CZ20021539A3 - Léčivo pro vyvolání penilní erekce a léčení erektilní dysfunkce u samce živočicha a peptid - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká léčiva pro vyvolání penilní erekce a léčení erektilní dysfunkce u samce živočicha a peptidu vhodného pro tento účel.

Dosavadní stav techniky

Etiologie erektilní dysfunkce (ED) nebo impotence je komplexní a obvykle se tato jednotka dělí na primární a častější sekundární dysfunkci.

Hlavní příčina ED je vaskulární, ale existují další příčiny, včetně hormonálních poruch, užívání léků a neurologických onemocnění.

Léčba ED může být dělena na centrální a periferní iniciátory, centrální nebo periferní tonizátory a další. Přehled léčby, s popisem úlohy neurotransmiterů a neuropeptidů, je uveden v A. Argiolas a M. R. Melis, Progress in Neurobiology, 47, 235-255 (1995). Pro klasifikaci léčby viz J.P.W. Heaton et al., Int. J. Impotence Research 9, 1 15-121(1997).

Z neuropeptidů, které účinkují centrálně za indukce erekce penisu, jsou nejlépe známy ACTH/MSH peptidy a oxytocin. Nicméně, tyto centrálně aktivní peptidy nemají specifický účinek a v důsledku nežádoucích účinků nemohou být použity terapeuticky.

Jsou známé nepeptidylové produkty vhodné pro léčbu ED. Mezi takové sloučeniny patří alprostadil (PGEi), který je • · • · • · aplikován lokálně, apomorfin a sildenafil, které jsou podávány sublinguálně nebo orálně. Všechny známé léky mají určité nevýhody, jako jsou emetické charakteristiky (apomorfin) a kardiovaskulární nežádoucí účinky (sildenafil).

Peptidy v léčbě erektilní dysfunkce jsou již známé a jsou popsány v CA-A-2 158 425 (Competitive Tech. Inc.) WO 94122460A (University Patents Inc.), US-A 5,214,030 (Stief Georg) a ve Wessels H. et al. Synthetic melanotropic peptide initiates erections in men with psychogenic erectile dysfunctions: double-blind, placebo controlled crossover study, Journal of Urology, US, Baltimore, MD, svazek 160, August 1998, str. 389393, XP 002922952 ISSN: 0022-5347. WO 97/22620 A (Deghenghi R.) popisuje peptidy obecného vzorce A-D-X-D-MrpB (s A=H, Aib, GAB, X=Mrp, BC-Lys-NH2 s B=Phe, Mrp). Odlišnost od obecného vzorce podle předkládaného vynálezu je ve stereochemickém uspořádání C-koncového Mrp ve skupině Mrp-Lys-NH2.

US-A-5,955,421 (Deghenghi R.) a US-A-5,932,545 (Deghenghi R.) popsali peptid GAB-D-2-Mrp-D-2-Mrp-D-2-Mrp-Lys-NH2 a jeho terapeutické využití.

Existuje potřeba specifické a přijatelné léčby, která by měla minimálně vedlejších účinků a která by byla snadná z hlediska aplikace.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká překvapivého ujištění, že malé peptidy, které nepatří do žádné známé třídy peptidů ovlivňujících erekci penisu u samců po injekci do paraventrikulárního jádra hypothalamu nebo po systémovém podání (intravenosním nebo podkožním).

Podrobný popis výhodných provedení

V tomto popisu jsou použity následující zkratky: D je dextro enantiomer, Aib je α-aminoisobutyryl, TXM je tranexamyl (tj. 4-(aminomethyl)cyklohexankarbonyl), INIP je isonipekotinyl, GAB je γ-aminobutyryl, IMA je imidazolylacetyl, Mrp je 2-methyl-Trp, β-Nal je β-(2-naftyl)alanin, Trp je tryptofan, Phe je fenylalanin, Lys je lysin, Arg je arginin, H je vodík a NH₂ je terminální amid.

Mezi peptidy, které jsou použitelné v předkládaném vynálezu, patří peptidy obecného vzorce:

X-A-B-C-Y-NH2 kde:

X je Aib, TXM, IMP, GAB, H nebo IMA;

A je D-Mrp, ϋ-βΝβΙ nebo D-Trp;

B je D-Mrp, ϋ-βΝβΙ, D-Trp nebo není přítomen;

C je D-Mrp, Phe nebo není přítomen;

Y je Lys nebo Arg;

kde:

nil ukazuje, že B a/nebo C není přítomen.

