BG106735A - Пептиди за лечение на еректилна дисфункция - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до малки пептиди, причиняващи ерекция на мъжки животни, когато се инжектират в паравентрикуларното ядро на хипоталамуса или когато се прилагат постоянно интравенозно или подкожно. Пептидите са полезни за лечение на еректилна дисфункция.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до пептиди, които могат да се прилагат за лечение на еректилна дисфункция в мъжки животни.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Етиологията на еректилната дисфункция (ED) или импотентност е комплексна и обикновено тя се разделя на първична или по-често на вторична дисфункция.

Основната причина за ED е васкуларна, но други често спещани причини включват хормонални нарушения, използване на лекарствени препарати и неврологични нарушения.

Леченията на ED могат да се класифицират като централно или периферно стимулирани, централно или периферно регулирани и други. За подробен преглед по този въпрос с дискусия за ролята на невротрансмитери и невропептиди, виж A. Argiolas и М. R. Melis, Progress in Neurobiology, 47, 235-255 (1995). За класификация на леченията, виж J. Р. W. Heaton et al., Int. J. Impotence Research 9, 115-121 (1997).

Сред невропептидите, които действат централно, за да индуцират ерекция, най-известните са ACTH/MSH пептиди и окситоцин. Тези централно действащи активни пептиди обаче, • iu-л.

·· ·· «· ··♦· ·· ·· • · ♦ · · · · · · · · • · *···· ·· · • · · · ···· ·*4· ··♦· ·· ··· ·· ···· не са специфични в своето действие и не могат да се използват в терапията, поради техните важни странични ефекти.

Известни са непептидни продукти, които могат да се използват за лечение на ED. Сред тях, алпростадил (PGE]) се използва локално, а апоморфин и силденафил се прилагат под езика или орално. Всички известни средства обаче имат някои важни недостатъци, например като свойствата да предизвикват повръщане (апоморфин) и кардиоваскуларни странични ефекти (силденафил).

Съвсем ясно е, че е необходимо лечение, което да е колкото е възможна по-специфично, да причинява минимални странични ефекти и да е лесно за прилагане.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася до изненадващото откритие, че малки пептиди, които не спадат към които и да са от преди това известните класове пептиди, въздействащи върху ерекциите, могат да причинят ерекции в мъжки животни, когато се инжектират в паравентрикуларното ядро на хипоталамуса или когато се дават системно (интравенозно или подкожно) на такива животни.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ

В това описание са използвани следните съкращения: D е декстро енантиомер, Aib е α-Аминоизобутирил, ТХМ е транексамил (т.е. 4-(аминометил) циклохексанкарбонил), INIP е изонипекотинил, GAB е γ-аминобутирил, IMA е имидазолилацетил, Мгр е 2-метил-Тгр, β-Nal е р-(2-нафтил) ·· 4444 ····

4 4 4 4 4 44444

4 44444 444

4444 44444

4 444444

4444 4444 44 444 444444 аланин, Тгр е триптофан, Phe е фенилаланин, Lys е лизин, Arg е алгинин, Н е водород и NH₂ е краен амид.

Пептидите, които са полезни в настоящото изобретение включват тези, които имат обща формула:

x-a-b-c-y-nh₂ в която:

X е Aib, ТХМ, INIP, GAB, Н или IMA;

А е D-Mrp, D-pNal, или D-Trp;

В е D-Mrp, D-PNal, D-Trp или не е представен;

С е D-Mrp, Phe, или не е представен;

Y е Lys или Arg;

в която:

нула означава, че В и/или С отсъства.

Предпочитани пептиди от настоящото изобретение включват:

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Lys-NH₂; GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂; и GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂.

Ако е необходимо могат да се използват каквито и да са фармацевтично приемливи соли на пептидите от настоящото изобретение. Такива соли включват, но не се ограничават до органични или неорганични присъединителни соли, например такива като хидрохлоридни, хидробромидни, фосфатни, сулфатни, ацетатни, сукцинатни, аскорбатни, тартаратни,

HMD· ·· ·· ·· ···· ·· ··

пюконатни, бензоатни, малатни, фумаратни, стеаратни и памоатни соли.

