 122
de G + C da sequência de
polipeptídeo AY008307 de
o códon de partida atg
[0267]
O polinucleotídeo tat-'AY008307_cuo mostrado na
SEQ ID NO:27 foi clonado no vetor do tipo ponte pVWEx1.
Para esse propósito, o polinucleotídeo mostrado na SEQ ID
NO:27 foi cortado com as endonucleases de restrição PstI e
BamHI e ligado no vetor tratado com as endonucleases de restrição PstI e BamHI. O plasmídeo obtido foi denominado pVWEx1_tat-'AY008307_cuo.
Gene agl2_cuo:
[0268] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo contendo a sequência de codificação do gene agl2_cuo é mostrada na SEQ ID NO:29 e a sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo Agl2 é mostrada na SEQ ID NO:30. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo das posições 1 a 604 é idêntica à sequência de aminoácidos de Agl2 mostrada na SEQ ID NO:6 da posição 1 a 604. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:30 das posições 2 a 604 é idêntica à sequência de aminoácidos da proteína de fusão Tat-Agl2 mostrada na SEQ ID NO:10 da posição 37 a 639.
[0269] Para mostrar o efeito do peptídeo sinal de Tat na secreção de enzima ou degradação de panose resp., um plasmídeo de controle contendo a sequência de codificação completa do gene agl2_cuo, mas sem uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinal, foi projetado
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88/116 e construído. Esse plasmídeo de controle foi denominado pVWEx1_agl2_cuo.
[0270] Para esse propósito, o polinucleotídeo Wo_tat mostrado na SEQ ID NO:31 foi projetado e sintetizado.
[0271] Wo_tat contém, da extremidade 5' à extremidade 3', o sítio de reconhecimento para uma endonuclease MauBI, o promotor de PtacI, sítios de reconhecimento para as endonucleases PstI e SexAI e a extremidade 5' da sequência de codificação de agl2_cuo incluindo o sítio de reconhecimento para a endonuclease FspAI (consultar SEQ ID NO:21). A dita extremidade 5' da sequência de codificação de agl2_cuo consiste na sequência de nucleotídeos da posição 14 a 77 de SEQ ID NO:29 que codifica os primeiros 21 aminoácidos no N-terminal do polipeptídeo Agl2, incluindo o aminoácido de partida metionina.
[0272] O plasmídeo pVWEx1_agl2_cuo foi construído como a seguir: O plasmídeo pVWEx1_tat-‘agl2_cuo (consultar figura 2) foi digerido com as endonucleases de restrição MauBI e FspI. Então, dois fragmentos de DNA foram obtidos. Um fragmento de DNA de 473 bps de comprimento que compreende o promotor de PtacI e a extremidade 5' da fusão de gene tat‘agl2_cuo que codifica essencialmente o peptídeo sinal de Tat (marcado como tat na figura 2) e um segundo fragmento de DNA de 10116 bps de comprimento que compreende a sequência de pVWEx1 e a extremidade 3' da fusão de gene tat-‘agl2_cuo que codifica essencialmente a α-1,6 glicosidase Agl2 (marcada como 'agl2_cuo na figura 2). Os dois fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose. O fragmento de DNA de 473 bps foi descartado e o fragmento de DNA de 10116 bps foi isolado do
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89/116 gel de agarose e purificado. O polinucleotídeo Wo_tat também foi tratado com as endonucleases de restrição MauBI e FspAI e purificado. Os dois fragmentos de DNA então preparados foram ligados e a mistura de ligação foi usada para transformar células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes. A sequência de nucleotídeos de agl2_cuo (também mostrada na SEQ ID NO:29) no plasmídeo isolado de um transformante foi confirmada com o uso do método de sequenciamento de Sanger.
[0273] Então, o plasmídeo pVWEx1_agl2_cuo foi obtido. Seu mapa é mostrado na figura 3.
Exemplo 1.3
Construção de cepa [0274] Como hospedeiro para avaliar a habilidade das fusões de gene construído para conferir a habilidade de degradação de panose à espécie C. glutamicum, a cepa DM1933 foi escolhida.
[0275] A cepa DM1933 é um produtor de L-lisina descrito por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste sob o número de acesso DSM25442.
[0276] A cepa DM1933 foi transformada com DNA plasmidial isolado de pVWEx1, pVWEx1_tat-'agl2_cuo, pVWEx1_tatagl1_cuo, pVWEx1_tat-'IMA1_cuo, pVWEx1_tat-'AY008307_cuo e pVWEx1_agl2_cuo por eletroporação. A seleção para transformantes, a propagação dos transformantes e a preparação de culturas de estoque de glicerol foram feitas como descrito sob materiais e métodos e na presença de canamicina.
[0277] As sequências de nucleotídeos específicas dos
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90/116 transformantes foram amplificadas por PCR de colônia a fim de verificar a situação de plasmídeo dos transformantes. Os iniciadores usados e o tamanho dos amplificados de PCR estão resumidos na tabela 7.
Tabela 7: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificados durante a análise por PCR de transformantes.
Análise por PCR
plasmídeo iniciador sequência tamanho [bp]
pVWEX1 pVW_2 TTTGCGCCGACATCATAACG 327
pVW_3 TACTGCCGCCAGGCAAATTC
pVWEx1 tat- 'agl2 cuo pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 328
gluc rev GTAGCCGTTATCATCCTGTG
pVWEx1 tat- agl1 cuo pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 439
gluc rev GTAGCCGTTATCATCCTGTG
pVWEx1 tat- 'IMA1 cuo pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 184
gluc2 rev TGCTCCAAGGGCGTTGGCCTTTG
pVWEx1 tat'AY008307_cuo pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 376
gluc rev GTAGCCGTTATCATCCTGTG
pVWEx1 agl2 cuo pVW_2 TTTGCGCCGACATCATAACG 413
gluc rev GTAGCCGTTATCATCCTGTG
[0278] Para PCR, o kit Taq (consultar tabela 1) foi usado cp, a temperatura da etapa de recozimento (etapa 3) definida a 53 °C e o tempo da etapa de alongamento (etapa 4) definido a 13 s. A determinação de tamanho dos amplificados foi realizada por eletroforese capilar.
