BG62093B1

BG62093B1 - Инхибитори на hiv протеаза

Info

Publication number: BG62093B1
Application number: BG100643A
Authority: BG
Inventors: Joel R. Huff; Joseph P. Vacca; Bruce D. Dorsey
Original assignee: Merck & Co.
Priority date: 1993-12-15
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-02-26
Also published as: ATE215952T1; US5646148A; KR100234863B1; JPH09506619A; ES2174921T3; DE69430385T2; EP0734387A1; EP0734387B1; DE69430385D1; FI962488A0; CZ158696A3; JP3000564B2; HUT74681A; FI962488A; SK75796A3; CA2178760A1; PL314984A1; BR9408305A; AU692509B2; CA2178760C

Description

Изобретението се отнася до съединения, които инхибират протеазата, кодирана от вирус на човешка имунна недостатъчност (HIV) или до техни фармацевтично приемливи соли. Тези

съединения могат да се използват за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, за лечение на инфекции, причинени от HIV, както и за лечение на синдрома на придобитата имунна недостатъчност (СПИН). Изобретението се отнася и до фармацевтични състави, съдържащи съединенията и до метод за използване на съединенията, съгласно изобретението и други средства, за лечение на СПИН и на вирусна инфекция, причинена от HIV.

ПРЕДШЕСТВУВАШО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Ретровирусът, наречен вирус на човешка имунна недостатъчност (HIV), е етиологичен причинител на комплексно заболяване, което включва прогресивна деструкция на имунната система (синдром на придобита имунна недостатъчност; СПИН) и дегенерация на централната и периферната нервни системи. Този вирус, по-рано, е бил известен като LAV, HTLV-III или

ARV. Характерна особеност на ретровирусната репликация е екстензивната посттранслационна обработка на полипротеинови прекурсори от вирусно кодирана протеаза, за да се генерират зрели вирусни протеини, необходими за вирусиста цялост и функциониране.Инхибирането на тази обработка предотвратява продуцирането на естествения инфекциозен вирус.Така например, Kohl, N.E. и др. в Proc, Nat l

Acad, Sei., &5l, 4686 (1988) показват, че генетично инактивиране на протеазата, кодирана от HIV, води до получаване на незрели неинфекциозни вирусни частици. Тези резултати показват, че инхибирането на HIV протеазата представлява един перспективен метод за лечение на СПИН и за профилактика или лечение на инфекции, причинени от HIV.

Нуклеотидната последователност на HIV показва присъствието на pol-ген в една отворена рамка на разчитане [виж Ratner, L. et al., Nature. 313. 277 (1985)]. Хомоложността на аминокиселинната последователност доказва, че pol-последователността кодира обратна транскриптаза, ендонуклеаза и HIV протеаза.[Toh, Н. et al., EMBO J.. 4 1267 (1985); Power, M.D. et al., Science., 231, 1567 (1986); Pearl, L.H. et al., Nature. 329. 351 (1987)]. Заявителите показват, че съединенията, съгласно изобретението, са инхибитори на HIV протеаза.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съединенията с формула I, представена по-долу, могат да се използват за инхибиране на HIV протеаза, за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, за лечение на инфекции, причинени от HIV, както и за лечение на СПИН. Обект на изобретението са и фармацевтично приемливите соли на тези съединения, съединенията като ингредиенти на фармацевтични състави, включени самостоятелно или заедно с други антивирусни средства, имуномодулатори, антибиотици или ваксини. Описани са и методи за лечение на СПИН, методи за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, както и методи за лечение на инфекции, причинени от HIV.

В описанието са използвани следните съкращения:

СЪКРАЩЕНИЯ

Обозначение

ВОС (Вос)

CBZ (Cbz)

Защитна група трет-бутилоксикарбонил бензилоксикарбонил(карбобензокси)

TBS (TBDMS) трет-бутилдиметилсилил

Активираща група

НВТ (НОВТ или HOBt) 1-хидроксибензотриазол хидрат

ВОР реагент

BOP-CI

EDC

Свързваш реагент бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфониев хексафлуорфосфат бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфинов хлорид

1-етил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид хидрохлорид

(ВОС)₂О (ВОС₂О) n-Bu₄N ⁺ F' n-BuLi (n-Buli)

DMF

Et₃N

EtOAc

TFA

DMAP

DME

LDA

THF

Други ди-трет-бутилдикарбонат тетрабутиламониев флуорид норм-бутиллитий диметилформамид триетиламин етилацетат трифлуороцетна киселина диметиламинопиридин диметоксиетан литиев диизопропиламид тетрахидрофуран

Изобретението се отнася до съединения с формула I, до комбинации от такива съединения или техни фармацевтично приемливи соли, които се използват за инхибиране на HIV протеаза, за профилактика или лечение на инфекции, причинение от HIV, както и за лечение на синдрома на придобита имунна недостатъчност (СПИН). Съединенията, съгласно изобретението, се представят със следната формула (I):

(I) или са техни фармацевтично приемливи соли.

като във формула (I):

е стабилен 8- до 10-атомен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като този хетероцикъл се състои от въглеродни атоми и от 1 до 3 хетероатома, избрани от N, S или О и може да бъде незаместен или заместен с ОН, халоген, С₁.₄алкил, оксо; при условие, че

не означава

, нито

Един аспект на изобретението представляват съедине нията с формула I или техни фармацевтично приемливи соли, в които:

е стабилен 8- до 10-атомен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като хетероцикълът се състои от въглеродни атоми и 2 хетероатома, избрани от N или О,

и двата хетероатома се намират в различни пръстени.

Втори аспект на изобретението представляват съединенията с формула I, в които:

или

и X е О или S както и техни фармацевтично приемливи соли.

Трети аспект на изобретението са съединения с формула

I, в които

е ограничено до

или техни фармацевтично приемливи соли.

Конкретно съединение, обект на изобретението, е съединение А:

което представлява М-(2(В)-хидрокси-1(3)-инданил)-2(В)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)-2(8)М -(Ьбутилкарбоксамидо) пиперазинил))пентанамид, или негова фармацевтично приемлива сол.

Съединенията, съгласно изобретението, имат хирални центрове и се получават като рацемати, рацемични смеси и като отделни диастереомери, или енантиомери, като всички изомерни форми са обект на изобретението. Рацемичната смес включва смеси от стереоизомери в съотношение 50:50 или в други съотношения.

Когато всяка променяща се част (например, ) се съдържа повече от един път във всеки елемент или във формула I, то нейната дефиниция във всички отделни случаи е независима. Така също, комбинациите от заместители и/или променящи се елементи от формулата са допустими само, ако тези комбинации водят до стабилни съединения.

Както е използван тук терминът „алкил“, ако не е казано

нещо изрично, означава правоверижна или с разклонена верига наситена алифатна въглеводородна група със съответния брой въглеродни атоми (Ме е метил, Et е етил, Рг е пропил, Ви е бутил); „Халоген“ означава флуор, хлор, бром и йод.

фармацевтично приемливите соли на съединенията с формула I (под формата на водо- или маслоразтворими или диспергируеми продукти) са обичайните нетоксични соли или кватернерните амониеви соли, които се получават, например, с неорганични или органични киселини или основи. Примери за присъединителни с киселина соли са: ацетат, адипат, алгинат, аспартат, бензоат, бензенсулфонат, бисулфат, бутират, цит

рат, камфорат, камфорсулфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, дихидрохлорид, дифосфат, додецилсулфат, етансулфонат, фумарат, глюкохептаноат, глутамат, глицерофосфат, хемисулфат, хептаноат, хексаноат, хидрохлорид, хидробромид, хидройодид, 2-хидроксиетансулфонат, лактат, малеат, метансулфонат, 2-нафталенсулфонат, никотинат, нитрат, оксалат, памоат, пектинат, персулфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пик рат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартарат, тиоцианат, тозилат, и ундеканоат. Основните соли включват: амониеви соли, соли на алкални метали, като натриеви или калиеви соли, соли на алкалоземни метали, като калциеви и магнезиеви соли, соли с органични основи, като дициклохексиламинни соли, N-метилD-глюкамин и соли с аминокиселини, като аргинин, лизин и т.н.

Освен това, основните групи, съдържащи азот, могат да се

кватернизират с такива средства като нисшалкилхалогениди, като например, метил-, етил-, бутил- и пропил-хлориди, бромиди и йодиди; диалкилсулфати, като диметил-, диетил-, дибутил-; и диамил-сулфати, дълговерижни халогениди, като децил-, лаурил-, миристил-, и стеарил-хлориди, бромиди и йодиди, аралкилхалиди, като бензил и фенетилбромиди и други. Други фармацевтично приемливи соли са сулфатна сол на етанолат и сулфати.

По-долу са представени схеми 1-11 за получаване на новите съединения, съгласно изобретението. Примерите илюстрират прилагането на тези схеми за получаване на конкретни съе динения.

Амидните връзки, използвани за образуване на съединенията, съгласно изобретението, обикновено се получават като се прилага карбодиимидният метод с такива реагенти като дициклохексилкарбодиимид или 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. Други методи за образуване на амидна или пептидна връзка включват, без да се ограничават до спо менатите, синтези, използващи киселинен хлорид, азид, смесен анхидрид или активиран естер. Обикновено, амидното свързване се осъществява в разтвор, но може да се използва и синтез в твърда фаза по класическия метод на Мерифийлд. Обичайна практика е и добавянето и отстраняването на една или повече защитни групи

Допълнителна информация във връзка с известните синтези може да се получи от ЕР 337,714 и ЕР 541,168.

Един метод за получаване на съединения с формула I е показан на схема I. Дихидро-5(8)-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)-3(2Н)-фуранон (съединение 1, по-долу) се получава по известните стандартни методи от търговския продукт дихидро5(в)-(хидроксиметил)-2(ЗН)-фуранон. След алкилиране на съединение 1, при което се получава съединение 2, се отстранява защитната група в лактона 2 с помощта на воден разтвор на HF и се получава съединение 3.

Алкохолната група в съединение 3 се активира чрез превръщане в напускаща група , като мезилат, тозилат или трифлат, като алкохолът се обработва със сулфонилхлорид или (за предпочитане) със сулфонов анхидрид, като трифлуорметансулфонов анхидрид, в присъствието на запречена амино основа, като триетиламин, диетилизопропиламин или 2,6лутидин, при което се получава съединение, като съединение 4. Напускащата група в съединение 4 се замества с амин 5, като 4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-пиперазин-2(в)-карбоксамид, в разтворител като диметилформамид или кеилен, като се получава съединение, като съединение 6. Трифлуорметансулфонилокси група може да се замести с амин при стай-

на температура в разтворител, като изопропанол или метиленхлорид чрез взаимодействие с Ν,Ν-диизопропилетиламин.

