BE1025935B1 - Procédé de différenciation de cellules souches mésenchymateuses - Google Patents

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BE1025935B1 BE2018/5662A BE201805662A BE1025935B1 BE 1025935 B1 BE1025935 B1 BE 1025935B1 BE 2018/5662 A BE2018/5662 A BE 2018/5662A BE 201805662 A BE201805662 A BE 201805662A BE 1025935 B1 BE1025935 B1 BE 1025935B1
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Xuan Mai Nguyen
Isabelle Tytgat
Sandra Pietri
Sabrina Ena
Pierre-Yves Laruelle
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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM, le procédé comprenant une étape de réduction de taille de cellule, dans lequel ladite étape de réduction de taille de cellule est caractérisée par mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml. L'invention concerne en outre un procédé d'obtention de cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM) comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-I3 et au moins 0,01 Ul/ml d'héparine ou d'un dérivé ou analogue de celle-ci. L'invention concerne en outre les cellules et populations de cellules obtenues ainsi, ainsi que des produits supplémentaires comprenant celles-ci et des utilisations de celles-ci.

Description

BE2018/5662
PROCÉDÉS DE DIFFÉRENCIATION DE CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des procédés d'expansion et/ou différenciation de cellules souches mésenchymateuses (CSM), en cellules et populations de cellules dérivées de CSM, et des produits comprenant de telles cellules et populations de cellules, des procédés et des utilisations.
CONTEXTE
La greffe de cellules souches capables de subir une différenciation ostéogénique, de cellules qui sont programmées pour une différenciation ostéogénique ou de cellules ayant une capacité ostéoformatrice est une voie prometteuse pour le traitement des maladies osseuses, en particulier lorsque le traitement requiert la production de nouveaux tissus osseux.
Des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été précédemment utilisées pour traiter des troubles osseux (Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42). Cependant, bien que de telles cellules souches relativement indifférenciées puissent être transplantées, elles ne sont pas associées à une lignée ostéoblastique et, par conséquent, une proportion considérable de telles cellules souches transplantées ne peuvent finalement pas contribuer à la formation du tissu osseux souhaité. De plus, la quantité de telles cellules souches est souvent insatisfaisante.
WO 2007/093431 concerne un procédé pour l'expansion in vitro de CSM isolées, qui produit des cellules présentant un phénotype ostéoblastique. Dans ledit procédé, des CSM humaines ont été cultivées en présence de sérum ou de plasma et de facteur de croissance des fibroblastes basique (FGF-2).
WO 2009/087213 concerne un procédé d'obtention d'ostéoprogéniteurs, d'ostéoblastes ou de cellules présentant un phénotype d'ostéoblaste à partir de CSM humaines in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact desdites CSM avec du plasma ou sérum humain, FGF-2 et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β).
Il existe un besoin continu de nouvelles cellules et populations de cellules utiles en thérapie, entre autres, telles que de nouvelles cellules et populations de cellules dérivées de CSM, et des procédés de production de celles-ci.
RÉSUMÉ
Comme cela est corroboré par la section expérimentale, qui illustre certains modes de réalisation représentatifs de l'invention, les inventeurs ont réalisé que le potentiel de transplantation de cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM) peut être considérablement augmenté lorsque lesdites cellules sont obtenues par mise en contact de
CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivéEou 18/5662 analogue de celle-ci. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que la mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celleci, de préférence de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, conduit à de nouvelles populations de cellules dérivées de cellules CSM dont les cellules ont une taille de cellule normalisée, homogène et comparativement faible. De telles cellules dérivées de cellules CSM possèdent des propriétés de transplantation améliorées, telles que (i) une conformité améliorée pour administration parentérale (par exemple, intravasculaire, y compris intraveineuse), (ii) la possibilité d'administrer in vivo une concentration de cellules ajustables et élevées avec un volume limité, (iii) un profil de sécurité in vivo satisfaisant et/ou (iv) une bonne seringabilité lorsqu'elles sont administrées par voie parentérale.
De plus, les présentes cellules dérivées de CSM sont capables d'induire une formation osseuse. Outre les propriétés ostéo-inductrices, les présents inventeurs ont découvert que les présentes cellules dérivées de CSM présentent en outre une activité ostéogénique élevée. L'activité ostéogénique conduit avantageusement à l'occurrence de nodules minéralisés produits par ossification endochondrale.
Par conséquent, dans un aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM, le procédé comprenant une étape de réduction de taille, dans lequel ladite étape de réduction de taille est caractérisée par la mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Dans un autre aspect l'invention concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-ß et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-ß et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans lequel au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, dans laquelle au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60
BE2018/5662 < 25 μm) et dans laquelle au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM telle que présentement décrite.
Dans un autre aspect, l'invention concerne la population de cellules dérivées de CSM ou la composition pharmaceutique telles que présentement décrites pour utilisation en tant que médicament.
Ces aspects et modes de réalisation préférés de l'invention et d'autres sont décrits dans les sections et dans les revendications annexées. L'objet des revendications annexées est spécifiquement incorporé dans la présente spécification.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre la taille de cellule de cellules dérivées de CSM, en particulier des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM, générées avec le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2) et le facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF-P1) (A) et des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM générées avec FGF-2, TGF-P1 et l'héparine (B).
La figure 2 illustre la génération de cellules dérivées de CSM, en particulier des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM, avec différent héparinoïdes : héparine non fractionnée (HNF), daltéparine, danaparoïde et sulfate d'héparane ; utilisés à 0,1 UI/ml.
La figure 3 illustre une culture de CSM avec de l'héparine comparée à d'autres anticoagulants : EDTA et Actilyse® (altéplase, activateur tissulaire du plasminogène recombinant). Après 36 h de culture, les cellules mises en contact avec l'EDTA à 2 mg/ml et Actilyse® à 0,1 mg/ml sont en suspension, tandis que les cellules mises en contact avec de l'héparine à 1 ou 100 UI/ml croissent et sont adhérentes.
La figure 4 illustre des cellules dérivées de CSM, en particulier des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM, cultivées selon un mode de réalisation du procédé de l'invention dans lequel le plasma traité par solvant/détergent (S/D) (5 % v/v) a été remplacé par du sérum (5 % v/v).
La figure 5 illustre la minéralisation in vitro de cellules dérivées de CSM, dosée par coloration au rouge d'alizarine (ARS). Des cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-P1 et l'héparine) ont été cultivées dans des conditions ostéogéniques. Une ARS a été effectué après 21 jours (A) et 28 jours (B) de culture dans des conditions ostéogéniques pour colorer les dépôts de calcium et de phosphate (grossissement 100x).
La figure 6 illustre la coloration à l'hématoxyline et l'éosine et la coloration de la matrice extracellulaire cartilagineuse (protéoglycanes et collagène) de coupes d'agrégats de cellules. Des cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-P1 et l'héparine) sont centrifugées pour former des agrégats de cellules, et les agrégats de cellules sont cultivés pendant 21 jours dans des conditions chondrogéniques ou des conditions témoins. Le bleu de toluidine colore le protéoglycane de la matrice extracellulaire cartilagineuse et les noyaux cellulaires. La safranine orange colore le protéoglycane de la matrice extracellulaire cartilagineuse, et le rouge sirius colore le collagène.
La figure 7 illustre la coloration par l'hématoxyline et l'éosine de coupes histologiques de parenchyme pulmonaire (grossissement 200x). (A) Animal après injection de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM : parenchyme pulmonaire normal ; (B) Animal après injection de cellules ostéoformatrices A : parenchyme pulmonaire avec nombreux groupes disséminés de cellules injectées dans les capillaires alvéolaires (flèches).
La figure 8 illustre la néoformation osseuse sur une coupe coronale de voûte crânienne murine mise en évidence par des fluorochromes se liant au calcium murins et humains, 2 semaines après l'administration d'excipient seul (condition témoin), de cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM (générées avec FGF-2 et TGF-ß1) ou de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine).
La figure 9 illustre la quantification de formation osseuse (%) effectuée sur des coupes coronales de voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration d'excipient seul (condition témoin), de cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM (générées avec FGF-2 et TGF-ß1) ou de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine).
La figure 10 illustre une double immunocoloration (immunofluorescence) anti-collagène de type I humain et murin effectuée sur des coupes coronales de voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine). Figure 10a illustre une double immunocoloration (fusion) anti-collagène de type I humain et murin tandis que les figures 10b et 10c représentent une immunocoloration de collagène de type I anti-humain et anti-murin, respectivement.
La figure 11 illustre la taille de cellule de (A) CSM, (B) cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM (générées avec FGF-2 et TGF-ß1), et (C) cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine).
La figure 12 illustre la coloration histologique de coupes coronales de voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration d'excipient seul, de CSM, de cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM générées avec FGF-2 et TGF-ß1 (cellules o-f A) ou de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine (cellules o-f B). (A) des fluorochromes se liant au calcium sont séquentiellement injectés par voie intrapéritonéale (rouge d'alizarine vert de calcéine bleu de calcéine tétracycline) pour mettre en évidence la néoformation osseuse (flèches) et évaluer la dynamique de la formation osseuse ; (B) immunofluorescence (IF) de collagène de type I humain + murin ; (C) IF de collagène de type I murin; (D) IF de collagène de type I humain. La dOu^§ 18/5662 immunofluorescence de collagène de type I anti-humain et anti-murin est effectuée pour permettre la détection de collagène de type I humain et murin sécrétée par la matrice osseuse ;
(E) coloration ALP + Goldner : ALP : détection de l'activité des ostéoblastes en noir (traits et zones pleines), trichrome de Masson-Goldner : détection de l'ostéoïde (tissu osseux non minéralisé) en trait pointillé noir, os minéralisé en trait gris foncé ; (F) phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) : détection de l'activité des ostéoclastes en gris foncé/noir.
La figure 13 représente des photographies illustrant la néoformation osseuse sur des coupes coronales de voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration d'excipient seul ; de CSM ; de cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM générées avec FGF-2 et TGF-ß1 (cellules o-f A) ; ou de cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine (cellules o-f B). La néoformation osseuse est mise en évidence par fluorescence (marquée par l'intégration séquentielle de différents fluorochromes : rouge d'alizarine vert de calcéine bleu de calcéine jaune de tétracycline). Une coloration rouge, verte et bleue apparaît en gris clair et l'épaisseur de néoformation osseuse est indiquée avec des doubles flèches. La coloration jaune a été entourée par des traits pointillés.
La figure 14 représente un graphique illustrant la surface totale d'os néoformé (moyenne ± SEM, * p < 0,05) mesurée sur des coupes de voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration de CSM (gris foncé) ou de cellules ostéoformatrices B (gris clair).
La figure 15 illustre la coloration par la safranine orange de la matrice cartilagineuse (entourée par des traits pointillés) de nodules minéralisés effectuée sur des coupes sagittales de voûte crânienne murine, un jour après l'administration de cellules ostéoformatrices B (J1) et au cours du temps (J7, J14, J21) jusqu'à 28 jours (J28) après administration.
La figure 16 illustre l'effet de cellules dérivées de CSM dans un modèle de défaut de taille subcritique fémoral segmentaire. (A) représente un graphique illustrant la mesure de la taille de défaut sur des radiographies effectuées le jour de l'intervention chirurgicale/administration de produit (J0) et au cours du temps (1, 2, 3, 4, 5 semaines) jusqu'à 6 semaines (6S) après l'administration de l'excipient seul, de cellules ostéoformatrices A (cellules o-f A) ou de cellules ostéoformatrices B (cellules o-f B) ; moyenne ± SEM, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ; (B) représente des radiographies représentatives de défauts fémoraux segmentaires à J0 et 6S après l'administration de l'excipient seul ou de cellules ostéoformatrices B (cellules o-f B) ; (C) représente un graphique illustrant la mesure de volume de réparation osseuse par des analyses de microtomodensitométrie (micro-TDM) à 6S après l'administration de l'excipient seul (n = 7) et de cellules ostéoformatrices B (n = 8) ; moyenne ± SEM, * p < 0,05.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
BE2018/5662
Dans le présent contexte, les formes au singulier « un », « une », et « le/la » comprennent à la fois des références au singulier et pluriel, sauf si cela est clairement contre-indiqué dans le contexte.
Les termes « comprenant », « comprend » et « consistanten », dans le présent contexte, sont synonymes de « comportant », « comporte » ou « contenant », « contient », et sont inclusifs ou ouverts et n'excluent pas des membres, éléments ou étapes de procédé supplémentaires, non mentionnés. Les termes couvrent en outre « constitué de » et « essentiellement constitué de », qui ont des significations bien définies dans la terminologie des brevets.
La citation de plages numériques par des limites comprend tous les nombres et fractions compris dans les plages respectives ainsi que les limites mentionnées.
Les termes « environ » ou « approximativement », dans le présent contexte, en référence à une valeur mesurable telle qu'un paramètre, une quantité, une durée temporelle, et similaire, sont destinés à couvrir des variations de la valeur spécifiée et par rapport à celle-ci, telles que des variations de +/-10 % ou moins, de préférence +/-5 % ou moins, plus préférablement +/-1 % ou moins, et encore plus préférablement +/-0,1 % ou moins de la valeur spécifiée et par rapport à celle-ci, dans la mesure où de telles variations sont appropriées pour application dans la présente invention. Il doit être entendu que la valeur à laquelle le modificateur « environ » fait référence est elle-même spécifiquement et de préférence décrite.
Bien que les termes « un ou plusieurs » ou « au moins un », tels qu'un ou plusieurs membres ou au moins un membre d'un groupe de membres, soit clair en tant que tel, au moyen d'une exemplification supplémentaire, le terme couvre entre autres une référence à l'un quelconque desdits membres, ou à deux ou plus de deux quelconques desdits membres, tels que, par exemple, >3, >4, >5, >6 ou >7 quelconques, etc., desdits membres, et jusqu'à tous lesdits membres. Dans un autre exemple, « un ou plusieurs » ou « au moins un » peut désigner 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou plus.
La discussion du contexte l'invention est présentement incluse pour expliquer le contexte de l'invention. Cela ne doit pas être considéré comme une admission qu'une partie quelconque du matériau a été publiée, connue, ou fait partie de la connaissance générale commune dans un pays quelconque à la date de priorité de l'une quelconque des revendications.
Dans l'ensemble de cette description, différents publications, brevets et spécifications de brevet publiées sont référencés par une citation identifiée. Tous les documents cités dans la présente spécification sont présentement incorporés en référence dans leur intégralité. En particulier, les enseignements ou sections de ces documents spécifiquement référencés présentement sont incorporés en référence.
Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la description de l'invention, y corn pns 18/5662 les termes techniques et scientifiques, ont leur signification couramment connue de l'homme du métier auquel cette invention appartient. À titre d'indication supplémentaire, les définitions des termes sont incluses pour mieux comprendre l'enseignement de l'invention. Lorsque des termes spécifiques sont définis dans le contexte d'un aspect particulier de l'invention ou d'un mode de réalisation particulier de l'invention, une telle connotation est destinée à s'appliquer à l'ensemble de cette spécification, c'est-à-dire, également dans le contexte d'autres aspects ou modes de réalisation de l'invention, sauf indication contraire.
Dans les sections suivantes, différents aspects ou modes de réalisation de l'invention sont définis de façon plus détaillée. Chaque aspect ou mode de réalisation défini ainsi peut être combiné avec un ou plusieurs autre(s) aspect(s) ou mode(s) de réalisation, sauf indication claire du contraire. En particulier, une caractéristique indiquée comme étant préférée ou avantageuse peut être combinée avec une autre caractéristique ou d'autres caractéristiques indiquées comme étant préférées ou avantageuses.
Une référence tout au long de cette spécification à « un mode de réalisation » signifie qu'un élément, une structure ou une caractéristique particulière décrite dans le contexte du mode de réalisation est incluse dans au moins un mode de réalisation de la présente invention. Par conséquent, les occurrences d'expression « dans un mode de réalisation » à différents endroits tout au long de cette spécification ne font pas nécessairement référence au même mode de réalisation, mais cela est possible. De plus, les éléments, structures ou caractéristiques particuliers peuvent être combinés d'une façon adaptée quelconque, comme il apparaîtra à l'homme du métier de la présente description, dans un ou plusieurs modes de réalisation. De plus, bien que certains modes de réalisation présentement décrits comprennent certains, mais pas d'autres éléments inclus dans d'autre modes de réalisation, des combinaisons d'éléments de différents modes de réalisation sont destinées à être dans la porte de l'invention, et constituent des modes de réalisation différents, comme il apparaîtra à l'homme du métier. Par exemple, dans les revendications annexées, l'un quelconque des modes de réalisation revendiqués peut être utilisé dans une combinaison quelconque.
Comme cela est corroboré par la section expérimentale, qui illustre certains modes de réalisation représentatifs de l'invention, les inventeurs ont identifié un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ou d'une population de cellules dérivées de CSM ayant un potentiel de transplantation accru. Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert de manière inattendue que, lors de la mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, de préférence de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml, une nouvelle population de cellules dérivées de CSM ayant une taille normalisée, homogène et petite, peut être obtenue. Dans certains modes de réalisation, des CSM ou des cellules dérivées de CSM sont mises en contact avec une combinaison de FGF-2, de TGF-β et d'héparine ou un dérivé ou analogd®^ 18/5662 celle-ci, de préférence de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml. Une telle taille normalisée, homogène et petite représente des propriétés de transplantation améliorées telles que (i) le potentiel d'administration parentérale (par exemple, intravasculaire, y compris intraveineuse) desdites cellules dérivées de CSM, (ii) la possibilité d'administrer in vivo une concentration de cellules ajustable et élevée avec un volume limité, (iii) un profil de sécurité in vivo satisfaisant et/ou (iv) une bonne seringabilité lorsqu'elles sont administrées par voie parentérale. En conséquence, un premier aspect concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml.
Le terme « cellule souche mésenchymateuse » ou « CSM », dans le présent contexte, désigne une cellule souche dérivée de mésoderme adulte qui est capable de générer des cellules de lignées mésenchymateuses, typiquement de deux lignées mésenchymateuses ou plus, plus typiquement trois lignées mésenchymateuses ou plus, par exemple, une lignée ostéochondroblastique (os et cartilage), ostéoblastique (os), chondroblastique (cartilage), myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) et stromogénique (stroma médullaire). Des CSM peuvent être isolées à partir d'un échantillon biologique, de préférence un échantillon biologique d'un sujet humain, par exemple, la moelle osseuse, l'os trabéculaire, le sang, le cordon ombilical, le placenta, le sac vitellin fœtal, la peau (derme), spécifiquement la peau fœtale et de l'adolescent, le périoste, la pulpe dentaire, le tendon et le tissu adipeux. Le terme « échantillon biologique » ou « échantillon », dans le présent contexte, désigne un échantillon obtenu à partir d'une source biologique, par exemple, à partir d'un organisme, tel qu'un sujet animal ou humain, une culture de cellules, un échantillon de tissu, etc. Un échantillon biologique d'un sujet animal ou humain désigne un échantillon prélevé à partir d'un sujet animal ou humain et comprenant des cellules de celui-ci. L'échantillon biologique d'un sujet animal ou humain peut comprendre un ou plusieurs types de tissu et peut comprendre des cellules d'un ou plusieurs types de tissu. Des procédés d'obtention d'échantillons biologiques d'un animal ou sujet humain sont connus dans l'art, par exemple, une biopsie de tissu ou un prélèvement de sang. Des CSM humaines, leurs isolement, expansion in vitro et différenciation, ont été décrits dans, par exemple, le brevet U.S. n° 5 486 359 ; le brevet U.S. n° 5 811 094 ; le brevet U.S. n° 5 736 396 ; le brevet U.S. n° 5 837 539 ; ou le brevet U.S. n° 5 827 740. Les CSM décrites dans l'art et isolées par un procédé quelconque décrit dans l'art peuvent être adaptées dans le présent procédé. En particulier, des CSM peuvent être définies comme présentant une capacité de différenciation mésenchymateuse de trilignée in vitro en ostéoblastes, adipocytes, et chondroblastes (Dominici et al., 2006, vol. 8, 315).
Le terme « CSM » couvre en outre la descendance de CSM, par exemple, une descend§n8ê 18/5662 obtenue par prolifération (propagation/expansion) in vitro ou ex vivo de CSM obtenues à partir d'un échantillon biologique d'un sujet animal ou humain.
Le terme « cellule souche » désigne généralement une cellule non spécialisée ou relativement moins spécialisée et compétente pour la prolifération, qui est capable d'autorenouvellement, c'est-à-dire qu'elle peut proliférer sans différenciation, et qui conduit, ou dont la descendance peut conduire, à au moins un type de cellules relativement plus spécialisé. Le terme couvre des cellules souches capables d'autorenouvellement sensiblement illimité, c'est-à-dire que la descendance d'une cellule souche ou au moins une partie de celle-ci conserve sensiblement le phénotype non spécialisé ou relativement moins spécialisé, le potentiel de différenciation et la capacité de prolifération de la cellule souche mère, ainsi que des cellules souches qui présentent un autorenouvellement limité, c'est-à-dire que la capacité de la descendance d'une partie de celle-ci de prolifération et/ou différenciation ultérieure est réduite de façon démontrable par rapport à la cellule mère. À titre d'exemple et sans limitation, une cellule souche peut conduire à des descendants qui peuvent se différencier dans un ou plusieurs lignées pour produire des cellules de plus en plus relativement plus spécialisées, de tels descendants et/ou cellules de plus en plus relativement spécialisés peuvent eux-mêmes être des cellules souches telles que présentement définies, ou même produire des cellules à différenciation terminale, c'est-à-dire, des cellules totalement spécialisées, qui peuvent être post-mitotiques.
Le terme « cellule souche adulte », dans le présent contexte, désigne une cellule souche présente dans, ou obtenue à partir (par exemple, isolée à partir) d'un organisme au stade fœtal, de préférence, après la naissance (par exemple, en particulier mais sans limitation pour un organisme humain, à l'âge d'au moins un mois après la naissance, par exemple, à l'âge d'au moins 2 mois, au moins 3 mois, par exemple, au moins 4 mois, au moins 5 mois, par exemple, au moins 6 mois après la naissance, tel que, par exemple, à l'âge de 1 an ou plus, 5 ans ou plus, au moins 10 ans ou plus, 15 ans ou plus, 20 ans ou plus, ou 25 ans ou plus après la naissance), tel que, par exemple, après avoir atteint l'âge adulte. À titre d'exemple, des cellules souches adultes peuvent être obtenues à partir de sujets humains qui seraient autrement décrits par les termes conventionnels « nourrisson », « enfant », « jeune », « adolescent » ou « adulte ».
Des CSM préférables ont le potentiel pour générer des cellules d'au moins la lignée ostéochondroblastique, telles que, par exemple, des cellules de lignée ostéoblastique, telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des ostéoprogéniteurs et/ou des préostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou des ostéocytes, et/ou de lignée chondroblastique, telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des chondroprogéniteurs et/ou des préchondroblastes et/ou des chondroblastes et/ou des chondrocytes.
D'autres CSM préférables ont le potentiel pour générer des cellules d'au moins la lignée18/5662 ostéoblastique (os), telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des ostéoprogéniteurs et/ou des préostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou des ostéocytes, etc. ; ou d'au moins la lignée chondroblastique (cartilage), telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des chondroprogéniteurs et/ou des préchondroblastes et/ou des chondroblastes et/ou des chondrocytes ; de lignée fibroblastique (tissu conjonctif), telles que, par exemple, des fibroblastes, des fibrocytes ; ou d'au moins des synoviocytes (liquide synovial) ; ou des ténocytes, etc.
Sauf indication contraire, « sujet » ou « patient » sont utilisés de façon interchangeable et désignent des animaux, de préférence des vertébrés, plus préférablement des mammifères, et comprend spécifiquement des patients humains et des mammifères non humains. Des patients préférés sont des sujets humains. Des sujets animaux comprennent des formes prénatales d'animaux, telles que, par exemple, des fœtus. Des sujets humains peuvent comprendre des fœtus, mais pas des embryons.
Dans un mode de réalisation, des CSM peuvent être obtenues à partir d'un sujet sain, ce qui peut contribuer à assurer la fonctionnalité de cellules dérivées de CSM obtenues à partir desdites CSM.
Dans un autre mode de réalisation, des CSM sont obtenues à partir d'un sujet humain qui a besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM.
Dans certains modes de réalisation des produits ou des procédés tels que présentement décrits, les CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être allogéniques pour le sujet à traiter. Les termes « allogénique » ou « homologue » en référence à des CSM ou des cellules dérivées de CSM signifient que les CSM ou cellules dérivées de CSM sont obtenues à partir d'un ou plusieurs sujets (groupés) autres que le sujet devant être mis en contact ou traité avec les cellules dérivées de CSM.
Dans certains modes de réalisation des produits ou des procédés tels que présentement décrits, les CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être autologues pour le sujet à traiter. Le terme « autologue », en référence à des CSM ou des cellules dérivées de CSM, signifie que les CSM ou cellules dérivées de CSM sont obtenues à partir du même sujet devant être mis en contact ou traité avec les cellules dérivées de CSM.
Dans certains modes de réalisation des produits ou des procédés tels que présentement décrits, les CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent comprendre un mélange de CSM ou cellules dérivées de CSM autologues et allogéniques (c'est-à-dire, homologues) telles que définies ci-dessus. De préférence, les CSM ou cellules dérivées de CSM sont allogéniques pour le sujet devant être traité.
Le terme « cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses » ou « cellules dériVëêS 18/5662 de CSM », dans le présent contexte, désigne des cellules de lignée mésenchymateuse (par exemple, de lignée ostéochondroblastique (os et cartilage), ostéoblastique (os), chondroblastique (cartilage), myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) ou stromogénique (stroma médullaire)) obtenues par différenciation de CSM, en particulier obtenues par différenciation de CSM in vitro (y compris ex vivo).
La différenciation de CSM peut mettre en œuvre la culture de CSM dans des conditions pouvant induire la différenciation de CSM vers le type de cellules souhaité, plus typiquement la culture de CSM dans un milieu comprenant un ou plusieurs agents (par exemple, des facteurs de croissance) pouvant induire la différenciation de CSM en un type de cellules souhaité. Des protocoles pour la différenciation de CSM sont connus en tant que tels (voir, entre autres, WO 2007/093431 ; ainsi que REGER, R.L. et al. « Differentiation and Characterization of Human MSCs », dans : Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), édité par D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, vol. 449, p. 93-107 ; VERMURI, M.C. et al. (éd.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, vol. 698, en particulier les pages 201 à 352).
Le terme « facteur de croissance », dans le présent contexte, désigne une substance biologiquement active qui influence la prolifération, la croissance, la différenciation, la survie et/ou la migration de différents types de cellules, et peut causer des changements liés au développement, morphologiques et fonctionnels dans un organisme, seule ou lorsqu’elle est modulée par d’autres substances. Un facteur de croissance peut typiquement agir par liaison, en tant que ligand, à un récepteur (par exemple, un récepteur de surface ou intracellulaire) présent dans des cellules sensibles au facteur de croissance. Un facteur de croissance peut présentement être, en particulier, une entité protéinique comprenant une ou plusieurs chaînes polypeptidiques. À titre d’exemple et non de limitation, le terme « facteur de croissance » couvre les membres de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), la famille des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), la famille des facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF), la famille des facteurs de croissance transformants bêta (TGF-β), la famille des facteurs de croissance nerveuse (NGF), la famille des facteurs de croissance épidermique (EGF), la famille des facteurs de croissance insulinomimétiques (IGF), la famille des facteurs de différenciation de croissance (GDF), la famille des facteurs de croissance des hépatocytes (HGF), les facteurs de croissance hématopoïétiques (HeGF), le facteur de croissance des cellules endothéliales dérivé des plaquettes (PD-ECGF), l’angiopoïétine, la famille des facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), les glucocorticoïdes, et similaire. Il apparaîtra à l’homme du métier que le facteur de croissance ou la combinaison de facteurs de croissance peut être un facteur de croissance ou une combinaison de facteurs de croissance quelconque connu comme étant capable d'induire la différenciation de CSM enEun 18/5662 type de cellules souhaité. Il apparaîtra à l'homme du métier que les procédés in vitro pour induire la différenciation de CSM en un type de cellules souhaité (par exemple, en cellules de lignée ostéochondroblastique, ostéoblastique ou chondroblastique) peut conduire à une population sensiblement pure (c'est-à-dire, principalement constituée) de cellules du type de cellules souhaité. Sans limitation, une population de cellules obtenue ainsi peut contenir au moins 90 % (en nombre) du type de cellules souhaité, tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, ou 100% du type de cellules souhaité.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique (os et cartilage), ostéoblastique (os), telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des ostéoprogéniteurs et/ou des préostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou des ostéocytes, etc. ; de lignée chondroblastique (cartilage), telles que, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs et/ou des chondroprogéniteurs et/ou des préchondroblastes et/ou des chondroblastes et/ou des chondrocytes ; de lignée adipogénique (graisse) ; myogénique (muscle) ; ténogénique (ténocytes) ; de lignée fibroblastique (tissu conjonctif), telles que, par exemple, des fibroblastes, des fibrocytes ; ou de lignée synovial (liquide synovial).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique. La mention de « cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique », dans le présent contexte, peut désigner des cellules progénitrices qui ont la capacité à se différencier en cellules de lignée ostéoblastique, telles que des ostéochondroprogéniteurs, des ostéoprogéniteurs et/ou des préostéoblastes et/ou des ostéoblastes et/ou des ostéocytes, etc., ou en cellules de lignée chondroblastique, telles que des ostéochondroprogéniteurs, des chondroprogéniteurs et/ou des préchondroblastes et/ou des chondroblastes et/ou des chondrocytes. Il apparaîtra à l'homme du métier que les cellules progénitrices se différencieront en cellules de lignée ostéoblastique (par exemple, des préostéoblastes ou des ostéoblastes), ou en cellules de lignée chondroblastique (par exemple, des préchondroblastes ou des chondroblastes) suivant les conditions auxquelles elles sont exposées, telles que des facteurs physiques et/ou des composants chimiques et biologiques, tels que des facteurs de croissance.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM sont des cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique ou chondroblastique. Dans des modes de réalisation préférés, les cellules dérivées de CSM sont des cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique. Dans des modes de réalisation plus préférés, les cellules dérivées de CSM sont des ostéoprogéniteurs, des préostéoblastes, des ostéoblastes ou des ostéocytes.
