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"Conservation de matières facilement périssables."
Nous vous prions de noter que le texte de la descrix tion déposé à l'appui de la demande de brevet sous rubrique doit être rectifiée comme suit :
Page 3, ligne 20, il faut insérer "comme" après "pas"
Page 4, ligne 22, il faut insérer "l'acide asparagi- que" après "Asparagine",
Page 9, ligne 25, il faut insérer "de" après "mole",
Page 11, ligne 7, il faut lire "Il y a avantage à préparer la N-sorboyl..."au lieu de "La- préparation de la N-sorboyl..."
Nous vous prions de bien vouloir verser la présente lettre rectificative au dossier de la demande, d'en délivrer une copie aux personnes désirant obtenir une copie complète du brevet et d'en annexer une copie à la copie imprimée du brevet.
Ci-inclus, noue vous remettons le montant de Er.15.- en timbres fiscaux, en paiement de la taxe prévue pour les notifications de l'espèce,
Nous vous prions d'agréer, Messieurs, nos saluta- tiens distinguées.
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" Conservation de matières facilement périssables .-
L'importance de l'acide sorbique pour la conservation de denrées est due, comme on le sait, à ce que, d'une part, l'acide aorbique est très.nocif pour certains microorganismes alors, que, d'autre part, il est tout à fait inoffensif pour l'homme et pour les animaux supérieurs. L'acide sorbique se comporte comme un aci- de gras courant d'aliments et, dans le métabolisme, il subit les mêmes transformations que tous les autres acides gras.
L'acide eorbique exerce son influence nocive principalement sur les levures et les moisissures, c'est-à-dire qu'il a un effet antifongique ou antimycotique, à savoir l'effet d'arrêter la croissance (effet
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fongistatique) et de tuer (effet fongicide) Parfois, l'acide sor- bique nuit également aux bactéries (effet antibactérien), effet qui, cependant, n'est pas d'importance en pratique. On sait aussi que, dans des processus de fermentation provoquée par des bacté- ries, on peut utiliser l'acide sorbique comme agent de conservation ayant un effet antifongique sélectif.
Par exemple, dans la prépara- tion de la Cjbuoroute et de cornichons au sel il empêche la forma- tion indésirable de moisissures (fleure) alors qu'il n'a pas d'in- fluence sur la fermentation lactique qui, elle, est recherchée et qui est causée par des bactéries. D'une part, cet effet sélec- tif de l'acide aorbique sur des moisissures et levures entraîne certains avantages. Mais d'autre part, cet effet limite les possi- bilitéa d'emploi de l'acide sorbique.
Comme la plupart des substances alimentaires se gâtent i principalement par l'action de moisissures et de levures, on a certes besoin pour la conservation d'aliments, en premier lieu de substances fongistatiques. Mais on a également besoin de substance? ' ayant des propriétés antibactériennes prononcées, surtout pour conserver des alimente contenant des protéines animales, par exem- ple la viande ou le posisson. Egalement pour la conservation d'ali- ment. d'origine végétale, par exemple les jus de fruits ou le vin, il peut être nécessaire de combattre non seulement les moisissures et les levures, mais encore par exemple les bactéries de la fermen- tation acétique ou de la fermentation lactique.
Comme agents de conservation protégeant contre la corrup- tion due à des bactéries on a récemment opposé, entre autres, des antibiotiques qui, cependant, pour des raisons médicales, ne peu- vent pas trouver emploi dans la conservation de produits alimen- taires. Pour la conservation du poisson on utilise l'hexaméthylène- tétramine. Mais, ces dernières années, cette substance a de plus en plus été tenue à l'écart parce qu'elle libère du formsldéhyde, corps qui n'est pas sans danger du point de vue physiologique.
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On sait que certaine amides ou hydrazides d'acides monocarboxyli.- ques aliphatiques ont un effet anti-enzymatique ou antimiorobien.
C'est le cas, par l'exemple de l'anilide de l'acide aorbique et des dérives N-acyl-aminés d'acides amino-oarboxyliques aliphatiques saturés à bas poids moléculaire dans lesquels le reste acyle déri- ve d'acides gras saturés contenant 12 à 16 atomes de carboné.
Il est également connu que le phényl-hydrazide de l'acide sorbique et le N-éthyl-o-toluidide de l'acide sorbique ont un effet anti- microbien. Etant donné, cependant, que la liaison amide de ces composes se décompose facilement dans le corps humain avec forma- tion d'acide carboxylique libre et du composé azoté correspondant, les substances ci-dessus mentionnées ne sont pas dépourvues de dan- gers du point de vue physiologique et on ne peut pas recommander de les utiliser sans précaution comme agents pour conserver des aliments.
Marne celles des substances ci-dessus mentionnées dont les produits de décomposition ne nuisent pas au corps humain, par exemple les acides amino-oarboxyliques aliphatiques à bas poids moléculaires qui ont été aoylés aveo des acides gras à poids molé- culaire élevé, par exemple ceux contenant 12 à 14 atomes de carbo- @ ne, ne conviennent généralement pas, on le sait, pour la conserva- @ tion des aliments. Ces substances ont plutôt la propriété d'inhi- biter l'action des microorganismes et des fermenta dans la bouche.
Elles y empêchent, par exemple, la décomposition d'hydrates de carbone déoomposables, en particulier du sucre, et on les emploie donc comme produits pour les soins de la bouche servant à empêcher des altérations des dents.
Pour les raisons qui viennent d'être mentionnées il était très important de préparer des dérivés de l'acide sorbique ayant un effet principalement antibaotérien et possédant en même temps les propriétés physiologiques et pharmacologiques propres à l'acide aorbique et particulièrement avantageuses pour la ooneer- vation d'aliments. On n'a pas encore décrit de composée de ce
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genre.
