BR112020007775A2 - métodos para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais (msc) a partir de msc, método para obter células derivadas de msc com propriedades de transplante aprimoradas a partir de msc, populações de células derivadas de msc e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

O pedido divulga um método para obter células derivadas de MSC com propriedades de transplante aprimoradas a partir de MSC, o método compreendendo uma etapa de redução de tamanho de célula, em que a dita etapa de redução de tamanho de célula é caracterizada por colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL. O pedido fornece ainda um método para obter células derivadas de células-tronco mesenquimais a partir de células-tronco mesenquimais (MSC), que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFß e pelo menos 0,01 IU/mL de heparina ou um derivado ou análogo da mesma. A invenção também fornece as células e populações de células assim obtidas, bem como produtos adicionais que compreendem as mesmas e suas utilizações.

Description

MÉTODOS PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) A PARTIR DE MSC, MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE MSC COM PROPRIEDADES DE TRANSPLANTE APRIMORADAS A PARTIR DE MSC, POPULAÇÕES DE CÉLULAS

DERIVADAS DE MSC E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a métodos para expansão e/ou diferenciação de células-tronco mesenquimais (MSC), células e populações celulares derivadas de MSC, e a produtos que compreendem essas células e populações celulares, métodos e usos.

Antecedentes da Invenção

[002] O transplante de células-tronco capazes de sofrer diferenciação osteogênica, de células que estão comprometidas na diferenciação osteogênica ou de células com capacidade para formação óssea é uma via promissora para o tratamento de doenças ósseas, em particular quando o tratamento necessita da produção de novos tecidos ósseos.

[003] Foram usadas anteriormente células-tronco mesenquimais (MSC) para tratar disfunções ósseas (Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437- 42). No entanto, embora essas células-tronco relativamente indiferenciadas possam ser transplantadas, elas não estão comprometidas com uma linhagem osteoblástica e, portanto, uma proporção considerável dessas células-tronco transplantadas eventualmente pode não contribuir para a formação do tecido ósseo desejado. Além disso, a quantidade dessas células-tronco é frequentemente insatisfatória.

[004] O documento WO 2007/093431 refere-se a um método para expansão in vitro de MSC isoladas, que produziu células que exibiam um fenótipo osteoblástico. No dito método, foram cultivadas MSC humanas na presença de soro ou plasma e fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF- 2).

[005] O documento WO 2009/087213 refere-se a um método para obter células osteoprogenitoras, osteoblastos ou fenótipos osteoblásticos a partir de MSC humanas in vitro ou ex vivo, que compreende colocar as ditas MSC em contato com plasma ou soro humano, FGF-2 e fator de crescimento transformador beta (TGF-B).

[006] Existe uma necessidade contínua para novas células e populações celulares úteis, entre outras terapias, como novas células e populações celulares derivadas de MSC, e métodos para produzir as mesmas.

Descrição Resumida da Invenção

[007] Conforme corroborado pela seção experimental, que ilustra certas realizações representativas da invenção, os inventores perceberam que o potencial de transplante de células derivadas de células-tronco mesenquimais (MSC) pode ser consideravelmente aumentado quando as ditas células são obtidas por contato com MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo com heparina ou um derivado ou análogo. Mais particularmente, os inventores descobriram que colocar MSC ou células derivadas de MSC em contato com heparina ou com um derivado ou análogo, preferencialmente heparina ou um derivado ou análogo da mesma, a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, origina novas populações celulares derivadas de células MSC, cujas células têm um tamanho de célula padronizado, homogêneo e comparativamente pequeno. Essas células derivadas de MSC têm propriedades de transplante aprimoradas, como (i) adequação aprimorada para administração parenteral (por exemplo, intravascular, incluindo intravenosa), (ii) possibilidade para distribuir in vivo uma concentração celular alta e ajustável com um volume limitado, (iii) um bom perfil de segurança in vivo e/ou (iv) uma boa seringabilidade quando distribuída por via parenteral.

[008] Além disso, as presentes células derivadas de MSC são capazes de induzir formação óssea. Em adição às propriedades osteoindutivas, os presentes inventores descobriram que as presentes células derivadas de MSC também exibem alta atividade osteogênica. A atividade osteogênica, vantajosamente, leva à ocorrência de nódulos mineralizados produzidos através da ossificação endocondral.

[009] Então, em um aspecto, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC com propriedades de transplante aprimoradas a partir de MSC, o método compreendendo uma etapa de redução de tamanho, em que a dita etapa de redução de tamanho é caracterizada por colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[010] Em um aspecto adicional, invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[011] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina, ou um derivado ou análogo da mesma, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo <€ 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 UM.

[012] Em outro aspecto, a invenção fornece uma população de células derivadas de MSC que pode ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 uM.

[013] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido.

[014] Em outro aspecto, a invenção fornece a população de células derivadas de MSC ou a composição farmacêutica, conforme ensinado no presente pedido, para uso como medicamento.

[015] Estes e outros aspectos e as realizações preferenciais da invenção são descritos nas seções a seguir e nas reivindicações anexas. A matéria em questão das reivindicações anexas é especificamente incorporada neste relatório descritivo.

Breve Descrição das Figuras

[016] A Figura 1 ilustra o tamanho celular de células derivadas de MSC, particularmente células de formação óssea derivadas de MSC, geradas com fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2) e fator de crescimento transformador beta 1 (TGFB1) (A) e células de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina (B).

[017]A Figura 2 ilustra a geração de células derivadas de MSC, particularmente de células de formação óssea derivadas de MSC, com diferentes heparinoides: heparina não fracionada (UFH), dalteparina, danaparoide e sulfato de heparano; usados a 0,1 IU/mL.

[018] Figura 3 ilustra uma cultura de MSC com heparina versus outros anticoagulantes: EDTA e Actilyseº (alteplase, ativador do plasminogênio tecidual recombinante). Após 36 horas de cultura, as células colocadas em contato com EDTA a 2 mg/mL e Actilyseº a 0,1 mg/mL estão em suspensão enquanto as células colocadas em contato com heparina 1 ou 100 IU/mL estão crescendo e aderidas.

[019] A Figura 4 ilustra células derivadas de MSC, particularmente as células de formação óssea derivadas de MSC, cultivadas com uma realização do método da invenção em que o plasma tratado com solvente/detergente (S/D) (5% v/v) foi substituído por soro (5% v/v).

[020] A Figura 5 ilustra a mineralização in vitro de células derivadas de MSC, analisadas por coloração com vermelho de alizarina (ARS). As células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina) foram cultivadas sob condições osteogênicas. A ARS foi realizada após 21 dias (A) e 28 dias (B) de cultura sob condições osteogênicas para coloração de depósitos de cálcio e fosfato (ampliação de 100 x).

[021] A Figura 6 ilustra a coloração de hematoxilina e eosina e coloração da matriz extracelular cartilaginosa (proteoglicanos e colágeno) dos cortes dos agregados celulares. As células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina) foram centrifugadas para formar agregados celulares, e os agregados celulares foram cultivados por 21 dias sob condições condrogênicas ou condições de controle. Azul de toluidina cora proteoglicano da matriz extracelular cartilaginosa e dos núcleos celulares. Laranja safranina cora proteoglicano da matriz extracelular cartilaginosa, e vermelho sirius cora colágeno.

[022] A Figura 7 ilustra a coloração de hematoxilina e eosina dos cortes histológicos do parênquima pulmonar (ampliação de 200 x). (A) Animal injetado com células B de formação óssea derivadas de MSC: parênquima pulmonar normal; (B) animal injetado com células A de formação óssea: parênquima pulmonar com numerosos grupos disseminados de células injetadas em capilares alveolares (setas).

[023] A Figura 8 ilustra a neoformação óssea em um corte coronal do osso da calvária de murino evidenciada por fluorocromos da ligação de cálcio humano e murino, 2 semanas após administração de excipiente isoladamente (condição de controle), células A de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF- 2 e TGFB1) ou células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina).

[024] A Figura 9 ilustra a quantificação da formação óssea (%) realizada em cortes coronais de calvaria de murino, 2 semanas após administração de excipiente isoladamente (controle negativo), células A de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2 e TGFRB1) ou células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina).

[025] A Figura 10 ilustra imunocoloração dupla (imunofluorescência) de anti-colágeno tipo | humano e anti-murino realizada em cortes coronais de osso de calvária de murino, 2 semanas após a administração de células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina). A

Figura 10a ilustra imunocoloração dupla (mesclada) de anti-colágeno tipo | murino e anti-humano, enquanto as Figuras 10b e 10c mostram imunocoloração de anti-colágeno tipo | murino e anti-humano, respectivamente.

[026] A Figura 11 ilustra o tamanho celular de (A) MSCs, (B) células A de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2 e TGFRB1) e (C) células B de formação óssea derivadas de MSC (geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina).

[027] A Figura 12 illustra coloração histológica de cortes coronais de osso de calvária de murino, 2 semanas após administração de excipiente isoladamente, MSC, células A de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2 e TGFRB1 (células A b-f), ou células B de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina (células B b-f). (A) fluorocromos de ligação de cálcio foram sequencialmente injetados por via intraperitoneal (vermelho de alizarina — calceína verde — calceína azul — tetraciclina) para evidenciar a neoformação óssea (setas) e avaliar a dinâmica da formação óssea; (B) imunofluorescência (IF) de colágeno tipo | murino + humano; (C) |F de colágeno tipo | murino; (D) IF de colágeno tipo | humano. Imunofluorescência dupla de anti-colágeno tipo | murino e anti-humano para permitir a detecção de colágeno tipo | murino e humano secretados pela matriz óssea; (E) ALP + coloração Goldner: ALP: detecção da atividade osteoblástica em preto (linhas e áreas cheias), tricrôômico de Masson-Goldner: Detecção do osteoide (tecido ósseo não mineralizado) em linhas pontilhadas pretas, osso mineralizado em linhas cinza escuro; (F) fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP): detecção da atividade osteoclástica em cinza escuro/preto.

[028] A Figure 13 representa fotografias que ilustram a neoformação óssea em cortes coronais de osso de calvária de murino, 2 semanas após administração de excipiente isoladamente; MSC; células A de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2 e TGFRB1 (células A b-f), ou células B de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina (células B b-f). A neoformação óssea é evidenciada por fluorescência (marcada pela integração sequencial de diferentes fluorocromos: vermelho de alizarina — calceína verde — calceína azul — tetraciclina amarela). A coloração vermelha, verde e azul aparece em cinza claro e a espessura de neoformação óssea é indicada com setas duplas. A coloração amarela foi rodeada por linhas pontilhadas.

[029] A Figura 14 representa um gráfico que ilustra a área superficial total de osso neoformado (média + SEM, * p < 0,05) medida nos cortes de calvária de murino, 2 semanas após administração de MSC (cinza escuro) ou células B de formação óssea (cinza claro).

[030]A Figura 15 ilustra a coloração laranja safranina da matriz cartilaginosa (cercada por linhas tracejadas) de nódulos mineralizados, realizada nos cortes sagitais do osso da calvária de murino um dia após a administração das células B de formação óssea (D1) e ao longo do tempo (D7, D14, D21) até 28 dias (D28) após administração.

[031] A Figura 16 ilustra o efeito de células derivadas de MSC em um modelo de defeito segmentar de tamanho subcrítico do fêmur. (A) representa um gráfico que ilustra a medição do tamanho do defeito nas imagens de raios X no dia do procedimento cirúrgico/administração de item (DO) e ao longo do tempo (1, 2, 3, 4, 5 semanas) até 6 semanas (6W) após administração de excipiente isoladamente, células A de formação óssea (células A b-f) ou células B de formação óssea (células B b-f); média + SEM, ** p < 0,01, *** p < 0,001; (B) representa imagens de raios X representativas de defeitos femorais segmentares em DO e 6W após administração do excipiente isoladamente ou de células B de formação óssea (células B b-f); (C) representa um gráfico que ilustra o volume de medição de reparação óssea por análises de microtomografia computadorizada (micro-TC) em 6W após administração do excipiente isoladamente (n = 7) e células de formação óssea B (n = 8); média + SEM, * p < 0,05.

Descrição Detalhada

[032] Como usado no presente pedido, as formas singulares “um”, “uma” e

“o/a” incluem tanto o singular com os referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma.

[033] Os termos “que compreende”, “compreende” e “compreendido de” como usado no presente pedido são sinônimos com “que inclui”, “inclui” ou “que contém”, “contém”, e são inclusivos ou abertos e não excluem, membros não recitados, elementos ou etapas de método adicionais. Os termos também englobam “que consiste em” e “que consiste essencialmente em”, que gozam de significados bem estabelecidos na terminologia de patentes.

[034] A citação de faixas numéricas por desfechos primários inclui todos os números e frações incluídas dentro das respectivas faixas, bem como os desfechos primários citados.

[035] Os termos “cerca de” ou “aproximadamente”, como usado no presente pedido, ao se referirem a um valor mensurável como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporária, e similares, significam englobar variações de e do valor especificado, como variações de +/-10% ou menos, preferencialmente +/-5% ou menos, mais preferencialmente +/-1% ou menos, e ainda mais preferencialmente +/-0,1% ou menos e do valor especificado, na medida em que essas variações são apropriadas para realizar na invenção divulgada. Entende-se que o valor ao qual o modificador “cerca de” refere-se a sim mesmo, também é especificamente, e preferencialmente, divulgado.

[036] Enquanto que os termos “um ou mais” ou “pelo menos um”, como um ou mais membros ou pelo menos um membro de um grupo de membros, é claro por si mesmo, por meio de exemplificação adicional, o termo engloba entre outras coisas uma referência a qualquer um dos ditos membros, ou a qualquer dois ou mais dos ditos membros como, por exemplo, qualquer um 2 3, 24,25, > 6 ou > 7 etc. dos ditos membros, e até todos os ditos membros. Em outro exemplo, “um ou mais” ou “pelo menos um” pode se referir a 1, 2, 3,4,5,6,7 ou mais.

[037] A discussão dos antecedentes da invenção no presente pedido é incluída para explicar o contexto da invenção. Isso não deve ser considerado como uma admissão de que qualquer material citado foi publicado, conhecido ou parte dos conhecimentos gerais comuns em qualquer país na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[038] Ao longo desta divulgação, várias publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicadas são referenciadas por uma citação de identificação. Todas os documentos citados no presente relatório descritivo são incorporados ao presente pedido como referência em sua totalidade. Em particular, os ensinamentos ou seções desses documentos no presente pedido citados especificamente são incorporados como referência.

[039] A menos que definido de outra forma, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no assunto para o qual esta invenção pertence. Por meio de orientação adicional, são incluídas definições de termos para melhor apreciar o ensinamento da invenção. Quando termos específicos são definidos em conexão com um aspecto particular da invenção ou uma realização particular da invenção, essa conotação é destinada a se aplicar por todo o relatório descritivo, isto é, também no contexto de outros aspectos ou realizações da invenção, a menos que definido de outra forma.

[040] Nas passagens a seguir, diferentes aspectos ou realizações da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto ou realização então definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto(s) ou realização(ões), a menos que claramente indicado ao contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferencial ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferenciais ou vantajosas.

[041] Referir-se ao longo deste relatório descritivo a, “uma realização” significa que um recurso, estrutura ou característica específica descritos em conjunto com a realização está incluída em pelo menos uma realização da presente invenção. Dessa forma, aspectos da expressão “em uma realização” em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não necessariamente todo referem-se à mesma realização, mas podem. Além disso, os recursos específicos, estruturas ou características podem ser combinados de qualquer maneira conveniente, como seria aparente para um técnico no assunto a partir desta divulgação, em uma ou mais realizações. Além disso, embora algumas realizações descritas no presente pedido incluam algumas, mas não outras características incluídas em outras realizações, combinações de características de diferentes realizações têm a intenção de estar dentro do escopo da invenção e formar diferentes realizações, como seria entendido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das realizações reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[042] Conforme corroborado pela seção experimental, que ilustra certas realizações representativas da invenção, os inventores identificaram um método para obter células derivadas de MSC ou uma população de células derivadas de MSC com um potencial de transplante aumentado. Mais particularmente, os inventores descobriram surpreendentemente que ao colocar MSC ou células derivadas de MSC em contato com heparina ou um derivado ou análogo, preferencialmente heparina ou um derivado ou análogo da mesma, a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, pode ser obtida uma nova população de células derivadas de MSC, com um tamanho padronizado, homogêneo e pequeno. Em certas realizações, MSC ou células derivadas de MSC são colocadas em contato com uma combinação de FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, preferencialmente heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL. Esse tamanho pequeno, padronizado e homogêneo representa propriedades aprimoradas de transplante, como (i) o potencial de administração parenteral (por exemplo, intravascular, incluindo intravenosa) das ditas células derivadas de MSC, (ii) a possibilidade para distribuir in vivo uma concentração celular alta e ajustável com um volume limitado, (ili) um bom perfil de segurança in vivo e/ou (iv) uma boa seringabilidade quando distribuída por via parenteral. Consequentemente, um primeiro aspecto fornece um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[043] O termo “célula-tronco mesenquimal” ou “MSC”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula-tronco adulta derivada do mesoderma capaz de gerar células de linhagens mesenquimais, tipicamente de duas ou mais linhagens — mesenquimais, mais tipicamente três ou mais linhagens mesenquimais, por exemplo, linhagem osteocondroblástica (osso e cartilagem), osteoblástica (osso), condroblástica (cartilagem), miocítica (músculo), tenocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) e estromal (estroma da medula) MSC pode ser isolada de uma amostra biológica, preferencialmente uma amostra biológica de um sujeito humano, por exemplo, medula óssea, osso trabecular, sangue, cordão umbilical, placenta, saco vitelino fetal, pele (derme), especificamente pele fetal e adolescente, periósteo, polpa dentária, tendão e tecido adiposo. O termo “amostra biológica” ou “amostra”, como usado no presente pedido, refere-se a uma amostra obtida a partir de uma fonte biológica, por exemplo, de um organismo, como um animal ou um sujeito humano, cultura celular, amostra de tecido, etc. Uma amostra biológica de um animal ou de um sujeito humano refere-se a uma amostra retirada de um animal ou de um sujeito humano e que compreende células dos mesmos. A amostra biológica de um animal ou de um sujeito humano pode compreender um ou mais tipos de tecidos e pode compreender células de um ou mais tipos de tecidos. Métodos para obter amostras biológicas de um animal ou sujeito humano são bem conhecidos na técnica, por exemplo, biópsia de tecido ou sangue de coleta. MSC humana, seu isolamento, expansão in vitro e diferenciação foram descritos, por exemplo, na patente US 5.486.359, patente US 5.811.094, patente US

5.736.396, patente US 5.837.539 ou patente US 5.827.740. Qualquer MSC descrita na técnica e isolada por qualquer método descrito na técnica pode ser adequada no presente método. Em particular, MSC pode ser definida como exibindo a capacidade de diferenciação mesenquimal de trilinhagem in vitro para osteoblastos, adipócitos e condroblastos (Dominici et a/, 2006, vol. 8, 315).

[044] O termo “MSC” também engloba a progênie de MSC, por exemplo, progênie obtida por proliferação in vitro ou ex vivo (propagação/expansão) de MSC obtida de uma amostra biológica de um animal ou sujeito humano.

[045] O termo “célula-tronco” refere-se geralmente a uma célula não especializada ou relativamente menos especializada e competente para proliferação, que é capaz de se autorrenovar, isto é, pode proliferar sem diferenciação, e as quais ou a progênie das quais pode dar origem a pelo menos um tipo de célula relativamente mais especializado. O termo abrange células- tronco com capacidade de autorrenovação substancialmente ilimitada, isto é, em que a progênie de uma célula-tronco ou pelo menos parte da mesma substancialmente mantém o fenótipo não especializado ou relativamente menos especializado, o potencial de diferenciação e a capacidade de proliferação da célula-tronco mãe, bem como células-tronco que apresentam autorrenovação limitada, isto é, em que a capacidade da progênie ou parte da mesma para proliferação e/ou diferenciação adicional é comprovadamente reduzida em comparação à célula-mãe. Por meio de exemplo e não de limitação, uma célula- tronco pode dar origem a descendentes que podem se diferenciar em uma ou mais linhagens para produzir células relativamente cada vez mais especializadas, em que esses descendentes e/ou células relativamente cada vez mais especializadas podem ser elas próprias células-tronco, conforme definido no presente pedido, ou mesmo para produzir células terminalmente diferenciadas, isto é, células totalmente especializadas, que podem ser pós- mitóticas.

[046] O termo “célula-tronco adulta”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula-tronco presente ou obtida a partir de (como isolada a partir de) um organismo no estágio fetal ou preferencialmente após o nascimento (por exemplo, particularmente mas sem limitação a um organismo humano, pelo menos um mês de idade após o nascimento, por exemplo, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, por exemplo, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses,

por exemplo, pelo menos 6 meses de idade após o nascimento como, por exemplo, 1 ano ou mais, 5 anos ou mais, pelo menos 10 anos ou mais, 15 anos ou mais, 20 anos ou mais, ou 25 anos ou mais de idade após o nascimento) como, por exemplo, após atingir a idade adulta. Por meio de exemplos, células- tronco adultas podem ser obtidas a partir de sujeitos humanos que, de outro modo, seriam descritos nos termos convencionais “lactente”, “criança”, “jovem”, “adolescente” ou “adulto”.

[047] MSC preferencialmente têm o potencial para gerar células pelo menos da linhagem osteocondroblástica como, por exemplo, células da linhagem osteoblástica — como, por exemplo, osteocondroprogenitoras — e/ou osteoprogenitoras e/ou pré-osteoblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos, e/ou da linhagem condroblástica como, por exemplo, osteocondroprogenitoras e/ou condroprogenitoras e/ou pré-condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos.

[048] Além disso, MSC preferencialmente têm o potencial para gerar células pelo menos da linhagem osteoblástica (osso) como, por exemplo, osteocondroprogenitoras e/ou osteoprogenitoras e/ou pré-osteoblastos e/ou osteócitos, etc.; ou pelo menos da linhagem condroblástica (cartilagem) como, por exemplo, osteocondroprogenitoras e/ou condroprogenitoras e/ou pré- condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos; linhagem fibroblástica (tecido conjuntivo) como, por exemplo, fibroblastos, fibrócitos; ou pelo menos sinoviócitos (fluido sinovial); ou tenócitos etc.

[049] Exceto quando observado, “sujeito” ou “paciente” são usados de forma intercambiável e se referem a animais, preferencialmente vertebrados, mais preferencialmente mamíferos, e incluem especificamente pacientes humanos e mamíferos não humanos. Pacientes preferenciais são sujeitos humanos. Sujeitos animais incluem formas pré-natal de animais como, por exemplo, fetos. Sujeitos humanos podem incluir fetos, e não embriões.

[050] Em uma realização, MSC podem ser obtidas a partir de um sujeito saudável, o que pode ajudar a garantir a funcionalidade das células derivadas de MSC obtidas a partir das ditas MSC.

[051] Em outra realização, MSC são obtidas a partir de um sujeito humano que necessita de transplante de células derivadas de MSC.

[052] Em certas realizações dos produtos ou dos métodos ensinados no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC podem ser alogênicas para o sujeito a ser tratado. Os termos “alogênico” ou “homólogo”, com referência a MSC ou células derivadas de MSC, denotam que as MSC ou células derivadas de MSC são obtidas a partir de um ou mais sujeitos (agrupados), exceto o sujeito a ser colocado em contato ou tratado com as células derivadas de MSC.

[053] Em certas realizações dos produtos ou dos métodos ensinados no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC podem ser autólogas para o sujeito a ser tratado. O termo “autólogo” com referência a MSC ou células derivadas de MSC denota que as MSC ou células derivadas de MSC são obtidas a partir do mesmo sujeito a ser colocado em contato ou tratado com as células derivadas de MSC.

[054] Em certas realizações dos produtos ou dos métodos ensinados no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC podem compreender uma mistura de MSC ou células derivadas de MSC autólogas e alogênicas (isto é, homólogas), conforme definido acima. Preferencialmente, as MSC ou células derivadas de MSC são alogênicas para o sujeito a ser tratado.

[055] O termo “células derivadas de célula-tronco mesenquimal” ou “células derivadas de MSC”, como usado no presente pedido, refere-se a células de linhagem mesenquimal (por exemplo, linhagem osteocondroblástica (osso e cartilagem), osteoblástica (osso), condroblástica (cartilagem), miocítica (músculo), tenocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) ou estromal (estroma da medula)), obtidas por diferenciação de MSC, em particular, obtidas por diferenciação de MSC in vitro (incluindo ex vivo).

[056] A diferenciação de MSC pode envolver o cultivo de MSC sob condições capazes de induzir a diferenciação de MSC para o tipo celular desejado, mais tipicamente o cultivo de MSC em um meio que compreende um ou mais agentes (por exemplo, fatores de crescimento) capazes de induzir a diferenciação de MSC para o tipo celular desejado. Os protocolos para diferenciação de MSC são conhecidos por si mesmo (consulte, entre outros, documento WO 2007/093431; e ainda REGER, R.L. et al. “Differentiation and Characterization of Human MSCs”., Em: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Editado por D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, Vol. 449, págs. 93-107; VERMURI, M.C. et a/. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, especialmente págs. 201 a 352).