Mezi výhodné peptidy podle předkládaného vynálezu patří:

GAB-D-Mrp-D^Nal-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D^Nal-Phe-Arg-NH₂; a

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂.

Jakákoliv farmaceuticky přijatelná sůl peptidů podle • · · · · · · · ··· ·· · · · · · · ·· předkládaného vynálezu může být použita, pokud je to vhodné. Mezi takové soli patří například adiční soli s organickými nebo anorganickými kyselinami, jako je hydrochlorid, hydrobromid, fosforečnan, síran, acetát, jantaran, ascorbát, vinan, glukonát, benzoát, malát, fumaráte, stearát a pamoát.

Výše uvedené peptidy mohou být připraveny za použití metod obvyklých v peptidové chemii, jako je syntéza na pevné fázi za použití Fmoc-aminokyselin (Fmoc je fluorenylmethoxykarbonyl), jak je popsána v Atherton a Sheppard Solid Phase Peptide Synthesis (IRL Press at Oxford University Press,

1989), nebo v J. Jones The Chemical Synthesis of Peptidy (Clarendon Press, Oxford, 1994).

Syntéza na pevné fázi začíná na C-konci peptidu. Připraví se vhodný výchozí materiál, například navázáním chráněné alfaaminokyseliny na chlormethylovanou pryskyřici, hydroxymethylovanou pryskyřici, benzhydrylaminovou pryskyřici (BHA), nebo na para-methylbenzhydrylaminovou pryskyřici (p-MeBHA). Příkladem vhodné chlormethylované pryskyřice je

BIOBEADS® SX 1 od BioRad Laboratories, Richmond, California. Příprava hydroxymethylované pryskyřice je popsána v Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997 (1966). BHA pryskyřice je popsána v Pietta and Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) a je komerčně dostupná od Peninsula Laboratories lne., Belmont, California.

Po navázání může být chránící skupina alfa-aminokyseliny odstraněna za použití různých kyselých činidel, včetně kyseliny trifluoroctové (TFA) nebo kyseliny chlorovodíkové (HCI) rozpuštěných v organických rozpouštědlech při teplotě místnosti. Po odstranění chránící skupiny alfa-aminokyseliny mohou být postupně další aminokyseliny v požadovaném pořadí.

to ·· · · ·· · · • to

Každá chráněná aminokyselina může reagovat v přibližně trojnásobném nadbytku za použiti vhodné karboxylové aktivační skupiny, jako je dicyklohexylkarbodiimiid (DCC) nebo diisopropylkarbodiimid (DIC), rozpuštěný, například, v methylenchloridu (CH2CÍ2) , dimethylformamidu (DMF) nebo jejich směsi. Po dokončení požadované aminokyselinové sekvence může být požadovaný peptid odštěpen od pryskyřice reakcí s činidlem, jako je fluorovodík (HF), který odštěpí nejen peptid od pryskyřice, ale též chránící skupiny postranních řetězců. Když se použije chloromethylovaná pryskyřice nebo hydroxymethylovaná pryskyřice, tak vede reakce s HF ke tvorbě peptidu s terminální kyselinou ve volné formě. Když se použije BHA nebo p-Me-BHA pryskyřice, tak vede reakce s HF přímo ke tvorbě peptidu s terminálním amidem ve volné formě.

Výše uvedené peptidy mohou být podány systémově, sublinguálně, bukálne, orálně, intranasálně, intrapulmonálně nebo nitroočně v dávkách mezi 0,02 a 2 mg/kg tělesné hmotnosti s farmaceuticky přijatelnými přísadami nebo ve formě vodných roztoků nebo kapalin nebo ve formě solidního prášku v mikronizované formě. Další dávkové formy, ačkoliv nejsou specificky uvedeny, jsou známé odborníkům v oboru a spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Léčiva použitelná pro léčbu erektilní dysfunkce nebo pro indukci erekce u samců savců, včetně člověka, mohou obsahovat peptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, nebo kombinaci peptidů podle předkládaného vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, volitelně ve směsi s nosičem, přísadou, vehikulem, matricí nebo potahem zpomalujícím uvolňování. Příklady takových nosičů, přísad, vehikul a ředidel jsou uvedeny v Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, A. R. Gennaro, Ed., Mack • · • · • · · · • · · · · ···· ·· ··

Publishing Company, Easton, PA, 1990.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci výhodných provedení předkládaného vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah.