Dans certains modes de realisation particulièrement préférés, les expressions « cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique » ou « cellules ostéoformatrices dérivées de CSM » peuvent désigner toutes deux des types de cellules ayant un phénotype ostéoblastique, et qui peuvent contribuer à, ou sont capables de se développer en cellules qui peuvent contribuer à, la formation de matériau osseux ou de matrice osseuse, telles que des ostéochondroprogéniteurs, des ostéoprogéniteurs, des préostéoblastes, des ostéoblastes ou des ostéocytes, ou des mélanges de ceux-ci. Dans le présent contexte, des « ostéoprogéniteurs » peuvent comprendre, en particulier, des ostéoprogéniteurs précoces et tardifs. Encore plus préférablement, des « cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique » ou des « cellules ostéoformatrices dérivées de CSM » peuvent également désigner des ostéochondroprogéniteurs, des ostéoprogéniteurs, des préostéoblastes ou des ostéoblastes, ou des mélanges de ceux-ci, encore plus préférablement, le terme peut désigner des ostéochondroprogéniteurs ou des préostéoblastes ou des ostéoblastes, ou des mélanges de ceux-ci, de sorte que, dans certains exemples, le terme peut désigner des préostéoblastes, ou dans certains autres exemples, le terme peut désigner des ostéoblastes. Tous ces termes sont connus en tant que tels.
À titre d’indication supplémentaire et sans limitation, des ostéoprogéniteurs, des préostéoblastes et des ostéoblastes, ainsi que des populations de cellules comprenant des ostéoprogéniteurs, préostéoblastes et/ou ostéoblastes peuvent présenter les caractéristiques suivantes :
a) les cellules présentent l’expression du facteur de transcription lié à Runt 2 (Runx2), un facteur de transcription multifonctionnel qui régule la différenciation des ostéoblastes et l’expression d’un grand nombre de gènes de protéine de matrice extracellulaire pendant la différenciation des ostéoblastes ;
b) les cellules présentent l’expression d’au moins l’un des suivants : phosphatase alcaline (ALP), plus spécifiquement ALP du type os-foie-rein ; et, plus préférablement, comprennent en outre l’expression d’un ou plusieurs marqueurs osseux supplémentaires tels que l’ostéocalcine (OCN, BGLAP), le propeptide amino-terminal de procollagène de type 1 (P1NP), l’ostéonectine (ON, SPARC), l’ostéopontine (OPST, SPP1, OPN) et/ou la sialoprotéine osseuse (BSP), et/ou une ou plusieurs protéines de matrice osseuse supplémentaires telles que la décorine et/ou l’ostéoprotégérine (OPG) ;
c) les cellules n’expriment sensiblement pas CD45 (par exemple, moins d’environ 10%, de préférence moins d’environ 5 %, plus préférablement moins d’environ 2 % des cellules peuvent exprimer CD45) ;
d) les cellules présentent des signes de capacité à minéraliser l’environnement externe, ou à synthétiser une matrice extracellulaire contenant du calcium (par exemple, lorsqu’elles sont
RP9Q18/5662 exposées à un milieu ostéogénique ; voir Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-3T2). L’accumulation de calcium à l'intérieur des cellules et son dépôt dans des protéines matricielles peuvent être conventionnellement mesurés, par exemple, par culture dans 45Ca2+, lavage et reculture, puis détermination de la radioactivité présente à l’intérieur de la cellule ou déposée dans la matrice extracellulaire (US 5 972 703), ou au moyen d’un dosage de minéralisation à base de rouge d’alizarine (voir, par exemple, Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84) ;
e) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignée adipocytaire (par exemple, adipocytes) ou de lignée chondroblastique (par exemple, chondroblastes, chondrocytes). L’absence de différenciation en ces lignées cellulaires peut être évaluée en utilisant des conditions d’induction de différenciation (par exemple, voir Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7), et des méthodes de dosage standard établies dans l’art (par exemple, lorsqu’ils sont induits, des adipocytes sont typiquement colorés par l’Oil Red O, indiquant une accumulation de lipides ; les chondrocytes sont typiquement colorés avec le bleu alcian ou la safranine orange). L’absence substantielle de propension à la différenciation adipogénique et/ou chondrogénique peut typiquement signifier que moins de 20 %, ou moins de 10 %, ou moins de 5 %, ou moins de 1 % des cellules testées présenteraient des signes de différenciation adipogénique ou chondrogénique lorsqu’elles sont appliquées dans l’essai respectif.
À titre d’exemple, mais sans limitation, des marqueurs de surface cellulaire adaptés pour évaluer l’identité cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent comprendre CD105, CD90, CD73, CD45 et ALP, en particulier ALP du type os-foie-rein. Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent, par exemple, être détectés par des anticorps monoclonaux commercialisés, tels que des anticorps monoclonaux marqués par un fluorochrome permettant la détection de cellules par cytométrie en flux. En particulier, CD105, CD90, et CD73 sont des marqueurs mésenchymateux, et sont typiquement fortement exprimés par des cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique ; CD45 est un marqueur hématopoïétique, et est typiquement sensiblement absent de cellules dérivées de CSM de lignée ostéoblastique ; ALP est un marqueur des préostéoblastes et des ostéoblastes, et est typiquement exprimé par une fraction substantielle des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent présenter des propriétés ostéo-inductrices.
Les termes «propriétés ostéo-inductrices », «potentiel ostéo-inducteur » ou «activité ostéoinductrice », dans le présent contexte, désigne la capacité de cellules à attirer d’autres cellules sécrétrices de matrice osseuse et/ou induire la (trans)différenciation d’autres cellules en cellules sécrétrices de matrice osseuse.
Par exemple, l'activité cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblasBqUê 18/5662 ou ostéoblastique peut être déterminée par mesure des propriétés ostéoformatrices de ces cellules. La capacité de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à induire la formation osseuse peut être mesurée in vivo, par exemple par évaluation de l'épaisseur d'os nouvellement minéralisé après l'administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne. La capacité de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à induire la formation osseuse peut également être mesurée, par exemple, par évaluation de l'activité phosphatase alcaline (ALP) par un coloration de substrat d'ALP.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent présenter des propriétés ostéogéniques.
Par exemple, l'activité cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être déterminée par mesure de l'activité ostéogénique de ces cellules. L'activité ostéogénique de cellules dérivées de CSM humaines de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être mesurée in vivo, par exemple, par détermination de la présence d'au moins un nodule minéralisé d'origine humaine après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne. L'activité ostéogénique de cellules dérivées de CSM humaines de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être mesurée in vivo, par exemple, par évaluation de l'épaisseur de nodules nouvellement minéralisés d'origine humaine après administration des cellules à des souris par injection souscutanée sur la voûte crânienne.
Par exemple, des cellules dérivées de CSM humaines de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, telles que 2,5 x 106 cellules formulées dans 100 pl d'excipient, peuvent être administrées à des souris nude par administration sous-cutanée unique sur l'os de la voûte crânienne. Afin de marquer la néoformation osseuse au cours du temps, des fluorochromes se liant au calcium tels que le rouge d'alizarine (rouge), la calcéine (verte et bleue) et la tétracycline (jaune) peuvent être administrés séquentiellement à des souris par injection intrapéritonéale 3 jours avant et 4, 8, et 12 jours après l'administration des cellules dérivées de CSM, respectivement. Les souris peuvent être euthanasiées 2 semaines après l'administration de cellules et la voûte crânienne de chaque souris peut être collectée afin d'évaluer les propriétés de formation osseuse par histomorphométrie (par exemple, quantification de formation osseuse). Les épaisseurs initiale et finale de la voûte crânienne peuvent être utilisées pour calculer le pourcentage de néoformation osseuse après l'administration des cellules. De plus, les propriétés de formation osseuse peuvent également être évaluées par immunofluorescence (par exemple, origine murine ou humaine de la formation osseuse). L'activité ostéoblastique peut être évaluée sur des coupes de voûte crânienne en utilisant le procédé de détection d'activité enzymatique d'ALP. L'activité ostéoclastique peut être évaluée sur des coupes de voûte crânienne en utilisant les procédés de détection d’activité enzymaB^Sê 18/5662 TRAP. Le statut de minéralisation de l’os néoformé peut être évalué au moyen de la coloration trichrome de Masson-Goldner sur des coupes de voûte crânienne colorées avec ALP, par exemple, en utilisant des kits commercialisés (par exemple, Bio-Optica®). La formation de cartilage peut être évaluée en utilisant la coloration à la safranine orange sur des coupes à la paraffine sagittales de voûte crânienne.
Le terme « potentiel ostéogénique », dans le présent contexte, désigne la capacité de cellules à se (trans)différencier en cellules sécrétrices de matrice osseuse ou la capacité de cellules à sécréter de la matrice osseuse (c’est-à-dire, sans nécessiter une étape de (trans)différenciation), in vivo, et facultativement in vitro. Le terme couvre la capacité de cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire ou ossification endochondrale. La capacité de cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire représente typiquement la capacité des cellules à former du tissu osseux sans nécessiter une matrice de cartilage classifié en tant que modèle. La capacité de cellules à former du tissu osseux par ossification endochondrale représente typiquement la capacité des cellules à former du tissu osseux, dans un premier temps, par formation d’une matrice de cartilage calcifié et ensuite, utilisation de ladite matrice de cartilage calcifié en tant que modèle pour la formation de tissu osseux. Le terme ne couvre pas le potentiel ostéo-inducteur de cellules, qui représente la capacité de cellules à attirer d’autres cellules sécrétrices de matrice osseuse et/ou induire la (trans)différenciation d’autres cellules en cellules sécrétrices de matrice osseuse. Il apparaîtra à l’homme du métier que les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique telles que présentement décrites peuvent avoir un potentiel à la fois ostéogénique et ostéo-inducteur.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent avoir des propriétés à la fois ostéoinductrices et ostéogéniques. Avantageusement, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique telles que présentement décrites, après une greffe chez un sujet en ayant besoin, permettent une néoformation osseuse qui dépasse la néoformation osseuse obtenue avec une greffe de CSM ou de cellules dérivées de CSM obtenues par des procédés de l’art antérieur.
À titre d’exemple, mais sans limitation, des marqueurs de surface cellulaire adaptés pour évaluer l’identité cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent comprendre CD73, CD105, CD10, et CD44. Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent, par exemple, être détectés par des anticorps monoclonaux commercialisés, tels que des anticorps monoclonaux marqués par un fluorochrome permettant la détection de cellules par cytométrie en flux. En particulier, CD73 et CD105 sont des marqueurs mésenchymateux; CD44 est un marqueur d’adhésion; et CD10 est un marqueur ostéochondroblastique qui sont typiquement exprimés par une fraction élevée de celBUes 18/5662 dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique. La quantité de CD73 sur la surface cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique est typiquement élevée ; la quantité de CD105 sur la surface cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique est typiquement faible ; et la quantité de CD44 sur la surface cellulaire de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique est typiquement élevée.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD90, CD105, CD73, CD63 et CD166.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD90, CD105, CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD14 et CD19.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD14 et CD19.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée18/5662 ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD34 et CD3.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD34, CD3, CD14 et CD19.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour l'un quelconque ou plusieurs, par exemple un, deux, trois ou la totalité, de CD73, CD105, CD10 ou CD44 (c'est-à-dire, expriment l'un quelconque ou plusieurs, tels qu'un, deux, trois ou la totalité, de CD73, CD105, CD10 ou CD44 sur la surface cellulaire). De préférence, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 (c'est-à-dire, expriment CD73, CD105, CD10 et CD44 sur la surface cellulaire).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM ont l'une quelconque ou plusieurs parmi une médiane normalisée d'intensité de fluorescence (nMFI) pour CD73 (nMFICD73) d'au moins 500, une nMFI pour CD44 (nMFICD44) d'au moins 100 ou une nMFI pour CD105 (nMFICD105) d'au plus 150. Par exemple, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique ont l'une quelconque ou plusieurs parmi une nMFICD73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; une nMFICD44 d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; ou une nMFICD105 d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100. De préférence, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM ont une nMFICD73 d'au moins 500, une nMFICD44 d'au moins 100, et une nMFICD105 d'au plus 150.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au 18/5662 % (en nombre), tel que, par exemple, > 91 %, > 92 %, > 93 %, > 94 %, > 95 %, > 96 %, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour l'un quelconque ou plusieurs, par exemple un, deux, trois ou la totalité, de CD73, CD105, CD10 ou CD44 (c'est-à-dire, expriment l'un quelconque ou plusieurs, tels qu'un, deux, trois ou la totalité, de CD73, CD105, CD10 ou CD44 sur la surface cellulaire), et les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM ont l'une quelconque ou plusieurs parmi une nMFICD73 d'au moins 500, une nMFICD44 d'au moins 100 ou une nMFICD105 d'au plus 150. De préférence, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD73, CD105, CD10 et CD44 (c'est-à-dire, expriment CD73, CD105, CD10 et CD44 sur la surface cellulaire), et les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM ont une nMFICD73 d'au moins 500, une nMFICD44 d'au moins 100, et une nMFICD105 d'au plus 150.
La « médiane d'intensité de fluorescence normalisée » ou « nMFI », dans le présent contexte, désigne le rapport de la MFI de la population de cellules marquées totale analysée avec un ou plusieurs anticorps conjugués à des fluorochromes (MFIcanal_marqueur) à la MFI de la population de cellules marquées avec un ou plusieurs anticorps témoins d'isotype conjugués à des fluorochromes (MFIcanaljsotype), tels qu'un témoin d'immunoglobuline G (IgG) conjuguée avec un fluorochrome tel que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), l'allophycocyanine (APC) ou la phycoérythrine (PE). Les résultats de nMFI sont proportionnels à la quantité de marqueurs présents sur la surface cellulaire d'une population d'intérêt. La (n)MFI est typiquement liée à la longueur d'onde à laquelle l'émission du signal fluorescent est mesurée.
Les expressions « une nMFI pour CD73 » ou « nMFICD73 », dans le présent contexte, désignent le rapport de la MFI de la population totale de cellules analysées marquées avec un anticorps contre CD73 conjugué à APC (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 560847) à la MFI de la population de cellules marquées avec un IgG témoin conjugué à APC (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 555751). De préférence, la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.
Les expressions « une nMFI pour CD44 » ou « nMFICD44 », dans le présent contexte, désignent le rapport de la MFI de la population totale de cellules analysées marquées avec un anticorps contre CD44 conjugué à PE (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 550989) à la MFI de la population de cellules marquées avec un IgG témoin conjugué à PE (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 556650). De préférence, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.
Les expressions «une nMFI pour CD105» ou «nMFICD105», dans le présent contexte, désignent le rapport de la MFI de la population totale de cellules analysées marquées avec un anticorps contre CD105 conjugué à APC (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 562408) à la MFI de la population de cellules marquées avec un IgG témoin conjugué à APC (par exemple, BD Biosciences®, réf. n° 555751). De préférence, la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peuvent comprendre l'un ou plusieurs de :
- une expression accrue d'un gène codant pour un marqueur ostéochondroblastique choisi dans le groupe constitué de RUNX2, SOX9, ZNF521, ALPL, BMP2, OPG, POSTN, CHI3L1, MMP13, CADM1, CX43, CD10, et WISP1 ;
- une expression accrue d'un gène codant pour une protéine de matrice osseuse ou cartilagineuse choisie parmi DCN ou SPON1 ;
- une expression réduite du gène DKK1 codant pour un inhibiteur d'ostéochondrogenèse ; et/ou
- une expression réduite d'un gène codant pour un marqueur de prolifération choisi parmi KI67 ou PCNA, par rapport à l'expression du gène respectif dans des CSM.
Dans certains modes de réalisation, l'expression d'un gène codant pour un marqueur lié à l'apoptose choisi parmi BCL2 ou BAX peut être similaire pour des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique et des CSM.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique comprennent l'un ou plusieurs de :
- une expression accrue du gène PPARG codant pour une protéine impliquée dans l'adipogenèse ;
- une expression accrue d'un gène codant pour une protéine ostéochondroblastique choisie parmi CD73 ou BMP2 ; et/ou ,, .. ,, - , . .,. ., , , .. .. .BE2018/5662 une expression réduite d'un gene codant pour une proteine ostéochondroblastique choisie dans le groupe constitué de COL1A1, BGN, SPARC, ALPL et BCL2, par rapport à l'expression du gène respectif dans des cellules ostéoformatrices générées par un procédé qui est sensiblement identique pour sensiblement tous les paramètres au procédé tel que présentement décrit d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM, hormis la présence vs. l'absence d'héparine ou son analogue ou dérivé.
Dans certains modes de réalisation, l'expression d'un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être augmentée (c'est-à-dire, amplifiée) d'au moins environ 1 % par rapport à (c'est-à-dire, comparée à) (c'est-à-dire, que l'expression d'un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être au moins environ 1,01 fois) l'expression dudit gène dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie. Par exemple, l'expression d'un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être augmentée (c'est-à-dire, amplifiée) d'au moins environ 2 % (c'est-à-dire, 1,02 fois), au moins environ 5% (c'est-à-dire, 1,05 fois), au moins environ 10% (c'est-à-dire, 1,10 fois), au moins environ 15 % (c'est-à-dire, 1,15 fois), au moins environ 20 % (c'est-à-dire, 1,20 fois), au moins environ 25 % (c'est-à-dire, 1,25 fois), au moins environ 30 % (c'est-à-dire, 1,30 fois), aumoins environ 35 % (c'est-à-dire, 1,35 fois), au moins environ 40 % (c'est-à-dire, 1,40 fois), aumoins environ 45 % (c'est-à-dire, 1,45 fois), au moins environ 50 % (c'est-à-dire, 1,50 fois), aumoins environ 55 % (c'est-à-dire, 1,55 fois), au moins environ 60 % (c'est-à-dire, 1,60 fois), aumoins environ 65 % (c'est-à-dire, 1,65 fois), au moins environ 70 % (c'est-à-dire, 1,70 fois), aumoins environ 75 % (c'est-à-dire, 1,75 fois), au moins environ 80 % (c'est-à-dire, 1,80 fois), aumoins environ 85 % (c'est-à-dire, 1,85 fois), au moins environ 90 % (c'est-à-dire, 1,90 fois), aumoins environ 95% (c'est-à-dire, 1,95 fois), ou au moins environ 100% par rapport à (c'est-à-dire, comparée à) (c'est-à-dire, 2 fois) l'expression dudit gène dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie.
Dans certains modes de réalisation, l'expression d'un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être au moins environ 2 fois, au moins environ 5 fois, au moins environ 10 fois, au moins environ 20 fois, au moins environ 30 fois, au moins environ 40 fois, au moins environ 40 fois, au moins environ 50 fois, au moins environ 100 fois, au moins environ 500 fois, au moins environ 1000 fois, au moins environ 2000 fois, au moins environ 3000 fois ou au moins environ 5000 fois, l'expression d'un gène témoin dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie.
Dans certains modes de réalisation, l'expression d'un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être diminuée (c’est-à-dire, réduite) d'au moins environ 1 % par rapport à (c’est-à-dire, comparée à) (c’est-à-dire, que l’expression d’un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être au moins environ 0,99 fois) l’expression dudit gène dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie. Par exemple, l’expression d’un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être diminuée (c’est-à-dire, réduite) d’au moins environ 2 % (c’est-à-dire, 0,98 fois), au moins environ 5 % (c’est-à-dire, 0,95 fois), au moins environ 10 % (c’est-à-dire, 0,90 fois), au moins environ 15 % (c’est-à-dire,
0,85 fois), au moins environ 20 % (c’est-à-dire, 0,80 fois), au moins environ 25 % (c’est-à-dire,
0,75 fois), au moins environ 30 % (c’est-à-dire, 0,70 fois), au moins environ 35 % (c’est-à-dire,
0,65 fois), au moins environ 40 % (c’est-à-dire, 0,60 fois), au moins environ 45 % (c’est-à-dire,
0,55 fois), au moins environ 50 % (c’est-à-dire, 0,50 fois), au moins environ 55 % (c’est-à-dire,
0,45 fois), au moins environ 60 % (c’est-à-dire, 0,40 fois), au moins environ 65 % (c’est-à-dire,
0,35 fois), au moins environ 70 % (c’est-à-dire, 0,30 fois), au moins environ 75 % (c’est-à-dire,
0,25 fois), au moins environ 80 % (c’est-à-dire, 0,20 fois), au moins environ 85 % (c’est-à-dire,
0,15 fois), au moins environ 90 % (c’est-à-dire, 0,10 fois), au moins environ 95 % (c’est-à-dire,
0,05 fois), ou au moins environ 99% par rapport à (c’est-à-dire, comparée à) (c’est-à-dire, 0,01 fois) l’expression dudit gène dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie.
Dans certains modes de réalisation, l’expression d’un gène codant pour une protéine dans les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique peut être au moins environ 0,005 fois, au moins environ 0,001 fois, au moins environ 0,0005 fois, ou au moins environ 0,0001 fois, l’expression d’un gène témoin dans une cellule témoin correspondante telle que présentement définie.
Dans certains modes de réalisation, les cellules témoin telles que présentement décrites peuvent être des CSM ou peuvent être des cellules ostéoformatrices générées par un procédé qui est sensiblement identique pour sensiblement tous les paramètres au procédé tel que présentement décrit d’obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM, hormis la présence vs. l’absence d’héparine ou son analogue ou dérivé.
Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sécrètent des quantités plus élevées de protéines impliquées dans l’ostéochondrogenèse choisies parmi CHI3L1 ou MMP13, par rapport à des CSM ou des cellules ostéoformatrices générées par un procédé qui est sensiblement identique pour sensiblement tous les paramètres au procédé tel que présentement décrit d’obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM, hormis la présence vs. l’absence d’héparine ou son analogue ou dérivé. Dans certains modes de réalisation, les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sécrètent des quantités plus faibles de protéines
DKK1 impliquées dans l’inhibition de l'ostéogenèse par rapport à des CSM ou des ceiTufes ostéoformatrices générées par un procédé qui est sensiblement identique pour sensiblement tous les paramètres au procédé tel que présentement décrit d’obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM, hormis la présence vs. l’absence d’héparine ou son analogue ou dérivé.
Comme décrit précédemment, les procédés détaillés ci-dessus peuvent produire des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, ou des populations de telles cellules dérivées de CSM, ayant des caractéristiques supérieures, telles que, en particulier, (i) une expression élevée d’ALP, qui représente l’orientation de la cellule vers la lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, et (ii) une faible expression de HLA-DR, qui représente l’immunogénicité limitée des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, ce qui indique que les cellules sont plus adaptées pour la transplantation de cellules, par exemple vers des sujets allogéniques.
En conséquence, dans des modes de réalisation particuliers, au moins 70 % (en nombre) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10 % (en nombre) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour HLA-DR.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, s 91 %, s 92 %, s 93 %, s 94 %, s 95 %, s 96 %, >97%, s 98%, s 99 %, ou 100%) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d’obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, s 91 %, s 92 %, s 93 %, s 94 %, s 95 %, s 96 %, s 97 %, s 98 %, s 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45 ; au moins 70 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour HLA-DR.
Dans des modes de réalisation particuliers, sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, s 91 %, s 92 %, s 93 %, s 94 %, s 95 %, s 96 %, s 97 %, s 98 %, s 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique obtenues par les procédés d’obtention de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique à partir de CSM sont positives pour CD90, CD105, CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement la totalité (par exemple, au moins 90 % (en nombre), tel que, par exemple, s 91 %, s 92 %, s 93 %, s 94 %, s 95 %, s 96 %, s 97 %, s 98 %, s 99 %, ou 100 %) des cellules dérivées de CSM de ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45, CD14 et CD19 ; au moins
BE2018/5662 70 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour HLA-DR.
Dans certains modes de réalisation particulièrement préférés, l'expression « cellules dérivées de CSM de lignée chondroblastique (cartilage) » peut désigner des types de cellules ayant un phénotype chondroblastique, et qui peuvent contribuer à, ou sont capables de se développer en cellules qui peuvent contribuer à, la formation de cartilage ou de matrice cartilagineuse. Dans le présent contexte, des « chondroprogéniteurs » peuvent comprendre, en particulier, des chondroprogéniteurs précoces et tardifs. Encore plus préférablement, des « cellules dérivées de CSM de lignée chondroblastique (cartilage) » peuvent désigner des ostéochondroprogéniteurs, des chondroprogéniteurs, des préchondroblastes ou des chondroblastes, ou des mélanges de ceux-ci, encore plus préférablement, l'expression peut désigner des préchondroblastes ou des chondroblastes, ou des mélanges de ceux-ci, en particulier, dans certains exemples, l'expression peut désigner des préchondroblastes ou, dans certains autres exemples, l'expression peut désigner des chondroblastes. Tous ces termes sont connus en tant que tels.
À titre d'indication supplémentaire et sans limitation, les cellules de lignée ostéochondroblastique et/ou chondroblastique, telles que des ostéochondroprogéniteurs, des chondroprogéniteurs, des préchondroblastes et des chondroblastes, ainsi que des populations de cellules comprenant des ostéochondroprogéniteurs, chondroprogéniteurs, préchondroblastes et/ou chondroblastes, peuvent présenter les caractéristiques suivantes :
a) les cellules présentent l'expression de SOX9, un facteur de transcription qui joue un rôle central pendant la différenciation des chondroblastes et la formation du cartilage ;
b) les cellules présentent l'expression d'au moins l'un des suivants : aggrécane (ACAN), collagène de type II ou CD90 ;
c) les cellules n'expriment sensiblement pas CD45 (par exemple, moins d'environ 10%, de préférence moins d'environ 5 %, plus préférablement moins d'environ 2 % des cellules peuvent exprimer CD45) ;
d) les cellules présentent des signes de capacité à produire des taux élevés de collagène de types II, IX, et XI et des protéoglycanes, les principaux constituants de la matrice extracellulaire (MEC) de hyaline in situ. La formation de cartilage peut être conventionnellement mesurée, par exemple, en utilisant un dosage avec safranine orange/vert solide pour colorer les protéoglycanes et les protéines non collagéniques, respectivement (voir, par exemple, Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98) ;
e) les chondrocytes articulaires humains peuvent présenter des caractéristiques d'expression cellulaire telles que résumées dans Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-
42), par exemple, ils peuvent exprimer des intégrines et d'autres molécules d'adhésion (CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD51/61, CD54, CD106, CD166, CD58, CD44), des tétraspanines (CD9, CD63, CD81, CD82, CD151), des récepteurs (CD105, CD119, CD130, CD140a, CD221, CD95, CD120a, CD71, CD14), des ectoenzymes (CD10, CD26), et d'autres molécules de surface (CD90, CD99). Pendant la culture en monocouche, les chondrocytes peuvent réguler positivement certains marqueurs considérés comme étant distinctifs pour des cellules souches mésenchymateuses (CD10, CD90, CD105, CD166). Par conséquent, de tels marqueurs peuvent également être exprimés par les préchondroblastes ou chondroblastes moins matures.
f) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignée adipocytaire (par exemple, adipocytes) ou de lignée ostéoblastique (par exemple, ostéoblastes, chondrocytes). L'absence de différenciation en ces lignées cellulaires peut être évaluée en utilisant des conditions d'induction de différenciation (par exemple, voir Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7), et des méthodes de dosage standard établies dans l'art (par exemple, lorsqu'ils sont induits, des adipocytes sont typiquement colorés par l'Oil Red O, indiquant une accumulation de lipides ; les préostéoblastes et ostéoblastes sont typiquement colorés pour ALP). L'absence substantielle de propension à la différenciation adipogénique et/ou ostéoblastique peut typiquement signifier que moins de 20 %, ou moins de 10 %, ou moins de 5 %, ou moins de 1 % des cellules testées présenteraient des signes de différenciation adipogénique ou ostéoblastique lorsqu'elles sont appliquées dans l'essai respectif.
