CN111247240A - 用于分化间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于从MSC获得具有改善的移植特性的MSC衍生的细胞的方法，所述方法包括细胞尺寸减小步骤，其中所述细胞尺寸减小步骤的特征在于使MSC或MSC衍生的细胞在体外或离体与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。本申请还提供了用于从间充质干细胞(MSC)获得间充质干细胞衍生的细胞的方法，包括使MSC在体外或离体与FGF‑2、TGFβ和至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。本发明还提供了如此获得的细胞和细胞的群体，以及包含它们的其它产品及其用途。

Description

用于分化间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及用于间充质干细胞(MSC)的扩增和/或分化的方法，涉及MSC衍生的细胞和细胞群体，并且涉及包含此类细胞和细胞群体的产品、方法和用途。

背景技术

能够经历成骨分化的干细胞、定向于成骨分化的细胞或具有骨形成能力的细胞的移植是治疗骨相关疾病的有前途的途径，特别是当治疗需要产生新骨组织时。

先前已经将间充质干细胞(MSC)用于治疗骨疾患(Gangji等，2005Expert OpinBiol Ther 5:437-42)。然而，尽管可以移植这种相对未分化的干细胞，但它们不定向成骨细胞谱系，因此相当大比例的这种移植的干细胞可能最终不能有助于形成所需的骨组织。此外，这种干细胞的量通常不令人满意。

WO2007/093431涉及一种体外扩增分离的MSC的方法，其产生显示成骨细胞表型的细胞。在所述方法中，在血清或血浆和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在下培养人MSC。

WO2009/087213涉及用于从人MSC体外或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法，其包括使所述MSC与人血浆或血清、FGF-2和转化生长因子β(TGF-β)接触。

对尤其在治疗中有用的新细胞和细胞群体，例如新MSC衍生的细胞和细胞群体，及其生产方法存在持续的需求。

发明概述

如说明本发明的某些代表性实施方案的实验部分所证实的，本发明人认识到，当通过使MSC或MSC衍生的细胞与肝素或衍生物或类似物在体外或离体接触而获得间充质干细胞(MSC)衍生的细胞时，所述细胞的移植潜力可以显著增加。更特别地，本发明人发现，将MSC或MSC衍生的细胞与肝素或衍生物或类似物，优选肝素或其衍生物或类似物以至少0.01IU/ml的浓度接触，产生新的MSC细胞衍生的细胞群，其细胞具有标准化的、均一的和相对小的细胞大小。这种MSC细胞衍生的细胞具有改善的移植性质，例如(i)改善的胃肠外(例如，血管内，包括静脉内)施用的适合性，(ii)以有限体积体内递送可调且高细胞浓度的可能性，(iii)良好的体内安全性和/或(iv)当胃肠外递送时良好的可注射性。

此外，本发明MSC衍生的细胞能够诱导骨形成。除了骨诱导特性外，本发明人发现本发明的MSC衍生的细胞还显示高的成骨活性。成骨活性有利地导致通过软骨内骨化产生的矿化节结的出现。

因此，在一方面，本发明提供了用于从MSC获得具有改善的移植特性的MSC衍生的细胞的方法，所述方法包括尺寸减小步骤，其中所述尺寸减小步骤的特征在于使MSC或MSC衍生的细胞在体外或离体与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

在另一方面，本发明提供了从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，包括在体外或离体使MSC与FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

在另一方面，本发明提供了从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，包括在体外或离体使MSC与FGF-2、TGFβ和肝素或其衍生物或类似物接触，其中悬浮液中至少60％的MSC衍生的细胞具有等于或小于25μM的直径(D₆₀≤25μM)，并且其中悬浮液中至多5％的MSC衍生的细胞具有大于35μM的直径。

在另一方面，本发明提供了可通过MSC的体外或离体扩增获得的MSC衍生的细胞群体，其中悬浮液中至少60％的MSC衍生的细胞具有等于或小于25μM(D₆₀≤25μM)的直径，并且其中悬浮液中至多5％的MSC衍生的细胞具有大于35μM的直径。

在另一方面，本发明提供了包含如本文教导的MSC衍生的细胞群体的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了MSC衍生的细胞群或如本文教导的药物组合物，其用作药物。

本发明的这些和其它方面以及优选实施例在以下部分和所附权利要求中描述。所附权利要求的主题特此明确地并入本说明书中。

附图简述

图1示出了MSC衍生的细胞，特别是MSC衍生的骨形成细胞的细胞大小，其由成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和转化生长因子β1(TGFβ1)产生(A)，以及MSC衍生的骨形成细胞，其由FGF-2、TGFβ1和肝素产生(B)。

图2示出了MSC衍生的细胞，特别是MSC衍生的骨形成细胞与不同的类肝素的产生：未分级的肝素(UFH)、达肝素、达那肝素和硫酸乙酰肝素；以0.1IU/ml使用。

图3示出了具有肝素的MSC培养物相较于其他抗凝剂：EDTA和

(alteplase，重组组织纤溶酶原激活物)。培养36小时后，与2mg/ml EDTA和0.1mg/ml

接触的细胞处于悬浮状态，而与1或100IU/ml肝素接触的细胞生长并粘附。

图4示出了MSC衍生的细胞，特别是MSC衍生的骨形成细胞，其用本发明方法的实施方案培养，其中溶剂/去污剂处理(S/D)的血浆(5％v/v)已经用血清(5％v/v)替代。

图5示出了MSC衍生的细胞的体外矿化，通过茜素红染色(ARS)测定。在成骨条件下培养MSC衍生的骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)。在成骨条件下培养21天(A)和28天(B)后进行ARS，以染色钙和磷酸盐沉淀(100x放大率)。

图6示出了细胞聚集体切片的苏木精和伊红染色以及软骨细胞外基质(蛋白聚糖和胶原)染色。将MSC衍生的骨形成细胞B(由FGF-2、TGFβ1和肝素产生)离心以形成细胞聚集体，并将所述细胞聚集体在软骨形成条件或对照条件下培养21天。甲苯胺蓝对来自软骨细胞外基质和细胞核的蛋白聚糖进行染色。番红-橙染色来自软骨细胞外基质的蛋白聚糖，天狼星红染色胶原蛋白。

图7示出了肺实质组织切片的苏木精和伊红染色(200x放大率)。(A)注射了MSC衍生的骨形成细胞B的动物：正常肺实质；(B)注射了骨形成细胞A的动物：肺实质，在肺泡毛细血管中散布了许多组的注射细胞(箭头)。

图8示出了在鼠骨颅盖冠状切片上的新骨形成，其通过在单独施用赋形剂(对照条件)、MSC衍生的骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)或MSC衍生的骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周的鼠和人的钙结合荧光染料来证明。

图9示出了在单独施用赋形剂(阴性对照)、MSC衍生的骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)或MSC衍生的骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周，在鼠颅盖冠状切片上进行的骨形成(％)的定量。

图10示出了在施用MSC衍生的骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周在鼠骨盖冠状切片上进行的抗鼠和抗人I型胶原双重免疫染色(免疫荧光)。图10a示出了抗人和抗鼠I型胶原双重免疫染色(融合)，而图10b和10c分别示出了抗人和抗鼠I型胶原免疫染色。

图11示出了(A)MSC、(B)MSC衍生的骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)和(C)MSC衍生的骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)的细胞大小。

图12显示了单独施用赋形剂、MSC、用FGF-2和TGFβ1产生的MSC衍生的骨形成细胞A(B-f细胞A)或用FGF-2、TGFβ1和肝素产生的MSC衍生的骨形成细胞B(B-f细胞B)后2周的鼠骨颅盖冠状切片的组织学染色。(A)顺序腹膜内注射钙结合荧光染料(茜素-红→钙黄绿素绿→钙黄绿素蓝→四环素)以证实新骨形成(箭头)并评价骨形成的动态；(B)免疫荧光(IF)人+鼠I型胶原蛋白；(C)IF鼠I型胶原蛋白；(D)IF人I型胶原蛋白。进行抗人和抗鼠I型胶原蛋白的双重免疫荧光，以允许检测由骨基质分泌的人和鼠类I型胶原蛋白；(E)ALP+Goldner染色：ALP：黑色(实线和区域)中骨形成细胞活性的检测，Masson’s trichrome Goldner：检测类骨质(未矿化骨组织)为黑色虚线，矿化骨为深灰色线；(F)耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)：深灰色/黑色破骨细胞活性的检测。

图13表示示出在单独给予赋形剂后2周在鼠骨颅盖冠状部分上骨新形成的照片；MSC；用FGF-2产生的MSC衍生的骨形成细胞A，TGFβ1(b-f细胞A)；或用FGF-2、TGFβ1和肝素产生的MSC衍生的骨形成细胞B(b-f细胞B)。通过荧光(通过不同荧光染料的顺序整合标记：茜素-红→钙黄绿素绿→钙黄绿素蓝→四环素黄)证实骨新形成。红、绿和蓝染色出现在浅灰中，并且用双箭头指示骨新生厚度。黄色染色被虚线包围。

图14表示说明在给予MSC(深灰色)或骨形成细胞B(浅灰色)后2周在鼠颅盖切片上测量的新生骨的总表面积(平均值±SEM，*p＜0.05)的图。

图15示出了在施用骨形成细胞B后一天(D1)和在施用后一段时间(D7、D14、D21)直至28天(D28)在鼠骨颅盖矢状切片上进行的矿化节结的软骨基质(由虚线围绕)的番红-橙色染色。

图16示出了MSC衍生的细胞在节段性股骨亚临界尺寸缺损模型中的作用。(A)代表说明在单独施用赋形剂、骨形成细胞A(b-f细胞A)或骨形成细胞B(b-f细胞B)后，在外科手术/项目施用当天(D0)和随时间推移(1、2、3、4、5周)至6周(6W)的X-射线图像上测量缺损大小的图；平均值±SEM，**p＜0.01，***p＜0.001；(B)代表单独给予赋形剂或骨形成细胞B(b-f细胞B)后D0和6W处节段性股骨缺损的代表性X-射线图像；(C)代表说明在单独给予赋形剂(n＝7)和骨形成细胞B(n＝8)后在6W时通过显微计算机断层扫描(Micro-CT)分析的骨修复的体积测量的图；平均值±SEM，*p＜0.05。

发明详述

如本文所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指代物，除非上下文另外明确指出。

如本文所用的，术语“包含”、“包括”和“由其组成”与“包括”、“包含”或“含有”、“含有”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未叙述的成员、元件或方法步骤。该术语还包括“由……组成”和“基本上由……组成”，其享有专利术语中的公认含义。

由端点表述的数值范围的记载包括包含在相应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。

当涉及可测量值如参数、量、持续时间等时，本文所用的术语“大约”或“约”是指包括指定值的变化和与指定值的变化，如指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小，只要这些变化适于在所公开的发明中实施。应当理解，修饰语“大约”所指的值本身也是具体地和优选地公开的。

然而，通过进一步的示例，术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一个或多个成员或一组成员中的至少一个成员本身是清楚的，该术语尤其包括对所述成员中的任何一个或对所述成员中的任何两个或更多个的引用，例如所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，以及所有所述成员。在另一个示例中，“一个或多个”或“至少一个”可以指1、2、3、4、5、6、7或更多。

本文中包括对本发明背景的论述以解释本发明的背景。这不应被认为是承认所引用的任何材料在任何权利要求的优先权日之前在任何国家是公开的、已知的或公知常识的一部分。

贯穿本公开内容，通过明确的引用参考了各种出版物、专利和公开的专利说明书。本说明书中引用的所有文献都通过引用整体并入本文。特别地，本文特别提及的这些文献的教导或部分通过引用并入。

除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。当结合本发明的特定方面或本发明的特定实施例来定义特定术语时，除非另外定义，否则此内涵意欲适用于本说明书全文，即，也适用于本发明的其它方面或实施例的上下文中。

在以下段落中，更详细地限定本发明的不同方面或实施例。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面或实施例可以与任何其它方面或实施例组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的一个或多个特征组合。

在整个说明书中，对“一个实施例”的引用意味着结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施例中”或“在实施例中”不一定全部指代同一实施例，而是可以指代同一实施例。此外，如本领域技术人员从本公开中将显而易见的，在一个或多个实施例中，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，虽然本文描述的一些实施例包括一些但不包括在其它实施例中包括的其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着在本发明的范围内，并且形成不同的实施例，如本领域技术人员将理解的。例如，在所附权利要求中，任何要求保护的实施例可以以任何组合使用。

正如说明本发明某些代表性实施方案的实验部分所证实的，发明人确定了获得具有增加的移植潜力的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群的方法。更特别地，发明人惊奇地发现，当使MSC或MSC衍生的细胞与肝素或其衍生物或类似物，优选肝素或其衍生物或类似物以至少0.01IU/ml的浓度接触时，新的MSC-可以获得具有标准化，均质，小尺寸的衍生细胞群。在某些实施方案中，使MSC或MSC衍生的细胞与FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物，优选肝素或其衍生物或类似物的组合以至少0.01IU/ml的浓度接触。这种标准化的，均质的，小尺寸代表了改善的移植特性，例如(i)所述MSC衍生细胞的肠胃外(例如，血管内，包括静脉内)给药的潜力，(ii)在体内递送可调节且高浓度的可能性。(iii)肠胃外给药时具有良好的体内安全性和/或(iv)良好的可注射性。因此，第一方面提供了一种用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，该方法包括使MSC与FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物以至少0.01IU/ml的浓度体外或离体接触。

本文所用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指成体中胚层来源的干细胞，其能够产生间充质谱系的细胞，通常为两种或更多种间充质谱系，更通常为三种或更多种间充质谱系，例如骨成软骨细胞(osteochondroblastic)(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、肌细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)和基质源性(骨髓基质)谱系。MSC可以从生物样品中分离，优选从人受试者的生物样品中分离，例如骨髓、小梁骨、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年皮肤、骨膜、牙髓、腱和脂肪组织。如本文所用的，术语“生物样品”或“样品”是指从生物来源获得的样品，例如从生物体，诸如动物或人类受试者、细胞培养物、组织样品等获得的样品。动物或人类受试者的生物样品是指从动物或人类受试者中取出的并包含其细胞的样品。动物或人类受试者的生物样品可以包含一种或多种组织类型，并且可以包含一种或多种组织类型的细胞。获得动物或人类受试者的生物样品的方法是本领域熟知的，例如组织活检或抽血。人MSC、其分离、体外扩增和分化已描述于例如美国专利第5,486,359号；美国专利第5,811,094号；美国专利第5,736,396号；美国专利第5,837,539号；或美国专利第5,827,740号。本领域描述的和通过本领域描述的任何方法分离的任何MSC都可以适用于本发明的方法。特别地，MSC可以被定义为显示玻璃体三系间充质分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力(Dominici等，2006，第8卷，315)。

术语“MSC”还包括MSC的后代，例如通过从动物或人受试者的生物样品获得的MSC的体外体内增殖(增殖/扩增)获得的后代。

术语“干细胞”通常指非特化的或相对较不特化的增殖感受态细胞，其能够自我更新，即，可以增殖而不分化，并且其或其后代可以产生至少一种相对更特化的细胞类型。该术语包括能够基本上无限制自我更新的干细胞，即其中干细胞的子代或其至少部分基本上保持母干细胞的未特化或相对较不特化的表型、分化潜能和增殖能力，以及显示有限自我更新的干细胞，即其中子代或其部分进一步增殖和/或分化的能力与母细胞相比明显降低。通过举例而非限制的方式，干细胞可以产生能够沿着一个或多个谱系分化以产生越来越多的相对更特化的细胞的后代，其中这样的后代和/或越来越多的相对更特化的细胞本身可以是如本文定义的干细胞，或甚至产生可以是有丝分裂后的终末分化的细胞，即完全特化的细胞。

如本文所用的术语“成体干细胞”是指存在于处于胎儿阶段或优选地出生后(例如，特别地但不限于人生物，出生后至少一个月大，例如，至少2个月，至少3个月，例如，至少4个月，至少5个月，例如，出生后至少6个月大，例如，1年或更大，5年或更大，至少10年或更大，15年或更大，20年或更大，或出生后25年或更大)的生物中或从其获得(例如分离自)的干细胞，例如在成年期之后。例如，成体干细胞可以从人类受试者获得，其另外将以常规术语“婴儿”、“儿童”、“青年”、“青少年”或“成人”描述。

优选的MSC具有产生至少成骨软骨细胞谱系的细胞的潜力，例如，成骨细胞谱系的细胞，例如，骨软骨祖细胞和/或造骨祖细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞，和/或成软骨祖细胞谱系的细胞，例如，骨软骨祖细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞。

进一步优选的MSC具有产生至少成骨细胞(骨)谱系的细胞的潜力，例如骨软骨先祖细胞和/或造骨细胞和/或前成骨细胞和/或骨细胞等；或至少软骨细胞(软骨)谱系，例如骨软骨祖细胞和/或睾丸软骨祖细胞和/或前软骨细胞和/或软骨细胞；成纤维细胞(结缔组织)谱系，例如成纤维细胞、纤维细胞；或至少滑膜细胞(滑液)；或肌腱细胞等。

除非另有说明，“受试者”或“患者”可互换使用，并且是指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，并且具体包括人患者和非人哺乳动物。优选的患者是人类受试者。动物受试者包括动物的产前形式，例如胎儿。人类受试者可包括胎儿，而非胚胎。

在一个实施方案中，MSC可以从健康受试者获得，这可以帮助确保从所述MSC获得的MSC衍生的细胞的功能。

在另一个实施方案中，MSC获自需要移植MSC衍生的细胞的人受试者。

在如本文教导的产品或方法的某些实施方案中，MSC或MSC衍生的细胞可以对待治疗的受试者是同源的。术语“同种异体的”或“同源的”是指MSC或MSC衍生的细胞来源，所述MSC或MSC衍生的细胞获自一个或多个(合并的)受试者，而不是用MSC衍生的细胞接触或治疗的受试者。

在本文教导的产品或方法的某些实施方案中，MSC或MSC衍生的细胞可以自源于待治疗的受试者。术语“自体的”是指MSC或MSC衍生的细胞来源，它们获自将与MSC衍生的细胞接触或用MSC衍生的细胞处理的相同受试者。

在本文教导的产品或方法的某些实施方案中，MSC或MSC衍生的细胞可以包含自体和同种异体(即同源)MSC或MSC衍生的细胞的混合物，如上定义。优选地，MSC或MSC衍生的细胞对于待治疗的受试者是同源的。

本文所用的术语“间充质干细胞衍生的细胞”或“MSC衍生的细胞”是指通过MSC的分化获得的间充质谱系(例如骨成软骨细胞(osteochondroblastic)(骨和软骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、肌细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)或基质源性(骨髓基质)谱系)的细胞，特别是通过MSC的体外(包括体内)分化获得的间充质谱系的细胞。

MSC的分化可以包括在能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的条件下培养MSC，更典型地在包含能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的一种或多种试剂(例如，生长因子)的培养基中培养MSC。MSC分化的方案本身是已知的(参见，尤其是WO2007/093431；以及其它REGER,R.L.等人“Differentiation and Characterization of Human MSCs”.In:Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),D.J.Prockop等人编辑，Humana Press,2008,第449卷,第93-107页；VERMURI,M.C.等人(编辑).Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications(Methods in MolecularBiology).Humana Press,2011,第698卷,尤其是第201-352页)。

本文所用的术语“生长因子”是指单独或当被其它物质调节时影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移，并且可以影响生物体中发育、形态和功能变化的生物活性物质。生长因子通常可通过作为配体与细胞中存在的响应生长因子的受体(例如，表面或细胞内受体)结合而起作用。本文的生长因子可以具体是包含一个或多个多肽链的蛋白实体。作为实例而非限制，术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGFβ)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族、生长分化因子(GDF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、造血生长因子(HeGFs)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族、糖皮质激素等的成员。技术人员将理解，生长因子或生长因子组合可以是已知能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的任何生长因子或生长因子组合。技术人员将理解，用于诱导MSC向期望的细胞类型(例如，向成骨细胞、成骨细胞或成软骨细胞谱系的细胞)分化的锡玻璃体操作方法可以产生期望的细胞类型的基本上纯的(即，主要由期望的细胞类型的细胞群体组成)的细胞群体。非限制性地，SO衍生的细胞群体可以含有至少90％(按数目计)的所需细胞类型，例如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％的所需细胞类型。