Съединение 6 се хидролизира с воден разтвор на литиев или натриев хидроксид и получената хидроксикиселина 7 се превръща в защитена хидроксикиселина 8. За удобство, хид роксилната група е защитена със стандартна силилна защитна група, като t-бутилдиметилсилил или t-бутилдифенилсилил.

След това, защитената хидроксикиселина 8 се свързва с желания R¹² амин, за да се получи съединение 9 и силилната защитна група се отстранява с флуориден йон, като се получава съединение 10.

-10CXEMA I

ίο

(CF₃SO₂ )₂O

Δ, xylene

R = CH₃SO₂

R = CF₃SO₂

LiOH

DME

H 'CONH-|¹· ! ?^iCI 2. MeOH

Boc₄

OTBS r3

CONH -|COOH

- 11 БХЕЙА I-/ПРОДЪЛЖЕНИЕ/

H₂N-R¹²

EDC/HOBt

CONH -Η N-R¹²

CONH -ΙΗ N-R¹²

IQ

- 12СХЕМА II

♦

- 13 СХЕМА II (ПРОДЪЛЖЕНИЕ)

Един предпочитан метод е получаването на епоксида 12 чрез взаимодействие на 11 в присъствието на силна основа.ί i Силната основа трябва да бъде метал-съдържаща основа, вJ инертен безводен органичен разтворител, като например,| циклични или ациклични въглеводороди, включително хексан, пентан, циклохексан и др. Подходящи силни основи са:

'· | LiN[ (CH₃)₃Si]₂, KN[ (CH₃)₃Si]₂, NaN[ (CH₃)₃Si]₂, п-бутиллитий, (n-;

I I BuLi), s-BuLi, t-ByLi, калиев t-бутилат, литиев диизопропиламид (LDA), литиев изопропилциклохексиламид, литиев пиролидид, литиев тетраметилпиперидид, фениллитий, изопропилмагнезиев хлорид, изобутилмагнезиев хлорид и други подобни силни

- 14 основи, известни за целта. Предпочитани силни основи са: LiN[(CH₃)₃Si]2, n-BuLi, s-BuLi и LDA, като особено предпочитани са LiN[(CH₃)₃SiJ2 и n-BuLi. За предпочитане се използват около 1 до 2 молни еквивалента силна основа на един молен еквивалент от съединение 11.

Съединение 13 се получава чрез взаимодействие на съединение 12 с Ь1-трет-бутил-4- (1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(Б)-карбоксамид (5.). За предпочитане, се използват от 1 до 3 молни еквивалента от амин 5. за 1 молен еквивалент от епоксид 12., като съотношение от 1.05:1 молни еквивалента на V:IV е особено предпочитано.

Тази реакция може да протече във всеки подходящ разтворител, като например, такъв избран от въглеводороди, като толуен, етери, като диетилетер, алкохоли, като метанол, етанол или изопропанол, нитрили, като ацетонитрил и естери, като етилацетат иди в комбинация от изброените разтворители. За предпочитане се използва алкохол, като особено предпочитан е изопропанолът. Реакционната температура може да се поддържа от стайна до температурата на кипене на използвания разтворител, но се предпочита повишена температура, например в границите от 80°С до 90°С, като оптималната температура е от 83°С до 85°С.

Активирани глициди се получават по известни методи, като тези, описани в J. Klunder et al., J. Org. Chem.. 1989, 51, 1295-1304 и в съответната литература, цитирана там.

Амиди, като съединение 11. могат да се получат по стандартни методи, известни на специалиста в тази област, като например метода, описан в пример 10, като се използват съответните изходни вещества.

- 15 Защитни групи, като защитни групи на азота, се използват там, където е подходящо при осъществяване на изобретението. Например, азотът на 4-то място в 2-трет-бутилкарбоксамидпиперазин може да бъде защитен с група като ВОС, CBZ, бензилова, 4-метоксибензилова, 2,4-диметоксибензилова, трифлуорацетамидна, триалкилсилилова или други известни групи за целта.

Съединение с формула 15

в която Р е защитна група на азота, като ВОС или CBZ, също се получава по метода, представен на схема I, като за предпочитане, в случая се използва 5-трифлуорметансулфон

илоксиметилов аналог на лактон 4.

Съединенията с формула 16

NH-R

могат да се получат като се използва разновидност на метода, от съединение 14

1А

- 16 Съединение 14 се получава след отстраняване на защитната група на азота в съединение 15 и като се използват добре известни методи, като например, каталитично хидрогениране, за да се отстрани групата CBZ или обработване с триметилсилилтрифлат и 2,6-лутидин при температура около 0°С, в разтворител, като метиленхлорид, или обработване с 6N солна киселина в изопропанол, за да се отстрани ВОС групата.

Азотът на 4-то място в пиперазиниловия пръстен на съединение 14 може да се алкилира със съединение с формула R¹-X в разтворител, като диметилформамид, в присъствието на Et₃N при стайна температура, като X означава -CI, -Вг, или -I. Начините за провеждане на тези реакции са известни на специалиста в тази област.

Таблицата в пример 3, по-долу, също илюстрира съединенията, съгласно изобретението.

Съединенията, съгласно изобретението, са полезни за по лучаване на антивирусни съединения и за провеждане на скрининги с тях. Така например, съединенията, съгласно изобре-

тението, са полезни за изолиране на ензимни мутанти, които са отлични скринингови инструменти за по-ефикасни антивирусни съединения. Освен това, съединенията, съгласно изоб ретението, -са полезни за установяване или определяне мястото на свързване на други антивирусни вещества с HIV протеаза, например чрез конкурентно инхибиране. Или, съединенията, съгласно изобретението, са търговски продукти, предназначени за споменатите цели.

Съединенията, съгласно изобретението, се използват за инхибиране на HIV протеаза, за профилактика или лечение на инфекции, причинени от HIV и за лечение на съответно предизвикани патологични състояния, като СПИН. Лечението на СПИН

или профилактиката или лечението на инфекции, причинени от HIV, както бяха изброени, само се включват (без да се ограничават до тях) в третирането на широк спектър от състояния, предизвикани от HIV инфекции: СПИН, ARC (СПИН-свързан комплекс), както симптоматично, така и асимптоматично, при реално или потенциално излагане на HIV. Например, съединенията, съгласно изобретението, са полезни за лечение на инфекции, причинени от HIV, след предполагаемо излагане на действието на HIV при кръвопреливане, трансплантация на органи, смяна на телесни течности, охапвания, случайни убождания с игла или преливане на кръв при операции.

За тези цели, съединенията, съгласно изобретението, могат да се прилагат орално, парентерално (включително подкожно инжектиране, интравенозно, интрамускулно, интрастернално инжектирани или чрез инфузия), чрез инхалация със спрей или ректално, в дозирани единични форми, съдържащи обичайни нетоксични фармацевтично приемливи носители,

помощни средства и вехикулуми.

Следователно, съгласно изобретението се предлагат метод и фармацевтичен състав за лечение на инфекции, причинени от HIV и СПИН. Лечението включва приемане от нуждаещия се от такова лечение пациент на фармацевтичен състав, съдържащ фармацевтичен носител и терапевтично ефективно количество от съединение, съгласно изобретението или от негова фармацевтично приемлива сол.

Тези фармацевтични състави могат да бъдат под формата на орално приложими суспензии или таблетки; назални спрей ове; стерилни инжекционни препарати, като например, стерилни инжекционни водни или маслени суспензии или супозитории.

- 18 Когато се прилагат орално, във вид на суспензии, тези състави се приготвят по известните методи за формулиране на фармацевтични средства и могат да съдържат микрокристална целулоза като пълнител, алгинова киселина или натриев алгинат като суспендиращо средство, метилцелулоза за повишаване на вискозитета и подсладители/вкусови добавки, известни за тази цел. Когато се приготвят таблетки за бързо разтваряне, тези състави целулоза, двукалциев лактоза и/или други могат да съдържат микрокристална фосфат, нишесте, магнезиев стеарат и ексципиенти (добавки), свързващи ве щества, пълнители, разредители и смазващи вещества, извест ни за целта.

фармацевтичните състави за аерозолно прилагане, през носа или чрез инхалация, се приготвят по познати за специа листа начини за формулиране на фармацевтични състави и могат да се получат чрез разтваряне във като се използва бензилов алкохол или серванти, промотори на абсорбцията за физиологичен разтвор други подходящи конповишаване на биологичната пригодност, флуоровъглероди и/или други солюбилизи ращи или диспергиращи средства, известни за тази цел.

Разтворите или суспензиите за инжектиране се приготвят по познат начин, като се използват парентерално приемливи разредители манитол, 1,3-бутандиол, вода, рингеров подходящи нетоксични или разтворители, като разтвор или изотоничен разтвор на натриев хлорид, или подходящи диспергиращи, или омокрящи вещества, или суспендиращи средства, като стерилни леки нелетливи масла, включително синтетични моно-или диглицериди и мастни киселини, като олеинова киселина.

Супозиториите за ректално прилагане могат да се приготвят чрез смесване на активното вещество с подходящо

- 19 недразнещо вещество, като какаово масло, синтетични глицеридни естери или полиетиленгликоли, които са твърди при стайна температура, но се втечняват и/или се разтварят при ректално приложение, като се освобождава активното вещество.

Дозата, която е необходима за лечение или профилактика на посочените по-горе състояния, е от порядъка на 0,02 до 5,0 или 10 g дневно, като при орално приложение е необходима два до пет пъти по-висока доза. Така например, за лечение на инфекция, причинена от HIV, се препоръчва приемане на 1.0 до 50 милиграма от съединението на килограм телесно тегло, от един до четири пъти дневно. При един предпочитан режим, всеки пациент приема от 100 до 400 милиграма на всеки шест часа. Разбираемо е ,че конкретната доза и честотата на приемане на дозата се определя за всеки пациент в зависимост от голям брой фактори, включително от активността на използваното конкретно съединение, метаболитната стабилност и продължителността на действие на съединението,

както и от възрастта, телесното тегло, общото здравословно състояние, пола, храненето, начина и времето на прилагане, скоростта на изхвърляне от организма, комбинацията от лекарства, остротата на даденото състояние и от поносимостта на лечението.