По-горните пептиди могат да бъдат получени съгласно обичайните методи на пептидната химия, чрез твърдо-фазов синтез, като се използват Fmoc-аминокиселини (Fmoc е флуоренилметокси карбонил), както е описано от Atherton и Sheppard “Solid Phase Peptide Synthesis”(IRL Press at Oxford University Press, 1989), или в J. Jones “The Chemical Synthesis of Peptides” (Clarendon Press, Oxford, 1994).

Твърдо-фазовият синтез започва от С-края на пептида. Подходящ изходен материал може да се приготви например чрез прикрепване на нужната защитена алфа аминокиселина към хлорометилирана смола, хидроксиметилирана смола, бензхидриламинова смола (ВНА), или към параметилбензхидриламинова смола (р-Ме-ВНА). Като пример, една такава е хлорметилираната смола BIOBEADS® SX 1, която може да се достави от BioRad Laboratories, Richmond, California. Приготвянето на хидроксилметиловата смола е описано от Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997 (1966). Смолата ВНА е описана от Pietta и Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) и e налична в търговската мрежа от Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California.

След първоначалното прикрепване, защитната група на алфа аминокиселината може да се отстрани чрез различни кисели реагенти, включващи трифлуорооцетна киселина (TFA) или солна киселина (HCL), разтворени в органични разтворители на стайна температура. След отстраняването на защитната група на алфа аминокиселината, останалите защитени аминокиселини могат да се свързват последователно една след друга в желания ред. Всяка защитена аминокиселина

• · · · · · к · · ·· • · » · Λ · ··· • ♦ » · w « · · ·· • · · · ♦ · ·· ········ ·· ··· ·· ·«·· обикновено може да взаимодейства в излишък от около три пъти, като се използва подходяща карбоксил активираща група, като дициклохексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC), разтворени например в метилен хлорид (СН2С12), диметилформамид (DMF) или техни смеси. След като завърши подреждането на желаната аминокиселинна секвенция, нужният пептид може да се откъсне от подложката смола чрез третиране с реагент като флуороводород (HF), който не само къса пептида от смолата, но също така и защитните групи от страничните вериги. Когато се използва хлорометилирана смола или хидроксиметилирана смола, третирането с HF води до образуването на киселия край на пептида в свободна форма. Когато се използват ВНА или р-Ме-ВНА смола, третирането с HF води директно до образуване на амидния край на пептида в свободна форма.

По-горните пептиди могат да се прилагат системно, под езика, в устната кухина, орално, интраназално, интрапулмонарно или интраокуларно, при дози между 0.02 и 2 mg/kg на тегло, подходящо формулирани с фармацевтично приемливи ексципиенти или под формата на водни разтвори, или като твърди прахове в микронизирана форма. На специалистите в областта са известни и други дозирани форми, въпреки че те не са специално изброени и са в обхвата на настоящото изобретение.

Лекарствените препарати полезни за лечение на еректилна дусфункция или за индуциране на ерекция в мъжки животни, включително и човек, могат да включват пептид от настоящото изобретение или фармацевтично приемлива негова сол, или комбинации от пептиди от настоящото изобретение, или фармацевтично приемливи техни соли, по избор в смес с itt ·· ·· ·♦ ·«·· ·*- ·· • · · · · ^.· · · · · • · · 4Κ ·· · · · • ♦ ♦ · · · · · · · ·· ······ ···*···· ·· ··· ·· ···* носител, ексципиент, помощно средство, разредител, матрикс или с покрития забавящи освобождаването. Примери за такива носители, ексципиенти, помощни средства и разредители могат да се намерят в Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Следващите примери са представени само, за да илюстрират предпочитани варианти от настоящото изобретение и нямат за цел да ограничават широтата и обхвата на изобретението, както е ясно за специалистите в областта.

Следните примери илюстрират активността на четири пептида, които са характерни за някои предпочитани варианти от изобретението:

(1) GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Lys-NH₂ (2) GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂ (3) GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂ (4) GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂

Преди да се приготвят за подходящия биологичен тест, синтезираните пептиди се пречистват до чистота от > 95 % чрез кзлонна хроматография.

