BG100643A

BG100643A - Инхибитори на нiv протеаза

Info

Publication number: BG100643A
Application number: BG100643A
Authority: BG
Inventors: Joel Huff; Joseph VACCA; Bruce Dorsey
Original assignee: Merck & Co. Inc.
Priority date: 1993-12-15
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1997-02-28
Also published as: NZ278201A; WO1995016688A1; BR9408305A; CZ158696A3; EP0734387A4; EP0734387B1; CA2178760C; PL314984A1; AU1433195A; KR100234863B1; DE69430385T2; ES2174921T3; AU692509B2; HUT74681A; CN1046727C; JPH09506619A; US5646148A; CA2178760A1; HU9601649D0; JP3000564B2

Abstract

Съединенията с формула са инхибитори на нiv протеаза. Те са полезни за профилактика или лечение на инфекции, причинени от нiv, както и за лечение на спин като съединения или под формата на фармацевтично приемливи соли, или като ингредиенти във фармацевтични състави. Използват се самостоятелно или вкомбинация с други антивирусни вещества, имуномодулатори, антибиотици или ваксини. Изобретението сеотнася и до методи за лечение на спин, както и запрофилактика или лечение на инфекции, причинени от нiv.

Description

Изобретението се отнася до съединения, които инхибират протеазата, кодирана от вирус на човешка имунна недостатъчност (HIV) или до техни фармацевтично приемливи соли. Тези съединения могат да се използват за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, за лечение на инфекции, причинени от HIV, както и за лечение на синдрома на придобитата имунна недостатъчност (СПИН). Изобретението се отнася и до фармацевтични състави, съдържащи съединенията и до метод за използване на съединенията, съгласно изобретението и други средства, за лечение на СПИН и на вирусна инфекция, причинена от HIV.

ПРЕДШЕСТВУВАШО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Ретровирусът, наречен вирус на човешка имунна недостатъчност (HIV), е етиологичен причинител на комплексно заболяване, което включва прогресивна деструкция на имунната система (синдром на придобита имунна недостатъчност; СПИН) и дегенерация на централната и периферната нервни системи. Този вирус, по-рано, е бил известен като LAV, HTLV-III или ARV. Характерна особеност на ретровирусната репликация е екстензивният посттранслационен процесинг на полипротеинови прекурсори от вирусно кодирана протеаза, за да се генерират зрели вирусни протеини, необходими за конструирането и функционирането на вируса. Инхибирането на този процесинг предотвратява продуцирането на естествения инфекциозен вирус. Така например, Kohl, N.E. и др. в Proc. Nat l

- 2 Acad. Sci., 85. 4686 (1988) показват, че генетично инактивиране на протеазата, кодирана от HIV, води до получаване на незрели неинфекциозни вирусни частици. Тези резултати показват, че инхибирането на HIV протеазата представлява един перспективен метод за лечение на СПИН и за профилактика или лечение на инфекции, причинени от HIV.

Нуклеотидната последователност на HIV показва присъствието на pol-ген в една отворена рамка на разчитане [виж Ratner, L. et al., Nature. 313. 277 (1985)]. Хомоложността на аминокиселинната последователност доказва, че pol-последователността кодира обратна транскриптаза, ендонуклеаза и HIV протеаза.[Toh, Н. et al., EMBO J.. 4 1267 (1985); Power, M.D. et al., Science. 231, 1567 (1986); Pearl, L.H. et al., Nature. 329. 351 (1987)]. Заявителите показват, че съединенията, съгласно изобретението, са инхибитори на HIV протеаза.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съединенията с формула I, представена по-долу, могат да се използват за инхибиране на HIV протеаза, за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, за лечение на инфекции, причинени от HIV, както и за лечение на СПИН. Обект на изобретението са и фармацевтично приемливите соли на тези съединения, съединенията като ингредиенти на фармацевтични състави, включени самостоятелно или заедно с други антивирусни средства, имуномодулатори, антибиотици или ваксини. Описани са и методи за лечение на СПИН, методи за предотвратяване на инфекции, причинени от HIV, както и методи за лечение на инфекции, причинени от HIV.

В описанието са използвани следните съкращения:

Обозначение	- 3 - СЪКРАЩЕНИЯ Защитна група ι
ВОС (Вос) CBZ (Cbz)	t-бутилоксикарбонил бензилоксикарбонил(карбобензокси)
TBS (TBDMS)	t-бутилдиметилсилил
НВТ (НОВТ или HOBt)	Активираща група 1-хидроксибензотриазол хидрат
BOP реагент	Свързващ реагент бензотриазол-1-илокситрис(диметил-
BOP-CI	амино)фосфониев хексафлуорфосфат бис(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфинов
EDC	хлорид 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)карбо- диимид хидрохлорид
(ВОС)₂О (ВОС₂О)	Други ди4-бутилдикарбонат
n-Bu₄N ⁺ F-	тетрабутиламониев флуорид
n-BuLi (n-Birli)	п-бутиллитий
DMF	диметилформамид
Et₃N	триетиламин
EtOAc	етилацетат
TFA	трифлуороцетна киселина
DMAP	диметиламинопиридин
DME	диметоксиетан
LDA	литиев диизопропиламид
THF	тетрахидрофуран

ДЕТАЙЛНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО И ПРЕДПОЧИТАНИ ИЗПЪЛНЕНИЯ

Изобретението се отнася до съединения с формула I, до комбинации от такива съединения или техни фармацевтично приемливи соли, които се използват за инхибиране на HIV протеаза, за профилактика или лечение на инфекции, причинение от HIV, както и за лечение на синдрома на придобита имунна недостатъчност (СПИН). Съединенията, съгласно изобретението, се представят със следната формула (I):

(I)

или са техни фармацевтично приемливи соли, като във формула (I):

е стабилен 8- до 10-членен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като този хетероцикъл се състои от въглеродни атоми и от 1 до 3 хетероатома, избрани от N, S или 0 и може да бъде незаместен или заместен с ОН, халоген, С₁.₄алкил, оксо; при условие, че

не означава

- 5 , нито

Един аспект на изобретението представляват съедине нията с формула I или техни фармацевтично приемливи соли, в които:

е стабилен 8- до 10-членен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като хетероцикълът се състои от въглеродни атоми и 2 хетероатома, избрани от N или О,

и двата хетероатома се намират в различни пръсте ни.

Втори аспект на изобретението представляват съединенията с формула I, в които:

и X е 0 или S,

- 6 както и техни фармацевтично приемливи соли.

Трети аспект на изобретението са съединения с формула

I, в които

е ограничено до

или техни фармацевтично приемливи соли.

което представлява М-(2(В)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1 -(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)-2(8)М’-(Ьбутилкарбоксамидо)-пиперазинил))пентанамид, или негова

Конкретно съединение, обект на изобретението, е съединение А:

фармацевтично приемлива сол.

Съединенията, съгласно изобретението, имат хирални центрове и се .получават като рацемати, рацемични смеси и като отделни диастереомери, или енантиомери, като всички изомерни форми са обект на изобретението. Рацемичната смес включва смеси от стереоизомери в съотношение 50:50 или в други съотношения.

- 7 Когато всяка променяща се част (например, —) се съдържа повече от един път във всеки елемент или във формула I, то нейната дефиниция във всички отделни случаи е независима. Така също, комбинациите от заместители и/или променящи се елементи от формулата са допустими само, ако тези комби-нации водят до стабилни съединения.

Както е използван тук терминът „алкил“, ако не е казано нещо изрично, означава правоверижна или с разклонена верига наситена алифатна въглеводородна група със съответния брой въглеродни атоми (Ме е метил, Et е етил, Рг е пропил, Ви е бутил); „Халоген“ означава флуор, хлор, бром и йод.

Фармацевтично приемливите соли на съединенията с формула I (под формата на водо- или масло-разтворими или диспергируеми продукти) са обичайните нетоксични соли или кватернерните амониеви соли, които се получават, например, с неорганични или органични киселини или основи. Примери за присъединителни с киселина соли са: ацетат, адипат, алгинат, аспартат, бензоат, бензенсулфонат, бисулфат, бутират, цит-

рат, камфорат, камфорсулфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, дихидрохлорид, дифосфат, додецилсулфат, етансулфонат, фумарат, глюкохептаноат, глутамат, глицерофосфат, хемисулфат, хептаноат, хексаноат, хидрохлорид, хидробромид, хидройодид, 2-хидроксиетансулфонат, лактат, малеат, метан сулфонат, 2-нафталенсулфонат, никотинат, нитрат, оксалат, памоат, пектинат, персулфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пик рат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартарат, тиоцианат, тозилат, и ундеканоат. Основните соли включват: амониеви соли, соли на алкални метали, като натриеви или калиеви соли, соли на алкалоземни метали, като калциеви и магнезиеви соли, соли с органични основи, като дициклохексиламинни соли, N-метил- 8 D-глюкамин и соли с аминокиселини, като аргинин, лизин и т.н.

Освен това, основните групи, съдържащи азот, могат да се

кватернизират с такива средства като нисшалкилхалогениди, като например, метил-, етил-, бутил- и пропил-хлориди, бромиди и йодиди; диалкилсулфати, като диметил-, диетил-, дибутил-; и диамил-сулфати, дълговерижни халогениди, като децил-, лаурил-, миристил-, и стеарил-хлориди, бромиди и йодиди, аралкилхалиди, като бензил и фенетилбромиди и други. Други фармацевтично приемливи соли са сулфатна сол на етанолат и сулфати.

По-долу са представени схеми 1-11 за получаване на новите съединения, съгласно изобретението. Примерите илюстрират прилагането на тези схеми за получаване на конкретни съе динения.

Амидните връзки, използвани за образуване на съединенията, съгласно изобретението, обикновено се получават като се прилага карбодиимидният метод с такива реагенти като дициклохексилкарбодиимид или 1-етил-3-(3-диметиламинопро-

пил)карбодиимид. Други методи за образуване на амидна или пептидна връзка включват, без да се ограничават до спо менатите, синтези, използващи киселинен хлорид, азид, смесен анхидрид или активиран естер. Обикновено, амидното свързване се осъществява в разтвор, но може да се използва и синтез в твърда фаза по класическия метод на Мерифийлд. Обичайна практика е и добавянето и отстраняването на една или повече защитни групи

Допълнителна информация във връзка с известните синтези може да се получи от ЕР 337,714 и ЕР 541,168.

Един метод за получаване на съединения с формула I е показан на схема I. Дихидро-5(в)-(1-бутилдиметилсилилокси

- 9 метил)-3(2Н)-фуранон (съединение 1, по-долу) се получава по известните стандартни методи от търговския продукт дихидро5(в)-(хидроксиметил)-2(ЗН)-фуранон. След алкилиране на съединение 1, при което се получава съединение 2, се отстранява защитната група в лактона 2 с помощта на воден разтвор на HF и се получава съединение 3.