Comme cela est connu dans l'art, les cellules de lignée fibroblastique peuvent contribuer à, ou sont capables de se développer en cellules qui peuvent contribuer à, la formation de tissu conjonctif.
À titre d'indication supplémentaire et sans limitation, les cellules fibroblastiques peuvent présenter les caractéristiques suivantes :
a) les cellules présentent l'expression de FSP1 (protéine spécifique des fibroblastes 1) ;
b) les cellules présentent l'expression d'au moins l'un des suivants : collagène, vimentine, desmine ou CD90 ;
c) les cellules n'expriment sensiblement pas CD45 (par exemple, moins d'environ 10%, de préférence moins d'environ 5 %, plus préférablement moins d'environ 2 % des cellules peuvent exprimer CD45) ;
d) les cellules présentent des signes de capacité à produire du collagène, du glycosaminoglycane, des fibres réticulaires et élastiques, des glycoprotéines pour former la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs. Les fibroblastes contribuent à l'intégrité structurale des ligaments et des tendons et ont une fonction de réparation tissulaire. Le dépôt de collagène peut être visualisé au moyen de la coloration trichrome (Li et al. World J Gastroenterol, 2014 vol. 20(16), 4648-61). Le collagène de type I (Chondres, Redmond, WA) et la ténascine CB(Tn-18/5662 C ; IBL-America, Minneapolis, MN) sont deux marqueurs des fibroblastes des ligaments, et peuvent être dosés par ELISA (Brissett et al. Arthritis Rheum, 2012, vol. 64(1), 272-80).
Comme cela est connu dans l'art, les cellules de lignée tendinocytaire peuvent contribuer à la formation de matériau de tendon ou de matrice de tendon. Un tendon est constitué de grands faisceaux de fibres qui comprennent un réseau de fibrilles de collagène et différents types de cellules, notamment des cellules synoviales, des cellules endothéliales, des ténoblastes et des ténocytes disposés longitudinalement en rangées dans des molécules de collagène. Les ténoblastes sont une forme immature de cellules de tendon qui se différencient en ténocytes lorsqu'elles vieillissent avec une activité métabolique réduite.
À titre d'indication supplémentaire et sans limitation, les ténocytes peuvent présenter les caractéristiques suivantes :
a) les cellules comprennent l'expression de Scleraxis (SCX), un membre de la famille héliceboucle-hélice basique de facteur de transcription impliqué dans la différenciation cellulaire et l'organisation de la matrice extracellulaire dans les tendons ;
b) les cellules comprennent l'expression d'au moins l'un des suivants : ténomoduline (TNMD) et ténascine C (Tn-C) ;
c) les cellules expriment substantiellement CD44, CD73, CD90 et CD105, mais n'expriment pas CD34, CD45, CD146, ou stro-1 ;
d) les cellules présentent des signes de capacité à produire un composant extracellulaire de tendon qui est constitué de collagènes de type I, III et V, protéoglycanes, fibronectine, et fibrilles élastiques pour la régénération de tissu tendineux (Güngörmüs et al. Connect Tissue Res, 2008, vol. 53(6), 485-91) ;
e) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignée adipocytaire (par exemple, adipocytes), de lignée chondroblastique (par exemple, chondroblastes, chondrocytes) ou de lignée ostéoblastique (par exemple, ostéoblastes, ostéocytes).
Comme cela est connu dans l'art, les cellules de la lignée des synoviocytes (liquide synovial) comprennent typiquement les cellules synoviales de type A ou de type macrophages et les synoviocytes de type B ou de type fibroblastes (FLC), qui peuvent contribuer à la formation de la membrane synoviale et du liquide synovial. Tous ces termes sont connus en tant que tels. Le terme « synoviocyte », dans le présent contexte, désigne ainsi l'un quelconque, ainsi que, collectivement, l'ensemble de ces types de cellules.
À titre d'indication supplémentaire et sans limitation, les synoviocytes peuvent présenter les caractéristiques suivantes :
a) les cellules présentent des signes de capacité à sécréter le protéoglycane 4 (PRG4) et8Ôffl18/5662 la principale source de phospholipides tensioactifs (SAPL) ainsi que de hyaluronane (HA) présent dans le liquide synovial (Tamer et al. Interdiscip Toxicol, 2013, vol. 6(1), 111-125) ;
b) les cellules synoviales de type A ou de type macrophage comprennent l'expression de marqueurs d'origine hématopoïétique comprenant CD11b, CD86, CD14, CD163, l'antigène DR et le récepteur Fc. Les synoviocytes de type fibroblastes ou de type B sont des cellules mésenchymateuses qui présentent de nombreuses caractéristiques des fibroblastes, comprenant l'expression de collagènes de types IV et V, de vimentine et de CD90. De plus, les cellules de type B possèdent des propriétés uniques in situ qui les distinguent de nombreux autres lignées de fibroblastes, comprenant les fibroblastes résidents de sous-bordure. Par exemple, la cadhérine 11 (molécule d'adhésion spécifique jouant un rôle clé dans l'agrégation homotypique de FLS), CD55 (facteur d'accélération de dégradation), VCAM-1 (molécule d'adhésion vasculaire 1) et ICAM-1 (molécule d'adhésion intercellulaire 1) (Bartok et al. Immunol Rev, 2011, vol. 233(1), 233-255);
c) les cellules n'expriment sensiblement pas CD45 (par exemple, moins d'environ 10%, de préférence moins d'environ 5 %, plus préférablement moins d'environ 2 % des cellules peuvent exprimer CD45) ;
d) les cellules ne se différencient sensiblement pas en cellules de lignée adipocytaire (par exemple, adipocytes), de lignée chondroblastique (par exemple, chondroblastes, chondrocytes) ou de lignée ostéoblastique (par exemple, ostéoblastes, ostéocytes).
Lorsqu'il est dit qu'une cellule est positive (ou exprime ou comprend l'expression d'un) marqueur particulier, cela signifie que l'homme du métier conclura à la présence ou à la preuve d'un signal distinct, par exemple la détection d'anticorps ou la détection par réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse, pour ce marqueur lors de la conduite de la mesure appropriée, par rapport à des témoins adaptés. Lorsque le procédé permet l'évaluation quantitative du marqueur, les cellules positives peuvent, en moyenne, générer un signal qui est significativement différent du témoin, par exemple, mais sans limitation, au moins 1,5 fois plus élevé qu'un tel signal généré par des cellules témoins, par exemple, au moins 2 fois, au moins 4 fois, au moins 10 fois, au moins 20 fois, au moins 30 fois, au moins 40 fois, au moins 50 fois plus élevé ou même plus élevé.
L'expression des marqueurs de cellules spécifiques ci-dessus peut être détectée au moyen d'une technique immunologique adaptée quelconque connue dans l'art, telle que l'immunohistochimie ou l'adsorption d'affinité, l'analyse par transfert Western, la cytométrie en flux, ELISA, etc., ou par un dosage biochimique adapté quelconque d'une activité enzymatique (par exemple, pour ALP), ou par une technique adaptée quelconque de mesure de la quantité de l'ARNm marqueur, par exemple, transfert Northern, RT-PCR semi-quantitative ou quantitative, etc. Des données de séquence pour des marqueurs répertoriés dans la préi8nî£ 18/5662 description sont connues et peuvent être obtenues à partir de bases de données publiques telles que GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Dans certains modes de réalisation des procédés, tels que présentement décrits, les CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être des cellules animales, de préférence des cellules d'animal à sang chaud, plus préférablement des cellules de mammifère, telles que des cellules humaines ou des cellules de mammifère non humain et, de manière préférée entre toutes, des cellules humaines.
Les CSM ou cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites sont, de préférence, adhérentes, c'est-à-dire qu'elles ont besoin d'une surface pour croître et, typiquement, croissent sous la forme d'une monocouche adhérente sur ladite surface (c'est-à-dire, une culture de cellules adhérentes), plutôt que sous forme de cellules flottant librement dans un milieu de culture (culture en suspension). L'adhésion de cellules à une surface, telle que la surface d'un récipient en plastique de culture de tissu, peut être aisément examinée par inspection visuelle au microscope renversé. Des cellules cultivées en culture adhérente nécessitent un passage périodique, dans lequel les cellules peuvent être retirées de la surface par voie enzymatique (par exemple, en utilisant de la trypsine), mises en suspension dans du milieu de culture et à nouveau étalées dans un/des nouveau(x) récipient(s) de culture. En général, une surface ou un substrat qui permet l'adhésion de cellules à celle-ci peut être n'importe quel substrat sensiblement hydrophile. Comme cela est connu dans l'art, des récipients de culture de tissu, par exemple des flacons de culture, des plaques de puits, des boîtes ou similaire, peuvent généralement être constitués d'une grande variété de matériaux polymères, traités en surface de façon appropriée ou revêtus après moulage afin de fournir des surfaces de substrat hydrophiles. Le terme « mettre en contact », dans le présent contexte, signifie mettre en présence, directement ou indirectement, un ou plusieurs molécules, composants ou matériaux avec un autre, de façon à favoriser les interactions entre ceux-ci. Typiquement, un ou plusieurs agents capables d'induire l'expansion et/ou la différenciation de CSM ou cellules dérivées de CSM peuvent être mis en contact avec des CSM ou cellules dérivées de CSM au moyen de leur inclusion dans le milieu, dans lequel les CSM ou cellules dérivées de CSM sont cultivées.
Le terme « in vitro », dans le présent contexte, signifie à l'extérieur, où externe à, un corps animal ou humain. Le terme « in vitro », dans le présent contexte, doit être entendu comme comprenant « ex vivo ». Le terme « ex vivo » désigne typiquement des tissus ou des cellules retirés d'un corps animal ou humain et maintenus ou propagés à l'extérieur du corps, par exemple, dans un récipient de culture. Les termes « facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2) », « FGF basique », « FGF-b », « FGFB », « BFGF », « facteur de croissance se liant à l'héparine 2 (HBGF-2) », ou « prostatropine », peuvent être utilisés de façon interchangeable et désignent un membre connu de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes. Les inventeurs ont observé que FGF-2 est particulièrement efficace dans le procédé de la . BE2018/5662 présente invention.
Le terme « facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) », « TGFB » ou « TGFbêta », dans le présent contexte, désigne un membre de la famille du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β). Les inventeurs ont observé que TGF-β est particulièrement efficace dans le procédé de la présente invention. Dans un mode de réalisation supplémentaire, ledit membre de la famille TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-bêta-1, TGF-bêta-2, TGF-bêta3, TGF-bêta-4, GDF1 (facteur de différenciation de croissance 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA (chaîne alpha d'inhibine), INHBA (chaîne bêta A d'inhibine), INHBB (chaîne bêta B d'inhibine), INHBC (chaîne bêta C d'inhibine), INHBE (chaîne bêta E d'inhibine), MIS (facteur inhibiteur muellerien), et en outre de membres de la sous-famille GDNF, comprenant GDNF (facteur neurotrophique dérivé de lignée cellulaire gliale), NRTN (neurturine), PSPN (perséphine), et des mélanges de ceux-ci.
Dans un mode de réalisation particulier, TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-β! TGF^2, TGF^3, et des mélanges de ceux-ci. Dans un mode de réalisation particulier, TGF-β est TGF-βΤ À titre d'exemple, TGF^1 peut être utilisé dans les présents procédés en tant que seule cytokine TGFB.
Dans un mode de réalisation supplémentaire, les CSM ou les cellules dérivées de CSM peuvent être, en plus de FGF-2 et TGF-β, mises en contact avec un ou plusieurs facteurs de croissance supplémentaires, ajoutés de façon exogène, autres que FGF-2 et TGF-β. Dans un autre mode de réalisation, FGF-2 et TGF-β peuvent être les seuls facteurs de croissance exogènes avec lesquels les CSM ou les cellules dérivées de CSM sont mises en contact.
Dans un mode de réalisation préféré, le facteur de croissance utilisé dans le présent procédé est un facteur de croissance humain. Dans le présent contexte, le terme « facteur de croissance humain » désigne un facteur de croissance sensiblement identique à un facteur de croissance humain d'origine naturelle. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est une entité protéinique, le(s) constituant(s) peptidique(s) ou polypeptidque(s) de celle-ci peuvent avoir une séquence d'acides aminés primaire identique à un facteur de croissance humain d'origine naturelle. L'utilisation de facteurs de croissance humains dans le présent procédé est préférable, étant donné qu'il est attendu que de tels facteurs de croissance induisent un effet souhaitable sur la fonction cellulaire.
Le terme « d'origine naturelle » est utilisé pour décrire un objet ou une entité qui est présent dans la nature, par opposition à sa production artificielle par l'homme. Par exemple, une séquence polypeptidique présente dans un organisme, qui peut être isolée à partir d'une source naturelle et qui n'a pas été intentionnellement modifiée au laboratoire par l'homme, est naturelle. Lorsqu'il est fait référence à une entité particulière, par exemple à un polypeptide ou une protéine, le terme couvre l'ensemble des formes et variants de celle-ci qui sont présentes 18/5662 dans la nature, par exemple en raison d'une variation normale entre individus. Par exemple, lorsqu'il est fait référence à un facteur de croissance protéinique, le terme « d'origine naturelle » couvre les facteurs de croissance présentant des différences dans la séquence primaire de leur(s) constituant(s) peptidique(s) ou polypeptidique(s) en raison d'une variation allélique normale entre individus.
Le présent procédé peut utiliser un variant ou fragment biologiquement actif d'un facteur de croissance. Dans le procédé de l'invention, les variants ou fragments « biologiquement actifs » d'un facteur de croissance produisent au moins environ le même degré d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM que le facteur de croissance respectif, lorsque les autres conditions sont sensiblement les mêmes.
Un « variant » d'un polypeptide a une séquence d'acides aminés qui est pratiquement identique (c'est-à-dire, en grande partie, mais pas totalement, identique) à la séquence d'acides aminés du polypeptide. Présentement, le terme « sensiblement identique » désigne au moins 85 % identique, par exemple au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, et, par exemple, au moins 99 %. Des différences de séquence peuvent résulter de l'insertion (addition), la suppression et/ou la substitution d'un ou plusieurs acides aminés.
Dans un autre mode de réalisation, les facteurs de croissance utilisés dans le présent procédé, à savoir au moins FGF-2 et TGF-β, peuvent être des facteurs de croissance d'animal non humain, et en particulier des facteurs de croissance de mammifère non humain, ou des variants ou dérivés biologiquement actifs de ceux-ci. Dans le présent contexte, les termes « facteur de croissance d'animal non humain » et « facteur de croissance de mammifère non humain » désignent un facteur de croissance pratiquement identique à, respectivement, un facteur de croissance d'animal non humain ou de mammifère non humain d'origine naturelle. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est une entité protéinique, le(s) constituant(s) peptidique(s) ou polypeptidique(s) de celle-ci peuvent avoir une séquence d'acides aminés primaire identique à un facteur de croissance d'animal non humain ou de mammifère non humain d'origine naturelle. Il apparaîtra à l'homme du métier que des facteurs de croissance d'animal non humain ou de mammifère non humain peuvent être applicables dans le présent procédé, mais à un degré plus faible que les facteurs de croissance humains, étant donné que ceux-ci sont de la même origine que les cellules CSM. En particulier, des facteurs de croissance d'animal non humain ou de mammifère non humain peuvent être utilisés s'ils induisent l'effet souhaité, par exemple un effet similaire à un facteur de croissance humain (analogue).
Dans un mode de réalisation préféré, les facteurs de croissance ou des variants ou dérivés biologiquement actifs de ceux-ci sont recombinants, c'est-à-dire produits par un organisme hôte par l'expression d'une molécule d'acide nucléique recombinante, qui a été introduite dans l'organisme hôte ou un de ses ancêtres, et qui comprend une séquence codant pour ledit
BE2018/5662 polypeptide. L'expression « molecule d'acide nucléique recombinante », dans le present contexte, désigne une molécule d'acide nucléique (par exemple, une molécule d'ADN ou d'ADNc) qui est constituée de segments assemblés conjointement en utilisant la technologie d'ADN recombinant.
Dans des modes de réalisation particuliers, les CSM ou cellules dérivées de CSM sont en outre mises en contact avec, par exemple lorsque le milieu comprend en outre, l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci.
Le terme « plasma » est tel que défini conventionnellement et comprend du plasma frais, du plasma congelé décongelé, du plasma traité par solvant/détergent, du plasma transformé (par exemple, PRP), ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. Le plasma est généralement obtenu à partir d'un échantillon de sang total, auquel est ajouté ou qui est mis en contact avec un anticoagulant (par exemple, l'héparine (à des concentrations très faibles, typiquement environ 15 x 10-5 UI/ml, citrate, oxalate ou EDTA). Ensuite, les composants cellulaires de l'échantillon de sang sont séparés du composant liquide (plasma) par une technique appropriée, typiquement par centrifugation. À titre d'exemple spécifique, mais sans limitation, pour obtenir un plasma approprié pour utilisation dans la présente invention, un échantillon de sang peut être prélevé dans un tube vacutainer contenant l'anticoagulant EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) (par exemple, un tube EDTA en plastique BD Vacutainer, 10 ml, 1,8 mg/ml). L'échantillon est doucement agité puis centrifugé pendant 10 min à température ambiante entre 1000 et 2000 g pour séparer le plasma des globules rouges. Le surnageant (plasma) est collecté, facultativement groupé (si plusieurs échantillons de sang sont utilisés), et aliquotés dans des Cryovial, qui sont conservés à -80 °C jusqu'à leur utilisation. Le terme « plasma » désigne une composition qui ne fait pas partie d'un corps humain ou animal. Le terme « plasma » peut, dans certains modes de réalisation, comprendre spécifiquement du plasma transformé, c'est-à-dire du plasma soumis, après sa séparation du sang total, à une ou plusieurs étapes de traitement qui modifient sa composition, spécifiquement sa composition chimique, biochimique ou cellulaire. En conséquence, le terme « plasma », dans le présent contexte, peut comprendre un plasma riche en plaquettes (PRP), c'est-à-dire un plasma qui a été enrichi en plaquettes. Typiquement, un PRP peut contenir environ 1,0x106 plaquettes/pl, tandis que la concentration en plaquettes dans le sang total peut être d'environ 1,5x105 à 3,5x105/pl.
Le plasma peut être traité par un solvant ou un détergent. Les termes « plasma traité par solvant/détergent », « plasma traité par S/D » ou « plasma S/D » désignent généralement un plasma décellularisé pouvant être obtenu ou obtenu par un procédé comprenant les étapes de : (a) traitement du plasma avec un solvant et un détergent et (b) filtration du plasma traité par solvant/détergent. Les solvants adaptés pour un tel traitement sont des solvants tels que les phosphates de dialkyle ou de trialkyle et des détergents qui sont décrits dans le document U.S.
no 4 764 369. Le détergent utilisé pour préparer le plasma S/D est, de préférence, un détergent: 18/5662 non toxique (par exemple, Tween® 20 ou Tween® 80).
Le terme « sérum » est tel que défini conventionnellement et comprend du sérum frais, du sérum congelé décongelé ou du sérum préparé à partir de plasma, ou un mélange de deux quelconque de ceux-ci ou plus. Du sérum peut généralement être obtenu à partir d'un échantillon de sang total en laissant la coagulation se produire dans l'échantillon dans un premier temps, puis en séparant le caillot formé ainsi et les composants cellulaires de l'échantillon de sang du composant liquide (sérum) par une technique appropriée, généralement par centrifugation. La coagulation peut être facilitée par un catalyseur inerte, par exemple des billes ou une poudre de verre. En variante, du sérum peut être obtenu à partir de plasma en éliminant l'anticoagulant et la fibrine. À titre d'exemple spécifique, mais sans limitation, pour obtenir un sérum adapté pour utilisation dans la présente invention, un échantillon de sang peut être prélevé dans un tube vacutainer ne contenant pas d'anticoagulant (par exemple, un tube en plastique BD Vacutainer Plus, 10 ml) et incubé pendant 30 à 45 min à température ambiante pour permettre la coagulation. Le tube est ensuite centrifugé pendant 15 min à température ambiante entre 1000 et 2000 g pour séparer le sérum des globules rouges. Le surnageant (sérum) est collecté, facultativement groupé (si plusieurs échantillons de sang sont utilisés), et aliquoté dans des Cryovial, qui sont conservés à -80 °C jusqu'à leur utilisation. Par conséquent, le terme « sérum » désigne une composition acellulaire qui ne fait pas partie d'un corps humain ou animal. Le sérum tel que présentement décrit est du sérum humain, c'est-à-dire obtenu à partir d'un sujet humain unique ou d'une pluralité de sujets humains (par exemple, un pool de sérum mixte). Le sérum peut être du sérum non transformé, c'est-à-dire un sérum dérivé par séparation du sang total et non soumis à des étapes de traitement en aval modifiant sa composition chimique, biochimique ou cellulaire, autre que l'inactivation par la chaleur facultative, la conservation (cryogénique ou non cryogénique), la stérilisation, la lyophilisation et/ou la filtration. Dans certains modes de réalisation, le sérum peut être obtenu à partir de plasma traité par solvant/détergent.
Le plasma isolé, le sérum isolé ou un substitut de ceux-ci peuvent être utilisés directement dans le procédé de la présente invention. Ils peuvent également être conservés de manière appropriée pour utilisation ultérieure (par exemple, pendant des durées plus courtes, par exemple jusqu'à environ 1 à 2 semaines, à une température supérieure aux points de congélation respectifs du plasma, du sérum ou d'un substitut de ceux-ci, mais inférieure à la température ambiante, cette température sera généralement d'environ 4 °C à 5 °C ou plus longtemps, par conservation par congélation, entre environ -70 °C et environ -80 °C).
Le plasma isolé, le sérum ou un substitut de ceux-ci peut être inactivé par la chaleur comme cela est connu dans l'art, en particulier pour éliminer le complément. Lorsque le présent procédé utilise du plasma, du sérum ou un substitut de ceux-ci autologue pour les cellules cultivées en présence de celui-ci, il peut ne pas être nécessaire d'inactiver par la chaleur Té plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci. Lorsque le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci est au moins partiellement allogénique pour les cellules cultivées, il peut être avantageux d'inactiver par la chaleur le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci. Facultativement, le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci peut également être stérilisé avant conservation ou utilisation, en utilisant des filtres microbiologiques conventionnels, de préférence ayant une taille de pore de 0,2 μm ou moins.
Dans un mode de réalisation, le présent procédé peut utiliser du plasma humain, du sérum ou un substitut de ceux-ci, qui est autologue pour les CSM ou cellules dérivées de CSM humaines mises en contact avec celui-ci. Le terme « autologue », en référence à du plasma, du sérum ou un substitut de ceux-ci, signifie que le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci est obtenu à partir du même sujet que les CSM ou cellules dérivées de CSM devant être mises en contact avec ledit plasma, sérum ou substitut de ceux-ci. L'utilisation de plasma, sérum ou substitut de ceux-ci autologue peut assurer une acceptation optimale des cellules par le sujet et/ou éviter la transmission accidentelle d'agents infectieux à partir de, par exemple, d'autres sérums.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé peut utiliser du plasma humain, du sérum humain ou un substitut de ceux-ci, qui est « homologue » ou « allogénique » pour des CSM ou cellules dérivées de CSM humaines mises en contact avec celui-ci, c'est-à-dire obtenu à partir d'un ou plusieurs sujets humains (groupés) autres que le sujet à partir duquel les CSM sont obtenus.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé peut utiliser un mélange de plasma, de sérums ou de substituts de ceux-ci autologues et allogéniques (c'est-à-dire, homologues) tels que définis ci-dessus. L'expression « substitut de sérum ou de plasma », dans le présent contexte, désigne une composition naturelle ou artificielle non toxique ayant une ou plusieurs des fonctions du plasma et/ou du sérum, telle que des compositions pouvant induire la croissance et/ou l'expansion de CSM ou de cellules dérivées de CSM. Des exemples non limitatifs de substituts de sérum ou de plasma comprennent un lysat de plaquettes et des compositions pour culture de cellules comprenant un ou plusieurs composants fractionnés de plasma ou de sérum, tels que la sérum-albumine humaine. Il apparaîtra à l'homme du métier que le plasma humain, le sérum humain et des substituts de ceux-ci sont des compositions biologiques complexes pouvant comprendre un ou plusieurs facteurs de croissance, cytokines ou hormones.
Il est prévu que les facteurs de croissance FGF-2 et TGF-β ou leurs variants ou dérivés biologiquement actifs respectifs soient fournis en plus de, c'est-à-dire, de façon exogène ou en supplément de, l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci.
Le terme « héparine », dans le présent contexte, désigne un polymère de la famille de glucides des glucosaminoglycanes ayant un poids moléculaire dans la plage de 3 à 30 kDa caractérisé par ses effets anticoagulants. L'activité de l'héparine ou de ses dérivés ou analogues peut être déterminée in vitro par un dosage biologique dans lequel la concentration d'héparine nécessaire pour empêcher la coagulation de plasma de mouton ou de chèvre ou humain est comparé à la concentration d'un standard de référence internationalement reconnu sur la base des unités d'activité d'héparine par milligramme. Un mg d'héparine est typiquement égal à 140 à 180 unités internationales (UI).
Le terme « UI » ou « unités internationales » est une mesure standard de la quantité d'une substance biologique exprimée en activité ou effet biologique de ladite substance biologique. Pour chaque substance à laquelle cette unité est affectée, une activité ou un effet biologique internationalement accepté est attendu avec une dose de 1 UI lorsque celui-ci est évalué selon une procédure biologique internationalement acceptée.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'héparine ou dérivé ou analogue d'héparine est choisi dans le groupe constitué d'une héparine non fractionnée (HNF) ; une héparine de faible poids moléculaire (HBPM), telle que l'énoxaparine, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la réviparine, l'ardéparine, la parnaparine, la bémiparine, ou des mélanges de celles-ci ; un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparane, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou des mélanges de ceux-ci, tel que le danaparoïde ; un sel d'héparine ; un sel d'héparinoïde ; un fragment d'héparine ; un fragment d'héparinoïde ; et des mélanges de ceux-ci. De préférence, l'héparine ou dérivé ou analogue d'héparine est choisi dans le groupe constitué des HNF, daltéparine, danaparoïde et sulfate d'héparane.
Dans des modes de réalisation particuliers, ledit FGF-2, ledit TGF-β, ladite héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, et facultativement l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci, sont inclus dans un milieu, généralement un milieu de culture de cellules liquide. Typiquement, le milieu comprendra une formulation de milieu de base connue dans l'art. De nombreuses formulations de milieu de base (disponibles, par exemple, dans l'American Type Culture Collection, ATCC ; ou auprès d'Invitrogen, Carlsbad, California) peuvent être utilisées pour cultiver les cellules de l'invention, comprenant, mais non limités à, le milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM), le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le milieu essentiel minimal modifié alpha (alpha-MEM), le milieu essentiel de base (BME), BGJb, le mélange de nutriments F-12 (Ham), le milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM), ou le milieu sans sérum X-VIVOTM (qualité clinique), disponibles auprès d'Invitrogen ou de Cambrex (New Jersey), et des modifications et/ou combinaisons de ceux-ci. Les compositions des milieux de base ci-dessus sont généralement connues dans l'art et l'homme du métier sera en mesure de modifier ou moduler les concentrations de milieu et/ou suppléments de milieu, comme requis pour les cellules cultivées. De telles formulations de milieu de base contiennent des composants nécessaires au développement des cellules de mammifère, qui sont connus
BE2018/5662 en tant que tels. A titre d'illustration et non de limitation, ces composants peuvent comprendre des sels inorganiques (en particulier des sels contenant Na, K, Mg, Ca, Cl, P et facultativement Cu, Fe, Se et Zn), des tampons physiologiques (par exemple, HEPES, bicarbonate) , des nucléotides, des nucléosides et/ou des bases d'acide nucléique, le ribose, le désoxyribose, des acides aminés, des vitamines, des antioxydants (par exemple, le glutathion) et des sources de carbone (par exemple, le glucose, le pyruvate de sodium, l'acétate de sodium), etc.