[0279] As sequências de nucleotídeos dos iniciadores usados também são mostradas na listagem de sequências sob SEQ ID NO:33 a SEQ ID NO:37.
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91/116 [0280] Os transformantes então obtidos e analisados foram usados para investigação adicional.
Exemplo 1.4
Degradação de panose [0281] Os transformantes do exemplo 1.3 foram analisados quanto à sua habilidade de degradar panose por cultivo em batelada com o uso do sistema de BioLector®.
[0282] Como meio, CGXII_CSL contendo 15 g/l de glicose e 4,8 g/l de panose como fonte de carbono foi usado. O meio foi adicionalmente suplementado com canamicina e IPTG. As culturas foram incubadas por cerca de 20 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as densidades ópticas das culturas e a concentração de panose residual determinada.
[0283] O resultado do experimento é apresentado na tabela 8 e mostra que as a-1,6-glicosidases Agl1 e Agl2 fundidas ao peptídeo sinal de Tat de Cg0955, isto é, TatAgl1 e Tat-'Agl2, eram capazes de conferir a característica de degradação de panose a C. glutamicum, sendo que Tat'Agl2 é superior a Tat-Agl1.
Tabela 8: Degradação de panose por diferentes transformantes de DM1933 que expressam diferentes α-1,6glicosidases fundidas ao peptídeo sinal de Cg0955.
Cepa (DM1933 transformada com) Panose residual (g/l) Panose degradada (%) OD6 6 0
pVWEx1 4,8 0 6,4
pVWEx1 tat-'agl2 cuo 0,3 94 6,7
pVWEx1 tat-agl1 cuo 1,1 77 7,3
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Cepa (DM1933 transformada com) Panose residual (g/l) Panose degradada (%) OD6 6 0
pVWEx1 tat-'IMA1 cuo 4,7 2 6,4
pVWEx1_tat-'AY008307_cuo 4,6 4 6,6
pVWEx1 agl2 cuo 4,8 0 6,5
Exemplo 2
Identificação de um peptídeo sinal adequado
Exemplo 2.1
Projeto experimental [0284] Os peptídeos sinais de secreção de Tat de várias proteínas secretadas de C. glutamicum foram testados quanto à sua habilidade de direcionar a secreção da α-1,6glicosidase Agl2 para o sobrenadante de uma cultura de C. glutamicum.
[0285] Watanabe et al. (Microbiology 155, 741-750, 2009) avaliaram a eficiência de diferentes peptídeos sinais de Tat de C. glutamicum R para direcionar a α-amilase de Geobacillus stearothermophilus desprovida de seu peptídeo sinal natural para o sobrenadante de uma cultura de C. glutamicum R com o uso de um ensaio de difusão de placa de ágar. Consultar figura 3 na página 745 de Watanabe et al.
[0286] Em uma abordagem similar, os peptídeos sinais de polipeptídeos CgR0079, CgR0120, CgR0124, CgR0900, CgR0949,
CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2627 e CgR2926 foram avaliados quanto à sua habilidade de direcionar a α-1,6glicosidase Agl2 de B. breve UCC2003 para o sobrenadante de uma cultura de C. glutamicum medindo-se a degradação de panose no sobrenadante de cultura. Consequentemente, a
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93/116 codificação de sequências de nucleotídeos para os peptídeos sinais dos ditos polipeptídeos foram fundidas ao gene agl2 com otimização de uso de códon de C. glutamicum ('agl2_cuo).
[0287] As sequências de nucleotídeos que codificam os polipeptídeos e as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos estão disponíveis no NCBI sob número de acesso de GenBank NC_009342 (genoma completo de C. glutamicum R). Em particular, podem ser identificadas sob as antigas etiquetas de identificação cgR_0079, cgR_0120, cgR_0124, cgR_0900, cgR_0949, cgR_1023, cgR_1448, cgR_2137, cgR_2627 e cgR_2926. A sequência de codificação de cgR0949 ou cgR_0949 resp também é mostrada na SEQ ID NO:3 da listagem de sequências.
Exemplo 2.2
Projeto e síntese das fusões de gene [0288] Como o ponto de partida para a construção das diferentes fusões de gene, o plasmídeo pVWEx1_tat-'agl2_cuo foi usado. A sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinal de tat de Cg0955 (etiqueta de localização atual NCgl0801) contida no plasmídeo foi substituída por uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinal de CgR0079, CgR0120, CgR0124, CgR0900, CgR0949, CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2627 ou CgR2926.
[0289] Para esse propósito, o plasmídeo pVWEx1_tat'agl2_cuo (consultar figura 2) foi digerido com as endonucleases de restrição SexAI e SpeI. Então, dois fragmentos de DNA foram obtidos. Um fragmento de DNA de 109 bps de comprimento que codifica o peptídeo sinal e um segundo fragmento de DNA de 10332 bps de comprimento que
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94/116 consiste essencialmente em sequência de DNA de pVWExl e 'agl2_cuo. Os dois fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose. O fragmento de DNA de 109 bps foi descartado e o fragmento de DNA de 10332 bps foi isolado do gel de agarose e purificado.
[0290] Os polinucleotídeos ou moléculas de DNA resp. que codificam os diferentes peptídeos sinais, incluindo o sítio de clivagem putativo descrito por Watanabe et al. são mostrados na SEQ ID NO:38 a 57.
[0291] Com a exceção do polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal de CgR0124, são projetados e sintetizados para permitir a clonagem por Montagem de Gibson. Para esse propósito, os polinucleotídeos contém, em sua extremidade 5' e sua extremidade 3', sequências de 25 a 45 bps e 24 a 54 bps de comprimento, as quais se sobrepõem com as extremidades correspondentes do fragmento de DNA de 10332 bps.