Алкохолната група в съединение 3 се активира чрез пре-

връщане в отцепваща се група, като мезилат, тозилат или трифлат, като алкохолът се обработва със сулфонилхлорид или (за предпочитане) със сулфонов анхидрид, като трифлуорметансулфонов анхидрид, в присъствието на запречена аминна основа, като триетиламин, диетилизопропиламин или 2,6 лутидин, при което се получава съединение, като съединение 4. Отцепващата се група в съединение 4 се замества с амин 5, като 4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-пиперазин-2(3)-карбоксамид, в разтворител като диметилформамид или ксилен, като се получава съединение, като съединение 6. Трифлуорметансулфонилокси група може да се замести с амин при стай-

на температура в разтворител, като изопропанол или метиленхлорид чрез взаимодействие с Ν,Ν-диизопропилетиламин.

Съединение 6 се хидролизира с воден разтвор на литиев или натриев хидроксид и получената хидроксикиселина 7 се превръща в защитена хидроксикиселина 8. За удобство, хид роксилната група е защитена със стандартна силилна защитна група, като t-бутилдиметилсилил или t-бутилдифенилсилил.

След това, защитената хидроксикиселина 8 се свързва с желания R¹² амин, за да се получи съединение 9 и силилната защитна група се отстранява с флуориден йон, като се получава съединение 10.


WO95/16688	PCT/US94/14I87

-10CXEMA I

Δ, xylene

LiOH

DME ?^{H R3}

Boo-N^N^AA_c02H'^Z'CONH-|1-T?^icl 2. MeOH

Βοο_χ

N^zX'^s'⁴i OTBS r3 —

CONH-|WO 95/16688

PCT/US94/14187

- 11 СХЕМА I · /ПРОДЪЛЖЕНИЕ/

H₂N-R¹²

EDC/HOBt

Ifi

c

WO 95/16688

PCT/US94/14187

- 12CXEMA II

III · ·

OH

Д K₂CO₃

Boc

- 13 СХЕМА II /ПРОДЪЛЖЕНИЕ)

Един предпочитан метод е получаването на епоксида 12 чрез взаимодействие на И в присъствието на силна основа. Силната основа трябва да бъде метал-съдържаща основа, в инертен безводен органичен разтворител, като например, циклични или ациклични въглеводороди, включително хексан, пентан, циклохексан и др. Подходящи силни основи са: LiN[(CH₃)₃Si]₂, KN[(CH₃)₃Si]₂, NaN[(CH₃)₃Si]₂, п-бутиллитий, (nBuLi), s-BuLi, t-ByLi, калиев t-бутилат, литиев диизопропиламид (LDA), литиев изопропилциклохексиламид, литиев пиролидид, литиев тетраметилпиперидид, фенилдитий, изопропилмагнезиев хлорид, изобутилмагнезиев хлорид и други подобни силни

- 14 основи, известни за целта. Предпочитани силни основи са: LiN[(CH₃)₃Si]₂, n-BuLi, s-BuLi и LDA, като особено предпочитани са LiN[(CH₃)₃Si]₂ и n-BuLi. За предпочитане се използват около ί до 2 модни еквивалента силна основа на един молен еквивалент от съединение 11.

Съединение 13. се получава чрез взаимодействие на съединение 12 с Ν-ί-6γτπΛ-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(8)-карбоксамид (5.). За предпочитане, се използват от 1 до 3 молни еквивалента от амин 5 за 1 молен еквивалент от епоксид 12, като съотношение от 1.05:1 молни еквивалента на V:IV е особено предпочитано.

Тази реакция може да протече във всеки подходящ разтворител, като например, такъв избран от въглеводороди, като толуен, етери, като диетилетер, алкохоли, като метанол, етанол или изопропанол, нитрили, като ацетонитрил и естери, като етилацетат или в комбинация от изброените разтворители. За предпочитане се използва алкохол, като особено предпочитан е изопропанолът. Реакционната температура може да се поддържа от стайна до температурата на кипене на използвания разтворител, но се предпочита повишена температура, например в границите от 80°С до 90°С, като оптималната температура е от 83°С до 85°С.

Активирани глициди се получават по известни методи, като тези, описани в J. Klunder et al., J. Org, Chem.. 1989, 54, 1295-1304 и в съответната литература, цитирана там.

Амиди, като съединение 11, могат да се получат по стандартни методи, известни на специалиста в тази област, като например метода, описан в пример 10, като се използват съответните изходни вещества.

- 15 Защитни групи, като защитни групи на азота, се използват там, където е подходящо при осъществяване на изобретението. Например, азотът на 4-то място в 24-бутилкарбоксамидпиперазин може да бъде защитен с група като ВОС, CBZ, бензилова, 4-метоксибензилова, 2,4-диметоксибензилова, трифлуорацетамидна, триалкилсилилова или други известни групи за целта.

Съединение с формула 15

в която Р е защитна група на азота, като ВОС или CBZ, също се получава по метода, представен на схема I, като за предпочитане, в случая се използва 5-трифлуорметансулфонилоксиметилов аналог на лактон 4.

Съединенията с формула 16

могат да се получат като се използва разновидност на метода, от съединение 14

Н

NH-R

- 16 Съединение 14 се получава след отстраняване на защитната група на азота в съединение 15 и като се използват добре известни методи, като например, каталитично хидрогениране, за да се отстрани групата CBZ или обработване с триметилсилилтрифлат и 2,6-лутидин при температура около 0°С, в разтворител, като метиленхлорид, или обработване с 6N солна киселина в изопропанол, за да се отстрани ВОС групата.

Азотът на 4-то място в пиперазиниловия пръстен на съединение 14 може да се алкилира със съединение с формула R¹-X в разтворител, като диметилформамид, в присъствието на Et₃N при стайна температура, като X означава -Cl, -Вг, или -I. Начините за провеждане на тези реакции са известни на специалиста в тази област.

Таблицата в пример 3, по-долу, също илюстрира съединенията, съгласно изобретението.

Съединенията, съгласно изобретението, са полезни за получаване на антивирусни съединения и за провеждане на скрининги с тях. Така например, съединенията, съгласно изобретението, са полезни за изолиране на ензимни мутанти, които са отлични скринингови инструменти за по-ефикасни антивирусни съединения. Освен това, съединенията, съгласно изобретението, са полезни за установяване или определяне мястото на свързване на други антивирусни вещества с HIV протеаза, например чрез конкурентно инхибиране. Или, съединенията, съгласно изобретението, са търговски продукти, предназначени за споменатите цели.

Съединенията, съгласно изобретението, се използват за инхибиране на HIV протеаза, за профилактика или лечение на инфекции, причинени от HIV и за лечение на съответно предизвикани патологични състояния, като СПИН. Лечението на СПИН

- 17 или профилактиката или лечението на инфекции, причинени от HIV, както бяха изброени, само се включват (без да се ограничават до тях) в третирането на широк спектър от състояния, предизвикани от HIV инфекции: СПИН, ARC (СПИН-свързан комплекс), както симптоматично, така и асимптоматично, при реално или потенциално излагане на HIV. Например, съединенията, съгласно изобретението, са полезни за лечение на инфекции, причинени от HIV, след предполагаемо излагане на действието на HIV при кръвопреливане, трансплантация на органи, смяна на телесни течности, охапвания, случайни убождания с игла или преливане на кръв при операции.

За тези цели, съединенията, съгласно изобретението, могат да се прилагат орално, парентерално (включително подкожно инжектиране, интравенозно, интрамускулно, интрастернално инжектирани или чрез инфузия), чрез инхалация със спрей или ректално, в дозирани единични форми, съдържащи обичайни нетоксични фармацевтично приемливи носители, помощни средства и вехикулуми.

Следователно, съгласно изобретението се предлагат метод и фармацевтичен състав за лечение на инфекции, причи нени от HIV и СПИН. Лечението включва приемане от нуждае щия се от такова лечение пациент на фармацевтичен състав, съдържащ фармацевтичен носител и терапевтично ефективно количество от съединение, съгласно изобретението или от негова фармацевтично приемлива сол.

Тези фармацевтични състави могат да бъдат под формата на орално приложими суспензии или таблетки; назални спрей ове; стерилни инжекционни препарати, като например, стерилни инжекционни водни или маслени суспензии или супозитории.

- 18 Когато се прилагат орално, във вид на суспензии, тези състави се приготвят по известните методи за формулиране на фармацевтични средства и могат да съдържат микрокристална целулоза като пълнител, алгинова киселина или натриев алгинат като суспендиращо средство, метилцелулоза за повишаване на вискозитета и подсладители/вкусови добавки, известни за тази цел. Когато се приготвят таблетки за бързо разтва-

ряне, тези състави могат да съдържат микрокристална целулоза, двукалциев фосфат, нишесте, магнезиев стеарат и лактоза и/или други ексципиенти (добавки), свързващи ве щества, пълнители, разредители и смазващи вещества, извест ни за целта.

Фармацевтичните състави за аерозолно прилагане, през носа или чрез инхалация, се приготвят по познати за специалиста начини за формулиране на фармацевтични състави и могат да се получат чрез разтваряне във физиологичен разтвор като се използва бензилов алкохол или други подходящи консерванти, промотори на абсорбцията за повишаване на биологичната пригодност, флуоровъглероди и/или други солюбилизиращи или диспергиращи средства, известни за тази цел.

Разтворите или суспензиите за инжектиране се приготвят по познат -начин, като се използват подходящи нетоксични парентерално-приемливи разредители или разтворители, като манитол, 1,3-бутандиол, вода, рингеров разтвор или изотоничен разтвор на натриев хлорид, или подходящи диспергиращи, или омокрящи вещества, или суспендиращи средства, като стерилни леки нелетливи масла, включително. синтетични моно-или диглицериди и мастни киселини, като олеинова киселина.

Супозиториите за ректално прилагане могат да се приготвят чрез смесване на активното вещество с подходящо

- 19 недразнещо вещество, като какаово масло, синтетични глице

ридни естери или полиетиленгликоли, които са твърди при стайна температура, но се втечняват и/или се разтварят при ректално приложение, като се освобождава активното вещество.