Or, la demanderesse a trouvé qu'on peut conserver des ma- tières facilement périssables, en particulier des produits alimen- taires, et les protéger en même tempo contre l'action des bactéries en ajoutant à la matière facilement périssable un ou plusieurs composes N-sorboyl-aminé répondant 4 la formule suivante
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dans laquelle Ri représente le reste d'un acide aminocarboxylique amputé d'un groupe amino et d'un groupe oarboxylique, R2 représen--
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te un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle 4 bas poids moléculaire contenant environ 1 à 4, en particulier 1 ou 2 atomes de carbone
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et X représente l'hydrogène ou un métal.
Par reste 8orboyle on en- tend ici le reste 2,4-hexadiénoyle CH3-CHCH-CH.CH-CO-.
Comme acides aminocarboxyliques qui sont à la base des acides 1-sorboyl-aminaocrboxyliquse utilisée conformément 4 l'in- vention conviennent en particulier ceux qui se trouvent dans les protéines humaines naturelles, en premier lieu l'acide glutamique et, en outre, en particulier, des acides a-aminocarboxyliques tels
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qII8 :iIa1&I que l'a-alanine, la p-alanine, l'acide a-aminobutyrique, l'asparagine, la cystine, la dihydroxy- phénylalanine, la glutamine, la glycine, l'iaoleuoine, la leuoine,
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1lyB1ne, la méthionine, la norleuoine, l'ornithine, l'acide hy- droxyglutamique, l'hydroxyproline, la proline, la sérine, le
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tryptophane, la tyrosine et la valine. Un aoide N-alky1-N-acY1mi- né approprié est, par exemple, la saroosine.
Comme exemples d'acides N-sorboyl-N-aminooarboxy1iquea convenables on peut donc mentionner entre autres l'aoiae N-oorboyl- glutamique, la N-00rboyl-leucine, la N-aorboyl-vallne, la N-sor- boy,iso3.eua.ne, la N-sorboyl-81yoïnee la N-eorboyl-aspara8l.ne et la N-aorboyl-saroosine et les sels de ces composes, de préféts,
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pence leurs soie hydrosolubles, en particulier les sels alcalins ou alcalino-terreux, et des mélanges de ces substances.
Si dans la formule ci- dessus indiquée X représente un métal polyvalent, les valences libres de ce métal sont saturées par d'autres restes de l'acide sorboyl-aminocarboxylique ou par des groupes hydroxyliques. Comme exemples de sels aloalino-terreux on mentionnera lea glyoinates de calcium neutre et basique. Dans le cas du sel neutre, le calcium est lié à deux radicaux de N-aorboyl-glycine, et dans le cas du sel basique, le calcium est lié à un reste de N-sorboyl-glycine et à un groupe hydroxylique.
Parmi lea sels alcaline, le sel potassique acide de l'acide N-sorboyl-glutamique, entre autres, corps qui n'a pas d'influence sur la saveur de la substance conservée, s'est révélé très conve- nable.
Les acides N-sorboyl-aminocarboxyliques ou leurs mélanges sont ajoutés à la matière à conserver en quantités généralement comprises entre 0,005 et 3 %, de préférence entre 0,05 et 0,3 %, les pourcentages étant rapportés au poids du mélange total.
Les substances qui conviennent pour l'application confor- me à l'invention ont, en général, une bonne solubilité dans l'eau.
Comme on peut les ajouter à la matière à conserver sous forme de solutions aqueuses, leur application est très simple.
On peut également mélanger les substances sous forme soli- les de avec la matière à conserver ou bien on peut/mélanger en agitant avec la matière à conserver. L'hydrosolubilité des sels, en parti- culier celle des sels alcaline, est souvent encore meilleure que celle des acides carboxyliques libres.
Du point de vue du goût, les substances sont neutres, c'est-à-dire qu'aux concentrations auxquelles on les emploie elles n'influent ni sur l'arôme ni sur la saveur des aliments conservés avec elle$.
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Les matières facilement périssables qu'on peut conserver par l'addition, conforme à l'invention, d'acides N-sorboyl-amino- oarboxyliques, sont en particulier des produite alimentaires sus- ceptibles de s'altérer facilement sous l'action de bactéries, par exemple le poisson, la viande et d'autres aliments contenant des protéines animales ou végétales, les jus de fruits, le vin, la gélatine, etc... On peut également conserver, par des additifs conformée à l'invention, d'autres produits commerciaux sensibles à la décomposition bactérienne, par exemple la colle protéinique ou des matières pareilles.
Il est étalement possible d'utiliser les acides N-sorboyl- aminocarboxyliques, en mélange avec d'autres substances connues pour la conservation. Ils peuvent contenir, par exemple de l'acide sorbique libre, de l'acide benzoïque, de l'acide formique, des esters de l'acide p-hydroxybenzoique ou d'autres composes ayant un effet analogue.
Les acides N-sorboyl-aminocarboxyliques et leurs sels qui on utilise conformément à l'invention sont des composes nouveaux.
Il y a avantage à les préparer par des procèdes d'acylation connus, en faisant réagir 1 'acide aminocarboxylique, de préférence sous forme d'un de ses sels, par exemple le sel de sodium ou de triéthy- lamine, ou sous ferme d'un ester dont la composante alcoolique
1 provient de préférence d'un aloanol contenant/à 4 atomes de carbone avec le chlorure de l'acide sorbique ou d'un dérivé de l'acide sorbique ayant un effet acylant analogue, par exemple le bromure de l'acide sorbique, l'anhydride sorbique ou un anhydride mixte de l'acide sorbique et d'un autre acide carboxylique.
Il s'est révélé particulièrement avantageux d'utiliser un.anhydride de l'acide sorbique et d'un mono.-enter de l'acide carbonique dont le reste alkyle contient, de préférence, 1 à 4 atomes de carbone. En effet, si l'on effectue le procédé au moyen d'un tel anhydride on peut utiliser cet anhydride roue forme d'
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une solution obtenue par réaction de quantités équimolaires d'un sel de l'acide sorbique et d'un ester alkylique de l'acide chlore* carbonique dans un solvant inerte anhydre et il n'est pas néces- saire d'isoler ou de purifier spécialement l'anhydre.
