62287 (54) МЕТОД И МЕЖДИНЕН ПРОДУКТ ЗАПРЕЧИСТВАНЕ НА ОКСИТЕТРАЦИКЛИН Област на техниката Настоящото изобретение се отнася до новметод за получаването на напълно чист окси-тетрациклин, несъдържащ ацетилдекарбокса-мидоокситетрациклин, както и до нов межди-нен продукт за изпълнението му. Предшестващо състояние на техниката Известно е, че при ферментацията наокситетрациклин по следната обща формула
в която R означава NH2 (формула 1),като страничен продукт се получава и от 3 до12,5% 2-ацетил-2 декарбоксамидоокситетра-циклин, който в описанието е посочен катоацетилдекарбоксамидоокситетрациклин със съ-щата обща формула, в която R означава СН3(формула II). Чрез използване на стандартни методиза изолиране на окситетрациклина от фермен-тационния бульон и последващо допълнител-но пречистване, съдържанието му на ацетил-декарбоксамидоокситетрациклин се намаляванезначително и той остава като примес в край-ния продукт окситетрациклин. Наличието наацетилдекарбоксамидоокситетрациклин катостраничен продукт при окситетрациклина е по-казано за първи път при хроматографското от-деляне на тези две съединения върху тънъкслой (Archiv der Pharmazie 300, 840/1967/.Изследвани са 15 проби от окситетрациклинна различни производители на този антиби-отик и е потвърдено качествено наличието наацетилдекарбоксамидоокситетрациклин притях. Количествено, съдържанието на ацетил-декарбоксамидоокситетрациклин в пробите ок-ситетрациклин е определено чрез течна хро-матография при високо налягане (по нататъкв текста - ТХВН) (Journal of Chromatography405, 229/19897/). Ацетилдекарбоксамидоокситетрациклине получаван чрез ферментация и по-рано.Веществото е изолирано и пречистено чрез про-тивотоково разпределение, определено е хи-мически (Jourmal of American Chemical Society82, 5934/1960/) и е патентовано като антиби-отик (US-патент 3,022,347 /1962/). Изслед-ването на биологичната активност на ацетил-декарбоксамидоокситетрациклина при 33 мик-роорганизма потвърди такъв антибактериаленспектър, както при окситетрациклина, но не-говата активност не достига дори и 10% оттази окситетрациклина. Поради изключителната близост на ок-ситетрациклиновите и на ацетилдеканбоксами-доокситетрациклиновите молекули, до днес нее описан никакъв процес на изолиране на окси-тетрациклин, който да не съдържа никакъвацетилдекарбоксамидоокситетрациклин. Също така е известно, че окситетрацик-линът образува молекулни солни комплекси сразлични органични киселини и основи (JP -Патент No 17 044 /63/; Chem. Abstr.60, 2875 a).Кристалната структура на някои от тези солие определена по рентгеновия дифракционен ме-тод (Bull.Chem.Soc.Japan 36, 1163-8/1963/).Описани са молекулярни солни комплекси наокситетрациклинов хидрохлорид с оксаловакиселина, пиразин и монохлорооцетна кисе-лина. Техническа същност на изобретението Съгласно изобретението е установено, чеокситетрациклинов хидрохлорид, разтворен вледена оцетна киселина, образува молекуля-рен солен комплекс, по-специално окситетра-циклинов хидрохлориден ацетилдекарбоксами-доокситетрациклинат. Забележителната разли-ка в разтворимостта на молекулярните солникомплекси на окситетрациклина и на ацетил-декарбоксамидоокситетрациклина в леденаоцетна киселина допринася за ефикасното имразделяне. А именни, ако окситетрациклинхлорид, съдържащ ацетилдекарбоксамидоокси-тетрациклинов хлорид (около 3%) като при-мес се суспендира в ледена оцетна киселина,като солта най-напред се разтваря напълно,при което окситетрациклинът се утаява въвформата на молекулярен солев комплекс. Моле-кулярният солев комплекс на ацетилдекарбок-самидоокситетрациклин при тези условия е 2 62287 силно разтворим и остава до голяма степен вразтвора. При филтрирането на утаения ок-ситетрациклинов хидрохлорен ацетат се изо-лира изключителен добив на окситетрациклинс намалено съдържание на ацетилдекарбокса-мидоокситетрациклин до 0,3 -0,5%, което сепотвърждава при ТХВН метода. Филтратът напрактика представлява целият наличен аце-тилдекарбоксамидоокситетрациклин и около 1-2% от първоначалното количество