Дозата, която е необходима за лечение или профилактика на посочените по-горе състояния, е от порядъка на 0.02 до 5.0 или 10 грама дневно, като при орално приложение е необходима два до пет пъти по-висока доза. Така например, за лечение на инфекция, причинена от HIV, се препоръчва приемане на 1.0 до 50 милиграма от съединението на килограм телесно тегло, от един до четири пъти дневно. При един предпочитан режим, всеки пациент приема от 100 до 400 милиграма на всеки шест часа. Разбираемо е ,че конкретната доза и чес тотата на приемане на дозата се определя за всеки пациент в зависимост от голям брой фактори, включително от активността на използваното конкретно съединение, метаболитната стабилност и продължителността на действие на съединението,

както и от възрастта, телесното тегло, общото здравословно състояние, пола, храненето, начина и времето на прилагане, скоростта на изхвърляне от организма, комбинацията от лек арства, остротата на даденото състояние и от поносимостта на лечението.

Изобретението се отнася и до комбинации от съединения, инхибиращи HIV-протеаза с едно или повече средства, полезни за лечение на СПИН. Така например, съединенията, съгласно изобретението, могат да се прилагат ефективно преди и/или след периоди на прилагане, или в комбинация с ефективни количества от антивирусни средства срещу СПИН, имуномоду

- 20 латори, средства срещу ифекции или ваксини, известни на специалиста в тази област.

- 21 ТАБЛИЦА

АНТИВИРУСНИ СРЕДСТВА

Наименование на лекарството AL-721	Производител Ethigen (Los Angeles, СА)	Показание СПИН-свързващ комплекс (ARC), PGL, HIV-позитивно, СПИН
рекомбинантен чо-	Triton Biosciences	СПИН, сарком на
вешки β-интерферон	(Almeda, СА)	Капоши, ARC
ацеманан	Carrington Labs (Irving, TX)	ARC (виж също имуномодулатори)
цитовен	Syntex	цитомегаловирусно (CMV) увреждане на зрението
ганцикловир	(Palo Alto, CA)	периферен цитомегаловирусен ретинит
d4T дидехидродеок- ситимидин	Bristol-Myers (New York, NY)	СПИН,ARC
ddl дидеоксиинозин	Bristol-Myers (New York, NY)	СПИН,ARC
EL10	Elan Corp., PLC	HIV-инфекция (виж

- 22 (Gainesville, GA)

тринатриев фосфоноформиат дидеоксицитидин ddC новапрен

Astra Pharm.

Products, Inc. (Westborough, MA)

Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)

Novaferon Labs, Inc (Akron, OH) Diapren, Inc.

(Roseville, MN, marketer) също имуномодулатори)

CMV ретинит, HIVинфекция, други CMV-инфекции

СПИН,ARC инхибитор на HIV пептид T октапептидна последователност зидовудин; · азидотимидин (AZT) напреднал СПИН, ARC

Peninsula Labs.

(Belmont, CA)

Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park

NC)

СПИН

СПИН, напреднал, ARC, детски СПИН, сарком на Капоши, асимптоматична HIVинфекция, в по-лека форма HIV-заболяване, неврологично заболяване, в комбинация с други лечения.

	Ансамицин LM 427	Adria Laboratories (Dublin, OH Erbamont (Stamford, CT)	ARC
	декстран сулфат	Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japan)	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно
©	виразол	Viratek/ICN	асимптоматично HIV-
	рибавирин	(Costa Mesa, CA)	позитивно, синдром на лимфаденопатия (LAS), ARC
	алфа интерферон	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Parc, NC)	сарком на Капоши, HIV в комбинация с w/ретровирус
©	ацикловир	Burroughs Wellcome	СПИН, ARC, асимптоматично HlV-noзитивно, в комбинация с AZT
	антитяло, неутрализиращо pH лабилен α-аберантен интерферон в имуноадсорбционна коло-	Advanced Biotherapy Concepts (Rockville, MD)	СПИН, ARC

на

В	Merck (Rahway, NJ)	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.
c	Merck (Rahway, NJ)	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.
Невирапин	Boehringer Ingelheim	СПИН, ARC, асимптоматично HIV-позитивно, също в комбинация с AZT.

ИМУНОМОДУЛАТОРИ

Наименование на	Производител	Показание
лекарството
AS-101	Weth-Ayerst Labs. (Philadelphia, РА)	СПИН
бропиримин	Upjohn (Kalamazoo, Ml)	напреднал СПИН

ацеманан	Carrington Labs., Inc	СПИН, ARC (виж съ-
	(Irving, TX)	що антивирусни)
CL246.738	American Cyanamid	СПИН, сарком на
	(Pearl River, NY)	Капоши
	Lederle Labs

(Wayne, NJ)

EL10	Elan Corp, PLC (Gainesville, GA)	HIV-инфекция (виж също антивирусни)
гама-интерферон	Genentech (S. San Francisco, CA)	ARC, в комбинация с /TNF (фактор на туморна некроза)

гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Genetics Institute (Cambridge, МА) Sandoz (East Hanover, NJ)	СПИН
гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Hoeschst-Roussel (Sommerville, NJ) Immunex (Seattle, WA)	СПИН
гранулоцитен макрофаг колонийстимулиращ фактор	Schering-Plough (Madison, NJ)	СПИН, СПИН в комбинация с /AZT
HIV Core Particle имуностимулатор	Rorer (Ft. Washington, PA)	HIV-серопозитивен

IL-2

Cetus

СПИН в комбинация интерлевкин-2 (Emeryville, СА) с /AZT

IL-2

Hoffman-La Roche

СПИН, ARC, HIV в (Nutley, NJ)

Immunex комбинация c /AZT интерлевкин-2

имуноглобулин интравенозен	Cutter Biological (Berkeley, СА)	детски СПИН, в комбинация с /AZT ί
	(човешки)
	IMREG-1	Imreg (New Orleans, LA)	СПИН, сарком на Капоши, ARC, PGL
	IMREG-2	Imreg (New Orleans, LA)	СПИН, сарком на Капоши, ARC, PGL
	имутиолдиетилдитиокарбамат	Merieux Institute (Miami, FL)	СПИН, ARC
	алфа-2 интерферон	Schering Plough (Madison,NJ)	сарком на Капоши, с /ΑΖΤ:ΟΠΗΗ
	метионин- енкефалин	TNI Pharmaceutical (Chikago, IL)	СПИН,ARC
мй W	МТР-РЕ мурамилтрипептид	Ciba-Geigy Corp. (Summit, NJ)	сарком на Капоши
	гранулоцитен коло-	Amgen	СПИН, в
	нийстимулиращ фактор	(Thosand Oaks, CA)	комбинация с /AZT
	rCD4 рекомбинантен раз- творим човешки	Genentech (S. San Francisco, CA)	СПИН,ARC

CD4

- 27 rCD4-lgG хибриди

СПИН,ARC рекомбинантен

Biogen

СПИН, ARC разтворим човешки (Cambridge, МА)

CD4

интерферон алфа 2а	Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)	сарком на Капоши, СПИН, ARC, в комбинация с w/AZT
SK&F106528 разтворим Т4	Smith, Kline & French Lab. (Philadelphia, PA)	HIV-инфекция
тимопентин	Immunobiology Research Institute (Annandale, NJ)	HIV-инфекция
тумор некротичен фактор (TNF)	Genentech (S. San Francisko,	ARC, в комбинация с /гама интерферон

СА)

АНТИИНФЕКИИОЗНИ СРЕДСТВА

наименование на	производител	показание
лекарството
клиндамицин с	Upjohn	пневмоцистна
примакуин	(Kalamazoo, Ml)	пневмония (РСР)

флуконазол	Pfizer (New York, NY)	криптококови менингити, кондидомикоза
пастила нистатин пастила	Squibb Corp. (Priceton, NJ)	предпазване от устна кандидомикоза
орнидил ефлорни- тин	Merrell Dow (Cincinnati, OH)	РСР
пентамидин изетионат (IM & IV)	LyphoMed (Rosemont, IL)	лечение на РСР
триметоприм		антибактериално
триметоприм/сулфа		антибактериално
пиритрексим	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)	лечение на РСР
пентамидин· изетионат за инхалация спирамицин	Fisons Corporation (Bedford, MA) Rhone-Poulenc Pharmaceuticals (Princeton, NJ)	профилактика на РСР криптоспоридийна диария
интраконазол- R51211	Janssen Pharm. (Piscataway, NJ)	хистоплазмоза; криптококови

менингити

триметрексат	Warner-Lambert	PCP
	ДРУГИ
наименование на	производител	показание
лекарството
рекомбинантен	Ortho Pharm. Corp.	остра анемия, свър-
човешки еритропои-	(Raritan, NJ)	зана с лечение на
етин		AZT
мегестрол ацетат	Bristol-Myers	лечение на анорек-
	(New York, NY)	сия, свързана
		с/СПИН
общо чревно хране-	Norwich Eaton	диария и смутена
не	Pharmaceuticals	чревна абсорбция,
	(Norwich, NY)	свързана със СПИН

Разбираемо е, че броят на комбинациите от съединения, съгласно изобретението и СПИН-антивирусни вещества, имуномодулатори, противоинфекциозни вещества или ваксини, не се ограничава до този на изброените в списъка по-горе, а включва по-принцип всяка комбинация с фармацевтично средство, полезно за лечение на СПИН.

Някои съединения от горната таблица имат следните наименования: съединение В е 6-хлор-4-(8)-циклопропил-3,4-дихидро-4-((2-пиридил)етинил)хиназолин-2(1Н)-он; съединение С е (-) 6-хлор-4-(8)-трифлуорметил-1,2-дихидро-4(Н)-3,1-бензоксазин-2-он; невирапин е 11-циклопропил-5,11-дихидро-4-метил-6Ндипиридо[3,2-Ь:2 ,3‘-е][ 1,4]диазепин-6-он. Съединения В и С се получават по методи, описани в ЕР 569,083, цитиран тук с тази

- 30 цел. Невирапинът е синтезиран от Klunder, J.M. et al.. J. Med, Cham., 25., 1887 (1992); Hargrave, K.D. et al., J. Med. Chem., 34. 2231 (1991); Cohen, K.A. et al., J. Biol, Chem... 266. 14670 (1991), като тези източници са цитирани тук, съответно.

Предпочитани комбинации са едновременно или последователно третиране с инхибитор на HIV протеаза и с ненуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза. Евентуален трети компонент в комбинацията е нуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза, като AZT, ddC или ddl. Предпочитан инхибитор на HIV протеаза е съединение А. Към предпочитаните ненуклеозидни инхибитори на HIV обратима транскриптаза спадат съединение В, съединение С или невипарин. Тези комбинации могат да проявяват синергитични ефекти при ограничаване разпространението на HIV. Предпочитани комбинации са: (1) съединение А и предпочитан ненуклеозиден инхибитор на HIV обратима транскриптаза и евентуално, AZT или, ddl, или ddC; (2) съединение А и който и да е от AZT, ddl или ddC.