在具体的实施方案中，MSC衍生的细胞属于骨成软骨细胞谱系(osteochondroblastic)(骨和软骨)、成骨细胞谱系(骨)，例如骨软骨先祖细胞和/或造骨前祖细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等；软骨细胞(软骨)谱系，例如骨软骨祖细胞和/或前软骨细胞和/或软骨细胞；脂肪形成(脂肪)；肌原性(肌肉)；肌腱原(肌腱细胞)谱系；成纤维细胞(结缔组织)谱系，例如成纤维细胞、纤维细胞；或滑液(滑液)谱系。

在具体的实施方案中，MSC衍生的细胞属于骨成软骨细胞(osteochondroblastic)谱系。如本文所用的“骨成软骨形成谱系的MSC衍生的细胞”可以指具有分化成成骨细胞谱系的细胞的能力的祖细胞，例如骨软骨祖细胞、骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞等，或具有分化成成软骨谱系的细胞的能力的祖细胞，例如骨软骨祖细胞、软骨生殖器和/或前成软骨细胞和/或软骨细胞。技术人员将理解，祖细胞将分化成成骨细胞谱系的细胞(例如前成骨细胞或成骨细胞)，或分化成成软骨细胞谱系的细胞(例如前成软骨细胞或成软骨细胞)，这取决于它们所暴露于的条件，例如物理因子，和/或化学或生物组分，例如生长因子。

在具体的实施方案中，MSC衍生的细胞是成骨细胞或成软骨细胞谱系的MSC衍生的细胞。在优选的实施方案中，MSC衍生的细胞是成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞。在更优选的实施方案中，MSC衍生的细胞是骨原细胞、前成骨细胞、成骨细胞或骨细胞。

在某些特别优选的实施方案中，列举“成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞”或“MSC衍生的骨形成细胞”可同样地指具有成骨细胞表型的细胞类型，并且其可有助于或可能发展成有助于骨材料或骨基质形成的细胞，例如骨软骨祖细胞、骨原细胞、前成骨细胞、成骨细胞或骨细胞或其混合物。如本文所用的，“骨祖细胞”可特别包括早期和晚期骨祖细胞。甚至更优选地，“成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞”或“MSC衍生的骨形成细胞”可以等同地指成骨细胞、骨原细胞、前成骨细胞或成骨细胞或其混合物，还更优选地，所述措辞可以指成骨细胞或前成骨细胞或成骨细胞或其混合物，例如在某些实例中，所述措辞可以指成骨细胞，或在某些其它实例中，所述措辞可以指成骨细胞。所有这些术语本身是公知的。

通过进一步的指导而非限制，骨原细胞、前成骨细胞和成骨细胞，以及包含骨原细胞、前成骨细胞和/或成骨细胞的细胞群可以显示以下特征：

a)所述细胞包含Runt相关转录因子2(Runx2)的表达、调节成骨细胞分化的多功能转录因子和成骨细胞分化期间许多细胞外基质蛋白基因的表达；

b)所述细胞包含至少一种下列的表达：碱性磷酸酶(ALP)，更具体地为骨-肝-肾型ALP；更优选还包括一种或多种其它骨标记的表达，所述其它骨标记例如骨钙蛋白(OCN，BGLAP)、1型前胶原氨基末端前肽(P1NP)、骨粘连蛋白(ON，SPARC)、骨桥蛋白(OPST，SPP1，OPN)和/或骨唾液酸蛋白(BSP)，和/或一种或多种其它骨基质蛋白例如核心蛋白聚糖和/或骨保护蛋白(OPG)；

c)所述细胞基本上不表达CD45(例如，少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％的细胞可表达CD45)；

d)细胞显示矿化外部环境或合成含钙细胞外基质的能力的证据(例如，当暴露于成骨培养基时；参见Jaiswal等人J Cell Biochem，1997，第64卷，295-312)。细胞内的钙积累和向基质蛋白中的沉积可常规地测量，例如通过在⁴⁵Ca²⁺中培养，洗涤和再培养，然后测定细胞内存在的或沉积到细胞外基质中的任何放射性(US 5,972,703)，或使用基于茜素红的矿化测定法(参见，例如，Gregory等人，Analytical Biochemistry，2004，第329卷，77-84)；

e)所述细胞基本上不向脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)或成软骨谱系(例如成软骨细胞、软骨细胞)的细胞分化。可以使用本领域建立的标准分化诱导条件(例如，参见Pittenger等人，Science,1999，第284卷，第143-7页)和测定方法(例如，当诱导时，脂肪细胞通常用显示脂质积累的油红O染色；软骨细胞通常用阿尔新蓝或番红橙染色)测试没有向这样的细胞谱系分化。基本上缺乏脂肪形成和/或软骨形成分化的倾向通常可意味着当应用于相应测试时，小于20％、或小于10％、或小于5％、或小于1％的测试细胞将显示脂肪形成或软骨形成分化的迹象。

作为实例但非限制性地，用于评估成骨生物弹性或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞身份的合适的细胞表面标志物可以包括CD105、CD90、CD73、CD45和ALP，特别是骨-肝-肾类型的ALP。这些细胞表面标志物可以例如通过可商购的单克隆抗体来检测，例如允许通过流式细胞术进行细胞检测的荧光染料标记的单克隆抗体。特别地，CD105、CD90和CD73是间充质标志物，并且通常由成骨细胞谱系的MSC衍生细胞高度表达；CD45是造血标志物，通常基本上不存在于成骨细胞谱系的MSC衍生细胞中；ALP是前成骨细胞和成骨细胞的标志物，并且通常由骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的大部分表达。

在某些实施方案中，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞具有骨诱导性质。

如本文所用的，术语“骨诱导性质”、“骨诱导潜能”或“骨诱导活性”是指细胞吸引其它骨基质分泌细胞和/或诱导其它细胞(转)分化为骨基质分泌细胞的能力。

例如，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的细胞效力可通过测量这些细胞的骨形成特性来确定。骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞诱导骨形成的能力可以在体内测量，例如通过在颅盖上皮下注射将细胞给予小鼠后，评价新矿化骨的厚度测量。骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞诱导骨形成的能力也可以通过例如ALP底物染色的碱性磷酸酶(ALP)活性评估来测量。

在某些实施方案中，骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞可具有成骨性质。

例如，可以通过测量骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的成骨活性来确定这些细胞的细胞效力。可以通过例如通过在颅骨上皮下注射给小鼠施用细胞后确定至少一种人类来源的矿化结节的存在来测量骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的人MSC衍生的细胞的成骨活性。人骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的成骨活性可以在体内测量，例如，通过在颅骨上皮下注射给小鼠施用细胞后，通过评估人来源的新矿化结节的厚度来进行评估。

例如，可通过在颅盖骨上的单次皮下给药，将骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的人MSC衍生的细胞，例如在100μl赋形剂中配制的2.5x10⁶个细胞，施用至裸鼠。为了标记随时间的骨新生，可以分别在MSC衍生细胞的细胞施用前3天和细胞施用后4、8和12天，将钙结合型荧光染料如茜素红(红)、钙黄绿素(绿)、钙黄绿素(蓝)和四环素(黄)依次腹膜内注射施用至小鼠。在细胞施用后2周，可对小鼠实施安乐死，并收获每只小鼠的颅盖，以通过组织形态测定法(例如，骨形成的定量)评估骨形成特性。颅盖的初始和最终厚度可用于计算给予细胞后新骨形成的百分比。此外，骨形成特性也可通过免疫荧光来评估(例如，骨形成的鼠或人来源)。成骨细胞活性可以使用ALP酶活性检测方法在颅盖切片上进行评价。使用TRAP酶活性检测方法可以在颅盖切片上评估破骨细胞活性。新形成的骨的矿化状态可以使用Masson Trichrome Goldner染色在用ALP染色的颅盖切片上，例如使用市售试剂盒(例如

)来评估。软骨形成可以使用番红-橙染色颅盖矢状石蜡切片来评估。

本文所用的术语“成骨潜能”是指细胞在体内和任选地在体外(跨)分化为分泌骨基质的细胞的能力或细胞分泌骨基质的能力(即，不需要(跨)分化步骤)。该术语包括细胞通过膜内骨化或软骨内骨化形成骨组织的能力。细胞通过膜内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞在不需要钙化软骨基质作为模板的情况下形成骨组织的能力。细胞通过软骨内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞通过首先形成钙化软骨基质，随后使用所述钙化软骨基质作为骨组织形成的模板来形成骨组织的能力。该术语不包括细胞的骨诱导潜能，其代表细胞吸引其它骨基质分泌细胞和/或诱导其它细胞(转)分化为骨基质分泌细胞的能力。技术人员将理解，本文预期的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞可具有成骨和骨诱导潜力。

在某些实施方案中，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞具有骨诱导和成骨特性。有利地，本文教导的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞在移植到有需要的受试者中时，与通过现有技术方法获得的MSC或MSC衍生的细胞的移植相比较，允许超过骨新生的骨新生。

作为实例而非限制，用于评估成骨生物弹性或成骨细胞谱系来源的MSC细胞的细胞身份的合适的细胞表面标志物包括CD73、CD105、CD10和CD44。这些细胞表面标志物可以例如通过可商购的单克隆抗体来检测，例如允许通过流式细胞术进行细胞检测的荧光染料标记的单克隆抗体。特别地，CD73和CD105是间充质标志物；CD44是粘附标记；CD10是骨软骨细胞标志物，其通常由MSC衍生的细胞在成骨弹性或成骨细胞谱系中的高比例表达。源自MSC的成骨细胞谱系细胞的细胞表面上的CD73的量通常是高的；骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的细胞表面上的CD105的量通常较低；并且骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的细胞表面上的CD44的量通常高。

在具体的实施方案中，基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD73、CD63和CD166呈阳性；基本上所有(例如至少90％(按数量计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45呈阴性。

在具体的实施方案中，通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)MSC衍生的成骨细胞的细胞对CD90、CD105、CD73、CD63和CD166呈阳性。

在具体的实施方案中，通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)MSC衍生的成骨细胞的细胞对CD90、CD105、CD73、CD63和CD166呈阳性；基本上所有(例如至少90％(按数量计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45、CD14和CD19呈阴性。

在具体的实施方案中，基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的成骨细胞的MSC衍生的细胞对CD45、CD14和CD19阴性。

在具体的实施方案中，基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的成骨细胞的MSC衍生的细胞对CD45、CD34和CD3是阴性的。

在具体的实施方案中，基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45、CD34、CD3、CD14和CD19是阴性的。

在具体的实施方案中，通过从MSC获得MSC衍生的细胞骨软母细胞成骨细胞的方法获得的基本上所有(例如，至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对于CD73、CD105、CD10或CD44中的一种或多种，例如一种、两种、三种或全部是阳性的(即，在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中的任何一种或多种，例如一种、两种、三种或全部)。优选地，通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如，至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)MSC来源的骨软母细胞或成骨细胞的细胞对CD73、CD105、CD10和CD44是阳性的(即，在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44)。

在具体的实施方案中，通过用于从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞具有以下中的任何一个或多个，关于CD73的标准化荧光强度(nMFI)的中值(nMFI_CD73)至少为500，关于CD44的nMFI(nMFI_CD44)至少为100，或关于CD105的nMFI(nMFI_CD105)至多为150中。例如，所述骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞具有以下中的一个或多个，至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850或至少900的nMFI_CD73；至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、至少300或至少350的nMFI_CD44；或最多180、最多170、最多160、最多150、最多140、最多130、最多120、最多110或最多100的nMFI_CD105。优选地，通过用于从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞来自具有至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44和至多150的nMFI_CD105。

在具体的实施方案中，通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如，至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞，对于任何一种或多种，例如一种、两种、三种或全部的CD73、CD105、CD10或CD44是阳性的(即，在细胞表面上表达任何一种或多种，例如一种、两种、三种或全部的CD73、CD105、CD10或CD44)，和通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞，具有以下中的一种或多种，至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44或至多150的nMFI_CD105。优选地，通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD73、CD105、CD10和CD44呈阳性(即在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44)，并且通过从MSC获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞具有至少500的nMFI_CD73、至少100的nMFI_CD44和至多150的nMFI_CD105。

如本文所用的“荧光强度的归一化中值”或“nMFI”是指用一种或多种荧光染料偶联的抗体(MFI_{marker_channel})标记的整个分析细胞群的MFI与用一种或多种荧光染料偶联的同种型对照抗体(MFI_{isotype_channel})标记的细胞群的MFI的比率，所述对照为与荧光染料如异硫氰酸荧光素(FITC)、别藻蓝蛋白(APC)或藻红蛋白(PE)偶联的阿西免疫球蛋白G(IgG)对照。通常将(n)MFI与测量荧光信号发射的波长相关联。

如本文所用的表述“CD73的nMFI”或“nMFI_CD73”是指用针对CD73的APC偶联抗体(例如BD

目录号：560847)标记的整个分析细胞群的MFI与用偶联APC的IgG对照(例如，BD

目录号：555751)。优选地，用633nm的激发波长对nMFI_CD73进行测量和用660nm的发射波长对APC进行测量。

如本文所用的“CD44的nMFI”或“nMFI_CD44”是指用针对CD44的PE偶联的抗体(例如BD

目录号：550989)标记的整个分析的细胞群的MFI与用PE偶联的IgG对照(例如，BD

目录号：556650)标记的细胞群的MFI的比率。优选地，nMFI_CD44用488nm的激发波长和580nm的PE发射波长测量

如本文所用的“CD105的nMFI”或“nMFI_CD105”是指用针对CD105的APC偶联的抗体标记的整个分析的细胞群体(例如BD

目录号：562408)的MFI与用偶联有APC的IgG对照标记的细胞群体(例如BD Biosciences

目录号：555751)的MFI的比率。优选地，对于APC，使用633nm的激发波长和660nm的发射波长测量nMFI₁₀₅。

在某些实施方案中，与MSC中各个基因的表达相比较，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞包含以下中的一种或多种：

-增加的编码骨成软骨标志物的基因的表达，所述骨成软骨标志物选自RUNX2、SOX9、ZNF521、ALPL、BMP2、OPG、POSTN、CHI3L1、MMP13、CADM1、CX43、CD10和WISP1；

-增加的编码骨骼或软骨基质蛋白的基因的表达，所述骨骼或软骨基质蛋白选自DCN或SPON1；

-降低的编码骨软骨形成抑制剂的基因DKK1的表达；和/或

-降低的编码选自KI67或PCNA的增殖标志物的基因的表达，与各基因在骨形成细胞中的表达相比较，。

在某些实施方案中，编码选自BCL2或BAX的细胞凋亡相关标志物的基因的表达可以类似于骨软骨细胞或成骨细胞谱系和MSC的MSC衍生细胞。

在某些实施方案中，与各基因在骨形成细胞中的表达相比较，所述成骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞包含以下一种或多种：

-增加的编码参与脂肪形成的蛋白的基因PPARG的表达；

-增加的编码选自CD73或BMP2的骨成软骨细胞蛋白的基因的表达；和/或

-降低的编码选自COL1A1、BGN、SPARC、ALPL和BCL2的骨成软骨蛋白的表达，

所述骨形成细胞通过除了肝素或其类似物或衍生物的存在与否之外，在基本上所有参数上与本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法基本上相同的方法产生。

在某些实施方案中，相对于(即与)本文定义的相应对照细胞中编码骨软骨细胞或成骨细胞谱系细胞中蛋白的基因的表达(即编码MSC衍生细胞中蛋白的基因的表达为至少约1.01倍)而言，骨软骨细胞或成骨细胞谱系细胞中编码MSC衍生细胞中蛋白的基因的表达增加(即增强)至少约1％。例如，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞中编码胶原蛋白的表达增加(即提高)至少约2％(即1.02倍)、至少约5％(即1.05倍)、至少约10％(即1.10倍)、至少约15％(即1.15倍)、至少约20％(即1.20倍)、至少约25％(即1.25倍)、至少约30％(即1.30倍)、至少约35％(即1.35倍)、至少约40％(即1.40倍)、至少约45％(即1.45倍)、至少约50％(即1.50倍)、至少约55％(即1.55倍)、至少约60％(即1.65倍)、至少约65％(即1.70倍)、至少约65％(即1.90倍)、至少约40％(即1.40倍)、至少约45％(即1.45倍)、至少约50％(即1.50倍)、至少约55％(即1.55倍)、至少约65％(即1.70倍)、至少约65％(即80倍)、至少约70％(即80倍)或至少约85％(即80倍)，1.95倍)，或相对于(即相比于)(即2倍)所述神经酰胺肽的表达为本文定义的相应对照细胞的至少约100％。

在某些实施方案中，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞中编码蛋白的基因的表达可以是本文定义的相应对照细胞中控制基因的表达的至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约500倍、至少约1000倍、至少约2000倍、至少约3000倍或至少约5000倍。

在某些实施方案中，相对于(即与之相比)(即编码骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的蛋白的基因的表达为至少约0.99倍)本文定义的相应对照细胞中的蛋白的表达，成骨细胞或成骨细胞谱系细胞中MSC衍生的细胞中编码蛋白的基因的表达降低(即减少)至少约1％。例如，相对于(即与之相比)(即0.01倍)在如本文所定义的相应对照细胞中的所述基因的表达，编码骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞中的蛋白的基因的表达降低(即降低)至少约2％(即0.98倍)、至少约5％(即0.95倍)、至少约10％(即0.90倍)、至少约15％(即0.85倍)、至少约20％(即0.80倍)、至少约25％(即0.75倍)、至少约30％(即0.70倍)、至少约35％(即0.65倍)、至少约40％(即0.60倍)、至少约45％(即0.55倍)、至少约50％(即0.50倍)、至少约55％(即0.45倍)、至少约60％(即0.65倍)、至少约40％(即0.60倍)、至少约45％(即0.55倍)、至少约50％(即0.50倍)、至少约55％(即0.45倍)、至少约65％(即0.65倍)、至少约30％(即0.65倍)、至少约40％(即0.60倍)、至少约65％(即0.65倍)、至少约30％(即80倍)、至少约0.65倍)、至少约50％(即0.35％(即30倍)和至少约0.05倍)，或至少约99％。

在某些实施方案中，编码骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞中的蛋白的基因的表达可以是本文定义的相应对照细胞中的纤维基因的表达的至少约0.005倍、至少约0.001倍、至少约0.0005倍或至少约0.0001倍。

在某些实施方案中，本文教导的对照细胞可以是MSC，或者可以是骨形成细胞，其通过除了肝素或其类似物或衍生物的存在与否之外，在基本上所有参数上与本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法基本上相同的方法产生。

在某些实施方案中，与MSC或骨形成细胞相比较，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞分泌更高量的参与选自CH3L1或MMP13的骨生成的蛋白，所述骨形成细胞通过除了肝素或其类似物或衍生物的存在与否之外，在基本上所有参数上与本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法基本上相同的方法产生。在某些实施方案中，与MSC或骨形成细胞相比较，骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞分泌较少量的参与骨生成抑制的DKK1蛋白，所述骨形成细胞通过除了肝素或其类似物或衍生物的存在与否之外，在基本上所有参数上与本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法基本上相同的方法产生。

如前所述，上述详细描述的方法可产生具有优异特性的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞，或这些MSC衍生的细胞的群体，所述优异特性例如特别是(i)ALP的高表达，其代表细胞向骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的定型，和(ii)HLA-DR低表达，其代表骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的有限的免疫原性，表明细胞更适于细胞移植，例如向同种异体受试者移植。

因此，在具体实施方案中，至少70％(按数目计)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；并且少于10％(按数目计)的MSC衍生的骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的细胞对HLA-DR呈阳性。

在具体的实施方案中，通过从MSC获得MSC衍生的骨软母细胞成骨细胞的方法获得的基本上所有(例如至少90％(以数量计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)MSC衍生的骨软母细胞成骨细胞的细胞对CD73、CD63和CD166呈阳性；基本上所有(例如至少90％(按数量计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45阴性；至少70％的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；并且小于10％的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对HLA-DR呈阳性。