[0292] As misturas individuais de Montagem de Gibson do polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal de CgR0079, CgR0120, CgR0900, CgR0949, CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2627 e CgR2926 com o dito fragmento de DNA de 10332 bps de pVWEx1_tat-‘agl2_cuo foram usadas para transformar células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes.
[0293] O polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal de CgR0124 (Consultar SEQ ID NO:42) foi projetado e sintetizado para permitir a clonagem com o uso de DNA ligase. Para esse propósito, o polinucleotídeo contém em sua extremidade 5' um sítio de reconhecimento de SexAI e em sua extremidade 3' um sítio de reconhecimento de SpeI. A mistura de ligação que compreende o polinucleotídeo tratado
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95/116 com as duas endonucleases de restrição e o dito fragmento de DNA isolado de 10332 bps de pVWEx1_tat-'agl2_cuo foi usada para transformar células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes.
[0294] Os DNAs plasmidiais de transformantes escolhidos aleatoriamente obtidos das diferentes misturas de Montagem de Gibson e a mistura de ligação foram, então, analisados. Para esse propósito, transformantes foram analisados por PCR de colônia com o uso da Sapphire Mix (consultar tabela 2) com o iniciador pVW_4 e os iniciadores Wtat, como listado na tabela 9, sucedidos pela determinação de tamanho dos amplificados por eletroforese capilar. Os iniciadores também são mostrados na SEQ ID NO:58 a SEQ ID NO:68 da listagem de sequências.
Tabela 9: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificados durante a análise por PCR de transformantes.
Detecção de nome sequência tamanho [bp]
pVW_4 TTTGCGCCGACATCATAACG
CgR0079 Wtat1 agl2 rev GCCACCGACAGCGATGATAG 255
CgR0120 Wtat2 agl2 rev ACTGTCGCCGGGAAAAACTA 199
CgR0124 Wtat3a agl2 GTCGCGGACGGCGTAGAGGG 251
CgR0900 Wtat4 agl2 rev GGCCGAAGGTGACATGATGC 252
CgR0949 Wtat5a agl2 AGCGCCGATAGTGGCAAGTC 231
CgR1023 Wtat6 agl2 rev GGTGCCTGTCAGTACAGTTC 249
CgR1448 Wtat7 agl2 rev ACCCGCACATGCTGCCAAAG 252
CgR2137 Wtat8a agl2 GTGGCTAGACCTGCAGTAAC 233
CgR2627 Wtat9 agl2 rev TGCAGCAACAACGCCTCTGG 237
CgR2926 Wtat10 agl2 AGCACCTGCGAAGGTTGTTG 243
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96/116 [0295] Então, transformantes contendo plasmídeos que portam a sequência desejada que codifica o peptídeo sinal específico ligado ao polipeptídeo Agl2 foram identificados.
[0296] Apesar de diversas tentativas, nenhum transformante foi obtido que portasse um plasmídeo portando a sequência que codifica o peptídeo sinal de CgR0124.
[0297] Subsequentemente, as sequências de nucleotídeos das fusões de gene contidas nos respectivos plasmídeos foram determinadas. Para esse propósito, o DNA plasmidial foi isolado dos transformantes e as sequências de nucleotídeos das fusões de gene individuais foram analisadas por sequenciamento de Sanger.
[0298] Então, plasmídeos baseados em pVWEx1 que portam fusões da sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinal de CgR0079, CgR0120, CgR0900, CgR0949, CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2627 e CgR2926 à sequência de nucleotídeos de 'agl2_cuo foram identificados.
Exemplo 2.3
Construção de cepa [0299] O C. glutamicum, cepa DM1933, foi transformado com os plasmídeos descritos acima por eletroporação. Os transformantes foram analisados por PCR de colônia com o uso da Sapphire Mix (consultar tabela 2) com os iniciadores da tabela 9 e análise de comprimento subsequente por eletroforese capilar.
[0300] As culturas de estoque de glicerol dos transformantes são preparadas na presença de canamicina e usadas como material de partida para investigações adicionais.
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Exemplo 2.4
Degradação de panose [0301] Os transformantes que portam as diferentes fusões de gene do exemplo 2.3 foram analisados quanto à sua habilidade de degradar panose por cultivo em batelada com o uso do sistema de cultivo BioLector®.
[0302] Como meio, CGXII_CSL contendo 15 g/l de glicose e 4,8 g/l de panose como fonte de carbono foi usado. O meio foi adicionalmente suplementado com canamicina e IPTG.
[0303] As culturas foram incubadas por cerca de 22 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue. As densidades ópticas das culturas e as concentrações de panose residual foram, então, determinadas.
[0304] O resultado do experimento é mostrado na tabela 10. Por conveniência, os resultados de Watanabe et al. referente à secreção da α-amilase foram incorporados na tabela.
Tabela 10: Degradação de panose por diferentes transformantes de DM1933 que expressam diferentes peptídeos sinais fundidos à a-1,6-glicosidase Agl2.
Peptídeo sinal de eficiência Secreção Watanabe 2 de de Panose residual (g/l) Panose degradada (%) OD6 6 0
nenhum - 4,8 0 7,1
CgR0079 + + 1,1 77 9,1
CgR0120 + + + + 4,3 10 7,2
CgR0124 + n.t.1 n.t.1 n.t.1
CgR0900 + + 0,8 83 9,1
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Peptídeo sinal de eficiência de Secreção de Watanabe 2 Panose residual (g/l) Panose degradada (%) OD6 6 0
CgR0949 + + + + 2,6 46 8,8
cg0955 n.t.1 por W.2 0,2 96 7,6
CgR1023 + + + + 3,8 21 9,9
CgR1448 + + + 1,3 73 8,7
CgR2137 + + + + 03 100 9,4
CgR2627 + + + + 4,5 6 7,1
CgR2926 + + + 4,8 0 7,2
1 não testado 2 Watanabe et al.