On réunit ensuite la solution qui vient d'être mentionnée, en agitant, avec
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la solution d'un sel de l'acide a.ml.uoaarbaxy,iquewx isole de manière appropriée l'acide N-sorboyi-aminocarboxylique ainsi for- mé, par exemple par acidification avec un acide fort, et on le purifie de manière usuelle, par exemple par rearïetal7.isation.
Comme solvants inertes conviennent en particulier des t4Ydrocarbtt- res aromatiques, tels que le benzène, le toluène, le xylène ou' l'éthylbenzene, et des éthers, tels que l'éther diisopropylique, le dioxanne ou le tétrahydrofuranne, dans lesquels le sel de l'acide sorbique et l'anhydride sont bien solubles. Il vaut mieux utiliser le sel de l'acide aminocarboxylique sous forme d'une solu- tion aqueuse du sel de sodium.
Aussi bien pour préparer la solu- tion de l'anhydride que pour effectuer la réaction d'acylation il y a avantage à opérer à des températures comprises entre -10 '
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et * 104Q, de préférence entre -.5 et +500o Une autre possibilité avantageuse pour préparer des acides N-sorbayl.-.am.nooarbox3rliques consiste à faire réagir aveo le chlo- rure de l'acide sorbique les esters des acides aminooaboX111que8 selon la méthode de Schotten et Baumann, par exemple en présence d'une solution alcaline diluée, comme une'solution aqueuse d'hydro- géno-oarbonate de sodium, de carbonate de sodium ou d'hydroxyde de sodium, et à des températures comprises entre -10 et +10 C.
de préférence entre -5 et +5 0, en agitant ou en secouant, puis à
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convertir l'ester de l'acide N-eorboy.-amin ainsi obtenu par sepo- nification, par exemple avec une solution alcoolique d'hydroxyde de sodium ou potassium, et par acidification subséquente avec un acide fort, en l'acide aminooarboxylique libre.
On peut, par exemple, préparer la N-sorboyl-glyoine en
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ajoutant goutte à goutte en 30 à 60 minutes, tout en agitant, une solution de 108,5 g ( 1 mole)de chloroformiate d'éthyle dans 100 cm3 d'éther diisopropylique, à une température comprise entre -5 ,et 0 C, à une solution de 112 g (1 mole) d'acide sorbique et de 102 g ( 1 mole) de triéthylamine dans 500 cm3 d'éther diisopropy- lique, en continuant à agiter pendant une heure à la température indiquée et en ajoutant ensuite peu à peu, en agitant fortement ou en utilisant un vibrateur, une solution, refroidie par de la glace,
de 1 mole de glycine dans un équivalent de solution d'hydroxyde de sodium deux fois normale. On agite le mélange réactionnel pen- dant encore une heure à la température ci-dessus indiquée, puis pendant quatre heures sans refroidissement, le mélange s'échauf- fant alors lentement à la température ambiante. On sépare la cou- che aqueuse, on l'acidifie avec de l'acide sulfurique deux fois normal jusqu'à ce que le pH soit de 5,7 - 5,8, puis on la refroidit dans de l'eau glacée et l'on essore l'acide sorbique qui n'a pas réagietqui a précipité. On acidifie encore le filtrat jusqu'à, ce que son pH soit de 3,5, ce qui fait précipiter la N-sorboyl-glycine sous forme de cristaux.
On essore la N-sorboyl-glycine, on la sè- che et, par extraction avec du cyclohexane à chaud, on la débarasse de traces d'acide sorbique. Ensuite on recristallise le produit réactionnel dans de 1' eau à 80 C. On obtient des cristaux incolo- res ayant la forme d'aiguilles et un point de fusion de 167 C. On recueille 114 g de N-sorboyl-glycine.
Pour préparer la N-sorboyl-glycine une autre possibilité consiste par exemple à ajouter goutte à goutte à une solution de 28 g (0,2 mole) de chlorhydrate d'aminoacétate d'éthyle dans 80 g de lessive de soude caustique à 10 %, à 0 C. sous agitation, 26 g de chlorure de l'acide sorbique et 0,1 mole d'une solution saturée de carbonate de sodium, de façon que le mélange réactionnel reste faiblement acide pendant toute cette opération.
Lorsque l'addition est terminée on agite pendant encore un court moment à 0 C puis on chauffe le mélange à la température ambiante. On sépare par essora-'
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ge le N-sorboylamino-acétate d'éthyle qui a précipité, on 1..'en.
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et le recristalliee dans de l'éther d1icopropyliqua.- On 9n recueil- le 26 g ; le produit fond à 9000, Par extraction avec de l'acétate d'éthyle on peut obtenir encore 7 g de produit réactionnel à partir
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du filtrat.
Par saponification du X-sorboylamino-acétate d'éthyle avec un équivalent d'une solution alcoolique une fois normale d'hy- droxyde de sodium sous une atmosphère d'azote et par acidification du mélange de saponification on obtient la N-sorboyl-glycine en un
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rendement de 90 à 95 %, par rapport au N¯sorboylamino-aeétate d'éthy' le utilisé comme matière de départ.
On peut préparer la N-sorboyl-8arcosin. selon le premier mode opératoire décrit ci-dessus pour la N.-sQrboylgLycine, an utili- sant une solution aqueuse commerciale à 15,7 du sol de sodium de la 8arc081o.. Après avoir séparé l'acide sx.drbicue libre à un pH de 5,7 on continue l'acidification et l'on obtient la M-sorboyl4.sarco- sine d'abord sous forme d'huile qu'on reprend dans de l'acétate On lave l'extrait d'acétate d'éthyle d'éthyle./avec un peu d'eau et le concentre sous pression réduite.
Lors du refroidissement la N-sorboyl-sarcosine cristallise. On la recristallise dans un mélange d'eau et de méthanol contenant 90%
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d'eau. Le produit a un point de fusion de 124-125 G. Le rendement est de 74% par rapport à l'acide sorbique qui a réagi.