Následující příklady ilustrují aktivitu čtyř peptidů, které představují některá výhodná provedení předkládaného vynálezu:

(1) GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Lys-NH₂ (2) GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂ (3) GAB-D-Mrp-D-pNal-Phc-Arg-NH₂ (4) GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂

Před přípravou přípravku vhodného pro biologický test se syntetizované peptidy přečistí na čistotu >95# pomocí chromatografické kolony.

Postupy testu

Následujícím způsobem se upraví postup popsaný v M.R. Melis et al., European Journal of Pharmacology 328, 115-123 (1997) :

Zvířata:

Samci Sprague Dawley krys (200-220 g) (Charles River, Como, Italy) se použijí ve všech pokusech. Zvířata se chovají ve skupinách po 4-6 při teplotě 24°C, 60% vlhkosti, se světlem od 07:00 do 19:00 h, s vodou a standardní laboratorní stravou podle potřeby. Tyto pokusy se provedou mezi 09:00 a 13:00 h.

Farmaceutické sloučeniny [d (CH₂) sTyr (Me) ²0rn⁸] vasotocin a ω-conotoxin-GVIA se zakoupily od Peninsula Eur. Ltd. (St. Helen, Merseyside, UK), N^G-nitro-l-arginin-methylester a dizolcipin (MK-801) od Sigma (S. Louis, MO, USA), cis-flupentixol-HCl od RBI (Natick, MA, USA) a morfin-HCl od SALARS (Como, Italy).

Mikroinjekce do laterálních komor (i.c.v.) a do paraventrikulárnich jader hypothalamu (PVN)

Vodici kanyly z nerezové oceli (22 gauge, 0,71 mm) se stereotakticky implantovaly unilaterálně do PVN (David Kopf Instruments, USA) za anestesie hydrátem chloru dva dny před pokusem (koordináty: 0,2 mm anteriorně k bregma, 0,4 laterálně k střední čáře a 2,0 mm ventrálně k důra mater). Každá krysa byla použita pouze jednou. Stejná vodící kanyla se použila pro i.c.v. a PVN injekce.

Pro i.c.v. injekce se všechny substance injikují v objemu 10 μΐ v salinickém roztoku během jedné minuty, za použití vnitřní kanyly (28 gauge), která přesahuje 1 mm pod konec zaváděcí kanyly a je napojena pomocí polyethylenových hadiček na 10 μΐ Hamiltonovou injekční stříkačku posunovanou mikrometrickým šroubem. Kontrolám se podá 10 μΐ salinického roztoku. Po injekci se konec kanyly ponechá v místě injekce po dobu 30 sekund aby se umožnilo rozptýlení injikovaného roztoku.

Pro PVN injekce se všechny substance injikují v objemu 0,3 μΐ salinického roztoku, ve 2 minutách vnitřní kanylou, která přesahuje o 5,3 mm konec zaváděcí kanyly a je napojena pomocí polyethylenových hadiček na 10 μΐ Hamiltonovou injekční • •toto • to • toto ·« ···· ·«·* ·· · • ··· ···· • ···· ···· · ·· ··· ···· ··· toto·· ♦· ···· ·· ·· stříkačku řízenou Stoelting mikroinfusní pumpou. Kontrolám se podá 0,3 μΐ salinického roztoku do PVN. Po injekci se konec kanyly ponechá v místě injekce po dobu 30 sekund aby se umožnilo rozptýlení injikovaného roztoku.

Studie chování:

Když se tvoří dávkové křivky, tak se každý peptid nebo salinický roztok mikroinjikuje během 2-minutové periody do PVN krys s implantovanými kanylami. Salinický roztok, ω-conotoxin, morfin, [d (CH2) sTyr (Me) ²-Orn⁸]-vasotocin, L-NAME MIK 801 nebo cisflupentixol se injikují během 2-minutové periody, 10 nebo 15 minut před salinickým roztokem, do PVN krys s implantovanými kanylami. L-NAME se injikuje i.c.v. během 1 minuty, 10 nebo 15 minut před salinickým roztokem nebo testovaným peptidem.