[057] O termo “fator de crescimento”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância biologicamente ativa que influencia na proliferação, crescimento, diferenciação, sobrevivência e/ou migração de vários tipos de células, e pode afetar alterações de desenvolvimento, morfológicas e funcionais em um organismo, tanto isoladamente como quando modulada por outras substâncias. Um fator de crescimento pode agir tipicamente por ligação, como um ligante, a um receptor (por exemplo, receptor de superfície ou intracelular) presente nas células responsivas ao fator de crescimento. Um fator de crescimento no presente pedido pode ser particularmente uma entidade proteica, que compreende uma ou mais cadeias polipeptídicas. Por meio de exemplo e sem limitação, o termo “fator de crescimento” engloba os membros da família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF), família da proteína morfogênica óssea (BMP), família do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), família do fator de crescimento transformador beta (TGFB), família do fator de crescimento do nervo (NGF), família do fator de crescimento epidérmico (EGF), família do fator de crescimento relacionado à insulina (IGF), família do fator de diferenciação do crescimento (GDF), família do fator de crescimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento hematopoiéticos (HeGFs), fator de crescimento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), angiopoietina, família do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) glicocorticoides, e similares. O técnico no assunto entenderá que o fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento podem ser qualquer fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento conhecidos por serem capazes de induzir diferenciação de MSC em direção a um tipo de célula desejada. O técnico no assunto irá considerar que os métodos in vitro para induzir diferenciação de MSC para um tipo celular desejado (por exemplo, para células de linhagem osteocondroblástica, osteoblástica ou condroblástica) podem resultar em uma população celular substancialmente pura (isto é, composta principalmente) do tipo celular desejado. Sem limitação, a população celular assim derivada pode conter pelo menos 90% (em número) do tipo celular desejado como, por exemplo, = 91%, = 92%, >= 93%, = 94%, > 95%, > 96%, >= 97%, >= 98%, >= 99% ou 100 % do tipo celular desejado.

[058] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC são de linhagem osteocondroblástica (osso e cartilagem), linhagem osteoblástica (osso) como, por exemplo, osteocondroprogenitoras e/ou osteoprogenitoras e/ou pré- osteoblastos e/ou osteócitos, etc.; linhagem condroblástica (cartilagem) como, por exemplo, osteocondroprogenitoras e/ou condroprogenitoras e/ou pré- condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos; linhagem adipogênica (gordura): miogênica (músculo); tenogênica (tenócitos); linhagem fibroblástica (tecido conjuntivo) como, por exemplo, fibroblastos, fibrócitos; ou linhagem sinovial (fluido sinovial).

[059] Em realizações particulares, células derivadas de MSC são de linhagem osteocondroblástica. A citação de “células derivadas de MSC da linhagem osteocondroblástica”, como usado no presente pedido, pode se referir a células progenitoras que têm a capacidade para se diferenciar em células da linhagem osteoblástica, como osteocondroprogenitoras, osteoprogenitoras e/ou pré-osteoblastos e/ou osteoblastos e/ou osteócitos, etc., ou em células da linhagem condroblástica, como osteocondroprogenitoras, condroprogenitoras e/ou pré-condroblastos e/ou condroblastos e/ou condrócitos. O técnico no assunto entenderá que as células progenitoras irão se diferenciar tanto em células da linhagem osteoblástica (por exemplo, pré-osteoblastos como osteoblastos) ou em células da linhagem condroblástica (por exemplo, pré-

condroblastos ou condroblastos), dependendo das condições em que são expostas, como fatores físicos e/ou componentes químicos ou biológicos, como fatores de crescimento.

[060] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC são células derivadas de MSC da linhagem osteoblástica ou condroblástica. Em realizações preferenciais, as células derivadas de MSC são células derivadas de MSC da linhagem osteoblástica. Em realizações mais preferenciais, as células derivadas de MSC são osteoprogenitoras, pré-osteoblastos, osteoblastos ou osteócitos.

[061] Em certas realizações particularmente preferenciais, a citação “células derivadas de MSC da linhagem osteoblástica” ou “células de formação óssea derivadas de MSC" podem se referir igualmente a tipos celulares que têm um fenótipo osteoblástico, e que podem contribuir, ou são capazes de se desenvolver para células que possam contribuir para a formação de material ósseo ou matriz óssea, como osteocondroprogenitoras, osteoprogenitoras, pré- osteoblastos, osteoblastos ou osteócitos, ou misturas das mesmas. Como usado no presente pedido, “osteoprogenitoras" pode compreender particularmente osteoprogenitoras precoces e tardias. Ainda mais preferencialmente, “células derivadas de MSC da linhagem osteoblástica” ou “células de formação óssea derivadas de MSC" podem se referir igualmente às osteocondroprogenitoras, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos ou osteoblastos, ou misturas das mesmas, ainda mais preferencialmente a expressão pode se referir às osteocondroprogenitoras ou pré-osteoblastos ou osteoblastos, ou misturas das mesmas como, em alguns exemplos, a expressão pode se referir a pré- osteoblastos ou, em outros exemplos, a expressão pode se referir a osteoblastos. Todos estes termos são bem conhecidos por si mesmos.

[062] Por meio de orientação adicional e não limitação, osteoprogenitoras, pré-osteoblastos e osteoblastos, bem como populações celulares que compreendem osteoprogenitoras pré-osteoblastos e/ou osteoblastos podem exibir as seguintes características: a) as células compreendem expressão de fator de transcrição 2 relacionado a Runt (Runx2), um fator de transcrição multifuncional que regula a diferenciação de osteoblastos e a expressão de muitos genes de proteínas da matriz extracelular durante a diferenciação de osteoblastos;

b) as células compreendem expressão de pelo menos uma das seguintes: fosfatase alcalina (ALP), mais especificamente ALP do tipo osso- fígado-rim; e mais preferencialmente também compreende expressão de um ou mais marcadores ósseos adicionais, como osteocalcina (OCN, BGLAP), propeptídeo aminoterminal do procolágeno tipo 1 (P1INP), osteonectina (ON, SPARC), osteopontina (OPST, SPP1, OPN) e/ou sialoproteína óssea (BSP) e/ou uma ou mais proteínas adicionais da matriz óssea como decorina e/ou osteoprotegerina (OPG);

c) as células substancialmente não expressam CD45 (por exemplo, menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45);

d) as células mostram evidências da capacidade para mineralizar o entorno externo, ou sintetizar a matriz extracelular contendo cálcio (por exemplo, quando exposta ao meio osteogênico; consulte Jaiswal et al.

J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312). O acúmulo de cálcio dentro das células e a deposição nas proteínas da matriz pode ser convencionalmente medido, por exemplo, por cultivo em *Ca?*, lavagem e recultura e, em seguida, determinar qualquer radioatividade presente dentro da célula ou depositada na matriz extracelular (patente US 5.972.703), ou usar um ensaio de mineralização à base de vermelho de alizarina (consulte, por exemplo, Gregory et al.

Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84);

e) as células substancialmente não se diferenciam para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos) nem linhagem condroblástica (por exemplo, condroblastos, condrócitos). A ausência de diferenciação em relação a essas linhagens celulares pode ser testada usando condições de indução de diferenciação padrão estabelecidas na técnica (por exemplo, consulte Pittenger et al.

Science, 1999, vol. 284, 143-7), e métodos de avaliação (por exemplo,

quando induzidos, adipócitos tipicamente coram com óleo vermelho O, mostrando acúmulo de lipídeos; condrócitos tipicamente coram com azul alcian ou laranja safranina). A falta substancial de propensão à diferenciação adipogênica e/ou condrogênica pode tipicamente significar que menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% das células testadas mostrariam sinais de diferenciação adipogênica ou condrogênica quando aplicadas ao respectivo teste.

[063] Por meio de exemplo, mas sem limitação, marcadores de superfície celular adequados para avaliar a identidade celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem incluir CD105, CD90, CD73, CD45 e ALP, particularmente ALP do tipo osso-fígado-rim. Estes marcadores de superfície celular podem ser, por exemplo, detectados por anticorpos = monoclonais comercialmente disponíveis, como anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo, que permitem detecção de células por citometria de fluxo. Em particular, CD105, CD90 e CD73 são marcadores mesenquimais, e são tipicamente altamente expressos por células derivadas de MSC de linhagem osteoblástica; CD45 é um marcador hematopoiético e tipicamente está substancialmente ausente das células derivadas de MSC de linhagem osteoblástica; ALP é um marcador de pré-osteoblastos e osteoblastos, e é tipicamente expresso por uma fração substancial de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica.

[064] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem ter propriedades osteoindutivas.

[065] Os termos “propriedades osteoindutivas”, “potencial osteoindutivo” ou “atividade osteoindutiva”, como usado no presente pedido, refere-se à capacidade das células para atrair outras células secretoras da matriz óssea e/ou induzir a (trans)diferenciação de outras células em células secretoras da matriz Óssea.

[066] Por exemplo, a potência celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser determinada medindo as propriedades de formação óssea dessas células. A capacidade de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica para induzir a formação óssea pode ser medida in vivo, por exemplo, avaliando a espessura do osso recém-mineralizado após administração das células a camundongos por injeção subcutânea sobre a calvária. A capacidade de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica para induzir a formação óssea também pode ser medida, por exemplo, através da avaliação da atividade da fosfatase alcalina (ALP) por uma coloração de substrato ALP.

[067] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem ter propriedades osteogênicas.

[068] Por exemplo, a potência celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser determinada medindo a atividade osteogênica dessas células. A atividade osteogênica das células derivadas de MSC humanas de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser medida in vivo, por exemplo, determinando a presença de pelo menos um nódulo mineralizado de origem humana após a administração das células aos camundongos por injeção subcutânea sobre a calvária. A atividade osteogênica de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica humana pode ser medida in vivo, por exemplo, avaliando a espessura de nódulos recém-mineralizados de origem humana após administração das células de camundongos por injeção subcutânea sobre a calvária.

[069] Por exemplo, células humanas derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, como 2,5 x 108 células formuladas em 100 uL de excipiente, podem ser administradas a camundongos nus por uma única administração subcutânea sobre o osso da calvária. Para identificar a neoformação óssea ao longo do tempo, fluorocromos de ligação de cálcio, como vermelho de alizarina (vermelho), calceína (verde), calceína (azul) e tetraciclina (amarelo) podem ser administrados sequencialmente aos camundongos por injeção intraperitoneal 3 dias antes e 4, 8 e 12 dias após a administração celular das células derivadas de MSC, respectivamente. Os camundongos podem ser eutanasiados 2 semanas após administração celular e a calvária de cada camundongo pode ser coletada para avaliar as propriedades de formação óssea por histomorfometria (por exemplo, quantificação de formação óssea). As espessuras iniciais e finais da calvária podem ser usadas para calcular a porcentagem de neoformação óssea após administração das células. Além disso, as propriedades de formação óssea também podem ser avaliadas por imunofluorescência (por exemplo, origem murina ou humana da formação óssea). A atividade osteoblástica pode ser avaliada em cortes da cálvaria usando o método de detecção de atividade enzimática ALP. A atividade osteoclástica pode ser avaliada em cortes da cálvaria usando métodos de detecção de atividade enzimática TRAP. O estado de mineralização do osso neoformado pode ser avaliado com o uso de coloração tricrômico de Masson-Goldner nos cortes de calvária corados com ALP, por exemplo, com o uso de kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Bio-Opticaº). A formação da cartilagem pode ser avaliada com o uso de coloração laranja safranina em cortes sagitais de parafina da calvária.

[070] O termo “potencial osteogênico”, como usado no presente pedido, refere-se à capacidade das células para se (trans)diferenciar em células secretoras da matriz óssea ou à capacidade das células para secretar matriz óssea (isto é, sem a necessidade de uma etapa de (trans)diferenciação), in vivo e, opcionalmente, in vitro. O termo engloba a capacidade das células para formar tecido ósseo por ossificação intramembranosa ou ossificação endocondral. À capacidade das células para formar tecido Ósseo por ossificação intramembranosa tipicamente representa a capacidade das células para formar tecido ósseo sem a necessidade de uma matriz de cartilagem calcificada como molde. A capacidade das células para formar tecido ósseo por ossificação endocondral tipicamente representa a capacidade das células para formar tecido ósseo formando primeiro uma matriz de cartilagem calcificada e,

subsequentemente, usando a dita matriz de cartilagem calcificada como molde para a formação de tecido ósseo. O termo não engloba o potencial osteoindutivo de células, o que representa a capacidade das células para atrair outras células secretoras da matriz óssea e/ou induzir a (trans)diferenciação de outras células em células secretoras da matriz óssea. O técnico no assunto entenderá que as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, conforme pretendido no presente pedido, podem ter potencial osteogênico e osteoindutivo.

[071] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem ter tanto propriedades osteoindutivas como osteogênicas. Vantajosamente, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, como ensinado no presente pedido, após transplante em um sujeito que necessita da mesma, permitem a neoformação óssea que excede a neoformação óssea em comparação ao transplante com MSCs ou células derivadas de MSC obtidas por métodos da técnica anterior.

[072] Por meio de exemplo, mas sem limitação, marcadores de superfície celular adequados para avaliar a identidade celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem incluir CD73, CD105, CD10 e CD44. Estes marcadores de superfície celular podem ser, por exemplo, detectados por anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis, como anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo, que permitem detecção de células por citometria de fluxo. Em particular, CD73 e CD105 são marcadores mesenquimais; CD44 é um marcador de adesão; e CD10 é um marcador osteocondroblástico, os quais são normalmente expressos por uma alta fração de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica. A quantidade de CD73 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica é tipicamente alta; a quantidade de CD105 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica é tipicamente baixa; e a quantidade de

CD44 na superfície celular de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica é tipicamente alta.

[073] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, >= 93%, >= 94%, > 95%, 2 96%, 2 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, >= 91%, >= 92%, >= 93%, > 94%, > 95%, >= 96%, >= 97%, > 98%, > 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45.

[074] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91 %, 2 92%, 2 93%, 2 94%, 2 95%, 2 96%, 2 97%, 2 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC são positivas para CD90, CD105, CD73, CD63 e CD166.

[075] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, > 92%, 2 93%, >= 94%, 295%, 2 96%, 2 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC são positivas para CD90, CD105, CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, > 92%, > 93%, > 94%, >= 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45, CD14 e CD45.

[076] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, 2 92%, 2 93%, 2 94%, 2 95%, 2 96%, > 97%, >= 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45, CD14 e CD19.

[077] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, = 93%, >= 94%, > 95%, 2 96%, > 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45, CD34 e CD3.

[078] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, >= 93%, >= 94%, > 95%, 2 96%, > 97%, >= 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45, CD34, CD3, CD14 e CD19.

[079] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, 2 92%, 2 93%, 2 94%, > 95%, 2 96%, > 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC são positivas para qualquer um ou mais, como um, dois, três ou todos, dentre CD73, CD105, CD10 ou CD44 (isto é, expressa qualquer um ou mais, como um, dois, três ou todos , dentre CD73, CD105, CD10 ou CD44 na superfície celular). Preferencialmente, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91 %, > 92%, >= 93%, > 94%, >= 95%, > 96%, 2 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44 (isto é, expressa CD73, CD105, CD10 e CD44 na superfície celular).

[080]Em particular, células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos de obtenção de células derivadas de MSC de linhagem ostocondroblástica ou osteoblástica de MSC têm qualquer uma ou mais das Mediana normalizada de Intensidade de

Fluorescência (nMFI) para CD73 (nMFlco73) de pelo menos 500, uma nMFI para CDA44 (nMFlcv4) de pelo menos 100 ou uma nMFI para CD105 (nMFlcv1os) de no máximo 150. Por exemplo, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica têm uma ou mais dentre uma nMFlco73 de pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850 ou pelo menos 900; a nMFlcov4 de pelo menos 110, pelo menos 120, pelo menos 130, pelo menos 140, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300 ou pelo menos 350; ou uma nMFlcpv105s de no máximo 180, no máximo 170, no máximo 160, no máximo 150, no máximo 140, no máximo 130, no máximo 120, no máximo 110 ou no máximo

100. Preferencialmente, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC têm uma nMFlcop73 de pelo menos 500, uma nMFlcv4 de pelo menos 100, e uma nMFlcv1os de no máximo 150.

[081] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, = 92%, >= 93%, = 94%, 2 95%, 2 96%, 2 97%, >= 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblásticas ou osteoblásticas de MSC são positivas para qualquer um ou mais, como um, dois, três ou todos, dentre CD73, CD105, CD10 ou CD44 (isto é, expressa qualquer um ou mais, como um, dois, três ou todos, dentre CD73, CD105, CD10 ou CD44 na superfície celular), e as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC têm qualquer um ou mais dentre uma nMFlco73 de pelo menos 500, uma nMFlcva4 de pelo menos 100 ou uma nMFlcoios de no máximo 150. Preferencialmente, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, > 92%, 2 93%, 2 94%, > 95%, >= 96%, 2 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblásticas ou osteoblásticas de MSC são positivas para CD73, CD105, CD10 e CD44 (isto é, expressa CD73, CD105, CD10 e CD44 na superfície celular) e as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC têm uma nMFlcp73 de pelo menos 500, uma nMFlcv4 de pelo menos 100 e uma nMFlcv1os de no máximo 150.

[082] A “Mediana normalizada da Intensidade de Fluorescência” ou “NMFI”, como usado no presente pedido, refere-se à razão da MF| da população celular analisada inteira e marcada com um ou mais anticorpos conjugados com fluorocromo (MF marcador canal) para a MFI da população celular marcada com um ou mais anticorpos de controle de isotipo conjugado com fluorocromo (MF lisotipo cana), como controle de imunoglobulina G (IgG) conjugado com um fluorocromo, como isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC) ou ficoertrina (PE). Os resultados de nMFI são proporcionais à quantidade de marcadores presentes na superfície celular de uma população de interesse. À (N)MFI é tipicamente ligado ao comprimento de onda no qual a emissão do sinal fluorescente é medido.

[083] As citações “uma nMFI para CD73" ou “nNMFlcv73”, como usado no presente pedido, referem-se à razão da MFI da população celular analisada inteira marcada com um anticorpo conjugado com APC contra CD73 (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 560847) para a MFI da população celular marcada com IgG de controle conjugada com APC (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 555751). Preferencialmente, a nMFlco73 é medida com um comprimento de onda de excitação de 633 nm e um comprimento de onda de emissão de 660 nm para APC.

[084] As citações “uma nMFI para CD44" ou “nMFlcv4s”, como usado presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com anticorpo conjugado a PE contra CD44 (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 550989) para a MFI da população de células marcada com IgG de controle conjugada com PE (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 556650). Preferencialmente, a nMFlcp4 é medida com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 580 nm para PE.

[085] A citação “uma nMFI para CD105” ou “nMFlcvios”, como usado presente pedido, refere-se à razão da MFI da população inteira de células analisadas marcadas com anticorpos conjugados a APC contra CD105 (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 562408) para a MFI da população de células marcada com IlgG de controle conjugada com APC (por exemplo, BD Biosciencesº, Cat nº: 555751). Preferencialmente, a nMFl10s é medida com um comprimento de onda de excitação de 633 nm e um comprimento de onda de emissão de 660 nm para APC.

[086] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica podem compreender uma ou mais dentre: - expressão aumentada de um gene que codifica um marcador osteocondroblástico selecionado a partir do grupo que consiste em RUNX?2, SOX9, ZNF521, ALPL, BMP2, OPG, POSTN, CHISL1, MMP13, CADM1, CX43, CD10 e WISP1; - expressão aumentada de um gene que codifica uma proteína de matriz óssea ou cartilaginosa selecionada a partir de DON ou SPON1; - expressão diminuída do gene DKK1 que codifica um inibidor de osteocondrogênese; e/ou - expressão diminuída de um gene que codifica um marcador de proliferação selecionado a partir de KI67 ou PCONA, em comparação à expressão do respectivo gene em MSC.

[087] Em certas realizações, a expressão de um gene que codifica um marcador relacionado à apoptose selecionado a partir de BCL2 ou BAX pode ser similar para células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica e MSC.

[088] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica compreendem uma ou mais dentre: - expressão aumentada do gene PPARG que codifica uma proteína envolvida na adipogênese; - expressão aumentada de um gene que codifica uma proteína osteocondroblástica selecionada a partir de CD73 ou BMP2; e/ou - expressão diminuída de um gene que codifica uma proteína osteocondroblástica selecionada a partir do grupo que consiste em COL1A1, BGN, SPARC, ALPL e BCL2, em comparação com a expressão do respectivo gene nas células de formação óssea geradas por um método que é substancialmente o mesmo substancialmente em todos os parâmetros que o método ensinado no presente pedido para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, exceto presença versus ausência de heparina ou seu análogo ou derivado.

[089] Em certas realizações, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser aumentada (isto é, melhorada) em pelo menos cerca de 1% em relação (isto é, em comparação com) (isto é, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser pelo menos cerca de 1,01 vez) à expressão do dito gene em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido. Por exemplo, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser aumentada em (isto é, melhorada em), pelo menos cerca de 2% (isto é, 1,02 vez), pelo menos cerca de 5% (isto é, 1,05 vez), pelo menos cerca de 10% (isto é, 1,10 vez), pelo menos cerca de 15% (isto é, 1,15 vez), pelo menos cerca de 20% (isto é, 1,20 vez), pelo menos cerca de 25% (isto é, 1,25 vez), pelo menos cerca de 30% (isto é, 1,30 vez), pelo menos cerca de 35% (isto é, 1,35 vez), pelo menos cerca de 40% (isto é, 1,40 vez), pelo menos cerca de 45% (isto é, cerca de 1,45 vez), pelo menos cerca de 50% (isto é, cerca de 1,50 vez), pelo menos cerca de 55% (isto é, cerca de 1,55 vez), pelo menos cerca 60% (isto é, cerca de 1,60 vez), pelo menos cerca de 65% (isto é, 1,65 vez), pelo menos cerca de 70% (isto é, 1,70 vez), pelo menos cerca de 75% (isto é, 1,75 vez), pelo menos cerca de 80% (isto é, 1,80 vez), pelo menos cerca de 85% (isto é, 1,85 vez), pelo menos cerca de 90% (isto é, cerca de 1,90 vez), pelo menos cerca de 95% (isto é, cerca de 1,95 vez) ou pelo menos cerca de 100% em relação (isto é, em comparação com) (isto é, 2 vezes) à expressão do dito gene em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido.

[090] Em certas realizações, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 1000 vezes, pelo menos cerca de 2000 vezes, pelo menos cerca de 3000 vezes, ou pelo menos cerca de 5000 vezes, a expressão de um gene de controle em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido.

[091] Em certas realizações, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser diminuída (isto é, reduzida) em pelo menos cerca de 1% em relação (isto é, em comparação com) (isto é, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser pelo menos cerca de 0,99 vez) à expressão do dito gene em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido. Por exemplo, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser diminuída em (isto é, reduzida em), pelo menos cerca de 2% (isto é, 0,98 vez), pelo menos cerca de 5% (isto é, 0,95 vez), pelo menos cerca de 10% (isto é, 0,90 vez), pelo menos cerca de 15% (isto é, 0,85 vez), pelo menos cerca de 20% (isto é, 0,80 vez), pelo menos cerca de 25% (isto é, 0,75 vez), pelo menos cerca de 30% (isto é, 0,70 vez), pelo menos cerca de 35% (isto é, 0,65 vez), pelo menos cerca de 40% (isto é, 0,60 vez), pelo menos cerca de 45% (isto é, cerca de 0,55 vez), pelo menos cerca de 50% (isto é, cerca de 0,50 vez), pelo menos cerca de 55% (isto é, cerca de 0,45 vez), pelo menos cerca 60% (isto é, cerca de 0,40 vez), pelo menos cerca de 65% (isto é, 0,35 vez), pelo menos cerca de 70% (isto é, 0,30 vez), pelo menos cerca de 75% (isto é, 0,25 vez), pelo menos cerca de 80% (isto é, 0,20 vez), pelo menos cerca de 85% (isto é, 0,15 vez), pelo menos cerca de 90% (isto é, cerca de 0,10 vez), pelo menos cerca de 95% (isto é, cerca de 0,05 vez) ou pelo menos cerca de 99% em relação (isto é, em comparação com) (isto é, 0,01 vez) à expressão do dito gene em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido.

[092] Em certas realizações, a expressão de um gene que codifica uma proteína nas células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica pode ser pelo menos cerca de 0,005 vez, pelo menos cerca de 0,001 vez, pelo menos cerca de 0,0005 vez ou pelo menos cerca de 0,0001 vez, a expressão de um gene de controle em uma célula de controle correspondente, conforme definido no presente pedido.

[093] Em certas realizações, as células de controle, conforme ensinado no presente pedido, podem ser MSC ou podem ser células de formação óssea geradas por um método que é substancialmente o mesmo substancialmente em todos os parâmetros que o método ensinado no presente pedido para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, exceto presença versus ausência de heparina ou seu análogo ou derivado.

[094] Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica secretam quantidades mais altas de proteínas envolvidas na osteocondrogênese selecionadas a partir de CHISL1 ou MMP13, em comparação às MSC ou células de formação óssea geradas por um método que é substancialmente o mesmo substancialmente em todos os parâmetros que o método ensinado no presente pedido para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, exceto a presença versus ausência de heparina ou seu análogo ou derivado. Em certas realizações, as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica secretam quantidades menores de proteínas DKK1 envolvidas na inibição de osteogênese em comparação com às MSC ou células de formação óssea geradas por um método que é substancialmente o mesmo praticamente em todos os parâmetros que o método conforme ensinado no presente pedido para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, exceto a presença versus ausência de heparina ou seu análogo ou derivado.

[095] Conforme descrito anteriormente, os métodos detalhados acima podem produzir células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, ou populações dessas células derivadas de MSC, com características superiores como, em particular, (i) alta expressão de ALP, que representa o comprometimento da célula para a linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, e (ii) baixa expressão de HLA-DR, que representa a imunogenicidade limitada das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, indicando que as células são mais adequadas para transplante de células, por exemplo, para sujeitos alogeneicos.

[096] Consequentemente, em realizações particulares, pelo menos 70% (em número) das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% (em número) das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para HLA-DR.

[097] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, >= 93%, > 94%, > 95%, 2 96%, > 97%, > 98%, >= 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de

MSC são positivas para CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, > 93%, 2 94%, >= 95%, 2 96%, >= 97%, >= 98%, >= 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45; pelo menos 70% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para HLA-DR.

[098] Em realizações particulares, substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, >= 92%, = 93%, 2 94%, > 95%, 2 96%, > 97%, > 98%, > 99% ou 100%) as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica obtidas pelos métodos para obter células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica de MSC são positivas para CD90, CD105, CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas (por exemplo, pelo menos 90% (em número), como, por exemplo, 2 91%, 292%, 2 93%, 2 94%, 2 95%, 2 96%, 2 97%, 2 98%, 2 99% ou 100%) células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45, CD14 e CD19; pelo menos 70% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para HLA-DR.