Изобретението се отнася и до комбинации от съединения, инхибиращи HIV-протеаза с едно или повече средства, полезни за лечение на СПИН. Така например, съединенията, съгласно изобретението, могат да се прилагат ефективно преди и/или след периоди на прилагане, или в комбинация с ефективни количества от антивирусни средства срещу СПИН, имуномодулатори, средства срещу ифекции или ваксини, известни на специалиста в тази област.

-20ТАБЛИЦА

ПРОТИВОВИРУСНИ СРЕДСТВА

Наименование на лекарството AL-721	Производител Ethigen (Los Angeles, СА)	Показание СПИН-свързващ комплекс (ARC), PGL, HIV-позитивно, СПИН
рекомбинантен чо-	Triton Biosciences	СПИН, сарком на
вешки β-интерферон	(Almeda, CA)	Капоши, ARC
ацеманан	Carrington Labs (Irving, TX)	ARC (виж също имуномодулатори)
цитовен	Syntex	цитомегаловирусно (CMV) увреждане на зрението
ганцикловир	(Palo Alto, CA)	периферен цитомегаловирусен ретинит
d4T дидехидродеок- ситимидин	Bristol-Myers (New York, NY)	СПИН, ARC
ddl дидеоксиинозин	Bristol-Myers (New York, NY)	СПИН, ARC
EL10	Elan Corp., PLC	HIV-инфекция (виж

(Gainesville, GA)

тринатриев фосфоноформиат дидеоксицитидин ddC новапрен пептид T октапептидна последователност зидовудин;

азидотимидин (AZT) напреднал СПИН,

ARC

Astra Pharm.

Products, Inc.

(Westborough, MA)

Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)

Novaferon Labs, Inc. (Akron, OH) Diapren, Inc.

(Roseville, MN, marketer)

Peninsula Labs.

(Belmont, CA)

Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park

NC) също имуномодулатори)

CMV ретинит, HIVинфекция, други CMV-инфекции

СПИН, ARC инхибитор на HIV

СПИН

СПИН, напреднал, ARC, детски СПИН, сарком на Капоши, асимптоматична HIVинфекция, в по-лека форма HIV-заболяване, неврологично заболяване, в комбинация с други лечения.

	Ансамицин LM 427	Adria Laboratories (Dublin, OH Erbamont (Stamford, CT)	ARC
	декстран сулфат	Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japan)	СПИН, ARC, асимп- томатично HIV-по- зитивно
	виразол	Viratek/ICN	асимптоматично HIV
	рибавирин	(Costa Mesa, CA)	позитивно, синдром на лимфаденопатия (LAS), ARC
	алфа интерферон	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Parc, NC)	сарком на Капоши, HIV в комбинация с w/ретровирус
•	ацикловир	Burroughs Well- come	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, в комбинация с AZT
	антитяло, неутрализиращо pH лабилен α-аберантен интер-	Advanced Biothera- py Concepts (Rockville, MD)	СПИН, ARC

ферон в имуноадсорбционна колона

В	Merck (Rahway, NJ)	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.
	с	Merck (Rahway, NJ)	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.
	Невирапин	Boehringer Ingelheim	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.

ИМУНОМОДУЛАТОРИ

Наименование на

Производител

лекарството

AS-101

Weth-Ayerst Labs. СПИН (Philadelphia, PA) бропиримин

Upjohn (Kalamazoo, Ml) напреднал СПИН ацеманан

Carrington Labs., Inc

СПИН, ARC (виж съCL246.738 (Irving, TX)

American Cyanamid (Pearl River, NY)

Lederle Labs що антивирусни)

СПИН, сарком на

Капоши (Wayne, NJ)

EL10	Elan Corp, PLC (Gainesville, GA)	HIV-инфекция (виж също антивирусни)
гама-интерферон	Genentech (S. San Francisco, CA)	ARC, в комбинация с /TNF (фактор на туморна некроза)
гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Genetics Institute (Cambridge, MA) Sandoz (East Hanover, NJ)	СПИН
гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Hoeschst-Roussel (Sommerville, NJ) Immunex (Seattle, WA)	СПИН
гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Schering-Plough (Madison, NJ)	СПИН,СПИН в комбинация с /AZT
HIV Core Particle имуностимулатор	Rorer (Ft. Washington, PA)	HIV-серопозитивен

IL-2

Cetus

СПИН в комбинация интерлевкин-2 (Emeryville, СА) с /AZT

IL-2

Hoffman-La Roche

СПИН, ARC, HIV в интерлевкин-2 (Nutley, NJ) комбинация c /AZT

Immunex

имуноглобулин интравенозен (човешки)	Cutter Biological (Berkeley, СА)	детски СПИН, в комбинация с /AZT
IMREG-1	Imreg	СПИН, сарком на
	(New Orleans, LA)	Капоши, ARC, PGL
IMREG-2	Imreg	СПИН, сарком на
	(New Orleans, LA)	Капоши, ARC, PGL
Ф
имутиолдиетилди-	Merieux Institute	СПИН,ARC
тиокарбамат	(Miami, FL)
алфа-2 интерферон	Schering Plough	сарком на Капоши,
	(Madison,NJ)	с /AZT:CnHH
метионин-	TNI Pharmaceutical	СПИН, ARC
енкефалин	(Chikago, IL)
Ф МТР-РЕ	Ciba-Geigy Corp.	сарком на Капоши
мурамилтрипептид	(Summit, NJ)
гранулоцитен коло-	Amgen	СПИН, в
нийстимулиращ	(Thosand Oaks, CA)	комбинация с 1кТХ
фактор
rCD4	Genentech	СПИН, ARC
рекомбинантен раз-	(S. San Francisco,
творим човешки	CA)
CD4

rCD4-lgG хибриди

СПИН,ARC рекомбинантен разтворим човешки

CD4 интерферон алфа

2а

SK&F106528 разтворим Т4 тимопентин тумор некротичен фактор (TNF)

Biogen (Cambridge, МА)

Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)

Smith, Kline &

French Lab. (Philadelphia, PA)

Immunobiology Research Institute (Annandale, NJ)

Genentech (S. San Francisko, CA)

СПИН,ARC сарком на Капоши, СПИН, ARC, в комбинация с w/AZT

HIV-инфекция

ARC, в комбинация с /гама интерферон

ПРОТИВОИНФЕКЦИОЗНИ СРЕДСТВА наименование на лекарството клиндамицин с примакуин производител

Upjohn (Kalamazoo, Ml) показание пневмоцистна пневмония (РСР)

флуконазол	Pfizer (New York, NY)	криптококови менингити, кондидоми коза
пастила нистатин пастила	Squibb Corp. (Priceton, NJ)	предпазване от ус на кандидомикоза
орнидил ефлорнитин	Merrell Dow (Cincinnati, OH)	РСР
пентамидин изетионат (IM & IV)	LyphoMed (Rosemont, IL)	лечение на РСР
триметоприм		антибактериално
триметоприм/сулфа		антибактериално
пиритрексим	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)	лечение на РСР
пентамидин изетионат за инхалация спирамицин	Fisons Corporation (Bedford, MA) Rhone-Poulenc Pharmaceuticals (Princeton, NJ)	профилактика на РСР криптоспоридийна диария
интраконазол- R51211	Janssen Pharm. (Piscataway, NJ)	хистоплазмоза; криптококови

менингити триметрексат

Warner-Lambert

РСР наименование на лекарството рекомбинантен

ДРУГИ производител

Ortho Pharm. Corp.

човешки еритропои- (Raritan, NJ) етин остра анемия, свързана с лечение на AZT

мегестрол ацетат

Bristol-Myers (New York, NY) лечение на анорексия,свързана с/СПИН общо чревно хранене

Norwich Eaton

Pharmaceuticals (Norwich, NY) диария и смутена чревна абсорбция, свързана със СПИН

Ясно е, че броят на комбинациите от съединения, съгласно изобретението и СПИН-антивирусни вещества, имуномодулатори, противоинфекциозни вещества или ваксини, не се ограничава до този на изброените в списъка по-горе, а включва по-принцип всяка комбинация с фармацевтично средство, полезно за лечение на СПИН.

Някои съединения от горната таблица имат следните наименования: съединение В е 6-хлор-4-(8)-циклопропил-3,4-дихидро-4-((2-пиридил)етинил)хиназолин-2(1 Н)-он; съединение С е (-) 6-хлор-4-(8)-трифлуорметил-1,2-дихидро-4(Н)-3,1-бензоксазин-2-он; невирапин е 11-циклопропил-5,11-дихидро-4-метил-6Ндипиридо[3,2-Ь:2’,3’-е][1,4]диазепин-6-он. Съединения В и С се получават по методи, описани в ЕР 569,083, цитиран тук с тази цел. Невирапинът е синтезиран от Klunder, J.M. et al.. J, Med, Chem.. 35, 1887 (1992); Hargrave, K.D. et al., J, Med. Chem.. 34. 2231 (1991); Cohen, K.A. et al., J, Biol, Chem.. 266. 14670 (1991), като тези източници са цитирани тук, съответно.

Предпочитани комбинации са едновременно или последователно третиране с инхибитор на HIV протеаза и с ненуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза. Евентуален трети компонент в комбинацията е нуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза, като AZT, ddC или ddl. Предпочитан инхибитор на HIV протеаза е съединение А. Към предпочитаните ненуклеозидни инхибитори на HIV обратима транскриптаза спадат съединение В, съединение С или невипарин. Тези комбинации могат да проявяват синергитични ефекти при ограничаване разпространението на HIV. Предпочитани комбинации са: (1) съединение А и предпочитан ненуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза и евентуално, AZT или, ddl, или ddC; (2) съединение А и който и да е от AZT, ddl или ddC.

Опил за инхибиране на микробиално експресирана НЖпр отказа

Инхибирането се изследва чрез реакцията на протеазата, експресирана в Eschericia coli, с пептиден субстрат [Val-SerΘΙη-Α3η-(6βτ3Η3φτΗΛ)Αΐ3-ΡΓο-ΙΙβ-ν3ΐ, 0.5 mg/ml, която се ини циира по време на реакцята] в 50 тМ натриев ацетат, pH 5.5, при 30°С в продължение на 1 час. Към 25 μΙ от пептидния разтвор във вода се прибавят различни концентрации от инхибитора в 1.0 μΙ диметилсулфоксид. Реакцията се инициира чрез добавяне на 15 μΙ от 003 пМ протеаза (0^11 ng) в разтвор на 0033 М натриев ацетат с pH 5,5 и 0^1% говежди серумен албу- 30 мин. Реакцията се прекъсва с добавяне на 160 μΙ от 5% фосфорна киселина. Реакционните продукти се разделят чрез високоефективна течна хроматография (VYDAC с широки пори с размер 5 cm С-18 с обърната фаза, градиент-ацетонитрил, 0.1% фосфорна киселина). Степента на инхибиране на реакцията се определя от височината на пиковете на продуктите. Чрез хроматограми на независимо синтезираните продукти се правят количествени стандарти, по които се определя количеството на продуктите в състава. Съединение А показва 1С₅₀стойности около 0.27 пМ.