De manière analogue on peut préparer l'acide N-sorboyl-
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gluta"que. Dans ce but on introduit à froia le mélange réaction- nel obtenu à partir d'une mole d'acide sorbique, une mole de trié- thylamine et une mole chlorofomiate d'éthyle dans du toluène, dans une solution d'une mole d'acide glutamique dans 2 équivalents de lessive de soude caustique binormale, puis on agite le mélange pen- dant 5 heures supplémentaires en le laissant échauffer lentement jusqu'à la température ambiante. On sépare la couche aqueuse et on achève le traitement d'une manière analogue à celle qui vient d'être décrite pour la N-sorboyl-sarcosine. à savoir on effectue une pré- cipitation partielle et on extrait le produit réactionnel huileux ots.
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avec de l'acétate d'éthyle.
Après avoir éliminé l'acétate d'éthy- le par distillation sous pression réduite on recristallise l'acide N-sorboyl-glutamique dans de l'eau ou un autre solvant appropria Le produit a un point de fusion de 1545 C le rendement est de 70, 5% par rapport à l'acide sorbique qui a réagi.
Pour préparer le sel potassique acide de l'acide N-sorboyl- glutamique on ajoute goutte à goutte une solution de 60 g de KOH (à 85 %) dans 80cm3 d'eau, en agitant et en refroidissant extérieu- rement, à une solution d'une mole d'acide N-sorboyl-glutamique dans 800 cm3 de méthanol. Après peu de temps des cristaux commencent à se former ; on complète la cristallisation en conservant le mélange plusieurs heures à 0 C. On sépare les cristaux par essorage, on les lave avec un peu de méthanol et les sèche sous pression réduite à la température ambiante. Le rendement est de 85 %. Le produit fond à une température comprise entre 208 et 210 C avec décomposition.
On peut préparer la N-sorboyl-valine selon le premier des modes opératoires décrits ci-dessus pour la N-sorboyl-glycine, en utilisant du toluène comme solvant. Dans la couche aqueuse contenant le produit réactionnel on précipite conjointement, par acidification avec de l'acide sulfurique binormal, la N-sorboyl-valine et l'acide sorbique libre. ONessore le précipité et recristallise dans de l'al- cool éthylique à 70% : l'acide sorbique reste alors en solution.On recueille 165 g du produit qui fond à 188-189 C.
Pour préparer la N-sorboyl-isoleucine on peut par exemple ajouter goutte 131 g de d.l-isoleucine, dissoute dans un équivalent de lessive de soude caustique binormale, à une solution d'anhydride mixte formé par l'acide sorbique et le carbonate acide de monoéthyle dans du toluène, solution qui a été obtenue à partir d'une mole d'acide sorbique, une mole de triéthylamine et une raole de chloro- formiate d'éthyle. Au cours de cette addition goutte à goutte on s'arrange pour que la température ne dépasse pas +5 C. On agite en- core pendant 3 heures à une température comprise entre 15 et 20 C.
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Puis on sépare la couche aqueuse et onachevé son traitement d'une manière analogue à celle appliquée pour le traitement complémentai- re de la N-Sorboyl-sarcosine, c'est-à-dire par précipitation partiel- le ot extraction du précipité avec de l'acétate d'éthyle. Après recristallisation dans de l'éthanol, la N-sorboyl-isoleucine fond à une température comprise entre 168 et 1700C. On en obtient 154 g.
La préparation de la N-sorboyl-asparagine se fait selon le premier des modes opératoires décrits pour la N-sorboyl-glycine, en utilisant du toluène comme solvant. Après l'addition de l'aspa- ragine (1 mole) le mélange réactionnel a une réaction alcaline. On acidifie prudemment avec de l'acide chlorhydrique demi-concentré jusqu'à ce que le pH soit de 5 ;pendant cette opération l'aspara- gine qui n'a pas réagi ( 12 g) précipite. Après filtration on ajuste la solution à un pH de 3,5 en ajoutant encore de l'acide chlorhy- drique la N-sorboyl-asparagine précipite alors sous forme de cric* taux incolores qu'on essore, sèche et extrait avec du cyclohexane chaud afin d'éliminer l'acide sorbique qui n'a pas réagi. On recueil- le 172 g du produit qui fond à 192 C.
Tandis que l'acide sorbique n'a généralement qu'un faible. effet sur les bactéries, comme on l'a déjà mentionné, les composée N-sorboylés utilisés conformément à l'invention ont un effet anti- ; bactérien prononcé. Il est vrai qu'ils ont également un effet sur les moisissures et le slevures mais cet effet est inférieur à leur effet antibactérien.
Il est très surprenant qu'un composé formé par l'union de l'acide sorbique qui a un effet principalement antifon- gique et d'un acide aminocarboxylique qui n'a pas d'effet antimicro- bien ait un effet antibactérien prononcé* Des essais ont montré ¯sot qu'un acide N-sorboyl-aminocarboxylique, par exemple l'acide N-sor- boyl-glutamique, n'a pas encore d'effet sur Penicillium/glaucum ou , Candida albicans lorsqu'on l'utilise à une concentration de 10 mg par ml de milieu liquide alors que la. concentration minimum à la- @ quelle l'acide sorbique a l'effet d'inhiber la croissance de ces
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micro-organismes est de 0,05 mg/cm3.
Par ailleurs, l'acide aorbi- que se montre pratiquement inactif (concentration supérieure à 10 mg/cm3) sur Corynebacterium diphtericum alors que, vis-à-vis du même micro-organisme, la concentration inhibitrice minimum de l'acide N-sorboyl-glutamique est de 1 mg/cm3 et celle de la N-sor- boylfasparagine est de 1,25 mg/cm3. Sur Streptococcus hemolyticus l'effet de la N-sorboyl-glycine, dont la concentration inhibitrice minimum est de 2,5 mg/ml est cinq fois plus grand que celui de l'acide sorbique. La N-sorboyl-sarcosine a un effet sur Proteus vul- garis lorsqu'on l'utilise à une concentration de 1 mg/cm3 et elle est donc dix fois plus efficace dans ce cas que l'acide sorbique.