[099] Em certas realizações particularmente preferenciais, a “citação de células derivadas de MSC da linhagem condroblástica (cartilagem)" pode se referir a tipos celulares que têm fenótipo condroblástico e que podem contribuir ou serem capazes de se desenvolver para células que podem contribuir para a formação de cartilagem ou matriz cartilaginosa. Como usado no presente pedido, “condroprogenitoras" pode compreender particularmente condroprogenitoras precoces e tardias. Ainda mais preferencialmente, “células derivadas de MSC da linhagem condroblástica (cartilagem) pode se referir a osteocondroprogenitoras, condroprogenitoras, pré-condroblastos ou condroblastos, ou misturas das mesmas, ainda mais preferencialmente a expressão pode se referir a pré- condroblastos ou condroblastos, ou misturas das mesmas, como em certos exemplos, a expressão pode se referir a pré-condroblastos, ou em outros exemplos a expressão pode se referir a condroblastos. Todos estes termos são bem conhecidos por si mesmos.

[100] Por meio de orientação adicional e não limitação, células de linhagem osteocondroblástica e/ou condroblástica, como osteocondroprogenitoras, condroprogenitoras, pré-condroblastos e condroblastos, bem como populações celulares que compreendem osteocondroprogenitoras, condroprogenitoras, pré- condroblastos e/ou condroblastos podem exibir as seguintes características: a) ascélulas compreendem expressão de SOX9, um fator de transcrição que desempenha um papel central durante a diferenciação de condroblastos e a formação de cartilagem; b) as células compreendem expressão de pelo menos uma das seguintes: agrecana (ACAN), colágeno tipo |l ou CD90; c) as células substancialmente não expressam CD45 (por exemplo, menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45); d) ascélulas mostram evidências da capacidade para produzir alto nível de colágeno tipo Il, IX e Xl e proteoglicanos, os principais constituintes da matriz extracelular hialihna (ECM) in situ"! A formação da cartilagem pode ser convencionalmente medida, por exemplo, com o uso de um ensaio de laranja safranina/verde rápido para corar proteoglicanos e proteínas não colagenosas, respectivamente (consulte, por exemplo, Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98); e) condrócitos articulares humanos podem exibir características de expressão celular, conforme resumido em Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42), por exemplo, eles podem expressar integrinas e outras moléculas de adesão (CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD49f, CD51/61, CD54, CD106, CD166, CD58, CD44), tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82,

CD151), receptores (CD105, CD119, CD130, CD140a, CD221, CD95, CD120a, CD71, CD14), ectoenzimas (CD10, CD26), e outras moléculas de superfície (CD90, CD99). Durante a cultura em monocamada, os condrócitos podem suprarregular certos marcadores considerados distintos para células-tronco mesenquimais (CD10, CD90, CD105, CD166). Esses marcadores também podem ser assim expressos pelos pré-condroblastos ou condroblastos menos maduros.

f) ascélulas substancialmente não se diferenciam nem para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos) nem para linhagem osteoblástica (por exemplo, osteoblastos, osteócitos). A ausência de diferenciação em relação a essas linhagens celulares pode ser testada usando condições de indução de diferenciação padrão estabelecidas na técnica (por exemplo, consulte Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 1437), e métodos de avaliação (por exemplo, quando induzidos, adipócitos tipicamente coram com óleo vermelho O, mostrando acúmulo de lipídeos; pré-osteoblastos e osteoblastos tipicamente coram para ALP). A falta substancial de propensão à diferenciação adipogênica e/ou osteoblástica pode tipicamente significar que menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% das células testadas mostrariam sinais de diferenciação adipogênica ou osteoblástica quando aplicadas ao respectivo teste.

[101] Como conhecido na técnica, as células de linhagem fibroblástica podem contribuir ou são capazes de se desenvolver para células que podem contribuir para formação de tecido conjuntivo.

[102] Por meio de orientação adicional e não limitação, células fibroblásticas podem exibir as seguintes características: a) ascélulas compreendem expressão de FSP1 (proteína específica de fibroblastos 1); b) as células compreendem expressão de pelo menos uma das seguintes: colágeno, vimentina, desmina ou CD90; c) as células substancialmente não expressam CDA45 (por exemplo,

menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45); d) ascélulasmostram evidências de capacidade para produzir colágeno, glicosaminoglicano, fibras reticulares e elásticas, glicoproteínas para formar a matriz extracelular dos tecidos conjuntivos. Fibroblastos contribuem para a integridade estrutural dos ligamentos e tendões e têm uma função de reparo tecidual. A deposição de colágeno pode ser visualizada com o uso da coloração tricrômica (Li et al. World J Gastroenterol, 2014 vol. 20(16), 4648-61). Colágeno tipo | (Chondres, Redmond, WA) e tenascina-C (Tn-C; IBL-America, Mineápolis, MN) são dois marcadores para fibroblastos ligamentares, e podem ser avaliados por ELISA (Brissett et al. Arthritis Rheum, 2012, vol. 64(1), 272-80).

[103] Como conhecido na técnica, células de linhagem tendinocítica podem contribuir para a formação de material do tendão ou da matriz do tendão. O tendão é constituído por grandes feixes de fibras que compreendem uma rede de fibrilas de colágeno e diferentes tipos de células, incluindo células sinoviais, células endoteliais, tenoblastos e tenócitos que se situam longitudinalmente como linhas nas moléculas de colágeno. Tenoblastos são formas imaturas de células do tendão que se diferenciam para tenócitos à medida que eles envelhecem com atividade metabólica diminuída.

[104] Por meio de orientação adicional e não limitação, tenócitos podem exibir as seguintes características: a) ascélulas compreendem expressão de escleraxis (SCX), membro da família básica de hélice-alça-hélice de fator de transcrição envolvido na diferenciação celular e organização da matriz extracelular nos tendões; b) as células compreendem expressão de pelo menos uma das seguintes: tenomodulina (TNMD) e Tenascina-C (TNC); c) ascélulasexpressam substancialmente CD44, CD73, CD90 e CD105, mas não expressam CD34, CD45, CD146 ou stro-1; d) as células mostram evidências de capacidade para produzir componente extracelular de tendão que consiste em colágenos tipo |, Ill e V,

proteoglicanos, fibronectina e fibrilas elásticas para regeneração de tecido do tendão (Guúngórmúus et al. Connect Tissue Res, 2008, vol. 53(6), 485-91); e) ascélulas substancialmente não se diferenciam nem para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos), linhagem condroblástica (por exemplo, condroblastos, condrócitos) nem para linhagem osteoblástica (por exemplo, osteoblastos, osteócitos).

[105] Como conhecido na técnica, células de linhagem sinoviocítica (fluido sinovial) tipicamente englobam células sinoviais similares a macrófagos ou tipo A e sinoviócitos similares a fibroblastos (FLC) ou tipo B, e que podem contribuir para a formação de membrana sinovial e líquido sinovial. Todos estes termos são bem conhecidos por si mesmos. O termo “sinoviócito”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer um, bem como coletivamente todos esses tipos celulares.

[106] Por meio de orientação adicional e não limitação, sinoviócitos podem exibir as seguintes características: a) as células mostram evidências de capacidade para secretar proteoglicano 4 (PRG4) e são a principal fonte de fosfolipídeos ativos de superfície (SAPL), bem como hialuronano (HA) presente no fluido sinovial (Tamer et al. Interdiscip Toxicol, 2013, vol. 6(1), 111-125); b) as células sinoviais tipo A ou similares a macrófagos compreendem expressão de marcadores de origem hematopoiética, incluindo antígeno CD11b, CD86, CD14, CD163 e receptor Fc. Os sinoviócitos tipo B ou similares a fibroblastos são células mesenquimais que exibem muitas características de fibroblastos, incluindo expressão de colágeno tipo IV e V, vimentina e CD90. Além disso, as células tipo B têm propriedades únicas in situ que as distinguem de muitas outras linhagens de fibroblastos, incluindo fibroblastos residentes subjacentes. Por exemplo, caderina-11 (molécula de adesão específica que desempenha um papel chave na agregação homotípica de FLS), CD55 (fator de aceleração de decaimento), VCAM-1 (molécula de adesão vascular 1) e ICAM- 1 (molécula de adesão intercelular 1) (Bartok et al. Immunol Rev, 2011, vol.

233(1), 233-255); c) as células substancialmente não expressam CD45 (por exemplo, menos que cerca de 10%, preferencialmente menos que cerca de 5%, mais preferencialmente menos que cerca de 2% das células podem expressar CD45); d) ascélulas substancialmente não se diferenciam nem para células de linhagem adipocítica (por exemplo, adipócitos), linhagem condroblástica (por exemplo, condroblastos, condrócitos) nem para linhagem osteoblástica (por exemplo, osteoblastos, osteócitos).

[107] Quando se diz que uma célula é positiva para (ou expressa ou compreende a expressão de) um marcador específico, isso significa que um técnico no assunto concluirá a presença ou evidência de um sinal distinto, por exemplo, detectável por anticorpo ou detecção por reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa, para esse marcador ao realizar a medição apropriada, em comparação aos controles adequados. Quando o método permite a avaliação quantitativa do marcador, as células positivas podem, em média, gerar um sinal que é significativo diferente do controle, por exemplo, mas sem limitação, pelo menos 1,5 vez mais alto do que esse sinal gerado por células de controle, por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes mais alto ou até mais alto.

[108] A expressão dos marcadores específicos das células acima pode ser detectado com o uso de qualquer técnica imunológica adequada conhecida, como imuno-histoquímica ou adsorção por afinidade, análise Western blot, citometria de fluxo, ELISA, etc., ou por qualquer ensaio bioquímico adequado de atividade enzimática (por exemplo, para ALP), ou por qualquer técnica adequada de medição da quantidade do MRNA marcador, por exemplo, Northern blot, RT- PCR semi-quantitativa ou quantitativa, etc. Dados de sequência para marcadores listados nesta divulgação são conhecidos e podem ser obtidos a partir de bancos de dados públicos como GenBank (http://www.ncbi.nIm.nih.gov/).

[109] Em certas realizações dos métodos, conforme ensinado no presente pedido, as MSC ou células derivadas de MSC podem ser células animais, preferencialmente células animais de sangue quente, mais preferencialmente células de mamíferos, como células de mamíferos humanos ou células de mamíferos não humanos, e com a máxima preferência células humanas.

[110]MSC ou células derivadas de MSC, como pretendido neste documento, são preferencialmente aderentes, isto é, necessitam de uma superfície para crescimento e tipicamente crescem como uma monocamada aderente na dita superfície (isto é, cultura de células aderentes), ao invés de células de flutuação livre em um meio de cultura (cultura em suspensão). À adesão de células a uma superfície, como a superfície de um recipiente de plástico de cultura de tecidos, pode ser facilmente examinada por inspeção visual sob microscópio invertido. As células cultivadas em cultura aderente necessitam de passagem periódica, em que as células podem ser removidas da superfície enzimaticamente (por exemplo, com o uso de tripsina), suspensas em meio de crescimento e replaqueadas em novo(s) recipiente(s) de cultura. Em geral, uma superfície ou substrato que permita a adesão de células a este pode ser qualquer substrato substancialmente hidrofílico. Como é conhecido na arte, recipientes de cultura de tecidos, por exemplo, frascos de cultura, placas de poços, pratos ou similares, podem ser usualmente fabricados com uma grande variedade de materiais poliméricos, adequadamente tratados na superfície ou revestidos após moldagem, de modo a fornecer superfícies de substrato hidrofílico. O termo “colocar em contato”, como usado no presente pedido, significa reunir, tanto direta como indiretamente, uma ou mais moléculas, componentes ou materiais, com outra, facilitando assim as interações entre elas. Tipicamente, um ou mais agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC ou células derivadas de MSC podem ser colocados em contato com MSC ou células derivadas de MSC ou por meio de sua inclusão no meio, no qual as MSC ou células derivadas de MSC são cultivadas.

[111] O termo “in vitro”, como usado no presente pedido, é para denotar fora ou externamente ao corpo animal ou humano. O termo “in vitro" como usado no presente pedido deve-se entender incluir “ex vivo”. O termo “ex vivo” tipicamente refere-se a tecidos ou células removidas de um corpo animal ou humano e mantidos ou propagados fora do corpo, por exemplo, em um recipiente de cultura. O termo “fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF-2)”, “FGF básico”, “FGF-b”, “FGFB”, “BFGF”, “fator de crescimento de ligação de heparina 2 (HBGF-2)" ou “prostatropina”, pode ser usado de forma intercambiável e se refere ao conhecido membro da família de fator de crescimento de fibroblastos. Os inventores constataram que o FGF-2 é particularmente efetivo no método da presente invenção.

[112] O termo “fator de crescimento transformador beta (TGFB)”, “TGFB” ou “TGFbeta”, conforme usado no presente pedido, refere-se a um membro da família do fator de crescimento transformador beta (TGFB). Os inventores perceberam que o TGFEB é particularmente efetivo no método da presente invenção. Em uma realização adicional, o dito membro da família TGFB é escolhido a partir do grupo que consiste em TGF-beta-1, TGF-beta-2, TGF-beta- 3, T]GF-beta-4, GDF1 (Fator de diferenciação de crescimento 1), GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-11, GDF-15, INHA (cadeia alfa da inibina), INHBA (cadeia beta A da inibina), INHBB (cadeia beta B da inibina), INHBC (cadeia beta C da inibina), INHBE (cadeia beta E da inibina), MIS (fator inibidor Muelleriano), e membros adicionais da subfamília GDNF, incluindo GDNF (fator neurotrófico derivado de linhagem celular glial), NRKTN (neurturina), PSPN (persefina), e misturas dos mesmos.

[113] Em uma realização particular, TGFB é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFRB2, TGFB3, e misturas dos mesmos. Em uma realização particular, TGFB é TGFB1. Por meio de exemplo, TGFB1 pode ser usado nos presentes métodos como única citocina TGFB.

[114] Em uma realização adicional, as MSC ou células derivadas de MSC podem ser colocadas em contato, além de FGF-2 e TGFB, com um ou mais fatores de crescimento adicionais, adicionados de maneira exógena, exceto

FGF-2 e TGFB. Em outra realização, FGF-2 e TGFB podem ser os únicos fatores de crescimento exógenos com os quais as MSC ou células derivadas de MSC são colocadas em contato.

[115] EM uma realização preferencial, o fator de crescimento usado no presente método é um fator de crescimento humano. Como usado no presente pedido, o termo “fator de crescimento humano” refere-se a um fator de crescimento substancialmente o mesmo que um fator de crescimento humano que ocorre naturalmente. Por exemplo, quando o fator de crescimento é uma entidade proteinácea, o(s) peptídeo(s) constituinte(s) ou polipeptídeo(s) do mesmo podem ter uma sequência principal de aminoácidos idêntica a um fator de crescimento humano que ocorre naturalmente. O uso de fatores de crescimento humano no presente método é preferencial, pois espera-se que esses fatores de crescimento provoquem um efeito desejável na função celular.

[116] O termo “que ocorre naturalmente” é usado para descrever um objeto ou entidade que pode ser encontrada na natureza como diferente daquela sendo produzida artificialmente pelo homem. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos presente em um organismo, que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem em laboratório, é de ocorrência natural. Ao se referir a uma entidade particular, por exemplo, a um polipeptídeo ou proteína, o termo engloba todas as formas e variantes da mesma que ocorrem na natureza, por exemplo, devido a uma variação normal entre os indivíduos. Por exemplo, ao se referir a um fator de crescimento proteináceo, o termo “que ocorre naturalmente" engloba fatores de crescimento que têm diferenças na sequência primária de seus peptídeos ou polipeptídeos constituintes devido à variação alélica normal entre os indivíduos.

[117] O presente método pode empregar uma variante biologicamente ativa ou fragmento de um fator de crescimento. No método da invenção, variantes “biologicamente ativas” ou fragmento de um fator de crescimento atingem pelo menos aproximadamente o mesmo grau de obtenção de células derivadas de MSC a partir de MSCs que o respectivo fator de crescimento, quando outras condições são substancialmente as mesmas.

[118]Uma “varianter de um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica (isto é, em grande parte, mas não totalmente idêntica) à sequência de aminoácidos do polipeptídeo. No presente pedido, “substancialmente idêntica” refere-se a pelo menos 85% idêntica, por exemplo, pelo menos 90% idêntica, preferencialmente pelo menos 95% idêntica, por exemplo, pelo menos 99% idêntica. Diferenças de sequência podem resultar de inserção (adição), deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos.

[119] Em outra realização, os fatores de crescimento usados no presente método, especialmente pelo menos FGF-2 e TGFRB, podem ser fatores de crescimento animais não humanos, e particularmente fatores de crescimento de mamíferos não humanos, ou variantes biologicamente ativas ou derivados dos mesmos. Como usado no presente pedido, os termos “fator de crescimento animal não humano” e “fator de crescimento de mamífero não humano” referem- se a um fator de crescimento substancialmente idêntico, respectivamente, a um fator de crescimento animal não humano ou fator de crescimento de mamífero não humano que ocorre naturalmente. Por exemplo, quando o fator de crescimento é uma entidade proteinácea, o(s) peptídeo(s) constituinte(s) ou polipeptídeo(s) do mesmo podem ter uma sequência principal de aminoácidos idêntica a um fator de crescimento animal não humano ou fator de crescimento de mamífero não humano que ocorre naturalmente. Um técnico no assunto entenderá que os fatores de crescimento animal não humano ou de mamífero não humano podem ser aplicáveis no presente método, embora em menor medida que os fatores de crescimento animais humanos, uma vez que estes são da mesma origem que as células MSC. Em particular, fatores de crescimento animal não humano ou de mamífero não humano podem ser úteis se eles provocarem o efeito desejado, por exemplo, um efeito similar a um fator de crescimento humano (análogo).

[120]EM uma realização preferencial, os fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou derivados dos mesmos são recombinantes,

isto é, produzidos por um organismo hospedeiro através da expressão de uma molécula de ácido nucleico recombinante, que foi introduzida no organismo hospedeiro ou em um ancestral do mesmo, e que compreende uma sequência que codifica o dito polipeptídeo. O termo “molécula de ácido nucleico recombinante”, conforme usado no presente pedido, refere-se a uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de DNA ou cDNA) que é composta de segmentos unidos em conjunto com o uso da tecnologia de DNA recombinante.

[121] Em realizações particulares, as MSC ou células derivadas de MSC são adicionalmente colocadas em contato com o meio em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[122]O termo “plasma” é convencionalmente definido e compreende plasma fresco, plasma congelado descongelado, plasma tratado com solvente/detergente, plasma processado (por exemplo, PRP), ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos. Plasma é usualmente obtido a partir de uma amostra de sangue total, fornecido ou colocado em contato com um anticoagulante (por exemplo, heparina (em concentrações muito baixas, tipicamente cerca de 15 x10º IU/mL, citrato, oxalato ou EDTA). Subsequentemente, componentes celulares da amostra de sangue são separados do componente líquido (plasma) por uma técnica apropriada, tipicamente por centrifugação. Por meio de um exemplo específico, mas não de limitação, para obter plasma adequado para uso na presente invenção, uma amostra de sangue pode ser coletada em um tubo Vacutainer contendo o anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) (por exemplo, tubo BD Vacutainer de plástico com EDTA, 10 mL, 1,8 mg/mL). À amostra é suavemente agitada e então centrifugada por 10 min à temperatura ambiente a 1.000 a 2.000 g para separar o plasma dos glóbulos vermelhos. O sobrenadante (plasma) é coletado, opcionalmente agrupado (se uma pluralidade de amostras de sangue for usada) e aliquotado em criofrascos que são armazenados a -80ºC até o uso. O termo “plasma” refere-se a uma composição que não forma parte de um corpo humano ou animal. O termo “plasma” pode,

em certas realizações, incluir especificamente o plasma processado, isto é, o plasma submetido após sua separação do sangue total a uma ou mais etapas de processamento que alteram sua composição, especificamente sua composição química, bioquímica ou celular. Consequentemente, o termo “plasma”, como pretendido no presente pedido, pode incluir plasma rico em plaquetas (PRP), isto é, plasma que foi enriquecido com plaquetas. Tipicamente, o PRP pode conter cerca de 1,0 x 10º plaquetas/ul, enquanto que a concentração de plaquetas no sangue total pode ser de cerca de 1,5 x 10º a 3,5 x 10%/UL.

[123] O plasma pode ser tratado com solvente/detergente. Os termos “plasma tratado com solvente/detergente”, “plasma tratado com S/D" ou “plasma S/D" referem-se geralmente ao plasma descelularizado obtido ou que pode ser obtido por um método que compreende as etapas de: (a) tratar o plasma com um solvente e um detergente e (b) filtar o plasma tratado com solvente/detergente. Solventes adequados para esse tratamento são solventes como di- ou trialquilfosfatos e detergentes que são descritos na patente US

4.764.369. O detergente usado para preparar plasma S/D preferencialmente é um detergente não tóxico (por exemplo, Tweenº 20 ou Tweenº 80).

[124] O termo “soro” é conforme convencionalmente definido e compreende soro fresco, soro congelado descongelado ou soro preparado a partir de plasma, ou uma mistura de quaisquer dois ou mais dos mesmos. Soro geralmente pode ser obtido a partir de uma amostra de sangue total permitindo primeiro que ocorra coagulação na amostra e, subsequentemente, separando o coágulo então formado e componentes celulares da amostra de sangue do componente líquido (soro) por uma técnica apropriada, tipicamente por centrifugação. A coagulação pode ser facilitada por um catalisador inerte, por exemplo, microesferas ou pó de vidro. Alternativamente, o soro pode ser obtido a partir de plasma removendo o anticoagulante e fibrina. Por meio de um exemplo específico, mas não de limitação, para obter soro adequado para uso na presente invenção, uma amostra de sangue pode ser coletada em um tubo Vacutainer sem anticoagulante (por exemplo, tubo de soro de plástico BD Vacutainer Plus, 10 mL) e incubada por 30 a 45 minutos em temperatura ambiente para permitir a coagulação. O tubo é então centrifugado por 15 min à temperatura ambiente a

1.000 a 2.000 g para separar o soro dos glóbulos vermelhos. O sobrenadante (soro) é coletado, opcionalmente agrupado (se uma pluralidade de amostras de sangue for usada) e aliquotado em criofrascos que são armazenados a -80ºC até o uso. O termo “soro” refere-se então a uma composição acelular que não forma parte de um corpo humano ou animal. O soro, conforme pretendido no presente pedido, é soro humano, isto é, obtido a partir de um único sujeito humano ou de uma pluralidade de sujeitos humanos (por exemplo, pool de soro misto). O soro pode ser soro não processado, isto é, soro derivado por separação do sangue total e não submetido a etapas de processamento a jusante que alteram sua composição química, bioquímica ou celular, exceto inativação por calor opcional, armazenamento (criogênico ou não criogênico), esterilização, secagem por congelamento e/ou filtração. Em certas realizações, o soro pode ser obtido a partir de plasma tratado com solvente/detergente.

[125] O plasma isolado, soro ou substituto do mesmo pode ser usado diretamente no método da presente invenção. Eles podem ser armazenados de maneira adequada para uso posterior (por exemplo, por períodos de tempo mais curtos, por exemplo, até cerca de 1 a 2 semanas, a uma temperatura acima dos respectivos pontos de congelamento do plasma, soro ou substitutos dos mesmos, mas abaixo da temperatura ambiente, esta temperatura será geralmente cerca de 4ºC a 5ºC; ou por períodos mais longos para armazenamento congelado, geralmente entre cerca de -70ºC e cerca de -80ºC).

[126] O plasma isolado, soro ou substituto dos mesmos pode ser inativado por calor conforme conhecido na técnica, particularmente para remover o complemento. Quando o presente método emprega plasma, soro ou substitutos dos mesmos autólogos para as células cultivadas na presença dos mesmos, pode ser desnecessário inativar por calor o plasma, soro ou substituto dos mesmos. Se o plasma, o soro ou substituto dos mesmos são pelo menos parcialmente alogeneicos para as células cultivadas, pode ser vantajoso inativar por calor o plasma, soro ou substituto dos mesmos. Opcionalmente, o plasma, soro ou substituto dos mesmos também podem ser esterilizados antes do armazenamento ou uso, usando filtros microbiológicos convencionais, preferencialmente com tamanho de poros de 0,2 um ou menores.

[127] EM uma realização, o presente método pode empregar plasma humano, soro ou substituto dos mesmos, que é autólogo para MSC humanas ou células derivadas de MSC colocadas em contato com este. O termo “autólogo” com referência ao plasma, soro ou substituto dos mesmos denota que o plasma, soro ou substituto dos mesmos é obtido do mesmo indivíduo que as MSC ou células derivadas de MSC a serem colocadas em contato com o dito plasma, soro ou substituto dos mesmos. O uso de plasma autólogo, soro ou substituto dos mesmos pode garantir a aceitação ideal das células pelo paciente e/ou evitar a transmissão acidental de agentes infecciosos, por exemplo, de outros soros.

[128] Em outra realização, o método pode empregar plasma humano, soro ou substituto dos mesmos, que é “homólogo” ou “alogeneico” para MSC humanas ou células derivadas de MSC colocadas em contato com este, isto é, obtidas a partir de um ou mais sujeitos humanos (agrupados), exceto o sujeito a partir do qual as MSC são obtidas.

[129] Em uma realização adicional, o método pode empregar uma mistura de plasma, soro ou substituto dos mesmos, autólogo e alogeneico (isto é, homólogo), conforme definido acima. A expressão “substituto de soro ou plasma”, como usado no presente pedido, refere-se a uma composição não tóxica natural ou artificial que tem uma ou mais das funções do plasma e/ou do soro, como composições capazes de induzir crescimento e/ou expansão de MSC ou células derivadas de MSC. Exemplos não limitantes de substitutos de soro ou plasma incluem lisados plaquetários e composições para cultura celular que compreendem um ou mais componentes fracionados de plasma ou soro, como albumina de soro humano. Um técnico no assunto considera que o plasma humano, soro e substitutos dos mesmos são composições biológicas complexas,

que podem incluir um ou mais fatores de crescimento, citocinas ou hormônios.