3 não detectável [0305] A melhor degradação de panose foi alcançada pelas cepas que portam fusões de gene que codificam o peptídeo sinal de CgR2137 ou de Cg0955.
[0306] A cepa que expressa o polipeptídeo de fusão que tem o peptídeo sinal de Cg0955 é denominada DM1933/pVWEx1_tat-'agl2_cuo (consultar exemplo 1.3) e a cepa que expressa o polipeptídeo de fusão que tem o peptídeo sinal de CgR2137 é denominada DM1933/pVWEx1_cgR2137-'agl2_cuo a seguir.
Exemplo 2.5
Produção de L-lisina por diferentes transformantes da cepa DM1933 [0307] As cepas DM1933/pVWEx1, DM1933/pVWEx1_tat'agl2_cuo e DM1933/pVWEx1_cgR2137-'agl2_cuo foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina a partir de uma mistura de glicose e panose por cultivo em
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99/116 batelada com o uso do sistema de Biolector®.
[0308] Como meio, CGXII_CSL contendo 15 g/l de glicose e 4,8 g/l de panose como fonte de carbono foi usado. O meio foi adicionalmente suplementado com canamicina e IPTG. As culturas foram incubadas por cerca de 20 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose
com o uso de medidor de glicose no sangue e as
concentrações de L-lisina, panose e a densidade óptica
OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é
apresentado na tabela 11.
Tabela 11: Formação de L-lisina com o uso de uma mistura de glicose e panose como fonte de carbono.
Cepa OD6 6 0 Lys1 (g/l) Panose Residual (g/l)
DM1933/pVWEx1 7,0 3,7 4,8
DM1933/pVWEx1 tat-'agl2 cuo 7,5 4,6 0,3
DM1933/pVWEx1_cgR2137-'agl2_cuo 9,0 2,9 02
1 L-lisina como L-lisina x HCl 2 não detectável [0309] O experimento mostrou que a formação de L-lisina foi fortemente prejudicada na cepa DM1933/pVWEx1_cgR2137'agl2_cuo. Consequentemente, o trabalho com a fusão de gene cgR2137-'agl2_cuo deixou de ser visado.
[0310] O experimento mostrou ainda que a cepa DM1933/pVWEx1_tat-'agl2_cuo é capaz de produzir L-lisina a partir de panose.
Exemplo 3
Efeito de expressão da fusão de gene tat-'agl2_cuo no
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100/116 crescimento e no rendimento de L-lisina [0311] Os experimentos foram projetados para avaliar se a expressão da fusão de gene tat-'agl2_cuo como contida em pVWEx1_tat-'agl2_cuo afeta negativamente a taxa de crescimento de seu hospedeiro e a produção de L-lisina. Exemplo 3.1 [0312] Efeito no crescimento com o uso de glicose como fonte de carbono [0313] As cepas DM1933/pVWEx1 e DM1933/pVWEx1_tat'agl2_cuo foram cultivadas com o uso do sistema BioLector® e a formação de biomassa foi registrada medindo-se a luz difundida (sinal retrodifundido).
[0314] Como meio, CGXII_CSL contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. O meio foi adicionalmente suplementado com canamicina e IPTG. Ao final do cultivo, a atividade enzimática de a-1,6-glicosidase foi medida no sobrenadante de cultura.
[0315] O resultado é apresentado na figura 4 e na tabela 12. Mostra que a expressão da fusão de gene tat-agl2_cuo contida em uma unidade de expressão que compreende o promotor PtacI como contida na cepa DM1933/pVWEx1_tat'agl2_cuo não afeta de modo adverso a taxa de crescimento de sua cepa hospedeira.
Tabela 12: Atividade enzimática de a-1,6-glicosidase no sobrenadante de cultura de cepas DM1933/pVWEx1 e DM1933/pVWEx1_tat-'agl2_cuo após crescimento em glicose.
cepa atividade [U/l]
DM1933/pVWEx1 0
DM1933/pVWEx1 tat-'agl2 cuo 119
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Exemplo 3.2
Efeito na produção de L-lisina com o uso de glicose como fonte de carbono [0316] As cepas DM1933/pVWEx1 e DM1933/pVWEx1_tat'agl2_cuo foram cultivadas com o uso do sistema BioLector® e a concentração da L-lisina formada foi medida ao final do cultivo.
[0317] Como meio, CGXII_CSL contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. O meio foi adicionalmente suplementado com canamicina e IPTG. As culturas foram incubadas por cerca de 20 h até o consumo completo de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue como confirmado por análise de glicose e a concentração da Llisina formada e a densidade óptica OD660 foram medidas.
[0318] O resultado é apresentado na tabela 13. Mostra que a expressão da fusão de gene tat-agl2_cuo contida em uma unidade de expressão que compreende o promotor PtacI como contida na cepa DM1933/pVWEx1_tat-'agl2_cuo não afeta de modo adverso o rendimento da L-lisina produzida.
Tabela 13: Produção de L-lisina pelas cepas DM1933/pVWEx1 e DM1933/pVWEx1_tat-'agl2_cuo com o uso de glicose como fonte de carbono.
Cepa OD6 6 0 Lys1 (g/l)
DM1933/pVWEx1 8,5 4,9
DM1933/pVWEx1 tat-'agl2 cuo 8,3 4,8
1 L-lisina como L-lisina x HCl
Exemplo 4
Produção de L-lisina com o uso de transformantes da cepa
DM2031
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102/116 [0319] O produtor de L-lisina DM2031 C. glutamicum é um descendente da cepa DM1933 caracterizada por uma capacidade aumentada de produzir L-lisina. Contém uma cópia adicional do operão lysC(T311I)asd expresso pelo promotor Pg3N3 (WO2013000827) e inserido na região intergênica entre NCgl0038 e NCgl0039. Contém ainda uma cópia do alelo pyc(P458S) disposto em tandem no sítio de pyc(P458S) como descrito no documento WO2003014330. A cepa foi depositada sob o tratado de Budapeste no DSMZ sob a designação DSM32514.