окситетра-циклин, който може да се регенерира чрез из-паряването на филтрата. Окситетрациклинътможе да се подложи също така на подобнопречистване под формата на своята основа(дихидрат, в текста по-долу дадена като ок-ситетрациклинов дихидрат). В този случай съ-що така се прибавя еквимоларно количествохлороводород под формата на концентриранасолна киселина към разтвора на окситетрацик-линовия дихидрат в ледена оцетна киселина,което спомага за образуването на молекуляр-ния солев комплекс окситетрациклинов хлоро-водороден ацетат. След започване на утаява-нето на комплекса може да се прибави толуолв количество до 80 об. % към наличната леде-на оцетна киселина, за да се намали разтво-римостта на продукта.Ако като изходен мате-риал се подбере суров окситетрациклиновдихидрат, той би трябвало предварително дасе превърне, като се използват известни стан-дартни процедури - в окситетрациклинов хид-рохлорид, който в последствие да се превърнебез изсушаване в окситетрациклинов хидрох-лориден ацетат. Съотношението на леденатаоцетна киселина спрямо окситетрациклина мо-же да бъде в рамките между 1,5-5 ml/mmolокситетрациклин, като най-добър резултат сеполучава при съотношение 2,5 ml/mmol окси-тетрациклин. Методът съгласно изобретението се из-вървява, като ледената оцетна киселина се сус-пендира при разбъркване на окситетрапикли-новия хидрохлорид или алтернативно окситет-рациклинов дихидрат при добавянето на ек-вимолно количество хлороводород. Разбърк-ването е в продължение на още 5 h. През пър-вия час разбъркване окситетрациклинът се раз-тваря напълно, след което молекулярният со-лев комплекс се утаява. След 5 - часово раз-бъркване преципитатът се филтрира, проми-ва се с ледена оцетна киселина и ацетон, следкоето се изсушава при понижено налягане при температура до 40°С до постоянно тегло.Добивът на изолиран окситетрациклинов хид-рохлориден ацетат варира в зависимост от чис-тотата на началния материал. Добивите ста-ват по-високи, когато началният материал епо-чист. Окситетрациклиновият хидрохлориденацетат е добре изкристализирана и устойчивасол с жълт цвят, която без особена загуба мо-же да се превърне в окситетрациклинов хид-рохлорид или окситетрациклинов дихидрат.Превръщането в окситетрациклинов хидрохло-рид се извършва, като се разтвори окситетра-циклинов хидрохлориден ацетат в минималноколичество вода и се прибави смес от метанолконцентрирана солна киселина. Чрез повторе-нието на целия процес, като се започне от та-ка пречистен окситетрациклинов хидрохлоридсе получава напълно чист окситетрациклиновхидрохлорид без никакво съдържание на аце-тилдекарбоксамидоокситетрациклин. Превръща-нето на окситетрациклиновия хидрохлориденацетат в окситетрациклинов дихидрат се извър-шва чрез разтварянето на окситетрациклиновхидрохлориден ацетат във вода, таковаколичество, при което концентрацията на окси-тетрациклин в разтвора е около 50000 ME/ml,a pH на разтвора се коригира до 5, което водидо утаяването на окситетрациклиновия дихид-рат, който накрая се изолира чрез филтрация. Окситетрациклиновият хидрохлориденацетат, който се изолира от разтвор на окси-тетрациклин в ледена оцетна киселина, предс-тавлява молекулярен солев комплекс, който до-сега не е описан. Неговият молекулярен със-тав е установен чрез титруване с натриева ос-нова и сребърен нитрат и чрез определяне съ-държанието на оцетната киселина чрез газовахроматографя. Установено е, че солният ком-плекс се състои от окситетрациклин, хлорово-дород и оцетна киселина в еквимоларно съот-ношение, като отговаря на следната формула