在具体的实施方案中，通过获得骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞的方法获得的基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD90、CD105、CD73、CD63和CD166呈阳性；基本上所有(例如至少90％(按数目计)，例如≥91％，≥92％，≥93％，≥94％，≥95％，≥96％，≥97％，≥98％，≥99％或100％)的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45、CD14和CD19阴性；至少70％的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；和少于10％的骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对HLA-DR呈阳性。

在某些特别优选的实施方案中，表述“骨成软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞”可以指具有软骨增殖表型的细胞类型，并且其可以有助于或能够发育为可以有助于软骨或软骨基质形成的细胞。如本文所用的，"软骨祖细胞"可特别包括早期和晚期软骨祖细胞。甚至更优选地，“成软骨(软骨)谱系的MSC衍生细胞”可以指成软骨细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞或其混合物，还更优选地，所述措辞可以指成软骨细胞或其混合物，例如在某些实例中，所述措辞可以指成软骨细胞，或在某些其它实例中，所述措辞可以指成软骨细胞。所有这些术语本身是公知的。

通过进一步的指导而非限制，骨软骨细胞和/或成软骨细胞谱系的细胞，例如骨软骨祖细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞和成软骨细胞，以及包含骨软骨祖细胞、软骨祖细胞、前成软骨细胞和/或成软骨细胞的细胞群显示以下特征：

a)所述细胞包含SOX9的表达，SOX是在成软骨细胞分化和软骨形成期间起中心作用的转录因子；

b)所述细胞包含至少一种下列的表达：聚集蛋白聚糖(ACAN)、II型胶原蛋白或CD90；

c)所述细胞基本上不表达CD45(例如，少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％的细胞可表达CD45)；

d)细胞显示出能够原位产生高水平的II、IX和XI型胶原蛋白和作为透明细胞外基质(ECM)的主要成分的蛋白聚糖的证据。软骨形成可以常规测量，例如通过使用番红-橙/固绿测定法分别对染色蛋白聚糖和非胶原蛋白进行测定(参见，例如Leeet等，组织工程，2011，第18卷，484-98)；

e)人关节软骨细胞可显示细胞表达特征，如Diaz-Romero等2005(J CellPhysiol，vol)中总结的。202(3)，731-42)，例如，它们可以表达整联蛋白和其它粘附分子(CD49a，CD49b，CD49c，CD49e，CD49f，CD51/61，CD54，CD106，CD166，CD58，CD44)，四跨膜蛋白(CD9，CD63，CD81，CD82，CD151)，受体(CD105，CD119，CD130，CD140a，CD221，CD95，CD120a，CD71，CD14)，胞外酶(CD10，CD26)，和其它表面分子(CD90，CD99)。在单层培养期间，软骨细胞可以上调某些被认为是间充质干细胞特有的标志物(CD10、CD90、CD105、CD166)。因此，这些标志物也可由较不成熟的前成软骨细胞或成软骨细胞表达。

f)细胞基本上不向脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)或成骨细胞谱系(例如成骨细胞、骨细胞)的细胞分化。可以使用本领域建立的标准分化诱导条件(例如，参见Pittenger等人，Science，1999，第284卷，143-7)和测定方法(例如，当诱导时，脂肪细胞通常用显示脂质积累的油红O染色；前成骨细胞和成骨细胞通常染色ALP)来测试没有向这样的细胞谱系分化。基本上缺乏脂肪形成和/或成骨细胞分化的倾向通常可以意味着当应用于相应的测试时，小于20％、或小于10％、或小于5％、或小于1％的测试细胞将显示脂肪形成或成骨细胞分化的迹象。

如本领域已知的，成纤维细胞谱系的细胞可有助于或可能发展成有助于结缔组织形成的细胞。

通过进一步的指导而非限制，成纤维细胞可显示以下特征：

a)该细胞表达FSP1(成纤维细胞特异性蛋白1)；

b)所述细胞包含至少一种下列的表达：胶原、波形蛋白、结蛋白或CD90；

c)所述细胞基本上不表达CD45(例如，少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％的细胞可表达CD45)；

d)细胞显示出产生胶原蛋白、糖胺聚糖、网状和弹性纤维、糖蛋白以形成结缔组织的细胞外基质的能力的证据。成纤维细胞有助于韧带和腱的结构完整性，并具有组织修复功能。胶原沉积可以使用三色染色来可视化(Liet等人，World J Gastroenterl，2014vol.20(16)，4648-61)。I型胶原(Chondres，Redmond，WA)和腱生蛋白-C(Tn-C；IBL-America，Mineapolis，MN)是韧带成纤维细胞的两种标记，可通过ELISA(Brissetttet等，Arthritis Rheum，2012，第64(1)，272-80卷)进行测定。

如本领域所知，腱细胞谱系的细胞可有助于腱材料或腱基质的形成。肌腱由大纤维束构成，所述大纤维束包括胶原纤维和不同类型细胞的网络，所述不同类型细胞包括滑膜细胞、内皮细胞、成肌腱细胞和成纵向成排位于胶原分子中的肌腱细胞。成肌腱细胞是随着它们老化代谢活性降低而分化为肌腱细胞的未成熟形式。

通过进一步的指导而非限制，肌腱细胞可以显示以下特征：

a)所述细胞包含硬核细胞增多症(SCX)的表达，SCX是参与腱中细胞分化和细胞外基质组织形成的转录因子的基本螺旋-环-螺旋家族的成员；

b)所述细胞包含至少一种下列的表达：肌腱调节素(TNMD)和生腱蛋白-C(TNC)；

c)所述细胞基本上表达CD44、CD73、CD90和CD105，但不表达CD34、CD45、CD146或stro-1；

d)细胞显示产生由I、III和V型胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白和弹性原纤维组成的腱的细胞外组分以进行腱组织再生的能力的证据(Güngrurmüs等。Connectitissue Res，2008年，第二卷。53(6)，485-91)；

e)所述细胞基本上不向脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)、成软骨细胞谱系(例如成软骨细胞、软骨细胞)或成骨细胞谱系(例如成骨细胞、骨细胞)的细胞分化。

如本领域所知，滑膜细胞(滑液)谱系的细胞通常包括A型或巨噬细胞样滑膜细胞和B型或成纤维细胞样滑膜细胞(FLC)，并且其可有助于滑膜和滑液的形成。所有这些术语本身是公知的。因此，本文所用的术语"滑膜细胞"是指任何一种，以及所有这些细胞类型。

通过进一步的指导而非限制，滑膜细胞可显示以下特征：

a)细胞显示出分泌蛋白聚糖4(PRG4)的能力的证据，并且是表面活性磷脂(SAPL)以及滑液中存在的透明质酸(HA)的主要来源(Tamer等，Interdispip Toxicol，2013，vol)。6(1)，111-125)；

b)A型或巨噬细胞样滑膜细胞包含造血起源标记的表达，包括CD11b、CD86、CD14、CD163、DR抗原和Fc受体。B型或成纤维细胞如滑膜细胞是显示成纤维细胞的许多特征的间充质细胞，包括表达IV型和V型胶原、波形蛋白和CD90。此外，B型细胞具有一些独特的性质位点，其区别于许多其它成纤维细胞谱系，包括转移驻留的成纤维细胞。例如，钙粘蛋白-11(在FLS的同型聚集中起关键作用的特异性粘附分子)、CD55(衰变加速因子)、VCAM-1(血管粘附分子1)和ICAM-1(细胞间粘附分子1)(Bartoket al Immunol Rev，2011，vol.233(1)，233-255)；

c)所述细胞基本上不表达CD45(例如，少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％的细胞可表达CD45)；

d)所述细胞基本上不向脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)、成软骨细胞谱系(例如成软骨细胞、软骨细胞)或成骨细胞谱系(例如成骨细胞、骨细胞)的细胞分化。

其中细胞被认为是特定标志物阳性的(或表达或包含特定标志物的表达)，这意味着技术人员将推断与合适的对照相比较，当进行适当的测量时，对于该标志物存在或存在独特的信号的证据，例如抗体可检测或通过逆转录聚合酶链式反应检测。当所述方法允许定量评估所述标志物时，阳性细胞可平均产生与对照显著不同的信号，例如但不限于，比对照细胞产生的这种信号高至少1.5倍，例如，高至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或甚至更高。

上述细胞特异性标记的表达可以使用本领域已知的任何合适的免疫学技术来检测，例如免疫组织化学或亲和吸附、Western印迹分析、流式细胞术、ELISA等，或通过酶活性的任何合适的生化测定(例如，对于ALP)，或通过测量标记mRNA的量的任何合适的技术，例如Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等。本公开中列出的标记的序列数据是已知的，并且可以从诸如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的公共数据库获得。

在所述方法的某些实施方案中，如本文所教导的，MSC或MSC衍生的细胞可以是动物细胞，优选温血动物细胞，更优选哺乳动物细胞，例如人细胞或非人哺乳动物细胞，并且最优选人细胞。

MSC或MSC衍生的细胞如本文预期优选是贴壁的，即需要表面用于生长，并且通常在所述表面上生长为贴壁单层(即贴壁细胞培养)，而不是在培养基中生长为自由漂浮的细胞(悬浮培养)。细胞与表面，例如组织培养塑料容器表面的粘附，可以容易地通过倒置显微镜下的目视检查来检查。在贴壁培养中生长的细胞需要定期传代，其中细胞可以酶促方式(例如，使用胰蛋白酶)从表面移出，悬浮于生长培养基中，并且重新铺板到新的培养容器中。通常，允许细胞粘附于其上的表面或基底可以是任何基本上亲水的基底。如本领域所知，组织培养容器，例如培养瓶、孔板、皿等，通常可以由多种聚合材料制成，在模制后进行适当的表面处理或涂覆，以提供亲水性基质表面。如本文所用的，术语“接触”是指将一种或多种分子、组分或材料直接或间接地与另一种分子、组分或材料放在一起，从而促进它们之间的相互作用。通常，能够诱导MSC或MSC衍生的细胞的扩增和/或分化的一种或多种试剂可以通过将它们包含在培养MSC或MSC衍生的细胞的培养基中而与MSC或MSC衍生的细胞接触。

如本文所用的，术语“体外”是指在动物或人体的外部或外部。本文所用的术语"体外"应理解为包括“离体”。术语“离体”通常指从动物或人体中取出并在体外，例如在培养容器中维持或增殖的组织或细胞。术语“成纤维细胞生长因子2(FGF-2)”、“碱性FGF”、“FGF-b”、“FGFB”、“BFGF”、“肝素结合生长因子2(HBGF-2)”或“前列腺素”可互换使用，是指成纤维细胞生长因子家族的已知成员。本发明人已经认识到FGF-2在本发明的方法中特别有效。

本文所用的术语“转化生长因子β(TGFβ)”、"TGFB"或"TGFβ"是指转化生长因子β(TGFβ)家族的成员。本发明人认识到TGFβ在本发明的方法中特别有效。在另一个实施方案中，所述TGFβ家族成员选自TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3、TGF-β-4、GDF1(生长分化因子1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-11、GDF-15、INHA(抑制素α链)、INHBA(抑制素βA链)、INHBB(抑制素βB链)、INHBC(抑制素βC链)、INHBE(抑制素βE链)、MIS(Muellerian抑制因子)，以及GDNF亚族成员，包括GDNF(胶质细胞系衍生的神经营养因子)、NRTN(neurturin)、PSPN(perspin)及其混合物。

在一个特定的实施方案中，TGFβ选自TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3及其混合物。在一个特定的实施方案中，TGFβ是TGFβ1。举例来说，TGFβ1可以在本发明方法中用作唯一的TGFB细胞因子。

在另一个实施方案中，除了FGF-2和TGFβ之外，MSC或MSC衍生的细胞可以与一种或多种另外的外源添加的除了FGF-2和TGFβ之外的生长因子接触。在另一个实施方案中，FGF-2和TGFβ可以是MSC或MSC衍生的细胞接触的唯一外源生长因子。

在优选的实施方案中，本发明方法中使用的生长因子是人生长因子。如本文所用的，术语"人生长因子"是指与天然存在的人生长因子基本相同的生长因子。例如，当生长因子是蛋白实体时，其组成肽或多肽可具有与天然存在的人生长因子相同的一级氨基酸序列。在本发明方法中优选使用人生长因子，因为预期这种生长因子会对细胞功能产生所需的作用。

术语"天然存在的"用于描述可以在自然界中发现的不同于由人人工产生的物体或实体。例如，存在于生物体中的多肽序列是天然存在的，所述多肽序列可以从天然来源分离并且未在实验室中被人有意修饰。当提及特定实体，例如多肽或蛋白时，该术语包括其在自然界中，例如由于个体之间的正常变异而出现的所有形式和变体。例如，当提及蛋白生长因子时，术语"天然存在的"包括由于个体之间的正常等位基因变异而在其组成肽或多肽的一级序列中具有差异的生长因子。

本发明的方法可以使用生长因子的生物活性变体或片段。在本发明的方法中，当其它条件基本上相同时，生长因子的"生物活性"变体或片段实现了与相应的生长因子至少大约相同程度的从MSC获得MSC衍生的细胞。

多肽的"变体"具有与多肽的氨基酸序列基本上相同(即，大部分但不完全相同)的氨基酸序列。本文中，"基本上相同"是指至少85％相同，例如至少90％相同，优选至少95％相同，例如至少99％相同。序列差异可能是由于一个或多个氨基酸的插入(添加)、缺失和/或取代所致。

在另一个实施方案中，用于本发明方法的生长因子，即至少FGF-2和TGFβ，可以是非人动物生长因子，特别是非人哺乳动物生长因子，或其生物活性变体或衍生物。本文所用的术语"非人动物生长因子"和"非人哺乳动物生长因子"是指分别与天然存在的非人动物或非人哺乳动物生长因子基本相同的生长因子。例如，当生长因子是蛋白实体时，其组成肽或多肽可具有与天然存在的非人动物或非人哺乳动物生长因子相同的一级氨基酸序列。技术人员将理解，非人动物或非人哺乳动物生长因子可以适用于本发明方法，虽然程度低于人动物生长因子，因为后者与MSC细胞来源相同。特别地，如果非人动物或非人哺乳动物生长因子引起期望的效果，例如，类似于(类似的)人生长因子的效果，则可以使用它们。

在优选的实施方案中，生长因子或其生物活性变体或衍生物是重组的，即由宿主生物体通过重组核酸分子的表达产生，所述重组核酸分子已经被引入宿主生物体或其祖先中，并且其包含编码所述多肽的序列。本文所用的术语"重组核酸分子"是指由使用重组DNA技术连接在一起的片段组成的核酸分子(例如DNA或cDNA分子)。

在特定的实施方案中，使MSC或MSC衍生的细胞另外接触，例如其中培养基另外包含血浆，血清或其替代物中的一种或多种。

术语"血浆"如常规定义，包括新鲜血浆、解冻的冷冻血浆、溶剂/去污剂处理的血浆、处理的血浆(例如PRP)或其任意两种或多种的混合物。血浆通常从全血样品中获得，全血样品提供有或接触有抗凝剂(例如肝素(浓度非常低，通常约为15×10-5IU/mL，柠檬酸盐、草酸盐或EDTA)，随后，通过适当的技术，通常通过离心将血样的细胞组分从液体组分(血浆)中分离出来，通过特定的例子但不是限制，以获得适用于本发明的血浆，可将血样抽入含有抗凝剂EDTA(乙二胺四乙酸)(例如BD Vacutainer塑料EDTA管，10mL，1.8mg/mL)的真空采血管中，轻轻摇动样品，然后在室温下以1,000-2,000g离心10分钟，以将血浆与红细胞分离，收集上清液(血浆)，任选地合并(如果使用多个血样)，并将其分装到小瓶中，在使用前储存在-80℃下，术语"血浆"是指不形成人或动物体的一部分的组合物，在本文的实施方案中，具体地包括其在生化组合物，如"血浆"或生化组合物"中，具体地包括其在本文中的一项或多项的"血浆，具体地包括其化学处理步骤，如"的"或"之后，其从其化学处理步骤，具体地，其包括其在其具体地包括其化学处理步骤之后的一项或"中，其从其化学成分，即已经富集血小板的血浆。典型地，PRP可以含有约1.0×10⁶血小板/μL，而全血中的血小板浓度可以是约1.5×10⁵至3.5×10⁵/μL。

血浆可以是溶剂/清洁剂处理的。术语"溶剂/去污剂处理的血浆"、"S/D处理的血浆"或"S/D血浆"通常指通过包括以下步骤的方法可获得的或获得的脱细胞血浆：(a)用溶剂和去污剂处理血浆，和(b)过滤溶剂/去污剂处理过的血浆。适于这种处理的溶剂是US4,764,369中描述的溶剂如二-或三烷基磷酸盐和洗涤剂。用于制备S/D血浆的去污剂优选是无毒去污剂(例如

20或

80)。

术语"血清"如常规定义，包括新鲜血清、解冻的冷冻血清或由血浆制备的血清，或其任意两种或多种的混合物。血清通常可通过首先使样品中发生凝结，随后通过适当的技术(通常通过离心)将血液样品的如此形成的凝块和细胞组分与液体组分(血清)分离而从全血样品中获得。凝结可通过惰性催化剂如玻璃珠或粉末促进。或者，可通过除去抗凝血剂和纤维蛋白从血浆中获得血清。通过一个具体的例子，但不是限制，为了获得适用于本发明的血清，可以将血液样品抽到不含抗凝血剂的Vacutainer管(例如，BD Vacutainer Plus塑料血清管，10ml)中，并在室温下温育30至45分钟以允许凝固。然后在室温下以1,000-2,000g离心试管15分钟，以从红细胞中分离血清。收集上清液(血清)，任选地合并(如果使用多个血液样品)并等分至冷冻小瓶中，将其在-80℃下储存直至使用。因此，术语"血清"是指不形成人或动物体的一部分的无细胞组合物。本文所指的血清是人血清，即从单个人受试者或从多个人受试者获得的血清(例如血清混合池)。血清可以是未处理的血清，即通过从全血分离而得到的血清，并且不经受下游处理步骤，所述下游处理步骤除了任选的热灭活、储存(低温或非低温)、灭菌、冷冻干燥和/或过滤之外，改变其化学、生物化学或细胞组成。在某些实施方案中，血清可以从溶剂/去污剂处理的血浆获得。

分离的血浆、血清或其替代物可直接用于本发明的方法中。它们也可以适当地储存以备以后使用(例如，在高于血浆、血清或其替代物的各自冰点但低于环境温度的温度下储存较短的时间，例如，至多约1-2周，该温度通常为约4℃-5℃；或通过冷冻储存较长的时间，通常在约-70℃-约-80℃)。

分离的血浆、血清或其替代物可以如本领域已知的热灭活，特别是除去补体。当本发明方法使用与在其存在下培养的细胞自体的血浆、血清或其替代物时，可能不需要热灭活血浆、血清或其替代物。当血浆、血清或其替代物对于培养的细胞至少部分是同种异体的时，加热灭活血浆、血清或其替代物可能是有利的。任选地，血浆、血清或其替代物也可在储存或使用前使用常规微生物过滤器灭菌，优选孔径为0.2μm或更小。

在一个实施方案中，本发明方法可以使用人血浆、血清或其替代物，其对于与其接触的人MSC或MSC衍生的细胞是自体的。关于血浆、血清或其替代物的术语"自体的"表示血浆、血清或其替代物与要与所述血浆、血清或其替代物接触的MSC或MSC衍生的细胞获自相同的受试者。自体血浆、血清或其替代物的使用可以确保受试者对细胞的最佳接受和/或避免来自例如其他血清的传染原的意外传播。

在另一个实施方案中，所述方法可以采用人血浆、血清或其替代物，其与接触的人MSC或MSC衍生的细胞"同源"或"同种异体"，即，从除了获得MSC的受试者之外的一个或多个(合并的)人受试者获得。

在进一步的实施方案中，所述方法可以使用如上定义的自体和同种异体(即同源)血浆、血清或其替代物的混合物。本文所用短语"血清或血浆的替代物"指具有血浆和/或血清的一种或多种功能的天然或人工无毒组合物，例如能够诱导MSC或MSC衍生的细胞生长和/或扩增的组合物。血清或血浆代用品的非限制性实例包括血小板裂解物和用于细胞培养的组合物，其包含一种或多种血浆或血清的分级组分，例如人血清白蛋白。技术人员理解，人血浆、血清及其替代物是复杂的生物组合物，其可以包含一种或多种生长因子、细胞因子或激素。