Опит за инхибиране на микробиално експресирана

HIV протеаза

Инхибирането се изследва чрез реакцията на протеазата, експресирана в Eschericia coli, с пептиден субстрат [Val-SerО1п-А5П-(бетанафтил)А1а-Рго-Ие-\/а1, 0.5 mg/ml, която се инициира по време на реакцята] в 50 тМ натриев ацетат, pH 5.5, при 30°С в продължение на 1 час. Към 25 μΙ от пептидния разтвор във вода се прибавят различни концентрации от инхибитора в 1.0 μΙ диметилсулфоксид. Реакцията се инициира чрез добавяне на 15 μΙ от 0.33 пМ протеаза (0.11 ng) в разтвор на

0.133 М натриев ацетат с pH 5.5 и 0.1% говежди серумен албу- 31 - мин. Реакцията се прекъсва с добавяне на 160 μΙ от 5% фосфорна киселина. Реакционните продукти се разделят чрез високоефективна течна хроматография (VYDAC с широки пори с размер 5 cm С-18 с обратна фаза, градиент-ацетонитрил, 0.1% фосфорна киселина). Степента на инхибиране на реакцията се определя от височината на пиковете на продуктите. Чрез хроматограми на независимо синтезираните продукти се правят количествени стандарти, по които се определя количеството на продуктите в състава. Съединение А показва 1С₅₀©* стойности около 0.27 пМ.

Изследване на клетъчно разпространение

Инхибирането на разпространението на HIV в клетъчна култура се определя съгласно Nunberg, J. Н. et al, J. Virol., 65., 4887 (1991). В този опит МТ-4 Т-лимфоидни клетки се заразяват с HIV-1 (див тип, ако не е посочено друго), като се използва предварително определен инокулум и културите се инкубират в продължение на 24 часа. За този период се установява, че <1% от клетките са позитивни като се използва индиректна имунофлуоресценция. След това, клетките добре се промиват и се разпределят в блюда с 96 ямки. В ямките се прибавя инхибитор, който е разреден серийно двукратно и култивирането продължава още 3 дни. На четвъртия ден след заразяването, 100% от клетките в контролните култури са заразени. HIV-1 р24 акумулирането директно съответства на вирусното разпространение. Концентрацията, при която се инхибира клетъчната култура, се дефинира като инхибираща концентрация в наномола/литър и това е концентрацията, която редуцира разпространението на заразата с поне 95% или се означава още като CIC₉₅. С1С₉₅ за съединение А е 25 пМ.

- 32 Инхибиране на разпространението на вируса

A. Получаване на суспензия на МТ-4 клетки, заразени с HIV

МТ клетки се заразяват в ден, означен като нулев, при концентрация 250,000 на ml, с изходен разтвор на HIV-1 щам lllb, разреден 1:1000 (крайна концентрация 125 pg p24/ml; достатъчен, за да се заразят <1% клетки първия ден и 25-100% на четвъртия ден). Клетките се заразяват и култивират в следната среда: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10% инактивиран зародишен говежди серум, 4 тМ глутамин (Gibco Labs) и 1:100 Penicillin-Streptomycin (Gibco Labs).

Сместа се инкубира в продължение на 1 нощ при температура 37°С в атмосфера, съдържаща 5% СО₂.

Б. Лечение с инхибитори

Приготвя се матрица от комбинации от два инхибитора с концентрации в наномоларния диапазон. В първия ден , проби от по 125 μΙ от инхибиторите се прибавят към равни обеми от МТ-4 клетки, заразени с HIV (50,000 за ямка), в микротитърна паничка за клетъчно култивиране с 96 ямки. Инкубирането продължава 3 дни при температура 37°С в атмосфера, съдържаща 5% СО₂.

B. Отчитане на разпространението на вируса

Като се използва многоканална пипета, утаените клетки се ресуспендират и 125 μΙ се посяват в отделна микротитърна паничка. Супернатантата се изследва за HIV р24 антиген.

Концентрацията на HIV р24 антиген се определя чрез ензимен имуноанализ, описан по-долу. Проби от р24 антиген,

- 33 подлежащи на отчитане, се прибавят в микроямки, покрити с моноклонално антитяло, специфично за HIV вътрешен антиген. Микроямките се промиват в този етап и в други подходящи етапи, които следват. Прибавят се последователно биотинилирано HIV-специфично антитяло и конюгирани стрептавидинпероксидаза от хрян. След прибавяне на водороден пероксид и тетраметилбензидинов субстрат, се получава цветна реакция. Интензитетът на цвета е пропорционален на концентрацията на HIV р24 антигена.

Изчисляване на синергизма или степента на усилване на инхибирането

Когато комбинацията от двата инхибитора е синергитична, то тя усилва забележимо инхибирането на разпространението на вируса, в сравнение с действието на отделния инхибитор или в сравнение с простото наслагване на действието на отделните инхибитори в комбинацията.

Резултатите се обработват по следния начин: концентрациите, при които инхибиторите действат поотделно се изчисляват по метода на Elion, et al., J. Biol. Chem., 208, 477 (1954). Минималната сума от стойностите на тези концентрации, която дава максималния синергизъм, се определя за различни комбинации от инхибитори. Колкото по-малка е сумата, толкова посилно изразен е синергизъмът.

ПРИМЕР 1

Получаване на М-(2(П)-хидрокси-1(3)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(3)-(хидрокси)-5-(1-(2(3)-1\1-(1бутилкарбоксамидо)-пиперазинил)пентанамид. Съединение 14

- 34 Етап 1: Получаване на дихидро-5(3)-((Ьбутилдифенилсилил)оксиметил)-3(А)-фенилметил-3(2Н)-фуранон

Разтвор на литиев диизопропиламид се получава чрез добавяне на 1.55 ml п-бутиллитий (2.5 М в хексан) към 0.55 ml (3.9 mmola) диизопропиламин в 10 ml тетрахидрофуран при температура -78°С. След 30 минути се прибавя разтвор на дихидро-5-(3)-((Ьбутилдифенилсилил)оксиметил)-3(2Н)-фуранон (1.38 д, 3.89 mmola) в 5 ml тетрахидрофуран. След разбъркване в продължение на 30 минути се прибавя бензилбромид (0.68 д, 3.9 mmola) и разбъркването продължава още 3 часа, след което реакцията се прекъсва с добавяне на 10%-ен воден разтвор на лимонена киселина. Разтворът се екстрахира с етилацетат (2 х 50 ml), промива се обратно с концентриран солен разтвор, суши се, филтрува се и се концентрира до получаване на масло. Продуктът се пречиства чрез хроматография (силициев диоксид, 20% етилацетат/хексан), при което се получава съединението от заглавието.

Етап 2: Получаване на дихидро-5(в)-(хидроксиметил)-3(П)фенилметил-3(2Н)-фуранон

Към 5.26 g дихидро-5(8)-((1:-бутилдифенилсилил)оксиметил)-3(Р)-фенилметил-3(2Н)-фуранон в 40 ml ацетонитрил се прибавят 1.34 ml 49%-ен воден разтвор на флуороводород. Тази смес престоява 18 часа при стайна температура, след което се концентрира до сухо и остатъкът се разделя между вода (50 ml) и етилацетат (50 ml). Органичният слой се промива с концентриран солен разтвор, суши се, филтрува се и се концентрира до получаване на продукта под формата на червеникавокафяво твърдо вещество (т.т. 69-72°С).

- 35 Етап 3:

Получаване на дихидро-5(8)-((трифлуорметансулфонил)оксиметил)-3(И)-фенилметил-3(2Н)-фуранон

Към разтвор на 18.4 g (89.2 mmola) дихидро-5(в)-(хидроксиметил)-3(П)-фенилметил-3(2Н)-фуранон в 350 ml метиленхлорид, охладен до 0°С, се прибавят 13.51 ml 2,6-лутидин (115.98 mmola), след което се прибавят на капки 16.51 ml трифлуорметансулфонов анхидрид (98.1 mmola). Сместа престоява 1.5 часа при 0°С, след което реакционната смес се излива в 300 ml смес от лед/концентриран солен разтвор и се разбърква 0.5 часа. Водният слой се екстрахира с метиленхлорид (3 х 150 ml), органичните слоеве се промиват с 10% HCI (2 х 75 ml), наситен разтвор на натриев бикарбонат (100 ml), вода (100 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира, при което се получава твърд остатък. Пречистване чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm, градиент на елуиране хексани:етилацетат, 4:1 до 3:1) дава продуктът от заглавието; т.т. 53-54°С.

Етап 4: Получаване на 4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-1(фенилметилкарбониламино)-пиперазин-28-карбоксилна киселина

Съединението от заглавието се получава като се прилага метода на Bigge, C.F.; Hays, S.J.; Novak, Р.М.; Drummond, J.T.; Johnson, G.; Bobovski, T.P., Tetrahedron Lett., 1989, 30., 5193; и като се излиза от 2(8)-пиперазинкарбоксилна киселина, (виж Felder, Е.; Maffei, S.; Pietra, S.; Pitre, D.. Helv, Chim, Acta. 1960, 117. 888.

- 36 Етап 5: Получаване на Ν-ΐ-6γτπΛ-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-1-(фенилметилкарбониламино)пиперазин-2(8)-карбок самид

Към 9.90 g (27.16 mmola) от продукта, получен в етап 4, разтворен в 75 ml диметилформамид и охладен до 0°С, се прибавят последователно 5.73 g (29.88 mmola) EDC, 4.03 g (29.88 mmola) HOBt, 3.14 ml (29.88 mmola) t-бутиламин и 4.16 ml (29.88 mmola) триетиламин. Реакционната смес се разбърква в продължение на 18 часа и се концентрира докато обемът стане наполовина. След това, сместа се разрежда с 600 ml етилацетат и се промива с 10% HCI (2 х 75 ml), наситен разтвор на натриев бикарбонат (1 х 75 ml), вода (3 х 75 ml) и с концентриран солен разтвор (1 х 50 ml), суши се над магнезиев сулфат и се концентрира до получаване на твърда маса. Последната се стрива с етилацетат : хексан (1:2) и се филтрува, като се получава съединението от заглавието под формата на бяло твърдо вещество; т.т. 134-135°С.

Етап 6: Получаване на М-Ьбутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(в)-карбоксамид

Към 1.20 g (2.86 mmola) М-Ьбутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)-1-(фенилметилкарбониламино)пиперазин-2(8)карбоксамид и 1.1 g (0.086 mmola) 10% Pd/C се прибавят 15 ml метанол. Съдът се зарежда с водород и реакционната смес се разбърква 2 часа, филтрува се през целит и се промива с етанол. Разтворителите се отстраняват във вакуум, като се получава съединението от заглавието във вид на пяна.