Молекулата на тази композиция съдър-жа теоритично 6,55% хлороводород и 10,78%оцетна киселина, докато изчислената по суховещество биологична активност възлиза на 3 62287 826,7 ME/mg. Получените резултати от анали-зи на изготвените проби от окситетрациклиновхидрохлориден ацетат се различават от теори-тичните в рамките на няколко %. И така вразлични проби се установи съдържание на хло-роводород от 6,2-6,7%. Съдържание на оцетнакиселина от 10,2-11,5% и на биологичен по-тенциал от 800-836 ME/mg. Като всички тет-рациклинови съединения окситетрациклиновияхидрохлориден ацетат няма строго определенаточка на топене. При нагряване веществотопроменя цвета си при температура, превиша-ваща 170°С, като се разпада напълно при тем-пература над 200°С. Присъствието на оцетна киселина в мо-лекулата се доказва по спектралните характе-ристики на новото съединение. И така УВ спек-търът съответства на максималното разпреде-ление, идентично на спектъра на окситетра-циклиновия хидрохлорид с изключение на това,че поглъщането се намалява, поради увелича-ването на молекулната маса. Поради същатапричина стойността на специфичното въртенена плоскостта на поляризацията е също такапо-малка. При Ή и13 CNMR (ядрен магнитенрезонанс) на спектъра окситетрациклиновиятхидрохлориден ацетат изразява всички сигна-ли на окситетрациклина на обикновеното имместоположение, в допълнение към сигналитеза оцетна киселина. При масова спектрогра-фия на окситетрациклиновия хидрохлориденацетат, в допълнение на фрагменти, характер-ни за окситетрациклина, също така се получа-ват масови фрагменти от 43 и 60, получени отоцетна киселина. Поради изключително ниската биологич-на активност на ацетилдекарбоксамидоокситет-рациклина, неговото присъствие в окситетра-циклина съставлява неактивен баласт. След от-страняването на този баласт се избягва него-вото безполезно утаяване в костите на човеш-кия организъм, като същевременно се получа-ва окситетрациклин с подобрена микробиоло-гична мощност. Това означава, че при меди-цинско приложение се постига същия ефект припо-ниска доза на лекарственото средство. Примерно изпълнение на изобретението Изобретението се пояснява, без да сеограничава, със следните примери. Пример 1. Получаване на окситетрацик- линов хидрохлориден ацетат от окситетрацик-линов хидрохлорид Суспендира се окситетрациклинов хид-рохлорид (100 g, 890 ME/mg, съдържаниетоопределено по ТХВН метод: 91,9% окситет-рациклин и 2,6% ацетилдекарбоксамидоокси-тетрациклин, изразени като хидрохлориди) в500 ml ледена оцетна киселина, като разтво-рът се разбърква в продължение на 5 h пристайна температура. След около 1 h се полу-чава бистър разтвор, в който започва да сеобразува жълт преципитат. След 5 h разбърк-ване, преципитатьт се филтрува, промива сес 50 ml охладена оцетна киселина и се изсу-шава при понижено налягане до постоянно тег-ло. Добив: 110 g(98%). Определение по ТХВНметод; продуктът се състои от окситетрацик-лин и ацетилдекарбоксамидоокситетрациклинв съотношение 99,6:0,4. Биооценка: 829 МЕ/mg; съдържание на оцетна киселина 10,23%;вода (метод на К.Фишер) 1.0%; HCL (титру-ване с AgNO3) 6,6%; точка на топене 203-208°С (разпадане); [а] 20: - 172,1; UVмакс.:218пт(А 1% 248,41),268 пт (λΐ %336,63) и 360 пт, (А 1% 251,87) (0,001 NHCL/EtOH). Пример 2. Получаване на окситетрацик-линов хидрохлориден ацетат от суров окси-тетрациклин дихидрат през окситетрацикли-нов хидрохлорид. Суровият (необработен) окситетрацик-линов дихидрат (съдържание по ТХВН: 95,6%окситетрациклинов дихидрат и 3,0% ацетилде-карбоксамидоокситетрациклинов дихидрат)чрез стандартна процедура се превръща в ок-ситетрациклинов хидрохлорид: суровият дихид-рат (100 g) се разбърква и нагрява във воднабаня до 30°С, разтваря се в смес от 750 mlметанол и 12 ml концентрирана солна кисели-на. Прибавят се 0,5 g двунатриева сол на ети-лендиаминотетраоцетна киселина и 1,5 g ак-тивен въглен и разтворът се филтрира придобавяне на 1,5 g филтрираща пръст. Филтру-ваната утайка се промива с 100 ml метанол.