Krátce po podání se zvířata umístí jednotlivě do Plexiglas klecí (30 x 30 x 30 cm) a pozorují se po dobu 60 minut a během této doby se zaznamenávají epizody erekcí penisu, kde tyto pozorování provádí pracovník, který nezná typ léčby, aby se eliminovalo subjektivní hodnocení.

Histologické vyšetření:

Na konci pokusů se zvířata utratí dekapitací a ihned se odeberou jejich mozky, které se uloží ve 2% vodném formaldehydu na dobu 10-12 dnů. Pro lokalizování místa injekce se 50 pm transversální řezy mozkem, připravené za použití zmrazovacího mikrotomu, barví Neutrál Red a vyšetří se na mikroskopu s fázovým kontrasetm. Místo injekce se lokalizuje podle dráhy vnitřní kanyly v sérii řezů mozkem. Pouze ta zvířata, která mají konec vnitřní kanyly umístěn správně v i.c.v. nebo v PVN, se zahrnou do statistického hodnocení.

• 44 44 4» • 44 · · 4 4 4

4 4 4 4 • 4 · 4 · 4 •4 4444

Statistické hodnoceni

Statistické hodnoceni výsledků se provede za použiti jednocestné analýzy variance (ANOVA) pro opakovaná měřeni, a potom za použiti Duncanova testu. Student t-test se použije pro porovnáni rozdílů mezi dvěma skupinami, p < 0,025 se považuje za statisticky významné.

Příklad 1: Vliv peptidů podle předkládaného vynálezu injikovaných do PVN na spontánní erekci penisu

Všechny čtyři testované peptidy injikované do PVN byly schopné zvyšovat v závislosti na dávce počet spontánních erekcí penisu u samců krys. Minimální účinná dávka byla 20 až 50 ng a tato dávka zvyšovala odpověď u léčených zvířat o více než 70%. Maximální efekt byl zjištěn pro 2 až 5 ug a tyto dávky indukovaly odpověď u více než 90% zvířat. Po aktivní dávce začaly reakce na její podání za 5-8 minut a trvaly 50-60 minut. Každá epizoda erekce penisu trvala 0,5-2 minuty a byla spojena s nebo potom následovalo přípravou genitálu. Výše uvedené dávky také zvyšovaly frekvenci spontánních epizod zívání, ačkoliv tento efekt není tak výrazný jako efekt na erekce penisu a nebyla pozorována jasná závislost na dávce.

Příklad 2: Vliv [d (CH₂) sTyr (Me) ²-Orn⁸] -vasotocinu na indukci erekce penisu peptidy podle předkládaného vynálezu [d (CH2) sTyr (Me) ²-0rn⁸]-vasotocin, antagonista oxytocinového receptoru, (0,1, 0,5 a 1 pg), injikovaný i.c.v. 10 minut před peptidy podle předkládaného vynálezu, snižuje v závislosti na dávce počet erekcí penisu indukovaných injekcí 2 pg peptidů podle předkládaného vynálezu do PVN. Naopak, antagonista * 9 44 ·· · · · · · ·

4999 »9·· 4

444 4444 • 44 44 4 4 4 4 4 4 4 · oxytocinového receptorů (0,1, 0,5 a 1 pg) byl neúčinný tehdy, když byl injikován do PVN 10 minut před peptidy podle předkládaného vynálezu.

Přiklad 3: Vliv L-NAME na erekci penisu indukovanou peptidy podle předkládaného vynálezu

L-NAME, inhibitor NO synthasy, (10-20 pg), injikovaný do PVN 10 minut před peptidy podle předkládaného vynálezu, redukuje v závislosti na dávce erekce penisu indukované injekci 2 pg testovaných peptidů do PVN. Podobná prevence byla pozorována tehdy, když byl L-NAME injikován i.c.v. v dávkách 75 a 150 pg 10 minut před injekci 2 mg testovaných peptidů do PVN.

Přiklad 4: Vliv ω-conotoxin-GVIA na erekci penisu indukovanou peptidy podle předkládaného vynálezu

N-typ blokátoru Ca²⁺ kanálu, ω-conotoxin-GVIA (2 a 5 pg), injikovaného do PVN 10 minut před injekci 2 pg testovaných peptidů do PVN, snižuje počet erekci penisu.