Изследване на клетъчно разпространение

Инхибирането на разпространението на HIV в клетъчна култура се определя съгласно Nunberg, J. Н. et al, J, Virol.. 65. 4887 (1991). В този опит МТ-4 Т-лимфоидни клетки се заразяват с HIV-1 (див тип, ако не е посочено друго), като се използва предварително определен инокулум и културите се инкубират в продължение на 24 h . За този период се установява, че <1% от клетките са позитивни като се използва индиректна имунофлуоресценция. След това, клетките добре се промиват и се разпределят в блюда с 96 ямки. В ямките се прибавя инхибитор, който е разреден серийно двукратно и култивирането продължава още 3 дни. На четвъртия ден след заразяването, 100% от клетките в контролните култури са заразени. HIV-1 р24 акумулирането директно съответства на вирусното разпространение. Концентрацията, при която се инхибира клетъчната култура, се дефинира като инхибираща концентрация в наномола/литър и това е концентрацията, която редуцира разпространението на заразата с поне 95% или се означава още като CIC₉₅. С1С₉₅ за съединение А е 25 пМ.

Инхибиране на разпространението на вируса

А. Получаване на суспензия на МТ-4 клетки, заразени с HIV

МТ клетки се заразяват в ден, означен като нулев, при концентрация 250,000 на ml, с изходен разтвор на HIV-1 щам lllb, разреден 1:1000 (крайна концентрация 125 pg p24/ml;

достатъчен, за да се заразят <1% клетки първия ден и 25-100% на четвъртия ден). Клетките се заразяват и култивират в следната среда: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10% инакти виран зародишен говежди серум, 4 тМ глутамин (Gibco Labs) и 1:100 Penicillin-Streptomycin (Gibco Labs).

Сместа се инкубира в продължение на 1 нощ при температура 37°С в атмосфера, съдържаща 5% СО₂.

Б. Лечение с инхибитори

Приготвя се матрица от комбинации от два инхибитора с концентрации в наномоларния диапазон. В първия ден , проби от по 125 μΙ от инхибиторите се прибавят към равни обеми от МТ-4 клетки, заразени с HIV (50,000 за ямка), в микротитърна паничка за клетъчно култивиране с 96 ямки. Инкубирането продължава 3 дни при температура 37°С в атмосфера, съдържаща 5% СО₂.

В. Отчитане на разпространението на вируса

Като се използва многоканална пипета, утаените клетки се ресуспендират и 125 μΙ се посяват в отделна микротитърна паничка. Супернатантата се изследва за HIV р24 антиген.

Концентрацията на HIV р24 антиген се определя чрез ензимен имуноанализ, описан по-долу. Проби от р24 антиген, подлежащи на отчитане, се прибавят в микроямки, покрити с моноклонално антитяло, специфично за HIV вътрешен антиген. Микроямките се промиват в този етап и в други подходящи етапи, които следват. Прибавят се последователно биотинилирано HIV-специфично антитяло и конюгирани стрептавидинпероксидаза от хрян. След прибавяне на водороден пероксид и тетраметилбензидинов субстрат, се получава цветна реакция. Интензитетът на цвета е пропорционален на концентрацията на HIV р24 антигена.

Изчисляване на синергизма или степента на усилване на инхибирането

Когато комбинацията от двата инхибитора е синергична, то тя усилва забележимо инхибирането на разпространението на вируса, в сравнение с действието на отделния инхибитор или

в сравнение с простото наслагване на действието на отделните инхибитори в комбинацията.

Резултатите се обработват по следния начин: концентрациите, при които инхибиторите действат поотделно се изчисляват по метода на Elion, et al., J, Biol. Chem.. 208. 477 (1954). Минималната сума от стойностите на тези концентрации, която дава максималния синергизъм, се определя за различни комбинации от инхибитори. Колкото по-малка е сумата, толкова по силно изразен е синергизъмът.

ПРИМЕР 1

Получаване_на N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (в)-инданил)-2(Р)-фенилметг ил-4(3)-(хидрокси)-5-(1-(2(3)-М-(трет-бутилкарбоксамидо)- пиперазинил)пентанамид, Съединение 14

Етап 1: Получаване на дихидро-5(8)-((.трет-бутилдифенилсилил)оксиметил)-3(Я)-фенилметил-3(2Н)-фуранон

Разтвор на литиев диизопропиламид се получава чрез добавяне на 1,55 ml норм-бутиллитий (2,5 М в хексан) към 0,55 ml (3,9 mmol ) диизопропиламин в 10 ml тетрахидрофуран при температура -78°С. След 30 min се прибавя разтвор на дихидро-5-(8)-((Ьбутилдифенилсилил)оксиметил)-3(2Н)-фуранон (1,38 д, 3,89 mmol ) в 5 ml тетрахидрофуран. След разбъркване в продължение на 30 min се прибавя бензилбромид (0,68 д,

3,9 mmola) и разбъркването продължава още 3 часа, след което реакцията се прекъсва с добавяне на 10%-ен воден разтвор на лимонена киселина. Разтворът се екстрахира с етилацетат (2 х 50 ml), промива се обратно с концентриран солен разтвор, суши се, филтрира се и се концентрира до получаване на масло. Продуктът се пречиства чрез хроматография (силициев диоксид, 20% етилацетат/хексан), при което се получава съе динението от заглавието.

Етап 2: Получаване на дихидро-5(8)-(хидроксиметил)-3(П)фенилметил-3(2Н)-фуранон

Към 5,26 g дихидро-5(8)-((-трет-бутилдифенилсилил)оксиме-?тил)-3(П)-фенилметил-3(2Н)-фуранон в 40 ml ацетонитрил се прибавят 1.34 ml 49%-ен воден разтвор на флуороводород. Тази смес престоява 18 h при стайна температура, след което се концентрира до сухо и остатъкът се разделя между вода (50 ml) и етилацетат (50 ml). Органичният слой се промива с концентриран солен разтвор, суши се, филтрира се и се концентрира до получаване на продукта под формата на червеникавокафяво твърдо вещество (т.т. 69-72°С).

Етап 3:

Получаване на дихидро-5(в)-((трифлуорметансулфонил)оксиметил)-3(В)-фенилметил-3(2Н)-фуранон

Към разтвор на 18,4 g (89.2 mmol ) дихидро-5(8)-(хидроксиметил)-3(А)-фенилметил-3(2Н)-фуранон в 350 ml метиленхлорид, охладен до 0°С, се прибавят 13.51 ml 2,6-лутидин (115.98 mmola), след което се прибавят на капки 16.51 ml трифлуорметансулфонов анхидрид (98,1 mmol ). Сместа престоява 1,5 h а при 0°С, след което реакционната смес се излива в 300 ml смес от лед/ наситен разтвор на NaCl и се разбърква

0,5 h . Водният слой се екстрахира с метиленхлорид (3 х 150 ml), органичните слоеве се промиват с 10% HCI (2 х 75 ml), наситен разтвор на натриев хидрогенкарбонат(100 ml), вода (100 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрира се и се концентрира, при което се получава твърд остатък. Пречистване чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm, градиент на елуиране хексани:етилацетат, 4:1 до 3:1) дава продуктът от заглавието; т.т. 53-54°С.

Етап 4: Получаване на 4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-1(фенилметилкарбониламино)-пиперазин-28-карбоксилна киселина

Съединението от заглавието се получава като се прилага метода на Bigge, C.F.; Hays, S.J.; Novak, Р.М.; Drummond, J.T.; Johnson, G.; Bobovski, T.P., Tetrahedron Lett.. 1989, 30. 5193; и като се излиза от 2(8)-пиперазинкарбоксилна киселина, (виж Felder, Е.; Maffei, S.; Pietra, 8.; Pitre, D.. Helv, Chim, Acta. 1960, 117. 888.

- 35 Етап 5: Получаване на И-1-бутил-4-(1,1-диметилетоксикарбонил амино)-1- (фенил метил карбон иламино) пипера зин-2(8)-карбоксамид

Към 9,90 g (27.16 mmol ) от продукта, получен в етап 4, разтворен в 75 ml диметилформамид и охладен до 0°С, се прибавят последователно 5,73 g (29,88 mmol ) EDC, 4_f03 g (29_z88 mmola) HOBt, 3,14 ml (29.88 тто1а)трет-бутиламин и 4,16 ml (29_;88 mmol ) триетиламин. Реакционната смес се разбърква в продължение на 18 h и се концентрира докато обемът стане наполовина. След това, сместа се разрежда с 600 ml етилацетат и се промива с 10% HCI (2 х 75 ml), наситен разтвор на натриев хидрогенкарбонат (1 х 75 ml), вода (3 х 75 ml) и с и с наситен разтвор на NaCI (1 х 50 ml ), суши се над магнезиев сулфат и се концентрира до получаване на твърда маса. Последната се стрива с етилацетат : хексан (1:2) и се филтрува, като се получава съединението от заглавието под формата на бяло твърдо вещество; т.т. 134-135°С.

Етап 6: Получаване на Н-трет-бутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(8)-карбоксамид

Към 1,20 g (2.86 mmol )Н-трет-бутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-!-(фенилметилкарбониламино)пиперазин-2(в)карбоксамид и 1,1 g (0.,086 mmol ) 10% Pd/C се прибавят 15 ml метанол. Съдът се зарежда с водород и реакционната смес се разбърква 2 h, филтрира се през целит и се промива с етанол. Разтворителите се отстраняват във вакуум, като се получава съединението от заглавието във вид на пяна.

¹Н NMR (300 MHz, CDCI₃) δ 6,65 (br, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,81 (br, 1H), 3,21 (dd, J = 18 и 7 Hz, 1H), 3,02-2_;70 (m, 4H), 2,10-2_;0 (br, 1H), 1_}50 (s, 9H), 1,41 (s, 9H).