Окситетрациклиновият хидрохлорид се утаявавъв филтрата чрез бавно добавяне, при еднов-ременно разбъркване и охлаждане на 55 ml кон-центрирана солна киселина. След филтрува-нето и изсушаването във въздушно цикрула-ционна сушилна пещ при 50°С с получава97,06 g окситетрациклинов хидрохлорид. Це-лият продукт се разтваря чрез разбъркване в 4 62287 500 ml ледена оцетна киселина. След 10 minкъм получения бистър разтвор се прибавя 0,1 gокситетрациклинов хидрохлориден ацетат, катосе разбърква в продължение на 5 h при стайнатемпература. Следвайки идентична процедура,като тази, посочена в пример 1, се получава 98,5 g окситетрациклинов хидрохлориденацетат. Съдържанието на продукта по ТХВНопределение, възлезе на 99,07% окситетрацик-линов хидрохлориден ацетат и 0,56% аце-тилдекарбоксамидоокситетрациклинов хидрох-лориден ацетат. Добив на регенериран окситетрациклин:90,98%. Пример 3. Получаване на окситетрацик-линов хидрохлориден ацетат направо от суров(необработен) окситетрациклинов дихидрат. Суровият (необработен) окситетрацик-линов дихидрат (200 g; 913 ME/mg, вода: 6,9%;съдържание по ТХВН: 98,5% окситетрацик-линов дихидрат и 2,1 % ацетилдекарбоксами-доокситетрациклинов дихидрат) се суспенди-ра в 600 ml ледена оцетна киселина, като 32 gконцентрирана солна киселина се прибавя накапки при едновременно разбъркване до сус-пензия. След разбъркването се получава разт-вор, към който се прибавя 0,1 g окситетрацик-линов хидрохлориден ацетат. След разбърква-не в продължение на 1,5 h се прибавя 400 mlтолуол, като разбъркването продължава. Следобщо 5 h разбъркване полученият преципитатсе филтрува, филтруваната утайка се разбър-ква с 400 ml ацетон, филтрира се още веднъжи се промива с допълнително количество от400 ml ацетон. Продуктът се изсуши при стайнатемпература и при понижено налягане. Полу-чава се 188,06 g окситетрациклинов хидрох-лориден ацетат, съставляващ (по ТХВН мето-да): 98,5% окситетрациклинов хидрохлориденацетат и 0,45% ацетилдекарбоксамидоокситет-рациклинов хидрохлориден ацетат. Добив на регенериран окситетрациклин:83,8%. Пример 4. Получаване на окситетрацик-линов дихидрат от окситетрациклинов хид-рохлориден ацетат. Окситетрациклинов хидрохлориден аце-тат (9,85 g), получен в пример 2, се разтваряв 155 ml дестилирана вода. При едновременноразбъркване се прибавя на капки концентри-ран амоняк до кисел разтвор (pH - 2,3) и сепрециптира окситетрациклинов дихидрат. След като pH на сместа достигне 5 , разбъркванетопродължава още един час, преципитатът сефилтрира, промива се с 50 ml вода и се сушипри намалено налягане при 40-50°С. Получавасе 8,6 g окситетрациклинов дихидрат с биоло-гична активност: 921 ME/mg (вода: 7,1%; из-числено пир сухо вещество - 991 ME/mg.Продуктът съдържа (по ТХВН метод) 98,9%окситетрациклинов дихидрат и 0,4% ацетил-декарбоксамидоокситетрациклин дихидрат. До-бивът на регенерирания окситетрациклин въз-лиза на 87,16%. Пример 5. Получаване на окситетрацик-линов хидрохлорид от окстетрациклинов хид-рохлорид ацетат. Суспендира се чрез разбъркване в 100 mlдестилирана вода окситетрациклинов хидрох-лорид ацетат (95,7 g), получен в пример 2.Към разтвора на капки и при разбъркване сеприбавя смес от 660 ml метанол и 110 ml кон-центрирана солна киселина. Добавянето се из-вършва при стайна температура, докато окси-тетрациклиновият хидрохлорид започне дакристализира (около 1 /3 от сместа), като ос-татъчната смес се прибавя на капки при ох-лаждане и температура около +2°С. След катосе прибави сместа, утаените кристали се оста-вят да се охлаждат без разбъркване в продъл-жение на още 1 h, филтрират се, промиват сев 100 ml охладен метанол и се сушат при по-нижено налягане при 40°С. Получава се 80,64g окситетрациклинов хидрохлорид с биологи-чен потенциал: 918 ME/mg (вода: 0,6%, 924ME/mg, изчислен на база сухо вещество).Продуктът се състои (по ТЕХН) от 93,9% ок-ситетрациклинов хидрохлорид и 0,5% ацетил-декарбоксамидоокситетрациклинов хидрохло-рид. Добивът на регенерирания окситетрацик-лин възлиза на 89,6%. По същия начин се работи с окситетра-циклинов хидрохлорид ацетат, съгласно полу-ченото в пример 3. Продуктът от пример3(188,06 г) се разтваря в 185 ml вода. По-малкото количество от неразтворени примесисе филтрира през пласт филтрационна;пръсти филтруваната утайка се промива в смес от10 ml метанол и 1 ml вода. При прибавянетона капки на смес от 1050 Ml метанол и 192 mlконцентрирана солна киселина при условията,посочени при получаването на продукта от при-мер 2, от филтрата се утаява окситетрацикли-нов хидрохлорид с биологичен потенциал 933 5