Přiklad 5: Vliv morfinu na erekci penisu indukovanou peptidy podle předkládaného vynálezu

Opiát morfin (1,5 a 10 ug) injikovaný do PVN 15 minut před tetovanými peptidy, redukuje v závislosti na dávce erekce penisů indukované injekci 2 pg testovaných peptidů do PVN.

Přiklad 6: Vliv MK-801 nebo cis-flupentixolu na erekci penisu indukovanou peptidy podle předkládaného vynálezu

NMDA excitační antagonista aminokyselinového receptorů MK

801 (1 pg) nebo antagonista dopaminového receptoru cisflupentixol (10 pg), injikované do PVN 15 minut před testovanými peptidy, nemodifikuje erekce penisu.

Příklad 7: Systémové podání

Erekce penisu byla pozorována u všech zvířat, kterým byly injekčně podány peptidy podle předkládaného vynálezu (50 pg/50 pl), podkožně nebo do jugulární žíly.

Claims (12)

1. Patentové nároky

   1. Použití peptidu obecného vzorce

   X-A-B-C-Y-NH₂ kde

   X je α-aminoisobutyryl, tranexamyl (t.j (aminomethyl)cyklohexankarbonyl), isonipekotinyl, aminobutyryl, vodík nebo imidazolylacetyl;

   4yA je D-2-methyl-tryptofan, D-P-(2-naftyl)alanin, nebo D-tryptofan;

   B je D-2-methyl-tryptofan, D-P-(2-naftyl)alanin, Dtryptofan nebo není přítomen;

   C je D-2-methyl-tryptofan, fenylalanin nebo není přítomen;

   Y je lysin nebo arginin;

   přičemž D znamená dextro isomer; nebo jeho farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou pro výrobu léčiva pro vyvolání penilní erekce u samce živočicha.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde léčivo je vhodné pro intranasální, intrapulmonární nebo intraokulární podávání.
3. 3. Použití podle nároku 1, kde léčivo je vhodné pro • ·· ·· · • · · • · · · • · · · · · · • · · ·· · bukální, sublinguální nebo perorální podávání.
4. 4. Použití podle nároku 1, kde peptidem je

   GAB-D-Mrp-D-PNal-Phe-Lys-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-PNal-Phe-Arg-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

   nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
5. 5. Použití podle nároku 1, kde peptid je pro podávání v dávce mezi 0,2 a 2 mg/kg tělesné hmotnosti zvířete.
6. 6. Použití peptidu obecného vzorce

   X-A-B-C-Y-NH₂ kde

   X je α-aminoisobutyryl, tranexamyl (t.j. 4(aminomethyl)cyklohexankarbonyl), isonipekotinyl, γaminobutyryl, vodík nebo imidazolylacetyl;

   A je D-2-methyl-tryptofan, D-P-(2-naftyl)alanin, nebo D-tryptofan;

   B je D-2-methyl-tryptofan, D-p-(2-naftyl)alanin, Dtryptofan nebo není přítomen;

   C je D-2-methyl-tryptofan, fenylalanin nebo není přítomen;

   Y je lysin nebo arginin;

   přičemž D znamená dextro isomer; nebo jeho farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou pro výrobu léčiva pro léčení erektilní dysfunkce u samce živočicha.
7. 7. Použití podle nároku 6, kde léčivo je vhodné pro intranasální, intrapulmonární nebo intraokulární podávání.
8. 8. Použití podle nároku 6, kde léčivo je vhodné pro bukální, sublinguální nebo perorální podávání.
9. 9. Použití podle nároku 6, kde peptidem je

   GAB-D-Mrp-D-3Nal-Phe-Lys-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂;

   GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

   nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
10. 10. Použití podle nároku 1, kde peptid je pro podávání v dávce mezi 0,2 a 2 mg/kg tělesné hmotnosti zvířete.
11. 11. Peptid vzorce

    GAB-D-Mrp-D-pNal-Phe-Arg-NH₂;

    ·· ·

    99 ► « • ·

    GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

    a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
12. 12. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje peptid podle nároku 11 a farmaceuticky přijatelný nosič.

    01-1106-02-Če