[0320] A cepa DM2031 foi transformada com plasmídeos pVWEx1_tat-'agl2_cuo e pVWEx1. As cepas DM2031/pVWEx1 e DM2031/pVWEx1_tat-'agl2_cuo então obtidas foram cultivadas com o uso do sistema BioLector® e a concentração da Llisina formada foi medida ao final do cultivo.
[0321] Como meio, CGXII_CSL contendo 8 g/l de glicose ou 8 g/l de glicose e 5,7 g/l de panose como fonte de carbono. Os meios foram adicionalmente suplementados com canamicina e IPTG. As culturas foram incubadas por cerca de 20 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e a concentração da L-lisina formada foi medida.
Tabela 14: Produção de L-lisina por transformantes de cepa
DM2031 com o uso de glicose e uma mistura de glicose e panose como fonte de carbono.
Fonte de carbono: Glicose Glicose e Panose
Cepa Lys1 (g/l) Lys1 (g/l)
DM2031/pVWEx1 3,6 3,7
DM2031/VWEx1_tat-'agl2_cuo 3,6 6,9
1 L-lisina como L-lisina x HCl
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103/116 [0322] O resultado é apresentado na tabela 14. Mostrou que a cepa DM2031/pVWEx1_tat-'agl2_cuo é capaz de produzir L-lisina a partir de panose.
Exemplo 5
Integração cromossômica e expressão da fusão de gene tat'agl2_cuo [0323] Uma unidade de expressão (consultar SEQ ID NO:16) que compreende o promotor PdapBN1 (consultar SEQ ID NO:15), a fusão de gene tat-'agl2_cuo (consultar SEQ ID NO:9) e o terminador transcricional Tgap* (consultar SEQ ID NO:13) foi projetada e sintetizada e integrada no sítio-alvo, o qual é a região intergênica entre a etiqueta de localização NCgl2176 e NCgl2177 (consultar SEQ ID NO:18), do cromossoma do produtor de L-lisina DM1933.
[0324] Para transferência da unidade de expressão para o cromossoma, o plasmídeo pK18mobsacB, em conjunto com a cepa S17-1 de E. coli como descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994), foi usado. A sequência de nucleotídeos de pK18mobsacB está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso FJ437239.
Exemplo 5.1
Construção do plasmídeo pK18mobsacB_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo [0325] Na primeira etapa, um polinucleotídeo ou molécula de DNA resp. foi projetada e sintetizada, a fim de fornecer as sequências flanqueadoras necessárias para integração da unidade de expressão no sítio-alvo no cromossoma do hospedeiro de C. glutamicum por recombinação homóloga. O polinucleotídeo foi denominado INT.
[0326] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo (molécula de DNA) INT é mostrada na SEQ ID NO:69.
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104/116
Compreende a partir de sua extremidade 5' à sua extremidade 3' um sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição EcoRI, uma parte (extremidade 3') do gene identificado pela etiqueta de localização NCgl2176, a região intergênica (IR) entre as etiquetas de localização NCgl2176 e NCgl2177 que porta sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição EcoRV (GATATC), AvrII (CCTAGG) e SmaI (CCCGGG) artificialmente geradas por troca de nucleotídeos, a sequência de nucleotídeos do gene identificado pela etiqueta de localização NCgl2177 (no filamento complementar da molécula de DNA), uma sequência a montante de NCgl2177 e um sítio de reconhecimento para a endonuclease de restrição HindIII (AAGCTT).
[0327] Os dois sítios de restrição EcoRI e HindIII nas extremidades 5' e 3' da molécula de DNA foram usados para clonar o polinucleotídeo no corte de vetor pK18mobsacB por endonucleases de restrição EcoRI e HindIII.
[0328] Como resultado, o vetor pK18mobsacB contendo o polinucleotídeo INT foi obtido. Esse plasmídeo foi denominado pK18mobsacB_INT.
[0329] Em uma segunda etapa, um polinucleotídeo que compreende uma unidade de expressão denominada PBN1-tat'agl2_cuo foi projetado e sintetizado. Contém o promotor PdapBN1, a fusão de gene tat-'agl2_cuo e o terminador transcricional Tgap*. Sua sequência de nucleotídeos é mostrada na SEQ ID NO:70. Compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:16 e contém adicionalmente 20 nucleotídeos (GCGTCTAGAACTGATGAACA) na extremidade 5' e 9 nucleotídeos (GGATCCGCG) na extremidade 3'. Um mapa da unidade de expressão PBN1-tat-'agl2_cuo é mostrada na
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105/116 figura 5.
[0330] Em uma terceira etapa, o polinucleotídeo PBN1tat-'agl2_cuo foi tratado com endonuclease de restrição XbaI e clonado no vetor pK18mobsacB_INT linearizado por tratamento com endonuclease de restrição AvrII. As células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes foram usadas como hospedeiro de transformação.
[0331] O DNA plasmidial foi isolado dos transformantes e tratado com a endonuclease de restrição HincII.
fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em
Os gel de agarose (0,8 % em peso por volume de agarose).
Plasmídeos contendo a orientação [0332] desejada da unidade de na região intergênica orientação
NCgl2177-3' expressão PBN1-tat-'agl2_cuo (IR) do polinucleotídeo INT, desejada é 5'-'NCgl2176-PBN1-tat-'agl2_cuopelo padrão de fragmentos foram identificados sendo que a de DNA que e 822 bp.
têm um comprimento de
Um dos plasmídeos
3197 bp, 2928 bp, 2314 bp então identificado foi denominado integridade plasmídeo foi confirmada nucleotídeos com o uso do pK18mobsacB_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo. da unidade de INT::PBN1-tat-'agl2_cuo sequência determinando-se sua método de Sanger. Um unidade de INT::PBN1-tat-'agl2_cuo é mostrado Em essência, consiste nas características de no de mapa da dita na figura 6.