除了一种或多种血浆、血清或其替代物之外，即作为其的外源性补充或补充，还提供了生长因子FGF-2和TGFβ或它们各自的生物活性变体或衍生物。

本文所用的术语"肝素"是指糖胺聚糖家族的碳水化合物的聚合物，其分子量为3-30kDa，特征在于其抗凝作用。肝素或其衍生物或类似物的效力可以在生物学试验中被确定，其中防止绵羊或山羊或人血浆凝固所必需的肝素浓度与国际接受的参考标准的浓度相比较，国际接受的参考标准基于每毫克肝素活性的单位。一mg肝素通常等于140-180国际单位(IU)。

术语"IU"或"国际单位"是生物物质的量的标准量度，表示为所述生物物质的生物活性或作用。对于该单位所分配的每种物质，当根据国际上可接受的生物学方法进行测试时，预期剂量为1IUM的物质具有国际上可接受的生物学活性或作用。

在特定的实施方案中，肝素或肝素衍生物或类似物选自未分级的肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，例如依诺肝素，达肝素，那屈肝素(nadroparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、舍托肝素(certoparin)、瑞肝素(reviparin)、阿地肝素(ardeparin)、帕肝素(parnaparin)、贝米肝素(bemiparin)或其混合物；类肝素(heparinoid)，比如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸亚硫酸盐、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素(danaparoid)；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；和它们的混合物。优选地，肝素或肝素衍生物或类似物选自UFH，达肝素，danaparoide和硫酸乙酰肝素。

在具体的实施方案中，所述FGF-2、所述TGFβ、所述肝素或其衍生物或类似物，以及任选的血浆、血清或其替代物中的一种或多种包含在培养基中，通常是液体细胞培养基。通常，培养基将包含本领域已知的基础培养基制剂。许多基础培养基配方(例如，可从美国典型培养物保藏中心，ATCC获得；或从Invitrogen，Carlsbad，California获得)可用于培养本文的细胞，包括但不限于Eagle极限必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、α改良极限必需培养基(α-MEM)、基础培养基必需培养基(BME)、BGJb、F-12营养混合物(HAM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)或X-VVOTM无血清培养基(临床级)，可从Invitrogen或Cambrex(New Jersey)获得，以及其修饰和/或组合。上述基础培养基的组成通常是本领域已知的，并且本领域技术人员能够根据培养细胞的需要来改变或调节培养基和/或培养基补充物的浓度。这种基础培养基配方含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。作为说明而非限制，这些成分可以包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲液(例如HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸钠、乙酸钠)等。

为了用于培养，可以向基础培养基中提供一种或多种其它成分。例如，可以使用额外的补充物来为细胞提供用于最佳生长和扩增的必需微量元素和物质。这样的补充剂包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些组分可以包含在盐溶液中，例如但不限于Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液。可以加入另外的抗氧化剂补充物，例如β-巯基乙醇。虽然许多基础培养基已经含有氨基酸，但后来可补充一些氨基酸，例如L-谷氨酰胺，已知其在溶液中较不稳定。培养基可以进一步提供抗生素和/或抗真菌化合物，例如，通常是青霉素和链霉素的混合物，和/或其它化合物，例如但不限于，两性霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酮酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大观霉素、四环素、泰乐菌素和zeocin。脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。这样的脂质和载体可以包括但不限于环糊精、胆固醇、与白蛋白共轭的亚油酸和油酸、非共轭的亚油酸、与白蛋白共轭的亚油酸-油酸-花生四烯酸、非共轭的和与白蛋白共轭的油酸等。白蛋白可类似地用于无脂肪酸的制剂中。

在具体的实施方案中，人血浆、血清或其替代物中的一种或多种可以以约0.5％至约30％，优选约1％至约15％，更优选2％至10％的比例(血浆、血清或其替代物中的一种或多种的体积/培养基的体积)包含在所述培养基中。本发明方法可以令人满意地进行，其中血浆、血清或其替代物中的一种或多种的量相对较低，例如约5或10体积％或更低，例如约1、约2、约3或约4体积％，从而允许减少为了培养MSC或MSC衍生的细胞而需要获得的血浆、血清或其替代物中的一种或多种的体积。

在更进一步的实施方案中，可以使用一种或多种浓缩的血浆产品(例如，血浆浓缩物，例如来自冷冻血浆的浓缩物)、浓缩的血清产品或浓缩的血浆或血清替代品的产品。这种浓缩产品可以以低于血浆、血清或其替代物中的一种或多种的期望浓度的浓度包含在组合物中，以便抵消(平衡、补偿)浓缩因子。

在具体实施方案中，可以使用人血浆、血清和/或其替代物中的任何两种或更多种的组合或混合物。

在具体的实施方案中，FGF-2和TGFβ以足以诱导向所需细胞类型分化的浓度包含在所述培养基中。

在具体的实施方案中，FGF-2和TGFβ以足以诱导MSC分化为成骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的浓度包含在所述培养基中。通常，培养基中可以包含FGF-2或其生物活性变体或片段，其浓度为0.1到100ng/ml，优选0.5到20ng/ml，例如大约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6ng/ml，或大约5ng/ml或更低，例如大约4、3、2、1或0.5ng/ml。通常，培养基中包含的TGFβ，例如TGFβ1，或其生物活性变体或片段的浓度可以在0.1和100ng/ml之间，优选在0.25和20ng/ml之间，例如在约19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6ng/ml，或在约5ng/ml或更低，例如在约4、3、2、1或0.5ng/ml。所述值旨在指外源补充到培养基中的相应生长因子或其生物活性变体或片段的浓度。

在具体实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以至少0.01IU/ml、至少0.02IU/ml、至少0.03IU/ml、至少0.04IU/ml、至少0.05IU/ml、至少0.06IU/ml、至少0.07IU/ml、至少0.08IU/ml、至少0.09IU/ml、至少0.1IU/ml、至少0.5IU/ml、至少1IU/ml、至少5IU/ml、至少10IU/ml、至少20IU/ml、至少30IU/ml、至少40IU/ml、至少50IU/ml、至少60IU/ml、至少70IU/ml、至少80IU/ml、至少90IU/ml或至少100IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在具体实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以至少0.10IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在某些优选的实施方案中，肝素或其衍生物或类似物以约0.1IU/ml的浓度包含在所述培养基中。在某些实施方案中，肝素或其衍生物或类似物可以以约0.10IU/ml、0.20IU/ml、0.30IU/ml、0.40IU/ml、0.50IU/ml、0.60IU/ml、0.70IU/ml、0.80IU/ml、0.90IU/ml或1.0IU/ml的浓度包含在所述培养基中。

在特定的实施方案中，肝素或其衍生物或类似物的浓度为至少0.05IU/ml，优选约0.1IU/ml。

在一个实施方案中，上述浓度可以指培养基中生长因子或其生物活性变体或片段或所述肝素或其衍生物或类似物的总浓度，即指由血浆、血清或其替代物贡献的和另外提供的所述生长因子或其生物活性变体或片段或所述肝素或其衍生物或类似物的总浓度。

在另一个实施方案中，上述浓度可以指除了已经由血浆或血清贡献的生长因子或其生物活性变体或片段的浓度，或者指除了已经由血浆或血清贡献的肝素或其衍生物或类似物的浓度之外提供的肝素或其衍生物或类似物的浓度。可以理解，如果待添加的生长因子或肝素或其衍生物或类似物在血浆、血清或其替代物中通常不存在(检测不到)，则生长因子或肝素或其衍生物或类似物的总浓度和添加浓度将(基本上)相同。

在具体实施方案中，如本文所述的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法包括以下步骤

(a)在包含浓度为至少0.01IU/ml的FGF-2、TGFβ和肝素或者其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品中回收的MSC；

(b)去除非贴壁物质，并在包含FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物的培养基中以至少0.01IU/ml的浓度进一步培养贴壁细胞，从而获得MSC衍生的细胞。在优选的实施方案中，从本文别处定义的受试者的生物样品回收的MSC在培养容器中培养。培养容器可提供塑料表面以使细胞能够粘附。在另一个实施方案中，所述表面可以是玻璃表面。在另一个实施方案中，表面可以用能够粘附和生长细胞的合适材料，例如

层粘连蛋白或胶原蛋白包被。

在具体实施方案中，MSC可以通过选择那些可以粘附于基质表面(例如塑料表面)的(单核)细胞而从骨髓(或其他来源)回收。

在具体实施方案中，在步骤(b)中除去非粘附物质之前，可以允许细胞附着约1至8天，更典型地约2至6天，更典型地约4天。否则，在开始步骤(a)后至多8天、至多6天、至多4天、优选至多4天进行步骤(b)。

在具体实施方案中，可以将步骤(a)和(b)中的细胞一起培养约7至约35天，通常在约10至约28天之间，更优选约12-21天。另外，可以将步骤(a)和(b)中的细胞一起培养，直到它们的汇合达到约60％或更多，或约80％或更多，或约90％或更多，或甚至达到100％。

在一个实施方案中，在步骤(b)之后，所述方法可包括收集如此获得的细胞或细胞群。

在一个实施方案中，在步骤(b)之后，该方法可包括将MSC衍生的细胞分离、重新铺板并培养在包含FGF-2、TGFβ和肝素或者其衍生物或类似物的培养基中，优选浓度为至少0.01IU/ml。

在一个实施方案中，在步骤(b)之后，所述方法可包括在成骨或软骨分化培养基中分离、再铺板和培养MSC衍生的细胞。

成骨和成软骨分化介质是本领域已知的。非限制性地，成骨分化培养基可以包括提供有抗坏血酸、β-甘油磷酸酯和地塞米松的基础培养基。非限制性地，软骨形成分化培养基可以包括提供有胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、抗坏血酸、TGFβ-1、丙酮酸钠和地塞米松的基础培养基。

步骤(b)后分离、再铺平板和培养MSC衍生的细胞可进行一次或多次，例如一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。技术人员将理解，这可分别产生传代1(P1)、传代2(P2)、传代3(P3)、传代4(P4)、传代5(P5)、传代6(P6)、传代7(P7)、传代8(P8)、传代9(P9)或传代10(P10)的细胞培养物。第0代(P0)可以指未被分离和/或重新铺板的MSC或MSC衍生的细胞。

MSC的分化，例如特别是MSC的成骨分化，通常产生MSC衍生的细胞，其具有比它们所源自的MSC更大的细胞尺寸。本发明人发现，当通过以至少0.01IU/ml的浓度接触MSC或MSC衍生的细胞与玻璃体活肝肝素或其衍生物或类似物而从MSC获得MSC衍生的细胞时，细胞尺寸的这种增加不会发生或减少或最小化。如本文别处所述，这种较小的MSC衍生的细胞具有有利地改善的移植性质。

因此，另一方面提供了一种从MSC获得具有改善的移植特性的MSC衍生的细胞的方法，该方法包括尺寸减小步骤，其中所述尺寸减小步骤的特征在于使MSC或MSC-来源的细胞体外或离体接触。肝素或其衍生物或类似物的浓度至少为0.01IU/ml。

本文所用术语"尺寸减小"是指(i)与通过不包括尺寸减小步骤的其他相同方法获得的MSC衍生的细胞相比较，通过包括尺寸减小步骤的方法获得的MSC衍生的细胞的物理尺寸或尺寸(例如，如通过平均尺寸、直径或体积或合适的细胞尺寸指示变量如D 60、D 65、D70或D 75测量的)减小。与没有尺寸减小步骤获得的MSC衍生的细胞的平均细胞尺寸相比较，尺寸减小可以是用尺寸减小步骤获得的MSC衍生的细胞的平均细胞尺寸减小至少30％、至少25％、至少20％、优选至少30％。

在具体实施方案中，从MSC获得如本文所述的具有改善的移植特性的MSC衍生细胞的方法包括在适当补充的培养基中培养MSCin玻璃体活体以达到具有晚期和早期分化特征的高增殖率的步骤，其中所述步骤与尺寸减小步骤同时或在尺寸减小步骤之前进行。

在具体实施方案中，所述方法可包括在使所述细胞与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触的同时或之前，使MSC与一种或多种能够诱导MSC的扩增和/或分化的试剂接触。

术语"试剂"广义地指任何化学(例如，无机或有机)、生物化学或生物物质、分子或大分子(例如，生物大分子)、其组合或混合物、未确定组成的样品、或由生物材料(例如，细菌、植物、真菌、或动物细胞或组织)制成的提取物。能够诱导MSC扩增和/或分化的试剂的非限制性实例是生长因子，例如FGF-2和TGFβ，以及血浆或血清或其替代物。技术人员将理解，生长因子或生长因子组合可以是已知能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的任何生长因子或生长因子组合。

在具体实施方案中，从本文所述的具有改善的移植特性的MSC获得MSC衍生的细胞的方法进一步包括使MSC或MSC衍生的细胞与活体外的FGF-2和TGFβ接触的步骤。优选同时进行所述MSC或MSC衍生的细胞素玻璃体与FGF-2、TGFβ和浓度至少为0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的接触。

在具体实施方案中，MSC或MSC衍生的细胞另外与血浆、血清或其替代物接触，例如其中培养基另外包含血浆、血清或其替代物中的一种或多种。

如前所述，上述详细描述的方法产生MSC衍生的细胞或包含MSC衍生的细胞的群体，其具有优异的特性，例如特别是比前述MSC衍生的细胞更小和更均一的大小。通过本文所述方法可获得的MSC衍生细胞的更小和更均一的尺寸使得细胞具有改善的移植性质。更特别地，通过本文所述方法可获得的MSC衍生细胞的更小和更均一的尺寸使得所述细胞适合于所有施用途径，特别是血管内施用，尤其是通过降低或消除肺栓塞和梗塞的风险，通过提供良好的体内胚胎特征和/或可注射性。此外，通过本文所述方法可获得的MSC衍生细胞允许在施用有限体积的情况下在部位递送可调的高细胞浓度。

鉴于此，本发明的方法可以进一步由MSC衍生的细胞的大小来定义，所述MSC衍生的细胞的大小以细胞的直径和/或体积为特征，所述MSC衍生的细胞由MSC与FGF-2、TGFβ和肝素或其衍生物或类似物的接触产生。

在具体实施方案中，悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径小于30μm、小于29μm、小于28μm、小于27μm、小于26μm、小于25μm或小于24μm。优选地，MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径小于24μm。

术语"悬浮液"和"细胞悬浮液"通常指分散在液相中的MSC衍生的细胞，特别是活的MSC衍生的细胞。

在具体实施方案中，悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径大于10μm、大于11μm、大于12μm、大于13μm、大于14μm、大于15μm、大于16μm、大于17μm或大于18μm。

在具体实施方案中，悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径为16μm至26μm，优选20μm至25μm。

在具体实施方案中，至少60％的MSC衍生细胞在悬浮液中的直径等于或小于25μm(D 60≤25μm)、等于或小于24μm(D₆₀≤24μm)、等于或小于23μm(D₆₀≤23μm)、等于或小于22μm(D₆₀≤22μm)、等于或小于21μm(D₆₀≤21μm)或等于或小于20μm(D₆₀≤20μm)，优选等于或小于25μm(D₆₀≤25μm)。

在具体实施方案中，至少65％的MSC衍生细胞在悬浮液中的直径等于或小于25μm(D₆₅≤25μm)、等于或小于24μm(D₆₅≤24μm)、等于或小于23μm(D₆₅≤23μm)、等于或小于22μm(D₆₅≤22μm)、等于或小于21μm(D₆₅≤21μm)或等于或小于20μm(D₆₅≤20μm)，优选等于或小于25μm(D₆₅≤25μm)。

在具体实施方案中，至少70％的MSC衍生细胞在悬浮液中的直径等于或小于25μm(D₇₀≤25μm)、等于或小于24μm(D₇₀≤24μm)、等于或小于23μm(D₇₀≤23μm)、等于或小于22μm(D₇₀≤22μm)、等于或小于21μm(D₇₀≤21μm)或等于或小于20μm(D₇₀≤20μm)，优选等于或小于25μm(D₇₀≤25μm)。

在具体实施方案中，至少75％的MSC衍生的细胞悬浮液(D₇₅≤25μm)的直径等于或小于25μm，等于或小于24μm(D₇₅≤24μm)，等于或小于23μm(D₇₅≤23μm)，等于或小于22μm(D₇₅≤22μm)，等于或小于21μm(D₇₅≤21μm)，或等于或小于20μm(D₇₅≤20μm)，优选等于或小于25μm(D₇₅≤25μm)。

在具体实施方案中，所述MSC衍生的细胞在悬浮液中显示D 60等于或小于25μm(D60在具体实施方案中，所述MSC衍生的细胞在悬浮液中显示D 65等于或小于25μm(D₆₅≤25μm)，并且至多5％的MSC衍生的细胞在悬浮液中的直径大于35μm。

在具体实施方案中，所述MSC衍生的细胞在悬浮液中显示D 70等于或小于25μm(D₇₀≤25μm)，并且至多5％的MSC衍生的细胞在悬浮液中的直径大于35μm。

在具体实施方案中，所述MSC衍生的细胞在悬浮液中显示D 75等于或小于25μm(D₇₅≤25μm)，并且至多5％的MSC衍生的细胞在悬浮液中的直径大于35μm。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞悬浮液中D₆₀为约25μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤25μm)，为约24μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤24μm)，为约23μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤23μm)，为约22μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤22μm)，为约21μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤21μm)或为约20μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤20μm)，优选为约25μm至约10μm(10μm≤D₆₀≤20μm)。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞悬浮液中D 65为约25μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤25μm)，为约24μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤24μm)，为约23μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤23μm)，为约22μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤22μm)，为约21μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤21μm)或为约20μm至约10μm(10μm≤D 65≤20μm)，优选为约25μm至约10μm(10μm≤D₆₅≤20μm)。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞悬浮液中D₇₀为约25μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤25μm)，为约24μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤24μm)，为约23μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤23μm)，为约22μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤22μm)，为约21μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤21μm)或为约20μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤20μm)，优选为约25μm至约10μm(10μm≤D₇₀≤20μm)。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞悬浮液中D₇₅为约25μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤25μm)，为约24μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤24μm)，为约23μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤23μm)，为约22μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤22μm)，为约21μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤21μm)或为约20μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤20μm)，优选为约25μm至约10μm(10μm≤D₇₅≤20μm)。

在具体实施方案中，至少90％的MSC衍生细胞的悬浮液直径等于或小于30μm(D₉₀≤30μm)，等于或小于29μm(D₉₀≤29μm)，等于或小于28μm(D₉₀≤28μm)，等于或小于27μm(D₉₀≤27μm)，等于或小于26μm(D₉₀≤26μm)或等于或小于25μm(D₉₀≤25μm)，优选等于或小于30μm(D₉₀≤30μm)。

在具体实施方案中，所述MSC衍生的细胞悬浮液中D₉₀等于或小于30μm(D₉₀≤30μm)，至多5％的MSC衍生的细胞悬浮液中直径大于35μm。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞在悬浮液中显示D₉₀为约30μm至约10μm(10μm≤D₉₀≤30μm)。

在具体实施方案中，悬浮液中各MSC衍生的细胞的直径大于10μm，大于11μm，大于12μm，大于13μm，大于14μm或大于15μm，优选大于10μm。

细胞的直径可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如通过数字显微镜和用于图像分析的伴随软件(例如Motic Image Plus2.02)。本文所指的平均细胞直径应基于自由漂浮、非附着状态的细胞的直径，因此基于悬浮状态的细胞的直径来确定。优选将细胞悬浮在包含透明、无毒、等渗缓冲液如PBS和任选的用于分化活细胞和死细胞的染料如台盼蓝的溶液中。优选地，至少应测量上百个细胞以考虑统计学上显著的分析。

在具体实施方案中，悬浮液中各MSC衍生的细胞的直径小于38μm，小于37μm，小于36μm，小于35μm，优选小于35μm。

在具体实施方案中，悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径的标准偏差小于7.0μm、小于6.5μm、小于6.0μm、小于5.5μm、小于5μm、小于4.5μm、小于4μm或小于3.5μm。优选地，MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径的标准偏差小于4.0μm，例如在3.0和3.5μm之间。

本发明人发现通过本文所述方法获得的MSC衍生细胞的细胞尺寸分布是稳定的。因此，通过本文所述方法获得的MSC衍生细胞的直径和/或体积可以在任何时间点和在玻璃体培养过程中的任何汇合处确定。在优选的实施方案中，当MSC衍生的细胞达到30％至80％，优选40％至70％，例如40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的汇合时，测定所述细胞的直径和/或体积。

另一方面提供了从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，包括使MSC在体外或离体地与FGF-2、TGFβ和肝素或者其衍生物或类似物接触，其中悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径小于25μm，例如小于24μm或者例如在20μm和25μm之间。.