Методи за анализ:

Методът описан от М. R. Melis et al., European Journal of Pharmacology, 328, 115-123 (1997) беше адаптиран фактически по следния начин:

·· ·· *· ··♦· ·- ·· • · · · · · · · · · · • · ····· ·· · • · · · · · · ·

Животни:

Във всички експерименти са използвани мъжки Sprague Dawley плъхове (200-220 g) (Charles River, Como, Italy). Животните се затварят в клетки в групи от 4-6, при 24° С, 60 % влажност, като светлината е от 07:00 до 19:00 h, с достъп до вода и стандартна лабораторна храна по желание ad libitum. Експериментите се провеждат между 09:00 и 13:00 h.

Фармацевтични съединения:

[d(CH₂)5 Туг(Ме) От ] вазотоцин и (d-kohotokchh-GVIA са доставени от Peninsula Eur. Ltd. (St. Helen, Merseyside, UK), №-нитро-1-аргинин метил естер и дизолципин (МК-801) от Sigma (S. Louis, МО, USA), цис-флупентиксол-HCl от RBI (Natick, МА, USA) и морфин-HCl от SALARS (Como, Italy).

Микроинжекции в латералните вентрикули (i, с. у.) и в паравентрикуларното ядро на хипоталамуса (PVN)

Водещи канюли от неръждаема стомана (22 размер, 0.71 mm) поставени унилатерално за PVN, се имплантират стереотаксично (David Kopf Instruments, USA), под анестезия от хлорал хидрат два дена преди експериментите (координати: 0.2 mm пред теменната кост, 0.4 латерално от средната линия и 2.0 mm вентрално от външната обвивка на мозъка). Всеки плъх се използва само веднъж. Същата водеща канюла се използва за i.

с. v. и PVN инжекции.

За i. с. v. инжекциите, всички субстанции се инжектират в обем от 10 μΐ солеви разтвор за 1 минута, чрез вътрешна канюла (28 размер), която продължава 1 mm под върха на водещата канюла и е свързана чрез полиетиленова тръбичка с 10 μΐ

спринцовка Hamilton, управлявана чрез микрометрично бутало. Контролите получават 10 μΐ солеви разтвор. След инжекцията, върхът на канюлата остава в инжектираното място за 30 секунди, за да може инжектираният разтвор да се разнесе добре.

За PVN инжекциите, всички субстанции се инжектират в обем от 0.3 μΐ солеви разтвор за 2 минути, чрез вътрешна канюла, която продължава 5.3 mm под върха на водещата канюла и е свързана чрез полиетиленова тръбичка с 10 μΐ спринцовка Hamilton, управлявана чрез Stoelting микроинфузионна помпа. Контролите получават 0.3 μΐ солеви разтвор в PVN. След микроинжекцията, върхът на канюлата остава в инжектираното място за 30 секунди, за да може инжектираният разтвор да се разнесе добре.

Изследвания на поведението:

Когато се направи дозо-зависима крива, всеки пептид или солеви разтвор се микроинжектират за период от две минути в PVN на плъхове, имплантирани с постоянни водещи канюли. Солевият разтвор, ω-конотоксин, морфин, [d (СН₂)₅ Туг (Ме)² От⁸]- вазотоцин, L-NAME МК-801 или цис-флупентиксол се инжектират за период от две минути, 10 или 15 минути преди солевия разтвор, в PVN на плъхове, имплантирани с постоянни водещи канюли. L-NAME се инжектира i. с. v. за период от 1 минута, 10 или 15 минути преди солевия разтвор или пептида за анализ.

Накратко, след третирането, животните се поставят поотделно в клетки Plexiglas (30 х 30 х 30 cm) и се наблюдават 60 минути, през което време се отчитан епизодите на ерекция, от наблюдател който не е запознат с третирането, за да се елиминират субективните оценки.

ЙЙЙМ

·· ·< • 4

• Хи сто л оги я:

В края на експериментите, животните се убиват чрез декапитация, мозъците се изваждат веднага и се съхраняват в 2 % воден формалдехид, за 10-12 дена. За да се локализира инжектираното място, като се използва замразяващ микротом, се правят 50 pm напречни срезчета от мозък, които се оцветяват с Neutral red и се изследват под фазово-контрастен микроскоп. Инжектираното място се локализира като се проследява пътя на вътрешната канюла през серийните срези от мозъчна тъкан. Само тези животни, в които върхът на вътрешната канюла е разположен коректно i. с. v. или в PVN, са включени в статистическата оценка на резултатите.