Етап 7: Получаване на дихидро-5(в)-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино))-2(8)-1М-( трет-бутилкарбоксамидо)пиперазинил)метил-3(А)-фенилметил-3(2Н)-фуранон

Към разтвор на 22.40 g (0^662 mol .) дихидро-5(8)-((трифлу орметансул фон ил)о кс иметил)-3(В)-ф е нилметил-3(2Н)фу район (получен в етап 3) и 18,0 g (0,063 то1)М-трет-бутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(8)-карбоксамид, разтворен в 180 ml изопропанол, се прибавят 11,53 ml (0.,0662 moI ) Ν,Ν-диизопропилетиламин. След 2,5 h а се прибавят още 1.2 g дихидро-5(8)-(( трифлуорметансулфонил)оксиметил)-З(В)фенилметил-3(2Н) фуранон. Реакцията завършва (тънкослойна хроматография)след 3,5 h и реакционната смес се концентрира до гъсто масло. След разбъркване с етилацетат:хексани (1:2, 200 ml) се получава бяло твърдо вещество, което се филтриран се изхвърля. Маслото се пречиства чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm колона, градиент на елуирането 1:1, 2:1, 3:1 етилацетат:хексани), при което се получава съединението от заглавието.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 7,34-7,17 (m, 5Н), 6,31 (br s, 1H), 4,38 Ф (br m, 1H), 3,96-3,92 (m, 1H), 3,79 (br m, 1H), 3,16 (dd, J = 13,6 и 4,4 Hz, 1H), 3,08-2.99 (m, 3H), 2,90-2,82 (m, 1H), 2,80 (dd, J = 13_z5 и 8,9 Hz, 1H), 2,78 (m, 1H), 2,67-2,61 (m, 1H), 2,58-2,49 (m, 1H), 2,38-2,32 (m, 1H), 2,32-2.,04 (m, 1H), 1,99-1,92 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1.29 (s, 9H).

Етап 8: Получаване на 2(П)-фенилметил-4(8)-(Ьбутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М(Сбутилкарбоксамидо)-пиперазинил)) пентанамид

Към 25,50 g (52,50 mmol ) дихидро-5(8)-(4-(1,1-диметиле т о к с и к а р б о н и л а м и н о)) - 2 (S) - N - (трет- бутилкарбоксамидо) пипера- 37 зинил) метил)-3(Р)-фенилметил-3(2Н)-фуранон, разтворен в 120 ml DME, охладен до 0°С, се прибавя разтвор от 60 ml вода и

1_Г512 g (63,01 mmol ) литиев хидроксид. След 0,5 h реакцията се прекъсва, като се добавя 10% HCI до установяване на pH 6 и разтворът се концентрира във вакуум. Остатъкът се разтваря в 50 ml вода и се екстрахира с етилацетат (4 х 75 ml) и органичните слоеве се промиват с вода (1 х 20 ml), концентриран солен разтвор (1 х 20 ml). Водните слоеве се екстрахират с етилацетат (2 х 75 ml) и обединените органични слоеве се сушат над магнезиев сулфат, след което се концентрират до жълто твърдо вещество. Суровият продукт се разтваря в 100 ml диметилформамид и се прибавят последователно 17,87 g (0,262 mola) имидазол, охладен до 0° и 31,50 g (0.21 mol) трет-бутилдиметилсилилхлорид. Тази смес се разбърква 1 h при 0°С, след

което се затопля до стайна температура. След 20 h се добавят 10 ml метанол и реакционната смес се концентрира до намаляване на обема наполовина. Прибавят се 100 ml буферна вода с pH 7 и водният слой се екстрахира с етилацетат (4 х 100 ml), събраните органични слоеве се промиват с 10% HCI (2 х 50 ml), с вода (3 х 75 ml) и с наситен разтвор на NaCl (1 х 50 ml), сушат се над магнезиев сулфат и се концентрират до получаване на съединението от заглавието. Този продукт се използва директно в следващия етап.

Етап 9: Получаване на N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (8)-инданил)-2(В)-фенилметил-4(8)-(трет- бутилдиметилсилилокси)-5-(1 -(4-(1,1 -диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М-( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил)) пентанамид

Към 27_r0 g (0.0446 mol ) непречистен продукт от етап 6, разтворен в 180 ml диметилформамид и охладен до 0°С, се

- 38 прибавят 8.98 g (0,0468 mol ) EDC, 6_?32 g (0,0468 mol ) HOBt и 7,31 g (0.049 mol ) аминохидроксииндан. Прибавя се триетиламин (6,52 ml, 0_f0468 mol ) и реакционната смес се разбърква при 0°С в продължение на 22 h , след това при стайна температура 16 h и се реакцията се прекъсва чрез разреждане с 500 ml етилацетат. Органичният слой се промива с 10% HCI (2 х 100 ml), с наситен разтвор на натриев хидрогенкарбонат (1 х 100 ml), С вода (3 х 150 ml) и с наситен разтвор на NaCl (1 х 75 ml), суши се над магнезиев сулфат и се концентрира, като се получава съединението от заглавието под формата на бяла пяна.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 7,4-7,17 (m, 9Н), 6,51 (br s, 1H), 5,79 (br s, 1H), 5,23 (m, 1H), 4,23 (br s, 1H), 4,06 (m, 1H), 3,96-3,84 (m, 2H), 3,07-2.78 (m, 8H), 3,65 (dd, J = 9,6 и 4,1 Hz, 1H), 2,56-2.44 (m, 2H), 2₍29 (dd, J = 12,0 и 4,5 Hz, 1H), 2,17-2.,09 (m, 1H), 1,79 (br s, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (s, 1H), 0,84 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H).

Етап 10: Получаване на N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (в)-инданил)-2(В)фенилметил-4(3)-(хидрокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(3)-1М-( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил)) пентанамид

Към 32,20 g (0,0437 mol ) М-(2(Р)-хидрокси-1(8)-инданил)2(Р)-фенилметил-4(8)-трет-бутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2 (S)-N-( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил))-пентанамид се прибавят 437 ml (0,437 mol ) тетрабутиламониев флуорид (1 _?0 М разтвор в тетрахидрофуран, Aldrich). Реакционната смес се разбърква 1 18 h, след което се концентрира до 200 ml и се разрежда със 700 ml етилацетат. Промива се с вода (2 х 100 ml), с наситен разтвор на NaCl (1 х 50 ml) и водните слоеве се екстрахират отново с етил39 ацетат (2 х 200 ml). Обединените органични слоеве се сушат над магнезиев сулфат и се концентрират до получаване на масло. След пречистване чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm колона, градиентно елуиране с CH₂CI₂:CHCI₃, наситен с амоняк:метанол, нарастваща концентрация на метанол от 1%, 1.5%, 2%) се получава съединението от заглавието във вид на бяла пяна.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 7.31-701 (m, 9Н), 6,41 (br s, 1H), 6,23 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 8,6 и 4,7 Hz, 1H), 4,21 (m, 1H), 3,83-3,82 (m, 2H), 3.22-3.19 (m, 2H), 3,03-2,78 (m, 8H), 2,62-2,58 (m, 1H), 2,41-2,35 (m, 2H), 2,04-2,02 (m, 1H), 1,57-1,50 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,32 (s, 9H).

Етап 11: Получаване на N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (3)-инданил)-2(П)фенилметил-4(3)-(хидрокси)-5-(1-(2(в)-М-( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил)) пентанамид

Към 21,15 g (0,034 mol ) 1М-(2(Р)-хидрокси-1(3)-инданил)2(В)-фенилметил-4(3)-(хидрокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М-(Ьбутилкарбоксамидо) пиперазинил))пентанамид, разтворен в 350 ml метиленхлорид и охладен до 0°С, се прибавят 22,43 ml (0.204 mol ) 2,6-лутидин и след това 32,85 ml (0,170 mol ) триметилсилилтрифлат в продължение на 5 min . След 0,5 h реакцията се прекъсва с 10% HCI (80 ml) и реакционната смес се разбърква 0,5 h . Към нея се прибавят 100 ml наситен разтвор на натриев хидрогенкарбонат и след това твърд натриев хидрогенкарбонат до установяване на pH 8. Водният слой се екстрахира с етилацетат (4.x 100 ml), а обединените органични слоеве се промиват с вода (1 х 50 ml), с концентриран разтвор на NaCl (1 х 75 ml), сушат се над магнезиев сулфат и се концентрират. Остатъкът се пречиства чрез колонна

- 40 хроматография (120 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH₂CI₂:CHCI₃, наситен с NH₃:MeOH, бавно нарастваща концентрация на метанол от 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, до 10%). Получава се продуктът съгласно заглавието като бяла пяна.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 7,53 (s, 1H), 7,29-7,09 (m, 9H), 6,52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5_r24 (dd, J = 8,2 и 4,9 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 4.7 и

4,03 Hz, 1H), 4,25-4,00 (br s, 1H), 3,83-3,81 (m, 1H), 3,03-2,88 (m, 4H), 2,82-2,73 (m, 7H), 2 50-1,60 (br s, 2H), 2,45 (d, J = 6,2 Hz,

2H), 2,32-2,29 (m, 1H), 1,98 (m, 1H), 1,51 (m, 1H), 1,33 (s, 9H).

ПРИМЕР 2

Получаване на М-(2(В)-хидрокси-1(Н)-инданил)-2(Р)-фенилметил-4 (R)-хидрокси-5-(1 - (4-(3-фу ро[ 2.3-b] пиридилметил)-2(Р)-N-CrpeTбутилкарбоксамидо) пиперазинил)Упентанамид

Етап 1: Получаване на фуро[2,3-Ь]пиридин-2,5-дикарбоксилна киселина

НО

ОН

Към р-азтвор на известния [Snyder, H.R., Ebetino, F.F., J, Het. Chem.. 3., 202-205 (1966)] диетилфуро[2,3-Ь]пиридин-2,5карбоксилат (1,22 g, 4,923 mmol ) в 10 ml 95% етанол се прибавя разтвор на калиев хидроксид (0_r66 g, 11,81 mmol .), разтворен в 10 ml вода. Реакционната смес се загрява до 80°С в продължение на 3 h , охлажда се до стайна температура и се филтрира. Двукалиевата сол се разтваря във вода и се подкислява с 10% HCI до pH 2. Утайката се филтрира и се суши под вакуум, като се получават 850 mg бяло твърдо вещество.

- 41 ¹H NMR (400 MHz, (CD₃)₂SO) δ 8.98 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 8,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7.,69 (s, 1H), 4,25 (br s, 3H).