¹Н ЯМР (300 MHz, CDCI₃) δ 6.65 (br, 1Н), 4.10 (m, 1Н), 3.81 (br,

1Н), 3.21 (dd, J = 18 и 7 Hz, 1 Η), 3.02-2.70 (m, 4H), 2.10-2.0 (br,

1H), 1.50 (s, 9H), 1.41 (s, 9H).

- 37 Етап 7: Получаване на дихидро-5(8)-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино))-2(8)-М-(Ьбутилкарбоксамидо)пиперазинил)метил-3(Я)-фенилметил-3(2Н)-фу ранон

Към разтвор на 22.40 g (0.0662 mola) дихидро-5(8)-((трифлуорметансулфонил) оксим етил)-3(И)-фе нилметил-3(2Н)фу ранон (получен в етап 3) и 18.0 g (0.063 mola) 1М-Ьбутил-4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)пиперазин-2(8)-карбоксамид, разтворен в 180 ml изопропанол, се прибавят 11.53 ml (0.0662 mola) Ν,Ν-диизопропилетиламин. След 2.5 часа се прибавят още

1.2 g дихидро-5(8)-((три-флуорметансулфонил)оксиметил)-3(П)фенилметил-3(2Н)фуран-он. Реакцията завършва с тънкослойна хроматография след 3.5 часа и реакционната смес се концентрира до гъсто масло. След стриване с етилацетат:хексани (1:2, 200 ml) се получава бяло твърдо вещество, което се филтрува и се изхвърля. Маслото се пречиства чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm колона, градиент на елуирането 1:1, 2:1, 3:1 етилацетат:хексани), при което се получава съединението от заглавието.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 7.34-7.17 (m, 5Н), 6.31 (br s, 1H), 4.38 (br m, 1H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.79 (br m, 1H), 3.16 (dd, J = 13.6 и 4.4 Hz, 1H), 3.08-2.99 (m, 3H), 2.90-2.82 (m, 1H), 2.80 (dd, J = 13.5 и 8.9 Hz, 1H), 2.78 (m, 1H), 2.67-2.61 (m, 1H), 2.58-2.49 (m, 1H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.32-2.04 (m, 1H), 1.99-1.92 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.29 (s, 9H).

Етап 8: Получаване на 2(Р)-фенилметил-4(8)-(Ьбутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М(Ьбутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид

Към 25.50 g (52.50 mmola) дихидро-5(8)-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино))-2(8)-М-(Ьбутилкарбоксамидо)-пипера- 38 зинил)-метил)-3(К)-фенилметил-3(2Н)-фуранон, разтворен в 120 ml DME, охладен до 0°С, се прибавя разтвор от 60 ml вода и 1.512 g (63.01 mmola) литиев хидроксид. След 0.5 часа реакцията се прекъсва, като се добавя 10% HCI до установяване на pH 6 и разтворът се концентрира във вакуум. Остатъкът се разтваря в 50 ml вода и се екстрахира с етилацетат (4 х 75 ml) и органичните слоеве се промиват с вода (1 х 20 ml), концентриран солен разтвор (1 х 20 ml). Водните слоеве се екстрахират с етилацетат (2 х 75 ml) и събраните органични слоеве се сушат над магнезиев сулфат, след което се концентрират до жълто твърдо вещество. Суровият продукт се разтваря в 100 ml диметилформамид и се прибавят последователно 17.87 g (0.262 mola) имидазол, охладен до 0° и 31.50 g (0.21 mola) t-бутилдиметилсилилхлорид. Тази смес се разбърква 1 час при 0°С, след което се затопля до стайна температура. След 20 часа се добавят 10 ml метанол и реакционната смес се концентрира до намаляване на обема наполовина. Прибавят се 100 ml буферна вода с pH 7 и водният слой се екстрахира с етилацетат (4 х 100 ml), събраните органични слоеве се промиват с 10% HCI (2 х 50 ml), с вода (3 х 75 ml) и с концентриран солен разтвор (1 х 50 ml), сушат се над магнезиев сулфат и се концентрират до получаване на съединението от заглавието. Този продукт се използва директно в следващия етап.

Етап 9: Получаване на М-(2(П)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(8)-(Ьбутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2 (8)-М-(1-бутилкарбоксами до)-пиперазинил) )-пентанамид

Към 27.0 g (0.0446 mola) непречистен продукт от етап 6, разтворен в 180 ml диметилформамид и охладен до 0°С, се

- 39 прибавят 8.98 g (0.0468 mola) EDC, 6.32 g (0.0468 mola) HOBt и

7.31 g (0.049 mola) аминохидроксииндан. Прибавя се триетиламин (6.52 ml, 0.0468 mola) и реакционната смес се разбърква при 0°С в продължение на 2 часа, след това при стайна температура 16 часа и се реакцията се прекъсва чрез разреждане с 500 ml етилацетат. Органичният слой се промива с 10% HCI (2 х 100 ml), с наситен разтвор на натриев бикарбонат (1 х 100 ml), с вода (3 х 150 ml) и с концентриран солен разтвор (1 х 75 ml), суши се над магнезиев сулфат и се концентрира, като се получава съединението от заглавието под формата на бяла пяна.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 7.4-7.17 (m, 9Н), 6.51 (br s, 1 Η), 5.79 (br s, 1H), 5.23 (m, 1H), 4.23 (br s, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.96-3.84 (m, 2H), 3.07-2.78 (m, 8H), 3.65 (dd, J = 9.6 и 4.1 Hz, 1H), 2.56-2.44 (m, 2H), 2.29 (dd, J = 12.0 и 4.5 Hz, 1H), 2.17-2.09 (m, 1H), 1.79 (br s, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (s, 1H), 0.84 (s, 9H), 0.12 (s, 3H), 0.08 (s, 3H).

Етап 10: Получаване на М-(2(Р)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(Р)фенилметил-4(8)-(хидрокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбонилам ино) ))-2 (S)-N-(Ьбутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид

Към 32.20 g (0.0437 mola) М-(2(Р)-хидрокси-1(в)-инданил)2(Р)-фенилметил-4(8)-(Ьбутилдиметилсилилокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М-(Ьбутилкарбоксамидо)пиперазинил))-пентанамид се прибавят 437 ml (0.437 mola) тетрабутиламониев флуорид (1.0 М разтвор в тетрахидрофуран, Aldrich). Реакционната смес се разбърква 18 часа, след което се концентрира до 200 ml и се разрежда със 700 ml етилацетат. Промива се с вода (2 х 100 ml), с концентриран солен разтвор (1 х 50 ml) и водните слоеве се екстрахират отново с етил

- 40 ацетат (2 х 200 ml). Събраните органични слоеве се сушат над магнезиев сулфат и се концентрират до получаване на масло. След пречистване чрез флаш колонна хроматография (120 х 150 mm колона, градиентно елуиране с CH₂CI₂:CHCI₃, наситен с амоняк:метанол, нарастваща концентрация на метанол от 1%, 1.5%, 2%) се получава съединението от заглавието във вид на бяла пяна.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 7.31-7.11 (m, 9Н), 6.41 (br s, 1H), 6.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 8.6 и 4.7 Hz, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.83-3.82 (m, 2H), 3.22-3.19 (m, 2H), 3.03-2.78 (m, 8H), 2.62-2.58 (m, 1H), 2.41-2.35 (m, 2H), 2.04-2.02 (m, 1H), 1.57-1.50 (m, 1H),

1.45 (s, 9H), 1.32 (s, 9H).

Етап 11: Получаване на М-(2(И)-хидрокси-1 (8)-инданил)-2(Я)фенилметил-4 (S)-(хидрокси)-5-(1-(2 (S)-N-(t-бутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид

Към 21.15 g (0.034 mola) М-(2(К)-хидрокси-1(8)-инданил)2(Я)-фенилметил-4(8)-(хидрокси)-5-(1-(4-(1,1-диметилетоксикарбониламино)))-2(8)-М-(Ьбутилкарбоксамидо)-пиперазинил))пентанамид, разтворен в 350 ml метиленхлорид и охладен до 0°С, се прибавят 22.43 ml (0.204 mola) 2,6-лутидин и след това 32.85 ml (0.170 mola) триметилсилилтрифлат в продължение на 5 минути. След 0.5 часа реакцията се прекъсва с 10% HCI (80 ml) и реакционната смес се разбърква 0.5 часа. Към нея се прибавят 100 ml наситен разтвор на натриев бикарбонат и след това твърд натриев бикарбонат до установяване на pH 8. Водният слой се екстрахира с етилацетат (4.x 100 ml), а събраните органични слоеве се промиват с вода (1 х 50 ml), с концентриран солен разтвор (1 х 75 ml), сушат се над магнезиев сулфат и се концентрират. Остатъкът се пречиства чрез колонна

- 41 хроматография (120 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH₂CI₂:CHCI₃, наситен с NH₃:MeOH, бавно нарастваща концентрация на метанол от 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, до 10%). Получава се продуктът от заглавието като бяла пяна.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 7.53 (s, 1H), 7.29-7.09 (m, 9H), 6.52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.24 (dd, J = 8.2 и 4.9 Hz, 1H), 4.23 (dd, J = 4.7 и 4.03 Hz, 1H), 4.25-4.00 (br s, 1H), 3.83-3.81 (m, 1H), 3.03-2.88 (m, 4H), 2.82-2.73 (m, 7H), 2.50-1.60 (br s, 2H), 2.45 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.32-2.29 (m, 1H), 1.98 (m, 1H), 1.51 (m, IH), 1.33 (s, 9H).

Получаване на М-(2(Н)-хидрокси-1(В)-инданил)-2(Н)-фенилметил-4(Н)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2.3-Ь]пиридилметил)-2(В)-М’-(Ь бутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид

Етап 1: Получаване на фуро[2,3-Ь]пиридин-2,5-дикарбоксилна киселина

ОН

Към р-азтвор на известния [Snyder, H.R., Ebetino, F.F., JL Het, Chem.. 3., 202-205 (1966)] диетилфуро[2,3-Ь]пиридин-2,5карбоксилат (1.22 g, 4.923 mmola) в 10 ml 95% етанол се прибавя разтвор на калиев хидроксид (0.66 g, 11.81 mmola), разтворен в 10 ml вода. Реакционната смес се загрява до 80°С в продължение на 3 часа, охлажда се до стайна температура и се филтрува. Двукалиевата сол се разтваря във вода и се подкиселява с 10% HCI до pH 2. Утайката се филтрува и се суши под вакуум, като се получават 850 mg бяло твърдо вещество.