另一方面提供了从MSC获得MSC衍生细胞的方法，包括将MSC在体外或离体地与FGF-2、TGFβ和肝素或其衍生物或类似物接触，其中至少60％的MSC衍生细胞在悬浮液中具有等于或小于25μm的直径(D₆₀≤25μm)，优选至少70％的MSC衍生细胞在悬浮液中具有等于或小于25μm的直径(D₇₀≤25μm)，并且至多5％的细胞群直径大于35μm。

本领域技术人员将清楚，先前描述的所有实施方案，包括涉及MSC衍生的细胞的平均直径、MSC衍生的细胞的最大个体直径、MSC衍生的细胞的平均体积、D₆₀、D₆₅、D₇₀、D₇₅、D₉₀、肝素或其衍生物或类似物的浓度、MSC衍生的细胞的谱系和能够诱导MSC的扩增和/或分化的试剂的那些实施方案，适用于如本文教导的用于获得MSC衍生的细胞的所有方法。

另一方面提供可通过MSC体外扩增获得的MSC衍生的细胞群体，其中悬浮液中MSC衍生细胞的平均直径小于30μm、小于29μm、小于28μm、小于27μm、小于26μm、小于25μm或小于24μm。优选地，MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径小于24μm。

另一方面提供了可通过MSC体外扩增获得的MSC衍生的细胞群体，其中至少60％的MSC衍生细胞在悬浮液中的直径等于或小于25μm(D₆₀≤25μm)，优选至少70％的MSC衍生细胞在悬浮液中的直径等于或小于25μm(D₇₀≤25μm)，且至多5％的细胞群的直径大于35μm。权利要求11本文所用的术语"群体"是指所需MSC衍生的细胞类型的基本上纯的(即，主要由其组成)且同质的细胞群。

在具体实施方案中，悬浮液中各MSC衍生的细胞的直径小于38μm，小于37μm，小于36μm，优选小于35μm。

在具体实施方案中，悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径的标准偏差小于6.0μm、小于5.5μm、小于5.0μm、小于4.5μm、小于4.0μm或小于3.5μm。优选地，MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径的标准偏差小于4.0μm，例如在3.0和3.5μm之间。

在具体实施方案中，MSC衍生的细胞群可通过如本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法获得。

本领域技术人员将清楚的是，先前描述的所有实施方案，包括涉及MSC衍生的细胞的平均直径、MSC衍生的细胞的最大个体直径、MSC衍生的细胞的平均体积、D₆₀、D65、D 70、D75、D 90、肝素或其衍生物或类似物的浓度、MSC衍生的细胞的谱系和能够诱导MSC的扩增和/或分化的试剂的那些实施方案，适用于如本文教导的用于从MSC获得MSC衍生的细胞的所有方法，并且因此也适用于如本文教导的MSC衍生的细胞和通过所述方法可获得的MSC衍生的细胞的群体。

因此，另一方面涉及包含本文定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群的组合物。还提供了包含本文的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群并且还包含一种或多种其他组分的组合物。例如，可以包括能够维持或增强细胞活力的组分。作为实例而非限制，这些成分可以包括确保基本上等渗条件的盐、pH稳定剂如缓冲系统(例如，确保基本上中性的pH，如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)、载体蛋白如白蛋白、包括基础培养基和/或培养基补充物的培养基、血清或血浆、营养物、碳水化合物源、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或本领域技术人员公知的其它材料。还公开了通过将各自的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群与上述一种或多种另外的组分混合来制备所述组合物的方法。组合物可以是例如液体，或者可以是半固体或固体(例如，可以是冷冻组合物，或者可以作为凝胶存在，或者可以存在于固体支持物或支架等上)。这些类似的二甲基亚砜(DMSO)的低温保存剂是本领域公知的。

术语"组合物"、"制剂"或"制备"在本文中可互换使用。

在特定的实施方案中，该组合物是药物组合物，其包含如本文所定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群，以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本文所用的术语"药学上可接受的"与本领域一致，并且是指与药物组合物的其它成分相容，并且对其接受者无害。

如本文所用的，"载体"或"赋形剂"包括任何和所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、媒介物、填充剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如甘氨酸)、蛋白、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂、用于实现储库效应的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、张力控制剂、吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。这些物质应该是无毒的，并且不应该干扰细胞的活性。

载体或赋形剂或其它材料的精确性质将取决于给药途径。例如，组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。对于药物制剂的一般原理，读者可以参考细胞疗法：干细胞移植、基因治疗和细胞免疫治疗。Morstyn&W.Sheridan.剑桥大学出版社，1996；以及造血干细胞疗法，E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone，2000。

液体药物组合物通常可以包括液体载体，例如水或药学上可接受的水溶液。例如，可以包括生理盐水溶液、组织或细胞培养基、葡萄糖或其它糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

所述组合物可以包括一种或多种细胞保护分子、细胞再生分子、生长因子、抗凋亡因子或调节细胞中基因表达的因子。这些物质可以使细胞独立于其环境。

这样的药物组合物可以含有确保其中细胞生存力的其它组分。例如，组合物可包含合适的缓冲体系(例如磷酸盐或碳酸盐缓冲体系)以达到期望的pH，更通常接近中性pH，并且可包含足够的盐以确保细胞的等渗条件以防止渗透应激。例如，用于这些目的合适溶液可以是本领域已知的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氯化钠溶液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液。此外，组合物可包含载体蛋白，例如白蛋白(例如牛或人白蛋白)，其可增加细胞的活力。

进一步合适的药学上可接受的载体或添加剂是本领域技术人员熟知的，例如可以选自蛋白如胶原或明胶，碳水化合物如淀粉、多糖、糖(右旋糖、葡萄糖和蔗糖)，纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠或羧甲基纤维素钙，羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素，预胶化淀粉，果胶琼脂，角叉菜胶，粘土，亲水胶(金合欢胶、瓜尔胶、阿拉伯胶和黄原胶)，藻酸，藻酸盐，透明质酸，聚乙醇酸和聚乳酸，葡聚糖，果胶，合成聚合物如水溶性丙烯酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，蛋白聚糖，磷酸钙等。

如果需要，可在支持物、支架、基质或材料上施用细胞制剂以提供改善的组织再生。例如，该材料可以是粒状陶瓷，或生物聚合物如明胶、胶原或纤维蛋白原。多孔基质可根据标准技术合成(例如，Mikoset Al，Biomaterials14:323,1993；Mikoset Al，Polymer35:1068,1994；Cooket Al，Biomed.Material.Res.35:513,1997)。这样的支持物、支架、基质或材料可以是可生物降解的或不可生物降解的。因此，细胞可以被转移到合适的基质上和/或在合适的基质上培养，例如多孔或无孔基质，以提供植入物。例如，如果需要，可以将已经增殖的或在培养皿中分化的细胞转移到三维固体支持物上，以便通过在本发明的液体营养培养基中孵育固体支持物来使它们增殖和/或继续分化过程。细胞可以转移到三维固体支持物上，例如通过用含有所述细胞的液体悬浮液浸渍所述支持物。以这种方式获得的浸渍载体可以植入受试者体内。在最终植入之前，也可通过将这些浸渍的支持物浸入液体培养基中来再培养它们。三维固体支持物需要是生物相容的，以便使其能够被植入人中。它可以是生物可降解的或非生物可降解的。

细胞或细胞群可以以允许它们存活、生长、繁殖和/或分化成期望的细胞类型例如肝细胞的方式施用。细胞或细胞群可以移植到或可以迁移到并移入预期器官，例如肝脏。可以设想将细胞或细胞群植入其它位置、组织或器官，例如肝、脾、胰腺、肾包膜、腹膜或网膜。

在一个实施方案中，如上定义的药物细胞制剂可以以液体组合物的形式施用。在实施方案中，细胞或包含其的药物组合物可以全身、局部、在器官内、在器官功能障碍或损伤的部位或在组织损伤的部位施用。

优选地，药物组合物可以包含治疗有效量的所需细胞。术语"治疗有效量"是指可在组织、系统、动物或人中引起研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物学或医学反应，并且尤其可预防或减轻所治疗的疾病或病症的一种或多种局部或全身症状或特征的量。合适的治疗有效量可由有资格的医师根据所需细胞的性质、疾病状况和严重性以及受试者的年龄、大小和状况来确定。

还提供了通过将本发明的细胞与一种或多种如上所述的另外的组分以及与一种或多种如上所述的药物赋形剂混合来制备所述药物组合物的方法。

还公开了包括手术器械或装置的部件的布置或试剂盒，所述手术器械或装置用于例如通过注射将如本文教导的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞的群体或如本文定义的药物组合物例如全身性地施用至受试者，并且还包括如本文教导的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞的群体或如本文定义的药物组合物。

在一个实施方案中，上文定义的药物组合物可以以液体或粘性组合物的形式施用。

在相关方面，本发明提供了以上定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群或包含所述MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群的药物组合物用作药物。在相关方面，本发明提供了上述定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群或包含所述MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群的药物组合物，用于治疗需要移植MSC的对象衍生的细胞。在相关方面，本发明提供了一种治疗需要移植MSC衍生的细胞的对象的方法，该方法包括向所述对象施用治疗有效量的上述定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群或包含以下成分的药物组合物：所述受试者的所述MSC衍生细胞或MSC衍生的细胞群体。在相关方面，本发明提供以上定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群或包含所述MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞群的组合物在制备用于治疗受试者的药物中的用途。需要移植MSC衍生的细胞。

如本文所用的，术语"治疗"或"治疗"是指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展和并发症发生的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻。"治疗"也可以指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。

本文所用术语"需要移植MSC衍生细胞的受试者"包括将受益于治疗给定病症，优选上述病症或疾病的受试者，例如哺乳动物或人类受试者。这样的受试者通常包括但不限于已诊断出所述病症的那些、倾向于患有或发展所述病症的那些和/或其中所述病症待预防的那些。

术语"移植"或"细胞移植"具有其正常含义，并且特别是指向受试者施用细胞。术语"细胞移植"可与"细胞疗法"互换使用。细胞移植可通过本领域已知的任何技术进行。例如，但不限于，细胞可以通过输注移植到受试者中。通常，细胞输注可以胃肠外进行，例如血管内、皮下、皮内或肌内，优选血管内。细胞可以例如但不限于全身、局部或在损伤部位施用。可以清楚的是，取决于具体应用、靶组织、治疗目的或细胞类型，可以相应地在施用途径以及制剂、浓度等方面进行调整。

本文教导的MSC衍生的细胞的均一且小的细胞尺寸导致在将所述细胞静脉内施用于受试者后急性毒性降低或消除。因此，本文教导的MSC衍生的细胞特别适合于血管内或经皮施用。

因此，在具体实施方案中，可以将上述定义的MSC衍生的细胞或MSC衍生的细胞的群体或药物组合物经皮或血管内施用于需要移植MSC衍生的细胞的所述受试者。

此外，本发明人发现，通过本文教导的方法将获得具有更强的骨形成特性的骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。

因此，在一个具体实施方案中，所述病症或疾病是肌肉骨骼疾病。

本文所用的术语"肌肉骨骼疾病"是指任何类型的骨病、肌肉疾病、关节疾病或软骨发育不良，其治疗可受益于将本发明药物制剂施用于患有该疾病的受试者。特别地，这种疾病的特征可在于，例如，骨和/或软骨形成减少或过度的骨和/或软骨吸收，存在于骨中的成骨细胞或骨细胞和/或存在于软骨中的成软骨细胞或软骨细胞的数量、活力或功能减少，受试者中的骨质量和/或软骨质量减少，骨变薄，骨强度或弹性受损等。

肌肉骨骼疾病的非限制性实例可以包括局部或全身性病症，例如任何类型的骨质疏松或骨质减少，例如原发性、绝经后、老年、肾上腺皮质激素诱导的、双膦酸盐诱导的和放射疗法诱导的；任何继发性、单位点或多位点骨坏死；任何类型的骨折，例如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压缩、颌面骨折；需要骨融合的病症(例如，脊柱融合和重建)；先天性骨缺损；骨重建，例如在外伤或癌症手术后，和颅面骨重建；创伤性关节炎、局灶性软骨和/或关节缺损、局灶性退行性关节炎；骨关节炎、退行性关节炎、膝关节病和髋关节病；成骨不全症；溶骨性骨癌；佩吉特病；内分泌紊乱；低磷酸盐血症；低血钙症；肾性骨营养不良；骨软化症；动力缺失性骨病、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进；牙周病；Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征；类风湿性关节炎；脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、肠病性关节病、和未分化的脊椎关节炎和反应性关节炎；系统性红斑狼疮和相关综合征；硬皮病和相关病症；干燥综合征；全身性血管炎，包括巨细胞动脉炎(Horton's病)、Takayasu's动脉炎、风湿性多肌痛、ANCA-相关的血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微多血管炎和Churg-Strauss综合征)、Behcet’s综合征和其它多动脉炎和相关病症(例如结节性多动脉炎、Cogan’s综合征和Buerger’s病)；伴随其它全身性炎性疾病的关节炎，包括淀粉样变性和结节病；晶体关节病，包括痛风、焦磷酸钙二水合物疾病、与磷酸钙或草酸钙晶体的关节沉积有关的病症或综合征；软骨软化和神经性关节病；费尔特综合征和赖特综合征；莱姆病和风湿热。

在一个具体实施方案中，所述病症或疾病是骨相关疾病。

因此，本文所用的术语"骨相关病症"是指任何类型的骨疾病，其治疗可受益于具有骨形成特性的细胞，例如骨软骨祖细胞、骨原细胞、前成骨细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞向患有该病症的受试者的移植。特别地，这样的病症的特征可在于，例如，骨形成减少或过度的骨吸收，存在于骨中的成骨细胞或骨细胞的数量、存活性或功能降低，受试者的骨量减少，骨变薄，骨强度或弹性受损等。

例如但不限于，通过本发明方法获得的具有骨形成特性的MSC衍生细胞(例如成骨细胞谱系的细胞)的经植物移植可受益的骨相关疾病可包括局部或全身性疾病，例如任何类型的骨质疏松症或骨质减少，例如原发性、绝经后、老年、皮质激素诱导的、任何继发性、单或多位骨坏死，任何类型的骨折，例如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压迫，需要骨融合的病症(例如脊柱重建和融合)、上颌面骨骨折、骨重建，例如创伤性损伤或癌症手术后的骨重建、颅面骨重建、成骨不全、溶骨性骨癌、佩吉特氏病、内分泌疾病、低磷酸盐血症、低钙血症、肾性骨营养不良、骨软化关节炎、老年性骨病、类风湿性骨机能亢进、甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进、牙周病、库骨再痉挛综合征和右上皮症。

本文所述的MSC衍生的细胞、MSC衍生的细胞群和药物组合物可以单独使用或与任何已知的用于相应病症的疗法或活性化合物组合使用。如别处所述，施用可以是同时的或以任何顺序相继的。

如果细胞来自异源(即非自体、非同源或非同种异体)来源，通常可以施用伴随的免疫抑制治疗，例如使用免疫抑制剂，如环孢菌素或他克莫司(FK506)。

待施用的细胞的量将随所治疗的受试者而变化。在一个优选的实施方案中，给予的细胞量是10²至10¹⁰或10²至10⁹，或10³至10¹⁰或10³至10⁹，或10⁴至10¹⁰或10⁴至10⁹，例如10⁴至10⁸，或10⁵至10⁷，例如约1x10⁵，约5x10⁵，约1x10⁶，约5x10⁶，约1x10⁷，约5x10⁷，约1x10⁸，约5x10⁸，约1x10⁹，约2x10⁹，约3x10⁹，约4x10⁹，约5x10⁹，约6x10⁹，约7x10⁹，约8x10⁹，约9x10⁹或约1x10¹⁰个细胞，可以给予人受试者。在其它实施方案中，可给予人受试者10^6-10个10⁸个细胞/kg体重或1×10^7-9×10⁷个细胞/kg体重，例如约1×10⁷、约2×10⁷、约3×10⁷、约4×10⁷、约5×10⁷、约6×10⁷、约7×10⁷、约8×10⁷、约9×10⁷或约1×10⁸个细胞/kg体重。例如，这样的细胞数或这样的细胞数/kg体重可以特别指待施用给受试者的细胞总数，所述施用可以适当地分布在一天或多天(例如，1、2、3、4或5天或更多天)施用的一个或多个剂量中(例如，分布在2、3、4、5、6、7、89或10个或更多个剂量中)。然而，治疗有效剂量的精确确定可以基于每个患者各自的因素，包括他们的大小、年龄、大小、组织损伤和自损伤发生以来的时间量，并且可以由本领域技术人员根据本公开和本领域的知识容易地确定。

适当地，在待施用的组合物中，细胞可以以约10⁴/ml至约10⁹/ml、优选约105/ml至约10⁸/ml、更优选约1×10⁶/ml至约1×108/ml、更优选约1×10⁷/ml至约1×10 8/ml的浓度存在，例如约7.5×10⁷/ml。如本文所教导的MSC衍生的细胞的减小的细胞尺寸允许可调的和/或高的细胞浓度。因此，如果组合物是液体组合物，则待施用于需要移植MSC衍生的细胞的受试者的通过如本文教导的方法获得的包含MSC衍生的细胞的组合物的体积小于通过其他方法获得的包含MSC衍生的细胞的组合物的体积。

因此，本发明的方面和实施例包括并且本说明书描述了如在以下陈述中的任一个和全部中阐述的主题：

声明1，一种用于从间充质干细胞(MSC)获得间充质干细胞衍生的细胞的方法，包括使MSC在体外或离体与FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

声明2，根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或者其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品中回收的MSC；

(b)除去非粘附物质，并在含有FGF-2、TGFβ和浓度至少为0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中进一步培养粘附细胞，从而获得MSC衍生的细胞。

声明3，根据声明1或2的方法，其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选地，其中TGFβ是TGFβ1。

声明4，一种用于从MSC获得具有改善的移植特性的MSC衍生的细胞的方法，所述方法包括尺寸减小步骤，其中所述尺寸减小步骤的特征在于MSC或MSC衍生的细胞在体外或体内与至少0.01IU/ml的浓度肝素或其衍生物或类似物接触。

声明5，如声明1至4中任一项所述的方法，其中肝素或其衍生物或类似物的浓度为至少0.05IU/ml，优选约0.1IU/ml。

声明6，如声明1至5中任一项所述的方法，其中肝素或肝素衍生物或类似物选自：未分级的肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素、达肝素、那屈肝素、亭扎肝素、舍托肝素、瑞肝素、阿地肝素、帕肝素、贝米肝素或其混合物；类肝素，如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸阿卡拉新、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；和它们的混合物。

声明7，根据声明1至6中任一项的方法，其中所述MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径小于25μm，例如小于24μm，例如20μm至25μm。

声明8，根据声明1至7中任一项的方法，其中悬浮液中各MSC衍生的细胞的直径小于35μm。

声明9，根据声明1至8中任一项的方法，其中悬浮液中至少60％的MSC衍生的细胞具有等于或小于25μm的直径(D 60≤25μm)，并且其中悬浮液中至多5％的MSC衍生的细胞具有大于35μm的直径。