Pour une utilisation en culture, un ou plusieurs autres composants peuvent être ajoutés au milieu de base. Par exemple, des suppléments additionnels peuvent être utilisés pour fournir aux cellules les oligo-éléments et les substances nécessaires pour une croissance et une expansion optimales. De tels suppléments comprennent l'insuline, la transferrine, des sels de sélénium, et des combinaisons de ceux-ci. Ces composants peuvent être inclus dans une solution saline telle que, sans limitation, la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), la solution saline de Earle. Des suppléments antioxydants additionnels peuvent être ajoutés, par exemple, le β-mercaptoéthanol. Bien que de nombreux milieux de base contiennent déjà des acides aminés, certains acides aminés peuvent être supplémentés ultérieurement, par exemple la L-glutamine, qui est connue pour être moins stable en solution. Un milieu peut en outre être approvisionné en composés antibiotiques et/ou antimycotiques, tels que, typiquement, des mélanges de pénicilline et de streptomycine, et/ou d'autres composés, à titre d'exemple mais non limités à, l'amphotéricine, l'ampicilline, la gentamicine, la bléomycine, l'hygromycine, la kanamycine, la mitomycine , l'acide mycophénolique, l'acide nalidixique, la néomycine, la nystatine, la paromomycine, la polymyxine, la puromycine, la rifampicine, la spectinomycine, la tétracycline, la tylosine et la zéocine. Des lipides et des supports lipidiques peuvent également être utilisés pour supplémenter les milieux de culture de cellules. Ces lipides et supports peuvent comprendre, sans limitation, la cyclodextrine, le cholestérol, l'acide linoléique conjugué à l'albumine, l'acide linoléique et l'acide oléique conjugué à l'albumine, l'acide linoléique non conjugué, l'acide linoléique-oléique-arachidonique l'acide oléique non conjugué et conjugué à l'albumine, entre autres. L'albumine peut être utilisée de manière similaire dans des formulations sans acide gras.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma humain, le sérum ou un substitut de ceux-ci peuvent être contenus dans ledit milieu dans une proportion (volume de l'un ou plusieurs parmi le plasma humain, le sérum ou un substitut de ceuxci/volume de milieu) compris entre environ 0,5 % et environ 30 %, de préférence entre environ 1 % et environ 15 %, plus préférablement entre 2 % et 10 %. Les présents procédés peuvent présenter des performances satisfaisantes avec des quantités relativement faibles de l'un ou plusieurs parmi le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci, par exemple environ 5 ou 10 % en volume ou moins, par exemple environ 1, environ 2, environ 3 ou environ 4 % en volume, ce qui permet de diminuer le volume de l'un ou plusieurs parmi le plasma, le sérum ou un su
18/5662 de ceux-ci qui doit être obtenu afin de cultiver les CSM ou cellules dérivées de CSM.
Dans d'autres modes de réalisation supplémentaires, l'un ou plusieurs parmi des produits de plasma concentrés (par exemple, des concentrés de plasma tels que des concentrés de plasma congelé), des produits de sérum concentrés ou des produits de substitut de plasma ou de sérum concentrés peuvent être utilisés. De tels produits concentrés peuvent être inclus dans la composition à une concentration inférieure à la concentration souhaitée de l'un ou plusieurs parmi du plasma, du sérum ou un substitut de ceux-ci, de façon à déplacer (contrebalancer, compenser) le facteur de concentration.
Dans des modes de réalisation particuliers, des combinaisons ou des mélanges de deux quelconques ou plus parmi du plasma humain, du sérum humain et/ou un substitut de ceux-ci peuvent être utilisés.
Dans des modes de réalisation particuliers, FGF-2 et TGF-β sont inclus dans ledit milieu à des concentrations suffisantes pour induire une différenciation vers un type de cellule souhaité.
Dans des modes de réalisation particuliers, FGF-2 et TGF-β sont inclus dans ledit milieu à des concentrations suffisantes pour induire une différenciation de CSM en cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique. Typiquement, FGF-2 ou un variant ou fragment biologiquement actif de celui-ci peut être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 100 ng/ml, de préférence entre 0,5 et 20 ng/ml, par exemple d'environ 19,
18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/ml, ou d'environ 5 ng/ml ou moins, par exemple d'environ 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/ml. Typiquement, TGF-β, tel que TGF-β! ou un variant ou fragment biologiquement actif de celui-ci peut être inclus dans le milieu à une concentration comprise entre 0,1 et 100 ng/ml, de préférence entre 0,25 et 20 ng/ml, par exemple d'environ
19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/ml, ou d'environ 5 ng/ml ou moins, par exemple d'environ 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/ml. Lesdites valeurs sont destinées à désigner des concentrations des facteurs de croissance respectifs ou de variants ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci, tels que supplémentés de façon exogène dans le milieu.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci est comprise dans ledit milieu à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, au moins 0,02 UI/ml, au moins 0,03 UI/ml, au moins 0,04 UI/ ml, 0,05 UI/ml, au moins 0,06 UI/ml, au moins 0,07 UI/ml, au moins 0,08 UI/ml, au moins 0,09 UI/ml, au moins 0,1 UI/ml, au moins 0,5 UI/ml, au moins 1 UI/ml, au moins 5 UI/ml, au moins 10 UI/ml, au moins 20 UI/ml, au moins 30 UI/ml, au moins 40 UI/ml, au moins 50 UI/ml, au moins 60 UI/ml, au moins 70 UI/ml, au moins 80 UI/ml, au moins 90 UI/ml ou au moins 100 UI/ml. Dans des modes de réalisation particuliers, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci est comprise dans ledit milieu à une concentration d'au moins 0,10 UI/ml. Dans certains modes de réalisation préférés, l'héparine ou un dérivé ou
BE2018/5662 analogue de celle-ci est comprise dans ledit milieu a une concentration d'environ 0,1 Ul/ml:
Dans certains modes de réalisation, l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci peut être comprise dans ledit milieu a une concentration d'environ 0,10 UI/ml, 0,20 UI/ml, 0,30 UI/ml, 0,40 UI/ml, 0,50 UI/ml, 0,60 UI/ml, 0,70 UI/ml, 0,80 UI/ml, 0,90 UI/ml ou 1,0 UI/ml.
Dans des modes de réalisation particuliers, la concentration d'héparine ou d'un dérivé ou analogue de celle-ci est d'au moins 0,05 UI/ml, de préférence d'environ 0,1 UI/ml.
Dans un mode de réalisation, les concentrations ci-dessus peuvent désigner la concentration totale de facteurs de croissance ou de variants ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci ou de ladite héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci dans le milieu, c'est-a-dire la somme des concentrations desdits facteurs de croissance ou variants ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci ou de ladite héparine ou dérivé ou analogue de celle-ci, apportés par le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci et tels que fournis en plus de ceux-ci.
Dans un autre mode de réalisation, les concentrations ci-dessus peuvent désigner la concentration desdits facteurs de croissance ou variants ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci ou de ladite héparine ou dérivé ou analogue de celle-ci, tels que fournis en plus de ceux déjà apportés par le plasma ou le sérum. Naturellement, si les facteurs de croissance ou l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci devant être ajoutés ne sont normalement pas présents (non détectables) dans le plasma, le sérum ou un substitut de ceux-ci, la concentration totale et ajoutée des facteurs de croissance ou de l'héparine ou un dérivé ou analogue de ceuxci seront (sensiblement) identiques.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM a partir de CSM, tel que présentement décrit, comprend les étapes de :
(a) culture de CSM récupérées a partir d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci a une concentration d'au moins 0,01 UI/ml ;
(b) élimination de la matière non adhérente et poursuite de la culture des cellules adhérentes dans le milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci a une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, de façon a obtenir les cellules dérivées de CSM. Dans un mode de réalisation préféré, les CSM récupérées a partir d'un échantillon biologique d'un sujet telles que définies par ailleurs présentement sont cultivées dans un récipient de culture. Le récipient de culture peut fournir une surface en plastique pour permettre l'adhérence des cellules. Dans un autre mode de réalisation, la surface peut être une surface de verre. Dans un autre mode de réalisation supplémentaire, la surface peut être revêtue d'un matériau approprié permettant l'adhérence et la croissance de cellules, par exemple, Matrigel®, la laminine ou le collagène.
BE2018/5662 Dans des modes de realisation particuliers, les CSM peuvent etre recuperees a partir de moelle osseuse (ou d'autres sources) en sélectionnant les cellules (mononucléaires) qui peuvent adhérer à une surface de substrat, par exemple une surface en plastique.
Dans des modes de réalisation particuliers, on laisse les cellules se fixer pendant environ 1 à 8 jours, plus typiquement entre environ 2 et 6 jours, plus typiquement environ 4 jours avant d'éliminer la matière non adhérente à l'étape (b). Sinon, l'étape (b) est effectuée au plus 8 jours, au plus 6 jours, au plus 4 jours, de préférence au plus 4 jours, après le début de l'étape (a).
Dans des modes de réalisation particuliers les cellules peuvent être cultivées dans les étapes (a) et (b) considérées conjointement pendant une durée comprise entre environ 7 et environ 35 jours, généralement entre environ 10 et environ 28 jours, et plus préférablement pendant environ 12 à 21 jours. Sinon, les cellules peuvent être cultivées dans les étapes (a) et (b) considérées conjointement jusqu'à ce que leur confluence atteigne environ 60 % ou plus, ou environ 80 % ou plus, ou environ 90 % ou plus, ou même jusqu'à 100 %.
Dans un mode de réalisation, après l'étape (b), le procédé peut comprendre la collecte des cellules ou de la population de cellules obtenues ainsi.
Dans un mode de réalisation, après l'étape (b), le procédé peut comprendre le détachement, le repiquage et la culture des cellules dérivées de CSM dans le milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, de préférence à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Dans un mode de réalisation, après l'étape (b), le procédé peut comprendre le détachement, le repiquage et la culture des cellules dérivées de CSM dans un milieu de différenciation ostéogénique ou chondrogénique.
Des milieux de différenciation ostéogénique et chondrogénique sont connus dans l'art. Sans limitation, les milieux de différenciation ostéogénique peuvent comprendre des milieux de base supplémentés avec de l'acide ascorbique, du ^-glycérophosphate et de la dexaméthasone. Sans limitation, les milieux de différenciation chondrogénique peuvent comprendre des milieux de base supplémentés avec de l'insuline, de la transferrine, du sélénite de sodium, de l'acide ascorbique, TGF-β-! du pyruvate de sodium et de la dexaméthasone.
Le détachement, le repiquage et la culture des cellules dérivées de CSM après l'étape (b) peuvent être effectués une ou plusieurs fois, par exemple une fois, deux fois, trois fois, quatre fois, cinq fois, six fois, sept fois, huit fois, neuf fois ou dix fois. Il apparaîtra à l'homme du métier que cela peut générer des cultures de cellules de passage 1 (P1), passage 2 (P2), passage 3 (P3), passage 4 (P4), passage 5 (P5), passage 6 (P6), passage 7 (P7), passage 8 (P8), passage 9 (P9) ou passage 10 (P10), respectivement. Le passage 0 (P0) peut désigner des CSM ou des cellules dérivées de CSM qui n'ont pas été détachées et/ou repiquées.
BE2018/5662 La différenciation de CSM, par exemple, en particulier, la différenciation osteogenique de CSM, conduit typiquement à des cellules dérivées de CSM qui ont une taille de cellule plus grande que les CSM à partir desquelles elles sont dérivées. Les inventeurs ont découvert que cette augmentation de taille de cellule ne se produit pas ou est réduite ou réduite au minimum lorsque des cellules dérivées de CSM sont obtenues à partir de CSM par mise en contact de CSM ou cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml. De telles cellules dérivées de CSM de plus petite taille présentent avantageusement des propriétés de transplantation améliorées, comme décrit présentement par ailleurs.
En conséquence, un autre aspect concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM, le procédé comprenant une étape de réduction de taille, dans lequel ladite étape de réduction de taille est caractérisée par la mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Le terme « réduction de taille », dans le présent contexte, désigne (i) des dimensions physiques ou une taille réduites de cellules dérivées de CSM (par exemple, telles que mesurées par la taille, le diamètre ou le volume moyens, ou une variable d'indication de taille de cellule adaptée, telle que D60, D65, D70, ou D75) obtenues par un procédé comprenant l'étape de réduction de taille par rapport à des cellules dérivées de CSM obtenues par un procédé identique par ailleurs ne comprenant pas l'étape de réduction de taille. La réduction de taille peut être une diminution de taille de cellule moyenne d'au moins 30 %, au moins 25 %, au moins 20 %, de préférence au moins 30 %, de cellules dérivées de CSM obtenues avec l'étape de réduction de taille par rapport à la taille de cellule moyenne de cellules dérivées de CSM obtenues sans l'étape de réduction de taille.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM tel que présentement décrit comprend une étape de culture de CSM in vitro ou ex vivo dans un milieu de culture supplémenté approprié pour atteindre un taux de prolifération élevée avec des caractéristiques de différenciation de stade précoce et tardif, ladite étape étant conduite simultanément avec ou avant l'étape de réduction de taille.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé peut comprendre la mise en contact de CSM avec un ou plusieurs agents capables d'induire l'expansion et/ou la différenciation de CSM simultanément avec ou avant la mise en contact des cellules avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Le terme « agent » désigne généralement une substance chimique quelconque (par exemple, inorganique ou organique), une substance, molécule ou macromolécule (par exemple, une matériaux ou tissus et/ou la
BE2018/5662 macromolécule biologique) biochimique ou biologique, une combinaison ou un mélange de ceux-ci, un échantillon de composition indéterminée, ou un extrait constitué de biologiques tels que des bactéries, des plantes des champignons ou des cellules animaux. Des exemples non limitatifs d'agents capables d'induire l'expansion différenciation de CSM sont des facteurs de croissance, tels que FGF-2 et TGF-β, et du plasma ou du sérum ou un substitut de ceux-ci. Il apparaîtra à l'homme du métier que le facteur de croissance ou la combinaison de facteurs de croissance peut être un facteur de croissance ou une combinaison de facteurs de croissance quelconque connu comme étant capable d'induire la différenciation de CSM en un type de cellules souhaité.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées tel que présentement décrit comprend en outre une étape de mise en contact de CSM ou cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2 et TGF-β. La mise en contact desdites CSM ou cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celleci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml est, de préférence, effectuée simultanément.
Dans des modes de réalisation particuliers, les CSM ou cellules dérivées de CSM sont en outre mises en contact avec, par exemple lorsque le milieu comprend en outre, l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci.
Comme décrit précédemment, les procédés détaillés ci-dessus produisent des cellules dérivées de CSM, ou des populations comprenant celles-ci, ayant des caractéristiques supérieures telles que, en particulier, une taille plus petite et plus homogène que les cellules dérivées de CSM décrites précédemment. La taille plus petite et plus homogène des cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par les procédés tels que présentement décrits rend les cellules ayant des propriétés de transplantation améliorées. Plus particulièrement, la taille plus petite et plus homogène des cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par les procédés tels que présentement décrits rend les cellules adaptées pour toutes les voies d'administration et, en particulier, l'administration intravasculaire, entre autres, par réduction ou élimination du risque d'embolie et d'infarctus pulmonaire, en offrant un profil de sécurité in vivo et/ou une seringabilité satisfaisants. En outre, les cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par les procédés tels que présentement décrits permettent qu'une concentration de cellules ajustable et élevée soit administrée à un site avec un volume administré limité.
Par conséquent, le procédé de l'invention peut être défini plus avant par la taille, caractérisée par le diamètre et/ou le volume d'une cellule, des cellules dérivées de CSM résultant de la mise en contact de CSM avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci.
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 30 μm, inférieur à 29 μm, inférieur à 28 μm, inférieur à 27 μm, inférieur à 26 μm, inférieur à 25 μm, ou inférieur à 24 μm. De préférence, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 24 μm.
Les termes « suspension » et « suspension de cellules » désignent généralement des cellules dérivées de CSM, en particulier des cellules dérivées de CSM viables, dispersées dans une phase liquide.
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est supérieur à 10 μm, supérieur à 11 μm, supérieur à 12 μm, supérieur à 13 μm, supérieur à 14 μm, supérieur à 15 μm, supérieur à 16 μm, supérieur à 17 μm ou supérieur à 18 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est compris entre 16 μm et 26 μm, de préférence entre 20 μm et 25 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm), égal ou inférieur à 24 μm (D60 < 24 μm), égal ou inférieur à 23 μm (D60 < 23 μm), égal ou inférieur à 22 μm (D60 < 22 μm), égal ou inférieur à 21 μm (D60 <21 μm), ou égal ou inférieur à 20 μm (D60 <20 μm), de préférence égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, au moins 65% des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D65 < 25 μm), égal ou inférieur à 24 μm (D65 < 24 μm), égal ou inférieur à 23 μm (D65 < 23 μm), égal ou inférieur à 22 μm (D65 < 22 μm), égal ou inférieur à 21 μm (D65 <21 μm), ou égal ou inférieur à 20 μm (D65 <20 μm), de préférence égal ou inférieur à 25 μm (D65 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, au moins 70% des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D70 < 25 μm), égal ou inférieur à 24 μm (D70 < 24 μm), égal ou inférieur à 23 μm (D70 < 23 μm), égal ou inférieur à 22 μm (D70 < 22 μm), égal ou inférieur à 21 μm (D70 <21 μm), ou égal ou inférieur à 20 μm (D70 <20 μm), de préférence égal ou inférieur à 25 μm (D70 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, au moins 75 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D75 < 25 μm), égal ou inférieur à 24 μm (D75 < 24 μm), égal ou inférieur à 23 μm (D75 < 23 μm), égal ou inférieur à 22 μm (D75 < 22 μm), égal ou inférieur à 21 μm (D75 <21 μm), ou égal ou inférieur à 20 μm (D75 <20 μm), de préférence égal ou inférieur à 25 μm (D75 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un D60 égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm. Dans des modes de réalisation particuliers, les
BE2018/5662 cellules dérivées de CSM en suspension ont un D65 égal ou inférieur à 25 μm (D65 < 25 μm)et au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un D70 égal ou inférieur à 25 μm (D70 < 25 μm) et au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un
D75 égal ou inférieur à 25 μm (D75 < 25 μm) et au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un
D60 compris entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 25 μm), entre environ 24 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 24 μm), entre environ 23 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 23 μm), entre environ 22 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 22 μm), entre environ 21 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 21 μm) ou entre environ 20 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 20 μm), de préférence entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D60 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un
D65 compris entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 25 μm), entre environ 24 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 24 μm), entre environ 23 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 23 μm), entre environ 22 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 22 μm), entre environ 21 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 21 μm) ou entre environ 20 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 20 μm), de préférence entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D65 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un
D70 compris entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 25 μm), entre environ 24 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 24 μm), entre environ 23 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 23 μm), entre environ 22 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 22 μm), entre environ 21 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 21 μm) ou entre environ 20 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 20 μm), de préférence entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D70 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un
D75 compris entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 25 μm), entre environ 24 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 24 μm), entre environ 23 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 23 μm), entre environ 22 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 22 μm), entre environ 21 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 21 μm) ou entre environ 20 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 20 μm), de préférence entre environ 25 μm et environ 10 μm (10 μm < D75 < 25 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, au moins 90% des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 30 μm (D90 < 30 μm), égal ou inférieur à 29 μm (D90 < 29 μm), égal ou inférieur à 28 μm (D90 < 28 μm), égal ou inférieur à 27 μm (D90 < 27 μm), égal ou inférieur à 26 μm (D90 < 26 μm), ou égal ou inférieur à 25 μm (D90 < 25 μm), de préférence égal ou inférieur à 30 μm (D90 < 30 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un D90 égal ou inférieur à 30 μm (D90 < 30 μm) et au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM en suspension ont un D90 compris entre environ 30 μm et environ 10 μm (10 μm < D90 < 30 μm).
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est supérieur à 10 μm, supérieur à 11 μm, supérieur à 12 μm, supérieur à 13 μm, supérieur à 14 μm ou supérieur à 15 μm, de préférence supérieur à 10 μm.
Le diamètre d'une cellule peut être déterminé par un procédé quelconque connu dans l'art, par exemple au moyen d'un microscope numérique et d'un logiciel associé pour l'analyse d'image (par exemple, Motic Image Plus 2.02). Le diamètre de cellule moyen présentement mentionné doit être déterminé sur la base du diamètre des cellules dans un état libre, non fixé, c'est-à-dire des cellules en suspension. Les cellules sont, de préférence, mises en suspension dans une solution comprenant un tampon transparent, non toxique, isotonique, tel que PBS, et facultativement un colorant pour différencier les cellules vivantes et mortes, tels que le bleu de trypan. De préférence, au moins cent cellules doivent être mesurées pour considérer l'analyse statistiquement significative.
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est inférieur à 38 μm, inférieur à 37 μm, inférieur à 36 μm, inférieur à 35 μm, de préférence inférieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'écart type du diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 7,0 μm, inférieur à 6,5 μm, inférieur à 6,0 μm, inférieur à 5,5 μm, inférieur à 5 μm, inférieur à 4,5 μm, inférieur à 4 μm ou inférieur à 3,5 μm. De préférence, l'écart type du diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 4,0 μm, par exemple entre 3,0 et 3,5 μm.
Les inventeurs ont découvert que la distribution de taille de cellule de cellules dérivées de CSM obtenues par les procédés tels que présentement décrits est stable. En conséquence, le diamètre et/ou le volume des cellules dérivées de CSM obtenues par les procédés tels que présentement décrits peut être déterminé à un temps quelconque et à une confluence quelconque pendant une culture in vitro. Dans des modes de réalisation préférés, le diamètre et/ou le volume des cellules dérivées de CSM est déterminé lorsque les cellules atteignent une confluence comprise entre 30 % et 80 %, de préférence entre 40 % et 70 %, tel que 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % ou 70 %.
Un autre aspect concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de C SM 18/5662 comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 25 μm, par exemple inférieur à 24 μm ou, par exemple, compris entre 20 μm et 25 μm.
Un autre aspect concerne un procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm), de préférence au moins 70 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D70 < 25 μm), et au plus 5 % de la population de cellules ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Il apparaîtra à l'homme du métier que tous les modes de réalisation précédemment décrits, comprenant les modes de réalisation relatifs aux diamètre moyen des cellules dérivées de CSM, diamètre individuel maximal des cellules dérivées de CSM, volume moyen des cellules dérivées de CSM, D60, D65, D70, D75, D90, concentration d'héparine ou dérivé ou analogue de celle-ci, lignée de cellules dérivées de CSM et agents capables d'induire l'expansion et/ou la différenciation de CSM, s'appliquent à tous les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM tels que présentement décrits.
Un autre aspect concerne une population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par expansion de CSM in vitro ou ex vivo, dans laquelle le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 30 μm, inférieur à 29 μm, inférieur à 28 μm, inférieur à 27 μm, inférieur à 26 μm, inférieur à 25 μm ou inférieur à 24 μm. De préférence, le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 24 μm.
Un autre aspect concerne une population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenue par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, dans laquelle au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm), de préférence au moins 70 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D70 < 25 μm), et au plus 5 % de la population de cellules ont un diamètre supérieur à 35 μm. Le terme « population », dans le présent contexte, désigne un groupe sensiblement pur (c'est-à-dire, principalement composé de) et homogène de cellules d'un type de cellules dérivées de CSM souhaité.
Dans des modes de réalisation particuliers, le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est inférieur à 38 μm, inférieur à 37 μm, inférieur à 36 μm, de préférence inférieur à 35 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, l'écart type du diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 6,0 μm, inférieur à 5,5 μm, inférieur à 5,0 μm, inférieur à 4,5 μm, inférieur à 4,0 μm ou inférieur à 3,5 μm. De préférence, l'écart typ§Edfl 18/5662 diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 4,0 μm, par exemple entre 3,0 et 3,5 μm.
Dans des modes de réalisation particuliers, la population de cellules dérivées de CSM peut être obtenue par les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM telles que présentement décrites.
Il apparaîtra à l'homme du métier que tous les modes de réalisation précédemment décrits, comprenant les modes de réalisation relatifs aux diamètre moyen des cellules dérivées de CSM, diamètre individuel maximal des cellules dérivées de CSM, volume moyen des cellules dérivées de CSM, D60, D65, D70, D75, D90, concentration d'héparine ou dérivé ou analogue de celle-ci, lignée de cellules dérivées de CSM et agents capables d'induire l'expansion et/ou la différenciation de CSM, s'appliquent à tous les procédés d'obtention de cellules dérivées de CSM a partir de CSM tels que présentement décrits et, par conséquent, également aux cellules dérivées de CSM et à une population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par lesdits procédés tel que présentement décrit.
En conséquence, un autre aspect concerne une composition comprenant les cellules dérivées de CSM ou la population de cellules dérivées de CSM telle que présentement définie. L'invention concerne en outre des compositions comprenant les cellules dérivées de CSM ou la population de cellules dérivées de CSM présentement décrites et comprenant en outre un ou plusieurs autre composants. Par exemple, des composants peuvent être inclus qui peuvent maintenir ou augmenter la viabilité de cellules. À titre d'exemple et sans limitation, de tels composants peuvent comprendre des sels pour assurer des conditions sensiblement isotoniques, des stabilisants de pH tels qu'un ou des système(s) tampon(s) (par exemple, pour assurer un pH sensiblement neutre, tel qu'un système tampon phosphate ou carbonate), des protéines de support telles que, par exemple, l'albumine, des milieux comprenant des milieux de base et/ou des suppléments de milieu, du sérum ou du plasma, des nutriments, des sources de glucide, des conservateurs, des stabilisants, des antioxydants ou d'autres matériaux connus de l'homme du métier. L'invention concerne en outre des procédés de production desdites compositions par mélange des cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM respectives avec lesdits un ou plusieurs composants supplémentaires tels que décrits cidessus. Les compositions peuvent être, par exemple, liquides ou peuvent être semi-solides ou solides (par exemple, peuvent être des compositions congelées ou peuvent exister sous forme de gel ou peuvent exister sur un support ou échafaudage solide, etc.). Des cryoconservateurs tels que, entre autres, le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont connus dans l'art.
Les termes « composition », « formulation », ou « préparation » peuvent être utilisés présentement de manière interchangeable.
Dans des modes de réalisation particuliers, la composition est une composition pharmaceutique 18/5662 comprenant les cellules dérivées de CSM ou la population de cellules dérivées de CSM telles que présentement définies, et facultativement un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable », dans le présent contexte, est conforme à l'art connexe et signifie : compatible avec les autres composants d'une composition pharmaceutique et non délétère pour le receveur de celle-ci.
Dans le présent contexte, « véhicule » ou « excipient » comprend l'un quelconque et l'ensemble des solvants, diluants, tampons (par exemple, tampon salin neutre ou tampon phosphate salin), solubilisants, colloïdes, milieux de dispersion, véhicules, charges, agents chélateurs (par exemple, EDTA ou glutathion), acides aminés (par exemple, glycine), protéines, délitants, liants, lubrifiants, agents mouillants, émulsifiants, édulcorants, colorants, arômes, aromatisants, épaississants, agents pour obtenir un effet retard, enrobages, agents antifongiques, conservateurs, stabilisants, antioxydants, agents de contrôle de tonicité, agents retardant l'absorption, et similaire. L'utilisation de tels milieux et agents pour des substances pharmaceutiques actives est connue dans l'art. De tels matériaux doivent être non toxiques et ne doivent pas interférer avec l'activité des cellules.
La nature précise du véhicule, de l'excipient ou d'un autre matériau dépendra de la voie d'administration. Par exemple, la composition peut être sous la forme d'une solution aqueuse acceptable par voie parentérale, qui est apyrogène et a un pH, une isotonicité et une stabilité adaptés. Pour des principes généraux en formulation médicinale, le lecteur peut consulter Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, de G. Morstyn et W. Sheridan éd., Cambridge University Press, 1996 ; et Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister et P. Law, Churchill Livingstone, 2000.
Des compositions pharmaceutiques liquides peuvent généralement comprendre un véhicule liquide tel que l'eau ou une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, une solution saline physiologique, un milieu de culture de tissu ou de cellules, une solution de dextrose ou d'un autre saccharide ou des glycols tels que l'éthylène glycol, le propylène glycol ou le polyéthylène glycol peuvent être inclus.