[130] Pretende-se que os fatores de crescimento FGF-2 e TGFB ou as respectivas variantes biologicamente ativas ou derivados sejam fornecidos em adição, isto é, exogenamente ou em complemento a um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[131] O termo “heparina”, como usado no presente pedido, refere-se a um polímero da família glicosaminoglicano de carboidratos com peso molecular variando de 3 a 30 kDa, caracterizado por seus efeitos anticoagulantes. À potência de heparina ou de um derivado ou análogo pode ser determinada in vitro por um ensaio biológico em que a concentração de heparina necessária para prevenir a coagulação de plasma de ovelhas, cabras ou humano é comparada à concentração de um padrão de referência internacionalmente aceito e um padrão internacional de referência aceito com base em unidades de atividade de heparina por miligrama. Um mg de heparina é tipicamente igual a 140 a 180 unidades internacionais (IU).

[132] O termo “IU” ou “unidades internacionais” é uma medida padrão da quantidade de uma substância biológica expressa como a atividade biológica ou efeito da dita substância biológica. Para cada substância a que esta unidade é atribuída, existe uma atividade biológica internacionalmente aceita ou um efeito esperado com uma dose de 1 |U quando testada de acordo com um procedimento biológico internacionalmente aceito.

[133] Em realizações particulares, a heparina ou derivado de heparina ou análogo é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (UFH); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos. Preferencialmente, a heparina ou derivado de heparina ou análogo é selecionado a partir do grupo que consiste em UFH, dalteparina, danaparoide e sulfato de heparano.

[134] Em realizações particulares, o dito FGF-2, o dito TGFB, a dita heparina ou um derivado ou análogo da mesma, e opcionalmente um ou mais dentre plasma, soro ou substituto dos mesmos, são incluídos em um meio, comumente um meio líquido de cultura celular. Tipicamente, o meio compreenderá uma formulação de meio basal, conforme conhecido na técnica. Muitas formulações de meios basais (disponíveis, por exemplo, junto à Coleção Americana de Tipo de Cultura, ATCC; ou junto à Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) podem ser usadas para cultivar as células no presente pedido, incluindo, mas não se limitando Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM), Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Meio Essencial Mínimo modificado alfa (alfa- MEM), Meio Basal Essencial (BME), BGJb, Mistura de Nutriente F-12 (Ham), Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), ou meio livre de soro X-VIVOTYM (grau clínico), disponível junto à Invitrogen ou Cambrex (Nova Jersey), e modificações e/ou combinações dos mesmos. As composições dos meios basais acima são geralmente conhecidas na técnica e estão dentro da capacidade de um técnico para modificar ou modular concentrações de meios e/ou suplementos de meios conforme necessário para as células cultivadas. Essas formulações de meio basal contêm ingredientes necessários para o desenvolvimento celular de mamíferos, que são conhecidos por si mesmos. Por meio de ilustração e não limitação, estes ingredientes podem incluir sais inorgânicos (em particular, sais contendo NA, K, Mg, Ca, Cl, P e possivelmente Cu, Fe, se e Zn), tampões fisiológicos (por exemplo, HEPES, bicarbonato), nucleotídeos, nucleosídeos e/ou bases de ácido nucleico, ribose, desoxirribose, aminoácidos, vitaminas, antioxidantes (por exemplo, glutationa) e fontes de carbono (por exemplo, glicose, piruvato de sódio, acetato de sódio), etc.

[135] Para uso em cultura, o meio basal pode ser fornecido com um ou mais componentes adicionais. Por exemplo, suplementos adicionais podem ser usados para suprir as células com elementos traço e substâncias necessárias para um ótimo crescimento e expansão. Esses suplementos incluem insulina, transferrina, sais de selênio e combinações dos mesmos. Estes componentes podem ser incluídos em uma solução salina como, mas não se limitando a, Solução Salina Balanceada de Hanks (HBSS), Solução Salina de Earle. Suplementos antioxidantes adicionais podem ser adicionados, por exemplo, B- mercaptoetanol. Enquanto muitos meios basais já contêm aminoácidos, alguns aminoácidos podem ser suplementados posteriormente, por exemplo, L- glutamina, que é conhecida por ser menos estável quando em solução. Um meio pode ser ainda fornecido com compostos antibióticos e/ou antimicóticos, como, tipicamente, misturas de penicilina e estreptomicina e/ou outros compostos, exemplificados mas não limitados a anfotericina, ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, canamicina, mitomicina, ácido micofenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatinay paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina e zeocina. Lipídeos e carreadores de lipídeos também podem ser usados para suplementar o meio de cultura celular. Esses lipídeos e carreadores de lipídeos podem incluir, mas não se limitam a ciclodextrina, colesterol, ácido linoleico conjugado à albumina, ácido linoleico e ácido oleico conjugado à albumina, ácido linoleico não conjugado, ácido linoleico-oleico-araquidônico conjugado à albumina, ácido oleico não conjugado e conjugado à albumina, entre outros. A albumina pode ser, de maneira similar, usada em formulações livres de ácido graxo.

[136] Em realizações particulares, um ou mais dentre plasma humano, soro ou um substituto dos mesmos podem estar compreendidos nos ditos meios em uma proporção (volume de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos / volume de meio) entre cerca de 0,5% e cerca de 30%, preferencialmente entre cerca de 1% e cerca de 15%, mais preferencialmente entre 2% e 10%. Os métodos presentes podem ser realizados satisfatoriamente com quantidades relativamente baixas de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos, por exemplo, cerca de 5 ou 10%, em volume, ou inferior, por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3 ou cerca de 4%, em volume, permitindo diminuir o volume de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos que necessita ser obtido a fim de cultivar as MSC ou células derivadas de MSC.

[137] Ainda em realizações adicionais, podem ser empregados um ou mais produtos de plasma concentrado (por exemplo, concentrados de plasma como concentrados a partir de plasma congelado), produtos de soro concentrado ou produtos de um substituto concentrado de plasma ou soro. Esses produtos concentrados podem ser incluídos na composição a uma concentração menor que a concentração desejada de um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos, como para compensar (contrabalançar, equilibrar) o fator de concentração.

[138] Em realizações particulares, podem ser usadas combinações ou misturas de quaisquer dois ou mais dentre plasma, soro e/ou um substituto do mesmo.

[139] Em realizações particulares, FGF-2 e TGFB estão compreendidos no dito meio a concentrações suficientes para induzir diferenciação em relação a um tipo de célula desejado.

[140] Em realizações particulares, FGF-2 e TGFB estão compreendidos no dito meio em concentrações suficientes para induzir diferenciação de MSC em células derivadas de MSC de uma linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica. Tipicamente, FGF-2 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento do mesmo pode estar incluído no meio a uma concentração entre 0,1 e 100 ng/mL, preferencialmente entre 0,5 e 20 ng/mL, por exemplo, em cerca de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/mL, ou em cerca de 5 ng/ml ou menos, por exemplo, em cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/mL. Tipicamente, TGFRB, como TGFB1, ou uma variante biologicamente ativa ou fragmentos do mesmo podem estar incluídos no meio a uma concentração entre 0,1 e 100 ng/mL, preferencialmente entre 0,25 e 20 ng/mL, por exemplo, em cerca de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12,11, 10, 9, 8, 7 ou 6 ng/mL, ou em cerca de 5 ng/mL ou menos, por exemplo, em cerca de 4, 3, 2, 1 ou 0,5 ng/mL. Estes valores destinam-se a se referir às concentrações dos respectivos fatores de crescimento ou a variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos, como exogenamente suplementados aos meios.

[141] Em realizações particulares, heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, pelo menos 0,02 IU/mL, pelo menos 0,03 IU/mL, pelo menos 0,04 IU/mL, pelo menos 0,05 IU/mL, pelo menos 0,06 IU/mL, pelo menos 0,07 IU/mL, pelo menos 0,08 IU/mL, pelo menos 0,09 IU/mL, pelo menos 0,1 IU/mL, pelo menos 0,5 IU/mL, pelo menos 1 IU/mL, pelo menos 5 IU/mL, pelo menos 10 IU/mL, pelo menos 20 IU/mL, pelo menos 30 IU/mL, pelo menos 40 IU/mL, pelo menos 50 IU/mL, pelo menos 60 IU/mL, pelo menos 70 IU/mL, pelo menos 80 IU/mL, pelo menos 90 IU/mL ou pelo menos 100 IU/mL. Em realizações particulares, heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de pelo menos 0,10 IU/mL. Em certas realizações preferenciais, heparina ou um derivado ou análogo da mesma está compreendido no dito meio a uma concentração de cerca de 0,1 IU/mL. Em certas realizações, heparina ou um derivado ou análogo da mesma pode estar compreendido no dito meio a uma concentração de cerca de 0,10 IU/mL, 0,20 IU/mL, 0,30 IU/mL, 0,40 IU/mL, 0,50 IU/mL, 0,60 IU/mL, 0,70 IU/mL, 0,80 IU/mL, 0,90 IU/mL ou 1,0 IU/mL.

[142] Em realizações particulares, a concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma é pelo menos 0,05 IU/mL, preferencialmente cerca de 0,1 IU/mL.

[143] Em uma realização, as concentrações acima podem se referir à concentração total de fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou derivado ou análogo da mesma no meio, isto é, à concentração da soma dos ditos fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou derivado ou análogo da mesma conforme contribuído pelo plasma, soro ou substituto, dos mesmos e conforme fornecido em adição aos mesmos.

[144] Em outra realização, as concentrações acima podem se referir à concentração dos ditos fatores de crescimento ou variantes biologicamente ativas ou fragmentos dos mesmos ou da dita heparina ou derivado ou análogo da mesma conforme fornecidos em adição ao que já contribuiu com o plasma ou soro. Compreensivelmente, se os fatores de crescimento ou heparina ou derivado ou análogo da mesma a serem adicionados normalmente não estiverem presentes (não detectáveis) no plasma, soro ou substituto dos mesmos, a concentração total e adicionada dos fatores de crescimento ou heparina ou derivado ou análogo da mesma será (substancialmente) a mesma.

[145] Em realizações particulares, o método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, conforme descrito no presente pedido, compreende as etapas de: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL; (b) remover matéria não aderente e ainda cultivar células aderentes no meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, obtendo assim as células derivadas de MSC.Em uma realização preferencial, as MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito, conforme definido em outra parte no presente pedido, são cultivadas em um recipiente de cultura. O recipiente de cultura pode fornecer uma superfície de plástico para permitir a aderência das células. Em outra realização, a superfície pode ser uma superfície de vidro. Ainda em outra realização, a superfície pode ser revestida com um material apropriado permitindo aderência e crescimento de células, por exemplo, Matrigelº, laminina ou colágeno.

[147] Em realizações particulares, as MSC podem ser recuperadas da medula óssea (ou de outras fontes) selecionando essas células (mononucleares) que podem aderir a uma superfície de substrato, por exemplo, superfície de plástico.

[148] Em realizações particulares, permite-se que as células se liguem por cerca de 1 e 8 dias, mais tipicamente entre cerca de 2 e 6 dias, mais tipicamente cerca de 4 dias antes de remover a matéria não aderente na etapa (b). De outro modo, a etapa (b) é realizada no máximo 8 dias, no máximo 6 dias, no máximo 4 dias, preferencialmente no máximo 4 dias, após início da etapa (a).

[149] Em realizações particulares, as células podem ser cultivadas nas etapas (a) e (b) tomadas juntas por um período entre cerca de 7 e cerca de 35 dias, geralmente entre cerca de 10 e cerca de 28 dias, e mais preferencialmente por cerca de 12 a 21 dias. De outro modo, as células podem ser cultivadas nas etapas (a) e (b) tomadas juntas até que suas confluências atinjam cerca de 60% ou mais, ou cerca de 80% ou mais, ou cerca de 90% ou mais, ou mesmo até 100%.

[150] Em uma realização, após a etapa (b) o método pode compreender coletar as células ou população celular assim obtida.

[151] Em uma realização, após a etapa (b) o método pode compreender destacar, replaquear e cultivar as células derivadas de MSC no meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, preferencialmente a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[152] Em uma realização, após a etapa (b) o método pode compreender destacar, replaquear e cultivar as células derivadas de MSC em um meio de diferenciação osteogênico ou condrogênico.

[153] Os meios de diferenciação osteogênicos e condrogênicos são conhecidos na técnica. Sem limitação, o meio de diferenciação osteogênico pode incluir meios basais fornecidos com ácido ascórbico, B-glicerofosfato e dexametasona. Sem limitação, o meio de diferenciação condrogênico pode incluir meios basais fornecidos com insulina, transferrina, selenita de sódio, ácido ascórbico, TGFB-1, piruvato de sódio e dexametasona.

[154] Destacar, replaquear e cultivar as células derivadas de MSC após a etapa (b) pode ser realizado uma ou mais vezes, como uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes ou dez vezes. O técnico no assunto entenderá que isto pode gerar culturas celulares da passagem 1 (P1), passagem 2 (P2), passagem 3 (P3), passagem 4 (P4), passagem 5 (P5), passagem 6 (P6), passagem 7 (P7), passagem 8 (P8), passagem 9 (P9) ou passagem 10 (P10), respectivamente. A passagem O (PO) pode se referir a MSC ou células derivadas de MSC que não foram destacadas e/ou replaqueadas.

[155] A diferenciação de MSC como, em particular, a diferenciação osteogênica de MSC, tipicamente resulta em células derivadas de MSC que têm um tamanho maior de célula do que a MSC da qual são derivadas. Os inventores descobriram que este aumento no tamanho celular não ocorre ou é reduzido ou minimizado quando células derivadas de MSC são obtidas a partir de MSC colocando MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/ml. Essas células menores derivadas de MSC têm vantajosamente propriedades de transplante aprimoradas, conforme descrito em outras partes no presente pedido.

[156] Consequentemente, um aspecto adicional fornece um método para obter células derivadas de MSC com propriedades de transplante aprimoradas a partir de MSC, o método compreendendo uma etapa de redução de tamanho, em que a dita etapa de redução de tamanho é caracterizada por colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[157] O termo “redução de tamanho”, como usado no presente pedido, refere-se a (i) dimensões físicas reduzidas ou tamanho de células derivadas de MSC (por exemplo, conforme medido por tamanho médio, diâmetro ou volume, ou uma variável adequada de indicação de tamanho de célula, como Deo, Des, Do ou D75) obtida por um método que compreende a etapa de redução de tamanho em comparação às células derivadas de MSC obtidas por um método idêntico que de outro modo não compreende a etapa de redução de tamanho. À redução de tamanho pode ser uma diminuição no tamanho médio da célula de pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 30%, de células derivadas de MSC obtidas com a etapa de redução de tamanho em comparação ao tamanho médio de células derivadas de MSC obtidas sem a etapa de redução de tamanho.

[158] Em realizações particulares, o método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC com propriedades de transplante aprimoradas, conforme descrito no presente pedido, compreende uma etapa de cultivar MSC in vitro ou ex vivo em um meio de cultura suplementado apropriado para atingir uma alta taxa de proliferação com características de diferenciação tardia e precoce, em que a etapa é realizada simultaneamente com, ou antes da etapa de redução de tamanho.

[159] Em realizações particulares, o método pode compreender colocar MSC em contato com um ou mais agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC simultaneamente com ou antes de colocar as células em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[160] O termo “agente” refere-se amplamente a qualquer substância química (por exemplo, inorgânica ou orgânica), bioquímica ou biológica, molécula ou macromolécula (por exemplo, macromolécula biológica), uma combinação ou mistura das mesmas, uma amostra de composição indeterminada ou um extrato feito de materiais biológicos como bactérias, plantas, fungos, células ou tecidos animais. Exemplos não limitantes de agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC são fatores de crescimento, como FGF-2 e TGFB, e plasma ou soro ou um substituto dos mesmos. O técnico no assunto entenderá que o fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento podem ser qualquer fator de crescimento ou combinação de fatores de crescimento conhecidos por serem capazes de induzir diferenciação de MSC em direção a um tipo de célula desejada.

[161] Em realizações particulares, o método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC com propriedades aprimoradas de transplante,

conforme descrito no presente pedido, compreende ainda uma etapa de colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2 e TGFRB. Colocar as ditas MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL preferencialmente é realizado simultaneamente.

[162] Em realizações particulares, as MSC ou células derivadas de MSC são adicionalmente colocadas em contato com o meio em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[163] Conforme descrito anteriormente, os métodos detalhados acima descritos produzem células derivadas de MSC, ou populações que as compreendem, com características superiores, como, em particular, um tamanho menor e mais homogêneo do que as células derivadas de MSC descritas anteriormente. O tamanho menor e mais homogêneo das células derivadas de MSC que podem ser obtidas pelos métodos, conforme descrito no presente pedido, produz as células com propriedades de transplante aprimoradas. Mais particularmente, o tamanho menor e mais homogêneo das células derivadas de MSC que podem ser obtidas pelos métodos descritos no presente pedido, torna as células adequadas para todas as rotas de administração e, em particular, administração intravascular, entre outras coisas, reduzindo ou eliminando o risco de embolia pulmonar e infarto, oferecendo um bom perfil de segurança in vivo e/ou seringabilidade. Além disso, as células derivadas de MSC que podem ser obtidas pelos métodos conforme descrito no presente pedido permitem que uma concentração celular alta e ajustável seja distribuída no local com um volume administrado limitado.

[164] Em vista disto, o método da invenção pode ser ainda definido pelo tamanho, caracterizado pelo diâmetro e/ou volume de uma célula, das células derivadas de MSC resultantes do contato de MSC com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma.

[165] Em realizações particulares, o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 30 um, menor que 29 um, menor que 28 um, menor que 27 um, menor que 26 um, menor que 25 um ou menor que 24 um. Preferencialmente, o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menos que 24 um.

[166] Os termos “suspensão” e “ suspensão celular" geralmente se referem a células derivadas de MSC, particularmente células derivadas de MSC viáveis, dispersas em uma fase líquida.

[167] Em realizações particulares, o diâmetro médio das células derivada de MSC em suspensão é maior que 10 um, maior que 11 um, maior que 12 um, maior que 13 um, maior que 14 UM, maior que 15 uM, maior que 16 uM, mais que 17 ou maior que 18 um.

[168] Em realizações particulares, o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é entre 16 um e 26 um, preferencialmente entre 20 um e 25 um.

[169] Em realizações particulares, pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo £ 25 um), igual ou menor que 24 um (Deo € 24 um), igual ou menor que 23 um (Deo < 23 um), igual ou menor que 22 um (Deo < 22 um), igual ou menor que 21 um (Deo < 21 um), ou igual ou menor que 20 um (Deo < 20 um), preferencialmente igual ou menor que 25 um (Deo <€ 25 um).

[170] Em realizações particulares, pelo menos 65% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Des € 25 um), igual ou menor que 24 um (Des < 24 um), igual ou menor que 23 um (Des < 23 um), igual ou menor que 22 um (Des <$ 22 um), igual ou menor que 21 um (Des < 21 um), ou igual ou menor que 20 um (Des < 20 um), preferencialmente igual ou menor que 25 um (Des < 25 um).

[171] Em realizações particulares, pelo menos 70% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Do * 25 um), igual ou menor que 24 um (Do <$ 24 um), igual ou menor que 23 um (Do < 23 um), igual ou menor que 22 um (D70< 22 um), igual ou menor que 21 um (Do

< 21 um), ou igual ou menor que 20 um (Do < 20 um), preferencialmente igual ou menor que 25 um (Do < 25 um).

[172] Em realizações particulares, pelo menos 75% das células derivadas de MSC em suspensão (D75 < 25 um) têm um diâmetro igual ou menor que 25 um, igual ou menor que 24 um (D75 < 24 pum), igual ou menor que 23 um (D75 < 23 pm), igual ou menor que 22 um (D75< 22 um), igual ou menor que 21 um (D75 < 21 um), ou igual ou menor que 20 um (D75 < 20 um), preferencialmente igual ou menor que 25 um (D75< 25 um).

[173] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Deo igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 upm.Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Des igual ou menor que 25 um (Des < 25 um) e no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[175] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Dro igual ou menor que 25 um (D70< 25 um) e no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[176] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Drs igual ou menor que 25 um (D75< 25 um) e no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[177] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Deo entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 25 um), entre cerca de 24 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 24 um), entre cerca de 23 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 23 um), entre cerca de 22 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 22 um), entre cerca de 21 um e cerca de 10 um (10 um < Deo € 21 um) ou entre cerca de 20 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 20 um), preferencialmente entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < Deo < 25 um).

[178] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Dss entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 25 um), entre cerca de 24 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 24 um), entre cerca de 23 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 23 um), entre cerca de 22 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 22 um), entre cerca de 21 um e cerca de 10 um (10 um < Des € 21 um) ou entre cerca de 20 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 20 um), preferencialmente entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < Des < 25 um).

[179] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Dro entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < D7o < 25 um), entre cerca de 24 um e cerca de 10 um (10 um < D7o < 24 um), entre cerca de 23 um e cerca de 10 um (10 um < D7o < 23 um), entre cerca de 22 um e cerca de 10 um (10 um < D7o < 22 um), entre cerca de 21 um e cerca de 10 um (10 um < D7o < 21 um) ou entre cerca de 20 um e cerca de 10 um (10 um < Do < 20 um), preferencialmente entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < Dro < 25 um).

[180] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Drs entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um € D75 < 25 um), entre cerca de 24 um e cerca de 10 um (10 um < D75 <€ 24 um), entre cerca de 23 um e cerca de 10 um (10 um < D75< 23 um), entre cerca de 22 um e cerca de 10 um (10 um < D75< 22 um), entre cerca de 21 um e cerca de 10 um (10 um € D75 € 21 um) ou entre cerca de 20 um e cerca de 10 um (10 um < D75 < 20 um), preferencialmente entre cerca de 25 um e cerca de 10 um (10 um < D75< 25 um).

[181] Em realizações particulares, pelo menos 90% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 30 um (Dao * 30 um), igual ou menor que 29 um (Deo < 29 um), igual ou menor que 28 um (Doo < 28 um), igual ou menor que 27 um (Deo < 27 um), igual ou menor que 26 um (Deo < 26 um), ou igual ou menor que 25 um (Doo < 25 um), preferencialmente igual ou menor que 30 um (Dao < 30 um).

[182] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Dao igual ou menor que 30 um (Doo < 30 um) e no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[183] Em realizações particulares, as células derivadas de MSC em suspensão exibem um Doo entre cerca de 30 um e cerca de 10 um (10 um < Doo < 30 um).

[184] Em realizações particulares, o diâmetro de cada célula derivada de MSC em suspensão é maior que 10 um, maior que 11 um, maior que 12 um, maior que 13 um, maior que 14 UM ou maior que 15 UM, preferencialmente maior que 10 um.

[185] O diâmetro de uma célula pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por um microscópio digital e software que acompanha para análise de imagens (por exemplo, Motic Image Plus 2.02). O diâmetro médio da célula, como citado no presente pedido, deve ser determinado com base no diâmetro das células em um estado livre de flutuação, não aderido, então, das células em suspensão. As células estão preferencialmente suspensas em uma solução que compreende um tampão transparente, não tóxico, isotônico como PBS, e opcionalmente um corante para diferenciar as células vivas e mortas, como azul de tripano. Preferencialmente, pelo menos cem células devem ser medidas para considerar a análise estatisticamente significativa.

[186] Em realizações particulares, o diâmetro de cada célula derivada de MSC em suspensão é menor que 38 um, menor que 37 um, menor que 36 um, menor que 35 um, preferencialmente menor que 35 um.

[187] Em realizações particulares, o desvio padrão do diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 7,0 um, menor que 6,5 um, menor que 6,0 um, menor que 5,5 um, menor que 5 um, menor que 4,5 um, menor que 4 um ou menor que 3,5 um. Preferencialmente, o desvio padrão do diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 4,0 um, como entre 3,0 e 3,5 um.

[188] Os inventores descobriram que a distribuição de tamanho de célula de células derivadas de MSC obtidas pelos métodos conforme descritos no presente pedido é estável. Consequentemente, o diâmetro e/ou volume das células derivadas de MSC obtidas pelos métodos conforme descrito no presente pedido podem ser determinados em qualquer ponto no tempo e em qualquer confluência durante cultura in vitro. Em realizações preferenciais, o diâmetro e/ou volume das células derivadas de MSC é determinado quando as células atingem uma confluência entre 30% e 80%, preferencialmente entre 40% e 70%, como 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou 70%.

[189] Um aspecto adicional fornece um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, em que o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 25 um, como menor que 24 um ou como entre 20 um e 25 um...

[190] Um aspecto adicional fornece um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um), preferencialmente pelo menos 70% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 uM (D7o < 25 um), e no máximo 5% da população celular tem um diâmetro maior que 35 um.

[191] Será evidente para um técnico no assunto que todas as realizações descritas anteriormente, incluindo as realizações relacionadas com o diâmetro médio das células derivadas de MSC, diâmetro individual máximo das células derivadas de MSC, volume médio das células derivadas de MSC, Deo, Des, Do, D75, Deo, concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma, linhagem de células derivadas de MSC e agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC, aplicar os ensinamentos no presente pedido a todos os métodos para obter células derivadas de MSC.

[192] Um aspecto adicional fornece uma população de células derivadas de MSC que pode ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, em que o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 30 um, menor que 29um, menor que 28 um, menor que 27 um, menor que 26 pum, menor que 25 um ou menor que 24 um. Preferencialmente, o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menos que 24 um.

[193] Um aspecto adicional fornece uma população de células derivadas de MSC que pode ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um), preferencialmente pelo menos 70% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que UM (D7o € 25 um), e no máximo 5% da população celular tem um diâmetro de mais que 35 um. O termo “população”, como usado no presente pedido, refere- se a um grupo substancialmente puro (isto é, composto principalmente de) e homogêneo de células de um tipo de célula derivado de MSC desejado.

[194] Em realizações particulares, o diâmetro de cada célula derivada de MSC em suspensão é menor que 38 um, menor que 37 um, menor que 36 um, preferencialmente menor que 35 um.

[195] Em realizações particulares, o desvio padrão do diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 6,0 um, menor que 5,5 um, menor que 5,0 um, menor que 4,5 um, menor que 4,0 um ou menor que 3,5 um. Preferencialmente, o desvio padrão do diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 4,0 um, como entre 3,0 e 3,5 um.