- 42 ¹Н ЯМР (400 MHz, (CD₃)₂SO) δ 8.98 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.76 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 4.25 (br s, 3H).

Етап 2: Получаване на фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилна киселина

Към суспензия на фуро[2,3-Ь]пиридин-2,5-дикарбоксилна киселина (0.36 g, 1.484 mmola) в 3 ml хинолин, под аргон, се прибавя мед на прах (180 mg, 2.82 mmola) и се загрява до 210°С в продължение на 1.5 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и се разрежда с 50 ml метиленхлорид, след което се филтрува през целит. Органичният слой се екстрахира с наситен разтвор на натриев карбонат (2 х 40 ml), подкиселява се до pH 3 с 3 N HCI и се филтрува, като се получават 80 mg червеникавокафяво твърдо вещество. Водният слой се екстрахира с етер/метанол (85/15) (3 х 50 ml) и се промива с концентриран солен разтвор (1 х 10 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира, при което се получават още 35 mg.продукт.

¹Н ЯМР (400 MHz, (CD₃OD) δ 8.89 (s, 1H), 8.67 (d, J = 2.0 Hz, 1H),

7.97 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.4 Hz, 1H).

Етап 3: Получаване на метил фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилат

- 43 Към фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилна киселина (3.0 д, 18.40 mmola), разтворена в 40 ml метанол се прибавят 160 ml хлороформ и след това се прибавя бавно триметилсилилдиазометан (42 ml, 10% разтвор в хексани). След 0.5 часа се прибавят 4 капки ледена оцетна киселина и реакционната смес се концентрира. Получават се 3.20 g белезникаво вещество ¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 9.02 (d,. J = 2.0 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H).

Етап 4: Получаване на 5-хидроксиметилфуро[2,3-Ь]пиридин

500-милилитрова облодънна колба, изсушена на пламък, се зарежда с метил фуро[2,3-Ь]пиридин-5-карбоксилат (3.20 д, 18.08 mmola) в 90 ml тетрахидрофуран и се охлажда до 0°С. Към този разтвор се прибавя диизобутилалуминиев хидрид (46 ml, 46.1 mmola, 1 М разтвор в хексани) в продължение на 10 минути и охлаждащата баня се отстранява. След 4 часа реакционната смес се охлажда до 0°С, след което реакцията се прекъсва със Сегнетова сол (100 ml). След още 18 часа слоевете се разделят и водният слой се екстрахира с етилацетат (4 х 40 ml). Събраните, органични слоеве се промиват с концентриран солен разтвор (1 х 20 ml), сушат се над магнезиев сулфат, филтруват се и се концентрират. Остатъкът се пречиства чрез флаш колонна хроматография (40 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH₂CI₂:CH₂Cl2, наситен с NH₃:MeOH

- 44 60:39:1.0 (1000 ml), 60:38:2 (1000 ml), 60:37:3 (1000 ml), 60:36:4 (1000 ml). Получават се 2.16 g бяло твърдо вещество.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 8.19 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2?4 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 3.8 Hz, 2H), 4.69 (br s, 1H).

Етап 5: Получаване на хидрохлорид на 3-хлорметилфуро[2,3-Ь]пиридин

CI

НС!

Към разтвор на 5-хидроксиметилфуро[2,3-Ь]пиридин, разтворен в 9 ml метиленхлорид, охладен до 0°С, се прибавя тионилхлорид (4.23 ml, 57.99 mmola). Ледената баня се отстранява и след 1 час реакционната смес се концентрира до получаване на 2.86 g белезникаво твърдо вещество.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI3) δ 8.40 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.74 (s, 2H).

Етап 6: Получаване на М-(2(П)-хидрокси-1(в)-инданил)-2(К)фенилметил-4(в)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)2(8)-М’-(1-бутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид

Към разтвор на М-(2(П)-хидрокси-1(3)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(2(8)-М’-(1-бутилкарбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид (6.50 g, 12.48 mmola), разтворен в 12 ml диметилформамид, под аргон, се прибавят 3-хлорметилфуро[2,3-Ь]пиридин хидрохлорид (2.80 g, 13.72 mmola) и триетиламин (5.21 ml, 37.44 mmola). Слез 18 часа реакционната смес се разрежда с 400 ml етилацетат и се промива с наситен разтвор на натриев бикарбонат (1 х 25 ml), с вода (5 х 20 ml) и с концентриран солен разтвор (1 х 25 ml). Разтворът се суши над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира до масло. Остатъкът се пречиства чрез флаш колонна хроматография (60 х 150 mm колона, градиентно елуиране CH₂CI₂:CH₂CI₂, наситен с NH₃:MeOH 60:39:1.0 (1000 ml), 60:38:2 (1500 ml), 60:37:3 (1500 ml), 60:36:4 (1500 ml). Получената пяна се обработва (чрез стриване) с етилацетат и желаният продукт се филтрува и суши в продължение на една нощ при висок вакуум и температура 65°С. Получават се 5.30 g бяло кристално твърдо вещество. Смесени фракции от колонната хроматография могат да се съберат и да се пречистят отново, за да се получи допълнителен добив от продукт. Т.т. 183.5-184.5°С.

¹Н ЯМР (400 MHz, CDCI₃) δ 8.25 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 2.0

Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.73 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32-7.10 (m, 9H),

6.75 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 8.5 и 4.8 Hz, 1H), 4.27-4.26 (m, 1H), 4.12 (br s, 1H), 3.89-3.83 (m, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.29 (dd, J = 17.5 и 4.0 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 3.66 и 3.48 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 6.6 и 5.1 Hz, 1H), 2.94-2.50 (m, 11H), 2.36-2.34 (m, 1H), 1.66 (s, 1H), 1.62-1.47 (m, 1H), 1.35 (s, 9H). Анализ Изчислено за C3₈H₄₇N₅O5

C, 69.81; H, 7.25; N,10.71. Намерено: C, 69.46; H, 7.22; N,10.69.

ПРИМЕР 3

Като се използва, по принцип, процедурата, описана в пример 2, но се обработва N-(2(R)-xnflpoKcn-1 (8)-инданил)-2(Р)фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(2(8)-Н’-(Ьбутилкарбоксамидо)пиперазинил))-пентанамид (съединение (i), дадено по-долу) с алкилиращ агент (ii), посочен по-долу, вместо алкилиращия агент, използван в етап 6, се получават съединенията с формула (iii):

WO 95/16688

PCT/US94/14187

-47-.

R¹-X

s

: таи, 4

Получаване-на амид. 1

»11

Разтвор на (-)-цис-1-аминоиндан-2-ол (884 д, 5.93 mola) в

17.8 I сух тетрахидрофуран (KF = 55 mg/ml) (KF означава титруване на вода по Karl Fisher) и триетиламин (868 ml, 6.22 mola) в 50-литрова облодънна колба, снабдена с термодвойка, механична бъркалка и входящ накрайник за азот и барботьор, се охлажда до 15°С. След това се прибавя 3-фенилпропионилхлорид (1000 д, 5.93 mola) в продължение на 75 минути, като температурата в колбата се поддържа между 14-24°С с охлаждаща баня лед-вода. След добавянето, сместа се оставя да престои при температура 18-20°С 30 минути и се проверява чрез високоефективна тънкослойна хроматография (ВЕТХ) за отсъствието на (-)-цис-1-аминоиндан-2-ол.

Ходът на реакцията се следи с ВЕТХ: 25 cm Dupont C8-RX колона, 60:40 ацетонитрил/ЮтМ (КН₂РО₄/К₂НРО₄), 1.0 ml/min, инжекторен обем = 20 ml, детектиране = 200 nm, приготвяне на пробата = 500 х разреждане. Приблизителни времена на задържане:

време на задържане (min.) идентифициран

6.3 цис-аминоинданол

Реакционната смес се обработва с пиридинов р-толуенсулфонат (241 д, 0.96 mola, 0.16 екв.) и се разбърква 10 минути (pH на сместа след разреждане на 1-милилитрова проба с равен обем вода е между 4.3-4.6). След това се прибавя 2-метоксипропен (1.27 I, 13.24 mola, 2.2 еквив.) и реакционната смес се загрява до 38-40°С в продължение на 2 часа. Реакционната смес се охлажда до 20°С и се разделя между етилацетат (12 I) и 5% воден разтвор на натриев бикарбонат (10 I). Сместа се разбърква и слоевете се разделят. Етилацетатният

- 51 екстракт се промива с 5% воден разтвор на натриев бикарбонат (10 I) и с вода (4 I). Етилацетатният екстракт се суши чрез дестилация при атмосферно налягане и разтворителят се пресича с циклохексан (общ обем приблизително 30 I). В края на дестилацията и концентрирането (20 об.% екстракционен обем на етилацетата), горещият циклохексанов разтвор се оставя да се охлади бавно до 25°С, при което кристализира

продуктът. Получената суспензия се охлажда допълнително до 10°С и се оставя да престои 1 час. Продуктът се изолира чрез филтруване, мократа филтърна утайка се промива със студен (10°С) циклохексан (2 х 800 ml). Промитата филтърна утайка се суши под вакуум (26“ Нд) при 40°С , при което се получават

1.65 kg ацетонид 1 (86.4%, 98% площ чрез ВЕТХ), ¹Н ЯМР (300.13 MHz, CDCI3, основен ротамер) δ 7.36-7.14 (m, 9Н), 5.03 (d, J = 4.4, 1Н), 4.66 (m, 1Н), 3.15 (m, 2Н), 3.06 (br s, 2H), 2.97 (m, 2H), 1.62 (s, ЗН), 1.37 (s, ЗН); ¹³C ЯМР (75.5 MHz, CDCI3, основен ротамер) δ0 168.8, 140.9, 140.8, 140.6, 128.6, 128.5, 128.4, 127.1, 126.3, 125.8, 124.1, 96.5, 78.6, 65.9, 38.4,

Анализ	изчислено за C21H23NO2 С, 78.47; Н, 7.21; Ν, 4.36
намерено	С, 78.65; Н, 7.24; Ν, 4.40

ПРИМЕР 5

Получаване на епоксид 3

OTs

--------------------------,

База

Разтвор на ацетонид 1 (1000 д, 3.11 mola) и 2(в)-глицидилтозилат 2 (853 д, 3.74 mola, 1.2 екв.) в 15.6 I тетрахидрофуран (KF = 22 mg/ml), в 50-литрова 4-гърлена облодънна колба, снабдена с термодвойка, механична бъркалка, допълнителна фуния и входящ накрайник за азот, се обезгазява три кратно през вакуумно устройство за продухване на азот и се охлажда до -56°С. След това, се прибавя литиев хексаметилдисилазид (LiN[(CH₃)₃Si]₂)(2.6 I, 1.38 Μ, 1.15 екв.) в продължение на 2 часа, като температурата в колбата се поддържа между -50 и -45°С. Реакционната смес се разбърква при -45 до -40°С 1 час и след това се оставя да се затопли до -25°С за 1 час.