La N-sorboyl-valine a un effet sur Pseudomonas aeruginosa à une concentration de 1,5 mg/cm3 alors que l'acide sorbique n'est actif qu'alla concentration de 8 mg/cm3. La N-sorboyl-isoleucine agit sur Escherichia coli à une concentration de 2 mg/cm3, son effet étant donc trois fois plus grand que celui de l'acide sorbique, Ce com- portement est caractéristrique des acides N-sorboyl-aminocarboxyli- quea.
Ni les acides N-sorboyl-aminocarboxyliques eux-mêmes utilisés conformément à l'invention ni leurs produits de décompo- sition qui pourraient se former dans le corps (acide sorbique et acide aminocarboxylique) ne sont nuisibles pour l'organisme et on peut donc utiliser ces substances sans hésitation pour la conserva- tion de produits alimentaires.
La question de savoir si l'utilisation des acides N-sor- boyl-aminocarboxyliques et de leurs sels est permise dépend des lois relative aux produits alimentaires, en vigueur dans les diffé- rente pays.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute- fois la limiter.
EXEMPLE 1:
A une mayonnaise ayantuns faible teneur en graisse on
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ajouta 0,1 % en poids d'acide N-sorboyl-glutamique puis on garde la mayonnaise à la température ambiante. Après 3 semaines environ elle est encore mangeable, alors que sur une autre portion de la même mayonnaise qui n'a pas été additionnée de l'agent de conserva- tion on observe une fermentation lactique prononcée au bout de 10 jours déjà.
EXEMPLE 2.:
Une salade de viande dont la mayonnaise a été additionnée de 0, 1 % d'acide sorbique a subi une fermentation lactique pronon- cée après être restée pendant 10 jours environ dans une étuve bacté- riologique à 35 C. Une autre portion de la salade de viande qui a la même composition mais qui contient en outre 0,15 % de N-sorboyl- alanine est encore parfaitement mangeable après la même période de stockage.
EXEMPLE 3 !
On stabilise une salade de poisson commerciale en ajoutant à sa portion mayonnaise, 0,05 % d'acide sorbique, 0,05 d'acide benzoïque et 0,2% d@ sel de potassium de la N-sorboyl-valine. Après avoir été gardée à la température ambiante pendant 3 semaines, la salade est encore bonne tandis qu'une salade de poisson analogue qui n'a pas été additionnée d'agents de conservation s'est avariée notablement après 4 jours déjà.
EXEMPLE 4 ;
On stabilise de la colle protéinique au moyen de 0,25% d'un mélange de parties égales d'acide N-sorboyl-glutamique et de N-sorboyl-sarcosine. La colle ainsi additionnée d'agents de conser- vation se garde cinq fois plus longtemps qu'une colle analogue qui n'a pas été stabilisée.
SIMPLE 5
Une salade de viande dont la portion mayonnaise a été additionnée de 0,1 % d'acide sorbique, manifeste une fermentation lactique prononcée après avoir séjourné pendant 10 jours environ
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dan une étuve bactériologique à 35 C. Une salade de viande ana- logue mais qui contient en outre 0,15 % de N-sorboyl-glycine est encore parfaitement mangeable après la même période de stockage.
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"Preservation of easily perishable materials."
Please note that the text of the description filed in support of the patent application under heading should be corrected as follows:
Page 3, line 20, insert "as" after "step"
Page 4, line 22, insert "asparagic acid" after "Asparagine",
Page 9, line 25, insert "de" after "mole",
Page 11, line 7, it should read "It is advantageous to prepare N-sorboyl ..." instead of "The- preparation of N-sorboyl ..."
We kindly ask you to place this letter of amendment in the application file, issue a copy to persons wishing to obtain a complete copy of the patent and attach a copy to the printed copy of the patent.
Herewith, we give you the amount of Er.15.- in fiscal stamps, in payment of the tax provided for the notifications of the species,
We ask you to accept, Gentlemen, our best regards.
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"Conservation of easily perishable materials .-
The importance of sorbic acid for the preservation of foodstuffs is due, as we know, to the fact that, on the one hand, aorbic acid is very harmful to certain microorganisms while, on the other hand, it is quite harmless to man and to higher animals. Sorbic acid behaves like a common fatty acid in food, and in metabolism it undergoes the same transformations as all other fatty acids.
Eorbic acid exerts its harmful influence mainly on yeasts and molds, that is, it has antifungal or antimycotic effect, that is, the effect of stopping growth (effect
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fungistatic) and killing (fungicidal effect) Sometimes sorbic acid also harms bacteria (antibacterial effect), an effect which, however, is not important in practice. It is also known that in fermentation processes caused by bacteria, sorbic acid can be used as a preservative having a selective antifungal effect.
For example, in the preparation of Cjbuoroute and salt pickles, it prevents the undesirable formation of molds (flower) while it has no influence on lactic fermentation which, for its part, is sought after and which is caused by bacteria. On the one hand, this selective effect of aorbic acid on molds and yeasts has certain advantages. But on the other hand, this effect limits the possibilities of using sorbic acid.
Since most food substances are spoiled i mainly by the action of molds and yeasts, there is certainly a need for food preservation, in the first place of fungistatic substances. But do we also need substance? 'having pronounced antibacterial properties, especially for preserving foods containing animal proteins, for example meat or posisson. Also for preserving food. of vegetable origin, for example fruit juices or wine, it may be necessary to combat not only molds and yeasts, but also, for example, bacteria resulting from acetic fermentation or lactic fermentation.
As preservatives protecting against corruption due to bacteria, antibiotics have recently been opposed, inter alia, which, however, for medical reasons cannot be used in the preservation of food products. For the preservation of fish hexamethylene tetramine is used. But, in recent years, this substance has been sidelined more and more because it releases formsldhyde, a body which is not physiologically safe.
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It is known that certain amides or hydrazides of aliphatic monocarboxylic acids have an anti-enzymatic or antimiorobial effect.