声明10，根据声明1至9中任一项的方法，其中MSC衍生的细胞是骨软骨细胞谱系的细胞。

声明11，根据声明1至10中任一项所述的方法，其中所述MSC衍生的细胞是骨形成细胞谱系或成软骨细胞谱系，优选骨形成细胞谱系。

声明12，如声明1至11中任一项所述的方法，其中，所述MSC另外地与之接触，例如其中所述培养基另外地包括血浆，血清或其替代物中的一种或多种。

声明13，一种用于从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，包括使该方法包括使MSC与FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物体外或离体接触，其中悬浮液中MSC衍生的细胞的平均直径小于25μm，例如小于24μm，例如20μm至25μm。

声明14，根据声明13的方法，其中悬浮液中每个MSC衍生的细胞的直径小于35μm。

声明15，一种从MSC获得MSC衍生细胞的方法，该方法包括使MSC与FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物体外或离体接触，其中至少60％的MSC衍生细胞在悬浮液中具有等于或小于25μm的直径(D 60≤25μm)，并且其中至多5％的MSC衍生细胞在悬浮液中具有大于35μm的直径。

声明16，如声明13至15中任一项所述的方法，其中MSC与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

声明17，根据声明13至16中任一项所述的方法，其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选地，其中TGFβ是TGFβ1。

声明18，可通过MSC的体外或离体扩增获得的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞在悬浮液中的平均直径小于25μm，例如小于24μm，例如20μm至25μm。

声明19，根据声明18的MSC衍生的细胞群体，其中悬浮中的每个MSC衍生的细胞的直径小于35μm。

声明20，可通过MSC的体外或离体扩增获得的MSC衍生的细胞群体，其中悬浮液中至少60％的MSC衍生细胞的直径等于或小于25μm(D 60≤25μm)，并且其中悬浮液中至多5％的MSC衍生细胞的直径大于35μm。

声明21，根据声明18至20中任一项所述的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞可通过包括使MSC与FGF-2，TGFβ和肝素或其衍生物或类似物体外或离体接触的方法获得。

声明22，声明21的MSC衍生的细胞群体，其中MSC以至少0.01IU/ml的浓度与肝素或其衍生物或类似物接触。

声明23，根据声明18至22中任一项所述的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞是骨软骨细胞群。

声明24，根据声明18至23中任一项所述的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞是成骨细胞谱系或骨成软骨细胞谱系，优选成骨细胞谱系。

声明25，声明18至24任一项的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC另外与血浆、血清或其替代物中的一种或多种接触。

声明26，如声明18至25中任一项所述的MSC衍生的细胞群体，其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选地，其中TGFβ是TGFβ1。

声明27，根据声明23至27中任一项所述的骨成软骨谱系的MSC衍生的细胞群体，其中基本上所有MSC衍生的骨成软骨谱系细胞均为CD90、CD105、CD73、CD63和CD166阳性；基本上所有MSC衍生的骨成软骨细胞谱系细胞对CD45、CD14和CD19呈阴性；至少70％的MSC衍生的骨成软骨细胞谱系细胞为碱性磷酸酶(ALP)阳性；并且少于10％的MSC衍生的骨成软骨细胞谱系细胞呈HLA-DR阳性。

声明28，一种药物组合物，其包含如声明18至27中任一项所定义的MSC衍生的细胞群。

声明29，如声明18至27中任一项所述的MSC衍生的细胞群体或如声明28所述的药物组合物，其用作药物。

声明30，根据声明29所述的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞群体以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml，优选7.5×10⁷细胞/ml的浓度存在。

声明31，如声明18至27中任一项所述的MSC衍生的细胞群体或如声明28所述的药物组合物，其用于治疗需要移植MSC衍生的细胞的受试者。

声明32，根据声明29至31中任一项所述的MSC衍生的细胞群体，其中所述MSC衍生的细胞群体或所述药物组合物适合于经皮或血管内施用。

虽然已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但是显然，根据前面的描述，许多替换、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，在所附权利要求的精神和宽范围内，本发明包括所有这些替代、修改和变化。

上述方面和实施例进一步由以下非限制性示例支持。

实施例

实施例1：用于获得小型MSC衍生的骨形成细胞的方法

1.实验步骤

1.1人骨髓收集和人BM-MSC培养

从8个健康志愿者供体的髂嵴获得20-60ml的人骨髓(BM)抽吸物。收获后，计数骨髓白血细胞，在37℃下在含有5％CO₂的潮湿气氛中培养，接种密度为50,000细胞/cm²的含有1％青霉素-链霉素的常规培养基。24小时后，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza Bio

)冲洗除去未粘附的细胞，并加入新鲜培养基。每2-3天更换培养基。培养粘附细胞集落直至达到80％的细胞汇合。然后用胰蛋白酶-EDTA(EDTA，Lonza BioWhittaker)分离细胞。胰蛋白酶活性用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中和。计数细胞并将其重新铺板以用于另外的培养物。每2-3天更换培养基，直到达到80％的细胞汇合。如上所述分离间充质干细胞(MSC)。

1.2MSC衍生的骨形成细胞和细胞培养物及血浆制备

如上所述，从8个健康人志愿者的髂嵴获得20-60ml肝素化骨髓(BM)。收获后，将骨髓以固定的白血细胞密度(50000细胞/cm宽度)接种到培养瓶中，并在其中任一种中培养

-为了获得MSC衍生的骨形成细胞B：常规培养基，其添加5％v/v溶剂/去污剂处理(S/D)的血浆(

Octapharma AG，人源)、0.1IU/ml肝素(肝素LEO，LEO PharmaSA，Belgium，Lot A17605)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和转化生长因子β(TGFβ1)；

-获得MSC衍生的骨形成细胞Z：常规培养基，其添加5％v/v溶剂/去污剂处理的(S/D)血浆(

Octapharma AG，人源)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)；或

-获得MSC衍生的骨形成细胞A：常规培养基，其添加5％v/v溶剂/去污剂处理的(S/D)血浆(

Octapharma AG，人源)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和转化生长因子β(TGFβ1)。

细胞在37℃含5％CO2的潮湿环境中培养。允许MSC在初始培养基改变之前附着。每3或4天更换培养基。在原代培养结束时，使用胰蛋白酶/EDTA溶液在37℃分离细胞1-5分钟，计数并在相同培养基中的培养瓶中重新铺板用于继代培养。在二次培养结束时，收获MSC衍生的骨形成细胞并用PBS洗涤。

1.3体外细胞表征

1.3.1.细胞计数和生存力

使用台盼蓝排除测定来确定细胞密度和生存力。收集后，用台盼蓝(0.4％，LonzaBioWhittaker)1:2稀释细胞，并使用Bürker室和倒置显微镜(AE31，Motic)分析细胞生存力。还使用氨基放线菌素D(7-AAD，BD Bioscanto II)、和BD FACSDiva软件通过流式细胞术分析细胞生存力。收获后，将50,000个细胞在PBS-1％牛血清白蛋白(BSA)中(LonzaBioWhittaker)与2.5μl7-AAD于室温在黑暗中孵育10分钟。

1.3.2标志物表达

1.3.2.1流式细胞术分析

收获如上述1.1节所述的二次培养后获得的MSC衍生的骨形成细胞，并通过流式细胞术(BD FACScanto II和BD FACSdiva软件；Becton Dickinson，USA)分析细胞表面标记。将细胞与以下缀合的单克隆抗体一起孵育：抗CD73、抗CD90、抗CD105和抗CD166(它们是间充质标志物，并且应当由MSC或MSC衍生细胞高度表达)、抗CD3、抗CD34和抗CD45(它们是造血标志物，并且应当基本上不存在于MSC或MSC衍生细胞中)、抗CD44、抗CD51/61、抗CD49a-e、抗CD29(它们是粘附标志物)、抗CD40、抗CD86和抗HLA-DR(它们是免疫原性标志物)和抗碱性磷酸酶(ALP)，并且在室温下洗涤15分钟，然后在离心之前用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并且再悬浮于0.3ml PBS中。

为了表征细胞表面标志物CD105、CD73、CD10和CD44，将50000个细胞以1×10⁶细胞/ml的浓度在PBS-1％BSA中在暗处与5μl抗体一起温育10分钟。在该孵育时间后，用PBS洗涤细胞一次。用于细胞外染色的不同抗体如下：别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD105抗体(BD

直至它们达到汇合(1至2天)。随后，用成骨培养基更换培养基，所述成骨培养基包含添加有青霉素-链霉素(Lonza)、5％血清、10目录号：562408)，CD73(BD

目录号：560847)，藻红蛋白(PE)缀合的抗CD10抗体(BD

目录号：555375)，CD44(BD

目录号：550989)。非特异性染色通过将细胞与偶联了FITC、APC和PE的免疫球蛋白G(IgG)对照(所有BD

目录号分别为：556649；555751；556650)一起孵育来确定。在分析之前，进行小单胃和感兴趣群体的门控。使用FACS CantoII(BD

)和FACS Diva

软件(BD

)对10000个事件的门控群体进行流式细胞术分析。用于分析的设置参数用珠子(BDComppBeads

目录号560497)自动进行。对于每种缀合物，阳性截止值被固定在对照同种型抗体的阳性的1％并且确定每种标志物的阳性。还测定了整个分析群体的荧光强度(MFI)的中值，并除以相应同种型对照抗体的MFI，以获得归一化的MFI(nMFI)。

表1：概述实例中使用的抗体的供应商和目录号

1.3.2.2.ALP染色

在生产过程结束时，将细胞以60.000个细胞/cm²的宽度铺板于其相应的培养基中，并置于湿润的培养箱中(37-5％CO2)。24小时后对粘附细胞进行ALP染色。用柠檬酸化的缓冲丙酮固定细胞，并用ALP染色溶液在黑暗中孵育30分钟，所述ALP染色溶液由4％v/v萘酚AS-MX磷酸碱性溶液(Sigma；ref：855)和96％v/v固蓝RR盐溶液(Sigma；ref：FBS25)组成。

1.3.2.3.ALP酶活性测量

ALP酶活性通过基于对硝基苯磷酸酯(pNPP)水解的生物化学测定来测量。pNPP经ALP脱磷酸化后，变为黄色，可用分光光度计在410nm处检测。根据纯化的牛肠碱性磷酸酶活性的标准曲线测定细胞的ALP酶活性。ALP活性以ALP/mg蛋白单位报道。一个ALP单元在37℃下在1分钟内水解1μmol pNPP。

1.3.3.逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

收获后，将细胞以干燥沉淀的形式(500,000个细胞)储存在-80℃直至RNA提取。根据制造商的说明，使用

Mini试剂盒

提取总RNA。使用16

测量RNA浓度。根据制造商的说明，使用

RT试剂盒

从1μg总RNA提取物进行RT。按照制造商的说明，使用来自2μl cDNA的Premix

进行qPCR。定量下列目的基因的表达水平：定量下列目的基因的表达水平：RUNX2(Forward:GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG(SEQ ID NO:1),Reverse:AGACACCAAACTCCACAGCC(SEQ ID NO:2)),SOX9(F:TAAAGGCAACTCGTACCCAA(SEQ ID NO:3),R:ATTCTCCATCATCCTCCACG(SEQ ID NO:4),BMP2(F:GGAACGGACATTCGGTCCTT(SEQ ID NO:5),R:CACCATGGTCGACCTTTAGGA(SEQ ID NO:6)),ALPL(F:ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG(SEQ ID NO:7),R:AGACATTCTCTCGTTCACCGCC(SEQID NO:8)),MMP13(F:TGGAATTAAGGAGCATGGCGA(SEQ ID NO:9),R:AACTCATGCGCAGCAACAAG(SEQ ID NO:10)),CHI3L1(F:TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA(SEQ ID NO:11),R:GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA(SEQ ID NO:12)),DCN(F:AAAATGCCCAAAACTCTTCAGG(SEQ ID NO:13),R:GCCCCATTTTCAATTCCTGAG(SEQ ID NO:14)),OCN(F:AAGGTGCAGCCTTTGTGT(SEQ IDNO:15),R:GCTCCCAGCCATTGATACAG(SEQ ID NO:16)),SPON1(F:CCTGCGGAACTGCCAAGTA(SEQID NO:17),R:CACGGGTGAGCCCAATTCT(SEQ ID NO:18)),POSTN(F:TTTGGGCACCAAAAAGAAAT(SEQ ID NO:19),R:TTCTCATATAACCAGGGCAACA(SEQ ID NO:20))。使用

480

一式两份进行qPCR。使用从三个管家基因获得的几何平均值进行标准化：RPL13A(F:CATAGGAAGCTGGGAGCAAG(SEQ ID NO:21),R:GCCCTCCAATCAGTCTTCTG(SEQ ID NO:22)),TBP(F:AACAACAGCCTGCCACCTTA(SEQ ID NO:23),R:GCCATAAGGCATCATTGGAC(SEQ IDNO:24)),HPRT(F:CCCTGGCGTCGTGATTAGT(SEQ ID NO:25),R:GTGATGGCCTCCCATCTCCTT(SEQID NO:26))。通过使用2-ΔΔCt方法计算每个目的基因的基因表达(倍数变化)，对来自同一供体的不同MSC衍生的细胞产物进行比较(Schmittgen和Livak，2008，3(6)，1101-8；Nature Protocols，3(6)，1101-1108)。

使用(13.1.0)软件进行统计分析。将以倍数变化表示的RT-qPCR数据进行对数变换，并进行Student检验(α＝0.05)以评价在各型之间观察到的差异的统计学显著性。

统计学显著性根据获得的p值(p)以图形表示：*表示p<0.05，**表示p<0.01，和***表示p<0.001。

1.3.4.多重测定

收获后，将细胞以50,000个细胞/cm²宽度的密度铺板。在37℃下在含有5％CO2的潮湿环境中孵育48小时后，收获细胞培养上清液，离心(1500rpm，室温下5分钟)并储存在-80℃。上清液使用人磁性分析(R&

)通过分析进行分析。预混合的多重体系是定制的(R&

)。研究了下列分泌因子：BMP-2、COL1A1、MMP13、OPN、OPG、SPARC、RANKL、CHI3L1。按照制造商的说明进行分析，并使用并使用

(R&

)和Bio-Plex Manager 5.0TM软件

进行分析。

1.4细胞大小测量

收获如上文1.1节所述的二次培养后获得的MSC衍生的骨形成细胞，并以12.5×10⁶个细胞/ml的细胞密度悬浮于含有0.4％台酚蓝的PBS中。将10μl细胞悬浮液置于刻度载玻片

上，然后用盖玻片保护，置于放大40X的倒置显微镜下(AE31；Motic)。通过Motic Image Plus2.02软件分析用置于显微镜上的照相机(Moticam)拍摄的图像以测量细胞直径。测量至少一百个细胞以考虑统计学上显著的分析。

还通过流式细胞术(BD FACS Canto II^TM和BD FACS Diva^TM软件；BectonDickinson SA)分析在离体培养的不同时间获得的MSC衍生的骨形成细胞的大小。简言之，在如1.1节所述，离体细胞培养开始后第21、23、26和28天，收获细胞，以1.10⁶个细胞/ml的细胞密度悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并用流式细胞仪分析以进行前向散射(FSC)测量(以相对荧光单位表示)。前向散射测量激光路径方向上的散射光，因此给出通过流动室的细胞的相对尺寸。

2.结果

2.1细胞标志物表达谱

流式细胞术分析显示，基于骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ-1产生)和骨形成细胞B(用FGF2、TGFβ1和肝素产生；本发明的实施方案)的细胞表面标记表达谱的细胞同一性是可比较的。

骨形成细胞A和B群体都表达间充质标记CD73、CD90、CD105、CD63、CD166，并且不表达造血标记CD45、CD34和CD3(少于5％的细胞群体表达这些标记)(表2和3)。骨形成细胞B(i)继续表达低水平的MHC II类细胞表面受体如HLA-DR，和(ii)高度表达的ALP。HLA-DR弱表达所代表的弱免疫原性有利于允许例如向同种异体受试者进行细胞移植(表5)。此外，与未分化的MSC相比，骨形成细胞A和骨形成细胞B在其表面上高度表达粘附标记物CD49e、CD44和酶ALP(表3和4)。最后这种标记(ALP)的高表达突出了向骨形成细胞的骨形成细胞谱系的定向。此外，ALP的高表达证明骨形成细胞B向骨形成细胞谱系定向(相对于未分化MSC相比)。表6还显示，在肝素存在下培养的细胞(骨形成细胞B)的ALP表达高于在没有肝素存在下培养的细胞(骨形成细胞A)的ALP表达。

表2：MSC和MSC衍生的骨形成细胞群的标志物表达谱。

缩写：ALP：碱性磷酸酶；APC：别藻蓝蛋白；FGF-2：成纤维细胞生长因子2；FITC：异硫氰酸荧光素；HLA-DR：人白细胞抗原-DR同种型；MSC：间充质干细胞；Na：不可用；Nd：不确定；PE：藻红蛋白；SD：标准偏差；TGFβ1：转化生长因子β1

表3：MSC和MSC衍生的骨形成细胞群的细胞表面标志物表达谱

缩写：ALP：碱性磷酸酶；APC：别藻蓝蛋白；FITC：异硫氰酸荧光素；HLA-DR：人白细胞抗原-DR同种型；HLA-DR/DP/DQ：人白细胞抗原DR/DP/DQ同种型；MSC：间充质干细胞；Nd：不确定；PE：藻红蛋白；SD：标准偏差

表4：通过不同方法评估MSC和MSC衍生的骨形成细胞群的ALP表达水平

缩写：ALP：碱性磷酸酶；MSC：间充质干细胞；Nd：不确定；nMFI：标准化的荧光强度中值；PE：藻红蛋白；SD：标准偏差

表5：使用不同培养条件比较MSC衍生的骨形成细胞上的免疫原性HLA-DR表面标志物(FACS)的表达

缩写：FGF-2：成纤维细胞生长因子2；HLA-DR：人白细胞抗原-抗原D相关；MSC：间充质干细胞；SD：标准偏差；TGFβ1：转化生长因子β1

表6：MSC和骨形成细胞群的ALP表达水平在不同的培养条件下产生。

缩写：ALP：碱性磷酸酶；FGF-2：成纤维细胞生长因子2；MSC：间充质干细胞；Na：不可用；TGFβ1：转化生长因子β1

细胞表面标记表达谱不仅通过细胞表面上标记的存在(群体阳性百分比)表征，而且通过分析不同标记在细胞表面上表达的标记的量(群体标准化荧光中值)表征。这些分析突出了不同MSC衍生的骨形成细胞之间的一些差异。

在肝素存在下培养的骨形成细胞B比MSC表达更高水平的ALP，在没有肝素存在下培养的骨形成细胞A(表7，ALP-PE nMFI结果)证实了骨形成细胞向成骨细胞谱系的定向。

间充质标记CD73和CD105在细胞表面的表达也依赖于细胞类型。在肝素存在下产生的骨形成细胞(骨形成细胞B)比骨形成细胞A表达更高水平的CD73和CD105(表7)。

表7：MSC和MSC衍生的骨形成细胞群的额外细胞表面标志物表达结果

缩写：ALP：碱性磷酸酶；APC：别藻蓝蛋白；FGF-2：成纤维细胞生长因子2；FITC：异硫氰酸荧光素；HLA-ABC：人白细胞抗原ABC；MSC：间充质干细胞；Na：不可用；Nd：不确定；PE：藻红蛋白；SD：标准偏差；TGFβ1：转化生长因子β1

2.2RT-qPCR和多重测定

分析显示，与MSC相比，编码骨软骨细胞标记的基因RUNX2、SOX9、ZNF521、ALPL、BMP2、OPG、POSTN、CHI3L1、MMP13、CADM1、CX43、CD10、WISP1，以及编码骨和软骨基质蛋白的基因DCN、SPON1在骨形成细胞A和B中显著过表达(表8)。一致地，与MSC相比，编码骨软骨生成抑制剂的DKK1的基因表达在骨形成细胞A和B中被显著下调(表8)。

与MSC相比，编码增殖标记的基因KI67和PCNA的表达在骨形成细胞A和B中均显著下调，并且凋亡相关标记BCL2和BAX的基因表达在所有细胞类型中均相同(表8)。

当与骨形成细胞A比较时，骨形成细胞B(根据p值(p)图示的统计学显著性，对于p＜0.05，获得的p值(p)为︰PERGET︰0.01，获得的p＜0.01为**，对于p＜0.001，获得的p值(p)为***)：