La composition peut comprendre une ou plusieurs molécules de protection cellulaire, molécules de régénération cellulaire, facteurs de croissance, facteurs antiapoptotiques ou facteurs qui régulent l'expression génique dans les cellules. De telles substances peuvent rendre les cellules indépendantes de leur environnement.
De telles compositions pharmaceutiques peuvent contenir en outre des composants assurant la viabilité des cellules contenues dans celles-ci. Par exemple, les compositions peuvent comprendre un système tampon adapté (par exemple, un système tampon phosphate ou carbonate) pour obtenir un pH souhaitable, le plus souvent un
L, . . . . ...BE2Q18/5662 pH proche de la neutralité, et peuvent comprendre suffisamment de sel pour assurer des conditions iso-osmotiques pour les cellules afin d'éviter un stress osmotique. Par exemple, une solution adaptée à cet effet peut être un tampon phosphate salin (PBS), une solution de chlorure de sodium, une solution pour injection de Ringer ou une solution pour injection de Ringer-lactate, comme cela est connu dans l'art. En outre, la composition peut comprendre une protéine de support, par exemple l'albumine (par exemple, l'albumine bovine ou humaine), qui peut augmenter la viabilité des cellules.
D'autres véhicules ou additifs pharmaceutiquement acceptables adaptés sont connus de l'homme du métier et, par exemple, peuvent être choisis parmi des protéines telles que le collagène ou la gélatine, des glucides tels que l'amidon, des polysaccharides, des sucres (dextrose, glucose et saccharose), des dérivés de cellulose tels que la carboxyméthylcellulose sodique ou calcique, l'hydroxypropylcellulose ou l'hydroxypropylméthylcellulose, des amidons prégélatinisés, la pectine gélosée, le carraghénane, des argiles, des gommes hydrophiles (gomme d'acacia, gomme de guar, gomme arabique et gomme xanthane), l'acide alginique, des alginates, l'acide hyaluronique, l'acide polyglycolique et polylactique, le dextrane, des pectines, des polymères synthétiques tels qu'un polymère acrylique hydrosoluble ou la polyvinylpyrrolidone, des protéoglycanes, le phosphate de calcium et similaire.
Le cas échéant, une préparation de cellules peut être administrée sur un support, un échafaudage, une matrice ou un matériau pour améliorer la régénération de tissu. Par exemple, le matériau peut être une céramique granulaire ou un biopolymère tel que la gélatine, le collagène ou le fibrinogène. Des matrices poreuses peuvent être synthétisées selon des techniques standard (par exemple, Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993 ; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994 ; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997). Un tel support, échafaudage, matrice ou matériau peut être biodégradable ou non biodégradable. Par conséquent, les cellules peuvent être transférées et/ou cultivées sur un substrat adapté, tel qu'un substrat poreux ou non poreux, pour produire des implants. Par exemple, des cellules qui ont proliféré ou qui sont différenciées dans des boîtes de culture peuvent être transférées sur des supports solides tridimensionnels afin de les amener à se multiplier et/ou continuer le processus de différenciation par incubation du support solide dans un milieu nutritif liquide de l'invention, si nécessaire. Les cellules peuvent être transférées sur un support solide tridimensionnel, par exemple, par imprégnation dudit support avec une suspension liquide contenant lesdites cellules. Les supports imprégnés obtenus ainsi peuvent être implantés dans un sujet. De tels supports imprégnés peuvent également être recultivés par immersion de ceuxci dans un milieu de culture liquide, avant d'être finalement implantés. Le support solide tridimensionnel n'est pas nécessairement biocompatible pour pouvoir être implanté dans un humain. Il peut être biodégradable ou non biodégradable.
Les cellules ou populations de cellules peuvent être administrées d'une manière qui leur peBme 18/5662 de survivre, croître, se propager et/ou se différencier dans les types de cellules souhaités tels que, par exemple, des hépatocytes. Les cellules ou populations de cellules peuvent être greffées ou peuvent migrer vers et se greffer à l'organe souhaité tel que, par exemple, le foie. Le greffage de cellules ou de populations de cellules à d'autres emplacements, tissus ou organes tels que le foie, la rate, le pancréas, la capsule rénale, le péritoine ou l'omentum peut être envisagé.
Dans un mode de réalisation, la préparation de cellules pharmaceutique telles que définie cidessus peut être administrée sous forme de composition liquide. Dans des modes de réalisation, les cellules ou la composition pharmaceutique comprenant celles-ci peuvent être administrées par voie systémique, topique, dans un organe, à un site de dysfonctionnement ou de lésion d'organe ou à un site de lésion tissulaire.
De préférence, les compositions pharmaceutiques peuvent comprendre une quantité thérapeutiquement efficace des cellules souhaitées. Le terme « quantité thérapeutiquement efficace » désigne une quantité qui peut induire une réponse biologique ou thérapeutique dans un tissu, un système, un animal ou un être humain, qui est recherchée par un chercheur, un vétérinaire, un médecin ou un autre clinicien et, en particulier, peut soulager un ou plusieurs des symptômes ou caractéristiques locaux ou systémiques d'une maladie ou affection devant être traitée. Des quantités thérapeutiquement efficaces appropriées peuvent être déterminées par un médecin qualifié en tenant dûment compte de la nature des cellules souhaitées, de l'état et de la sévérité de la maladie ainsi que de l'âge, la taille et l'état du sujet.
L'invention concerne en outre des procédés de production desdites compositions pharmaceutiques par mélange des cellules de l'invention avec un ou plusieurs composants supplémentaires tels que décrits ci-dessus, ainsi qu'avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques tels que décrits ci-dessus.
L'invention concerne en outre un agencement ou un kit de composants comprenant un instrument ou dispositif chirurgical pour l'administration des cellules dérivées de CSM ou de la population de cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites ou les compositions pharmaceutiques telles que présentement définies à un sujet, telle que, par exemple, par voie systémique, par exemple, par injection, et comprenant en outre les cellules dérivées de CSM ou la population de cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites ou les compositions pharmaceutiques telles que présentement définies.
Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique telles que définie ci-dessus peut être administrée sous forme de composition liquide ou visqueuse.
Dans des aspects connexes, l'invention concerne les cellules dérivées de CSM ou populations de cellules dérivées de CSM définies ci-dessus ou la composition pharmaceutique comprenant
BE2018/5662 lesdites cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM pour utilisation en tant que médicament. Dans des aspects connexes, l'invention concerne les cellules dérivées de CSM ou populations de cellules dérivées de CSM définies ci-dessus ou la composition pharmaceutique comprenant lesdites cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM pour utilisation dans le traitement d'un sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM. Dans des aspects connexes, l'invention concerne in procédé de traitement d'un sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM comprenant l'adm audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace des cellules dérivées de CSM définies ou populations de cellules dérivées de CSM définies ci-dessus ou de la composition pharmaceutique comprenant lesdites cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM au sujet. Dans des aspects connexes, l'invention concerne l'utilisation des cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM définies ci-dessus ou composition comprenant lesdites cellules dérivées de CSM ou une population de cellules dérivées de CSM pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM.
Dans le présent contexte, les termes « traiter » ou « traitement » désignent à la fois un traitement thérapeutique et des mesures prophylactiques ou préventives, l'objectif étant de prévenir ou de ralentir (diminuer) un changement ou un trouble physiologique indésirable. Les résultats cliniques bénéfiques ou souhaités comprennent, mais ne sont pas limités à, l'atténuation des symptômes, la diminution de l'étendue de la maladie, un état stabilisé (c'est-àdire, sans aggravation) de la maladie, le retard ou le ralentissement de la progression de la maladie et de l'apparition de complications, l'amélioration ou la palliation de l'état pathologique. «Traitement» peut également signifier prolonger la survie par rapport à la survie prévue en l'absence du traitement.
L'expression « sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM », dans le présent contexte, comprend des sujets, tels que des sujets mammifères ou humains, qui pourraient bénéficier du traitement d'une affection donnée, de préférence d'une affection ou d'une maladie telle que décrite ci-dessus. De tels sujets comprendront typiquement, sans limitation, ceux qui ont été diagnostiqués avec l'affection, ceux qui sont susceptibles d'avoir ou de développer l'affection en question et/ou ceux chez qui la maladie doit être prévenue.
Le terme « greffe » ou « greffe de cellules » a sa signification usuelle et, en particulier, désigne l'administration de cellules à un sujet. Le terme « greffe de cellules » peut être utilisé de façon interchangeable avec « thérapie cellulaire ». Une greffe de cellules peut être effectuée par une technique quelconque connue dans l'art. À titre d'exemple, et sans limitation, des cellules peuvent être transplantées par perfusion dans un sujet. Typiquement, une perfusion de cellules peut être effectuée par voie parentérale, par exemple, par voie intravasculaire, par voie souscutanée, par voie intradermique ou par voie intramusculaire, de préférence par voie
BE2018/5662 intravasculaire. Des cellules peuvent être administrées par exemple, et sans limitation, par voie systémique, topique ou au site d'une lésion. Il peut être clair que, suivant l'application spécifique, les tissus ciblés, un ajustement de l'objectif thérapeutique ou du type de cellules peut être effectué en conséquence, compte tenu des voies d'administration, ainsi que des formulations, concentrations, etc.
La taille de cellule homogène et petite des cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites conduit à une toxicité aiguë réduite ou supprimée après administration intraveineuse desdites cellules à un sujet. Par conséquent, les cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites sont particulièrement adaptées pour administration intravasculaire ou percutanée.
Par conséquent, dans des modes de réalisation particuliers, les cellules dérivées de CSM ou population de cellules dérivées de CSM définies ci-dessus ou la composition pharmaceutique peuvent être administrées audit sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM par voie percutanée ou intravasculaire.
De plus, les inventeurs ont découvert que des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou lignée ostéoblastique seraient obtenues par les procédés tels que présentement décrits qui ont des propriétés ostéoformatrices plus puissantes.
En conséquence, dans un mode de réalisation particuliers, ladite affection ou maladie est une maladie musculosquelettique.
Le terme « maladie musculosquelettique », dans le présent contexte, désigne un type quelconque de maladie osseuse, maladie musculaire, maladie articulaire ou chondrodystrophie, dont le traitement peut bénéficier de l'administration de la présent formulation pharmaceutique à un sujet ayant la maladie. En particulier, une telle maladie peut être caractérisée, par exemple, par une formation réduite d'os et/ou de cartilage ou une résorption excessive d'os et/ou de cartilage, un nombre, une viabilité ou une fonction réduite des ostéoblastes ou des ostéocytes présents dans l'os et/ou des chondroblastes ou des chondrocytes présents dans le cartilage, une diminution de la masse osseuse et/ou de la masse cartilagineuse chez un sujet, l'amincissement des os, la diminution de la résistance ou de l'élasticité des os, etc.
Des exemples non limitatifs de maladies musculosquelettiques peuvent comprendre des troubles locaux ou systémiques, tels que tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple primaire, post-ménopausique, sénile, induite par les corticoïdes, induite par les biphosphonates et induite par une radiothérapie ; tout type d'ostéonécrose secondaire, mono- ou multisite, tout type de fracture, par exemple, des fractures non consolidées, mal consolidées, à consolidation retardée ou une compression, des fractures maxillo-faciales ; des affections nécessitant une fusion osseuse (par exemple, des fusions et des reconstructions vertébrales) ; un défaut osseux congénital ; une reconstruction osseuse, par exemple, après une lésion traumatique ou une
BE2018/5662 chirurgie d'un cancer et une reconstruction osseuse cranio-faciale ; une arthrite traumatique, une lésion cartilagineuse et/ou articulaire focale, l'arthrite focale dégénérative ; l'arthrose, l'arthrite dégénérative, la gonarthrose et la coxarthrose ; l'ostéogenèse imparfaite ; un cancer osseux ostéolytique ; la maladie de Paget ; des troubles endocrinologiques; l'hypophosphatémie ; l'hypocalcémie ; l'ostéodystrophie rénale ; l'ostéomalacie ; une maladie osseuse adynamique, l'hyperparathyroïdie, l'hyperparathyroïdie primaire, l'hyperparathyroïdie secondaire; une maladie parodontale; la maladie de Gorham-Stout et le syndrome de McCuneAlbright ; la polyarthrite rhumatoïde ; les spondylarthropathies, comprenant la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, l'arthropathie entéropathique et une spondylarthrite indifférenciée et l'arthrite réactive ; le lupus érythémateux disséminé et des troubles apparentés ; la sclérodermie et des troubles associés ; le syndrome de Sjogren ; systémique, comprenant l'artérite à cellules géantes (maladie de Horton), Takayasu, la polymyalgie rhumatismale, la vascularite associée aux ANCA granulomatose de Wegener, la polyangéite microscopique et le syndrome de Churg-Strauss), le syndrome de Behçet et d'autres polyartérites et troubles associés (tels que la polyartérite noueuse, le syndrome de Cogan et la maladie de Buerger) ; l'arthrite accompagnant d'autres maladies inflammatoires systémiques, comprenant l'amylose et la sarcoïdose ; des arthropathies cristallines, comprenant la goutte, la maladie à cristaux de pyrophosphate de calcium dihydraté, des troubles ou des syndromes associés au dépôt articulaire de cristaux de phosphate de calcium ou d'oxalate de calcium ; la chondrocalcinose et l'arthropathie neuropathique ; le syndrome de Felty et le syndrome de Reiter ; la maladie de Lyme et le rhumatisme articulaire aigu.
la vascularite l'artérite de (telle que la
Dans un mode de réalisation particulier, ladite affection ou maladie est un trouble osseux.
En conséquence, le terme « trouble osseux », dans le présent contexte, désigne un type quelconque de maladie osseuse, dont le traitement peut bénéficier de la greffe de cellules ayant des propriétés ostéoformatrices, par exemple, des ostéochondroprogéniteurs, des ostéoprogéniteurs, des préostéoblastes, des ostéoblastes ou des cellules ayant un phénotype d'ostéoblastes à un sujet ayant le trouble. En particulier, de tels troubles peuvent être caractérisés, par exemple, par une formation osseuse réduite ou une résorption osseuse excessive, par un nombre, une viabilité ou une fonction réduit des ostéoblastes ou des ostéocytes présents dans les os, une masse osseuse réduite chez un sujet, un amincissement des os, une altération de la résistance de l'élasticité des os, etc.
À titre d'exemple, mais sans limitation, les troubles osseux qui peuvent bénéficier d'une greffe de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de formation osseuse (par exemple, des cellules de lignée ostéoblastique) obtenues par le procédé selon la présente invention peuvent comprendre des troubles locaux ou systémiques, tels que, tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple, primaire, postménopausique, sénile, induite par les corticoïdes, tout type d’ostéonécrose secondaire, mono- ou multisite, tout type de fracture, par exempleBdes 18/5662 fractures non consolidées, mal consolidées, à consolidation retardée ou une compression, des affections nécessitant une fusion osseuse (par exemple, des fusions et des reconstructions vertébrales), des fractures maxillo-faciales, une reconstruction osseuse, par exemple, après une lésion traumatique ou une chirurgie d’un cancer, une reconstruction osseuse crânio-faciale, l’ostéogenèse imparfaite, un cancer des os ostéolytique, la maladie de Paget, des troubles endocrinologiques , une hypophosphatémie, une hypocalcémie, une ostéodystrophie rénale, une ostéomalacie, une maladie osseuse adynamique, la polyarthrite rhumatoïde, l’hyperparathyroïdie, l’hyperparathyroïdie primaire, l’hyperparathyroïdie secondaire, une maladie parodontale, la maladie de Gorham-Stout et le syndrome de McCune-Albright.
Les cellules dérivées de CSM, la population de cellules dérivées de CSM et les compositions pharmaceutiques présentement décrites peuvent être utilisées seules ou en combinaison avec l’un quelconque des thérapies ou des composés actifs connus pour les troubles respectifs. L’administration peut être simultanée ou séquentielle dans un ordre quelconque, comme décrit par ailleurs.
Si les cellules sont dérivées d’une source hétérologue (c’est-à-dire, non autologue, non homologue ou non allogénique), un traitement d’immunosuppression concomitant peut être typiquement administré, par exemple, en utilisant des agents immunosuppresseurs, tels que la cyclosporine ou le tacrolimus (FK506).
La quantité de cellules à administrer variera suivant le sujet traité. Dans un mode de réalisation préféré, la quantité de cellules à administrer est comprise entre 102 et 1010 ou entre 102 et 109, ou entre 103 et 1010 ou entre 103 et 109, ou entre 104 et 1010 ou entre 104 et 109, par exemple entre 104 et 108, ou entre 105 et 107, par exemple, environ 1x105, environ 5x105, environ 1x106, environ 5x106, environ 1x107, environ 5x107, environ 1x108, environ 5x108, environ 1x109, environ 2x109, environ 3x109, environ 4x109, environ 5x109, environ 6x109, environ 7x109, environ 8x109, environ 9x109 ou environ 1x1010 cellules peuvent être administrées à un sujet humain. Dans des modes de réalisations supplémentaires, entre 106 et 108 cellules par kg de poids corporel, par exemple, environ 1x107 à 9x107 cellules par kg de poids corporel, par exemple, environ 1x107, environ 2x107, environ 3x107, environ 4x107, environ 5x107, environ 6x107, environ 7x107, environ 8x107, environ 9x107 ou environ 1x108 cellules par kg de poids corporel peuvent être administrées à un sujet humain. Par exemple, un tel nombre de cellules ou un tel nombre de cellules par kg de poids corporel peut désigner, en particulier, le nombre total de cellules à administrer à un sujet, ladite administration pouvant être répartie de manière appropriée dans une ou plusieurs doses (par exemple, répartie dans 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 doses ou plus) administrées sur un ou plusieurs jours (par exemple, sur 1, 2, 3, 4 ou 5 jours ou plus). Cependant, la détermination précise d’une dose thérapeutiquement efficace peut être basée sur des facteurs individuels pour chaque patient, comprenant ses taille, âge, taille des , 4.-1- 414 I . II'· 4 4 .BE2018/5662 dommages tissulaires, et le temps écoulé depuis que les lesions sont survenues, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier à partir de la présente description et des connaissances dans l'art.
De manière appropriée, dans une composition pour administration, les cellules peuvent être présentes à une concentration comprise entre environ 104/ml et environ 109/ml, de préférence entre environ 105/ml et environ 108/ml, encore plus préférablement entre environ 1x106/ml et environ 1x108/ml, encore plus préférablement entre environ 1x107/ml et environ 1x108/ml, telle que, par exemple, environ 7,5x107/ml. La taille de cellule réduite des cellules dérivées de CSM telles que présentement décrites permet d'obtenir une concentration de cellules ajustable et/ou élevée. En conséquence, si la composition est une composition liquide, le volume de la composition comprenant des cellules dérivées de CSM obtenues par le procédé tel que présentement décrit pour administration au sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM est inférieur au volume de la composition comprenant des cellules dérivées de CSM obtenues par d'autres procédés.
Par conséquent, les aspects et les modes de réalisation de la présente invention couvrent, et la présente spécification décrit, l'objet tel que décrit dans l'une quelconque et l'ensemble des déclarations suivantes :
Déclaration 1. Procédé d'obtention de cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses à partir de de cellules souches mésenchymateuses (CSM) comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
Déclaration 2. Procédé selon la déclaration 1, comprenant les étapes de :
(a) culture de CSM récupérées à partir d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml ;
(b) élimination de la matière non adhérente et poursuite de la culture des cellules adhérentes dans le milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, de façon à obtenir les cellules dérivées de CSM.
Déclaration 3. Procédé selon la déclaration 1 ou 2, dans lequel TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-β! TGF^2, TGF^3, et des mélanges de ceux-ci ; de préférence dans lequel TGF-β est TGF-β!
Déclaration 4. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM, le procédé comprenant une étape de réduction de taille, dans lequel ladite étape de réduction de taille est caractérisée par la mise en contact de
CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivéEOu 18/5662 analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml.
Déclaration 5. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 4, dans lequel la concentration d'héparine ou d'un dérivé ou analogue de celle-ci est d'au moins 0,05 UI/ml, de préférence d'environ 0,1 UI/ml.
Déclaration 6. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 5, dans lequel l'héparine ou le dérivé d'héparine ou l'analogue est choisi dans le groupe constitué d'une héparine non fractionnée (HNF) ; d'une héparine de bas poids moléculaire (HBPM), telle que l'énoxaparine, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la réviparine, l'ardéparine, la parnaparine, la bémiparine, ou des mélanges de celles-ci ; d'un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparane, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou des mélanges de ceux-ci, tel que le danaparoïde ; d'un sel d'héparine ; d'un sel d'héparinoïde ; d'un fragment d'héparine ; d'un fragment d'héparinoïde ; et des mélanges de ceux-ci.
Déclaration 7. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 6, dans lequel le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 25 μm, par exemple inférieur à 24 μm, tel qu'entre 20 μm et 25 μm.
Déclaration 8. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 7, dans lequel le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est inférieur à 35 μm.
Déclaration 9. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 8, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans lequel au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Déclaration 10. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 9, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique.
Déclaration 11. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 10, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéoblastique ou chondroblastique, de préférence de lignée ostéoblastique.
Déclaration 12. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 1 à 11, dans lequel les CSM sont en outre mises en contact avec, par exemple lorsque le milieu comprend en outre, l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci.
Déclaration 13. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 25 μm, par exemple inférieur à 24 μm ou, par exemple, compris entre 20 μm et 25 μm.
Déclaration 14. Procédé selon la déclaration 13, dans lequel le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est inférieur à 35 μm.
Déclaration 15. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans lequel au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Déclaration 16. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 13 à 15, dans lequel les CSM sont mises en contact avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml.
Déclaration 17. Procédé selon l'une quelconque des déclarations 13 à 16, dans lequel TGF-ß est choisi dans le groupe constitué de TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, et des mélanges de ceux-ci ; de préférence dans lequel TGF-ß est TGF-ß1.
Déclaration 18. Population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenue par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, dans laquelle le diamètre moyen des cellules dérivées de CSM en suspension est inférieur à 25 μm, par exemple inférieur à 24 μm, tel qu'entre 20 μm et 25 μm.
Déclaration 19. Population de cellules dérivées de CSM selon la déclaration 18, dans laquelle le diamètre de chaque cellule dérivée de CSM en suspension est inférieur à 35 μm.
Déclaration 20. Population de cellules dérivées de CSM pouvant être obtenues par expansion in vitro ou ex vivo de CSM, dans laquelle au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans laquelle au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
Déclaration 21. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 20, dans laquelle les cellules dérivées de CSM peuvent être obtenues par un procédé comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-ß et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci.
Déclaration 22. Population de cellules dérivées de CSM selon la déclaration 21, dans laquelle des CSM sont mises en contact avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 Ul/ml.
Déclaration 23. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 22, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique.
Déclaration 24. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 23, dans laquelle les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéoblastique ou chondroblastique, de préférence de lignée ostéoblastique.
Déclaration 25. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 24, dans laquelle les CSM sont en outre mises en contact avec l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci.
Déclaration 26. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 25, dans laquelle TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-β! TGFβ2, TGF^3, et des mélanges de ceux-ci ; de préférence dans laquelle TGF-β est TGF-β!
Déclaration 27. Population de cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique selon l'une quelconque des déclarations 23 à 27, dans laquelle sensiblement toutes les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique sont positives pour CD90, CD105, CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement toutes les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique sont négatives pour CD45, CD14 et CD19 ; au moins 70 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique sont positives pour HLA-DR.
Déclaration 28. Composition pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM telle que définie dans l'une quelconque des déclarations 18 à 27.
Déclaration 29. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 27 ou composition pharmaceutique selon la déclaration 28 pour utilisation en tant que médicament.
Déclaration 30. Population de cellules dérivées de CSM pour utilisation selon la déclaration 29, la population de cellules dérivées de CSM étant présente à une concentration comprise entre environ 1 x 107/ml et environ 1 x 108/ml, de préférence 7,5 x 107 cellules/ml.
Déclaration 31. Population de cellules dérivées de CSM selon l'une quelconque des déclarations 18 à 27 ou composition pharmaceutique selon la déclaration 28 pour utilisation dans le traitement d'un sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM.
Déclaration 32. Population de cellules dérivées de CSM pour utilisation selon l'une quelconque des déclarations 29 à 31, la population de cellules dérivées de CSM ou la composition pharmaceutique étant adaptée pour administration percutanée ou intravasculaire.
Bien que l'invention ait été décrite en référence à des modes de réalisation spécifiques de celleci, il est évident que de nombreuses alternatives, modifications et variations apparaîtront à l'homme du métier à la lecture de la description faite ci-dessus. En conséquence, elle est §E2018/5662 ans l'esprit et la portée au sens large des revendications annexées.
Les aspects et modes de réalisation ci-dessus sont en outre étayés par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : procédé d’obtention de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM de petite taille
1. Procédures expérimentales
1.1 Collecte de moelle osseuse humaine et cultures de CSM de moelle osseuse humaines à 60 ml d'aspirations de moelle osseuse (BM) humaine sont obtenus à partir de la crête iliaque de 8 donneurs volontaires sains. Après la collecte, les globules blancs de moelle osseuse sont comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans un milieu de culture conventionnel contenant 1 % de pénicilline-streptomycine et incubés à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Après 24 heures, les cellules non adhérentes sont retirées par rinçage avec du tampon phosphate salin (PBS) (Lonza BioWhittaker®) et du milieu frais est ajouté. Le milieu de culture est remplacé tous les 2 à 3 jours. Les colonies de cellules adhérentes sont cultivées jusqu'à ce que 80 % de confluence des cellules soit atteint. Les cellules sont ensuite détachées avec trypsine-EDTA (TrypZean® EDTA, Lonza BioWhittaker®). L'activité trypsine est neutralisée par du tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS). Les cellules sont comptées et repiquées pour une culture supplémentaire. Le milieu de culture est remplacé tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce que 80 % de confluence des cellules soit atteint. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont détachées comme décrit cidessus.
1.2 Cellules ostéoformatrices dérivées de CSM et culture de cellules et préparation de plasma
Comme décrit ci-dessus, 20 à 60 ml de moelle osseuse (BM) héparinée sont obtenus à partir de la crête iliaque de 8 donneurs volontaires sains. Après la collecte, la moelle osseuse est ensemencée dans des fioles de culture à une densité de globules blancs fixe (50 000 cellules/cm2) et cultivée soit
- pour obtenir des cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM dérivées de CSM : un milieu de culture conventionnel supplémenté avec 5 % v/v de plasma traité par solvant/détergent (S/D) (Octaplas®, Octapharma AG, origine humaine), 0,1 UI/ml d'héparine (Héparine LEO, LEO Pharma SA, Belgique, lot A17605), du facteur de croissance des fibroblastes basique (FGF-2) et du facteur de croissance transformant bêta (TGF-βΙ) ;
- pour obtenir des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM Z: un milieu de cuBure18/5662 conventionnel supplémenté avec 5 % v/v de plasma traité par solvant/détergent (S/D) (Octaplas®, Octapharma AG, origine humaine) et du facteur de croissance des fibroblastes basique (FGF-2) ; ou
- pour obtenir des cellules ostéoformatrices A dérivées de CSM : un milieu de culture conventionnel supplémenté avec 5 % v/v de plasma traité par solvant/détergent (S/D) (Octaplas®, Octapharma AG, origine humaine), du facteur de croissance des fibroblastes basique (FGF-2) et du facteur de croissance transformant bêta (TGF-ß1).
Les cellules sont cultivées dans une atmosphère humidifiée à 37 °C contenant 5 % de CO2. On laisse les CSM se fixer avant un changement de milieu initial. Le milieu est remplacé tous les 3 ou 4 jours. À la fin de la culture primaire, les cellules sont détachées, au moyen d'une solution de trypsine/EDTA pendant 1 à 5 min à 37 °C, comptées et repiquées pour culture secondaire dans des fioles de culture dans le même milieu. À la fin de la culture secondaire, les cellules ostéoformatrices dérivées de CSM sont collectées et lavées avec du PBS.
1.3 Caractérisation des cellules in vitro
1.3.1 Comptage et viabilité des cellules
La densité et la viabilité des cellules sont déterminés au moyen d'un dosage par exclusion au bleu de trypan. Après la collecte, les cellules sont diluées 1:2 avec du bleu de trypan (0,4 %, Lonza BioWhittaker®) et la viabilité cellulaire est analysée au moyen d'une chambre de Bürker (Sigma-Aldrich®) et un microscope renversé (AE31, Motic®). La viabilité cellulaire est également analysée par cytométrie en flux en utilisant l'amino-actinomycine D (7-AAD, BD Biosciences®) et les logiciels BD FACSCanto II™ et BD FACSDiva™ (Becton Dickinson®). Après la collecte, 50 000 cellules sont incubées dans l'obscurité pendant 10 min à température ambiante dans PBS-sérum-albumine bovine (BSA) 1 % (Lonza BioWhittaker®) avec 2,5 pl de 7-AAD.