Сместа се разбърква в продължение на 4 часа при температура -25 до -22°С (или докато изходният ацетонид съответства на 3% площ).

- 53 Ходът на реакцията се следи чрез ВЕТХ: 25 cm х 4.6 nm Zorbax Silica колона, 20% етилацетат в хексан, 2.0 ml/min, инжекторен обем = 20 ml, детектиране = 254 nm, приготвяне на пробата = 100 х разреждане. Приблизителни времена на задържане:

време на задържане (min)

5.5

6.5

13.5 идентифицирани амид 1 глицидилтозилат 2 епоксид 3

Реакционната смес се обработва бавно с дейонизирана вода (6.7 I) при -15°С и се разделя с етилацетат (10 I). Сместа се разбърква и слоевете се разделят. Етилацетатният екстракт се промива със смес от 1% воден разтвор на натриев бикарбонат (5 I) и наситен разтвор на натриев хлорид (0.5 I). Етилацетатният екстракт (28.3 I) се концентрира чрез вакуумдестилация (28“ Нд) и се прибавя допълнително количество етилацетат до доливане на разтворителя до такава степен, че да се пресече с етилацетата (краен обем = 11.7 I). След това, разтворителят в етилацетатния концентрат се пресича с метанол, при което кристализира продуктът и се концентрира до краен обем 3.2 I. Остатъчният етилацетат (разтворител) се отстранява чрез добавяне на 10 I метанол и събиране на 10 I дестилат. Получената суспензия се разбърква 1 час при 22°С , след това се охлажда до 5°С и се оставя да престои 0.5 часа. Продуктът се изолира чрез филтруване и мократа филтърна утайка се промива със студен метанол (2 х 250 ml). Промитата утайка се суши под вакуум (26“ Нд) при 25°С , като се полу- 54 чават 727 g от епоксид 3 (61.2%, 98.7% площ, съответстваща на основното количество епоксид, съгласно ВЕТХ):

¹³С ЯМР (300 MHz, CDCI₃) δ 171.1, 140.6, 140.5, 139.6, 129.6,

128.8, 128.2, 127.2, 126.8, 125.6, 124.1, 96.8, 79.2, 65.8, 50.0,

48.0, 44.8, 39.2, 37.4, 36.2, 26.6, 24.1.

- 55 ПРИМЕР 6

Получаване на пенултимат 6

Суспензия от 2(8)4-бутилкарбоксамид-4-М-Вос-пиперазин (1950 д, 6.83 mola, >99.5% ее) (ее = енантиомерен излишък) и епоксид 3 (2456 д, 97.5:2.5 смес от 4S/R епоксиди, 6.51 mola) в изопропанол (2-пропанол,18.6 I), в 72-литрова облодънна колба

- 56 с 4 входящи отвора, снабдена с механична бъркалка, обратен хладник, парна баня, термодвойка, покрита с Teflon и входящ отвор за азота, се загрява до температурата на кипене на сместа (вътрешната температура е 84-85°С). След 40 мин се получава хомогенен разтвор. Сместа се нагрява под обратен хладник 28 часа.

Вътрешната температура по време на загряването с обратен хладник е 84-85°С. Ходът на реакцията се следи с ВЕТХ: 25cm Dupont C8-RX колона, 60:40 ацетонитрил/1 ОтМ (КН₂РО4/К₂НРО₄), 1.0 ml/min, детектиране = 220 nm, приготвяне на пробата = 2μΙ, реакционна смес, разредена до 1 ml в ацетонитрил.

време на задържане (min) идентифицирани

4.8 пиперазин 4

8.9 епоксид 3

15.2 свързан продукт 5

След 28 часа, на остатъчния епоксид 3 и свързания продукт 5 (установено чрез ВЕТХ) съответства площ 1.5% и 9193%, съответно. Сместа се охлажда до 0-5°С и се прибавят 20.9 I 6N HCI, като температурата се поддържа под 15°С. След като приключи прибавянето, сместа се затопля до 22°С. Забелязва се отделяне на газ в този момент (изобутилен). Сместа се оставя да престои при 20-22°С в продължение на 6 часа.

Ходът на реакцията се следи чрез ВЕТХ: условията са същите като тези, посочени по-горе. Приблизителни времена на задържане:

- 57 време на задържане (min)

7.0

11.9

15.1 идентифицирани цис-аминоинданол пенултимат 6 свързан продукт 5

Сместа се охлажда до 0°С и към нея се прибавят бавно 7.5 I 50% NaOH, за да се установи pH на сместа 11.6, като температурата се поддържа под 25°С по време на прибавянето. Сместа се разделя между етилацетат (40 I) и вода (3 I). Сместа © се разбърква и слоевете се разделят. Органичната фаза (6 I) се концентрира при понижено налягане (29“ Нд) и разтворителят се пресича с диметилформамид, следва концентриране до краен обем 10.5 I (KF = 1.8 mg/ml). След ВЕТХ, добивът от 6 в етилацетат е 86.5%. Пенултиматът 6 в диметилформамид се използва направо в следващия етап, без допълнително пречистване. За изолирано съединение 6:

¹³С ЯМР (75.4 MHz, CDCI₃) δ 175.2, 170.5, 140.8, 140.5, 139.9,

129.1, 128.5, 127.9, 126.8, 126.5, 125.2, 124.2, 73.0, 66.0, 64.8, _А 62.2, 57.5, 49.5, 47.9, 46.4, 45.3, 39.6, 39.3, 38.2, 28.9.

ПРИМЕР 7

Пиразин-2-Ьбутилкарбоксамид 9

| ------------------->

^N^OOOH

2-пиразинкарбоксилна киселина (8)	3.35 kg (27 mola)
оксалилхлорид	3.46 kg (27.2 mola)
t-бутиламин (KF = 460 дд/ml)	9.36 I (89 mola)
етилацетат (KF = 56 цд/т1)	27 I
диметилформамид	120 ml

1-пропанол

I

Карбоксилната киселина 8 се суспендира в 27 I етилацеС тат и 120 ml диметилформамид в 72-литрова тригърлена колба, снабдена с механична бъркалка, под азот и суспензията се охлажда до 2°С. Прибавя се оксалилихлоридът и температурата се поддържа между 5 и 8°С.

Добавянето завършва след 5 часа. По време на екзотермичното добавяне се отделят CO и СО₂. Образувалият се HCI до голяма степен остава в разтвора. Наличната утайка, вероятно е, хидрохлоридна сол на киселинен хлорид на пиразина. Образуването на киселинния хлорид се установява чрез обработване на суха проба от реакционната смес с t-бутиламин. В края на реакцията се откриват <0.7% от киселина 8.

Установяването на приключването на процеса на образуване на киселинния хлорид е важно, тъй като непълното протичане на реакцията води до образуване на онечистване от бис-Ьбутилоксамид.

Реакцията може да се следи с ВЕТХ: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона с 1 ml/min поток и детектиране при 250 nm; линеен градиент от 98% 0.1% воден разтвор на Н₃РО₄ и 2% CH₃CN до 50% воден разтвор на Н₃РО₄ и 50% CH₃CN на 30-тата минута. Времена на задържане: киселина 8 = 10.7 min, амид 9 = 28.1 min.

- 59 Реакционната смес се оставя да престои при 5°С 1 час. Получената суспензия се охлажда до 0°С и се прибавя t-бутиламин с такава скорост, че вътрешната температура да се поддържа под 20°С.

Прибавянето изисква 6 часа, тъй като реакцията е силно екзотермична. Малка част от образувалия се t-бутиламониев хидрохлорид се отделя от реакционната смес като рохкава бяла маса.

Сместа се оставя да престои при температура 18°С още © 30 минути. Утаените амониеви соли се отстраняват чрез филтруване. филтърната утайка се промива с 12 I етилацетат. Събраните органични фази се промиват с 6 I 3% натриев бикарбонат и 2 х 2 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Органичната фаза се обработва с 200 g Darco G60 въглен и се филтрува през Solka Flok и филтърната утайка се промива с 4 I етилацетат.

Обработка с въглен отстранява до голяма степен появилото се виолетово оцветяване в продукта.

Етилацетатният разтвор на 9 се концентрира при налягане 10 mbar до 25% от изходния обем. Прибавят се 30 I 1-пропанол и дестилацията продължава до краен обем 20 I.

В този момент количеството на етилацетата е под определяемото чрез ¹Н ЯМР (<1 %). Вътрешната температура в този разтворител е под 30°С. Разтворът на 3 в 1-пропанол/етилацетат е стабилен при кипене при атмосферно налягане в продължение на няколко дни.

След изпаряване на пробата се получава червеникавокафяво твърдо вещество, т.т. 87-88°С.

¹³С ЯМР (75 MHz, CDCI₃, ppm) 161.8, 146.8, 145.0, 143.8, 142.1,

51.0, 28.5.

- 60 ПРИМЕР 8 рац.-2-Ьбутилкарбоксамид-пиперазин 10

H₂/Pd(OH)_2>

CONHt-Bu

N CONHt-Bu Η

10 © Материали

Пиразин-2-1-бутилкарбоксамид 9 2.4 kg (13.4 mola) в 1пропанолен разтвор 12 I на 20% Pd(OH)₂/C 16 тегл.% вода 144 д.

Пиразин-2-Ьбутилкарбоксамидът 9/1-пропанолният разтвор се поставят в автоклав с обем от 5 галона (1 галон = 3.79 I). Прибавя се катализаторът и сместа се хидрогенира при 65°С и водородно налягане 3 атм.(40 psi).

След 24 часа, в реакцията е изразходвано теоретично количество водород и газова хроматография показва <1% от 9. ©Сместа се охлажда, продухва се с азот и катализаторът се отстранява чрез филтруване през Solka Floc. Катализаторът се промива с 2I топъл 1-пропанол.

Установи се, че когато се използва топъл 1-пропанол за промиване на филтърната утайка, се подобрява филтруването и се намаляват загубите от продукт във филтърната утайка.

Реакцията се следи чрез газова хроматография (ГХ): 30m Megabore колона, от 100°С до 160°С при 10°С/мин, мъртво време 5 мин, след това при 10°С/мин до 250°С, времена на задържане: 9 = 7.0 min, 10 = 9.4 min. Реакцията може да се следи и чрез тънкослойна хроматография с етилацетат/метанол (50:50) като разтворител и нинхидрин като проявител.