[196] Em realizações particulares, a população de células derivadas de MSC pode ser obtida pelos métodos de obtenção de células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido.

[197] Será evidente para um técnico no assunto que todas as realizações descritas anteriormente, incluindo as realizações relacionadas com o diâmetro médio das células derivadas de MSC, diâmetro individual máximo das células derivadas de MSC, volume médio das células derivadas de MSC, Deo, Des, Do,

D75, Deo, concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma, linhagem de células derivadas de MSC e agentes capazes de induzir expansão e/ou diferenciação de MSC, se apliquem a todos os métodos para obter células derivadas de MSC a partir de MSC conforme ensinado no presente pedido, e então também às células derivadas de MSC e uma população de células derivadas de MSC que podem ser obtidas pelos ditos métodos conforme ensinado no presente pedido.

[198] Consequentemente, um aspecto adicional refere-se a uma composição que compreende as células derivadas de MSC ou a população de células derivadas da MSC, conforme definido no presente pedido.

[199] Também são fornecidas composições que compreendem as células derivadas de MSC ensinadas no presente pedido ou a população de células derivadas de MSC e que compreendem um ou mais dentre outros componentes. Por exemplo, podem ser incluídos componentes que podem manter ou melhorar a viabilidade de células. Por meio de exemplo e sem limitação, esses componentes podem incluir sais para assegurar condições substancialmente isotônicas, estabilizadores de pH, como sistema(s) tampão (por exemplo, para assegurar pH substancialmente neutro, como sistema tampão fosfato ou carbonato), proteínas carreadoras como, por exemplo, albumina, meios que incluem meios basais e/ou suplementos de meios, soro ou plasma, nutrientes, fontes de carboidratos, conservantes, estabilizadores, antioxidantes ou outros materiais bem conhecidos pelos técnicos no assunto. São também divulgados métodos de produção das ditas composições, por mistura das respectivas células derivadas de MSC ou da população de células derivadas de MSC com um ou mais componentes adicionais conforme acima. As composições podem ser, por exemplo, líquidas ou podem ser semissólidas ou sólidas (por exemplo, podem ser composições congeladas ou podem existir como gel ou podem existir em suporte sólido ou arcabouço, etc.). Os crioconservantes, entre outros, como dimetil sulfóxido (DMSO) são bem conhecidos na técnica.

[200] Os termos “composição”, “formulação” ou “preparação” podem ser usados de forma intercambiável no presente pedido.

[201] Em realizações particulares, a composição é uma composição farmacêutica que compreende as células derivadas de MSC ou a população de células derivadas de MSC, conforme definido no presente pedido e, opcionalmente, um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[202] O termo “farmaceuticamente aceitável", como usado no presente pedido, é coerente com a técnica e os meios compatíveis com os outros ingredientes de uma composição farmacêutica e não deletério para o seu receptor.

[203] Como usado no presente pedido, “carreador” ou “excipiente” inclui todos e quaisquer solventes, diluentes, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), solubilizantes, coloides, meios de dispersão, veículos, preenchedores, agentes quelantes (por exemplo, EDTA ou glutationa), aminoácidos (por exemplo, glicina), proteínas, disintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, agentes umectantes, emulsionantes, adoçantes, corantes, flavorizantes, aromatizantes, espessantes, agentes para atingir um efeito de depósito, revestimentos, agentes antifúngicos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes controladores de tonicidade, agentes retardadores de absorção, e similares. O uso desses meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Esses materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir na atividade das células.

[204] A natureza precisa do carreador ou excipiente ou outro material dependerá da rota de administração. Por exemplo, a composição pode estar sob a forma de uma solução aquosa aceitável de modo parenteral, que é livre de pirogênio e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Para princípios gerais em formulação medicinal, o leitor é submetido para Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

[205] As composições farmacêuticas líquidas geralmente podem incluir um carreador líquido, como água ou uma solução aquosa farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, solução salina fisiológica, meio de cultura de tecidos ou células, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, como etilenoglicol, propilenoglico! ou polietilenoglicol, podem ser incluídos.

[206] A composição pode incluir uma ou mais moléculas protetoras celulares, moléculas regenerativas celulares, fatores de crescimento, fatores antiapoptóticos ou fatores que regulam a expressão gênica nas células. Essas substâncias podem tornar as células independentes do seu ambiente.

[207] Essas composições farmacêuticas podem conter componentes adicionais, garantindo a viabilidade das células nelas. Por exemplo, as composições podem compreender um sistema tampão adequado (por exemplo, sistema tampão fosfato ou carbonato) para atingir o pH desejável, geralmente mais próximo do pH neutro, e pode compreender sal suficiente para garantir condições isosmóticas às células para evitar estresse osmótico. Por exemplo, uma solução adequada para esses propósitos pode ser solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução de cloreto de sódio, injeção de Ringer ou injeção de Ringer com Lactato, como conhecido na técnica. Além disso, a composição pode compreender uma proteína carreadora, por exemplo, albumina (por exemplo, albumina bovina ou humana), que pode aumentar a viabilidade das células.

[208] Além disso, carreadores ou aditivos adequados farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e, por exemplo, podem ser selecionados a partir de proteínas colágeno ou gelatina, carboidratos como amido, polissacarídeos, açúcares (dextrose, glicose e sacarose), derivados de celulose como carboximetil celulose de sódio ou cálcio, hidroxipropil celulose ou hidroxipropilmetil celulose, amidos pré-geletanizados, pectina, ágar, carragena, argilas, gomas hidrofílicas (goma de acácia, goma guar, goma arábica e goma xantana), ácido algínico, alginatos, ácido hialurônico, ácido poliglicólico e poliláctico, dextrano, pectinas, polímeros sintéticos como polímero acrílico solúvel em água ou polivinilpirrolidona, proteoglicanos, fosfato de cálcio, e similares.

[209] Se desejável, a preparação celular pode ser administrada em um suporte, arcabouço, matriz ou material para fornecer uma regeneração tecidual aprimorada. Por exemplo, o material pode ser uma cerâmica granular ou um biopolímero, como gelatina, colágeno ou fibrinogênio. Matrizes porosas podem ser sintetizadas de acordo com técnicas padrão (por exemplo, Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997). Esse suporte, arcabouço, matriz ou material pode ser biodegradável ou não biodegradável. Então, as células podem ser transferidas e/ou cultivadas em substrato adequado, como substrato poroso ou não poroso, para fornecer implantes. Por exemplo, as células que proliferaram, ou que estão sendo diferenciadas em pratos de cultura, podem ser transferidas para suportes sólidos tridimensionais para que se multipliquem e/ou continuem o processo de diferenciação, por incubação do suporte sólido em um meio líquido de nutrientes da invenção, se necessário. As células podem ser transferidas para um suporte sólido tridimensional, por exemplo, impregnando o dito suporte com uma suspensão líquida contendo as ditas células. Os suportes impregnados obtidos desse modo podem ser implantados em um sujeito. Esses suportes impregnados também podem ser recultivados por imersão dos mesmos em um meio líquido de cultura, antes de serem finalmente implantados. O suporte sólido tridimensional precisa ser biocompatível para permitir que seja implantado em um humano. Pode ser biodegradável ou não biodegradável.

[210] As células ou populações celulares podem ser administradas de forma a permitir que sobrevivam, cresçam, se propaguem e/ou se diferenciem para os tipos celulares desejados, como, por exemplo, hepatócitos. As células ou populações celulares podem ser enxertadas ou podem migrar para o interior do órgão pretendido como, por exemplo, fígado. O enxerto das células ou populações celulares em outros locais, tecidos ou órgãos como fígado, baço, pâncreas, cápsula renal, peritônio ou omento pode ser previsto.

[211] Em uma realização, a preparação de células farmacêuticas, conforme definido acima, pode ser administrada sob a forma de composição líquida. Em realizações, as células ou a composição farmacêutica que as compreende podem ser administradas sistemicamente, de forma tópica, no interior de um órgão, em um local de disfunção ou lesão do órgão ou em um local de lesão do tecido,

[212] Preferencialmente, as composições farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva das células desejadas. O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade que pode provocar uma resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal ou humano que está sendo buscado por um pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico e, em particular, pode prevenir ou aliviar um ou mais dos sintomas ou características locais ou sistêmicas de uma doença ou condição que está sendo tratada. Quantidades apropriadas terapeuticamente efetivas podem ser determinadas por um médico qualificado, tendo em conta a natureza das células desejadas, a condição e severidade da doença, e a idade, tamanho e condição do sujeito.

[213] Também são fornecidos métodos para produzir as ditas composições farmacêuticas por mistura das células da invenção com um ou mais componentes adicionais, conforme descrito acima, bem como com um ou mais excipientes farmacêuticos, conforme descrito acima.

[214] Também é divulgado um arranjo ou kit de partes que compreende um instrumento ou dispositivo cirúrgico para administração das células derivadas de MSC ou da população de células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido, ou das composições farmacêuticas, conforme definido no presente pedido, para um sujeito, como por exemplo sistemicamente, por injeção, e ainda compreendendo as células derivadas de MSC ou a população de células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido, ou as composições farmacêuticas, conforme definido no presente pedido.

[215] Em uma realização, a composição farmacêutica, conforme definido acima, pode ser administrada sob a forma de composição líquida ou viscosa.

[216] Em aspectos relacionados, a invenção fornece as células derivadas de MSC ou populações de células derivadas de MSC definidas acima ou a composição farmacêutica que compreende as ditas células derivadas de MSC ou população de células derivadas de MSC para uso como um medicamento. Em aspectos relacionados, a invenção fornece as células derivadas de MSC ou populações de células derivadas de MSC definidas acima ou a composição farmacêutica que compreende as ditas células derivadas de MSC ou população de células derivadas de MSC para uso no tratamento de um sujeito que necessita de transplante de células derivadas de MSC.Em aspectos relacionados, a invenção fornece um método para tratar um sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC, que compreende administrar ao dito sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva das células derivadas de MSC ou populações de células derivadas de MSC definidas acima, ou a composição farmacêutica que compreende as ditas células derivadas de MSC ou população de células derivadas de MSC ao sujeito. Em aspectos relacionados, a invenção fornece o uso das células derivadas de MSC ou de uma população de células derivadas de MSC definidas acima ou composição que compreende as ditas células derivadas de MSC ou uma população de células derivadas de MSC para a fabricação de um medicamento para tratamento de um sujeito que necessita de transplante de células derivadas de MSC.

[218] Como usado no presente pedido, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se tanto a tratamento terapêutico e profilático como medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma alteração ou disfunção fisiológica indesejada. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, sem piora) da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença e ocorrência de complicações, melhora ou paliação do estado da doença. “Tratamento” também pode significar sobrevida prolongada, em comparação à sobrevida esperada se não receber tratamento.

[219] O termo “sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC”, como usado no presente pedido, inclui sujeitos, como mamíferos ou sujeitos humanos, que se beneficiariam do tratamento de uma determinada condição, preferencialmente uma condição ou doença como acima. Esses sujeitos tipicamente incluem, sem limitação, aqueles que foram diagnosticados com a condição, aqueles propensos a ter ou desenvolver a condição e/ou aqueles em que a condição deve ser prevenida.

[220] O termo “transplante” ou “transplante celular” tem seu significado normal e refere-se particularmente à administração de células a um sujeito. O termo “transplante celular” pode ser usado de forma intercambiável com “terapia celular”. O transplante de células pode ser realizado por qualquer técnica conhecida. Por exemplo, e sem limitação, as células podem ser transplantadas por infusão em um sujeito. Normalmente, a infusão celular pode ser realizada por via parenteral, por exemplo, por via intravascular, subcutânea, intradérmica ou intramuscular, preferencialmente intravascular. As células podem ser administradas, por exemplo, e sem limitação, sistemicamente, topicamente ou no local de uma lesão. Pode ser claro que, dependendo da aplicação específica, tecidos-alvo, propósitos terapêuticos ou tipo celular, o ajuste pode ser feito, consequentemente, em relação às rotas de administração, bem como formulações, concentrações, etc.

[221] O tamanho celular homogêneo e pequeno das células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido, leva a uma toxicidade aguda reduzida ou abolida após a administração intravenosa das ditas células a um sujeito. Portanto, as células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido, são particularmente adequadas para administração intravascular ou percutânea.

[222] Portanto, em realizações particulares, as células derivadas de MSC ou população de células derivadas de MSC definidas acima, ou a composição farmacêutica, podem ser administradas ao dito sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC por via percutânea ou intravascular.

[223] Além disso, os inventores descobriram que as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou de linhagem osteoblástica seriam obtidas pelos métodos conforme ensinados no presente pedido, que têm propriedades de formação óssea mais potentes.

[224] Consequentemente, em uma realização particular, a dita condição ou doença é uma doença musculoesquelética.

[225] O termo “doença musculoesquelética”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer tipo de doença óssea, doença muscular, doença articular ou condrodistrofia, cujo tratamento pode se beneficiar da administração da presente formulação farmacêutica a um sujeito que tem a doença. Em particular, essa doença pode ser caracterizada, por exemplo, por formação óssea e/ou cartilaginosa diminuída ou reabsorção óssea e/ou cartilaginosa excessiva, por número, viabilidade ou função diminuída de osteoblastos ou osteócitos presentes nos ossos e/ou condroblastos ou condrócitos presentes na cartilagem, massa óssea e/ou massa cartilaginosa diminuída em um sujeito, afinamento do osso, força óssea ou elasticidade comprometida, etc.

[226] Exemplos não limitantes de doenças musculoesqueléticas podem incluir disfunções locais ou sistêmicas, como, qualquer tipo de osteoporose ou osteopenia, por exemplo, primária, pós-menopausa, senil, induzida por corticoide, induzida por bisfosfonatos e induzida por radioterapia; qualquer osteonecrose mono- ou multilocal secundária; qualquer tipo de fratura, por exemplo, não-união, mal-união, fraturas ou compressão de união retardada, fraturas maxilo-faciais; condições que requerem fusão óssea (por exemplo, fusões espinhais e reconstrução); defeito ósseo congênito; reconstrução óssea, por exemplo, após lesão traumática ou cirurgia de câncer, e reconstrução óssea crânio-facial; artrite traumática, defeito focal na cartilagem e/ou articulações, artrite degenerativa focal; osteoartrite, artrite degenerativa, gonartrose, e coxartrose; osteogênese imperfeita; câncer ósseo osteolítico; Doença de Paget; disfunções endocrinológicas; hipofosfatemia; hipocalcemia; osteodistrofia renal; osteomalácia; doença Óssea adinâmica, hiperparatiroidismo,

hiperparatireoidismo — primário, — hiperparatireoidismo — secundário; — doença periodontal; doença de Gorham-Stout e síndrome de McCune-Albright; artrite reumatoide; espondiloartropatias, incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática, artropatia enteropática, e espondiloartrite indiferenciada e artrite reativa; lúpus eritematoso sistêmico e síndromes relacionadas; escleroderma e disfunções relacionadas; Síndrome de Sjogren; vasculite sistêmica, incluindo Arterite de células gigantes (doença de Horton), arterite de Takayasu, polimialgia reumática, vasculite associada a ANCA (como granulomatose de Wegener, poliangiite microscópica, e Síndrome de Churg-Strauss), Síndrome de Behcet, e outras poliarterites e doenças relacionadas (como poliarterite nodosa, Síndrome de Cogan, e doença de Buerger); artrite qua acompanha outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo amiloidose e sarcoidose; artropatias de cristal, incluindo gota, doença do diidrato de pirofosfato de cálcio, disfunções ou síndromes associadas com deposição articular de fosfato de cálcio ou cristais de oxalato de cálcio; condrocalcinose e artropatia neuropática; Síndrome de Felty e Síndrome e Síndrome de Reiter; doença de Lyme e febre reumática.

[227] Em uma realização particular, a dita condição ou doença é uma disfunção relacionada aos ossos.

[228] Consequentemente, o termo “disfunção relacionada aos ossos”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer tipo de doença óssea, cujo tratamento pode se beneficiar do transplante de células com propriedades de formação óssea, por exemplo, osteocondroprogenitoras, osteoprogenitoras, pré- osteoblastos, osteoblastos ou células com fenótipo osteoblástico, a um sujeito que tem a disfunção. Em particular, essas disfunções podem ser caracterizadas, por exemplo, por formação óssea e/ou cartilaginosa diminuída ou reabsorção Óssea excessiva, por número, viabilidade ou função diminuída de osteoblastos ou osteócitos presentes nos ossos, massa óssea diminuída em um sujeito, afinamento do osso, força óssea ou elasticidade comprometida, etc.

[229] A título de exemplo, mas sem limitação, as disfunções relacionadas com ossos que podem se beneficiar do transplante de células derivadas de MSC com propriedades de formação óssea (por exemplo, células de linhagem osteoblástica) obtidas pelo método da presente invenção podem incluir disfunções locais ou sistêmicas, como, qualquer tipo de osteoporose ou osteopenia, por exemplo, primária, pós-menopausa, senil, induzida por corticoide, qualquer osteonecrose secundária, mono- ou multilocal, qualquer tipo de fratura, por exemplo, não-união, mal-união, fraturas ou compressão de união retardada, condições que requerem fusão óssea (por exemplo, fusões espinhais e reconstrução), fraturas maxilo-faciais, reconstrução óssea, por exemplo, após lesão traumática ou cirurgia de câncer, reconstrução óssea crânio-facial, osteogênese imperfeita, câncer ósseo osteolítico, Doença de Paget, disfunções endocrinológicos, — hipofosfatemia, — hipocalcemia, — osteodistrofia — renal, osteomalácia, doença óssea adinâmica, artrite reumatoide, hiperparatireoidismo, hiperparatireoidismo — primário, hiperparatireoidismo — secundário, “doença periodontal, doença de Gorham-Stout e síndrome de McCune-Albright.

[230] As células derivadas de MSC, a população de células derivadas de MSC e composições farmacêuticas descritas no presente pedido podem ser usadas isoladamente ou em combinação com qualquer uma das terapias ou compostos ativos conhecidos para as respectivas disfunções. A administração pode ser simultânea ou sequencial em qualquer ordem, conforme descrito em outra parte no presente pedido.

[231] Se as células são derivadas de fontes heterólogas (isto é, não autólogas, não homólogas ou não alogeneicas), a terapia de imunossupressão concomitante pode ser tipicamente administrada, por exemplo, com o uso de agentes imunossupressores, como ciclosporina ou tacrolimo (FK506).

[232] A quantidade de células a serem administradas irá variar de acordo com o sujeito sendo tratado. Em uma realização preferencial, a quantidade de células a ser administrada é entre 10º? a 10º ou entre 10? a 10º, ou entre 10º a 10º ou entre 10º a 10º, ou entre 10º a 10*º ou entre 10º a 10º, como entre 10º e 108, ou entre 10º e 107, por exemplo, cerca de 1 x 10º, cerca de 5 x 105, cerca de 1 x 108, cerca de 5 x 106, cerca de 1 x 107, cerca de 5 x 107, cerca de 1 x 108,

cerca de 5 x 108, cerca de 1 x 10º, cerca de 2 x 10º, cerca de 3 x 10º, cerca de 4 x 10º, cerca de 5 x 10º, cerca de 6 x 10º, cerca de 7 x 10º, cerca de 8 x 10º, cerca de 9 x 10º ou cerca de 1 x 10*º células podem ser administradas a um sujeito humano. Em realizações adicionais, entre 10º a 10º células por kg de peso corporal ou entre 1 x 107 a 9 x 107 células por kg de peso corporal, por exemplo, cerca de 1 x 107, cerca de 2 x 107, cerca de 3 x 107, cerca de 4 x 107, cerca de 5 x 107, cerca de 6 x 107, cerca de 7 x 107, cerca de 8 x 107, cerca de 9 x 107 ou cerca de 1 x 108 células por kg de peso corporal podem ser administradas a um sujeito humano. Por exemplo, esse número de células ou esse número de células por kg de peso corporal pode se referir particularmente ao número total de células a serem administradas a um sujeito, cuja administração pode ser adequadamente distribuída em uma ou mais doses (por exemplo, distribuídas em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 0u 10 ou mais doses) administradas durante um ou mais dias (por exemplo, durante 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais dias). No entanto, a determinação precisa de uma dose terapeuticamente efetiva pode ser baseada em fatores individuais para cada paciente, incluindo seu tamanho, idade, tamanho do dano ao tecido e tempo desde a ocorrência do dano, e pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto a partir desta divulgação e do conhecimento na técnica.

[233] Adequadamente, em uma composição a ser administrada, as células podem estar presentes em uma concentração entre cerca de 10*/mL a cerca de 10º/mL, preferencialmente entre cerca de 105/mL e cerca de 10º/mL, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1 x 10º/mL e cerca de 1 x 10º/mL, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 108&/mL como, por exemplo, cerca de 7,5 x 107/mL. O tamanho celular reduzido das células derivadas de MSC, conforme ensinado no presente pedido, permite uma concentração celular alta e/ou ajustável. Consequentemente, se a composição for uma composição líquida, o volume da composição que compreende células derivadas de MSC obtidas pelo método, conforme ensinado no presente pedido, a ser administrada ao sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC, é menor que o volume da composição que compreende células derivadas de MSC obtidas por outros métodos.

[234] Aspectos e realizações da presente invenção então englobam, e o presente relatório descritivo descreve, a matéria em questão conforme apresentada em qualquer uma das seguintes declarações:

[235] Declaração 1. Um método para obter células derivadas de células- tronco mesenquimais a partir de células-tronco mesenquimais (MSC) que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[236] Declaração 2. O método de acordo com a declaração 1, que compreende as etapas de: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL; (b) remover matéria não aderente e ainda cultivar células aderentes no meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, obtendo assim as células derivadas de MSC.

[237] Declaração 3. O método de acordo com a declaração 1 ou 2, em que TGFB é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFB2, TGFB3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFB é TGFRB1.

[238] Declaração 4. Um método para obter células derivadas de MSC com propriedades de transplante aprimoradas a partir de MSC, o método compreendendo uma etapa de redução de tamanho, em que a dita etapa de redução de tamanho é caracterizada por colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[239] Declaração 5. O método de acordo com qualquer uma das declarações | a 4, em que a concentração de heparina ou um derivado ou análogo da mesma é pelo menos 0,05 IU/mL, preferencialmente cerca de 0,1 IU/mL.

[240] Declaração 6. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 5, em que a heparina ou derivado de heparina ou análogo é selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (UFH); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos.

[241] Declaração 7. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 6, em que o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 25 um, como menor que 24 um, como entre 20 um e 25 um.

[242] Declaração 8. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 7, em que o diâmetro de cada célula derivada de MSC na suspensão é menor que 35 um.

[243] Declaração 9. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 8, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[244] Declaração 10. O método de acordo com qualquer uma das declarações | a 9, em que as células derivadas de MSC são de linhagem osteocondroblástica.

[245] Declaração 11. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 10, em que as células derivadas de MSC são de linhagem osteoblástica ou condroblástica, preferencialmente de linhagem osteoblástica.

[246] Declaração 12. O método de acordo com qualquer uma das declarações 1 a 11, em que as MSC são adicionalmente colocadas em contato com o meio em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[247] Declaração 13. Um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC, que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB, e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, em que o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 25 um, como menor que 24 um, como entre 20 um e 25 um.

[248] Declaração 14. O método de acordo com a declaração 13, em que o diâmetro de cada célula derivada de MSC em suspensão é menor que 35 um.

[249] Declaração 15. Um método para obter células derivadas de MSC a partir de MSC que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[250] Declaração 16. O método de acordo com qualquer uma das declarações 13 a 15, em que MSC são colocadas em contato com heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[251] Declaração 17. O método de acordo com qualquer uma das declarações 13 a 16, em que TGFB é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFB2, TGFB3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFB é TGFRB1.

[252] Declaração 18. Uma população de células derivadas de MSC que podem ser obtidas por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, em que o diâmetro médio das células derivadas de MSC em suspensão é menor que 25 um, como menor que 24 um, como entre 20 um e 25 um.

[253] Declaração 19. A população de células derivadas de MSC de acordo com a declaração 18, em que o diâmetro de cada célula derivada de MSC em suspensão é menor que 35 um.

[254] Declaração 20. Uma população de células derivadas de MSC que pode ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, através do qual pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Dso < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

[255] Declaração 21. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 20, em que as células derivadas de MSC podem ser obtidas por um método que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB, e heparina ou um derivado ou análogo da mesma.

[256] Declaração 22. A população de células derivadas de MSC de acordo com a declaração 21, em que MSC são colocadas em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

[257] Declaração 23. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 22, em que as células derivadas de MSC são de linhagem osteocondroblástica.

[258] Declaração 24. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 23, em que as células derivadas de MSC são de linhagem osteoblástica ou condroblástica, preferencialmente de linhagem osteoblástica.

[259] Declaração 25. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 24, em que as MSC são adicionalmente colocadas em contato com um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

[260] Declaração 26. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 25, em que TGFB é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFB2, TGFB3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFB é TGFRB1.

[261] Declaração 27. A população de células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica de acordo com qualquer uma das declarações 23 a 27, em que substancialmente todas as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica são positivas para CD90, CD105, CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica são negativas para CD45, CD14 e CD19; e pelo menos 70% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica são positivas para fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica são positivas para HLA-DR.

[262] Declaração 28. Uma composição farmacêutica que compreende a população de células derivadas de MSC conforme definido em qualquer uma das declarações 18 a 27.

[263] Declaração 29. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 27 ou a composição farmacêutica de acordo com a declaração 28 para uso como um medicamento.

[264] Declaração 30. A população de células derivadas de MSC para uso de acordo com a declaração 29, em que a população de células derivadas de MSC está presente a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 10%8/mL, preferencialmente 7,5 x 107 células/mL.

[265] Declaração 31. A população de células derivadas de MSC de acordo com qualquer uma das declarações 18 a 27, ou a composição farmacêutica de acordo com a declaração 28 para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC.

[266] Declaração 32. A população de células derivadas de MSC para uso de acordo com qualquer uma das declarações 29 a 31, em que a população de células derivadas de MSC ou a composição farmacêutica é adequada para administração percutânea ou intravascular.