'NCgl2176,
IR', a unidade de expressão PBN1-tat-'agl2_cuo, 'IR e NCgl2177. O segmento com as características de 'NCgl2176 e IR' representa a sequência flanqueadora 5' e o segmento com as características de 'IR e NCgl2177 representam a sequência flanqueadora 3' necessária para a integração da unidade de expressão PBN1-tat-'agl2_cuo no cromossoma. Um
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106/116 mapa de plasmídeo pK18mobsacB_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo é mostrado na figura 7.
Exemplo 5.2
Construção da cepa DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo [0333] O plasmídeo pK18mobsacB_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo foi usado para integrar a unidade de expressão PBN1-tat'agl2_cuo no cromossoma do produtor de L-lisina DM1933.
[0334] Para esse propósito, a cepa S17-1 de E. coli foi transformada com DNA plasmidial obtido no exemplo 5.1. O método de conjugação modificado de Schâfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) como descrito em materiais e métodos foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e seleção para clones de transconjugante em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.
[0335] Clones de transconjugante foram analisados por PCR de colônia com o uso do Kit Taq com os iniciadores IR_1 e IR_2 listados na tabela 15 sucedidos pela determinação de tamanho dos amplificados por eletroforese capilar. Os iniciadores também são mostrados na SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:72 da listagem de sequências. Para PCR, o Kit Taq (consultar tabela 1) foi usado com a temperatura da etapa de recozimento (etapa 3) definida a 55 °C e o tempo da etapa de alongamento (etapa 4) definido a 40 s.
Tabela 15: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificado durante análise de PCR de clones de transconjugante.
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Detecção de nome sequência tamanho [bp]
INT::PBN1- IR_1 GACCTCGGCTTTGTGACCAG 2344
tat-agl2 cuo IR_2 CTCACCGCACGATGGTTCAC
[0336] As sequências de nucleotídeos de produtos de PCR de clones de transconjugante que têm o tamanho correto foram adicionalmente analisadas por sequenciamento de Sanger.
[0337] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_INT::PBN1-tat'agl2_cuo. A cultura de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.
Exemplo 5.3 [0338] Produção de L-lisina pela cepa DM1933_INT::PBN1tat-'agl2_cuo com o uso de glicose e uma mistura de glicose e panose como fonte de carbono [0339] As cepas DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo e DM1933 como um controle foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina a partir de glicose ou de uma mistura de glicose e panose por cultivo em batelada com o uso do sistema de BioLector®.
[0340] Como meio, CGXII_CSL contendo 20 g/l de glicose ou 15 g/l de glicose ou uma mistura de 15 g/l de glicose e 4,8 g/l de panose foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 20 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue. As densidades ópticas OD660 e as concentrações de L-lisina e panose foram então medidas.
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108/116 [0341] O resultado do experimento é apresentado na tabela 16. Mostrou que a presença da unidade de expressão PBN1-tat-'agl2_cuo na cepa DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo não afeta negativamente o rendimento de L-lisina na glicose. Mostra ainda que a cepa DM1933_INT::PBN1-tat'agl2_cuo é capaz de produzir L-lisina a partir de panose.
Tabela 16: Produção de L-lisina pela cepa DM1933_INT::PBN1tat'-agl2_cuo.
Fonte carbono de Cepas
DM1933 DM1933 *
Glicose (g/l) Panose (g/l) Lys1 (g/l) OD6 6 0 Panose (g/l) Lys1 (g/l) OD6 6 0 Panose (g/l)
20 0 4,6 8,1 n a2 4,7 8,1 n a2
15 0 3,8 6,1 n a2 3,8 6,2 n a2
15 4,8 3,9 6,4 4,8 4,3 6,8 1,4
* INT::PBN1-tat-'agl2_cuo 1 L-lisina como L-lisina x HCl 2 não analisado
Exemplo 6
Produção de L-lisina pela cepa DM1933_INT::PBN1-tat'agl2_cuo com o uso de hidrolisado de amido como fonte de carbono [0342] As cepas DM1933 e DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo foram cultivadas em meio de CGXII_CSL com o uso de hidrolisado de amido como fonte de carbono (77,3 ml de hidrolisado de amido Clear Sweet®/l). O meio então preparado continha 60 g/l de glicose, 0,4 g/l de panose e 1,2 g/l de isomaltose.
[0343] O cultivo foi realizado em frascos Erlenmeyer de
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109/116 l como descrito em materiais e métodos. As amostras foram obtidas nas culturas em diferentes pontos no tempo e as densidades ópticas OD660 e as concentrações de L-lisina, isomaltose, panose e glicose foram medidas. O resultado do experimento está resumido na tabela 17. Mostra que a cepa DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo é capaz de consumir isomaltose e panose contidas no hidrolisado de amido.
Tabela 17: Produção de L-lisina com o uso de hidrolisado de amido como fonte de carbono.
OD6 6 0 OD6 6 0
Tempo: 0 h 13 h 33 h 57 h
Cepa
DM1933 0,5 25,3 46,0 40,9
DM1933_* 0,5 22,9 46,7 43,1
L-lisina2 (g/l) L-lisina*** (g/l)
Tempo: 0 h 13 h 33 h 57 h
Cepa
DM1933 n a1 2,7 11,6 15,5
DM1933_* n a1 2,9 10,5 16,2
Isomaltose (g/l) Isomaltose (g/l)
Tempo: 0 h 13 h 33 h 57 h
Cepa
DM1933 1,1 1,0 0,8 0,7
DM1933_* 1,1 0,9 03 03
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110/116
Panose (g/l) Panose (g/l)
Tempo: 0 h 13 h 33 h 57 h
Cepa
DM1933 0,4 0,4 0,4 0,4
DM1933_* 0,4 0,3 03 03
Glicose (g/l) Glicose (g/l)
Tempo: 0 h 13 h 33 h 57 h
Cepa
DM1933 59,9 35,0 03 03
DM1933_* 59,9 37,2 03 03
PBN1-tat-'agl2 cuo 2 como L-l .isina x HCl
1 não analisado 3 não detectável
Exemplo 7
Determinação da sequência de aminoácidos da proteína de fusão a-1,6-glicosidase secretada [0344] A cepa DM1933_INT::PBN1-tat-'agl2_cuo foi cultivada e o sobrenadante de cultura foi coletado, filtrado e concentrado como descrito em detalhes em materiais e métodos. O sobrenadante de cultura concentrado foi, então, analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS).