1.3.2 Expression de marqueurs
1.3.2.1 Analyse par cytométrie en flux
Les cellules ostéoformatrices dérivées de CSM obtenues après culture secondaire, comme décrit dans la section 1.1 ci-dessus, sont collectées et des marqueurs de surface cellulaire sont analysés par cytométrie en flux (logiciels BD FACSCanto II™ et BD FACSDiva™ ; Becton Dickinson, États-Unis). Les cellules sont incubées avec les anticorps monoclonaux conjugués suivants : anti-CD73, anti-CD90, anti-CD105 et anti-CD166 (qui sont des marqueurs mésenchymateux, et devraient être hautement exprimés par les CSM ou cellules dérivées de CSM), anti-CD3, anti-CD34 et anti-CD45 (qui sont des marqueurs hématopoïétiques et devraient être sensiblement absents des CSM ou cellules dérivées de CSM), anti-CD44, antiCD 51/61, anti-CD49a-e, anti-CD29 (qui sont des marqueurs d'adhésion), anti-CD40, anti-CD86 et anti-HLA-DR (qui sont des marqueurs d’immunogénicité), et anti-phosphatase alcaline (ALP) 18/5662 pendant 15 min à température ambiante, et ensuite lavées avec du tampon phosphate salin (PBS) avant centrifugation et remise en suspension dans 0,3 ml de PBS.
Pour la caractérisation de marqueurs de surface cellulaire CD105, CD73, CD10 et CD44, 50 000 cellules à une concentration de 1x106 cellules/ml dans PBS - BSA 1 % sont incubées pendant 10 min dans l’obscurité avec 5 pl d’anticorps. Après ce temps d’incubation, les cellules sont lavées une fois avec PBS. Les différents anticorps utilisés pour la coloration extracellulaire sont les suivants : anticorps contre CD105 conjugués à l’allophycocyanine (APC) (BD Biosciences®, réf. n° 562408), CD73 (BD Biosciences®, réf. n° 560847), anticorps contre CD10 conjugués à la phycoérythrine (PE) (BD Biosciences®, réf. n° 555375), CD44 (BD Biosciences®, réf. n° 550989). Une coloration non spécifique est déterminée par incubation de cellules avec un témoin d’immunoglobuline G (IgG) conjugué à FITC, APC et PE (tous de BD Biosciences®, réf. n° 556649 ; 555751 ; 556650 respectivement). Avant analyse, un tri d’individus et de population d’intérêt est effectué. L’analyse par cytométrie en flux est effectuée sur 10 000 événements de la population triée au moyen des logiciels FACS CantolI (BD Biosciences®) et FACS Diva® 8.0 (BD Biosciences®). Les paramètres de réglage utilisés pour l’analyse sont appliqués automatiquement avec des billes (BD CompBeads Plus®, réf. n° 560497). Pour chaque conjugué, le seuil de positivité est fixé à 1 % de positivité de l’anticorps témoin d’isotype et la positivité de chaque marqueur est déterminée. La médiane d’intensité de fluorescence (MFI) de la population analysée totale est également déterminée et divisée par la MFI de l’anticorps témoin d’isotype correspondant pour obtenir la MFI normalisée (nMFI).
Tableau 1 : présentation des fournisseurs et des numéros de catalogue des anticorps utilisés dans les exemples
Anticorps Fournisseur Numéro de catalogue
Anti-ALP BD Biosciences 561433
Anti-CD166 BD Biosciences 560903
Anti-CD3 BD Biosciences 555340
Anti-CD34 BD Biosciences 555824
Anti-CD40 BD Biosciences 555588
Anti-CD44 BD Biosciences 550989
Anti-CD45 BD Biosciences 555485
BE2018/5662
Anti-CD49a BD Biosciences 559596
Anti-CD49b BD Biosciences 555669
Anti-CD49c BD Biosciences 556025
Anti-CD49d BD Biosciences 555503
Anti-CD49e BD Biosciences 555617
Anti-CD51/61 BD Biosciences 550037
Anti-CD73 BD Biosciences 561254
Anti-CD29 BD Biosciences 556048
Anti-CD86 BD Biosciences 555660
Anti-CD90 R&D System FAB7335P
Anti-HLA-DR BD Biosciences 555558
Anti-CD105 BD Biosciences 562408
Anti-CD10 BD Biosciences 555375
Anti-HLA-DR-DP- DQ BD Biosciences 555558
Anti-HLA-ABC BD Biosciences 555552
1.3.2.2 Coloration ALP
Les cellules sont étalées à la fin du processus de fabrication à 60 000 cellules/cm2 dans leur milieu de culture respectif et placées dans un incubateur humidifié (37 °C - 5 % CO2). La coloration ALP est effectuée après 24 h sur des cellules adhérentes. Les cellules sont fixées 5 avec de l'acétone tamponnée par du citrate et incubées avec une solution de coloration d'ALP composée de 4 % v/v de phosphate alcalin de naphtol AS-MX (Sigma ; réf. 855) et 96 % v/v de solution de sel de bleu solide RR (Sigma ; réf. FBS25) pendant 30 min dans l'obscurité.
1.3.2.3 Mesure de l’activité enzymatique ALP
L'activité enzymatique ALP est mesurée par un dosage biochimique basé sur l'hydrolyse de 10 phosphate de p-nitrophényle (pNPP). Après avoir été déphosphorylé par ALP, le pNPP devient jaune et peut être détecté par un spectrophotomètre à 410 nm. L'activité enzymatique ALP des cellules est déterminée par rapport à une courbe d'étalonnage sur la base de l'activité de phosphatase alcaline d'intestin de veau purifiée. L'activité ALP est exprimée en unités d'ALP/mg de protéine. Une unité d'ALP hydrolyse 1 pmol de pNPP en 1 min à 37 °C.
rpqOI8/5662
1.3.3 Réaction de polymérase en chaîne quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)
Après collecte, les cellules sont conservées à -80 °C sous forme de culots secs (500 000 cellules) jusqu'à extraction d'ARN. Les ARN totaux sont extraits en utilisant le kit RNeasy® Mini (Qiagen®) conformément aux instructions du fabricant. La concentration d'ARN est mesurée en utilisant DropSense® 16 (Trinean®). Les transcriptions inverses sont effectuées à partir de 1 pg d'extraits d'ARN total, en utilisant le kit de réactif PrimeScript® RT (Takara®) conformément aux instructions du fabricant. Les qPCR sont effectuées en utilisant Premix Ex Taq® (Takara®) à partir de 2 pl d'ADNc conformément aux instructions du fabricant. Les taux d'expression des gènes d'intérêt suivants ont été quantifiés : Les taux d'expression des gènes d'intérêt suivants ont été quantifiés : RUNX2 (sens : GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG (SEQ ID NO: 1), antisens : AGACACCAAACTCCACAGCC (SEQ ID NO: 2)), SOX9 (S : TAAAGGCAACTCGTACCCAA (SEQ ID NO: 3), A : ATTCTCCATCATCCTCCACG (SEQ ID NO: 4), BMP2 (S : GGAACGGACATTCGGTCCTT (SEQ ID NO: 5), A :
CACCATGGTCGACCTTTAGGA (SEQ ID NO: 6)), ALPL(S :
ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG (SEQ ID NO: 7), A : AGACATTCTCTCGTTCACCGCC (SEQ ID NO: 8)), MMP13 (S: TGGAATTAAGGAGCATGGCGA (SEQ ID NO: 9), A: AACTCATGCGCAGCAACAAG (SEQ ID NO: 10)), CHI3L1(S:
TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA (SEQ ID NO: 11), A : GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA (SEQ ID NO: 12)), DCN (S : AAAATGCCCAAAACTCTTCAGG (SEQ ID NO: 13),A :
GCCCCATTTTCAATTCCTGAG (SEQ ID NO: 14)), OCN (S : AAGGTGCAGCCTTTGTGT (SEQ ID NO: 15), A : GCTCCCAGCCATTGATACAG (SEQ ID NO: 16)), SPON1(S :
CCTGCGGAACTGCCAAGTA (SEQ ID NO: 17), A : CACGGGTGAGCCCAATTCT (SEQ ID NO: 18)), POSTN (S : TTTGGGCACCAAAAAGAAAT (SEQ ID NO: 19), A :
TTCTCATATAACCAGGGCAACA (SEQ ID NO: 20)). Les qPCR sont effectuées en double en utilisant un LightCycler® 480 (Roche®). Une normalisation est effectuée en utilisant la moyenne géométrique obtenue à partir de trois gènes domestiques : RPL13A (S :
CATAGGAAGCTGGGAGCAAG (SEQ ID NO: 21), A : GCCCTCCAATCAGTCTTCTG (SEQ ID NO: 22)), TBP (S : AACAACAGCCTGCCACCTTA (SEQ ID NO: 23), A :
GCCATAAGGCATCATTGGAC (SEQ ID NO: 24)), HPRT (S : CCCTGGCGTCGTGATTAGT (SEQ ID NO: 25), A : GTGATGGCCTCCCATCTCCTT (SEQ ID NO: 26)). Une comparaison entre les différents produits de cellules dérivées de CSM des mêmes donneurs est effectuée par calcul de l'expression génique (facteur de changement) en utilisant le procédé 2-AACt pour chaque gène d'intérêt (Schmittgen et Livak, 2008, 3(6), 1101-8 ; Nature Protocols, 3(6), 11011108).
L'analyse statistique est effectuée en utilisant le logiciel JMP® (13.1.0). Les données RT-qPCR exprimées en facteur de changement sont soumises à une transformée logarithmique et des tests de Student (avec α = 0,05) sont effectués pour évaluer la signification statistiqueB5êS 18/5662 différences observées entre les types de cellules.
La signification statistique est représentée graphiquement en fonction de la valeur p (p) obtenue : * pour p < 0,05, ** pour p < 0,01, et *** pour p < 0,001.
1.3.4 Dosage multiplexe
Après collecte, les cellules sont étalées à une densité de 50 000 cellules/cm2. Après 48 heures d'incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, les surnageants de culture de cellules sont collectés, centrifugés (5 min à 1500 tours/min à température ambiante) et conservés à -80 °C. Les surnageants sont analysés par dosage Luminex® en utilisant des dosages Human Magnetic Luminex® (R&D System®). Le prémélange multiplexe est préparé sur mesure (R&D System®). Les facteurs sécrétés suivant sont étudiés : BMP-2, COL1A1, MMP13, OPN, OPG, SPARC, RANKL, CHI3L1. Le dosage est effectué conformément aux instructions du fabricant et les analyses sont effectuées en utilisant les logiciels MAGPIX® (R&D System®) et Bio-Plex Manager 5.0TM (Bio-Rad®).
1.4 Mesure de taille de cellule
Les cellules ostéoformatrices dérivées de CSM obtenues après culture secondaire comme décrit dans la section 1.1 ci-dessus sont collectées et mises en suspension dans du PBS avec 0,4% de bleu de trypan à une densité de cellules de 12,5x106 cellules par ml. 10 pl de la suspension de cellules sont placés sur une lame graduée (Motic®), puis protégés par une lamelle couvre-objet pour être placés sous un microscope renversé à un grossissement de 40X (AE31 ; Motic). Les images acquises avec une caméra (Moticam) placée sur le microscope sont analysées par le logiciel Motic Image Plus 2.02 afin de mesurer les diamètres des cellules. Au moins cent cellules sont mesurées pour considérer l'analyse statistiquement significative.
La taille des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM obtenues à différent temps de la culture ex vivo est également analysée par cytométrie en flux (logiciels BD FACS Canto II™ et BD FACS Diva™ ; Becton Dickinson, États-Unis). Brièvement, au jour 21, 23, 26 et 28 après le démarrage de la culture de cellules ex vivo telle que décrite dans la section 1.1, les cellules sont collectées, mises en suspension dans du tampon phosphate salin (PBS) à une densité de cellules de 1.106 cellules par ml et analysées avec le cytomètre en flux pour mesure de diffusion avant (FSC) (exprimée en unité de fluorescence relative). La diffusion avant mesure la lumière diffusée dans la direction du trajet laser et, par conséquent, donne une taille relative pour les cellules traversant la chambre d'écoulement.
2. Résultats BE2018/5662
2.1 Profil d’expression de marqueurs cellulaires
L'analyse par cytométrie en flux montre que les identités de cellules basées sur les profils d'expression de marqueurs de surface cellulaire de cellules ostéoformatrices A (générées avec FGF 2 et TGF-β 1) et de cellules ostéoformatrices B (générées avec FGF-2, TGF^1 et l'héparine ; mode de réalisation de la présente invention) sont comparables.
Les populations de cellules ostéoformatrices A et B expriment toutes deux les marqueurs mésenchymateux CD73, CD90, CD105, CD63, CD166 et n'expriment pas les marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et CD3 (moins de 5 % de la population de cellules exprime ces marqueurs) (tableaux 2 et 3). Les cellules ostéoformatrices B (i) continuent d'exprimer de faibles taux de récepteur de surface cellulaire de CMH de classe II tel que HLA-DR et (ii) expriment fortement ALP. La faible immunogénicité représentée par la faible expression de HLA-DR permet avantageusement une greffe de cellules, par exemple, vers des sujets allogéniques (tableau 5). De plus, les cellules ostéoformatrices A et les cellules ostéoformatrices B expriment fortement les marqueurs d'adhésion CD49e, CD44 et l'enzyme ALP sur leur surface par rapport à des CSM non différenciées (tableaux 3 et 4). L'expression élevée de ce dernier marqueur (ALP) indique l'orientation vers la lignée ostéoblastique des cellules ostéoformatrices. De plus, l'expression élevée d'ALP met en évidence l'orientation des cellules ostéoformatrices B vers la lignée ostéoblastique (par rapport à des CSM non différenciées). Le tableau 6 montre en outre que l'expression d'ALP est plus élevée pour les cellules cultivées en présence d'héparine (cellules ostéoformatrices B) que pour les cellules cultivées en l'absence d'héparine (cellules ostéoformatrices A).
Tableau 2 : profil d’expression de marqueurs de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM.
% Expression de marqueur (moyenne ± ET ) CSM Cellules ostéoformatrices Z générées avec FGF-2 Cellules ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGF-ß1 Cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l’héparine
CD44-FITC 98 ± 2 (N=3) 100 ± 1 (N=16) 100±1(N=11) 100 ± 1 (N=16)
CD51/61 19 ± 18 (N=10) 50 ± 17 (N=8) 13 ± 12 (N=8) 32 ± 31 (N=8)
CD34-FITC 3 ± 2 (N=3) 1 ± 1 (N=3) ND ND
CD34-APC 2 ± 1 (N=6) 3 ± 1 (N=5) ND ND
CD49-FITC 8 ± 8 (N=10) 44 ± 14 (N=7) 25 ± 13 (N=7) 42 ± 18 (N=6)
CD45-FITC 2 ± 1 (N=6) 2 ± 1 (N=11) 1 ± 1 (N=11) - 2 ± 1 (N=6)
CD166-PE 97 ± 3 (N=10) 98 ± 2 (N=8) 97 ± 3 (N=9) 96 ± 6 (N=8)
CD73-PE 99 ± 1 (N=6) 100 ± 1 (N=12) 100± 1 (N=11) 100 ± 1 (N=8)
CD29-APC 100 ± 1 (N=8) 100 ± 1 (N=7) 100 ± 1 (N=10)/ 100 ± 1 (N=8)
ALP-PE 20 ± 7 (N=13) 70 ± 19 (N=17) 69 ± 18 (N=16) 91 ± 8 (N=10)
ALP intra-PE 19±13(N=11) 63 ± 22 (N=10) 59 ± 22 (N=10) 80 ± 13 (N=8)
HLA-DR NA 63 ± 20 (N=10) 6 ± 6 (N=22) 3 ± 2 (N=8)
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes 2 ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-DR : antigène des leucocytes humains - isotype DR ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; NA : non disponible ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; ET: écart type; TGF-βΙ : facteur de 5 croissance transformant bêta 1
Tableau 3 : profil d’expression de marqueurs de surface cellulaire de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM
Expression de marqueur (en %) Statistiques CSM Cellules ostéoformatrice s A Cellules ostéoformatrice s B
CD73-APC Moyenne 100,0 100,0 100,0
ET 0,0 0,0 0,0
N 6 11 22
CD90-PE Moyenne 100,0 99,9 99,9
ET 0,1 0,2 0,2
N 8 12 22
CD105-APC Moyenne 100,0 99,8 100,0
ET 0,0 0,5 0,1
N 8 12 20
CD45-APC Moyenne 0,4 0,3 1,0
ET 0,2 0,2 2,9
N 8 12 19
CD34-APC Moyenne 0,6 1,0 1,6
Expression de marqueur (en %) Statistiques CSM Cellules ostéoformatrice s A - Cellules ostéoformatrice s B
ET 0,4 0,6 1,8
N 8 12 22
CD3-PE Moyenne 0,2 0,1 0,2
ET 0,1 0,1 0,1
N 6 10 17
HLA-DR-PE Moyenne 0,7 1,0 1,8
ET 1,2 0,6 2,0
N 8 12 22
HLA-DR/DP/DQ- FITC Moyenne 1,0 1,6 1,6
ET 0,4 1,1 1,1
N 8 12 22
ALP-PE Moyenne 40,7 88,7 94,8
ET ND 5,6 6,6
N 1 5 10
CD49e-PE Moyenne 92,7 99,6 99,8
ET 20,5 1,1 0,5
N 8 12 19
CD44-PE Moyenne 99,9 99,7 100,0
ET 0,2 0,5 0,0
N 8 12 22
CD10 Moyenne 19,6 99,6 98,8
Écart type 14 0,4 1,5
N 10 12 25
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-DR : antigène des leucocytes humains - isotype DR ; HLA-DR/DP/DQ :
antigène des leucocytes humains - isotypes DR/DP/DQ ; CSM : cellules
BE2018/5662 souches mésenchymateuses ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; ET : écart type
Tableau 4 : taux d’expression d’ALP d’une population de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM évalués par différents procédés
Statistiques CSM Cellules ostéoformatrice s A Cellules ostéoformatrice s B
Positivité de la population pour ALP-PE (%) Moyenne 40,7 88,7 94,8
ET ND 5,6 6,6
N 1 5 10
Taux d’expression de surface cellulaire d’ALPPE (nMFI) Moyenne 2,4 19,8 56,1
ET ND 10,8 27,4
N 1 5 10
Activité enzymatique ALP (mU/mg de protéines totales) Moyenne 176,3 671,9 874,7
ET 252,9 305,8 772,9
N 3 9 26
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ND : non déterminé ; nMFI : médiane normalisée d’intensité de fluorescence ; PE : phycoérythrine ; ET : écart type
Tableau 5 : comparaisons de l’expression du marqueur de surface d’immunogénicité
HLA-DR (FACS) sur des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM en utilisant différentes conditions de culture
Population de cellules
HLA-DR (%) moyenne ± ET
Cellules ostéoformatrices Z générées avec FGF-2
Cellules ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGFβ1 ± 20 (N=10) ± 6 (N=22)
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Cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l’héparine 3 ± 2 (N=8)
Cellules ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGFß1 1,0 ± 0,6 (N=12)
Cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l’héparine 1,8 ± 2,0 (N=22)
Abréviations : FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes 2 ; HLA-DR : antigène des leucocytes humains - lié à l’antigène D ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ET : écart type ; TGF-βΙ : facteur de croissance transformant bêta 1
Tableau 6 : taux d’expression d’ALP de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices générées dans différentes conditions de culture
Population de cellules % de cellules ALP+ (cytométrie en flux) % de cellules ALP intra+ (cytométrie en flux) Enz. ALP (mUI/mg de protéines totales) Coloration ALP
CSM (témoin) 20 ± 7 (N=13) 19 ± 13 (N=11) 108 ± 86 (N=2) NA
Cellules 70 ± 19 63 ± 22 877 ± 680 1,8 ± 0,4
ostéoformatrices Z générées avec FGF-2 (N=17) (N=10) (N=6) (N=23)
Cellules 69 ± 18 59 ± 22 495 ± 466 1,2 ± 0,4
ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGF-ß1 (N=16) (N=10) (N=17) (N=13)
Cellules 91 ± 8 80 ± 13 1,016 ± 685 2,0 ± 0,0
ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l’héparine (N=10) (N=8) (N=14) (N=22)
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes^0; 18/5662
CSM: cellules souches mésenchymateuses; NA: non disponible; TGF-βΙ : facteur de croissance transformant bêta 1
Le profil d'expression de marqueurs de surface cellulaire est non seulement caractérisé par la présence de marqueurs sur la surface cellulaire (pourcentage de positivité de population), mais également par analyse de la quantité de marqueurs exprimés sur la surface cellulaire (médiane de fluorescence normalisée pour la population) de différents marqueurs. Ces analyses mettent en évidence des différences entre les différentes cellules ostéoformatrices dérivées de CSM.
Des cellules ostéoformatrices B cultivées en présence d'héparine expriment un taux plus élevé d'ALP que des CSM et des cellules ostéoformatrices A cultivées en l'absence d'héparine (tableau 7, résultats ALP-PE nMFI), ce qui confirme l'orientation vers la lignée ostéoblastique de cellules ostéoformatrices.
L'expression des marqueurs mésenchymateux CD73 et CD105 sur la surface cellulaire sont également dépendants des types de cellules. Les cellules ostéoformatrices générées en 15 présence d'héparine (cellules ostéoformatrices B) expriment un taux de CD73 et CD105 plus élevé que les cellules ostéoformatrices A (tableau 7).
Tableau 7 : résultats supplémentaires d’expression de marqueur de surface cellulaire de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM
Expression de marqueur (en nMFI) Statistiques CSM Cellules ostéoformatrice s A Cellules ostéoformatrice s B
ALP-PE Moyenne 2,4 19,8 56,1
ET - 10,8 27,4
N 1 5 10
CD73-APC Moyenne 234,8 130,7 646,3
ET 84,3 80,1 138,8
N 6 11 22
CD105-APC Moyenne 207,7 26,6 59,1
ET 67,6 15,2 13,1
N 8 12 20
CD44-PE Moyenne 139,8 62,0 156,6
ET 57,5 19,1 40,7
BE2018/5662
N 8 12 22
CD49e-PE Moyenne 81,0 22,5 33,5
ET 51,4 9,9 11,0
N 8 12 19
HLA-ABC-FITC Moyenne 26,1 21,6 80,2
ET - 5,2 17,4
N 1 4 8
CD10-PE Moyenne 0,8 36,2 32,2
ET 1,1 16,4 16,8
N 8 12 22
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes 2 ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-ABC : antigène des leucocytes humains ABC ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; NA : non disponible ; ND : non déterminé; PE :_phycoérythrine ; ET: écart type ; TGF-P1 : facteur de croissance transformant bêta 1
2.2 RT-qPCR et dosage multiplexe
L'analyse met en évidence que les gènes RUNX2, SOX9, ZNF521, ALPL, BMP2, OPG, POSTN, CHI3L1, MMP13, CADM1, CX43, CD10, WISP1 codant pour des marqueurs ostéochondroblastiques, et les gènes DCN, SPON1 codant pour des protéines de matrice osseuse ou cartilagineuse sont significativement surexprimés dans les cellules ostéoformatrices A et B par rapport aux CSM (tableau 8). De même, l'expression génique de DKK1 codant pour un inhibiteur d'ostéochondrogenèse est significativement régulée négativement dans des cellules ostéoformatrices A et B par rapport à des CSM (tableau 8).
L'expression des gènes KI67 et PCNA codant pour des marqueurs de prolifération est significativement régulée négativement à la fois dans les cellules ostéoformatrices A et B par rapport aux CSM, et l'expression génique des marqueurs associés à l'apoptose BCL2 et BAX est équivalente dans tous les types de cellules (tableau 8).
Par rapport aux cellules ostéoformatrices A, les cellules ostéoformatrices B (signification statistique représentée graphiquement suivant la valeur p (p) obtenue : * pour p < 0,05, ** pour p < 0,01 et *** pour p < 0,001) :
- expriment des taux plus élevés du gène PPARG (***) (codant pour une protéine impliquée dans l'adipogenèse) ;
BE2018/5662
- - expriment des taux plus élevés des gènes CD73 (***), BMP2 (***) (codant pour des protéines ostéochondroblastiques) ;
- - expriment des taux plus élevés des gènes COL1A1 (***), BGN (***), SPARC (***), ALPL (*), BCL2 (***) (codant pour des protéines ostéochondroblastiques).
En ce qui concerne les gènes qui sont surexprimés dans les cellules ostéoformatrices B par rapport aux cellules ostéoformatrices A, PPARG, MMP13, BMP2 sont également significativement surexprimés dans des cellules ostéoformatrices B par rapport aux CSM, tandis que CD73 a le même taux d'expression dans des cellules ostéoformatrices B et dans des CSM.
En ce qui concerne les gènes qui sont régulés négativement dans les cellules ostéoformatrices
B par rapport aux cellules ostéoformatrices A (c'est-à-dire, COL1A1, BGN, SPARC, BCL2), tous ont le même taux d'expression dans les cellules ostéoformatrices B que dans les CSM à l'exception d'ALPL, qui est encore surexprimé dans les cellules ostéoformatrices B par rapport à des CSM.
Tableau 8 : profil d’expression génique de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices (exprimé en facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM - la signification statistique est graphiquement représentée en fonction de la valeur p (p) obtenue : * pour p < 0,05 ; ** pour p < 0,01 ; *** pour p < 0,001 ; NS : non statistiquement significatif)
Expression génique (facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM) Statistiq ues CSM Cellules ostéoformat rices A Cellules ostéoformat rices B
Marqueurs mésenchymateux CD73 Moyenne 1,00 0,36** 1,12 (NS)
ET NA 0,01 0,24
N 1 3 6
CD105 Moyenne 1,00 0,55 (NS) 0,48*
ET NA 0,10 0,12
N 1 3 6
Gènes maîtres de différenciation RUNX2 Moyenne 1,04 147*** 1,64***
ET 0,27 0,27 0,43
N 7 9 29
SOX9 Moyenne 1,16 2,95*** 2,03**
8/5662
Expression génique (facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM) Statistiq ues CSM Cellules ostéoformat rices A LJI—2-U Cellules ostéoformat rices B
ET 0,73 1,42 0,87
N 7 9 29
PPARG Moyenne 1,17 6,93*** 3,05***
ET 0,75 2,16 1,83
N 7 9 29
ZNF521 Moyenne 1,45 49,85*** 63,88***
ET 1,18 29,10 23,11
N 7 9 29
DKK1 Moyenne 1,00 0,02*** 0,01***
ET NA 0,01 0,01
N 1 3 6
Marqueurs associés à la matrice extracellulaire SPON1 Moyenne 1,09 576,25*** 539,25***
ET 0,45 397,77 339,77
N 6 9 29
COL1A1 Moyenne 1,03 2,09*** 0,88 (NS)
ET 0,27 0,41 0,41
N 7 9 29
BGN Moyenne 1,00 2,18*** 1,26 (NS)
ET 0,05 0,37 0,36
N 7 9 29
DCN Moyenne 1,08 9,80*** 7,31***
ET 0,42 3,30 3,22
N 6 9 29
SPARC Moyenne 1,01 2 21 *** 0,91 (NS)
ET 0,15 0,59 0,33
N 7 9 29
IBSP Moyenne 1,11 8,24 (NS) 14,34**
ET 0,46 11,29 15,38
N 7 9 28
BE2018/5662
Expression génique (facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM) Statistiq ues CSM Cellules ostéoformat rices A Cellules ostéoformat rices B
OCN Moyenne 1,02 1,29 (NS) 1,50**
ET 0,22 0,33 0,58
N 7 9 29
Marqueurs ostéochondrogéniq ues ALPL Moyenne 1,49 13,83*** 8,91***
ET 1,61 5,98 6,73
N 7 9 29
MMP13 Moyenne 1,32 216,27*** 2739,98***
ET 1,26 254,24 2886,30
N 7 9 29
CX43 Moyenne 1,06 3,20*** 2 74***
ET 0,38 0,98 0,96
N 7 9 29
OPN Moyenne 1,70 6,32 (NS) 4,47 (NS)
ET 1,71 6,60 11,23
N 7 9 29
OPG Moyenne 1,12 2,79* 1,48 (NS)
ET 0,53 2,43 0,78
N 7 9 29
BMP2 Moyenne 1,04 10,76*** 32,69***
ET 0,29 6,19 25,88
N 7 9 29
POSTN Moyenne 1,14 5,70*** 3,70***
ET 0,71 1,42 1,81
N 7 9 29
WISP1 Moyenne 1,11 3,16*** 2,13**
ET 0,53 1,21 0,92
N 7 9 29
CADM1 Moyenne 1,70 43,28*** 19,55***
ET 1,87 27,53 22,12
8/5662
Expression génique (facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM) Statistiq ues CSM Cellules ostéoformat rices A LJI—2-U Cellules ostéoformat rices B
N 7 9 29
CHI3L1 Moyenne 1,84 430,19*** 775,23***
ET 2,21 309,05 462,38
N 7 9 29
CD10 Moyenne 1,00 62,65*** 57,96***
ET NA 14,43 30,91
N 1 3 6
Marqueurs de prolifération KI67 Moyenne 1,27 0,13*** 0,14***
ET 1,13 0,26 0,13
N 7 9 29
PCNA Moyenne 1,09 0,63** 0,62***
ET 0,50 0,06 0,23
N 7 9 29
Marqueurs associés à l’apoptose BCL2 Moyenne 1,08 3,43*** 0,97 (NS)
ET 0,46 0,97 0,46
N 7 8 29
BAX Moyenne 1,01 1,65* 1,92**
ET 0,15 0,18 2,43
N 7 9 29
L'analyse de sécrétion cellulaire montre que les cellules ostéoformatrices B sécrètent des quantités des protéines CHI3L1 et MMP13 impliquées dans l'ostéochondrogenèse plus élevées que mes cellules ostéoformatrices A et les CSM (tableau 9) et sécrètent une quantité de DKK1 impliqué dans l'inhibition de l'ostéogenèse plus faible que mes cellules ostéoformatrices A et les CSM. Aucune différence significative n'est observée entre les types de cellules pour la quantité de COL1A1 sécrétée (tableau 9).