[267] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com realizações específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para o técnico no assunto em vista da descrição acima. Consequentemente, pretende-se adotar todas essas alternativas, modificações e variações como a seguir no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.

[268] Os aspectos e realizações acima são ainda apoiados pelos exemplos não limitantes a seguir.

Exemplos Exemplo 1 Método para Obter Células de Formação Óssea Derivadas de MSC de Tamanho Pequeno

1. Procedimentos Experimentais

1.1 Coleta de Medula Óssea Humana e Culturas BM-MSC

[269] 20 a 60 mL de aspirados de medula óssea humana (BM) foram obtidos a partir da crista ilíaca de 8 doadores voluntários saudáveis. Após coleta, foram contados glóbulos brancos da medula óssea, semeados a uma densidade de 50.000 células/cm? em meio de cultura convencional contendo 1% de penicilina-estreptomicina e incubados a 37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de CO>2. Após 24 horas, células não aderentes foram removidas por lavagem com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) (Lonza BioWhittakerº) e foi adicionado meio fresco. O meio de cultura foi substituído a cada 2 a 3 dias. Colônias de células aderentes foram cultivadas até atingir 80% de confluência celular. As células foram então separadas com tripsina-EDTA (TrypZeanº EDTA, Lonza BioWhittakerº). A atividade de tripsina foi neutralizada por Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS). As células foram contadas e replaqueadas para uma cultura adicional. O meio de cultura foi substituído a cada 2 a 3 dias até atingir 80% de confluência celular. Células- tronco mesenquimais (MSC) foram destacadas conforme descrito acima.

1.2 Células e Cultura Celular de Formação Óssea Derivadas de MSC e Preparação de Plasma

[270] Conforme descrito acima, 20 a 60 mL de medula óssea heparinizada (BM) foram obtidos da crista ilíaca de 8 voluntários humanos saudáveis. Após coleta, a medula óssea foi semeada em frascos de cultura a uma densidade fixa de glóbulos brancos (50.000 células/cm?) e cultivada tanto para: - obter células B de formação óssea derivadas de MSC: um meio de cultura — convencional! — suplementado —com plasma tratado com solvente/detergente (S/D) 5% v/v (Octaplasº, Octapharma AG, origem humana), 0,1 IU/mL de heparina (Heparin LEO, LEO Pharma SA, Bélgica, lote A17605), fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) e fator de crescimento transformador beta (TGFB1); - obter células Z de formação óssea derivadas de MSC: um meio de cultura convencional suplementado com plasma tratado com solvente/detergente (S/D) 5% v/v (Octaplasº, Octapharma AG, origem humana) e fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2); como - obter células A de formação óssea derivadas de MSC: um meio de cultura — convencional! — suplementado —com plasma tratado com solvente/detergente (S/D) 5% v/v (Octaplasº, Octapharma AG, origem humana) e fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) e fator de crescimento transformador beta (TGFRB1).

[271] As células foram cultivadas em atmosfera umidificada a 37ºC contendo 5% de CO». Permitiu-se a fixação de MSC antes de uma alteração de meio inicial. A mídia foi alterada a cada 3 ou 4 dias. No final da cultura primária, as células foram destacadas, usando solução de tripsina/EDTA por 1 a 5 mina 37ºC, contadas e replaqueadas para cultura secundária em frascos de cultura no mesmo meio. Ao final da cultura secundária, as células de formação óssea derivadas de MSC foram coletadas e lavadas com PBS.

1.3 Caracterização de Células /n Vitro

1.3.1. Contagem de Células e Viabilidade

[272] A densidade celular e viabilidade foram determinadas com o uso de um ensaio de exclusão com azul de tripano. Após coleta, as células foram diluídas 1:2 com Azul de Tripano (0,4%, Lonza BioWhittakerº) e a viabilidade celular foi analisada com o uso de uma câmara Búrker (Sigma-Aldrichº) e um microscópio invertido (AE31, Moticº). A viabilidade celular também foi analisada por citometria de fluxo com o uso de Amino-Actinomycin D (7-AAD, BD Biosciencesº), os softwares BD FACSCanto II'"” e BD FACSDiva"Y (Becton Dickinsonº). Após coleta, 50.000 células foram incubadas no escuro por 10 min em temperatura ambiente em PBS-albumina de soro bovino 1% (BSA) (Lonza BioWhittakerº) com 2,5 uL de 7-AAD.

1.3.2 Expressão de Marcador

1.321 —Análisede Citometria de Fluxo

[273] Células de formação óssea derivadas de MSC obtidas após cultura secundária, conforme descrito na Seção 1.1 acima, foram coletadas e os marcadores de superfície celular foram analisados por citometria de fluxo (BD FACSCanto II"Y e os softwares BD FACSDivatY; Becton Dickinson, EUA). As células foram incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais conjugados: anti-CD73, anti-CD90, anti-CD105 e anti-CD166 (que são marcadores mesenquimais, e devem ser altamente, expressos pelas MSC ou células derivadas de MSC), anti-CD3, anti-CD34 e anti-CD45 (que são marcadores hematopoieticos, e devem estar substancialmente ausentes das MSC ou células derivadas de MSC), anti-CD44, anti-CD 51/61, anti-CD49a-e, anti-CD29 (que são marcadores de adesão), anti-CD40, anti-CD86 e anti-HLA-DR (que são marcadores de imunogenicidade), e fosfatase alcalina (ALP) por 15 min em temperatura ambiente, e então lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da centrifugação e ressuspensão em 0,3 mL de PBS.

[274] Para a caracterização de marcadores de superfície celular CD105, CD73, CD10 e CD44, 50 000 células em uma concentração de 1 x 10ºcélulas/mL em PBS - BSA 1% foram incubadas 10 min no escuro com 5 uL de anticorpos. Após esse tempo de incubação, as células foram lavadas uma vez com PBS. Os diferentes anticorpos usados para coloração extracelular são os seguintes: anticorpos conjugados com aloficocianina (APC) contra CD105 (BD Biosciencesº, Cat nº: 562408), CD73 (BD Biosciencesº, Cat nº: 560847), anticorpos conjugados com Ficoeritrina (PE) contra CD10 (BD Biosciencesº, Cat nº: 555375), CD44 (BD Biosciencesº, Cat nº: 550989). A coloração não específica foi determinada incubando células com imunoglobulina G (IgG) de controle conjugada com FITC, APC e PE (todos da BD Biosciencesº, Cat nº: 556649; 555751; 556650 respectivamente). Antes da análise, foi realizado o gating de singuletos e população de interesse. A análise da citometria de fluxo foi realizada em 10 000 eventos da população gated com o uso dos softwares FACS Cantoll (BD Biosciencesº) e FACS Divaº 8.0 (BD Biosciencesº). As configurações de parâmetros usados para a análise foram realizadas automaticamente com microesferas (BD CompBeads Plusº, Cat nº 560497). Para cada conjugado, o corte de positividade foi fixado em 1% da positividade do anticorpo controle de isotipo e a positividade de cada marcador foi determinada. A mediana de intensidade de fluorescência (MFI) de toda a população analisada também foi determinada e dividida pela MFI do anticorpo controle de isotipo correspondente para obter a MFI normalizada (nMFI).

Tabela 1 Visão Geral de Fornecedores e Números de Catálogos de Anticorpos Usados nos Exemplos catálogo catálogo

1.3.2.2. Coloração de ALP

[275] As células são plaqueadas no final do processo de fabricação a

60.000 células/cm? em seu respectivo meio de cultura e colocadas em incubadora umidificada (37ºC - 5% de CO2). A coloração ALP é realizada após 24 horas em células aderentes. As células são fixadas com acetona tamponada com citrato e incubadas com solução de coloração ALP composta por 4% v/v de naftol AS-MX fosfato alcalino (Sigma; ref: 855) e 96% v/v de solução salina RR azul rápido (Sigma; ref: FBS25) por 30 minutos no escuro.

1.3.2.3. Medição de Atividade Enzimática de ALP

[276] A atividade enzimática de ALP foi medida por um ensaio bioquímico baseado na hidrólise do p-nitrofenil fosfato (DNPP). Depois de ser desfosforilado pela ALP, o pNPP torna-se amarelo e pode ser detectado por um espectrofotômetro a 410 nm. A atividade enzimática de ALP das células é determinada em relação a uma curva padrão baseada na atividade da fosfatase alcalina intestinal de bezerro purificada. A atividade de ALP é relatada em Unidade de ALP/mg de proteína. Uma unidade de ALP hidrolisa 1 umol de pDNPP em 1 minuto a 37ºC.

1.3.3. Transcrição Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (RT-qPCR)

[277] Após coleta, as células foram armazenadas a -80ºC como péletes secos (500.000 células) até a extração de RNA. RNAs totais foram extraídos com o uso do Mini kit RNeasyº (Qiagenº) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi medida com o uso de DropSenseº 16 (Trineanº). À RT foi realizada a partir de 1 ug de extratos de RNA total, com o uso do kit de reagente RT PrimeScriptº (Takaraº), de acordo com as instruções do fabricante. QPCRs foram realizadas com o uso de Premix Ex Tagº (Takaraº) a partir de 2 uL de cDNA seguindo as instruções do fabricante. Foram quantificados os níveis de expressão dos seguintes genes de interesse: Foram quantificados os níveis de expressão dos seguintes genes de interesse: RUNX2 (Forward: GGTTCCAGCAGGTAGCTGAG (SEQ ID NO: 1), Reverso: AGACACCAAACTCCACAGCC (SEQ ID NO: 2), SOX9 (F:TAMAGGCAACTCGTACCCAA (SEQ ID NO: 3), R: ATTCTCCATCATCCTCCACG (SEQ ID NO: 4), BMP2 (F:GGAACGGACATTCGGTCCTT (SEQ ID NO: 5), R:CACCATGGTCGACCTTTAGGA (SEQ ID NO: 6)), ALPL (F:ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG (SEQ ID NO: 7), R: AGACATTCTCTCGTTCACCGCC (SEQ ID NO: 8)), MMP13 (F:TGGAATTAAGGAGCATGGCGA (SEQ ID NO: 9), R: AACTCATGCGCAGCAACAAG (SEQ ID NO: 10)), CHISLI(F:TGGGTCTCAAAGATTTTCCAAGA (SEQ I|D NO: 11) R GCTGTTTGTCTCTCCGTCCA (SEQ ID NO: 12)), DCN (F:AMAATGCCCAAAACTCTTCAGG (SEQ ID NO: 13), R:GCCCCATTTTCAATTCCTGAG (SEQ ID NO: 14)), OCN (F:AAGGTGCAGCCTTTGTGT (SEQ ID NO: 15), R:GCTCCCAGCCATTGATACAG (SEQ ID NO: 16)), SPON1 (F:CCTGCGGAACTGCCAAGTA(SEQ ID NO: 17), R:CACGGGTGAGCCCAATTCT (SEQ ID NO: 18)), POSTN

(F:TTTGGGCACCAAAAAGAAAT (SEQ ID NO: 19), R:TTCTCATATAACCAGGGCAACA (SEQ ID NO: 20)) qPCRs foram executadas em duplicatas com o uso de um LightCyclerº 480 (Rocheº). A normalização foi realizada com o uso da média geométrica obtida de três genes housekeeping: RPLI3A (FICATAGGAAGCTGGGAGCAAG (SEQ ID NO: 21), R:GCCCTCCAATCAGTCTTCTG (SEQ ID NO: 22)), TBP (F:AACAACAGCCTGCCACCTTA (SEQ ID NO: 23), R:GCCATAAGGCATCATTGGAC (SEQ ID NO: 24)), HPRT (F:CCCTGGCGTCGTGATTAGT (SEQ ID NO: 25), R: GTGATGGCCTCCCATCTCCTT (SEQ ID NO: 26)). A comparação entre as diferentes células derivadas de MSC dos mesmos doadores foi realizada calculando a expressão gênica (razão de mudança (fold change)) com o uso do método 2-AACt para cada gene de interesse (Schmittgen e Livak, 2008, 3(6), 1101-8; Nature Protocols, 3(6), 1101-1108).

[278] A análise estatística foi realizada com o uso do software JMPº (13.1.0). Os dados de RT-QPCR expressos na razão de mudança foram transformados em log e os testes de Student (com a = 0,05) foram realizados para avaliar a significância estatística das diferenças observadas entre os tipos celulares.

[279] A significância estatística foi representada graficamente, dependendo do valor-p (p) obtido: * para p < 0,05, ** para p < 0,01 e *** para p < 0,001.

1.3.4. Ensaio Multiplex

[280] Após coleta, as células foram plaqueadas a uma densidade de 50.000 células/cm?. Após 48 horas de incubação a 37ºC C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO», os sobrenadantes da cultura celular foram coletados, centrifugados (5 min a 1500 rom em temperatura ambiente) e armazenados a -80ºC. Os sobrenadantes foram analisados pelo ensaio Luminexº com o uso dos Ensaios Human Magnetic Luminexº (R&D Systemº). O Multiplex pré-misturado foi feito sob encomenda (R&D Systemº). Foram investigados os seguintes fatores secretados: BMP-2, COL1A1, MMP13, OPN,

OPG, SPARC, RANKL, CHI3L1. O ensaio foi realizado seguindo as instruções do fabricante e as análises foram realizadas com o uso do Sistema MAGPIXº (R&D Systemº) e do Software Bio-Plex Manager 5.0TM (Bio-Radº).

1.4 Medição do Tamanho Celular

[281] As células de formação óssea derivadas de MSC obtidas após cultura secundária, conforme descrito na Seção 1.1, foram coletadas e suspensas em PBS com azul de tripano 0,4% a uma densidade celular de 12,5 x 106 células por mL. 10 ul da suspensão celular foram colocados em uma lâmina graduada (Moticº) e então protegidos por uma lamínula a ser colocado sob um microscópio invertido com ampliação de 40X (AE31; Motic). As imagens obtidas com uma câmera (Moticam) colocada no microscópio foram analisadas pelo software Motic Image Plus 2.02 para medir os diâmetros celulares. Pelo menos cem células foram medidas para considerar a análise estatisticamente significativa.

[282] O tamanho das células de formação óssea derivadas de MSC obtidas em diferentes momentos da cultura ex vivo também foi analisado por citometria de fluxo (softwares BD FACS Canto II"'" e BD FACS DivaTY; Becton Dickinson SA). Brevemente, nos dias 21, 23, 26 e 28, após o início da cultura celular ex vivo, conforme descrito na Seção 1.1, as células foram coletadas, suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma densidade celular de 1,106 células por mL e analisadas com o citômetro de fluxo quanto à dispersão de luz anterior (FSC) (expressa em unidade de fluorescência relativa). A dispersão anterior mede a luz dispersa na direção do caminho do laser e, portanto, fornece um tamanho relativo para as células que passam pela câmara de fluxo.

2. "Resultados

2.1 Perfil de Expressão do Marcador Celular

[283] A análise de citometria de fluxo revelou que as identidades celulares baseadas nos perfis de expressão do marcador de superfície celular das células A de formação óssea (geradas com FGF-2 e TGFRB-1) e das células B de formação óssea (geradas com FGF2, TGFRB1 e heparina; realização da presente invenção) foram comparáveis.

[284] As populações de células A e B de formação óssea expressaram os marcadores mesenquimais CD73, CD90, CD105, CD63, CD166 e não expressam os marcadores hematopoiéticos CD45, CD34 e CD3 (menos de 5% da população celular expressaram esses marcadores) (Tabelas 2 e 3). As células B (i) de formação óssea continuaram a expressar baixos níveis de receptor de superfície celular MHC classe |l, como HLA-DR e (ii) ALP altamente expressa. A fraca imunogenicidade representada pela fraca expressão de HLA-DR permite vantajosamente o transplante de células, por exemplo, para sujeitos alogeneicos (Tabela 5). Além disso, células A de formação óssea e células B de formação Óssea expressaram altamente os marcadores de adesão CD49%e, CDI e a enzima ALP em sua superfície em comparação a MSCs indiferenciadas (Tabelas 3 e 4) A alta expressão desse último marcador (ALP) destaca o comprometimento com a linhagem osteoblástica de células de formação óssea. Além disso, a alta expressão de ALP evidencia o comprometimento das células B de formação óssea com a linhagem osteoblástica (vs. MSCs indiferenciadas).

A Tabela 6 também mostra que a expressão de ALP foi mais alta para células cultivadas na presença de heparina (células B de formação óssea) do que para as células cultivadas na ausência de heparina (células A de formação óssea). Tabela 2 Perfil de Expressão de Marcador de MSC e Populações de Células de Formação Óssea Derivadas de MSC Expressão de MSCs Células Z de Células A de Células B de Marcador % formação formação formação (Média + SD) Óssea geradas | óssea geradas | óssea geradas com FGF-2 com FGF-2 e com FGF-2, TGFRB1 TGFRB1e heparina

Expressão de MSCs Células Z de Células A de Células B de Marcador % formação formação formação (Média + SD) Óssea geradas | óssea geradas | óssea geradas com FGF-2 com FGF-2 e com FGF-2, TGFRB1 TGFB1e heparina Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; APC: aloficocianina; FGF-2: Fator de crescimento de fibroblastos 2; FITC: Isotiocianato de fluoresceína; HLA-DR: antígeno leucocitário humano - isotipo DR; MSC: células-tronco mesenquimais; NA: não disponível; ND: não determinado; PE: ficoeritrina; SD: desvio padrão; TGFB1: fator de crescimento transformador beta 1 Tabela 3 Perfil de Expressão de Marcador de Superfície Celular de MSC e Populações de Células de Formação Óssea Derivadas de MSC Expressão Células A de | Células B de de Marcador MSCs formação formação (em %) Óssea Óssea cpr3.ape | Média | roma joao nono sm joe a aa

Expressão Células A de | Células B de de Marcador | Estatísticas MSCs formação formação (em %) Óssea Óssea CT TT Tm e e no | as as : [re | o | as oo CA e oC AL l E e Dr o go v es a o so

NL E E | ermPIDA- | so em av | ar | ss

LR E

Expressão Células A de | Células B de de Marcador | Estatísticas MSCs formação formação (em %) Óssea Óssea a das | es Ca a e [mes | os | ar no a a a [us | ss | ss | ss Padrão 14 0,4 1,5 Ag CG Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; APC: aloficocianina; FITC: isotiocianato de fluoresceína; HLA-DR: antígeno leucocitário humano isotipo DR; HLA- DR/DP/DQ: Antígeno Leucocitário Humano- isotipos DR/DP/DQ; MSC: células- tronco mesenquimais; ND: não determinado; PE: ficoeritrina; SD: desvio padrão Tabela 4 Níveis de Expressão de ALP de MSC e de População de Células de Formação Óssea Derivada de MSC Avaliadas por Diferentes Métodos Células A de | Células B de formação formação Óssea óssea Positividade Média & [Sw 6 População de Superfície

Células A de | Células B de Estatísticas formação formação Óssea óssea pe gua UÉ ESSO Atividade | Média | 176,3 671,9 874,7 Enzimática SD 252,9 305,8 772,9 de ALP (mU/mg de proteína 3 26 total) Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; MSC: células-tronco mesenquimais; ND: não determinado; nMFI: mediana normalizada de intensidade de fluorescência; PE: ficoeritrina; SD: desvio padrão Tabela 5 Comparações da Expressão do Marcador de Superfície HLA-DR de Imunogenicidade (FACS) em Células de Formação Óssea Derivadas de MSC com o Uso de Diferentes Condições de Cultura HLA-DR (%) População celular média + SD Células Z de formação óssea geradas com FGF2 63 + 20 (N=10) Células A de formação óssea geradas com FGF-2 e 6 + 6 (N=22) TGFRB1 Células B de formação óssea geradas com FGF-2, 3+2(N=8) TGFRB1 e heparina Células A de formação óssea geradas com FGF-2 e 1,0 + 0,6 (N=12) TGFR1 Células B de formação óssea geradas com FGF-2, 1,8 + 2,0 (N=22) TGFR1 e heparina

Abreviações: FGF-2: fator de crescimento de fibroblastos 2; HLA-DR: antígeno leucocitário humano - relacionado ao antígeno D; MSC: células-tronco mesenquimais; SD: desvio padrão; TGFB1: fator de crescimento transformador beta 1 Tabela 6 Níveis de Expressão de ALP de MSC e Populações de Células de Formação Óssea Geradas em Diferentes Condições de Cultura % de células enz.

ALP células ALP intra* (MIU/mg de | Coloração População celular ALP* (citometria de proteína de ALP (citometria fluxo) total) de fluxo) MSCs (controle) 20 +7 19+13 108 + 86 NA (N=13) (N=11) (N=2) Células rá de 70 +19 63 + 22 877 + 680 1,8 +0,4 formação Óssea (N =17) (N=10) (N=6) (N=23) geradas com FGF2 Células A de 69 +18 59 + 22 495 + 466 1,2+0,4 formação Óssea (N=16) (N=10) (N = 17) (N=13) geradas com FGF-2 e TGFRB1 Células B de 91+8 80 + 13 1.016 + 685 2,0 +0,0 formação óssea | (N=10) (N=8) (N=14) (N = 22) geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; FGF-2: fator de crescimento de fibroblastos 2; MSC: células-tronco mesenquimais; AN: não disponível; TGFB1: fator de crescimento transformador beta 1

[285] O perfil de expressão do marcador de superfície celular não se caracterizou somente pela presença de marcadores na superfície celular (porcentagem de positividade de população), mas também analisando a quantidade de marcadores expressos na superfície celular (mediana normalizada de fluorescência da população) de diferentes marcadores. Estas análises destacaram algumas diferenças entre as diferentes células de formação óssea derivadas de MSC.

[286] Células B de formação óssea cultivadas na presença de heparina expressaram nível mais alto de ALP do que MSCs e células A de formação óssea cultivadas na ausência de heparina (Tabela 7, resultados de ALP-PE nMFI) confirmando o comprometimento com a linhagem osteoblástica de células de formação óssea.

[287] A expressão dos marcadores mesenquimais CD73 e CD105 na superfície celular também depende dos tipos celulares. Células de formação Óssea geradas na presença de heparina (células B de formação óssea) expressaram nível mais alto de CD73 e CD105 do que as células A de formação óssea (Tabela 7).

Tabela 7 Resultados de Expressão de Marcador de Superfície Celular de MSC e Populações de Células de Formação Óssea Derivadas de MSC Expressão Células A de | Células B de de Marcador MSCs formação formação (em nMFI) Óssea óssea | | a o l o

Expressão Células A de | Células B de de Marcador | Estatísticas MSCs formação formação (em nMFI) Óssea Óssea E o E CT TT ww e ss | es ss a a a e o es as v es ar [as sz HLA-ABC- Ca TT a 1 + e o sz as | enrere [so [E Ts mw go Abreviações: ALP: fosfatase alcalina; APC: Aloficocianina; FGF-2: fator de crescimento do fibroblasto 2; FITC: Isotiocianato de fluoresceína; HLA-ABC: Antígeno Leucocitário Humano ABC; MSC: células-tronco mesenquimais; NA: não disponível; ND: não determinado; PE: ficoeritrina; SD: desvio padrão; TGFB1: fator de crescimento transformador beta 1

2.2 RT-qgPCR e Ensaio Multiplex

[288] A análise revelou que os genes RUNX2, SOX9, ZNF521, ALPL, BMP2, OPG, POSTN, CHISL1, MMP13, CADM1, CX43, CD10, WISP1 que codificam marcadores osteocondroblásticos, e os genes DCN, SPON1 que codificam proteínas da matriz óssea e cartilaginosa foram significativamente superexpressas nas células A e B de formação óssea, em comparação às MSCs (Tabela 8). Consistentemente, a expressão gênica de DKK1 que codifica um inibidor de osteocondrogênese foi significativamente infrarregulada nas células

A e B de formação óssea, em comparação às MSCs (Tabela 8).

[289] A expressão de genes KI67 e PCNA que codificam marcadores de proliferação foi significativamente infrarregulada em ambas as células A e B de formação óssea em comparação às MSCs, e a expressão gênica de marcadores relacionados à apoptose BCL2 e BAX foi equivalente em todos os tipos celulares (Tabela 8).

[290] Ao comparar com as células A de formação ósseas, as células B de formação ósseas (significância estatística representada graficamente dependendo do valor-p (p) obtido: * para p < 0,05 para, ** p <0,01 e *** parap < 0,001): - expressaram níveis mais altos de gene PPARG (***) (que codifica uma proteína envolvida na adipogênese); - expressaram níveis mais altos de genes CD73 (***), BMP2 (***) (que codifica proteínas osteocondroblásticas); - níveis mais baixos expressos de genes COL1IA1 (***), BGN (**), SPARC (*“*, ALPL (5), BCL2 (“*) (que codifcam proteínas osteocondroblásticas).

[291] Em relação aos genes que foram superexpressos nas células B de formação óssea em comparação às células A de formação óssea, PPARG, MMP13, BMP2 também foram significativamente superexpressos nas células B de formação óssea em comparação às MSCs, enquanto CD73 teve o mesmo nível de expressão nas células B de formação óssea e nas MSC.

[292] Em relação aos genes que foram infrarregulados nas células B de formação óssea em comparação às células A de formação óssea (isto é, COL1A1, BGN, SPARC, BCL2), todas eles tiveram o mesmo nível de expressão nas células B de formação óssea do que nas MSC, exceto ALPL que ainda foi superexpresso nas células B de formação óssea em comparação às MSC.