- 61 Изпаряване на проба показва, че добивът при амидиране и хидрогениране е 88% и че концентрацията на 10 е 133 g/l.

Изпаряване на проба дава 10 като бяло твърдо вещество с т.т. 150-151 °C;

¹³С ЯМР (75 MHz, D₂O, ppm) 173.5, 59.8, 52.0, 48.7, 45.0, 44.8, 28.7.

ПРИМЕР 9

сол на (8)-2-Ьбутилкарбоксамид-пиперазин и бис (в)-камфорсулфонова киселина (S)-11

Н

2( + )-CSA

-----------------►

• 2( + )-CSA

N CONHt-Bu Η

Материали

разтвор на рац-24-бутилкарбокс-	4.10 kg (22.12 mola)
амид-пиперазин 10 в 1-пропанол	в 25.5 kg разтворител
(в)-( + )-10-камфорсулфонова к-на	10.0 kg (43.2 mola)
1-пропанол.	12 I
ацетонитрил	39 I

вода

2.4 I

Разтворът на амин 10 в 1-пропанол се зарежда в 100литрова колба, свързана с концентратор с периодично действие. Разтворът се концентрира при 10 mbar и температура под 25°С до обем, приблизително, 12 I.

- 62 В този етап продуктът се утаява от разтвора, но се връща отново в разтвор, когато сместа се загрее до 50°С.

Анализ на хомогенна проба показва, че концентрацията на 10 е 341 g/l. Концентрацията се определя¹ чрез ВЕТХ: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона с 1.5 ml/min поток и детектиране

при 210 пт, изократна хроматография (98/2) CH₃CN/0.1% водна Н₃РО₄. Време на задържане за 10: 2.5 min.

Прибавят се ацетонитрил (39 I) и вода (2.4 I), като се получава бистър, бледо кафяв разтвор.

Определяне на водното съдържание чрез KF титруване и на съотношението СН₃СМ/1-пропанол чрез ¹Н ЯМР интегриране показва, че съотношението СН₃СМ/1-пропанол/Н₂О е 26/8/1.6.

Концентрацията в разтвора е 72.2 g/l.

(в)-Ю-камфорсулфоновата киселина (CSA) се подава в продължение на 30 минути, на 4 порции, при температура 20°С. Температурата се повишава до 40°С, след като се добави камфорсулфоновата киселина. След няколко минути се образува плътна бяла утайка. Последната се загрява до 76°С, при което

се разтварят твърдите вещества, а светлокафявият разтвор се оставя да се охлади до 21°С в продължение на 8 часа.

Продуктът се утаява при 62°С, филтрува се без престояване при 21°С и филтърната утайка се промива с 5 I смес от разтворители СН₃СМ/1-пропанол/Н₂О (26/8/1.6.). Тя се суши при 35°С във вакуумпещ при продухване с азот, като се получават

5.6 kg (39%) от 11 във вид на бяло кристално вещество с т.т. 288-290°С (с разлагане).

[a]D²⁵ = 18.9° (с = 0.37, Н₂О).

¹³С ЯМР (75 MHz, D₂O, ppm) 222.0, 164.0, 59.3, 54.9, 53.3, 49.0,

48.1, 43.6, 43.5, 43.1, 40.6, 40.4, 28.5, 27.2, 25.4, 19.9, 19.8.

Енантиомерният излишък (ее) от продукта е 95%, съгласно описаната по-нататък хирална ВЕТХ: проба от 11 (33 mg) се суспендира в 4 ml етанол и 1 ml Et₃N. Прибавя се Вос₂О (11 mg) и реакционната смес се оставя да престои 1 час. Разтво рителят се отстранява напълно във вакуум и остатъкът се разтваря в приблизително 1 ml етилацетат и се филтрува с пипета на Пастьор със силициев диоксид и елуент етилацетат.

Изпарените фракции на продукта се разтварят отново в хексани при приблизително 1 mg/ml. Енантиомерите се разделят върху колона Daicel Chiracell AS със система разтворители хексан/IPA (97:3)1 при скорост на потока 1 ml/min и детектиране при 228 nm. Времена на задържане: S антипод =

7.4 min, R = 9.7 min.

ПРИМЕР 10 (8)-2-Ьбутилкарбоксамид-4-1бутоксикарбонил-пиперазин 4 от сол 11

Н .2( + )-CSA | (Вос)₂О _г ^N^OONHt-Bu

Н

SL

IV CONHt-Bu Н

Материали:
(в)-2-1бутилкарбоксамид-пиперазин	5.54 kg (8.53 mola)
бис (S)-( + )-CSA сол 11, 95% ее
ди-1бутилдикарбонат	1.86 kg (8.53 mola)
Et₃N	5.95 I (42.6 mola)
етанол 200	55 I
етилацетат	2 I

- 64 Към сол на (S)-CSA 11 в 100-литрова 3-гърлена колба, снабдена с допълнителна фуния, под азот, се прибавят последователно етанол и триетиламин при температура 25°С. Твърдото вещество се разтваря лесно при добавяне на Et₃N. Вос₂О

се разтваря в етилацетат и се зарежда през допълнителната фуния. Прибавя се разтвор на Вос₂О в етилацетат с такава скорост, че температурата да се поддържа под 25 °C. Добавянето продължава 3 часа. Реакционната смес се оставя да престои 1 час след като приключи добавянето на разтвора на Вос₂О.

Реакцията се следи чрез ВЕТХ: 25 cm Dupont Zorbax RXC8 колона с 1 ml/min поток и детектиране при 228 nm, изократна хроматография (50/50) CH₃CN/0.1M КН₂РО₄, рН = 6.8 с NaOH. Време на задържане за 4 = 7.2 min. Хиралният анализ се осъ ществява, като се използва същата система, както в горния етап. Реакцията може да се следи и чрез тънкослойна хроматография със 100% етилацетат като разтворител (R_f=0.7).

Разтворът се концентрира до приблизително 10 I при вътрешна температура под 20°С в концентратор с периодично действие при вакуум 10 mbar. Пресичането на разтворителя завършва чрез бавно изливане в 20 I етилацетат и повторно концентриране до приблизително 10 I. Реакционната смес се промива в екстрактор с 60 I етилацетат. Органичната фаза се промива с 16 I 5%-ен воден разтвор на натриев карбонат, 2x10 I дейонизирана вода и 2 х 6 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Събраните промивни води се екстрахират отново с 20 I етилацетат и органичната фаза се промива с 2 х 3 I вода и 2 х 4 I наситен воден разтвор на натриев хлорид. Събраните етилацетатни екстракти се концентрират при 10 mbar вакуум, като вътрешната температура се поддържа под 20°С в 100-литров

- 65 концентратор с периодично действие приблизително до 8 I.

Пресичане на разтворителя с циклохексан се постига чрез бавно изливане в приблизително 20 I циклохексан и повторно канцентриране до приблизително 8 I. Към утайката се прибавят

I циклохексан и 280 ml етилацетат и сместа се загрява до температура на кипене, когато всичко преминава в разтвор. Раз-творът се охлажда и се прибавят зародишни кристали (10 д) при температура 58°С. Суспензията се охлажда до 22°С за 4

часа и продуктът се изолира чрез филтруване, след като престои 1 час при 22°С. филтърната утайка се промива с 1.8 I циклохексан и се суши във вакуумна пещ при температура 35°С, при продухване с азот, при което се получават 1.87 kg (77%, >99.9% площ чрез ВЕТХ, R-изомерът е под откриваемото количество) от съединение 4, във вид на бледо-червеникавокафяв прах.

[ ос] D²⁵ = 22.0° (с = 0.20, МеОН), т.т. 107°С;

¹³С ЯМР (75 MHz, CDCI₃, ppm) 170.1, 154.5, 79.8, 58.7, 50.6,46.6, 43.6, 43.4, 28.6, 28.3.

Доколкото горното описание разкрива принципите на изобретението, а примерите имат за цел само илюстриране, то разбираемо е, че обхватът на изобретението включва всички обичайни вариации, адаптации или модификации, в съответ ствие със следващите претенции и техните еквиваленти.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Съединение с формула:

(I) или негови фармацевтично приемливи соли, като във формула (I):

е стабилен 8- до 10-членен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като този хетероцикъл се състои от въглеродни атоми и от 1 до 3 хетероатома, избрани от N, S или О и може да бъде незаместен или заместен с ОН, халоген, С^алкил, оксо; при условие, че не означава
2. Съединение, съгласно претенция 1, в което е стабилен 8- до 10-членен двупръстенен хетероцикъл, в който всеки пръстен може да бъде наситен или ненаситен, като хетероцикълът се състои от въг леродни атоми и 2 хетероатома, избрани от N или О, и двата хетероатома се намират в различни пръс• тени, или негова фармацевтично приемлива сол.
3. Съединение, съгласно претенция 1, в което: и X е 0 или S, или негова фармацевтично приемлива сол.
4. Съединение, съгласно претенция 1, в което или негова фармацевтично приемлива сол.
5. Съединение, съгласно претенция 1, с формула което представлява М-(2(П)-хидрокси-1(8)-инданил)-2(П)-фенилметил-4(8)-хидрокси-5-(1-(4-(3-фуро[2,3-Ь]пиридилметил)-2(8)1\Г-(Ьбутилкарбоксамидо)-пиперазинил))пентанамид, или негова фармацевтично приемлива сол.
6. фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, заедно с фармацевтично приемлив носител.
7. Използване на фармацевтичен състав, съгласно която и да е претенция от 1 до 5, за лечение на СПИН, за предпазване от или за лечение на инфекция, причинена от HIV, или за инхибиране на HIV протеаза.
8. Метод за лечение на СПИН, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага еф- 69 - ективно количество от съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
9. Метод за предпазване от инфекция, причинена от HIV, характеризиращ се с това, че на бозайник, застрашен от такава инфекция, се прилага ефективно количество от съединение , съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
10. Метод за лечение на инфекция, причинена от HIV, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага ефективно количество от съединение, >© съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
11. Метод за инхибиране на HIV протеаза, характеризиращ се с това, че на бозайник, нуждаещ се от такова лечение, се прилага ефективно количество от съединение, съгласно която и да е претенция от 1 до 5.
12. Комбинация от съединения, съдържаща съединение, съгласно претенция 5 и ненуклеозиден аналог на инхибитор на HIV обратна транскриптаза, избран от съединение В, съединение С и невирапин и по желание, някой от AZT или ddl, или ddC.

® 13. Комбинация от съединения, съдържаща съединение, съгласно претенция 5 и някой от AZT или ddi, или ddC.

или негова фармацевтично приемлива сол.

- 70 15. Съединение или негова фармацевтично приемлива сол.