-表达较高水平的基因PPARG(***)(编码参与脂肪形成的蛋白质)；

-表达较高水平的基因CD73(***)、BMP2(***)(编码骨软骨素蛋白)；

-表达较低水平的基因COL1A1(***)、BGN(***)、SPARC(***)、ALPL(*)和BCL2(***)(编码骨软骨素蛋白)。

关于与骨形成细胞A相比在骨形成细胞B中过表达的基因，PPARG、MMP13、BMP2与MSC相比也在骨形成细胞B中显着过表达，而CD73在骨形成细胞B和MSC中具有相同的表达水平。

关于与骨形成细胞A相比在骨形成细胞B中下调的基因(即COL1A1、BGN、SPARC、BCL2)，它们在骨形成细胞B中均具有与MSC中相同的表达水平，除了与MSC相比在骨形成细胞B中仍然过量表达的ALPL。

表8：MSC和源自MSC的骨形成细胞群体的基因表达谱(以相对于平均MSC值的倍数变化表示-统计显着性取决于获得的p值(p)：*对于p<0.05；**对于p<0.01；***对于p<0.001；NS：无统计学意义)

细胞分泌分析显示，与骨形成细胞A和MSC相比，骨形成细胞B分泌出更多的参与骨软骨形成的蛋白CHI3L1和MMP13(表9)，而分泌出抑制成骨作用的DKK1的数量低于骨形成细胞和MSC。在细胞类型之间未观察到分泌的COL1A1数量的显著差异(表9)。

表9：MSC和MSC衍生的骨形成细胞群的分泌曲线(以相对于平均MSC值的倍数变化表示-统计显著性取决于获得的p值(p)：*对于p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001；NS：无统计学意义)

2.3细胞大小

使用(i)Motic Image Plus 2.0/3.0软件和(ii)流式细胞仪FSC分析进行的细胞大小测量证实，由FGF-2，TGFβ1和肝素生成的MSC衍生骨形成细胞(骨形成细胞B)是相比用FGF-2和TGFβ1生成的MSC衍生的骨形成细胞(不含骨蛋白)更小且更均匀(例如，骨形成细胞A)(表10和11，图1和11)。

非常有趣的是，绝大多数骨形成细胞B(≥70％)的直径不超过25μm，其中≤5％的直径超过35μm(表8和9)。相比之下，在不提供肝素的情况下获得的骨形成细胞群(骨形成细胞A)仅包括20％直径不超过25μm的细胞和41％直径超过35μm的细胞(图1和表10)。如在实施例3中进一步详述的，这种大直径的细胞可能在受试者植入后被证明是有害的。

表10：骨形成细胞A和B的细胞大小分布

缩写:FGF-2:成纤维细胞生长因子2；TGFβ1:转化生长因子-β1

表11：MSC和MSC衍生的骨形成细胞的细胞大小分布

细胞直径％	≤25μm	>35μm
			MSCs	89.9％	1.3％
骨形成细胞A	35.4％	26.9％
			骨形成细胞B	73.7％	3.3％

缩写:MSC:间充质干细胞

表12：MSC和MSC衍生的骨形成细胞的直径

缩写:FGF-2:成纤维细胞生长因子2；MSC:间充质干细胞；SD:标准偏差；TGFβ1:转化生长因子β-1

表13：MSC和MSC衍生的骨形成细胞的直径

细胞直径(μm)	平均值±SD	最小-最大	N
				MSCs	19.2±4.8	9.8–41.8	450
骨形成细胞A	30.2±9.9	11.4–67	1205
				骨形成细胞B	22.4±6.4	7.9–74.5	1744

缩写:MSC:间充质干细胞；SD:标准偏差

流式细胞仪FSC实验用于评估产生FGF-2，TGFβ1和肝素的骨形成细胞B在体外培养的不同时间点，因此在不同的细胞融合度(即45％，70％，90％和100％汇合度)下产生的相对平均细胞大小。表14显示骨形成细胞B的细胞大小是稳定的，并且最终随着细胞培养物的融合而增加。换句话说，表14显示来自融合程度更高的细胞烧瓶的骨形成细胞B的平均大小高于来自融合程度较小的培养瓶的骨形成细胞B的平均大小。应该注意的是，流式细胞术FSC实验允许比较不同样品的平均细胞大小，而无需给出有关平均细胞大小的绝对值的信息。

表14：在不同时间点收获的骨形成细胞B的流式细胞仪FSC值以及体外培养期间的融合

实施例2：实施例1的MSC来源细胞的制备方法的特异性

1.实验步骤

1.1细胞培养和血浆制备

如实施例1所述进行细胞培养和血浆制备。

对于与肝素及其类似物之间的比较相关的实验，常规培养基补充了(i)5％v/v S/D血浆；(ii)碱性FGF-2；(iii)TGFβ1；和(iv)0.1IU/ml的未分级的肝素(UFH)、达特肝素、硫酸乙酰肝素或达那肝素。

对于涉及肝素和其它抗凝血剂之间比较的实验，常规培养基添加(i)5％v/v S/D血浆；(ii)碱性FGF-2；(iii)TGFβ；和(iv)1IU/ml肝素(肝素LEO，LEO Pharma SA，比利时，批号A17605)，100IU/ml肝素，2mg/ml乙二胺四乙酸(EDTA)或0.1mg/ml

对于涉及S/D血浆和血清之间比较的实验，常规培养基补充(i)5％v/v S/D血浆或5％血清；(ii)碱性FGF-2；(iii)TGFβ；和(iv)0.1IU/ml肝素。

对于涉及S/D血浆或血清存在与否之间的比较的实验，常规培养基补充(i)5％v/vS/D血浆、5％v/v血清、或0％S/D血浆和0％血清；(ii)碱性FGF-2；(iii)TGFβ；和(iv)0.1IU/ml肝素。

2.结果

2.1肝素vs.其类似物

图2和表15显示，存在于培养基中的肝素可以被其衍生物(类肝素化合物)取代，即被达肝素、硫酸乙酰肝素或糖胺聚糖混合物如达那肝素(包括硫酸乙酰肝素)取代。4种肝素衍生物对细胞生存力和标记物表达谱具有与肝素相同的作用(表15)。

表15：使用不同的类肝素产生MSC衍生的骨形成细胞：UFH、达肝素(dalteparin)、达那肝素(danaparoid)和硫酸乙酰肝素；以0.1IU/ml使用。

2.2肝素vs.其它抗凝血剂

图3显示肝素及其衍生物(浓度为1IU/ml或100IU/ml)不能被其它抗凝剂如EDTA2mg/ml(E8008，Sigma-Aldrich，Lot RNBBB7793)，Actilyse0.1 mg/ml(BoehringerIngelheim，Lot001408)代替。

2.3血浆vs.血清、

图4显示了S/D血浆可以被血清替代以产生本发明的MSC衍生的骨形成细胞。鉴于此，肝素或其类似物是制备骨形成细胞B的方法中的关键要素。

实施例3：通过实施例1的方法获得的MSC衍生的细胞B的体外矿化能力

1.实验步骤

矿化分析研究了体外细胞通过在成骨培养基中培养几周而产生矿化基质的能力。然后使用茜素红S(ARS)染色对矿化基质进行染色。

简言之，收获上述实验1第1.1节中描述的二次培养后获得的MSC衍生的骨形成B，并在48孔板中以60,000个细胞/cm2铺板于每孔补充有青霉素-链霉素(Lonza)和5％血清的基础培养基α-MEM(Lonza)中，直至它们达到汇合(1至2天)。随后，用包含补充有青霉素-链霉素(Lonza)、5％血清、10-8M地塞米松(Sigma)、50μg/ml抗坏血酸(Sigma)和5mMβ-甘油磷酸(Sigma)的基础培养基α-MEM(Lonza)的成骨培养基更换培养基。用新鲜制备的成骨培养基每3±2天更换成骨培养基。

在成骨诱导后第21天和第28天进行ARS染色，如下：用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，在室温下用4％甲醛孵育15分钟，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，随后用去离子水洗涤。然后将细胞在室温下暴露于ARS溶液(20g/L)pH4.2 10分钟。用软化水洗涤细胞，直到洗涤液澄清，并在肉眼和显微镜下观察。将孔置于倒置显微镜(AE31；Motic)下。分析用置于显微镜上的照相机(Moticam)拍摄的图像，以评价沉积在孔中的钙的橙红色染色。

2.结果

肉眼和显微镜观察显示阳性ARS染色，从第21天到第28天，ARS染色增加，因此钙/磷酸盐沉积随时间增加(图5)。这些结果显示FGF-2、TGFβ1和肝素产生的骨形成细胞B能够合成骨基质并通过钙和磷酸盐的沉积使其矿化。更具体地说，这些结果显示骨形成细胞B显示高成骨特性。

实施例4：通过实施例1的方法获得的MSC衍生的细胞B的体外软骨发生能力

1.实验步骤

在特定培养条件下，通过实施例1的方法获得的MSC衍生细胞可以进行软骨细胞分化。这些条件包括聚集体中细胞的三维构象，其中高细胞密度和细胞-细胞相互作用促成软骨发生的机制。简言之，收获如上文实施例1的1.1节中所述的在二代培养后获得的MSC衍生的骨形成细胞B，并重悬于软骨形成分化培养基中，并以2.5×105个细胞/孔的密度置于96孔板(非粘附的圆锥底部)中。软骨形成培养基由Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、补充了10％人胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸钠(ITS)(ITS+1，Sigma-Aldrich)的高葡萄糖(4.5g/l)(DMEM-HG，Lonza)、1％丙酮酸钠(Lonza)、10-7M地塞米松(Sigma)、1μM抗坏血酸(Sigma)和10ng/ml TGFβ1(HumanZyme)组成。阴性对照组包括不含可溶性分化因子地塞米松、抗坏血酸和TGFβ1的软骨形成培养基。然后将多孔板以200×g离心5分钟以形成细胞聚集体，然后在37℃下在95％空气和5％CO2的潮湿环境中放置3周。软骨形成培养基每2或3天更换一次。聚集体形成24小时后的肉眼观察显示细胞聚集体自由漂浮在培养基中。

软骨形成诱导后三周，收集细胞聚集体并处理用于组织学分析：将收集的细胞聚集体固定在3.7％甲醛中并包埋在石蜡中。将石蜡块切成5微米切片。使用(i)苏木精和伊红(H&E)，(ii)甲苯胺蓝和番红-橙染色蛋白聚糖，和(iii)天狼星红染色胶原纤维，对切片进行染色。该方法包括标准脱蜡、染色、脱水和装在载玻片上。显微镜下定性观察染色切片(细胞结构、细胞定位和外观、细胞外基质外观以及胶原和蛋白聚糖含量)。

2.结果

显微镜观察和聚集体直径测量表明，在软骨形成培养基中培养的细胞聚集体比在对照培养基中培养的细胞聚集体显示出更大的尺寸(数据未显示)。软骨形成培养基中的这种大小的增加可能与(1)细胞产生和积累细胞外基质和/或(2)聚集体中的细胞增殖有关。

用苏木精和伊红染色的聚集体切片的定性观察显示对照和软骨形成培养基之间细胞形态的差异(H&E染色，图6)。实际上，在对照培养基中观察到"微核"，并且难以观察到细胞质。而在软骨形成培养基中，可以观察到两种细胞类型，即具有扁平核(在聚集体的外周)的细胞和当远离外周时具有圆形核的细胞。软骨形成分化通过软骨细胞外基质的蛋白聚糖和胶原的染色来证实。相比之下，对照聚集体对于所有测试的染色显示无阳性染色(甲苯胺蓝、番红-橙和天狼星红染色，图6)。

这些结果显示，当在软骨形成培养基中培养时，用FGF-2、TGFβ1和肝素产生的骨形成细胞B能够产生丰富的主要由软骨特异性分子如胶原和蛋白聚糖组成的细胞外基质。

实施例5：通过实施例1的方法获得的骨形成细胞A和B的体内安全性

1.实验步骤

1.1细胞培养和血浆制备

如实施例1所述进行细胞培养和血浆制备。

在施用前，测试骨形成细胞A和B的生存力、细胞大小、同一性(包括通过流式细胞术分析、ALP酶活性和ALP染色测定进行的表面抗原表达)和无菌性。

1.2小鼠毒性研究

给十二周龄雄性和雌性NMRI裸鼠静脉内注射下列测试项目之一：(i)骨形成细胞A(5百万个细胞悬浮于200μl赋形剂中)，(ii)骨形成细胞A(5百万个细胞悬浮于200μl赋形剂中)与肝素(肝素LEO100 UI/ml，LEO Pharma SA，Lot A17605；4单位)或(iii)骨形成细胞B(5百万个细胞悬浮于200μl赋形剂中)。对照组由200μL赋形剂(单独)组成。对照和测试项目以缓慢大丸剂形式通过静脉内注射到尾侧静脉中进行施用。注射的持续时间为至少60秒。每只动物的细胞数量和施用体积是恒定的。

观察动物长达6个月，并且在随访期间监测和/或评估以下几个参数，其中：死亡率和发病率、动物体重、临床观察/体检、血液学和化学血液分析、以及动物安乐死后用于组织病理学分析的器官收集。

1.3.组织病理学分析

收集小鼠肺用于组织病理学分析。处理收集的小鼠肺以进行组织病理学分析：将样品脱水并包埋在石蜡中。切片切成3-5μm厚(横向切片)并对苏木精和伊红染色。将载玻片提交给老年病理学家以确定急性死亡率的原因。

2.结果

2.1急性毒性

进行毒性研究以评价在小鼠中静脉内注射骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)和小尺寸骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)的可能副作用。

如表16所示，静脉内给予骨形成细胞A(A-1和A-2)后观察到急性死亡率(10-35％)，在细胞悬浮液中加入抗凝血剂肝素(4单位)没有降低这种死亡率(肝素的A-3至A-5)。相反，在静脉内给予对照组(赋形剂)和小尺寸骨形成细胞B(B-1至B-4)后，没有观察到急性毒性。

表16：静脉注射小鼠后观察到骨形成细胞A和B的细胞大小分布和急性毒性

*3只动物死亡后(计划中15只)停止注射。

Nd：未测定

2.2组织病理学检查

安乐死后，对所有动物进行尸体剖检。注射小尺寸骨形成细胞B的小鼠呈现总体正常的肺结构，没有观察到肺泡和细支气管毛细管的细胞栓塞(图7A)。注射骨形成细胞A的小鼠呈现肺部病变，其特征在于由大量中等大小的细胞(解释为注射细胞)引起的肺泡和细支气管毛细血管的中度至重度弥散性栓塞，通常伴有急性间质性炎症(图7B)：30％至50％的肺泡毛细血管和小至中等尺寸的细支气管小动脉被封闭全部血管腔的细胞组随机扩大。较大的闭塞毛细血管群压缩了其附近的细支气管，并被肺泡萎陷包围。在细胞群附近很少观察到肺泡内和支气管内的微出血。

所有观察到的样本的主要特征是大量注射细胞(骨形成细胞A)引起的肺泡和细支气管毛细血管的中度至重度弥散性栓塞。这些细胞的数量以及闭塞的肺泡毛细血管的数量表明肺泡中的气体交换可能已经被严重干扰，导致呼吸系统的崩溃。很可能，这个过程是造成受检动物死亡的原因。观察到的血管充血和微出血被解释为濒死变化。

没有发现在心脏、肝脏、肾脏或脾脏中形成微血栓。

实施例6：通过实施例1的方法获得的骨形成细胞A和B的体内骨形成特性

颅盖骨形成模型包括在12周龄雌性NMRI-裸鼠的颅盖上单次皮下施用配制在100μl赋形剂(或单独100μl赋形剂作为阴性对照)中的2.5×10⁶个骨形成细胞。在特定时间点，施用钙结合荧光染料(即茜素红、绿钙黄绿素、蓝钙黄绿素、四环素)以标记新骨形成。茜素红在骨形成细胞给药前给药，而绿钙黄绿素、蓝钙黄绿素和四环素在骨形成细胞给药后给药。在给药后2周期间，监测实验动物的体重、一般临床体征和给药部位的临床体征。2周后，将实验动物安乐死，以通过X-射线成像、组织形态测定(骨形成的定量)和免疫荧光评估骨形成细胞的骨形成特性。

1.实验步骤

1.1细胞培养和血浆制备

如实施例1所述进行细胞培养和血浆制备。

1.2小鼠

9-10周的雌性NMRI-裸(nu/nu)小鼠购自Janvier S.A.S.(Le Genest-St-Isles，法国)并在标准条件下饲养，随意摄取食物和水。196只小鼠共用于本研究。

1.3颅盖成骨小鼠模型

用异氟烷麻醉十二周龄雌性NMRI-裸(nu/nu)小鼠(n＝137)，并在颅盖骨上接受MSC、骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)或骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)(100μl/小鼠中2.5×106个细胞)或赋形剂(100μl)的单次皮下给药。为了标记随时间的骨新生，将钙结合荧光染料顺序地施用给小鼠。分别在细胞给药前3天和给药后4、8和12天腹膜内注射茜素红(红)、钙黄绿素(绿和蓝)和四环素(黄)(均来自Sigma-Aldrich.)。在给药后2周内监测实验动物的体重、一般临床体征和给药部位的临床体征。在细胞施用后2周，通过颈椎脱臼对小鼠实施安乐死，收获每只小鼠的颅盖，以通过组织形态测定法(骨形成的定量)和免疫荧光法评估骨形成细胞的骨形成特性。

1.4样品包埋和组织切片

对于组织形态学、ALP、TRAP(耐酒石酸盐的酸性磷酸酶)、Masson三色金氏染色和免疫荧光，固定颅盖并脱水，在70％、80％和90％乙醇浴中连续温育，每次12小时，在4℃下轻轻振荡，并包埋在甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)塑料树脂(HistoResin，Leica)中。使用切片机(Leica，RM2255)切割四个厚μm和8厚μm的冠状切片。对于番红-橙染色和免疫过氧化物酶，将颅盖固定在3.7％甲醛中24小时，在10％乙二胺四乙酸(EDTA)pH7.4中脱钙三天，并包埋在石蜡中。使用切片机(Leica，RM2255)切割七μm厚的冠状和矢状石蜡切片。

1.5.免疫荧光染色

在4μm厚的颅盖冠状整形组织切片上通过免疫荧光评估人和鼠胶原I。简言之，在室温(RT)下使用PBS1X/Triton0.3％溶液透化30分钟的步骤后，将组织学切片在封闭溶液(即PBS/BSA/马血清/TritonTM)中于RT下温育1小时以饱和非特异性结合位点。然后将组织学载玻片在4℃下与小鼠抗人和兔抗鼠胶原蛋白I第一抗体(分别为Abcam；#ab138492和Abcam；#ab21286)一起温育过夜。在PBS中室温漂洗5分钟3步后，用封闭溶液在室温封闭1小时。然后在避光的条件下，于室温下加入稀释在封闭溶液中的二抗2小时。第二抗体AlexaFluor488驴抗兔IgG H&L(ThermoFisher，#A21206)和Alexa Fluor Cy3羊抗小鼠IgG H&L(Abcam，#ab97035)分别用于显现绿色的鼠胶原I和红色的人胶原I。然后将载玻片在PBS中于室温漂洗3次，1×5分钟，并与溶液于室温温育1分钟以染色细胞核。最后，将载玻片在PBS中简单漂洗一次，然后固定在试剂GlycerGel中。作为免疫荧光的阴性对照，在邻近的组织学载玻片上省略一抗。

1.6组织学染色

分别使用ALP和TRAP酶活性检测方法，分别在颅盖切片上评价骨形成细胞活性和破骨细胞活性。对于ALP染色，将4μm厚的颅盖冠状塑料切片与固蓝RR盐(Sigma-Aldrich)和Naphtol AS-MX磷酸碱溶液(Sigma-Aldrich)一起温育1小时。根据制造商的说明书，使用酸性磷酸酶白细胞(TRAP)试剂盒(Sigma-Aldrich.)，在8μm厚的颅盖冠状塑料切片上进行TRAP染色。为了评估新生骨骼的矿化状态，根据制造商的说明书，使用试剂盒在用ALP染色的颅盖切片上进行Masson Trichrome Goldner染色。为了证明软骨形成，在7μm厚的颅盖矢状石蜡切片上进行番红-橙染色。简言之，脱蜡后，组织切片相继在Weigert苏木精中孵育10分钟，在0.1％Fast Green中孵育5分钟，在1％乙酸中孵育15秒，在0.1％番红橙中孵育5分钟。脱水后，使用Pertex将载玻片用盖玻片固定。用光学显微镜和LAS EZ软件拍摄数字图像。