Tabela 8 Perfil de Expressão Gênica de MSC e Populações de Células de Formação Óssea derivadas de MSC (Expresso em Razão de Mudança (Fold Change)

em Relação aos Valores Médios de MSCs - a Significância Estatística é Representada Graficamente, Dependendo do Valor-p (p) Obtido: * para p < 0,05; ** para p < 0,01; *** para p < 0,001; NS: Estatisticamente Não Significativo) Expressão gênica (razão Células A | Células B de mudança em de de . Estatísticas MSCs - - relação aos formação | formação valores médios Óssea Óssea de MSC) [as | o | ss 176 RF | | FO [ee | Tm | ae | se CET 3 | [ae | 5 ass | re Genes mestres de | N | 1 a | [oe | Tm se 5 diferenciação PPARG | se | ow | 2% | 18 | a 2 | Média | 145 | 49857" | 6388" aNFsAt | SD | 18 | 291 | sm a | PK | média | 100 | oo | oo |

Expressão gênica (razão Células A | Células B de mudança em de de Estatísticas MSCs relação aos formação | formação valores médios Óssea Óssea de MSC)

E E es | 1 | 3 |

LR NC NS E ae) To 65 | 0657) E | 7 | | [as | o | are 12566 e e] es) Marcadores LN | 1º | [as | o | se | ram relacionados à matriz 79 extracelular a 2a | Média | tor | 22Tt | ostas SPARC | sn | eis | osso | os | o aa | Média | 111 | 8240NS)| 14307 | So | os | 29 | 16536 a | Média | 1025 | 129009) EEN se 22 | ess | ess | a a

Expressão gênica (razão Células A | Células B de mudança em de de Estatísticas MSCs relação aos formação | formação valores médios Óssea Óssea de MSC) [| 8 | 7 | | CRT a | [Ee | a] 7 CE 7 3 | es | im Tese [ros eos [ae | e | 35 es se za | e) E | 7 | 7 CR 7 3 | [e | Tm | ne | ne CR TT 3 | mm [HE | GT | ae] = a e e =)

Expressão gênica (razão Células A | Células B de mudança em de de Estatísticas MSCs relação aos formação | formação valores médios Óssea Óssea de MSC) LT | CE TT 3 | [8 | 7 | Cs da | | Média | aro | orem | oram | e | r 1 | [ae | o | 5 Torn) arcadores 2a associados à To 1995 apoptose | Média | tor | es | reem | BAX | SD | os | o18 | 243 | a a

[293] A análise da secreção celular mostrou que as células B de formação óssea secretaram quantidades mais altas de proteínas CHISL1 e MMP13 envolvidas na osteocondrogênese, do que as células A de formação óssea e MSCs (Tabela 9) e secretaram menor quantidade de DKK1 envolvida na inibição da osteogênese do que as células A de formação óssea e MSC. Não foi observada diferença significativa entre os tipos celulares para a quantidade de COL1A1 secretada (Tabela 9). Tabela 9 Perfil de Secreção de MSC e Populações de Células de Formação Óssea Derivadas de MSC (Expresso em Razão de Mudança (Fold Change) em Relação aos Valores Médios de MSCs - Significância Estatística é Representada Graficamente, Dependendo do Valor-p (p) Obtido: * para p < 0,05; ** para p < 0,01; *** para p < 0,001; NS: Estatisticamente Não Significativo) Secreção de 1 Células A de Células B de | Média 5737) = 7asa2dNs) | 792166(NS) (| GOLA sp sas | aBega tese | Na média eme | seo jar 7a | 2528To | | NC A a | Média | 3679 aeza (ns) | ent

EEE ELE

ESSE MNP13 so Ns a

2.3 Tamanho Celular

[294] As medições de tamanho celular com o uso do (i) software Motic

Image Plus 2.0/3.0 e (ii) análise de citometria de fluxo FSC confirmaram que as células de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina (células B de formação óssea) são menores e mais homogêneas do que as células de formação óssea derivadas de MSC geradas com FGF-2 e TGFB1 - sem heparina (por exemplo, células A de formação óssea) (Tabelas 10 e 11, Figuras 1 e 11).

[295] De modo muito interessante, a grande maioria das células B de formação óssea (2 70%) não excedem 25 um de diâmetro e < 5% delas excedem um de diâmetro (Tabelas 8 e 9). Em contraste, a população celular de formação óssea obtida sem fornecimento de heparina (células A de formação óssea A) inclui apenas 20% das células que não excedem 25 um de diâmetro e 41% das células com um diâmetro maior que 35 um (Figura 1 e Tabela 10). Conforme ainda detalhado no Exemplo 3, essas células de diâmetro grande poderiam ser prejudiciais à implantação no sujeito.

Tabela 10 Distribuição de Tamanhos de Células de Células A e B de Formação Óssea Células A de formação óssea 20% 41% geradas com FGF-2 e TGFRB-1 am Células B de formação óssea geradas com FGF-2, TGFRB-1 e 70% 5% heparina Abreviações: FGF-2: fator de crescimento de fibroblastos 2; TGFB1: fator de crescimento transformador beta 1 Tabela 11 Distribuição de Tamanho de Célula de MSCs e Células de Formação Óssea Derivadas de MSC

Células A de formação óssea 35,4% 26,9% Células B de formação óssea 73,7% Abreviações: MSC: células-tronco mesenquimais Tabela 12 Diâmetro de MSC e Células de Formação Óssea Derivadas de MSC Diâmetro da célula (um) Média + SD (N) | Mn-máx | 22,4 +4,9 MSC (controle) 13,6 - 38,0 (N=101) Células A de formação óssea 34,1 + 9,9 15,9-67 geradas com FGF-2 e TGFRB1 (N = 699) : Células B de formação óssea 23,3 +6,8 geradas com FGF-2, TGFB1 e 12,1 - 74,5 (N = 1170) heparina Razão (Células B de formação óssea / Células A de formação 0,68 Óssea) Abreviações: FGF-2: fator de crescimento de fibroblastos 2; MSC: células- tronco mesenquimais; SD: desvio padrão; TGFEB1: fator de crescimento transformador beta 1 Tabela 13 Diâmetro de MSCs e células de formação óssea derivadas de MSC Diâmetro da célula (um) | Média +SD | Min. - Máx. [an] Células A de formação , 30,2 + 9,9 114-67 1205 Óssea Células B de formação . 224+6,4 7,9-74,5 1744 Óssea Abreviações: MSC: células-tronco mesenquimais; DP: desvio padrão

[296] Experimentos de citometria de fluxo FSC foram usados para avaliar o tamanho médio relativo das células B de formação óssea geradas com FGF-?, TGFB1 e heparina em diferentes pontos no tempo na cultura in vitro e, portanto, em diferentes confluências celulares, especialmente 45%, 70%, 90% e 100% de confluência. A Tabela 14 mostra que o tamanho celular das células B de formação óssea é estável e eventualmente aumenta com a confluência da cultura celular. Em outras palavras, a Tabela 14 mostra que o tamanho médio das células B de formação óssea de um frasco de células mais confluentes é maior do que aquelas de um frasco de cultura menos confluente. Deve-se notar que os experimentos de citometria de fluxo FSC permitem comparar o tamanho médio das células de diferentes amostras sem, no entanto, fornecer informações sobre os valores absolutos do tamanho médio das células.

Tabela 14 Valor de Citometria de Fluxo FSC das células B de Formação Óssea Coletadas em Diferentes Pontos no Tempo e Confluência Durante Cultura In Vitro TESE em eco Confluência fluorescência média cultura celular relativa

LER Exemplo 2 Especificidade do Método para Preparar Células Derivadas de MSC do Exemplo 1

1. “Procedimentos Experimentais 11 Cultura Celular e Preparação de Plasma

[297] A cultura celular e a preparação de plasma foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1.

[298] Para os experimentos relacionados à comparação entre heparina e análogos da mesma, o meio de cultura convencional foi suplementado com (i) plasma S/D 5% v/v; (ii) FGF-2 básico; (iii) TGFB1; e (iv) 0,1 IU/mL de heparina não fracionada (UFH), dalteparina, sulfato de hepano ou danaparoide,

[299] Para os experimentos relacionados à comparação entre heparina e outros anticoagulantes, o meio de cultura convencional foi suplementado com (i) plasma S/D 5% v/v; (ii) FGF-2 básico; (iii) TGFB; e (iv) 1 IU/mL de heparina (Heparin LEO, LEO Pharma SA, Bélgica, lote A17605), 100 IU/mL de heparina, 2 mg/ml de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) ou 0,1 mg/mL de Actilyseº.

[300] Para os experimentos relacionados à comparação entre plasma S/D e soro, o meio de cultura convencional foi suplementado com (i) plasma S/D 5% vv ou soro 5%; (ii) FGF-2 básico; (iii) TGFB; e (iv) 1 IU/mL de heparina.

[301] Para os experimentos relacionados à comparação entre a presença ou ausência de plasma S/D ou soro, o meio de cultura convencional foi suplementado com (i) plasma S/D 5% v/v, soro 5% v/v ou plasma SD 0% e soro SD 0%; (ii) FGF-2 básico; (iii) TGFB; e (iv) 0,1 IU/mL de heparina.

2. Resultados

2.1 Heparina vs Análogos da Mesma

[302] A Figura 2 e a Tabela 15 mostram que a heparina presente no meio de cultura pode ser substituída por derivados da mesma (compostos heparinoides), especialmente por dalteparina, sulfato de hepano ou mistura de glicosaminoglicanos, como danaparoide, que inclui sulfato de hepano. Os 4 derivados de heparina têm os mesmos efeitos sobre a viabilidade celular e perfil de expressão de marcador que a heparina (Tabela 15).

Tabela 15 Células de Formação Óssea Derivadas de MSC Geradas com o Uso de Diferentes Heparinoides: UFH, Dalteparina, Danaparoide e Sulfato de Heparano; Usados a 0,1 IU/mL

Viabilidade HLA- CD73 CcD90 | cD3 CD45| DR |cD40 | CD86| ALP | se | Heparina 97 +2(N=4) (N=4)|(N=4)|(N=4)| (N=4)| (N=4)|(N=3)|(N=4)|(N=4)| (N=4) | eres | Dalteparina 98 +2(N=3) ((N=3)(N=3)|(N=3)(N=3)|(N=3)|(N=3)|(N=3)|(N=3)) =3) E À 99+1/981|/0+1|223|5+4 422 /0+1 [3228915 PANARAOISS | 97+2(N=4) |(N=49)(N=4)|(N= 9) (N= 9 (N=4aIn=alin=alN=4] (N=4) Sulfato de 99H1/991|/2+3| 121 421 | 422 | 1+2 [424 | 92211 heparano —| 97 +2(N=4) |(N=4) (N=4)|(N=4)|(N=4)|(N=4)|(N=3)|(N=4)|(N=4)) (N=4) CcD51/ CD29 | CD44 | CD49a | CD49b | CD49d |CD49e ED CD54 |CD166 99+1 [98+1| 25+6 | 5387 | 7923 |97+4 5023/7019 [97+3 Heparina | feems [Soa eco íizo | eia | eco jeisajeãa) Neo aca) essere | 225 [2a nen | nos Nes es ía | ess aca) Dalteparina (N=3) |(N=3)) (N=3) | (N=3) | (N=3) |(N=3)| (N=3) | (N=3) |(N=3) 99+1 [99+1| 32+9 |69+21| 886 [982/3923 7410 /97+3 naparoide Dan | (N=4) |(N=4)) (N=4) | (N=4) | (N=4) |(N=4)| (N=4) | (N=4) |(N=4) Sulfato de | 99+1 [98+1| 32+8 |75+15| 88+3 |98+2/41+18/79+10 |98+2 heparano | (N=4) |(N=4)) (N=4) | (N=4) | (N=4) |(N=4)|(N=4) | (N=4) |(N=4)

2.2 Heparina versus Outros Anticoagulantes

[303] A Figura 3 mostra que a heparina e derivado da mesma (em uma concentração de 1 IU/mL ou 100 IU/mL) não podem ser substituídos por outros anticoagulantes, como EDTA 2 mg/mL (E8008, Sigma-Aldrich, lot RNBBB7793), Actilyseº 0,1 mg/mL (Boehringer Ingelheim, lote 001408).

2.3 Plasma versus Soro

[304] A Figura 4 mostra que o plasma S/D pode ser substituído por soro para gerar células de formação óssea derivadas de MSC de acordo com a invenção. Em vista disso, parece que a heparina ou análogos da mesma são elementos chave no método para preparar células B de formação óssea. Exemplo 3

Capacidade de Mineralização /n Vitro de Células B Derivadas de MSC Obtidas pelo Método do Exemplo 1

1. Procedimentos Experimentais

[305] O ensaio de mineralização investiga a capacidade das células in vitro para gerar uma matriz mineralizada cultivando as mesmas em meio osteogênico por várias semanas. A matriz mineralizada será posteriormente corada com o uso de uma coloração S (ARS) vermelho de alizarina.

[306] Brevemente, as células B de formação óssea derivadas de MSC obtidas após cultura secundária, conforme descrito na Seção 1.1 do Experimento 1, foram coletadas e plaqueadas em um meio básico a-MEM (Lonza) suplementado com Penicilina-estreptomicina (Lonza) e 5% de soro por poço a

60.000 células/cm? em placa de 48 poços até atingir confluência (1 a 2 dias). Subsequentemente, o meio foi trocado por meio osteogênico compreendendo meio básico a-MEM (Lonza) suplementado com Penicilina-estreptomicina (Lonza), 5% de soro, dexametasona 10-ºM (Sigma), 50 ug/mL de ácido ascórbico (Sigma) e &-glicerofosfato 5 mM (Sigma). O meio osteogênico foi trocado a cada 3 + 2 dias por meio osteogênico recém-preparado.

[307] Uma coloração ARS foi realizada no dia 21 e dia 28 após indução osteogênica, como a seguir: as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, incubadas com formaldeído 4% em temperatura ambiente por 15 minutos, lavadas com solução salina tamponada com fosfato e, subsequentemente, lavadas com água desmineralizada. As células foram então expostas por 10 minutos em temperatura ambiente a uma solução ARS (20 g/L) pH 4,2. As células foram lavadas com água desmineralizada até que a solução de lavagem ficasse clara e observadas macroscopicamente e microscopicamente. Os poços foram colocados sob microscópio invertido (AE31; Motic). Foram analisadas imagens obtidas com uma câmera (Moticam) colocada no microscópio para avaliar a coloração laranja-vermelha de cálcio depositado nos poços.

2. Resultados

[308] As observações macroscópicas e microscópicas revelam uma coloração ARS positiva, com um aumento na coloração ARS a partir do dia 21 até o dia 28, consequentemente um aumento de deposição de cálcio/fosfato ao longo do tempo (Figura 5). Estes resultados mostram que as células B de formação óssea geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina são capazes de sintetizar a matriz óssea e mineralizá-la por deposição de cálcio e fosfato. Mais particularmente, esses resultados mostram que as células B de formação óssea apresentam altas propriedades osteogênicas.

Exemplo 4 Capacidade de Condrogênese !/n Vitro de Células B Derivadas de MSC Obtidas pelo Método do Exemplo 1

1. Procedimentos Experimentais

[309] Mediante condições de cultura específicas, as células derivadas de MSC obtidas pelo método do Exemplo 1 podem garantir a diferenciação de condrócitos. Estas condições incluem conformação tridimensional das células em agregados onde a alta densidade celular e as interações célula-célula contribuem para o mecanismo de condrogênese. Brevemente, as células B de formação óssea derivadas de MSC obtidas após cultura secundária, conforme descrito na Seção 1.1 do Exemplo 1 acima, foram coletadas e ressuspensas em meio de diferenciação condrogênica e colocadas em placas de 96 poços (fundo cônico não aderente) a uma densidade de 2,5 x 105 células/poço. O meio de cultura condrogênico consiste no Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), Alta Glicose (4,5 g/L) (DMEM-HG, Lonza) suplementado com insulina humana 10%, transferrina humana e selenita de sódio (ITS) (ITS+1, Sigma- Aldrich), piruvato de sódio 1% (Lonza), dexametasona 107M (Sigma), ácido ascórbico 1 uM (Sigma) e TGFB1 10 ng/mL de TGFB1 (HumanZyme). O item de controle negativo consistiu em um meio condrogênico sem fatores de diferenciação solúveis de dexametasona, ácido ascórbico e TGFB1. As placas multipoços foram então centrifugadas a 200 x g por 5 min para formar agregados celulares e então colocadas a 37ºC em atmosfera umidificada de 95% de ar e

5% de CO, por 3 semanas. O meio de cultura condrogênico foi trocado a cada 2 ou 3 dias. A observação macroscópica, 24 horas após a formação de agregados, mostrou que os agregados celulares estavam flutuando livremente nos meios de cultura,

[310] Três semanas após a indução da condrogênese, os agregados celulares foram coletados e processados para análise histológica: os agregados celulares coletados foram fixados em formaldeído a 3,7% e embebidos em parafina. Os blocos de parafina foram cortados em cortes de 5 um. Os cortes foram corados com o uso de (i) hematoxilina e eosina (H&E), (ii) azul de toluidina e laranja safranina para corar proteoglicanos e (ili) vermelho sirius para corar fibras de colágeno. O método consistiu em desparafinização padrão, coloração, desidratação e montagem em uma lâmina de vidro. Os cortes corados foram qualitativamente observados microscopicamente (celularidade, localização e aspecto das células, aspecto da matriz extracelular e conteúdo de colágeno e proteoglicano).

2. “Resultados

[311] Observações microscópicas e medidas de diâmetro de agregado indicaram que os agregados celulares cultivados em meio condrogênico exibiram um tamanho maior do que os agregados celulares cultivados em meio de controle (dados não mostrados). Este aumento de tamanho no meio condrogênico poderia estar associado com (1) a produção e o acúmulo de matriz extracelular pelas células e/ou (2) a proliferação celular no agregado.

[312] A observação qualitativa de cortes de agregados corados com hematoxilina e eosina mostrou diferenças na morfologia celular entre o controle e meio condrogênico (coloração H&E, Figura 6). De fato, no meio controle, micronúcleos foram observados e foi difícil observar citoplasma celular. Enquanto que no meio condrogênico, dois tipos celulares puderam ser observados, células com núcleo achatado (na periferia dos agregados) e, à medida que se afastam da periferia, células com núcleo arredondado. A diferenciação — condrogênica foi confirmada através da coloração de proteoglicanos e colágeno da matriz extracelular cartilaginosa. Em comparação, agregados de controle não mostraram coloração positiva para todas as colorações testadas (coloração azul de toluidina, laranja safranina e vermelho sirius, Figura 6).

[313] Esses resultados mostram que as células B de formação óssea geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina são capazes de produzir uma matriz extracelular abundante composta principalmente de moléculas específicas da cartilagem, como colágeno e proteoglicanos, quando cultivadas em meio condrogênico.

Exemplo 5 Segurança “In Vivo” de Células A de Formação Óssea Obtidas pelo Método do Exemplo 1

1. Procedimentos Experimentais

1.1 Cultura Celular e Preparação de Plasma

[314] A cultura celular e a preparação de plasma foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1.

Antes da administração, células A e B de formação óssea foram testadas quanto a viabilidade, tamanho celular, identidade (incluindo expressão de antígenos de superfície por análise de citômetro de fluxo, atividade enzimática de ALP e ensaio de coloração de ALP) e esterilidade.

1.2 Estudo de Toxicidade em Camundongos

[315] Camundongos NMRI-nus machos e fêmeas doze semanas de idade foram injetados por via intravenosa com um dos seguintes itens de teste: (i) células A de formação óssea (5 milhões de células suspensas em 200 uL de excipiente), (ii) células A de formação óssea (5 milhões de células suspensas em 200 uL de excipiente) com heparina (Heparin LEO 100 Ul/mL, LEO Pharma SA, lote A17605; 4 unidades) ou (iii) células B de formação óssea (5 milhões de células suspensas em 200 uL de excipiente). O item de controle consistiu em 200 uL de excipiente (isoladamente). A administração dos itens de controle e teste foi realizada em bolus lento, por injeção intravenosa na veia lateral da cauda. A duração da injeção foi de pelo menos 60 segundos. A quantidade de células e o volume administrado por animal foram constantes.

[316] Os animais foram observados por até 6 meses, e vários dos seguintes parâmetros foram monitorados e/ou avaliados durante o acompanhamento, entre outros: mortalidade e morbidade, peso corporal do animal, observações clínicas/exame físico, análise hematológica e química do sangue e coleta de órgãos para análise histopatológica após a eutanásia do animal.

1.3. Análise Histopatológica

[8317] Puimões de camundongos foram coletados para análise histopatológica. Os pulmões de camundongos coletados foram processados para uma análise histopatológica: as amostras foram desidratadas e embebidas em parafina. Os cortes foram cortados com 3 a 5 um de espessura (cortes transversais) e corados para hematoxilina e eosina. As lâminas foram submetidas a um patologista sênior para determinar a(s) causa(s) de mortalidade aguda.

2. “Resultados

2.1 Toxicidade Aquda

[318] Foi conduzido um estudo de toxicidade para avaliar os possíveis efeitos adversos da injeção intravenosa de células A de formação óssea (geradas com FGF-2 e TGFRB1) e células B de formação óssea de tamanho pequeno (geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina) em camundongos.

[319] Conforme apresentado na Tabela 16, observou-se mortalidade aguda (10 a 35%) após administração intravenosa de células A de formação óssea (A- 1 e A2) ea adição de heparina anticoagulante (4 unidades) na suspensão celular não reduziu essa mortalidade (A-3 a A-5 com heparina). Ao contrário, não foi observada toxicidade aguda após a administração intravenosa do item de controle (excipiente) e de células B de formação óssea de tamanho pequeno (B- 1aB+X4).

Tabela 16 Perfil de Tamanho Celular das Células A e B de Formação Óssea e

Toxicidade Aguda Observada após Injeção Intravenosa em Camundongos Lote de células 1a Número de o ' Ps. [ES sima E [IIS (um) aguda Óssea >30 um Ca os e o | o | sr as aos | res | Tosuazo | onto | [BR TT e 6 | ser | sena * Injeções foram interrompida após 3 animais morrerem (fora os 15 planejados). ND: não determinado

2.2 Exame Histopatológico

[320] Após eutanásia, foi realizada uma necrópsia em todos os animais. Camundongos injetados com células B de formação óssea pequenas apresentaram arquitetura pulmonar normal em geral, sem embolização celular de capilares alveolares e bronquiolares (Figura 7a). Camundongos injetados com células A de formação óssea apresentaram lesões pulmonares caracterizadas por embolização disseminada moderada a severa de capilares alveolares e bronquiolares por um alto número de células de tamanho médio (interpretadas como células injetadas) muitas vezes acompanhadas de inflamação intersticial aguda (Figura 7B): 30% a 50% dos capilares alveolares e das arteríolas bronquiolares de tamanho pequeno a médio foram aleatoriamente aumentadas por grupos de células que obstruem a totalidade do lúmen vascular. Grupos maiores de capilares obstruídos comprimiram bronquíolos nas proximidades e foram circundados por colapso alveolar. Micro-hemorragia intra-

alveolar e intrabronquiolar raramente foi observada nas proximidades de grupos de células.

[321] A principal característica de todas as amostras observadas foi a embolização disseminada moderada a severa de capilares alveolares e bronquiolares por um alto número de células injetadas (células A de formação óssea). O número dessas células, bem como o número de capilares alveolares ocluídos, sugerem que a troca gasosa nos alvéolos pode ter sido severamente perturbada, levando ao colapso do sistema respiratório. É muito provável que este processo seja responsável pela morte dos animais examinados. A congestão vascular observada e a micro-hemorragia são interpretadas como alterações agônicas.

[322] Não foi encontrado nenhum microtrombo formado no coração, fígado, rim ou baço.

Exemplo 6 Propriedades de Formação Óssea “In Vivo” de Células A de Formação Óssea Obtidas pelo Método do Exemplo 1

[323] O modelo de formação óssea de calvária consistiu em uma única administração subcutânea de 2,5 x 10º células de formação óssea formuladas em 100 uL de excipiente (ou 100 uL de excipiente isoladamente como controle negativo) sobre a calvária de camundongos NMRI-Nus fêmeas de 12 semanas de idade. Em pontos no tempo específicos, corantes fluorescentes de ligação de cálcio (isto é, vermelho de alizarina, calceína verde, calceína azul, tetraciclina) foram administrados para identificar a neoformação óssea. Vermelho de alizarina foi administrado antes da administração de células de formação óssea, enquanto que calceína verde, calceína azul e tetraciclina foram administradas após administração celular de formação óssea. Animais experimentais foram monitorados quanto ao peso corporal, sinais clínicos gerais e sinais clínicos no local de administração durante 2 semanas após a administração. Após 2 semanas, os animais experimentais foram eutanasiados para avaliar as propriedades de formação óssea das células de formação óssea por imagem de raios X, histomorfometria (quantificação da formação óssea) e imunofluorescência.

1. Procedimentos Experimentais

1.1 Cultura Celular e Preparação de Plasma

[324] A cultura celular e a preparação de plasma foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1.

1.2 Camundongos

[325] Camundongos NMRI-Nus (nu/nu) fêmeas de 9 a 10 semanas foram comprados junto à Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle, França) e alojados em condições padrão com alimento e água à vontade. Foram usados 196 camundongos no total para o presente estudo.

1.3 Modelos de Camundongo da Formação Óssea da Calvária

[326] Camundongos NMRI-Nus (nu/nu) fêmeas de doze semanas de idade (n = 137) foram anestesiados com isoflurano (IsoFloº) e receberam uma administração subcutânea única de MSC, células A de formação óssea (geradas com FGF-2 e TGFB1), ou células B de formação óssea (geradas com FGF-?, TGFB1 e heparina) (2,5 x 106 células em 100 JL por camundongo) ou excipiente (100 UuL) sobre o osso da calvaria. Para identificar a neoformação óssea ao longo do tempo, fluorocromos de ligação de cálcio foram administrados sequencialmente em camundongos. Vermelho de alizarina (vermelho), calceínas (verde e azul) e tetraciclina (amarelo) (todos da Sigma-Aldrichº) foram injetados por via intraperitoneal 3 dias antes e 4, 8 e 12 dias após a administração celular, respectivamente. Animais experimentais foram monitorados quanto ao peso corporal, sinais clínicos gerais e sinais clínicos no local de administração por 2 semanas após a administração. Os camundongos foram eutanasiados 2 semanas após administração celular por deslocamento cervical e a calvária de cada camundongo foi coletada para avaliar as propriedades da formação óssea das células de formação óssea por histomorfometria (quantificação de formação óssea) e imunofluorescência.