Етап 2: Получаване на фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилна киселина

ОН

Към суспензия на фуро[2,3-Ь]пиридин-2,5-дикарбоксилна киселина (0.36 g, 1_?484 mmol ) в 3 ml хинолин, под аргон, се прибавя мед на прах (180 mg, 2,82 mmoli) и се загрява до 210°С в продължение на 1,5 h. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и се разрежда с 50 ml метиленхлорид, след което се филтрира през целит. Органичният слой се екстрахира с наситен разтвор на натриев карбонат (2 х 40 ml), подкислява се до pH 3 с 3 N HCI и се филтрира, като се получават 80 mg червеникавокафяво твърдо вещество. Водният слой се екстрахира с етер/метанол (85/151 (3 х 50 ml) и се промива с концентриран разтвор на NaCI (1 х 10 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрира се и се концентрира, при което се получават още 35 mg.продукт.

¹Н NMR (400 MHz, (CD₃OD) δ 8.,89 (s, 1 Η), 8,67 (d, J = 2_;0 Hz, 1H), 7_T97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7.,01 (d, J = 2,4 Hz, 1H).

Етап 3: Получаване на метил фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилат

N

- 42 Към фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилна киселина (3,0 д, 18,40 mmol ), разтворена в 40 ml метанол се прибавят 160 ml хлороформ и след това се прибавя бавно триметилсилилдиазометан (42 ml, 10% разтвор в хексани). След 0,5 h се прибавят 4 капки ледена оцетна киселина и реакционната смес се концентрира. Получават се 3.20 g белезникаво вещество ¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 9.02 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6_?87 (d, J = 2_Z5 Hz, 1H), 3,98 (s, 3H).

Етап 4: Получаване на 5-хидроксиметилфуро[2,3-Ь]пиридин

500-милилитрова облодънна колба, изсушена на пламък, се зарежда с метил фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилат (3.20 д, 18.08 mmol ) в 90 ml тетрахидрофуран и се охлажда до 0°С. Към този разтвор се прибавя диизобутилалуминиев хидрид (46 ml, 46.1 mmol , 1 М разтвор в хексани) в продължение на 10 min и охлаждащата баня се отстранява. След 4 h реакционната смес се охлажда до 0°С, след което реакцията се прекъсва със Сегнетова сол (100 ml). След още 18 h слоевете се разделят и водният слой се екстрахира с етилацетат (4 х 40 ml). Обединените органични слоеве се промиват с концентриран разтвор на NaCl (1 х 20 ml), сушат се над магнезиев сулфат, филтрират се и се концентрират. Остатъкът се пречиства чрез флаш колонна хроматография (40 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH₂CI₂:CH₂CI₂, наситен с NH₃:MeOH

60:39:1.0 (1000 ml), 60:38:2 (1000 ml), 60:37:3 (1000 ml), 60:36:4 (1000 ml). Получават се 2.16 g бяло твърдо вещество.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 8,19 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6.,69 (d, J = 2,‘4 Hz, 1H), 4_Z78 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 4,69 (br s, 1H).

Етап 5: Получаване на хидрохлорид на 3-хлорметилфуро[2,3-Ь]пиридин

Към разтвор на 5-хидроксиметилфуро[2,3-Ь]пиридин, разтворен в 9 ml метиленхлорид, охладен до 0°С, се прибавя тионилхлорид (4,23 ml, 57,99 mmol ). Ледената баня се отстранява и след 1 h реакционната смес се концентрира до получаване на 2,86 g белезникаво твърдо вещество.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 8,40 (cl, J = 2,0 Hz, 1H), 8_Z13 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4_;74 (s, 2H).

Етап 6: Получаване на М-(2(Я)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(Р)фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)2(S)-N-(трет-бутилкарбоксамидо ) пиперазинил)) пентанамид

Към разтвор на 1М-(2(П)-хидрокси-1 (в)-инданил)-2(Р)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(2(8)-М -( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил)) пентанамид (6.50 g, 12.48 mmol ), разтворен в 12 ml диметилформамид, под аргон, се прибавят 3-хлорметилфуро[2,3-Ь]пиридин хидрохлорид (2,80 g, 13,72 mmol ) и триетиламин (5,21 ml, 37,44 mmol ). Слез 18 h реакционната смес се разрежда с 400 ml етилацетат и се промива с наситен разтвор на натриев хидрогенкарбонат(1 χ 25 ml), с вода (5 х 20 ml) и с наситен разтвор на NaCl (1 х 25 ml). Разтворът се суши над магнезиев сулфат, филтрира се и се концентрира до масло. Остатъкът се пречиства чрез флаш колонна хроматография (60 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH2CI2.CH2CI2, наситен с NH₃:MeOH 60:39:1.0 (1000 ml), 60:38:2 (1500 ml), 60:37:3 (1500 ml), 60:36:4 (1500 ml). Получената пяна се обработва (чрез стриване) с етилацетат и желаният продукт се филтрира и суши в продължение на една нощ при висок вакуум и температура 65°С. Получават се 5_л30 g бяло кристално твърдо вещество. Смесени фракции от колонната хроматография могат да се съберат и да се пречистят отново, катосеполучавадопълнителтелно количество продукт. . Т.т. 183.5-184.5°С.

¹Н NMR (400 MHz, CDCI₃) δ 8,25 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,73 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,32-7,10 (m, 9H),

6,75 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 8,5 и

4,8 Hz, 1H), 4,27-4,26 (m, 1H), 4,12 (br s, 1H), 3.89-3.83 (m, 1H), 3,51 (s, 2H), 3.29 (dd, J = 17,5 и 4,0 Hz, 1H), 3,16 (dd, J = 3,66 и 3,48 Hz, 1H), 3,15 (dd, J = 6,6 и 5,1 Hz, 1H), 2,94-2,50 (m, 11H), 2.,36-2,34 (m, 1H), 1,66 (s, 1H), 1,62-1,47 (m, 1H), 1,35 (s, 9H). Анализ Изчислено за C₃₈H₄₇N₅O₅

C, 69,81; H, 7,25; N,..10,71. Намерено: C, 69,46; H, 7,22; N,10,.69.

ПРИМЕР 3

Като се използва, по принцип, процедурата, описана в пример 2, но се обработва N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (в)-инданил)-2(Р)фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(2(8)-М -( трет-бутилкарбоксамидо) пиперазинил)) пентанамид (съединение (i), дадено по-долу) с алкилиращ агент (ii), посочен по-долу, вместо алкилиращия агент, използван в етап 6, се получават съединенията с формула (iii):

R¹-X

Cl

: ПРИМЕР 4

Получаване -на амид 1

Разтвор на (-)-цис-1-аминоиндан-2-ол (884 д, 5,93 mol ) в

17,8 I сух тетрахидрофуран (KF = 55 mg/ml) (KF означава титруване на вода по Karl Fisher) и триетиламин (868 ml, 6,22 mol ) в 50-литрова облодънна колба, снабдена с термодвойка, механична бъркалка и входящ накрайник за азот и барботьор, се охлажда до 15°С. След това се прибавя 3-фенилпропионилхлорид (1000 д, 5,93 mol ) в продължение на 75 min, като температурата в колбата се поддържа между 14-24°С с охлаждаща баня лед-вода. След добавянето, сместа се оставя да престои при температура 18-20°С 30 min и се проверява чрез високоефективна тънкослойна хроматография (HPLC) за отсъствието на (-)-цис-1-аминоиндан-2-ол.

Ходът на реакцията се следи с HPLC: 25 cm Dupont C8-RX колона, 60:40 ацетонитрил/ЮтМ (КН₂РО₄/К₂НРО4), 1.0 ml/min, инжекторен обем = 20 ml, детектиране = 200 nm, приготвяне на пробата = 500 х разреждане. Приблизителни времена на задържане:

време на задържане (min.)

6_f3 идентифициран цис аминоинданол

Реакционната смес се обработва с пиридинов р-толуенсулфонат (241 д, 0,96 mol , 0,16 екв.) и се разбърква 10 min (pH на сместа след разреждане на 1-милилитрова проба с равен обем вода е между 4,3-4,6). След това се прибавя 2-метоксипропен (1.27 I, 13,24 mol , 2.2 еквив.) и реакционната смес се загрява до 38-40°С в продължение на 2 h . Реакционната смес се охлажда до 20°С и се разделя между етилацетат (12 I) и 5%-ен воден разтвор на натриев хидрогенкарбонат (10 I). Сместа се разбърква и слоевете се разделят. Етилацетатният

екстракт се промива с 5%-ен воден разтвор на натриев хидрогенкарбонат (10 I) и с вода (4 I). Етилацетатният екстракт се суши чрез дестилация при атмосферно налягане и разтворителят се пресича с циклохексан (общ обем приблизително 30 I). В края на дестилацията и концентрирането (20 об.% екстракционен обем на етилацетата), горещият циклохексанов разтвор се оставя да се охлади бавно до 25°С, при което кристализира продуктът. Получената суспензия се охлажда допълнително до 10°С и се оставя да престои 1 h . Продуктът се изолира чрез филтриране , мократа филтърна утайка се промива със студен (10°С) циклохексан (2 х 800 ml). Промитата филтърна утайка се суши под вакуум (26“ Нд) при 40°С , при което се получават 1,65 kg ацетонид 1 (86.4%, 98% площ чрез NPLC), ¹Н NMR (300.13 MHz, CDCI3) основен ротамер) δ 7.36-7,14 (m, 9Н), 5,03 (d, J = 4,4, 1Н), 4,66 (m, 1Н), 3,15 (m, 2Н), 3,06 (br s, 2H), 2,97 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 1,37 (s, 3H); ¹³C NMR (75,5 MHz, CDCI3, основен ротамер) 5_C 168,8, 140,9, 140,8, 140,6, 128,6, 128,5, 128,4, 127,1, 126,3, 125,8, 124,1, 96,5, 78,6, 65,9, 38_z4> 36,2, 31,9, 26,5, 24,1.