Статистики;

Статистическата оценка на резултатите се прави чрез еднопосочен вариантен анализ (ANOVA) за повторените измервания, последван от тест на Duncan’s с многократен обхват, за сравняване на разликите между многото групи. Използван е Student’s t-тест, за да се сравнят разликите между две групи. За значителна стойност се счита р < 0.025.

Пример 1

Ефект върху спонтанните ерекции при инжектиране на инстантните пептиди в PVN

Намерено е, че в мъжките плъхове и четирите анализирани пептида, инжектирани в PVN, са способни в зависимост от дозата да повишат броя на случаите със спонтанна ерекция. Минималната ефективна доза е от 20 до 50 ng, която увеличава отговора в повече от 70 % от третираните

.. - 10-

• 9 9 9 9 9 · животни. Намерен е максимален ефект при 2 до 5 pg, който индуцира отговор при повече от 90 % от животните. След активна доза, отговорът започва 5-8 минути след третирането и продължава 50-60 минути. Всеки период на ерекция продължава от 0.5-2 минути и е свързан с или е последван от генитално изчистване. По-горните дози увеличават също така броя на периодите със спонтанно отпускане, въпреки че този ефект не е така забележим, като този с ерекцията и не беше намерен ясно изразен дозо-зависим ефект.

Пример 2

Ефект на [diCHik Туг (Ме)² - Огп⁸] - вазотоцин върху ерекцията, индуцирана от инстантни пептиди [d(CH₂)5 Туг (Ме) - От ] - вазотоцин, един окситоцин рецепторен антагонист, (0.1, 0.5 и 1 pg) инжектиран i. с. v. 10 минути преди инстантните пептиди, редуцира по дозо-зависим начин, увеличаването на броя на периодите с ерекция, индуцирани чрез инжектиране на 2 pg от инстантните пептиди в PVN. За разлика от това, окситоциновият рецепторен антагонист (0.1, 0.5 и 1 pg) не е ефективен когато се инжектира в PVN 10 минути преди инстантните пептиди.

Пример 3

Ефект на L - NAME върху ерекцията, индуцирана от инстантни пептиди

L - NAME, един инхибитор на N0 синтазата, (10-20 pg), инжектиран в PVN 10 минути преди инстантните пептиди, редуцира по дозо-зависим начин ерекцията, индуцирана чрез инжектиране на 2 pg от пептидите за анализ в PVN. Подобна реакция се наблюдава, когато L - NAME се инжектира i. с. у., при дози от 75 и 150 pg, 10 минути преди инжектиране на 2 pg от пептидите за анализ в PVN.

Пример 4

Ефект на o-kohotkchh-GVIA върху ерекцията, индуцирана от анализирания пептид

I

N-тип Са каналният блокатор co-kohotkchh-GVIA (2 и 5 pg), инжектиран в PVN 10 минути преди инжектирането на 2 pg от пептидите за анализ в PVN, редуцира ерекцията.

Пример 5

Ефект на морфин върху ерекцията, индуцирана от анализираните пептиди

Опиатът морфин (1, 5 и 10 pg), инжектиран в PVN 15 минути преди пептидите за анализ, редуцира по дозо-зависим начин ерекцията, индуцирана чрез инжектиране на 2 pg от

анализираните пептиди в PVN.

Пример 6

Ефект на МК - 801 или на цис-флупентиксол върху ерекцията, индуцирана от анализираните пептиди

NMDA възбуждащия аминокиселинен рецепторен антагонист МК 801 (1 pg), или допаминовият рецепторен антагонист цис-флупентиксол (10 pg), инжектирани в PVN 15 минути преди пептидите за анализ, не модифицират ерекцията.

·· ·· ···· • · · · · 4 9 • · Л · ··« • · · · · · · • · · · · ···» ···· ·· ·*·

Пример 7

Системно прилагане

Ерекция се наблюдава във всички животни, в които са инжектирани инстантните пептиди (50 pg/50 μΐ) подкожно или във вратната вена.