1.4. Amostra Incorporada e Cortes Histológicos

[327] Para histomorfometria, ALP, TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato), coloração tricrômico de Masson-Goldner e imunofluorescência, calvárias foram fixadas e desidratadas com incubações sucessivas em banho de etanol a 70%, 80% e 90%, por 12 horas cada, a 4ºC com agitação suave, e embebidas em resina plástica de hidroxietilmetacrilato (HEMA) (HistoResin, Leicaº). Cortes coronais de 7 um de espessura e 8 uM de espessura foram cortados usando um micrótomo (Leicaº, RM2255). Para coloração safranina- laranja e imunoperoxidase, foram fixadas calvárias em formaldeído 3,7% por 24 horas, descalcificadas em ácido etilenodiamino tetra-acético 10% (EDTA) pH 7,4 por três dias e embebidas em parafina. Cortes coronais e sagitais de 7 um de espessura foram cortados usando um micrótomo (Leicaº, RM2255).

1.5. Coloração de Imunofluorescência

[328] A avaliação do colágeno | humano e murino por imunofluorescência foi realizada em cortes histológicos de plástico coronal de 4 um de espessura de calvária. Brevemente, após uma etapa de permeabilização com o uso de uma solução de PBS 1X/Triton 0,3% por 30 min em temperatura ambiente (RT), os cortes histológicos foram incubados por 1 hora em RT na solução de bloqueio (isto é, PBS/BSA/soro de cavalo/Triton'YM) para saturar os sítios de ligação não específicos. As lâminas histológicas foram então incubadas durante a noite a 4ºC com anticorpos primários de coelho anti-colágeno | murino e anti-humano de camundongo (Abcam; nº ab138492 e Abcam; nº ab21286, respectivamente). Após 3 etapas de enxágue em PBS por 5 min. à RT, o bloqueio foi realizado com a solução de bloqueio por 1 hora à RT. Os anticorpos secundários diluídos na solução de bloqueio foram então adicionados por 2 horas à RT protegidos da luz. O anticorpo secundário de burro anti-lgG de coelho H&L Alexa Fluorº 488 (ThermoFisher, nº A21206) e Alexa Fluor? Cy3º e de cabra anti-lgG de camundongo H&L (Abcam; nº ab97035) foram usados para visualizar o colágeno | murino em verde e o colágeno | humano em vermelho, respectivamente. As lâminas foram então enxaguadas 3 vezes em PBS 1X por 5 min em RT e incubadas com solução NucBlueº por 1 min em RT para corar o núcleo.

Finalmente, as lâminas foram rapidamente enxaguadas uma vez em PBS e, em seguida, montadas no reagente Glycergelº. Como controle negativo de imunofluorescência, foi realizada a omissão de anticorpo primário na lâmina histológica adjacente.

1.6 Coloração Histológica

[329] As atividades osteoblásticas e osteoclasásticas foram avaliadas nos cortes de calvárias, respectivamente, usando métodos de detecção de atividade enzimática de ALP e TRAP, respectivamente. Para coloração ALP, cortes coronais de plástico de calvária com 4 um de espessura foram incubados por 1 hora com uma solução de Sal RR azul rápido (Sigma-Aldrichº) e Naftol AS-MX fosfato alcalino (Sigma-Aldrichº). A coloração TRAP foi realizada em cortes coronais de plástico de calvária com 8 um de espessura, com o uso de Fosfatase Ácida, kit Leucócitos (TRAP) (Sigma-Aldrichº), de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar o estado de mineralização do osso neoformado, foi realizada coloração tricrômico de Masson-Goldner nos cortes de calvária corados com ALP usando um kit (Bio-Opticaº) de acordo com as instruções do fabricante. Para evidenciar a formação da cartilagem, foi realizada coloração safranina laranja em cortes sagitais de parafina com 7 um de espessura. Brevemente, após desparafinização, os cortes histológicos foram incubados sucessivamente em Hematoxilina de Weigert (Klinipathº) por 10 min, verde rápido 0,1% (Klinipathº) por 5 min, ácido acético 1% (VWR Chemicals) por 15s e safranina-laranja 0,1% (Flukaº ref: 84120) por 5 min. Após desidratação, as lâminas foram montadas com lamínulas de vidro usando Pertexº (HistoLabº). Foram tomadas imagens digitais com um microscópio óptico (Leicaº) e o software Leicaº LAS EZ.

1.77 Imunoperoxidase

[330] Após desparafinização, foram incubadas sucessivamente cortes coronais ou sagitais de calvária de 7 um com 2,5% de hialuronidase (Sigma- Aldrichº) por 30 min a 37ºC, em H202 3% (Sigma-Aldrichº) por 30 min à temperatura ambiente, em PBS contendo Triton X-100 0,3% (Sigma-Aldrichº)

por 30 minutos à temperatura ambiente e em solução de bloqueio (isto é, PBS/BSA/soro de cavalo/Triton) por 1 hora à RT à temperatura ambiente. Os cortes foram incubados durante a noite a 4ºC com anticorpos primários de camundongo anti-colágeno tipo | murino (Abcam, ab90395), anticorpos primários de coelho anti-colágeno tipo | humano (Abcam, ab21286) ou anticorpos primários de coelho anti-Ku80 (Abcam, ab80592). A coloração foi visualizada com o uso de um kit Vectastain (Vector Laboratories, PK6200) e 3,3' diaminobenzidina (Vector Laboratories), de acordo com as instruções do fabricante. Os cortes foram contracorados com Hematoxilihna de Mayer (Klinipathº). As lâminas foram montadas com lamínulas de vidro usando Pertexº.

1.8 Análises Histomorfométricas das Calvárias: Quantificação da Formação Óssea

[331] A quantificação de formação óssea (isto é, porcentagem de formação óssea) foi realizada em tecidos incorporados em plástico. As medidas da espessura inicial (mineralização basal frontal fluorescentemente marcada por vermelho de alizarina) e final (neoformação óssea fluorescentemente marcada por calceína e tetraciclina) da calvária foram medidas (em um) em seção coronal de 4 um de espessura por software de análise de imagem ZENº (Zeiss). As espessuras iniciais e finais da calvária foram então usadas para calcular a porcentagem de neoformação óssea em cada animal experimental após administração. Para cada animal, foram realizadas 4 medições de espessura inicial e final em 5 níveis independentes, com uma distância de 200 um entre cada nível. Como primeira etapa, a média da espessura inicial e final + SD (isto é, a média das 4 medidas por nível nos 5 níveis) foi calculada para cada animal. Em seguida, a porcentagem de formação óssea para cada camundongo foi calculada como a razão entre a média da espessura final e a média da espessura inicial.

1.9 Quantificação da Área Superficial de Osso Neoformado em Imagens Histológicas (Software ImageJº)

[332] Para a análise da área superficial dos nódulos de osteoindução e osteogênicos, foram obtidas imagens digitais de 6 níveis independentes a cada 2 níveis após a sutura coronal a partir de cortes histológicos de resina plástica (4 um) de calvária, com o uso de uma combinação de múltiplos filtros de fluorescência e campo brilhante do microscópio fluorescente (Zeiss Axioscope A1, Zeiss, Alemanha). Em cada nível medido, a seleção da neoformação óssea osteoinduzida foi definida manualmente nas imagens de pontos de campo brilhante usando o software ImageJº. As áreas mineralizadas e superficiais totais desta seleção foram medidas (em mm?). O mesmo procedimento foi realizado para as áreas mineralizadas e superficial total dos nódulos osteogênicos.

[333] Para a osteoindução e para os nódulos osteogênicos, a média da área superficial total e a média da área superficial mineralizada foram então calculadas por animal experimental e por grupo. A área superficial total da neoformação óssea foi finalmente calculada como a soma das áreas superficiais da osteoindução e dos nódulos osteogênicos.

1.10 Análises Estatísticas

[334] Os resultados são expressos como média + erro padrão da média (SEM). As análises estatísticas foram realizadas usando o software JMPº (SAS Institute Inc.). Para dados in vitro (citometria de fluxo, RT-GPCR e multiplex), foram realizados testes pareados-t em valores transformados log10 e, para dados in vivo, foram usados testes U de Mann-Whitney. A menos que indicado de outra forma, as diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05.

2. "Resultados

[335] Tanto as células A de formação óssea (geradas com FGF-2 e TGFRB1) como as células B de formação óssea (geradas com FGF-2, TGFB1 e heparina) mostraram significativa formação óssea mais alta do que os controles (excipiente) 2 semanas após administração (Figuras 8 a 9, Tabela 17). Mais particularmente, a Figura10 mostra que as células B de formação óssea apresentaram propriedades osteoindutivas (formação óssea homogênea de origem murina sobre a calvária) e propriedades osteogênicas (nódulos mineralizados de origem humana e murina). Tabela 17 Quantificação de Formação Óssea (%) em Fatias de Calvária de Murino. Calvária Murina Tratada com Excipiente (Controle Negativo), Células A de Formação Óssea ou Células B de Formação Óssea % de formação nº de lotes | nº de animais Óssea Média + SD FRA e Abreviações: SD: desvio padrão

[336] As propriedades osteoindutivas (isto é, quantidade de osso murino recém-formado pós-implante) foram equivalentes para as células A e B de formação óssea (Figuras 8 a 9).

[337] Muito curiosamente, as células B de formação óssea da presente invenção exibiram propriedades osteogênicas e propriedades osteoindutivas potentes, conforme mostrado pela alta quantidade de osso humano e murino pós-implante recém-formado (coloração IF Coll humana e murina, Figura 10).

[338] A presença de nódulos foi observada em 7/8 doadores e 80% de camundongos de células B de formação óssea e em 4/11 doadores e 20% de camundongos para células A de formação óssea. Nenhum nódulo foi observado após administração de MSC ou excipiente. Além de atividades de osteoindução, as células B de formação óssea promovem, assim, uma alta atividade osteogênica destacada pela presença de grandes nódulos mineralizados observados em 80% dos camundongos tratados, enquanto as células de formação óssea exibiram fraca atividade osteogênica, isto é, pequenos nódulos em somente 20% dos camundongos tratados (Tabela 18).

Tabela 18 Quantificação da Presença de Nódulos Mineralizados na Calvária Murina

Duas Semanas Após a Administração sobre a Calvária de Excipiente, MSC, Células A de Formação Óssea ou Células B de Formação Óssea Ocorrência de Doador Lote Animal Células A de 4/10 (40%) 4/11 (36%) 9/45 (20%) Células B de 7/8 (88%) 7/8 (88%) 37/46 (80%) [emaçãa ções | CS SS Abreviações: MSC: células-tronco mesenquimais; NA: não aplicável

[339] A coloração histológica de cortes coronais do osso da calvária duas semanas após administração (apenas excipiente, MSC, células A de formação Óssea (geradas com FGF-2 e TGFB1; células A b-f) ou células B de formação óssea (geradas com FGF-2, TGFRB1 e heparina; células B b-f)) revelaram que todas as condições tratadas (MSC, células A b-f e células B b-f) têm um alto potencial de osteoindução com uma atividade de remodelação média (coloração ALP e TRAP) no osso formado por osteoindução.

[340] Curiosamente, os nódulos mineralizados observados em camundongos tratados com células B de formação óssea eram constituídos tanto por tecidos murinos (hospedeiro) como tecidos ósseos humanos (doador) (evidenciados pela coloração de colágeno tipo | humano e murino), demonstrando que os nódulos foram formados por ambos os processos de formação óssea: osteogenia (formação óssea do doador) e processo de osteoindução (formação óssea do hospedeiro). Além das altas atividades de osteoblastos e osteoclastos (coloração ALP + TRAP), os nódulos exibiram tecido osteoide (tecido não mineralizado) sugerindo que a formação óssea ainda estava progredindo duas semanas após a administração, enquanto o processo de osteoindução observado em todas as condições já estava concluído (Figura 12).

[341] A Figura 12 mostra que a formação óssea humana (isto é, osteogenia)

(observada com coloração anti-colágeno tipo | humano) e altas atividades de osteoblastos e osteoclastos (observadas com coloração ALP + Goldner e TRAP, respectivamente) foram detectadas principalmente em nódulos de camundongos administrados com células B de formação óssea, dessa forma, mostrando que o processo de formação óssea nos nódulos estava em andamento e não foi concluído em 2 semanas, diferente do processo de osteoindução de MSC e células A de formação óssea que parecia concluído. Todas as condições tratadas (MSC, células A b-f, células B b-f) apresentaram alto potencial de osteoindução com uma atividade moderada de remodelação (coloração ALP e TRAP) na formação óssea osteoindutora (Figura 12).

[342] A neoformação óssea foi avaliada por fluorescência duas semanas após tratamento somente com excipiente, MSC, células A b-f, células B b-f (Figura 13). Para esse propósito, em pontos no tempo específicos, corantes fluorescentes de ligação de cálcio ósseo (isto é, vermelho de alizarina, calceína verde e azul, tetraciclina amarelo) foram administrados aos camundongos para identificar o osso neoformado. O último fluorocromo a ser administrado foi tetraciclina, administrada 12 dias após administração das células.

[343] Conforme mostrado na Figura 13, os nódulos dos camundongos administrados com as células B de formação óssea foram corados principalmente por fluorocromo tetraciclina (a coloração amarela foi circundada em linha pontilhada na Figura 13) confirmando um estágio posterior de formação em comparação à osteoindução observada na formação óssea osteoindutora (vermelho de alizarina (vermelha), calceína (verde) e calceína azul (azul): essas colorações aparecem em cinza claro e setas duplas indicam a espessura da formação óssea).

[344] A neoformação óssea de camundongos tratados foi avaliada por quantificação da área de superfície do osso neoformado em imagens histológicas (software ImageJº). A área superficial total do osso neoformado foi determinada pela soma das áreas superficiais osteo-induzidas e nódulo ósseo para cada nível analisado e cada camundongo.

[345] Os resultados mostram que células B de formação óssea (n = 7 camundongos, mostradas na Figura 14 em cinza claro) melhoraram significativamente a neoformação óssea 2 semanas após administração das células em cerca de 2 vezes em comparação a MSC (n = 6 camundongos, mostrados na Figura 14 em cinza escuro; Tabela 19). Esta diferença se deve à alta propriedade de osteogenia exibida pelas células B de formação óssea e à ausência dessa propriedade para MSC Tabela 19 Neoformação Óssea Total é Medida em Cortes Coronais, Incluindo a Osteoindução e a Formação Osteogênica (do mesmo de osteogenia) mineralizada (mm?) mineralizada (mm?) mineralizada (mm?) (mmº) (média + SD) (mm?) (média + SD) (mmP) (média + SD) (média + SD) (média + SD) (média + SD) Abreviações: MSC: células-tronco mesenquimais; DP: desvio padrão

[346] Além disso, a avaliação da neoformação óssea ao longo do tempo com o uso de coloração histológica, revelou que nódulos observados no topo da calvária de camundongos administrados com células B de formação óssea foram ossificantes através de um mecanismo de ossificação endocondral. Na Figura 15, a coloração laranja safranina mostra matriz proteoglicana (específica da cartilagem) (área circundada por linhas tracejadas); núcleos; tecido ósseo; e citoplasma. Ao contrário do osso osteo-induzido que foi produzido por ossificação intramembranosa, nódulos ósseos foram produzidos através de ossificação endocondral, com matriz cartilaginosa ocorrendo entre 1 semana e 3 semanas após administração (Figura 15).

[347] A coloração imuno-histoquímica direcionada ao colágeno tipo | humano, colágeno tipo | murino e núcleo humano (isto é, Ku80), realizado 4 semanas após a administração de células B de formação óssea, confirmou a presença de osso humano nos nódulos. Além disso, a coloração Ku80 revelou que células B de formação óssea foram enxertadas na matriz óssea (nódulos) e se tornaram osteócitos após administração in vivo. Exemplo 7 Defeito de Tamanho Subcrítico Segmental Femoral de Camundongo /n Vivo (Sub-CSD) Reparado por Células B de Formação Óssea Obtidas pelo Método do Exemplo 1

1. Procedimentos Experimentais

1.1 Modelo de Defeito de Tamanho Subcrítico Segmental Femoral (Sub- CSD)

[348] O procedimento cirúrgico foi realizado sob condições assépticas de acordo com a literatura (Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al, 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940). Resumidamente, camundongos NMRI-Nus (nu/nu) fêmea de 13 semanas de idade (n = 27) foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de dexmedetomidina (Dexdomitorº, Orion Pharma, 1 mg/kg de peso corporal) e cetamina (Nimatekº, Euronet, 150 mg/kg de peso corporal) e foram colocados em uma posição ventral em uma placa de aquecimento. Após aplicar uma placa de microtravamento de titânio com 6 orifícios (RISystem AGº) no lado anterior do fêmur esquerdo, foi realizada uma osteotomia femoral diafasária média de 2 mm de comprimento usando uma serra Gigli e um gabarito (RISystem AGº). Como medicação preventiva, foram administrados antibióticos (Baytrilº, 10 mg/kg de peso corporal) foram administrados no dia anterior à cirurgia (em água potável) e analgésicos (cloridrato de buprenorfina, Temgesicº, Schering-Plow, 0,1 mg/kg de peso corporal) no dia anterior à cirurgia e a cada 12 horas por pelo menos 3 dias após a cirurgia. Células derivadas de MSC (2,25 x 106 células em volume de 30 ul por mouse) ou o excipiente (grupo de controle) foram administradas no dia da cirurgia (logo após o fechamento da ferida com suturas cirúrgicas), localmente no local do defeito ósseo, por injeção percutânea usando uma seringa de 50 ul- Hamilton. Os camundongos foram eutanisados 6 semanas após a administração celular ou excipiente por deslocamento cervical. O fêmur esquerdo de cada camundongo foi dissecado, coletado e mantido em NaCl 0,9% à temperatura ambiente até a formação de imagens por Raios X.

1.2. Quantificação do Reparo Ósseo por Análises de Raios X

[349] Foram realizadas imagens por raios X in vivo do fêmur esquerdo de cada camundongo, com o uso do dispositivo Faxitronº MX-20 logo após a cirurgia, para controlar a fixação da placa, o tamanho do defeito femoral segmentar e para obter uma avaliação inicial, e a cada duas semanas até 6 semanas após a administração de células derivadas de MSC ou excipiente. As imagens digitais foram obtidas em visualizações mediolaterais e ântero- posteriores em uma ampliação de 4x em modo manual, com tensão ajustada em kV, tempo de exposição em 4,8 s, brilho em 4.300 e contraste em 7.100. A formação de imagens por Raios X ex vivo foi realizada nos fêmures esquerdos coletados na eutanásia, 6 semanas após administração celular. As imagens digitais foram obtidas em visualizações mediolaterais e ântero-posteriores em uma ampliação de 5x em modo manual, com tensão ajustada em 26 kV, tempo de exposição em 15 s, brilho em 4.850 e contraste em 6.850. O tamanho do defeito foi quantificado para cada camundongo ao longo do tempo, medindo a distância (um) entre as duas bordas do defeito ósseo em três locais (à direita, no meio e à esquerda do defeito) nas imagens de raios X mediolateral e ântero- posterior, com o uso do software ImageJº. A média das seis medições foi calculada para cada camundongo em cada ponto no tempo.

1.3. Análise por Tomografia Microcomputadorizada (Micro-CT)

[350] Após coleta na eutanásia, os fêmures esquerdos foram fixados com formaldeído 3,7% e transferidos para o Centro para Microscopia e Imagem Molecular (CMMI, ULB, Gosselies, Bélgica) para análises de micro-CT. As amostras foram digitalizadas com o uso de uma câmera multimodal microPET/CT nanoScanº PET/CT (Mediso) e do software NuclineTM v2.01 (Mediso). As varreduras foram feitas com o uso de um digitalizador semicircular, o zoom máximo, uma tensão do tubo de 35 kVp, 720 projeções por rotação do gantry, um tempo de exposição de 300 ms por projeção, uma segmentação de pixel do detector de 1 a 1. Os comprimentos de varredura nas dimensões Xe Y foram adaptados para cada aquisição. A duração total da varredura de micro-CT foi de 3 min e 42 s. Cada varredura de micro-CT foi pós-reconstruído com um voxel cúbico de 40 um usando um filto Shepp-Logan e um modo de multiamostragem de 8 amostras regulares. As dimensões das imagens X e Y foram adaptadas para cada reconstrução. O tamanho das imagens Z corresponde ao comprimento de varredura definido para a aquisição. Uma avaliação qualitativa do reparo ósseo foi realizada nas imagens de micro-CT após reorientar o osso com o eixo Z (eixo do digitalizador) e cortar a imagem de um parafuso proximal para o outro proximal no osso femoral no eixo Z, e o mais estreito possível no plano transversal (X-Y). Em seguida, foi produzida uma renderização de projeção de Intensidade Máxima (MIP) 3D. Para avaliar quantitativamente o reparo ósseo, um cilindro virtual de 2 mm de diâmetro e 2 mm de comprimento axial foi colocado no espaço do defeito nas varreduras de micro-TC e o volume ósseo médio foi avaliado neste cilindro por voxels de limiar com intensidade radiológica igual ou maior que 1500 HU.

2. Resultados

2.1 Células B de Formação Óssea Aprimoraram o Reparo do Defeito de Segmentação Subcrítico do Fêmur de Camundongos

[351] No modelo de defeito de segmentação de tamanho subcrítico (CSD) em camundongos NMRI-Nus, as células B de formação óssea (n = 12 camundongos, 2 lotes) aprimoraram o reparo da fratura, conforme mostrado por uma redução significativa do tamanho do defeito ósseo em comparação ao excipiente (n = 11 camundongos), e para as células A de formação óssea (n = 4 camundongos) de 2 a 6 semanas após administração (Figura 16A). As imagens de Raios X de defeitos femorais segmentares em DO e 6W após administração do excipiente, células A de formação óssea (não mostradas) ou células B de formação óssea mostraram uma redução do tamanho do defeito ósseo em camundongos administrados com células B de formação óssea de acordo com a realização da invenção em comparação a camundongos administrados com o excipiente (Figura 16B) ou células A de formação óssea (não mostrado).

[352] Os volumes de reparo ósseo do defeito femoral segmentar foram quantificados por tomografia computadorizada (micro-CT) em 6W após administração do excipiente e das células B de formação óssea. Os resultados confirmaram que as células B de formação óssea induziram maior reparo ósseo em comparação ao excipiente (Figura 16C).

Claims (15)

Reivindicações

1. MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE CÉLULAS- TRONCO MESENQUIMAIS (MSC) A PARTIR DE MSC, caracterizado por compreender colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2), fator de crescimento transformador beta (TGFB) e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: (a) cultivar MSC recuperadas a partir de uma amostra biológica de um sujeito em um meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL; (b) remover matéria não aderente e ainda cultivar células aderentes no meio que compreende FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, obtendo assim as células derivadas de MSC.

3. — MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por TGFB ser selecionado a partir do grupo que consiste em TGFRB1, TGFB2, TGFB3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFB é TGFRB1.

4. “MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE MSC COM PROPRIEDADES DE TRANSPLANTE APRIMORADAS A PARTIR DE MSC, caracterizado pelo método compreender uma etapa de redução de tamanho, em que a dita etapa de redução de tamanho é definida por colocar MSC ou células derivadas de MSC in vitro ou ex vivo em contato com heparina ou um derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL.

5. “MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por: - a concentração de heparina ou derivado ou análogo da mesma ser pelo menos 0,05 IU/mL, preferencialmente cerca de 0,1 IU/mL; e/ou

- heparina ou derivado de heparina ou análogo da mesma ser selecionado a partir do grupo que consiste em heparina não fracionada (UFH); heparina de baixo peso molecular (LMWH), como enoxaparina, dalteparina, nadroparina, tinzaparina, certoparina, reviparina, ardeparina, parnaparina, bemiparina, ou misturas das mesmas; um heparinoide, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, sulfato de acarano, sulfato de queratano, ou misturas dos mesmos, como danaparoide; um sal de heparina; um sal de heparinoide; um fragmento de heparina; um fragmento de heparinoide; e misturas dos mesmos.

6. “MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão terem um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo € 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

7. “MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas células derivadas de MSC serem de linhagem osteocondroblástica, preferencialmente osteoblástica.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelas MSC ou células derivadas de MSC serem adicionalmente colocadas em contato com o meio em que adicionalmente compreende um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos.

9. — MÉTODO PARA OBTER CÉLULAS DERIVADAS DE MSC A PARTIR DE MSC, caracterizado por compreender colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, em que pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por: - MSC serem colocadas em contato com heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL; e/ou

- TGFRB ser selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFB2, TGFRB3, e misturas dos mesmos; preferencialmente em que TGFB é TGFB1.

11. POPULAÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC, caracterizada por ser obtida por expansão in vitro ou ex vivo de MSC, em que pelo menos 60% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro igual ou menor que 25 um (Deo < 25 um) e em que no máximo 5% das células derivadas de MSC em suspensão têm um diâmetro maior que 35 um.

12. POPULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por: - as células derivadas de MSC poderem ser obtidas por um método que compreende colocar MSC in vitro ou ex vivo em contato com FGF-2, TGFB e heparina ou um derivado ou análogo da mesma, preferencialmente em que TGFB é selecionado a partir do grupo que consiste em TGFB1, TGFRB2, TGFRB3, e misturas dos mesmos, mais preferencialmente em que TGFB é TGFRB1, preferencialmente em que MSC são colocadas em contato com heparina ou derivado ou análogo da mesma a uma concentração de pelo menos 0,01 IU/mL, e opcionalmente as MSC são adicionalmente colocadas em contato com um ou mais dentre plasma, soro ou um substituto dos mesmos; e/ou - as células derivadas de MSC serem de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica, preferencialmente em que substancialmente todas as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para CD73, CD63 e CD166; substancialmente todas as células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são negativas para CD45; pelo menos 70% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para fosfatase alcalina (ALP); e menos de 10% das células derivadas de MSC de linhagem osteocondroblástica ou osteoblástica são positivas para HLA-DR.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a população de células derivadas de MSC, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 12.

14. POPULAÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MSC, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 12, ou a COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 13, caracterizadas por serem para uso como um medicamento, preferencialmente para uso no tratamento de um sujeito com necessidade de transplante de células derivadas de MSC.

15. POPULAÇÃO de células derivadas de MSC, para uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por: - a população de células derivadas de MSC estar presente a uma concentração entre cerca de 1 x 107/mL e cerca de 1 x 10º/mL, preferencialmente 7,5 x 107 células/mL; e/ou - a população de células derivadas de MSC ou a composição farmacêutica ser adequada para administração percutânea ou intravascular.