Анализ	изчислено за C₂₁H₂₃NO₂ С, 78.47; Н, 7.21; N, 4.36
намерено	С, 78.65; Н, 7.24; N, 4.40

ПРИМЕР 5

Получаване на епоксид 3

Разтвор на ацетонид 1 (1000 д, 3.11 mola) и 2(8)-глици-

дилтозилат 2 (853 g, 3_Z74 mol , 1.2 екв.) в 15_f6 I тетрахидрофуран (KF = 22 mg/ml), в 50-литрова 4-гърла облодънна колба, снабдена с термодвойка, механична бъркалка, допълнителна фуния и входящ накрайник за азот, се обезгазява три кратно през вакуумно устройство за продухване на азот и се охлажда до -56°С. След това, се прибавя литиев хексаметилдисилазид (LiN[(CH₃)₃Si]₂)(2,6 I, 1,38 Μ, 1,15 екв.) в продължение на 2 h , като температурата в колбата се поддържа между -50 и -45°С. Реакционната смес се разбърква при -45 до -40°С 1 h и след това се оставя да се затопли до -25°С за 1 h .

Сместа се разбърква в продължение на 4 h при температура -25 до -22°С (или докато изходният ацетонид съответства на 3% площ).

- 51 Ходът на реакцията се следи чрез HPLC: 25 cm х 4,6 nm Zorbax Silica колона, 20% етилацетат в хексан, 2,0 ml/min, инжекторен обем = 20 ml, детектиране = 254 nm, приготвяне на пробата = 100 х разреждане. Приблизителни времена на задържане:

време на задържане (min) идентифицирани

5.5

6.5

13.5 амид 1 глицидилтозилат 2 епоксид 3

Реакционната смес се обработва бавно с дейонизирана вода (6,7 I) при -15°С и се разделя с етилацетат (10 I). Сместа се разбърква и слоевете се разделят. Етилацетатният екстракт се промива със смес от 1 % воден разтвор на натриев хидрогенкарбонат (5 I) и наситен разтвор на натриев хлорид (0_z5 I). Етилацетатният екстракт (28,3

I) се концентрира чрез вакуумдестилация (28“ Нд) и се прибавя допълнително количество етилацетат до доливане на разтворителя до такава степен, че да се пресече с етилацетата (краен обем = 11,7 I). След това, разтворителят в етилацетатния концентрат се пресича с мета нол, при което кристализира продуктът и се концентрира до краен обем 3,2 I. Остатъчният етилацетат (разтворител) се отстранява чрез добавяне на 10 I метанол и събиране на 10 I дестилат. Получената суспензия се разбърква 1 h при 22°С , след това се охлажда до 5°С и се оставя да престои 0,5 h . Продуктът се изолира чрез филтриране и мократа филтърна утайка се промива със студен метанол (2 х 250 ml). Промитата утайка се суши под вакуум (26“ Нд) при 25°С , като се полу52

ПРИМЕР 6

Суспензия от 2(8)-трет-бутилкарбоксамид-4-М-Вос-пиперазин (1950 g, 6_;83 mol , >99,5% ее) (ее = енантиомерен излишък) и епоксид 3 (2456 д, 97,5:2,5 смес от 4S/R епоксиди, 6 51 mol ) в изопропанол (2-пропанол,18,6 I), в 72-литрова облодънна колба се псмчават 727 g от епоксид 3 (61,2%, 98.7% площ, съответстваща на основното количество епоксид, съгласно HPLC):

¹³С NMR (300 MHz, CDCI₃) 5 171,1, 140.,6, 140,5, 139,6, 129,6, 128,8, 128,2, 127,2, 126.8, 125,6, 124,1, 96,8‘, 79,2, 65.8, 50.0, 48.0, 44,8, 39.2, 37.4, 36.2, 26.6, 24.1.

с 4 входящи отвора, снабдена с механична бъркалка, обратен хладник, парна баня, термодвойка, покрита с Teflon и входящ отвор за азота, се загрява до температурата на кипене на сместа (вътрешната температура е 84-85°С). След 40 min се получава хомогенен разтвор. Сместа се нагрява под обратен хладник 28 h.

Вътрешната температура по време на загряването с обратен хладник е 84-85°С. Ходът на реакцията се следи с HPLC: 25cm Dupont C8-RX колона, 60:40 ацетонитрил/1 OmM (КН₂РО₄/К₂НРО₄), 1,0 ml/min, детектиране - 220 nm, приготвяне на пробата = 2μΙ, реакционна смес, разредена до 1 ml в аце тонитрил.

време на задържане (min) идентифицирани

4.8

8.9

15.2 !

пиперазин 4 епоксид 3 свързан продукт 5

След 28 h , на остатъчния епоксид 3 и свързания продукт 5 (установено чрез HPLC) съответства площ 1,5% и 9193%, съответно. Сместа се охлажда до 0-5°С и се прибавят 20,9 I 6N HCI, като температурата се поддържа под 15°С. След като приключи прибавянето, сместа се затопля до 22°С. Забелязва се отделяне на газ в този момент (изобутилен). Сместа се ос тавя да престои при 20-22°С в продължение на 6 h .

Ходът на реакцията се следи чрез HPLC: условията са същите като тези, посочени по-горе. Приблизителни времена на задържане:

време на задържане (min)

7,0

11,9

15.1

I идентифицирани цис аминоинданол пенултимат 6 свързан продукт 5

Сместа се охлажда до 0°С и към нея се прибавят бавно 7,5 I 50% NaOH, за да се установи pH на сместа 11,6, като температурата се поддържа под 25°С по време на прибавянето. Сместа се разделя между етилацетат (40 I) и вода (3 I). Сместа се разбърква и слоевете се разделят. Органичната фаза (6 I) се концентрира при понижено налягане (29“ Нд) и разтворителят се пресича с диметилформамид, следва концентриране до краен обем 10_f5 I (KF = 1.8 mg/ml). След HPLC, добивът от 6 в етилацетат е 86.,5%. Пенултиматът 6 в диметилформамид се използва направо в следващия етап, без допълнително пречистване. За изолирано съединение 6:

¹³С NMR (75.4 MHz, CDCI₃) δ 175,2, 170,.5, 140,8, 140,.5, 139,9, 129,1, 128,5, 127,9, 126,8, 126,5, 125.,2, 124,2, 73,0, 66,0, 64,8, 62,2, 57,5, 49,5, 47,9, 46,4, 45,3, 39,6, 39,3, 38,2, 28,9.

ПРИМЕР 7

П и p а з и н - 2-трет-бутилкарбоксамид 9

СООН

2-пиразинкарбоксилна киселина (8)	3.35 kg (27 mol )
оксалилхлорид трет-бутиламин(КР = 460 pg/ml)	3,46 kg (27,2 mol ) 9_y36 I (89 mol )
етилацетат (KF = 56 pg/ml)	27 I
диметилформамид	120 ml
1-пропанол	30 I

Карбоксилната киселина 8 се суспендира в 27 I етилацетат и 120 ml диметилформамид в 72-литрова тригърла колба, снабдена с механична бъркалка, под азот и суспензията се охлажда до 2°С. Прибавя се оксалилихлоридът и температурата се поддържа между 5 и 8°С.

Добавянето завършва след 5 h. По време на екзотермичното добавяне се отделят CO и СО₂. Образувалият се HCI до голяма степен остава в разтвора. Наличната утайка, вероят-

но е, хидрохлоридна сол на киселинен хлорид на пиразина. Образуването на киселинния хлорид се установява чрез обработване на суха проба от реакционната смес с трет-бутиламин. В края на реакцията се откриват <0.7% от киселина 8.

Установяването на приключването на процеса на обра зуване на киселинния хлорид е важно, тъй като непълното протичане на реакцията води до образуване на онечистване от бис-трет- бутилоксамид.

Реакцията може да се следи с HPLC: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона c 1 ml/min поток и детектиране при 250 nm; линеен градиент от 98% 0_г1% воден разтвор на.Н₃РО₄ и 2% CH₃CN до 50% воден разтвор на Н₃РО₄ и 50% CH₃CN на 30-тата минута. Времена на задържане: киселина 8 = 10_z7 min, амид 9 = 28,1 min.

Реакционната смес се оставя да престои при 5°С 1 h . Получената суспензия се охлажда до 0°С и се прибавя трет-бутиламин с такава скорост, че вътрешната температура да се поддържа под 20°С.

Прибавянето изисква 6h, тъй като реакцията е силно екзотермична. Малка част от образувалия се трет-бутиламониев хидрохлорид се отделя от реакционната смес като рохкава бяла маса.

Сместа се оставя да престои при температура 18°С още 30 min Утаената амониева сол се отстранява чрез филтриране . филтърната утайка се промива с 12 I етилацетат. Обединените органични фази се промиват с 6 1 3% натриев хидрогенкарбонат и 2 х 2 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Органичната фаза се обработва с 200 g Darco G60 въглен и се филтрира през Solka Flok и филтърната утайка се промива с 4 I етилацетат.

Обработка с въглен отстранява до голяма степен появи

лото се виолетово оцветяване в продукта.

Етилацетатният разтвор на 9 се концентрира при налягане 10 mbar до 25% от изходния обем. Прибавят се 30 I 1-пропанол и дестилацията продължава до краен обем 20 I.

В този момент количеството на етилацетата е под определяемото чрез ¹Н NMR (<1%). Вътрешната температура в този разтворител е под 30°С. Разтворът на 3 в 1-пропанол/етилацетат е стабилен при кипене при атмосферно налягане в продължение на няколко дни.

След изпаряване на пробата се получава червеникавокафяво твърдо вещество, т.т. 87-88°С.

^,3С NMR (75 MHz, CDCI₃, ppm) 161,8, 146,8, 145,0, 143,8, 142,1, 51,0, 28.,5.

ПРИМЕР 8 р а ц. - 2 - трет-бу тилкарбоксамид-пиперазин 10

H₂/Pd(OH)_2r

CONHt-Bu

^N^CONHt-Bu Η

10

Материали

Пиразин-2-трет-бутилкарбоксамид 9 2,4 kg (13,4 mol ) в 1пропанолен разтвор 12 I на 20% Pd(OH)₂/C 16 тегл.% вода 144 g.

Пиразин-2-трет-бутилкарбоксамидът 9/1-пропанолният разтвор се поставят в автоклав с обем от 5 галона (1 галон = 3,79 I). Прибавя се катализаторът и сместа се хидрогенира при 65°С и водородно налягане 3 атм. (40 х 6,895 k N/m²).

След 24 h , в реакцията е изразходвано теоретично

количество водород и газова хроматография показва <1% от 9. Сместа се охлажда, продухва се с азот и катализаторът се отстранява чрез филтриране през Solka Floc. Катализаторът се промива с 2 I топъл 1-пропанол.

При използване на топъл 1-пропанол за промиване на филтърната утайка, се подобрява филтрирането и се намаляват загубите от продукт във филтърната утайка.