Tableau 9 : profil de sécrétion de populations de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM (exprimé en facteur de changement par rapport aux valeurs moyennes de CSM - la signification statistique est graphiquement représentée en fonction dB3$a 18/5662 valeur p (p) obtenue : * pour p < 0,05 ; ** pour p < 0,01 ; *** pour p < 0,001 ; NS : non statistiquement significatif)
Sécrétion de protéine (pg/ml) Statistiqu es CSM Cellules ostéoformatrices A Cellules ostéoformatrices B
COL1A1 Moyenne 5734 7 79822 (NS) 79216 (NS)
ET 3228 8 48969 41636
N 5 6 11
CHI3L1 Moyenne 6453 3 123800 (NS) 303436**
ET 3224 2 70909 232874
N 5 6 11
DKK1 Moyenne 3679 4979 (NS) 1609***
ET 1287 1913 850
N 5 6 11
MMP13 Moyenne 180 294 693***
ET 54 80 (NS) 545
N 5 6 11
2.3 Taille de cellule
Les mesures de taille de cellule obtenues en utilisant (i) le logiciel Motic Image Plus 2.0/3.0 et (ii) l'analyse FSC par cytométrie en flux confirment que les cellules ostéoformatrices dérivées de CSM générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine (cellules ostéoformatrices B) sont plus petites et plus homogènes que les cellules ostéoformatrices dérivées de CSM générées avec 10 FGF-2 et TGF-β! sans héparine (par exemple, des cellules ostéoformatrices A) (tableaux 10 et
11, figures 1 et 11).
Il est très intéressant de noter que la grande majorité des cellules ostéoformatrices B (> 70 %) ne dépassent pas 25 μm de diamètre et <5 % de celles-ci dépassent 35 μm de diamètre (tableaux 8 et 9). Par contre, la population de cellules ostéoformatrices obtenue sans ajout 15 d'héparine (cellules ostéoformatrices A) comprend seulement 20 % de cellules qui ne dépassent pas 25 μm de diamètre et 41 % de cellules avec un diamètre supérieur à 35 μm (figure 1 et tableau 10). Comme détaillé plus avant dans l'exemple 3, de telles cellules à grand diamètre pourraient s'avérer être délétères pour la greffe du sujet.
Tableau 10 : distribution de tailles de cellule de cellules ostéoformatrices A et B
BE2018/5662
% de cellules ayant un diamètre < 25 μm > 35 μm
Cellules ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGF-ß-1 20% 41%
Cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß-1 et l’héparine 70% 5%
Abréviations : FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes 2 ; TGF-βΙ : facteur de croissance transformant bêta 1
Tableau 11 : distribution de taille de cellule de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM
% de cellules ayant un diamètre < 25 μm > 35 μm
CSM 89,9% 1,3%
Cellules ostéoformatrices A 35,4% 26,9%
Cellules ostéoformatrices B 73,7% 3,3%
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses
Tableau 12 : diamètre de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM
Diamètre de cellule (μm) Moyenne ± ET (N) Min - max
CSM (témoin) 22,4 ± 4,9 (N=101) 13,6 -38,0
Cellules ostéoformatrices A générées avec FGF-2 et TGF-ß1 34,1 ± 9,9 (N=699) 15,9 -67
Cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l’héparine 23,3 ± 6,8 (N=1170) 12,1 -74,5
Rapport (Cellules ostéoformatrices B/ Cellules ostéoformatrices A) 0,68
Abréviations : FGF-2 : facteur de croissance des fibroblastes 2 ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ET : écart type ; TGF^1 : facteur de croissance transformant bêta 1
Tableau 13 : diamètre de CSM et de cellules ostéoformatrices dérivées de CSM
Diamètre de cellule (μm) Moyenne ± ET Min - max N
CSM 19,2 ± 4,8 9,8 -41,8 450
Cellules ostéoformatrices A 30,2 ± 9,9 11,4 -67 1205
8/5662
-------BEZtTl
Cellules ostéoformatrices B 22,4 ± 6,4 7,9 -74,5 1744
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ET : écart type
Des essais FSC de cytométrie en flux sont utilisés pour évaluer la taille de cellule moyenne relative de cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine à différents temps pendant la culture in vitro et, par conséquent, à différentes confluences de cellules, à savoir 45 %, 70 %, 90 % et 100 % de confluence. Le tableau 14 montre que la taille de cellule de cellules ostéoformatrices B est stable et augmente finalement avec la confluence de culture de cellules. En d'autres termes, le tableau 14 montre que la taille moyenne de cellules ostéoformatrices B provenant d'une fiole de cellules plus confluente est plus élevée que celle d'une fiole de culture moins confluente. Il doit être noté que les essais FSC par cytométrie en flux permettent de comparer la taille de cellules moyenne de différents échantillons sans cependant donner d'informations sur les valeurs absolues de la taille de cellule moyenne.
Tableau 14 : valeur FSC par cytométrie en flux de cellules ostéoformatrices B collectées à différents temps et confluences pendant une culture in vitro
Durée totale de culture de cellules Confluence Unité de fluorescence moyenne relative
D21 45% 69,307
D23 70% 65,228
D26 90% 77,349
D28 100% 91,124
Exemple 2 : spécificité du procédé de préparation de cellules dérivées de CSM de l’exemple 1
1. Procédures expérimentales
1.1 Culture de cellules et préparation de plasma
La culture de cellules et la préparation de plasma sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1.
Pour les essais relatifs à la comparaison entre l'héparine et les analogues de celle-ci, le milieu de culture conventionnel est supplémenté avec (i) 5 % v/v de plasma S/D ; (ii) FGF-2 basique ; (iii) TGF-ß1 ; et (iv) 0,1 UI/ml d'héparine non fractionnée (HNF), de daltéparine, de sulfate d'héparane ou de danaparoïde.
Pour les essais relatifs à la comparaison entre l'héparine et d'autres anticoagulants, le milieu de culture conventionnel est supplémenté avec (i) 5 % v/v de plasma S/D ; (ii) FGF-2 basique ;
(iii) TGF-β ; et (iv) 1 UI/ml d'héparine (Héparine LEO, LEO Pharma SA, Belgique, lot A17B05)018/5662 100 UI/ml d'héparine, 2 mg/ml d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou 0,1 mg/ml Actilyse®.
Pour les essais relatifs à la comparaison entre le plasma S/D et le sérum, le milieu de culture conventionnel est supplémenté avec (i) 5 % v/v de plasma S/D ou 5 % de sérum ; (ii) FGF-2 basique ; (iii) TGF-β ; et (iv) 0,1 UI/ml d'héparine.
Pour les essais relatifs à la comparaison entre la présence ou l'absence de plasma S/D et de sérum, le milieu de culture conventionnel est supplémenté avec (i) 5 % v/v de plasma S/D, 5 % v/v de sérum ou 0 % de plasma S/D et 0 % de sérum ; (ii) FGF-2 basique ; (iii) TGF-β ; et (iv) 0,1 UI/ml d'héparine.
2. Résultats
2.1 Héparine vs. analogues de celle-ci
La figure 2 et le tableau 15 montrent que l'héparine présente dans le milieu de culture peut être remplacée par des dérivés de celle-ci (composés héparinoïdes), à savoir par la daltéparine, le sulfate d'héparane ou un mélange de glycosaminoglycanes tel que le danaparoïde comprenant du sulfate d'héparane. Les 4 dérivés d'héparine ont les mêmes effets sur la viabilité cellulaire et le profil d'expression de marqueurs que l'héparine (tableau 15).
Tableau 15 : cellules ostéoformatrices dérivées de CSM générées en utilisant différents héparinoïdes : HNF, daltéparine, danaparoïde et sulfate d'héparane ; utilisés à 0,1 UI/ml.
Viabilité CSM Hématopoïétique Immuno Ostéo
CD73 CD90 CD3 CD34 CD45 HLA-DR CD40 CD86 ALP
97 ± 2 99 ± 1 98 ± 1 0 ± 1 1 ± 1 4 ± 3 2 ± 1 0 ± 1 2 ± 2 88 ± 16
Héparine (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=3) (N=4) (N=4) (N=4)
98 ± 2 98 ± 1 98 ± 1 0 ± 1 0 ± 1 4 ± 4 3 ± 3 0 ± 1 1 ± 2 94 ± 3
Daltéparine (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3) (N=3)
97 ± 2 99 ± 1 98 ± 1 0 ± 1 2 ± 3 5 ± 4 4 ± 2 0 ± 1 3 ± 2 89 ± 15
Danaparoïde (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=3) (N=4) (N=4) (N=4)
Sulfate 97 ± 2 99 ± 1 99 ± 1 2 ± 3 1 ± 1 4 ± 1 4 ± 2 1 ± 2 4 ± 4 92 ± 11
d'héparane (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) (N=3) (N=4) (N=4) (N=4)
Adhésion
8/5662
CD29 CD44 CD49a CD49b CD49d CD49e CD51/ CD61 CD54 LJI 2 t CD166
Héparine 99 ± 1 (N=4) 98 ± 1 (N=4) 25 ±6 (N=4) 53 ±7 (N=4) 79 ±3 (N=4) 97 ±4 (N=4) 50 ±23 (N=4) 70 ± 19 (N=4) 97 ±3 (N=4)
Daltéparine 98 ± 1 (N=3) 98 ± 1 (N=3) 29 ± 14 (N=3) 61 ±3 (N=3) 78 ± 15 (N=3) 98 ± 1 (N=3) 26 ± 19 (N=3) 65 ± 11 (N=3) 96 ± 1 (N=3)
Danaparoïde 99 ± 1 (N=4) 99 ± 1 (N=4) 32 ±9 (N=4) 69 ± 21 (N=4) 88 ±6 (N=4) 98 ±2 (N=4) 39 ±23 (N=4) 74 ± 10 (N=4) 97 ±3 (N=4)
Sulfate d’héparane 99 ± 1 (N=4) 98 ± 1 (N=4) 32 ±8 (N=4) 75 ± 15 (N=4) 88 ±3 (N=4) 98 ±2 (N=4) 41 ± 18 (N=4) 79 ± 10 (N=4) 98 ±2 (N=4)
2.2 Héparine vs. autres anticoagulants
La figure 3 montre que l’héparine et les dérivés de celle-ci (à une concentration de 1 Ul/ml ou
100 Ul/ml) ne peuvent pas être remplacés par d’autres anticoagulants tels que l’EDTA à 5 2 mg/ml (E8008, Sigma-Aldrich, lot RNBBB7793), Actilyse® 0,1mg/ml (Boehringer Ingelheim, lot
001408).
2.3 Plasma vs. sérum
La figure 4 montre que le plasma S/D peut être remplacé par du sérum pour générer des cellules ostéoformatrices dérivées de CSM selon l’invention. En conséquence, il apparaît que 10 l’héparine ou des analogues de celle-ci sont des éléments essentiels dans le procédé de préparation de cellules ostéoformatrices B.
Exemple 3 : capacité de minéralisation in vitro de cellules dérivées de CSM B obtenues par le procédé de l’exemple 1
1. Procédures expérimentales
Le dosage de minéralisation évalue la capacité de cellules à générer une matrice minéralisée in vitro par culture de celles-ci dans du milieu ostéogénique pendant plusieurs semaines. La matrice minéralisée est ensuite colorée au moyen d’une coloration au rouge d’alizarine S (ARS).
Brièvement, les cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM obtenues après culture co8mé 18/5662 décrit dans la section 1.1 de l'essai 1 ci-dessus sont collectées et étalées dans un milieu αMEM basique (Lonza) supplémenté avec pénicilline-streptomycine (Lonza) et 5 % de sérum par puits à 60 000 cellules/cm2 dans une plaque de 48 puits jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence (1 à 2 jours). Ensuite, le milieu est remplacé par un milieu ostéogénique comprenant du milieu α-MEM basique (Lonza) supplémenté avec pénicilline-streptomycine (Lonza), 5 % de sérum, dexaméthasone 10-8M (Sigma), 50 pg/ml d'acide ascorbique (Sigma) et βglycérophosphate 5 mM (Sigma). Le milieu ostéogénique est remplacé tous les 3 ± 2 jours par du milieu ostéogénique fraîchement préparé.
Une coloration ARS est effectué au jour 21 et au jour 28 après induction ostéogénique, comme suit : les cellules sont lavées avec du tampon phosphate salin, incubées avec du formaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 15 minutes, lavées avec du tampon phosphate salin et ensuite lavées avec de l'eau déminéralisée. Les cellules sont ensuite exposées pendant 10 minutes à température ambiante à une solution d'ARS (20 g/l) pH 4,2. Les cellules sont lavées avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que la solution de lavage soit limpide, et observées de façon macroscopique et microscopique. Les puits sont placés sous un microscope renversé (AE31 ; Motic). Les images prises avec une caméra (Moticam) placée sur le microscope sont analysées afin d'évaluer la coloration rouge-orange du calcium déposé dans les puits.
2. Résultats
Les observations macroscopiques et microscopiques mettent en évidence une coloration ARS positive, avec une augmentation de la coloration ARS du jour 21 au jour 28 et, par conséquent, une augmentation du dépôt de calcium/phosphate au cours du temps (figure 5). Ces résultats montrent que des cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine sont capables de synthétiser une matrice osseuse et de minéraliser celle-ci par dépôt de calcium et de phosphate. Plus particulièrement, ces résultats montrent que les cellules ostéoformatrices B présentent des propriétés ostéogéniques élevées.
Exemple 4 : capacité de chondrogenèse in vitro de cellules dérivées de CSM B obtenues par le procédé de l’exemple 1
1. Procédures expérimentales
Dans des conditions de culture spécifiques, des cellules dérivées de CSM obtenues par le procédé de l'exemple 1 peuvent subir une différenciation en chondrocytes. Ces conditions comprennent la conformation tridimensionnelle des cellules en agrégats où une densité cellulaire élevée et les interactions intercellulaires contribuent au mécanisme de la chondrogenèse. Brièvement, les cellules ostéoformatrices B dérivées de CSM obtenues après culture secondaire comme décrit dans la section 1.1 de l'exemple 1 ci-dessus sont collectées et remises en suspension dans du milieu de différenciation chondrogénique et placées dansB des 18/5662 plaques de 96 puits (fond conique non adhérent) à une densité de 2,5 x 105 cellules/puits. Le milieu de culture chondrogénique est constitué du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), riche en glucose (4,5 g/l) (DMEM-HG, Lonza) supplémenté avec 10% d'insuline humaine, de transferrine humaine, et de sélénite de sodium (ITS) (ITS+1, Sigma-Aldrich), 1 % de pyruvate de sodium (Lonza), dexaméthasone 10-7 M (Sigma), acide ascorbique 1 pM (Sigma) et 10 ng/ml de TGF-ß1 (HumanZyme). Le témoin négatif est constitué de milieu chondrogénique sans facteurs de différenciation solubles, dexaméthasone, acide ascorbique et TGF-ß1. Des plaques multipuits sont ensuite centrifugées à 200 x g pendant 5 min pour former des agrégats de cellules et sont ensuite placées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % air et 5 % CO2 pendant 3 semaines. Le milieu de culture chondrogénique est remplacé tous les 2 ou 3 jours. L'observation macroscopique 24 heures après la formation d'agrégats montre que des agrégats de cellules flottent librement dans les milieux de culture.
Trois semaines après l'induction de la chondrogenèse, les agrégats cellulaires sont collectés et traités pour analyse histologique : les agrégats cellulaires collectés sont fixés dans du formaldéhyde à 3,7 % et inclus dans de la cire de paraffine. Des blocs de paraffine sont découpés en sections de 5 μm. Les coupes sont colorées avec (i) de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E), (ii) du bleu de toluidine et de la safranine orange pour colorer les protéoglycanes et (iii) du rouge sirius pour colorer les fibres de collagène. Le procédé consiste en une déparaffinisation standard, une coloration, une déshydratation et un montage sur une lame de verre. Les coupes colorées sont observées qualitativement au microscope (cellularité, localisation et aspect des cellules, aspect de la matrice extracellulaire et teneur en collagène et en protéoglycanes).
2. Résultats
Les observations microscopiques et les mesures de diamètre des agrégats indiquent que les agrégats de cellules cultivés dans du milieu chondrogénique présentent une taille supérieure à celle des agrégats de cellules cultivés dans un milieu témoin (données non présentées). Ces augmentations de taille dans du milieu chondrogénique pourraient être associées à (1) la production et l'accumulation de matrice extracellulaire par les cellules et/ou (2) la prolifération cellulaire dans l'agrégat.
L'observation qualitative de coupes d'agrégats colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine met en évidence des différences de morphologie cellulaire entre le milieu témoin et le milieu chondrogénique (coloration H&E, figure 6). En effet, dans le milieu témoin, des « micronoyaux » sont observés et il est difficile d'observer le cytoplasme cellulaire. Tandis que dans du milieu chondrogénique, deux types de cellules peuvent être observés : des cellules à noyau aplati (à la périphérie des agrégats) et, à mesure qu'on s'éloigne de la périphérie, des cellules à noyau arrondi. La différenciation chondrogénique est confirmée par la coloration des protéoglycanes et du collagène de la matrice extracellulaire cartilagineuse. En comparaison, les agrégats témoins 18/5662 ne présentent aucune coloration positive pour toutes les colorations testées (coloration au bleu de toluidine, à la safranine orange et au rouge sirius, figure 6).
Ces résultats montrent que les cellules ostéoformatrices B générées avec FGF-2, TGF-βΙ et l'héparine sont capables de produire une matrice extracellulaire abondante principalement composée de molécules spécifiques au cartilage telles que le collagène et les protéoglycanes, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu chondrogénique.
Exemple 5 : sécurité in vivo de cellules ostéoformatrices A et B obtenues par le procédé de l’exemple 1
1. Procédures expérimentales
1.1 Culture de cellules et préparation de plasma
La culture de cellules et la préparation de plasma sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1.
Avant l'administration, les cellules ostéoformatrices A et B sont évaluées pour la viabilité, la taille de cellule, l'identité (comprenant l'expression d'antigènes de surface par analyse par cytométrie en flux, l'activité enzymatique ALP et le dosage par coloration d'ALP) et la stérilité.
1.2 Étude de toxicité chez des souris
Des souris NMRI-nude mâles et femelles âgées de douze semaines reçoivent l'un des produits suivants par injection intraveineuse : (i) cellules ostéoformatrices A (5 millions de cellules en suspension dans 200 pl d'excipient), (ii) cellules ostéoformatrices A (5 millions de cellules en suspension dans 200 pl d'excipient) avec de l'héparine (Héparine LEO 100 UI/ml, LEO Pharma SA, lot A17605 ; 4 unités) ou (iii) cellules ostéoformatrices B (5 millions de cellules en suspension dans 200 pl d'excipient). Le témoin est constitué de 200 pl d'excipient (seul). L'administration du témoin et des produits expérimentaux est effectuée sous forme de bolus lent, par injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue. La durée de l'injection est d'au moins 60 secondes. La quantité de cellules et le volume administré par animal sont constants.
Les animaux sont observés pendant une durée allant jusqu'à 6 mois, et plusieurs paramètres sont surveillées et/ou évalués pendant le suivi, entre autres : mortalité et morbidité, poids corporel des animaux, observations cliniques/examen physique, analyse hématologique et chimique du sang et collecte d'organes pour analyses histopathologiques après euthanasie des animaux.
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1.3 Analyse histopathologique
Les poumons des souris sont collectés pour analyse histopathologique. Les poumons des souris collectés sont traités pour analyse histopathologique : les échantillons sont déshydratés et inclus dans de la cire de paraffine. Des sections sont découpées de 3 à 5 μm d'épaisseur (coupes transversales) et colorées pour l'hématoxyline et l'éosine. Les lames sont soumises à un pathologiste qualifié pour déterminer la ou les cause(s) de mortalité aiguë.
2. Résultats
2.1 Toxicité aiguë
Une étude de toxicité est conduite pour évaluer les effets indésirables possibles de l'injection intraveineuse de cellules ostéoformatrices A (générées avec FGF-2 et TGF-βΙ) et de cellules ostéoformatrices B de petite taille (générées avec FGF-2, TGF-βΙ et l'héparine) chez des souris.
Comme décrit dans le tableau 16, une mortalité aiguë (10-35%) est observée après administration intraveineuse de cellules ostéoformatrices A (A-1 et A-2), et l'ajout d'anticoagulant héparine (4 unités) dans la suspension de cellules ne diminue pas cette mortalité (A-3 à A-5 avec de l'héparine). Par contre, aucune toxicité aiguë n'est observée après administration intraveineuse de témoin (excipient) et de cellules ostéoformatrices B de petite taille (B-1 à B-4).
Tableau 16 : profil de taille de cellule de cellules ostéoformatrices A et B et toxicité aiguë observée après injection intraveineuse chez des souris
Lot de cellules ostéoformatrices Moyenne (μm) Max (μm) Min (μm) Nombre de cellules > 30 μm Toxicité aiguë
A-1 ND ND ND ND 10% (4/40)
A-2 ND ND ND ND 35% (14/40)
A-3 + héparine 21,7 34,9 14,1 1 cellule/20 0% (0/20)
A-4 + héparine 38,2 57,6 18,6 17 cellules/20 21% (4/19)
A-5 + héparine 26,8 53,6 53,6 5 cellules/28 75% (3/4*)
B-1 17,5 29,5 11,6 Aucune 0% (0/19)
B-2 21,5 30,8 16,9 1 cellule/20 0% (0/20)
B-3 14,3 21,2 8,7 Aucune 0% (0/18)
B-4 17,7 25,0 13,3 Aucune 0% (0/17)
* Les injections ont été arrêtées après le décès de 3 animaux (sur les 15 prévus).
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ND : non déterminé
2.2 Examen histopathologique
Après euthanasie, une autopsie est effectuée sur tous les animaux. Les souris ayant reçu une injection de cellules ostéoformatrices B de petite taille présentent une architecture pulmonaire globalement normale, sans observation d'embolisation cellulaire des capillaires alvéolaires ou bronchiolaires (figure 7A). Les souris ayant reçu une injection de cellules ostéoformatrices A présentent des lésions pulmonaires caractérisées par une embolisation disséminée modérée à sévère des capillaires alvéolaires et bronchiolaires par un nombre élevé de cellules de taille moyenne (interprétées comme étant des cellules infectées) fréquemment accompagnée d'une inflammation interstitielle aiguë (figure 7B) : 30 % à 50 % des capillaires alvéolaires et des artérioles bronchiolaires de taille petite à moyenne sont dilatés de façon aléatoire par des groupes de cellules qui bloquent la totalité de la lumière vasculaire. Des groupes plus grands de capillaires occlus compriment les bronchioles dans leur voisinage et sont entourés par un collapsus alvéolaire. Des microhémorragies intra-alvéolaires et intrabronchiolaires sont observées rarement à proximité de groupes de cellules.
La caractéristique principale de tous les échantillons observés est une embolisation disséminée modérée à sévère des capillaires alvéolaires et bronchiolaires par un nombre élevé de cellules injectées (cellules ostéoformatrices A). Le nombre de ces cellules, ainsi que le nombre de capillaires alvéolaires occlus suggère que les échanges gazeux dans les alvéoles pourraient être fortement perturbés, entraînant un collapsus du système respiratoire. Il est très probable que ce processus soit responsable de la mort des animaux examinés. La congestion vasculaire et les microhémorragies observées sont interprétées comme des changements agonaux.
Aucune formation de microthrombus n'a été observée dans le cœur, le foie, les reins ou la rate.
Exemple 6 : propriétés de formation osseuse in vivo de cellules ostéoformatrices A et B obtenues par le procédé de l’exemple 1
Le modèle de formation osseuse de voûte crânienne consiste en une administration souscutanée unique de 2,5 x 106 cellules ostéoformatrices, formulées dans 100 pl d'excipient (ou 100 pl d'excipient seul en tant que témoin négatif) sur la voûte crânienne de souris NMRI-nude femelles âgées de 12 semaines. À des temps spécifiques, des colorants fluorescents fixant le calcium (à savoir le rouge d'alizarine, le vert de calcéine, le bleu de calcéine et la tétracycline) sont administrés pour marquer la néoformation osseuse. Le rouge d'alizarine est administré avant l'administration de cellules ostéoformatrices, tandis que le vert de calcéine, le bleu de calcéine et la tétracycline sont administrés après l'administration de cellules ostéoformatrices. Les animaux de laboratoire sont suivis pour le poids corporel, les signes cliniques généraux et les signes cliniques au site d'administration pendant les 2 semaines suivant l'administration.
Après 2 semaines, les animaux de laboratoire sont euthanasiés pour évaluer les propriétésEde 18/5662 formation osseuse des cellules ostéoformatrices par radiographie, histomorphométrie (quantification de la formation osseuse) et immunofluorescence.
1. Procédures expérimentales
1.1 Culture de cellules et préparation de plasma
La culture de cellules et la préparation de plasma sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1.
1.2 Souris
Des souris NMRI-nude femelles (nu/nu) de 9 à 10 semaines sont achetées à Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle, France) et logées dans des conditions standard avec de la nourriture et de l'eau à volonté. 196 souris sont utilisées au total pour la présente étude.
1.3 Modèle de formation osseuse de voûte crânienne chez la souris
Des souris NMRI-nude (nu/nu) femelles âgées de douze semaines (n = 137) sont anesthésiées avec de l'isoflurane (IsoFlo®) et reçoivent une administration sous-cutanée unique de CSM, de cellules ostéoformatrices A (générées avec FGF-2 et TGF-ß1) ou de cellules ostéoformatrices B (générées avec FGF-2, TGF-ß1 et l'héparine) (2,5 x 106 cellules dans 100 pl par souris) ou un excipient (100 pl) sur l'os de la voûte crânienne. Pour marquer la néoformation osseuse au cours du temps, des fluorochromes se liant au calcium sont administrés séquentiellement à des souris. Du rouge d'alizarine (rouge), des calcéines (verte et bleue) et de la tétracycline (jaune) (tous de Sigma-Aldrich®) sont injectés par voie intrapéritonéale 3 jours avant et 4, 8 et 12 jours après l'administration de cellules, respectivement. Les animaux de laboratoire sont suivis pour le poids corporel, les signes cliniques généraux et les signes cliniques au site d'administration pendant les 2 semaines suivant l'administration. Les souris peuvent être euthanasiées 2 semaines après l'administration de cellules par dislocation cervicale et la voûte crânienne de chaque souris est collectée pour évaluer les propriétés de formation osseuse par histomorphométrie (quantification de formation osseuse) et immunofluorescence.