This is the case, for the example of the anilide of aorbic acid and N-acyl-amino derivatives of low molecular weight saturated aliphatic amino-oarboxylic acids in which the acyl residue is derived from acids. saturated fat containing 12 to 16 carbon atoms.
It is also known that sorbic acid phenyl hydrazide and sorbic acid N-ethyl-o-toluidide have an anti-microbial effect. Since, however, the amide bond of these compounds is easily broken down in the human body with the formation of free carboxylic acid and the corresponding nitrogenous compound, the above-mentioned substances are not without danger from the point of view physiologically and cannot be recommended for careless use as food preservatives.
Only those of the above-mentioned substances whose decomposition products do not harm the human body, for example low molecular weight aliphatic amino-arboxylic acids which have been alkylated with high molecular weight fatty acids, for example those containing 12 to 14 carbon atoms, are generally not suitable for the preservation of foodstuffs. Rather, these substances have the property of inhibiting the action of microorganisms and fermenta in the mouth.
They prevent, for example, the decomposition of deoomposable carbohydrates, in particular sugar, and they are therefore used as oral care products to prevent damage to the teeth.
For the reasons just mentioned, it was very important to prepare sorbic acid derivatives having a mainly antibaoteric effect and having at the same time the physiological and pharmacological properties specific to aorbic acid and particularly advantageous for the ooneer- food vation. We have not yet described a compound of this
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kind.
Now, the Applicant has found that it is possible to preserve easily perishable materials, in particular food products, and protect them at the same time against the action of bacteria by adding to the easily perishable material one or more N compounds. -sorboyl-amino corresponding 4 the following formula
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in which R 1 represents the residue of an aminocarboxylic acid amputated from an amino group and an oarboxylic group, R 2 represents
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te a hydrogen atom or a low molecular weight 4 alkyl group containing about 1 to 4, in particular 1 or 2 carbon atoms
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and X represents hydrogen or a metal.
By 8orboyl residue is meant here the 2,4-hexadienoyl residue CH3-CHCH-CH.CH-CO-.
Particularly suitable amino carboxylic acids which form the basis of the 1-sorboyl-aminaocrboxylic acids used in accordance with the invention are those which are found in natural human proteins, primarily glutamic acid and, in addition, in particular. , α-aminocarboxylic acids such
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qII8: iIa1 & I that α-alanine, p-alanine, α-aminobutyric acid, asparagine, cystine, dihydroxy-phenylalanine, glutamine, glycine, iaoleuoine, leuoine,
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1lyB1ne, methionine, norleuoine, ornithine, hydroxyglutamic acid, hydroxyproline, proline, serine,
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tryptophan, tyrosine and valine. A suitable N-alky1-N-acY1minine aid is, for example, saroosine.
As examples of suitable N-sorboyl-N-aminoarboxylic acids there may therefore be mentioned, inter alia, N-oorboyl-glutamic aoiae, N-00rboyl-leucine, N-aorboyl-vallne, N-sor-boy, iso3. .eua.ne, N-sorboyl-81yoïnee, N-eorboyl-aspara8l.ne and N-aorboyl-saroosine and the salts of these compounds, of prefects,
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pence their water-soluble silks, in particular the alkaline or alkaline-earth salts, and mixtures of these substances.
If in the above formula X represents a polyvalent metal, the free valences of this metal are saturated with other residues of sorboyl-aminocarboxylic acid or with hydroxyl groups. As examples of aloalino-earth salts, mention will be made of neutral and basic calcium glyoinates. In the case of the neutral salt, calcium is linked to two radicals of N-aorboyl-glycine, and in the case of the basic salt, the calcium is linked to a residue of N-sorboyl-glycine and to a hydroxyl group.
Among the alkaline salts, the acid potassium salt of N-sorboyl-glutamic acid, among others, which has no influence on the flavor of the preserved substance, has been found to be very suitable.
The N-sorboyl-aminocarboxylic acids or their mixtures are added to the material to be preserved in amounts generally between 0.005 and 3%, preferably between 0.05 and 0.3%, the percentages being based on the weight of the total mixture.
Substances which are suitable for the application according to the invention generally have good solubility in water.
As they can be added to the material to be preserved in the form of aqueous solutions, their application is very simple.
The substances in solid form can also be mixed with the material to be preserved or the material can be mixed by stirring with the material to be preserved. The water solubility of salts, especially that of alkaline salts, is often even better than that of free carboxylic acids.
From the point of view of taste, the substances are neutral, that is to say that at the concentrations in which they are employed they do not influence either the aroma or the flavor of the food preserved with it.
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The easily perishable materials which can be preserved by the addition, in accordance with the invention, of N-sorboyl-amino-oarboxylic acids, are in particular food products which are liable to deteriorate easily under the action of bacteria, for example fish, meat and other foods containing animal or plant proteins, fruit juices, wine, gelatin, etc. It is also possible to preserve, by additives according to the invention, other commercial products susceptible to bacterial decomposition, for example protein glue or the like.
It is also possible to use the N-sorboyl-aminocarboxylic acids, in admixture with other substances known for preservation. They may contain, for example, free sorbic acid, benzoic acid, formic acid, esters of p-hydroxybenzoic acid or other compounds having a similar effect.
N-sorboyl-aminocarboxylic acids and their salts which are used in accordance with the invention are new compounds.
It is advantageous to prepare them by known acylation processes, by reacting the aminocarboxylic acid, preferably in the form of one of its salts, for example the sodium or triethylamine salt, or in a solid state. 'an ester whose alcoholic component
1 is preferably obtained from an aloanol containing / to 4 carbon atoms with the chloride of sorbic acid or from a derivative of sorbic acid having a similar acylating effect, for example sorbic acid bromide, l sorbic anhydride or a mixed anhydride of sorbic acid and another carboxylic acid.
It has been found to be particularly advantageous to use a sorbic acid anhydride and a carbonic acid mono-enter, the alkyl residue of which preferably contains 1 to 4 carbon atoms. In fact, if the process is carried out by means of such an anhydride, this anhydride wheel form can be used.