Реакцията се следи чрез газова хроматография (ГХ): 30m Megabore колона, от 100°С до 160°С при 10°C/min , мъртво време 5 min, след това при 10°C/mini до 250°С, времена на задържане: 9 = 7,0 min, 10 = 9.4 min. Реакцията може да се следи и чрез тънкослойна хроматография с етилацетат/метанол (50:50) като разтворител и нинхидрин като проявител.

Изпаряване на проба показва, че добивът при амидиране и хидрогениране е 88% и че концентрацията на 10 е 133 g/l.

Изпаряване на проба дава 10 като бяло твърдо вещество с т.т. 150-151 °C;

¹³С NMR (75 MHz, D₂O, ppm) 173,5, 59_r8, 52,.0, 48,7, 45,0, 44_?8, 28,7.

приме р a

Сол на (5)-2-трет-бутилкарбоксамид-пиперазин и бис (8)-камфорсулфонова киселина (S)-11

2( + )-CSA

-----------------►

• 2( + )-CSA

N CONHt-Bu Η

разтвор на рац-2-трет-бутилкарбокс- 4^10 kg (22,12 mol ) амид-пиперазин 10 в 1-пропанол в 25_t5 kg разтворител (8)-( + )-10-камфорсулфонова к-на

1-пропанол.

ацетонитрил вода

10,0 kg (43,2 mol )

I

2.4 I

Разтворът на амин 10 в 1-пропанол се зарежда в 100литрова колба, свързана с концентратор с периодично действие. Разтворът се концентрира при 10 mbar и температура под 25°С до обем, приблизително, 12 I.

В този етап продуктът се утаява от разтвора, но се връща отново в разтвор, когато сместа се загрее до 50°С.

Анализ на хомогенна проба показва, че концентрацията на 10 е 341 g/l. Концентрацията се определя'чрез HPLC: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона c 1,5 ml/min поток и детектиране при 210 nm, изократна хроматография (98/2) CH₃CN/0,1% водна Н₃РО₄. Време на задържане за 10: 2,5 min.

Прибавят се ацетонитрил (39 I) и вода (2,4 I), като се получава бистър, бледо кафяв разтвор.

Определяне на водното съдържание чрез KF титруване и на съотношението СН₃СМ/1-пропанол чрез ¹Н NMR интегриране показва, че съотношението СН₃СМ/1-пропанол/Н₂0 е 26/8/1,6. Концентрацията в разтвора е 72,2 g/l.

(в)-Ю-камфорсулфоновата киселина (CSA) се подава в продължение на 30 min, на 4 порции, при температура 20°С. Температурата се повишава до 40°С, след като се добави камфорсулфоновата киселина. След няколко минути се образува плътна бяла утайка. Последната се загрява до 76°С, при което се разтварят твърдите вещества, а светлокафявият разтвор се оставя да се охлади до 21 °C в продължение на 8 h .

Продуктът се утаява при 62°С, филтрира се без престояване при 21°С и филтърната утайка се промива с 5 I смес от разтворители СН₃СМ/1-пропанол/Н₂О (26/8/1,6.). Тя се суши при 35°С във вакуумпещ при продухване с азот, като се получават 5,6 kg (39%) от 11 във вид на бяло кристално вещество с т.т. 288-290°С (с разлагане).

[a]D²⁵ = 18,9° (с = 0.37, Н₂О).

¹³С NMR (75 MHz, D₂O, ppm) 222,0, 164/), 59_f3, 54_r9, 53,3, 49,0, 48_r1, 43,6, 43,5, 43,1, 40_f6, 40_f4, 28,5, 27,2, 25,4, 19,9, 19,8.

Енантиомерният излишък (ее) от продукта е 95%, съгласно описаната по-нататък хирална HPLC: проба от 11 (33 mg) се суспендира в 4 ml етанол и 1 ml Et₃N. Прибавя се Вос₂О (11 mg) и реакционната смес се оставя да престои 1 час. Разтворителят се отстранява напълно във вакуум и остатъкът се разтваря в приблизително 1 ml етилацетат и се филтрира с пипета на Пастьор със силициев диоксид и елуент етилацетат. Изпарените фракции на продукта се разтварят отново в хексани при приблизително 1 mg/ml. Енантиомерите се разделят върху колона Daicel Chiracell AS със система разтворители хексан/IPA (97:3)1 при скорост на потока 1 ml/min и детектиране при 228 nm. Времена на задържане: S антипод = 7,4 min, R = 9,7 min.

ПРИМЕР 10 (8)-2-трет-бутилкарбоксамид-4-трет-бутоксикарбонил-пиперазин 4 от

СОЛ 11

• 2( + )-CSA (Вос)₂О _r

N CONHt-Bu Η

SI

N CONHt-Bu H

Материали:

(S) - 2-трет-бутилкарбоксамид-пиперазин бис (S)-( + )-CSA сол 11, 95% ее д и - трет-бутилдикарбонат	5_r54 kg (8.53 mol ) 1 _т86 kg (8,53 mol )
Et₃N	5_ή95 I (42,6 mol )
етанол 200	55 I
етилацетат	2 I

- 61 Към сол на (S)-CSA 11 в 100-литрова З-гърла колба, снабдена с допълнителна фуния, под азот, се прибавят последователно етанол и триетиламин при температура 25°С. Твърдото вещество се разтваря лесно при добавяне на Et₃N. Вос₂О се разтваря в етилацетат и се зарежда през допълнителната фуния. Прибавя се разтвор на Вос₂О в етилацетат с такава скорост, че температурата да се поддържа под 25 °C. Добавянето продължава 3 h. Реакционната смес се оставя да престои 1 час след като приключи добавянето на разтвора на Вос₂О.

Реакцията се следи чрез HPLC: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона с 1 ml/min поток и детектиране при 228 nm, изократна хроматография (50/50) CH₃CN/0.1M КН₂РО_4> рН = 6,8 с NaOH. Време на задържане за 4 = 7,2 min. Хиралният анализ се осъществява, като се използва същата система, както в горния етап. Реакцията може да се следи и чрез тънкослойна хроматография със 100% етилацетат като разтворител (R_f = 0,7).

Разтворът се концентрира до приблизително 10 I при вътрешна температура под 20°С в концентратор с периодично действие при вакуум 10 mbar. Пресичането на разтворителя завършва чрез бавно изливане в 20 I етилацетат и повторно концентриране до приблизително 10 I. Реакционната смес се промива в екстрактор с 60 I етилацетат. Органичната фаза се промива с 16 I 5%-ен воден разтвор на натриев карбонат, 2x10 I дейонизирана вода и 2 х 6 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Събраните промивни води се екстрахират отново с 20 I етилацетат и органичната фаза се промива с 2 х 3 I вода и 2 х 4 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Обединените етилацетатни екстракти се концентрират при 10 mbar вакуум, като вътрешната температура се поддържа под 20°С в 100-литров концентратор с периодично действие приблизително до 8 I. Пресичане на разтворителя с циклохексан се постига чрез бавно изливане в приблизително 20 I циклохексан и повторно канцентриране до приблизително 8 I. Към утайката се прибавят 5 I циклохексан и 280 ml етилацетат и сместа се загрява до температура на кипене, когато всичко преминава в разтвор. Раз-творът се охлажда и се прибавят зародишни кристали (10

д) при температура 58°С. Суспензията се охлажда до 22°С за 4 часа и продуктът се изолира чрез филтруване, след като престои 1 час при 22°С. Филтърната утайка се промива с 1,8 I циклохексан и се суши във вакуумна пещ при температура 35°С, при продухване с азот при което се получават 1.87 kg (77%, >99,9% площ чрез HPLC, R-изомерът е под откриваемото количество) от съединение 4, във вид на бледо-червеникавокафяв прах.

[a]D²⁵ = 22,0° (с = 0.20, МеОН), т.т. 107°С;

¹³С NMR (75 MHz, CDCI₃, ppm) 170,1, 154,5, 79,8, 58,7, 50.,6,46.,6, 43,6, 43,4, 28,6, 28,3.

Доколкото горното описание разкрива принципите на изобретението, а примерите имат за цел само илюстриране, то разбираемо е, че обхватът на изобретението включва всички обичайни вариации, адаптации или модификации, в съответствие със следващите претенции и техните еквиваленти.

Claims

1. Съединение с формула:

(I) или негови фармацевтично приемливи соли, като във формула (I):

е стабилен 8- до 10-атомен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като този хетероцикъл се състои от въглеродни атоми и от 1 до 3 хетероатома, избрани от N, S или 0 и може да бъде незаместен или заместен с ОН, халоген, С_г4алкил, оксо; при условие, че не означава

2. Съединение, съгласно претенция 1, в което е стабилен 8- до 10-атомен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като хетероцикълът се състои от въглеродни атоми и 2 хетероатома, избрани от N или О, и двата хетероатома се намират в различни пръстени, или негова фармацевтично приемлива сол.

и X е О или S, или негова фармацевтично приемлива сол.

4. Съединение, съгласно претенция 1, в което или негова фармацевтично приемлива сол.

5. Съединение, съгласно претенция 1, с формула което представлява М-(2(В)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)-2(8)М’-(1-бутилкарбоксамидо)-пиперазинил))пентанамид, или негова фармацевтично приемлива сол.

6. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, заедно с фармацевтично приемлив носител.

7. Използване на фармацевтичен състав, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, за лечение на СПИН, за предпазване от или за лечение на инфекция, причинена от HIV, или за инхибиране на HIV протеаза.

8. Метод за лечение на СПИН, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага еф ективно количество от съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.

9. Метод за предпазване от инфекция, причинена от HIV, характеризиращ се с това, че на бозайник, застрашен от такава инфекция, се прилага ефективно количество от съединение , съгласно която и да е претенция от 1 до 5.

10. Метод за лечение на инфекция, причинена от HIV, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага ефективно количество от съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.

11.Метод за инхибиране на HIV протеаза, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага ефективно количество от съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.

12. Комбинация от съединения, съдържаща съединение, съгласно претенция 5 и ненуклеозиден аналог на инхибитор на HIV обратна транскриптаза, избран от съединение В, съединение С и невирапин и по желание, някой от AZT или ddl, или ddC.

13. Комбинация от съединения, съдържаща съединение, съгласно претенция 5 и някой от AZT или ddi, или ddC.

или негова фармацевтично приемлива сол.

67 15. Съединение или негова фармацевтично приемлива сол.