1.7免疫过氧化物酶

脱蜡后，将7μm厚的颅顶或矢状石蜡切片与2.5％透明质酸酶(Sigma-Aldrich公司)于37℃连续温育30分钟，于3％H2O2(Sigma-Aldrich公司)于室温温育30分钟，于含有0.3％Triton X-100的PBS(Sigma-Aldrich公司)于室温温育30分钟，以及于封闭溶液(即PBS/BSA/马血清/Triton)于室温温育1小时。切片与小鼠抗人I型胶原蛋白一抗(Abcam，ab90395)、兔抗鼠I型胶原蛋白一抗(Abcam，ab21286)或兔抗Ku80一抗(Abcam，ab80592)在4℃下孵育过夜。根据制造商的说明书，使用Vectastain试剂盒(Vector Laboratories，PK6200)和3，3'二氨基联苯胺(Vector Laboratories)使染色可视化。切片用Mayer苏木精复染。使用

将载玻片与盖玻片固定在一起。

1.8颅骨的组织形态计量学分析：骨形成的量化

对塑性包埋组织进行骨形成的定量(即骨形成的百分比)。通过

图像分析软件(Zeiss)在4μm厚的冠状部分上测量颅盖的初始(由茜素红荧光标记的基础矿化前端)和最终厚度(由钙黄绿素和四环素荧光标记的新骨形成)的测量值(以μm计)。然后使用颅盖的初始和最终厚度来计算施用后每个实验动物中的新骨形成百分比。对于每只动物，在5个独立的水平上进行4次初始和最终厚度的测量，每个水平之间的距离为200μm。作为第一步，计算每只动物的初始和最终厚度的平均值±SD(即，5个水平中每个水平的4次测量的平均值)。接着，以最终厚度的平均值与初始厚度的平均值的比值计算每只小鼠的骨形成百分比。

1.9组织学图像上新形成骨表面积的定量测定(

软件)

为了分析骨诱导和成骨性结节的表面积，使用荧光显微镜(Zeiss Axioscope A1，Zeiss，德国)的多个荧光和明场滤光器的组合，从颅盖的塑性树脂组织切片(4μm)上取冠状缝后每2个水平取6个独立水平的数字图像。在每个测量水平上，使用ImageTM软件在明场静态图像中手动定义骨诱导的骨新生的选择。测量该选择的矿化表面积和总表面积(以毫米宽度计)。对成骨性结节的矿化的和总表面积进行相同的程序。

对于骨诱导和骨性结节，然后计算每个实验动物和每组的总表面积平均值和矿化表面积平均值。最后，骨新生的总表面积计算为骨诱导结节和成骨结节表面积的总和。

1.10统计分析

结果表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用软件(SAS研究所公司)进行统计分析。对于体外数据(流式细胞术、RT-qPCR和多重)，对log10转化值进行配对t检验，对于体内数据，使用Mann-Whitney U检验。除非另有说明，否则当p<0.05时，认为组间差异是统计学显著的。

2.结果

在施用2周后，骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)和骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)都显示出比对照(赋形剂)显著更高的骨形成(图8-9，表17)。更具体地说，图10显示骨形成细胞B显示骨诱导特性(在颅盖上来自鼠来源的均匀骨形成)和成骨特性(来自人和鼠来源的矿化节结)。

表17：小鼠颅盖切片上的骨形成(％)的定量。鼠颅盖已经用赋形剂(阴性对照)、骨形成细胞A或骨形成细胞B处理。

缩写：SD：标准偏差

骨形成细胞A和B的骨诱导特性(即植入后新形成的鼠骨的量)是相等的(图8-9)。

非常有趣的是，本发明的骨形成细胞B显示有效的成骨特性和骨诱导特性，如由大量人和鼠骨植入后新形成的(人和鼠ColI IF染色，图10)所示。

在7/8供体和80％骨形成细胞B的小鼠中，以及在4/11供体和20％骨形成细胞A的小鼠中观察到结节的存在。在给予MSC或赋形剂后没有观察到结节。除了骨诱导活性，骨形成细胞B因此促进了高成骨活性，这通过在80％的治疗小鼠中观察到的大矿化节结的存在而突出，而骨形成细胞A显示弱的成骨活性，即在仅20％的治疗小鼠中的小节结(表18)。

表18：在颅盖上给予赋形剂、MSC、骨形成细胞A或骨形成细胞B两周后，定量鼠颅盖上矿化结节的存在

骨生成	供体	批次	动物
				赋形剂	NA	NA	0/32(0％)
MSC	0/2	0/2	0/14(0％)
				骨形成细胞A	4/10(40％)	4/11(36％)	9/45(20％)
骨形成细胞B	7/8(88％)	7/8(88％)	37/46(80％)

缩写：MSC：间充质干细胞；Na：不可适用

施用两周后鼠骨颅盖冠状切片(仅赋形剂MSC、骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生；B-f细胞A)或骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生；B-f细胞B))的组织学染色揭示所有治疗条件(MSC、B-f细胞A和B-f细胞B)具有高骨诱导潜力，在骨诱导形成的骨中具有中等重塑活性(ALP和TRAP染色)。

有趣的是，在用骨形成细胞B处理的小鼠中观察到的矿化节结由鼠(宿主)和人(供体)骨组织构成(通过人和鼠I型胶原染色证明)，这证明节结通过两种骨形成过程形成：成骨(供体骨形成)和骨诱导过程(宿主骨形成)。除了高的成骨细胞和破骨细胞活性(ALP+TRAP染色)之外，结节表现出类骨质组织(非矿化组织)，表明在给药后两周骨形成仍在进展，而在所有条件下观察到的骨诱导过程已经完成(图12)。

图12显示了在施用骨形成细胞B的小鼠的结节中主要检测到人骨形成(即，成骨(用抗人I型胶原染色观察到的)和高成骨细胞和破骨细胞活性(分别用ALP+Goldner染色和TRAP染色观察到的)，从而显示结节中的骨形成过程正在进行并且在2周时未完成，这与MSC和骨形成细胞A似乎完成的骨诱导过程不同。所有处理的条件(MSC、B-f细胞A、B-f细胞B)具有高的骨诱导潜力，在骨诱导的成骨中具有中等的重塑活性(ALP和TRAP染色)(图12)。

在仅用赋形剂MSC、B-f细胞A或B-f细胞B处理两周后，通过荧光评估骨新生的形成(图13)。为此，在特定时间点，将骨钙结合荧光染料(即茜素红、钙黄绿素绿和蓝、四环素黄)给予小鼠以标记新形成的骨。最后要给予的荧光染料是四环素，在给予细胞后12天给予。

如图13所示，施用骨形成细胞B的小鼠的结节大部分被四环素荧光染料染色(黄色染色在图13中用虚线围绕)，与在骨诱导的骨骼中观察到的骨诱导相比，证实了形成的后期形成(茜素红(红)、钙黄绿素(绿)和calecin蓝(蓝)：这些染色以浅灰色出现，双箭头表示骨形成厚度)。

通过在组织学图像上对新形成的骨的表面积进行定量来评估处理小鼠的骨新形成。通过对每个分析的水平和每只小鼠的骨诱导的表面积和骨结节表面积求和来确定新形成的骨的总表面积。

结果显示，与MSC相比(n＝7只小鼠，在图14中以浅灰色显示)，骨形成细胞B在施用所述细胞2周后显著地增加骨新生约2倍(n＝6只小鼠，在图14中以深灰色显示；表19)。这种差异是由于骨形成细胞B显示的高成骨特性，而MSC缺乏这种特性。

表19：在冠状切片上测量总的骨新生形成，包括骨诱导和成骨形成

缩写：MSC：间充质干细胞；SD：标准偏差

此外，使用组织学染色对随时间推移的骨新生的评价揭示了在施用骨形成细胞B的小鼠颅盖顶部观察到的结节通过软骨内的骨化机制骨化。在图15中，番红-橙染色显示蛋白聚糖(对软骨特异的)基质(由虚线围绕的区域)；细胞核；骨组织；和细胞质。与通过膜内骨化产生的骨诱导的骨相反，通过软骨内骨化产生骨结节，其中软骨基质在施用后1周至3周之间出现(图15)。

在施用骨形成细胞B后4周进行的靶向人I型胶原、鼠I型胶原和人核(即Ku80)的免疫组织化学染色证实结节中存在人骨。此外，Ku80染色显示骨形成细胞B在体内施用后移入骨基质(结节)中，并形成骨细胞。

实施例7：通过实施例1的方法获得的骨形成细胞B修复的体内小鼠股骨节段亚临界尺寸缺陷(亚CSD)

1.实验步骤

1.1股骨节段亚临界尺寸缺陷(亚CSD)模型

根据文献(Manassero等人，2013，组织工程，C部分方法，19(4)：271-80；Manassero等人，2016，Journal of Visualized实验；(116)：52940)，在无菌条件下进行手术过程。简言之，用腹膜内注射盐酸右美托咪定(Orion Pharma，1mg/kg体重)和氯胺酮(Euronet，150mg/kg体重)的混合物麻醉13周大的雌性NMRI-裸(nu/nu)小鼠(n＝27)，并放置在温热平板上的腹侧位置。在左股骨的前侧上施加6孔钛微锁定板(RISsystem AG.)之后，使用GilliSAW和夹具(RISsystem AG.)进行2mm长的骨干中段股骨截骨术。作为预防性药物，在手术前一天(在饮用水中)施用抗生素(10mg/kg体重)，在手术前一天和手术后至少3天每12小时施用止痛剂(盐酸丁丙诺啡，0.1mg/kg体重)。在手术当天(用外科缝合线缝合伤口后)，通过使用50μl Hamilton注射器经皮注射，将MSC衍生的细胞(每只小鼠2.25×106个细胞，体积为30μl)或赋形剂(对照组)局部施用于骨缺损部位。在细胞或赋形剂施用后6周通过颈脱位法对小鼠实施安乐死。解剖每只小鼠的左股骨，收获并在室温下保持在0.9％NaCl中直到X-射线成像。

1.2通过X射线分析对骨修复的量化

在手术后立即使用MX-20装置进行每只小鼠左股骨的体内X射线成像，以控制板的固定、节段性股骨缺损大小并得到基线，并且在施用MSC衍生的细胞或赋形剂后每两周至6周进行一次。数字图像以4x放大率以手动模式在中侧和前后视图中拍摄，其中电压设置为35kV，曝光时间为4.8秒，亮度为4,300，对比度为7,100。在细胞施用后6周，在安乐死时收获的左股骨上进行离体X射线成像。数字图像以手动模式在5x放大倍数下在中侧和前后视图中拍摄，其中电压设置为26kV，曝光时间设置为15秒，亮度设置为4,850，对比度设置为6,850。使用ImageJ软件，通过测量中外侧和前后X射线图像上三个位置(缺损的右、中和左)处骨缺损的两个边缘之间的距离(μm)，随时间定量每只小鼠的缺损大小。在每个时间点计算每只小鼠的六次测量的平均值。

1.3 Micro-计算机断层扫描(Micro-CT)分析

在安乐死收获后，用3.7％甲醛固定左股骨并转移至中心用于显微术和分子成像(CMMI，ULB，Gosselis，比利时)用于显微CT分析。使用多模式MicroPET/CT PET/CT照相机(Mediso)和NuclineTM v2.01软件(Mediso)扫描样品。扫描是使用半圆形扫描、最大缩放、35kVp的管张力、机架每次旋转720次投影、每次投影300ms的曝光时间、1比1的检测器像素装仓进行的。X和Y维度上的扫描长度适于每次采集。显微CT扫描的总持续时间为3分钟42秒。使用Shepp-Logan滤波器和8个规则样本的多采样模式，利用40μm边的立方体素后重建每个Micro-CT扫描。X和Y图像的尺寸适于每次重建。Z图像的尺寸对应于为采集而定义的扫描长度。在用Z轴(扫描器轴)重新定向骨并在Z轴上从股骨中的一个近端到另一个近端螺钉剪切图像，并且在横向(X-Y)平面中尽可能窄之后，在Micro-CT图像上执行骨修复的定性评估。然后，产生3D最大强度投影(MIP)绘制。为了定量地评估骨修复，在Micro-CT扫描上将直径2mm和轴长2mm的虚拟圆柱体放置在缺损空间中，并且通过将放射强度等于或高于1500HU的体素阈值处理来评估该圆柱体中的平均骨体积。

2.结果

2.1骨形成细胞B改善小鼠股骨亚临界节段性缺损的修复

在NMRI裸鼠的亚临界大小节段性缺损(CSD)模型中，骨形成细胞B(n＝12只小鼠，2批)改善了骨折修复，如通过与赋形剂(n＝11只小鼠)和与骨形成细胞A(n＝4只小鼠)相比，在施用后2至6周的骨缺损大小如所显示的显著降低(图16A)。

赋形剂，骨形成细胞A(未显示)或骨形成细胞B施用后，D0和6W处股骨节段缺损的X射线图像显示，根据本发明的实施方案与施用赋形剂(图16B)或骨形成细胞A(未显示)的小鼠相比，根据本发明的实施例施用骨形成细胞B的小鼠骨缺损大小减小。

在施用赋形剂和骨形成细胞B后6W时，通过显微计算机断层扫描(Micro-CT)分析定量节段性股骨缺损的骨修复体积。结果证实，骨形成细胞B与赋形剂相比诱导更高的骨修复(图16C)。

序列表

<110> 骨治疗股份公司

<120> 用于分化间充质干细胞的方法

<130> BONE-017-PCT

<150> EP17197605.3

<151> 2017-10-20

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2 正向引物

<400> 1

ggttccagca ggtagctgag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Runx2 反向引物

<400> 2

agacaccaaa ctccacagcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX9 正向引物

<400> 3

taaaggcaac tcgtacccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SOX9 反向引物

<400> 4

attctccatc atcctccacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP2 正向引物

<400> 5

ggaacggaca ttcggtcctt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP2 反向引物

<400> 6

caccatggtc gacctttagg a 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALPL 正向引物

<400> 7

accattccca cgtcttcaca tttg 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ALPL 反向引物

<400> 8

agacattctc tcgttcaccg cc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13 正向引物

<400> 9

tggaattaag gagcatggcg a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MMP13 反向引物

<400> 10

aactcatgcg cagcaacaag 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHI3L1 正向引物

<400> 11

tgggtctcaa agattttcca aga 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHI3L1 反向引物

<400> 12

gctgtttgtc tctccgtcca 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DCN 正向引物

<400> 13

aaaatgccca aaactcttca gg 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DCN 反向引物

<400> 14

gccccatttt caattcctga g 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCN 正向引物

<400> 15

aaggtgcagc ctttgtgt 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OCN 反向引物

<400> 16

gctcccagcc attgatacag 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SPON1 正向引物

<400> 17

cctgcggaac tgccaagta 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SPON1 反向引物

<400> 18

cacgggtgag cccaattct 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POSTN 正向引物

<400> 19

tttgggcacc aaaaagaaat 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> POSTN 反向引物

<400> 20

ttctcatata accagggcaa ca 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPL13 正向引物

<400> 21

cataggaagc tgggagcaag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RPL13 反向引物

<400> 22

gccctccaat cagtcttctg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBP 正向引物

<400> 23

aacaacagcc tgccacctta 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TBP 反向引物

<400> 24

gccataaggc atcattggac 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT 正向引物

<400> 25

ccctggcgtc gtgattagt 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT 反向引物

<400> 26

gtgatggcct cccatctcct t 21

Claims (15)

1.从间充质干细胞(MSC)获得MSC衍生的细胞的方法，包括使MSC在体外或离体与成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子β(TGFβ)和浓度至少为0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

(a)在包含FGF-2、TGFβ和浓度为至少0.01IU/ml的肝素或者其衍生物或类似物的培养基中培养从受试者的生物样品中回收的MSC；

(b)去除非贴壁物质，并在含有FGF-2、TGFβ和浓度至少为0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物的培养基中进一步培养贴壁细胞，从而获得所述MSC衍生的细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、以及它们的混合物；优选地，其中TGFβ是TGFβ1。

4.用于从MSC获得具有改善的移植特性的MSC衍生的细胞的方法，该方法包括尺寸减小步骤，其中所述尺寸减小步骤的特征在于使MSC或MSC衍生的细胞在体外或离体与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中：

-肝素或其衍生物或类似物的浓度为至少0.05IU/ml，优选约0.1IU/ml；和/或

-肝素或肝素衍生物或其类似物，选自未分级的肝素(UFH)；低分子量肝素(LMWH)，如依诺肝素(enoxaparin)、达肝素(dalteparin)、那屈肝素(nadroparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、舍托肝素(certoparin)、瑞肝素(reviparin)、阿地肝素(ardeparin)、帕肝素(parnaparin)、贝米肝素(bemiparin)或其混合物；类肝素(heparinoid)，比如硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸acharan、硫酸角质素或其混合物，如达那肝素(danaparoid)；肝素盐；类肝素盐；肝素片段；类肝素片段；和它们的混合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中悬浮液中至少60％的所述MSC衍生的细胞具有等于或小于25μm的直径(D₆₀≤25μm)，和其中悬浮液中至多5％的所述MSC衍生的细胞具有大于35μm的直径。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述MSC衍生的细胞是骨成软骨细胞谱系，优选成骨细胞谱系。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中另外使所述MSC或MSC衍生的细胞接触以下一种或多种，例如其中所述培养基另外包含以下一种或多种：血浆，血清或其替代物。

9.从MSC获得MSC衍生的细胞的方法，包括在体外或离体使MSC与FGF-2、TGFβ和肝素或其衍生物或类似物接触，其中悬浮液中至少60％的所述MSC衍生的细胞具有等于或小于25μm的直径(D₆₀≤25μm)，和其中悬浮液中至多5％的所述MSC衍生的细胞具有大于35μm的直径。

10.根据权利要求9所述的方法，其中：

-使MSC与浓度为至少0.01IU/ml的肝素或其衍生物或类似物接触；和/或

-TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物；优选地，其中TGFβ是TGFβ1。

11.通过MSC的体外或离体扩充能获得的MSC衍生的细胞群体，其中悬浮液中至少60％的所述MSC衍生的细胞具有等于或小于25μm的直径(D₆₀≤25μm)，并且其中悬浮液中至多5％的所述MSC衍生的细胞具有大于35μm的直径。

12.根据权利要求11所述的MSC衍生的细胞群体，其中：

-所述MSC衍生的细胞能通过以下方法获得，所述方法包括使MSC在体外或离体与FGF-2、TGFβ和肝素或其衍生物或类似物接触，优选地其中TGFβ选自TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3及其混合物，更优选地其中TGFβ是TGFβ1，优选地其中使MSC与至少0.01IU/ml的浓度的肝素或其衍生物或类似物接触，和任选地另外使所述MSC与血浆、血清或其替代物中的一种或多种接触；和/或

-所述MSC衍生的细胞是成骨软骨细胞或成骨细胞谱系，优选地，其中基本上所有的成骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD73、CD63和CD166均呈阳性；基本上所有成骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对CD45呈阴性；至少70％的所述成骨软骨细胞谱系或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对碱性磷酸酶(ALP)呈阳性；和少于10％的所述成骨软骨细胞或成骨细胞谱系的MSC衍生的细胞对HLA-DR呈阳性。

13.药物组合物，包含如权利要求11或12中所定义的MSC衍生的细胞群体。

14.根据权利要求11或12所述的MSC衍生的细胞群体或根据权利要求13所述的药物组合物用作药物，优选用于治疗需要移植MSC衍生的细胞的受试者。

15.根据权利要求14使用的MSC衍生的细胞群体，其中：

-所述MSC衍生的细胞群体以约1×10⁷/ml至约1×10⁸/ml，优选7.5×10⁷个细胞/ml的浓度存在；和/或

-所述MSC衍生的细胞群体或所述药物组合物适于经皮或血管内施用。

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