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a solution obtained by reacting equimolar quantities of a salt of sorbic acid and an alkyl ester of chlorine * carbonic acid in an anhydrous inert solvent and it is not necessary to isolate or purify especially anhydrous.
The solution which has just been mentioned is then combined, by stirring, with
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the solution of a salt of the acid a.ml.uoaarbaxy, iquewx suitably isolates the N-sorboyi-aminocarboxylic acid thus formed, for example by acidification with a strong acid, and it is purified in the usual manner , for example by rearïetal7.isation.
Suitable inert solvents in particular are aromatic carbons, such as benzene, toluene, xylene or ethylbenzene, and ethers, such as diisopropyl ether, dioxane or tetrahydrofuran, in which the sodium salt. sorbic acid and anhydride are well soluble. It is preferable to use the salt of the aminocarboxylic acid as an aqueous solution of the sodium salt.
Both for preparing the anhydride solution and for carrying out the acylation reaction, it is advantageous to operate at temperatures between -10 '
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and * 104Q, preferably between -.5 and + 500o Another advantageous possibility for preparing N-sorbayl .-. am.nooarbox3rliques acids consists in reacting with sorbic acid chloride the esters of aminooaboX111que8 acids according to the method of Schotten and Baumann, for example in the presence of a dilute alkaline solution, such as an aqueous solution of sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate or sodium hydroxide, and at temperatures between -10 and +10 C.
preferably between -5 and +5 0, stirring or shaking, then
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converting the N-eorboy.-amin acid ester thus obtained by sponification, for example with an alcoholic solution of sodium or potassium hydroxide, and by subsequent acidification with a strong acid, into the free aminooarboxylic acid .
One can, for example, prepare N-sorboyl-glyoine by
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adding dropwise over 30 to 60 minutes, while stirring, a solution of 108.5 g (1 mol) of ethyl chloroformate in 100 cm3 of diisopropyl ether, at a temperature between -5 and 0 C, to a solution of 112 g (1 mole) of sorbic acid and 102 g (1 mole) of triethylamine in 500 cm3 of diisopropyl ether, continuing to stir for one hour at the temperature indicated and then adding little bit by bit, stirring strongly or using a vibrator, a solution, cooled by ice,
of 1 mole of glycine in one equivalent of twice normal sodium hydroxide solution. The reaction mixture is stirred for a further hour at the above temperature, then for four hours without cooling, the mixture then slowly warming to room temperature. The aqueous layer is separated, acidified with twice normal sulfuric acid until the pH is 5.7 - 5.8, then cooled in ice water and the pH is removed. 'the sorbic acid which has not reacted and which has precipitated is filtered off. The filtrate is further acidified until its pH is 3.5, which precipitates the N-sorboyl-glycine in the form of crystals.
The N-sorboyl-glycine is filtered off, dried and, by extraction with hot cyclohexane, it is freed of traces of sorbic acid. The reaction product is then recrystallized from water at 80 ° C. Colorless crystals having the shape of needles and a melting point of 167 ° C. are obtained. 114 g of N-sorboyl-glycine are collected.
Another possibility to prepare N-sorboyl-glycine is, for example, to add dropwise to a solution of 28 g (0.2 mol) of ethyl aminoacetate hydrochloride in 80 g of 10% sodium hydroxide solution. , at 0 C. with stirring, 26 g of sorbic acid chloride and 0.1 mol of a saturated solution of sodium carbonate, so that the reaction mixture remains weakly acidic throughout this operation.
When the addition is complete, the mixture is stirred for a further short time at 0 ° C. and the mixture is then heated to room temperature. We separate by essora- '
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ge the N-sorboylaminoacetate of ethyl which precipitated, one 1 .. 'in.
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and recrystallized from dicopropyl ether. 26 g were collected; the product melts at 9000, By extraction with ethyl acetate a further 7 g of reaction product can be obtained from
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of the filtrate.
By saponification of ethyl X-sorboylamino-acetate with one equivalent of a once-normal alcoholic solution of sodium hydroxide under a nitrogen atmosphere and by acidification of the saponification mixture, N-sorboyl-glycine is obtained. in one
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90-95% yield, based on N Nsorboylaminoethyl ethyl ester used as starting material.
N-sorboyl-8arcosin can be prepared. according to the first procedure described above for N.-sQrboylgLycin, using a commercial 15.7 aqueous solution of the sodium sol of 8arc081o. After having separated the free sx.drbicue acid at pH of 5.7 acidification is continued and the M-sorboyl4.sarco- sine is obtained first in the form of an oil which is taken up in acetate. The ethyl acetate extract is washed. of ethyl. / with a little water and concentrated under reduced pressure.
On cooling, the N-sorboyl-sarcosine crystallizes. It is recrystallized from a mixture of water and methanol containing 90%
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of water. The product has a melting point of 124-125 G. The yield is 74% based on the sorbic acid which reacted.
Analogously, N-sorboyl- acid can be prepared.
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gluta "que. For this purpose, the reaction mixture obtained from one mole of sorbic acid, one mole of triethylamine and one mole of ethyl chlorofomate in toluene, in a solution of one mole of glutamic acid in 2 equivalents of binormal caustic soda lye, then the mixture is stirred for an additional 5 hours while allowing it to warm slowly to room temperature The aqueous layer is separated and the treatment is completed. in a manner analogous to that just described for N-sorboyl-sarcosine, i.e. partial precipitation is carried out and the oily reaction product is extracted.
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with ethyl acetate.
After having removed the ethyl acetate by distillation under reduced pressure, the N-sorboyl-glutamic acid is recrystallized from water or another suitable solvent. The product has a melting point of 1545 C the yield is 70.5% based on the sorbic acid which reacted.
To prepare the acid potassium salt of N-sorboyl-glutamic acid, a solution of 60 g of KOH (85%) in 80 cm3 of water is added dropwise, while stirring and cooling externally, to a solution. of one mole of N-sorboyl-glutamic acid in 800 cm3 of methanol. After a short time crystals start to form; crystallization is completed by keeping the mixture for several hours at 0 ° C. The crystals are separated by filtering, washed with a little methanol and dried under reduced pressure at room temperature. The yield is 85%. The product melts at a temperature between 208 and 210 C with decomposition.