1.4 Inclusion d’échantillon et sectionnement histologique
Pour l'histomorphométrie, ALP, TRAP (phosphatase acide résistante au tartrate), les colorations de trichrome de Masson-Goldner et l'immunofluorescence, les voûtes crâniennes sont fixées et déshydratées avec des incubations successives dans un bain d'éthanol à 70 %, 80 % et 90 %, pendant 12 heures à 4 °C sous agitation douce, et inclus dans de la résine plastique de méthacrylate d'hydroxyéthyle (HEMA) (HistoResin, Leica®). Des coupes coronales de 4 μm et 8 μm d'épaisseur sont découpées au moyen d'un microtome (Leica®, RM2255). Pour la coloration à la safranine orange et l'immunopéroxydase, les voûtes crâniennes sont fixées dans du formaldéhyde à 3,7 % pendant 24 heures, décalcifiées dans de l'acide d'épaisseur sont
BE2018/5662 éthylenediaminetétraacétique a 10% (EDTA) pH 7,4 pendant trois jours et incluses dans de la paraffine. Des coupes à la paraffine coronales et sagittales de 7 μm découpées au moyen d'un microtome (Leica®, RM2255).
1.5 Coloration par immunofluorescence
L'évaluation du collagène I humain et murin par immunofluorescence est effectuée sur des coupes histologiques plastiques coronales de 4 μm d'épaisseur de voûte crânienne. Brièvement, après une étape de perméabilisation au moyen d'une solution de PBS 1X/Triton 0,3 % pendant 30 min a température ambiante (TA), les coupes histologiques sont incubées pendant 1 heure a TA dans la solution de blocage (à savoir, PBS/BSA/sérum de cheval/TritonTM) pour saturer les sites de liaison non spécifique. Les lames histologiques sont ensuite incubées pendant une nuit a 4 °C avec des anticorps primaires de souris anti-collagène I humain et de lapin (Abcam ; n° ab138492 et Abcam; n° ab21286, respectivement). Après 3 étapes de rinçage dans PBS pendant 5 min a TA, un blocage est effectué avec la solution de blocage pendant 1 heure a TA. Les anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage sont ensuite ajoutés pendant 2 heures a TA a l'abri de la lumière. Les anticorps secondaires d'âne anti-IgG de lapin Alexa Fluor® 488 H&L (ThermoFisher, n° A21206) et de chèvre anti-IgG de souris Alexa Fluor® Cy3® H&L (Abcam; n° ab97035) sont utilisés pour visualiser le collagène I murin en vert et le collagène I humain en rouge, respectivement. Les lames sont ensuite rincées 3 fois dans PBS 1X pendant 5 minutes a TA et incubées avec une solution de NucBlue® pendant 1 minute a TA pour colorer le noyau. Enfin, les lames sont brièvement rincées une fois dans PBS puis montées dans le réactif GlycerGel®. En tant que témoin négatif d'immunofluorescence, l'omission de l'anticorps primaire est effectuée sur une lame histologique adjacente.
1.6 Coloration histologique
Les activités ostéoblastique et ostéoclastique sont évaluées sur des coupes de voûte crânienne, respectivement, en utilisant des procédés de détection d'activité enzymatique ALP et TRAP, respectivement. Pour la coloration d'ALP, des coupes plastiques coronales de voûte crânienne de 4 μm d'épaisseur sont incubées pendant 1 heure avec une solution de sel de bleu solide RR (Sigma-Aldrich®) et de phosphate alcalin de naphtol AS-MX (Sigma-Aldrich®). La coloration de TRAP est effectuée sur des coupes plastiques coronales de voûte crânienne de 8 μm d'épaisseur au moyen du kit Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) (Sigma-Aldrich®) conformément aux instructions du fabricant. Afin d'évaluer l'état de la minéralisation de l'os néoformé, une coloration de trichrome de Masson-Goldner est effectuée sur les coupes de voûte crânienne colorées avec ALP au moyen d'un kit (Bio-Optica®) conformément aux instructions du fabricant. Afin de mettre en évidence la formation de cartilage, une coloration a la safranine orange est réalisée sur des coupes a la paraffine sagittales de voûte crânienne de 7 μm d'épaisseur. Brièvement, après déparaffinisation, les coupes histologiques sont successivement incubées dans de l'hématoxyline de Weigert (Klinipath®) pendant 10 minutés, 0,1% de vert solide (Klinipath®) pendant 5 min, 1 % d'acide acétique (VWR Chemicals) pendant 15 secondes et 0,1 % de safranine orange. (Fluka® réf. 84120) pendant 5 min. Après déshydratation, les lames sont montées avec des lamelles de verre au moyen de Pertex® (HistoLab®). Des images numériques sont prises avec un microscope optique (Leica®) et le logiciel Leica® LAS EZ.
1.7 Immunoperoxydase
Après déparaffinisation, des coupes à la paraffine coronales ou sagittales de voûte crânienne de 7 μm d'épaisseur sont successivement incubées avec de la hyaluronidase à 2,5 % (SigmaAldrich®) pendant 30 min à 37 °C dans H2O2 à 3 % (Sigma-Aldrich®) pendant 30 min à température ambiante, dans PBS contenant 0,3% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich®) pendant 30 min à température ambiante et dans une solution de blocage (c'est-à-dire PBS/BSA/sérum de cheval/Triton) pendant 1 heure à température ambiante. Les coupes sont incubées pendant une nuit à 4 °C avec des anticorps primaires de souris anti-collagène de type I humain (Abcam, ab90395), des anticorps primaires de lapin anti-collagène I murin (Abcam, ab21286) ou des anticorps primaires de lapin anti-Ku80 (Abcam, ab80592). La coloration est visualisée au moyen d'un kit Vectastain (Vector Laboratories, PK6200) et de 3,3'-diaminobenzidine (Vector Laboratories), conformément aux instructions du fabricant. Les coupes sont contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer (Klinipath®). Les lames sont montées avec des lamelles de verre au moyen de Pertex®.
1.8 Analyses histomorphométriques de voûtes crâniennes : quantification de la formation osseuse
La quantification de la formation osseuse (c'est-à-dire, le pourcentage de formation osseuse) est effectuée sur des tissus inclus dans du plastique. Les mesures de l'épaisseur initiale (front de minéralisation basale marquée par fluorescence au rouge d'alizarine) et finale (néoformation osseuse marquée par fluorescence à la calcéine et la tétracycline) des voûtes crâniennes sont mesurées (en μm) sur une coupe coronale de 4 μm d'épaisseur par le logiciel d'analyse d'image ZEN® (Zeiss). Les épaisseurs initiale et finale de la voûte crânienne sont ensuite utilisées pour calculer le pourcentage de néoformation osseuse dans chaque animal de laboratoire après administration. Pour chaque animal, 4 mesures d'épaisseur initiales et finales sont effectuées sur 5 niveaux indépendants, avec une distance de 200 μm entre chaque niveau. Dans un premier temps, la moyenne des épaisseurs initiale et finale ± ET (c'est-à-dire la moyenne des 4 mesures par niveau sur les 5 niveaux) est calculée pour chaque animal. Ensuite, le pourcentage de formation osseuse pour chaque souris est calculé comme étant le rapport de la moyenne d'épaisseur finale à la moyenne d'épaisseur initiale.
1.9 Quantification de la surface d’os néoformé sur des images histologiques18/5662 (logiciel ImageJ®)
Pour l'analyse de surface d'ostéo-induction et des nodules ostéogéniques, des images numériques de 6 niveaux indépendants, prises tous les 2 niveaux après la suture coronale sont prises sur des coupes histologiques en résine plastique (4 μm) de voûte crânienne, en utilisant une combinaison de plusieurs filtres de fluorescence et en champ clair du microscope à fluorescence (Zeiss Axioscope A1, Zeiss, Allemagne). À chaque niveau mesuré, la sélection de la néoformation osseuse ostéo-induite est définie manuellement dans des images assemblées en champ clair au moyen du logiciel ImageJ®. Les surfaces minéralisées et totales de cette sélection sont mesurées (en mm2). La même procédure est conduite pour les surfaces minéralisées et totales des nodules ostéogéniques.
Pour l'ostéo-induction et les nodules d'ostéogénie, la moyenne de la surface totale et la moyenne de la surface minéralisée sont ensuite calculées par animal de laboratoire et par groupe. La surface totale de néoformation osseuse est finalement calculée comme étant la somme de la surface d'ostéo-induction et des nodules ostéogéniques.
1.10 Analyses statistiques
Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard sur la moyenne (SEM). Les analyses statistiques sont effectuées au moyen du logiciel JMP® (SAS Institute Inc.). Pour les données in vitro (cytométrie en flux, RT-qPCR et multiplexe), des tests t appariés sont effectués sur les valeurs transformées en log10 et pour les données in vivo, des tests U de Mann-Whitney sont utilisés. Sauf indication contraire, les différences entre les groupes sont considérées comme étant statistiquement significatives lorsque p < 0,05.
2. Résultats
Des cellules ostéoformatrices A (générées avec FGF-2 et TGF-βΙ) et des cellules ostéoformatrices B (générées avec FGF-2, TGF-βΙ et l'héparine) présentent une formation osseuse significativement supérieure à celle des témoins (excipient) 2 semaines après l'administration (figures 8-9, tableau 17). Plus particulièrement, la figure 10 montre que les cellules ostéoformatrices B présentent des propriétés ostéo-inductrices (formation osseuse homogène d'origine murine sur la voûte crânienne) et des propriétés ostéogéniques (nodules minéralisés d'origine humaine et murine).
Tableau 17: Quantification de la formation osseuse (%) sur des coupes de voûte crânienne murine. Les voûtes crâniennes sont traitées avec un excipient (témoin négatif), des cellules ostéoformatrices A ou des cellules ostéoformatrices B.
Nombre de lots Nombre d’animaux % de formation
8/5662
LJI 2 U osseuse Moyenne ± ET
Excipient - 59 107 ± 2
Cellules ostéoformatrices A 10 39 165 ± 19
Cellules ostéoformatrices B 7 30 158 ± 23
Abréviations : ET : écart type
Les propriétés ostéo-inductrices (c’est-à-dire, la quantité d'os murin nouvellement formé postimplantation) sont équivalentes pour les cellules ostéoformatrices A et B (figures 8 à 9).
Il est très intéressant de noter que les cellules ostéoformatrices B de la présente invention présentent des propriétés ostéogéniques et ostéo-inductrices puissantes, comme indiqué par la quantité élevée d’os humain et murin nouvellement formé après implantation (coloration de Coll IF humain et murin, figure 10).
La présence de nodules est observée chez 7/8 donneurs et 80 % des souris pour les cellules ostéoformatrices B et 4/11 donneurs et 20 % des souris pour les cellules ostéoformatrices A.
Aucun nodule n’est observé après l’administration de CSM ou d’excipient. Outre les activités d’ostéo-induction, les cellules ostéoformatrices B favorisent donc une activité ostéogénique élevée mise en évidence par la présence de grands nodules minéralisés observés chez 80 % des souris traitées, tandis que les cellules ostéoformatrices A présentent une faible activité ostéogène, c’est-à-dire des petits nodules chez seulement 20 % des souris traitées (tableau 18).
Tableau 18: quantification de la présence de nodules minéralisés sur des voûtes crâniennes murines deux semaines après administration sur la voûte crânienne d'excipient, de CSM, de cellules ostéoformatrices A ou de cellules ostéoformatrices B
Occurrence d’ostéogénie Donneur Lot Animal
Excipient SO SO 0/32 (0%)
CSM 0/2 0/2 0/14 (0%)
Cellules ostéoformatrices A 4/10 (40%) 4/11 (36%) 9/45 (20%)
Cellules ostéoformatrices B 7/8 (88%) 7/8 (88%) 37/46 (80%)
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses ; SO : sans objet
BE2018/5662 La coloration histologique de coupes coronales de voute crânienne murines deux semaines après administration (excipient seul, CSM, cellules ostéoformatrices A (générées avec FGF-2 et TGF-P1; cellules o-f A) ou cellules ostéoformatrices B (générées avec FGF-2, TGF-P1 et l'héparine; cellules o-f B)) indique que toutes les conditions traitées (CSM, cellules o-f A et o-f B) présentent un potentiel élevé d'ostéo-induction avec une activité de remodelage moyenne (coloration ALP et TRAP) dans l'os formé par ostéo-induction.
Il est intéressant de noter que les nodules minéralisés observés chez les souris traitées avec des cellules ostéoformatrices B sont constitués de tissus osseux murin (hôte) et humain (donneur) (indiqué par une coloration de collagène de type I humain et murin), ce qui démontre que les nodules sont formés par des processus de formation osseuse : ostéogénie (formation d'os du donneur) et processus d'ostéo-induction (formation d'os de l'hôte). Outre des activités ostéoblastique et ostéoclastique élevées (coloration ALP + TRAP), les nodules présentent un tissu ostéoïde (tissu non minéralisé), ce qui suggère que la formation osseuse a continué de progresser deux semaines après l'administration, alors que le processus d'ostéo-induction observé dans toutes les conditions était déjà terminé (figure 12).
La figure 12 montre que la formation d'os humain (c'est-à-dire, l'ostéogénie) (observée avec une coloration anti-collagène de type I humain) et des activités élevées des ostéoblastes et des ostéoclastes (observées avec la coloration ALP + Goldner et la coloration TRAP, respectivement) sont principalement détectées dans les nodules des souris ayant reçu des cellules ostéoformatrices B, ce qui démontre que le processus de formation osseuse dans les nodules était en cours et n'était pas terminé après 2 semaines, contrairement au processus d'ostéo-induction de CSM et de cellules ostéoformatrices A, qui semblait être terminé. Toutes les conditions traitées (CSM, cellules o-f A, cellules o-f B) indiquent un potentiel élevé d'ostéoinduction avec une activité de remodelage modérée (coloration ALP et TRAP) dans la formation osseuse ostéo-induite (figure 12).
La néoformation osseuse est évaluée par fluorescence deux semaines après le traitement avec un excipient seul, des CSM, des cellules o-f A ou o-f B (figure 13). À cet effet, à des temps spécifiques, des colorants fluorescents se liant au calcium (à savoir le rouge d'alizarine, le vert et bleu de calcéine, le jaune de tétracycline) sont administrés pour marquer la néoformation osseuse. Le dernier fluorochrome administré est la tétracycline, 12 jours après l'administration des cellules.
Comme indiqué sur la figure 13, les nodules des souris ayant reçu des cellules ostéoformatrices B sont principalement colorés par le fluorochrome tétracycline (la coloration jaune est entourée en pointillé sur la figure 13), ce qui confirme un stade de formation ultérieur par rapport à l'ostéo-induction observée dans la formation osseuse ostéo-induite (rouge d'alizarine (rouge), calcéine (verte et bleue) : ces colorations apparaissent en gris clair et une double flèche indique l'épaisseur de la formation osseuse).
BE2018/5662 La néoformation osseuse des souris traitées est évaluée par une quantification de la surface d'os néoformé sur des images histologiques (logiciel ImageJ®). La surface totale de l'os néoformé est déterminée en additionnant les aires de surface ostéo-induite et des nodules osseux pour chaque niveau analysé et chaque souris.
Les résultats montrent que les cellules ostéoformatrices B (n = 7 souris, représentées sur la figure 14 en gris clair) augmentent significativement la néoformation osseuse 2 semaines après l'administration des cellules, d'environ 2 fois par rapport à des CSM (n = 6 souris, représentées sur la figure 14 en gris foncé ; tableau 19). Cette différence était due à la propriété d'ostéogénie élevée présentée par les cellules ostéoformatrices B et à l'absence de cette propriété chez les CSM.
Tableau 19 : mesure de la néoformation osseuse totale comprenant l’ostéo-induction et la formation ostéogénique sur des coupes coronales
Type de cellul es (du même donn eur) Nombr e d'anim aux Ostéo-induction Ostéogénie (nodules) Total (ostéo-induction + ostéogénie)
Aire minéralisé e (mm2) (moyenne ±ET) Aire totale (mm2) (moyenne ± ET) Aire minéralisé e (mm2) (moyenne ±ET) Aire totale (mm2) (moyenne ± ET) Aire minéralisé e (mm2) (moyenne ±ET) Aire totale (mm2) (moyenne ± ET)
CSM 6 0,42 ± 0,09 0,57 ± 0,17 0 0 0,42 ± 0,09 0,57 ± 0,17
cellule s o-f B 7 0,43 ± 0,16 0,59 ± 0,25 0,22 ± 0,19 0,57 ± 0,53 0,65 ± 0,30 1,16 ± 0,71
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ET : écart type
En outre, l'évaluation de la néoformation osseuse au cours du temps en utilisant une coloration histologique indique que les nodules observés au sommet de la voûte crânienne de souris ayant reçu des cellules ostéoformatrices B subissent une ossification par l'intermédiaire d'un mécanisme d'ossification endochondral. Sur la figure 15, la coloration à la safranine orange indique une matrice de protéoglycanes (spécifique au cartilage) (zone entourée par un trait pointillé); les noyaux ; le tissu osseux ; et le cytoplasme. Contrairement à l'os ostéo-induit, qui est produit par ossification intramembranaire, les nodules osseux sont produits par ossification endochondrale, la matrice cartilagineuse apparaissant entre 1 et 3 semaines après l'administration (figure 15).
Les colorations immunohistochimiques ciblant le collagène de type I humain, le collagène de type I murin et le noyau humain (c'est-à-dire, Ku80) effectuées 4 semaines après l'administration de cellules ostéoformatrices B confirment la présence d'os humain dans ^es 18/5662 nodules. De plus, la coloration de Ku80 indique que des cellules ostéoformatrices B sont greffées dans la matrice osseuse (nodules) et deviennent des ostéocytes après administration in vivo.
Exemple 7 : défaut de taille subcritique (sub-CSD) de segmentation fémorale de souris réparé in vivo réparée par des cellules ostéoformatrices obtenues par le procédé de l’exemple 1
1. Procédures expérimentales
1.1 Modèle de défaut de taille subcritique (sub-CSD) de segmentation fémorale
L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions d'asepsie selon la littérature (Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80 ; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940). Brièvement, des souris NMRI-nude (nu/nu) femelles âgées de 13 semaines (n = 27) sont anesthésiées avec une injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de dexmédétomidine (Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg de poids corporel) et de kétamine (Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg de poids corporel) et sont placées en position ventrale sur une plaque chauffante. Après application d'une plaque de microverrouillage en titane à 6 trous (RISystem AG®) sur la face antérieure du fémur gauche, une ostéotomie fémorale diaphysaire de 2 mm de long est réalisée à l'aide d'une scie Gigli et d'un pied à coulisse (RISystem AG®). En traitement préventif, des antibiotiques (Baytril®, 10 mg/kg de poids corporel) sont administrés la veille de la chirurgie (dans de l'eau potable) et des analgésiques (chlorhydrate de buprénorphine, Temgesic®, Schering-Plough, 0,1 mg/kg de poids corporel) sonts administré la veille de la chirurgie et toutes les 12 heures pendant au moins 3 jours après la chirurgie. Des cellules dérivées de CSM (2,25 x 106 cellules dans un volume de 30 pl par souris) ou l'excipient (groupe témoin) sont administrés le jour de la chirurgie (juste après la fermeture de la plaie avec des sutures chirurgicales), localement au site de défaut osseux, par injection percutanée à l'aide d'une seringue Hamilton de 50 pl. Les souris sont euthanasiées 6 semaines après l'administration de cellules ou d'excipient par dislocation cervicale. Le fémur gauche de chaque souris est disséqué, collecté et conservé dans du NaCl à 0,9 % à température ambiante jusqu'à la radiographie.
1.2 Quantification de la réparation osseuse par radiographie
Une imagerie radiographique in vivo du fémur gauche de chaque souris est effectuée à l'aide de l'appareil Faxitron® MX-20 juste après l'opération afin de contrôler la fixation de la plaque, la taille du défaut fémoral segmentaire et d'obtenir une référence, toutes les deux semaines jusqu'à 6 semaines après l'administration de cellules ou dérivées de CSM ou d'excipient. Des images numériques sont prises dans des vues médio-latérale et antéro-postérieure à un grossissement 4x, en mode manuel, avec une tension réglée à 35 kV, une durée d'exposition
BE2018/5662 de 4,8 secondes, une luminosité de 4 300 et un contraste de 7 100. Une imagerie par radiographie ex vivo est effectuée sur les fémurs gauches prélevés lors de l'euthanasie, 6 semaines après l'administration des cellules. Des images numériques sont prises en vues médio-latérale et antéro-postérieure à un grossissement 5x, en mode manuel, avec une tension réglée à 26 kV, une durée d'exposition de 15 secondes, une luminosité de 4 850 et un contraste de 6 850. La taille de défaut est quantifiée au cours du temps pour chaque souris en mesurant la distance (μm) entre les deux bords du défaut osseux à trois emplacements (droite, centre et gauche du défaut) sur des images radiographiques médio-latérales et antéro-postérieures, à l'aide du logiciel ImageJ®. La moyenne des six mesures est calculée pour chaque souris à chaque temps.
1.3 Analyse par microtomodensitométrie (micro-TDM)
Après collecte à l'euthanasie, les fémurs gauches sont fixés avec du formaldéhyde à 3,7 % et transférés au Centre de microscopie et d'imagerie moléculaire (CMMI, ULB, Gosselies, Belgique) pour des analyses par micro-TDM. Les échantillons sont examinés au moyen d'une caméra TEP/TDM nanoScan® multimodale (Mediso) et du logiciel Nucline™ v2.01 (Mediso). Les scans sont acquis en utilisant un balayage semi-circulaire, un zoom maximal, une tension de tube de 35 kVp, 720 projections par rotation du portique, une durée d'exposition de 300 ms par projection et un compartimentage des pixels de détecteur 1:1. Les longueurs de balayage dans les dimensions X et Y sont adaptées pour chaque acquisition. La durée totale de la micro-TDM est de 3 min 42 s. Chaque scan de micro-TDM est post-reconstruit avec un voxel cubique de 40 μm de côté au moyen d'un filtre de Shepp-Logan et d'un mode de multi-échantillonnage de 8 échantillons réguliers. Les dimensions des images X et Y sont adaptées pour chaque reconstruction. La taille des images Z correspond à la longueur de numérisation définie pour l'acquisition. Une évaluation qualitative de la réparation osseuse est effectuée sur les images micro-TDM après réorientation de l'os avec l'axe Z (axe du scanner) et recadrage de l'image d'une vis proximale à l'autre vis proximale dans l'os fémoral sur l'axe Z, et aussi étroit que possible dans le plan transversal (XY). Ensuite, un rendu 3D de projection à intensité maximale (MIP) est généré. Afin d'évaluer quantitativement la réparation osseuse, un cylindre virtuel de 2 mm de diamètre et de 2 mm de longueur axiale est placé dans l'espace du défaut sur les scans de micro-TDM et le volume osseux moyen est évalué dans ce cylindre par seuillage des voxels ayant une intensité radiologique supérieure à 1500 UH.
2. Résultats
2.1 Les cellules ostéoformatrices B améliorent la réparation de défaut subcritique de segmentation fémorale chez la souris
Dans le modèle de défaut de segmentation de taille subcritique (CSD) chez des souris NMRInude, des cellules ostéoformatrices B (n = 12 souris, 2 lots) permettent d'améliorer la réparation de fracture comme indiqué par une réduction significative de la taille de défaut osseux3 par 18/5662 rapport à l'excipient (n = 11 souris) et aux cellules ostéoformatrices A (n = 4 souris) de 2 à 6 semaines après l'administration (figure 16A).
Les images radiographiques de défauts segmentaires fémoraux à J0 et 6S après l'administration de l'excipient, des cellules ostéoformatrices A (non représenté) ou des cellules ostéoformatrices B produisent une réduction de la taille du défaut osseux chez des souris recevant des cellules ostéoformatrices B selon un mode de réalisation de l'invention par rapport aux souris ayant reçu l'excipient (figure 16B) ou des cellules ostéoformatrices A (non représenté).
Les volumes de réparation osseuse de défaut de segmentation fémorale sont quantifiés par des analyses de microtomodensitométrie (micro-TDM) à 6S après l'administration de l'excipient et de cellules ostéoformatrices B. Les résultats confirment que les cellules ostéoformatrices B induisent une réparation osseuse supérieure à celle de l'excipient (figure 16C).

Claims (15)

1. Procédé d'obtention de cellules dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM) à partir de CSM, lesdites cellules dérivées de CSM étant des cellules de lignée mésenchymateuse obtenues par différenciation de CSM in vitro ou ex vivo, comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) et l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
2. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes de :
(a) culture de CSM récupérées à partir d'un échantillon biologique d'un sujet dans un milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml ;
(b) élimination de la matière non adhérente et poursuite de la culture des cellules adhérentes dans le milieu comprenant FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, de façon à obtenir les cellules dérivées de CSM.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-β! TGF^2, TGF^3, et des mélanges de ceux-ci ; de préférence dans lequel TGF-β est TGF-β!
4. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM ayant des propriétés de transplantation améliorées à partir de CSM, le procédé comprenant une étape de réduction de taille, dans lequel ladite étape de réduction de taille est caractérisée par la mise en contact de CSM ou de cellules dérivées de CSM in vitro ou ex vivo avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :
- la concentration d'héparine ou d'un dérivé ou d'analogue de celle-ci est d'au moins
0,05 UI/ml, de préférence d'environ 0,1 UI/ml ; et/ou
- l'héparine ou le dérivé d'héparine ou l'analogue de celle-ci est choisi dans le groupe constitué d'une héparine non fractionnée (HNF) ; d'une héparine de bas poids moléculaire (HBPM), telle que l'énoxaparine, la daltéparine, la nadroparine, la tinzaparine, la certoparine, la réviparine, l'ardéparine, la parnaparine, la bémiparine, ou des mélanges de celles-ci ; d'un héparinoïde, tel que le sulfate d'héparane, le sulfate de dermatane, le sulfate de chondroïtine, le sulfate d'acharane, le sulfate de kératane, ou des mélanges de ceux-ci, tel que le danaparoïde ; d'un sel d'héparine ; d'un sel d'héparinoïde ; d'un fragment d'héparine ; d'un fragment d'héparinoïde ; et des mélanges de ceux-ci.
BE2018/5662
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans lequel au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique, de préférence ostéoblastique.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les CSM ou cellules dérivées de CSM sont en outre mises en contact avec, (par exemple lorsque le milieu comprend en outre, l'un ou plusieurs éléments parmi) le plasma, sérum ou un substitut de ceuxci.
9. Procédé d'obtention de cellules dérivées de CSM à partir de CSM comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-β et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, dans lequel au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans lequel au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel :
- des CSM sont mises en contact avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celleci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml ; et/ou
- TGF-β est choisi dans le groupe constitué de TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, et des mélanges de ceux-ci ; de préférence dans lequel TGF-ß est TGF-ß1.
11. Population de cellules dérivées de CSM, qui sont des cellules de lignée mésenchymateuse obtenues par différenciation de CSM in vitro ou ex vivo, dans laquelle au moins 60 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre égal ou inférieur à 25 μm (D60 < 25 μm) et dans laquelle au plus 5 % des cellules dérivées de CSM en suspension ont un diamètre supérieur à 35 μm.
12. Population de cellules dérivées de CSM selon la revendication 11, dans laquelle :
- les cellules dérivées de CSM peuvent être obtenues par un procédé comprenant la mise en contact de CSM in vitro ou ex vivo avec FGF-2, TGF-ß et de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci, de préférence dans laquelle TGF-ß est choisi dans le groupe constitué de TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, et des mélanges de ceux-ci, plus préférablement dans laquelle le TGF-ß est TGF-ß1, de préférence dans laquelle les CSM sont mises en contact avec de l'héparine ou un dérivé ou analogue de celle-ci à une concentration d'au moins 0,01 UI/ml, et facultativement les CSM sont en outre mises en contact avec l'un ou plusieurs éléments parmi le plasma, sérum ou un substitut de ceux-ci ; et/ou
BE2018/5662
- les cellules dérivées de CSM sont de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique, de préférence dans laquelle sensiblement toutes les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour CD73, CD63 et CD166 ; sensiblement toutes les cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont négatives pour CD45 ; au moins 70 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour la phosphatase alcaline (ALP) ; et moins de 10 % des cellules dérivées de CSM de lignée ostéochondroblastique ou ostéoblastique sont positives pour HLA-DR.
13. Composition pharmaceutique comprenant la population de cellules dérivées de CSM telle que définie dans la revendication 11 ou 12.
14. Population de cellules dérivées de CSM selon la revendication 11 ou 12 ou composition pharmaceutique selon la revendication 13 pour utilisation en tant que médicament, de préférence pour utilisation dans le traitement d'un sujet ayant besoin d'une greffe de cellules dérivées de CSM.
15. Population de cellules dérivées de CSM pour utilisation selon la revendication 14, dans laquelle :
- la population de cellules dérivées de CSM est présente à une concentration comprise entre environ 1 x 107 cellules/ml et environ 1 x 108 cellules/ml, de préférence 7,5 x 107 cellules/ml ; et/ou
- la population de cellules dérivées de CSM ou la composition pharmaceutique est adaptée pour administration percutanée ou intravasculaire.
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