• <

• · · ··· ·

Claims (14)

1. Метод водещ до ерекция в мъжко животно, характеризиращ се с това, че включва прилагане към споменатото животно на пептид със следната формула:

X-A-B-C-Y-NH₂ в която:

X е α-Аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил) циклохексанкарбонил), изонипекотинил, γ-аминобутирил, водород или имидазолилацетил;

А е D-2-метил-триптофан, О-Р-(2-нафтил) аланин, или Dтриптофан;

В е D-2-метил-триптофан, О-Р~(2-нафтил) аланин, Dтриптофан или отсъства;

С е D-2-метил-триптофан, фенилаланин или отсъства;

Y е лизин или аргинин;

където D означава декстро изомер;

или фармацевтично приемлива присъединителна сол на пептида, в количество ефективно, за да предизвика споменатата еоекция.

2. Методът съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага интраназално, интрапулмонарно или интраокуларно.

3. Методът съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага в устната кухина, под езика или орално.

4. Методът съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът е;

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

или фармацевтично приемлива негова сол.

5. Методът съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага в доза между 0.2 и 2 mg/kg тегло от животното.

6. Методът за лечение на еректилна дисфункция в мъжко животно, характеризиращ се с това, че включва прилагане към споменатото животно на пептид със следната формула:

X-A-B-C-Y-NH₂ където

X е α-Аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил) циклохексанкарбонил), изонипекотинил, γ-аминобутирил, водород или имидазолилацетил;

А е D-2-метил-триптофан, О-р-(2-нафтил) аланин, или Dтриптофан;

В е D-2-метил-триптофан, О-Р-(2-нафтил) аланин, Dтриптофан или отсъства;

С е D-2-метил-триптофан, фенилаланин или отсъства;

Y е лизин или аргинин;

където D означава декстро изомер;

или фармацевтично приемлива присъединителна сол на пептида, в количество ефективно, за да предизвика споменатата ерекция.

7. Методът съгласно Претенция 6, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага интраназално, интрапулмонарно или интраокуларно.

8. Методът съгласно Претенция 6, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага в устната кухина, под езика или орално.

9. Методът съгласно Претенция 6, характеризиращ се с това, че пептидът е;

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

или фармацевтично приемлива негова сол.

10. Методът съгласно Претенция 6, характеризиращ се с това, че пептидът се прилага в доза между 0.2 и 2 mg/kg тегло от животното.

11. Пептид с формула:

Х-А-В където

X е α-Аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил) циклохексанкарбонил), изонипекотинил, γ-аминобутирил, водород или имидазолилацетил;

А е D-2-метил-триптофан, О-Р-(2-нафтил) аланин, или Dтриптофан;

В е D-2-метил-триптофан, О-Р-(2-нафтил) аланин, Dтриптофан или не присъства;

* ·· ·· 14 • ···· • · · · · ·· • · · ···· • · · · ·· · • · · ·· ···· ···· ·· ··· ·· ····

С е D-2-метил-триптофан, фенилаланин или не присъства;

Y е лизин или аргинин, с първо условие, че Y не е лизин, когато X е Н, α-аминоизобутирйл или γ-аминобутирил и когато А е D-2-метил-триптофан и когато В е D-2-метил-триптофан и когато С е фенилаланин и при второ условие, че Y не е лизин, когато X е транексамил (т.е. 4-(аминометил) циклохексан карбонил), изонипекотинил, γ-аминобутирил, или имидазолилацетил, и когато А е D-2-метил-триптофан, и когато В е D-триптофан или О-р-(2-нафтил) аланин, и когато С е фенилаланин;

където D означава декстро изомер;

и фармацевтично приемливи присъединителни соли на пептида.

12. Пептидът съгласно Претенция 11, притежаващ формула:

GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

и фармацевтично приемливи негови соли.

13. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва пептидът съгласно Претенция 11 и фармацевтично приемлив носител.

14. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва пептидът съгласно Претенция 12 и фармацевтично приемлив носител.