[0345] Duas espécies de polipeptídeos foram encontradas no sobrenadante de cultura. Uma tendo uma fórmula de soma de C3031 H4582 N844 O958 S18 ajustada à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 das posições 31 a 639. A outra tendo uma fórmula de soma de C3004 H4535 N837 O948 S17
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111/116 ajustada à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 das posições 38 a 639. Ambos os polipeptídeos foram encontrados em uma razão de aproximadamente 1:1.
Exemplo 8
Produção de L-valina [0346] A produção de L-valina a partir de panose com o uso da fusão de gene tat-'agl2_cuo foi investigada.
Exemplo 8.1
Construção de um produtor de L-valina contendo a fusão de gene tat-'agl2_cuo [0347] A cepa ATCC14067_PprpD2-ilvBN é um produtor de Lvalina que pertence à espécie C. glutamicum. A construção da cepa a partir da cepa ATCC14067 é descrita no documento EP2811028A1.
[0348] A cepa ATCC14067_PprpD2-ilvBN foi transformada com DNA plasmidial isolado de pVWEx1 e pVWEx1_tat-‘agl2_cuo por eletroporação. A seleção para transformantes, a propagação dos transformantes e a preparação de culturas de estoque de glicerol foram feitas como descrito sob materiais e métodos e na presença de canamicina.
[0349] As sequências de nucleotídeos específicas dos transformantes foram amplificadas por PCR de colônia a fim de verificar a situação de plasmídeo dos transformantes. Os iniciadores usados e o tamanho dos amplificados de PCR estão resumidos na tabela 18.
Tabela 18: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificados durante a análise por PCR de transformantes.
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112/116
plasmídeo Análise por PCR
iniciador sequência tamanho [bp]
pVWEX1 pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 241
pVW_3 TACTGCCGCCAGGCAAATTC
pVWEx1 tat- pVW_1 GTGAGCGGATAACAATTTCACAC 433
'agl2 cuo gluc rev GTAGCCGTTATCATCCTGTG
[0350] Para PCR, Sapphire Mix (consultar tabela 2) foi usada com a temperatura da etapa de recozimento (etapa 3) ajustada a 53 °C e o tempo da etapa de alongamento (etapa 4) ajustado a 10 s. A determinação de tamanho dos amplificados foi realizada por eletroforese capilar.
[0351] As sequências de nucleotídeos dos iniciadores usados também são mostradas na listagem de sequências sob SEQ ID NO:33 a SEQ ID NO:36.
[0352] Os transformantes ATCC14067_PprpD2-ilvBN/pVWEx1 e ATCC14067_PprpD2-ilvBN/pVWEx1_tat-'agl2_cuo então obtidos e analisados foram usados para investigação adicional.
Exemplo 8.2 [0353] Produção de L-valina pela cepa ATCC14067_PprpD2ilvBN/pVWEx1_tat-'agl2_cuo com o uso de glicose e uma mistura de glicose e panose como fonte de carbono.
[0354] As cepas ATCC14067_PprpD2-ilvBN/pVWEx1_tat'agl2_cuo e ATCC14067_PprpD2-ilvBN/pVWEx1 como um controle foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir Lvalina a partir de glicose ou de uma mistura de glicose e panose por cultivo em batelada com o uso do sistema de BioLector®.
[0355] Como meio, CGXII_YE contendo 15 g/l de glicose ou
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113/116 uma mistura de 15 g/l de glicose e 4,8 g/l de panose foi usado. Os meios foram suplementados adicionalmente com canamicina, IPTG e sal de hemicálcio de ácido propiônico (0,75 g/l) . As culturas foram incubadas por cerca de 25 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue. As densidades ópticas OD660 e as concentrações de L-valina e panose foram então medidas.
[0356] O resultado do experimento é apresentado na tabela 19. Mostra que a presença da fusão de gene tat-'agl2 contida em uma unidade de expressão que compreende o promotor PtacI como contido na cepa ATCC14067_PprpD2ilvBN/pVWEx1_tat-'agl2_cuo permite que a cepa produza Lvalina a partir de panose.
Tabela 19: Produção de L-valina pela cepa ATCC14067_PprpD2ilvBN/pVWEx1_tat-'agl2_cuo.