N-sorboyl-valine can be prepared according to the first of the procedures described above for N-sorboyl-glycine, using toluene as a solvent. In the aqueous layer containing the reaction product are precipitated together, by acidification with binormal sulfuric acid, N-sorboyl-valine and free sorbic acid. The precipitate is filtered off and recrystallized from 70% ethyl alcohol: the sorbic acid then remains in solution. 165 g of the product are collected, which melts at 188-189 C.
To prepare N-sorboyl-isoleucine, 131 g of dl-isoleucine, dissolved in one equivalent of binormal caustic soda lye, can for example be added dropwise to a mixed anhydride solution formed by sorbic acid and hydrogen carbonate. monoethyl in toluene, a solution which was obtained from one mole of sorbic acid, one mole of triethylamine and one mole of ethyl chloroformate. During this dropwise addition, arrangements are made so that the temperature does not exceed +5 C. The mixture is stirred for another 3 hours at a temperature between 15 and 20 C.
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The aqueous layer is then separated and its treatment is completed in a manner analogous to that applied for the additional treatment of N-Sorboyl-sarcosine, that is to say by partial precipitation and extraction of the precipitate with ethyl acetate. After recrystallization from ethanol, N-sorboyl-isoleucine melts at a temperature between 168 and 1700C. 154 g are obtained.
The preparation of N-sorboyl-asparagine is carried out according to the first of the procedures described for N-sorboyl-glycine, using toluene as solvent. After addition of asparagine (1 mole) the reaction mixture has an alkaline reaction. It is carefully acidified with semi-concentrated hydrochloric acid until the pH is 5, during this operation unreacted asparagine (12 g) precipitates. After filtration, the solution is adjusted to a pH of 3.5 by adding more hydrochloric acid, the N-sorboyl-asparagine then precipitates in the form of a colorless jack which is filtered off, dried and extracted with hot cyclohexane. to remove unreacted sorbic acid. 172 g of the product are collected, which melts at 192 C.
While sorbic acid is usually only weak. effect on bacteria, as has already been mentioned, the N-sorboyl compounds used in accordance with the invention have an anti- effect; pronounced bacterial. It is true that they also have an effect on molds and yeasts, but this effect is less than their antibacterial effect.
It is very surprising that a compound formed by the union of sorbic acid which has a predominantly antifungal effect and an aminocarboxylic acid which has no antimicrobial effect has a pronounced antibacterial effect. tests have shown that an N-sorboyl-aminocarboxylic acid, for example N-sorboyl-glutamic acid, does not yet have an effect on Penicillium / glaucum or, Candida albicans when used at a concentration of 10 mg per ml of liquid medium while the. minimum concentration at which sorbic acid has the effect of inhibiting the growth of these
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microorganisms is 0.05 mg / cm3.
Moreover, aorbic acid is practically inactive (concentration greater than 10 mg / cm3) on Corynebacterium diphtericum whereas, with respect to the same microorganism, the minimum inhibitory concentration of N-sorboyl acid -glutamic acid is 1 mg / cm3 and that of N-sor-boylfasparagine is 1.25 mg / cm3. On Streptococcus hemolyticus the effect of N-sorboyl-glycine, the minimum inhibitory concentration of which is 2.5 mg / ml is five times greater than that of sorbic acid. N-sorboyl-sarcosine has an effect on Proteus vulgaris when used at a concentration of 1 mg / cm3 and is therefore ten times more effective in this case than sorbic acid.
N-sorboyl-valine has an effect on Pseudomonas aeruginosa at a concentration of 1.5 mg / cm3 while sorbic acid is only active at a concentration of 8 mg / cm3. N-sorboyl-isoleucine acts on Escherichia coli at a concentration of 2 mg / cm3, its effect therefore being three times greater than that of sorbic acid. This behavior is characteristic of N-sorboyl-aminocarboxylic acids. .
Neither the N-sorboyl-aminocarboxylic acids themselves used according to the invention nor their decomposition products which could be formed in the body (sorbic acid and aminocarboxylic acid) are harmful to the organism and therefore can be used. these substances without hesitation for the preservation of food products.
Whether the use of N-sorboyl-aminocarboxylic acids and their salts is permitted depends on the food laws in force in the different countries.
The following examples illustrate the invention without, however, limiting it.
EXAMPLE 1:
To mayonnaise with a low fat content we
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added 0.1% by weight of N-sorboyl-glutamic acid and then the mayonnaise is kept at room temperature. After about 3 weeks it is still edible, while on another portion of the same mayonnaise which has not been added the preservative, a pronounced lactic fermentation is observed after already 10 days.
EXAMPLE 2 .:
A meat salad with mayonnaise added with 0.1% sorbic acid underwent pronounced lactic fermentation after remaining for about 10 days in a bacteriological oven at 35 C. Another portion of the salad meat which has the same composition but which additionally contains 0.15% N-sorboyl-alanine is still perfectly edible after the same storage period.
EXAMPLE 3!
A commercial fish salad is stabilized by adding mayonnaise, 0.05% sorbic acid, 0.05 benzoic acid and 0.2% potassium salt of N-sorboyl-valine to its portion. After being kept at room temperature for 3 weeks, the salad is still good while a similar fish salad which has not been added with preservatives has noticeably spoiled after 4 days already.
EXAMPLE 4;
Protein glue is stabilized using 0.25% of a mixture of equal parts of N-sorboyl-glutamic acid and N-sorboyl-sarcosine. The glue thus added with preservatives keeps five times longer than a similar glue which has not been stabilized.
SIMPLE 5
A meat salad in which the mayonnaise portion has been added 0.1% sorbic acid, shows a pronounced lactic fermentation after having stayed for about 10 days
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in a bacteriological oven at 35 C. A similar meat salad but which also contains 0.15% N-sorboyl-glycine is still perfectly edible after the same storage period.