Fonte de carbono Cepas
*/pVWEx1 */pVWEx1_tat- 'agl2 cuo
Glicose (g/l) Panose (g/l) Val1 (g/l) OD6 6 0 Panose (g/l) Val1 (g/l) OD6 6 0 Panose (g/l)
15 0 0,50 8,1 n a2 0,49 7,9 n a2
15 4,8 0,49 8,2 4,8 0,59 9,2 03
* ATCC14067_PprpD2-ilvBN 1 L-valina 2 não analisado 3 não detectável
LISTA DE ABREVIAÇÕES [0357] 'agl2_cuo sequência de codificação com otimização
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114/116 de uso de códon do gene agl2 de Bifidobacterium breve UCC2003 sem o códon de partida de ATG [0358] 'IR sequência da extremidade 3' da região intergênica (IR) entre os genes identificada pela etiqueta de localização Ncgl2177 e Ncgl2176 [0359] 'Ncgl2176 sequência da extremidade 3' da sequência de codificação identificada pela etiqueta de localização Ncgl2176 [0360] (Avrll/Xbal) sequência híbrida obtida após a ligação de extremidades coesivas geradas por endonucleases de restrição AvrII e XbaI [0361] agl2_cuo sequência de codificação com otimização de uso de códon do gene agl2 de Bifidobacterium breve UCC2003
[0362] BamHI sequência reconhecida pela endonuclease de
restrição BamHI
[0363] EcoRI sequência reconhecida pela endonuclease de
restrição EcoRI
[0364] FspAI sequência reconhecida pela endonuclease de
restrição FspAI
[0365] h horas
[0366] HincII sequência reconhecida pela endonuclease de
restrição HinclI [0367] HindIII sequência reconhecida pela endonuclease de restrição HindIII [0368] IR' sequência da extremidade 5' da região intergênica (IR) entre os genes identificada pela etiqueta de localização Ncgl2177 e Ncgl2176 [0369] lacI gene que codifica o repressor LacI [0370] lacZ-alfa sequência d extremidade 5' do gene lacZ
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115/116 que codifica o α-peptídeo da β-galactosidase [0371] MauBI sequência reconhecida pela endonuclease de restrição MauBI [0372] MCS sítio de clonagem múltipla [0373] Ncgl2177 sequência de codificação identificada pela etiqueta de localização Ncgl2177 [0374] neo gene que codifica a aminoglicosídeo 3'fosfotransferase [0375] nptII gene que codifica a neomicina fosfotransferase
[0376] ori p15A origem de replicação de plasmídeo p15A
de E. coli
[0377] ori pCG1 origem de replicação de plasmídeo pCG1
de C. glutamicum
[0378] ori pMB1 origem de replicação de plasmídeo pMBI
de E. coli [0379] PBN1 sequência de promotor PdapBN1 [0380] PtacI sequência de promotor PtacI [0381] PstI sequência reconhecida pela endonuclease de restrição PstI [0382] RP4-mob sequência da região de mob do plasmídeo RP4 [0383] sacB gene que codifica levanasacarase [0384] SexAI sequência reconhecida pela endonuclease de restrição SexAI [0385] SpeI sequência reconhecida pela endonuclease de restrição SpeI [0386] tat 5'-terminal da sequência de codificação cg0955 de C. glutamicum ATCC13032, que codifica um peptídeo sinal de Tat (translocador de dupla arginina)
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116/116 [0387] tat-'agl2_cuo sequência da fusão de gene que codifica o polipeptídeo de fusão Tat-'Agl2 [0388] Tgap* sequência de terminador Tgap* [0389] XbaI sequência reconhecida pela endonuclease de restrição XbaI

Claims (4)

1. Polinucleotídeo isolado caracterizado por codificar um polipeptídeo de fusão que compreende as sequências de aminoácidos a), b) e c) com
a) sendo um peptídeo sinal de Tat no N-terminal que consiste na sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 ou posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12 ou que consiste na sequência de aminoácidos das posições 1 a 33 de SEQ ID NO:10 com Ala na posição 13 ou posições 1 a 33 de SEQ ID NO:12 com Ala na posição 13;
b) sendo um polipeptídeo no C-terminal que tem atividade
de a-1,6-glicosidase que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de b1) pelo menos (>) 95 % idêntica à sequência das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 e b2) pelo menos (>) 95 % idêntica à sequência das posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12, e c) tendo 0 a no máximo 10 resíduos de aminoácido entre a)
e b).
2/4 posições 37 a 643 de SEQ ID NO:12.
2. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de aminoácidos de b1) é selecionada a partir das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 e das posições 37 a 639 de SEQ ID NO:10 mais um Met adicional no N-terminal na frente da posição 37 como mostrado na SEQ ID NO:6 e b2) é selecionada a partir das posições 39 a 643 de SEQ ID NO:12, posições 38 a 643 de SEQ ID NO:12 e
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10. Bactéria caracterizada por ser selecionada a partir do gênero Corynebacterium que compreende o polinucleotídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a dita bactéria tem a habilidade de secretar um polipeptídeo que tem atividade de a-1,6-glicosidase codificada pelo dito polinucleotídeo isolado.
11. Bactéria, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito polinucleotídeo isolado está contido em um vetor de plasmídeo que é replicado de modo autônomo na dita bactéria ou no
cromossoma da dita bactéria. 12. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria é uma Corynebacterium glutamicum. 13. Bactéria, de acordo com qualquer uma das
reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria tem a habilidade de excretar e produzir um produto químico fino selecionado a partir de Laminoácidos, vitaminas, nucleosídeos e nucleotídeos.
14. Bactéria, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o dito produto químico fino é um L-aminoácido.
15. Bactéria, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o dito L-aminoácido é selecionado a partir de L-lisina, L-treonina, L-valina e L-isoleucina.
16. Método para produzir um produto químico fino selecionado a partir do grupo que consiste em Laminoácidos, vitaminas, nucleosídeos e nucleotídeos
Petição 870180050094, de 12/06/2018, pág. 127/253
3. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito número de resíduos de aminoácido de c) é 1 a 3.
4. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito número de resíduos de aminoácido de c) é 3.
5. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os ditos resíduos de aminoácido entre a) e b) consistem na sequência de aminoácidos Met Thr Ser.
6. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os ditos resíduos de aminoácido de c) consistem na sequência de aminoácidos Ile Leu Val.
7. Polinucleotídeo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo está funcionalmente ligado a um promotor.
8. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é o promotor de PtacI de acordo com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:14 das posições 1 a 75 ou o promotor PdapBN1 de acordo com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:15.
9. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é o promotor PdapBN1 de acordo com SEQ ID NO:15.
Petição 870180050094, de 12/06/2018, pág. 126/253
4/4 caracterizado por compreender cultivar o produto químico fino que produz bactéria, como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 15, em um meio adequado, em que para cultivar a dita bactéria uma fonte de carbono é usada, a qual compreende oligômeros de a-D-glicose que consistem em pelo menos dois monômeros de glicose a-1-6glicosidicamente ligados.
BR102018011843A 2017-06-14 2018-06-12 Método para produção de produtos químicos finos com o uso de um corynebacterium que secreta a-1,6-glicosidases modificadas BR102018011843A8 (pt)

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