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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen geschützten Kanamycinverbindungen, die wertvolle Ausgangsverbindungen zur Herstellung von antibiotisch wirksamen Aminoglycosiden darstellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von neuen geschützten Kanamycinverbindungen der allgemeinen Formel
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worin R'Wasserstoff oder Benzyl, R3 Acetyl oder Halogenacetyl und H4 Hydroxyl oder NHR3 bedeu- ten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man entweder ein Säureadditionssalz oder ein vollständig N-geschütztes Derivat von Kanamycin A, Kanamycin B oder 3-N-Benzylkanamycin A mit einem Acetylierungsmittel oder Halogenacetylierungsmittel umsetzt, die N-Schutzgruppen, soweit vorhanden, entfernt, insbesondere durch Hydrierung das so gebildete O-acylierte Derivat zur intramolekularen 0 N-Acylwanderung mit einer Base neutralisiert,
noch verbliebene 0-Acylgruppen durch Hydrolyse oder Alkoholyse entfernt und das selektiv N-geschützte Derivat der Formel (I) isoliert.
Es wurde schon lange versucht, die andern Aminogruppen in Kanamycin während der Umsetzung der 1-Aminogruppe zur Herstellung von 1-N-substituierten Kanamycin A oder B-Derivaten zu schützen. Obwohl die 6'-Aminogruppe selbstverständlich die reaktionsfähigere Gruppe ist, gibt es in der Praxis einen geringen Unterschied zwischen der Reaktionsfähigkeit der andern Aminogruppen. Nun kann zwar die 6'-Aminogruppe selektiv geschützt werden, es waren aber Versuche zur Ausnützung dieser geringen Unterschiede der Reaktionsfähigkeit an den andern Stellungen zur Erzielung einer selektiven Reaktion an spezifischen Stellungen im allgemeinen nicht erfolgreich.
Erfindungsgemäss wird ein völlig anderes Konzept angewendet, um einen spezifischen Schutz der 6', 3"- und, im Falle von Kanamycin B, der 2'-Aminogruppe zu erzielen. Es wurde nämlich gefunden, dass unter geeigneten Bedingungen eine geeignete 0-Acylgruppe zu einer Aminogruppe an einer benachbarten Ringstellung über einen 5-oder 6gliedrigen Übergangszustand wandert.
Die Reaktion erfolgt spontan und ist für die Aminogruppen in den Stellungen 6', 3"und (bei Kanamycin B) 2'spezifisch, was ermöglicht, dass derart selektiv geschützte Verbindungen leicht erhalten werden können.
R3 kann eine Formylgruppe, eine Mono-, Di- oder Tri-halogenacetylgruppe oder eine nied. Alkanoylgruppe, z. B. eine Acetylgruppe, eine Benzylgruppe, gegebenenfalls am aromatischen Ring beispielsweise durch eine Nitrogruppe oder ein oder mehrere Halogenatom (e) substituiert, oder eine nied. Alkoxycarbonylgruppe, z. B. eine Äthoxycarbonyl-oder Methoxycarbonylgruppe sein. Bevorzugte labile aminoschützende Acylgruppen sind Acetyl und Trifluoracetyl.
Die Verbindungen der Formel (I) werden, wie erwähnt, durch selektive 0 N-Acylwande- rung hergestellt. So wird ein Säureadditionssalz von Kanamycin A oder B oder 3-N-Benzylkanamycin A zuerst mit einem Überschuss eines Acylierungsmittels unter sauren Bedingungen behandelt, so dass anfangs nur die Hydroxylgruppen acyliert werden.
Dann wird das Säureadditionssalz des 0-acylierten Produkts, in einem inerten organischen Lösungsmittel gelöst, neutralisiert.
Unter diesen Bedingungen kann eine intramolekulare Acylwanderung auf eine Aminogruppe
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stattfinden, die in einer benachbarten Ringstellung eine Acyloxygruppe hat, d. h. die 6'- und 3"-Aminogruppen und die 21-Aminogruppe im Kanamycin B. Die restlichen 0-Acylgruppen werden dann in üblicher Weise, z. B. durch Hydrolyse oder Alkoholyse, entfernt, und das Produkt kann, wenn gewünscht, chromatographisch gereinigt werden.
Dieses Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) hat sich als besonders wirksam für die Herstellung der Verbindungen erwiesen, in denen R4 Hydroxyl und Ra Trifluoracetyl
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Das Produkt wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, gelöst und durch Behandeln mit einer Base neutralisiert, z. B. durch Rühren der Lösung mit Natriumoder Kaliumcarbonat. Es wurde gefunden, dass unter diesen Bedingungen die 0 N-Acylwanderung rasch verläuft und innerhalb 20 min bei Raumtemperatur praktisch abgeschlossen ist. Die restlichen
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mit einem Säureanhydrid oder -chlorid, z. B. Acetanhydrid in Pyridin, und die Aminoschutzgruppen werden dann entfernt (z. B. werden tert. Butyloxycarbonyl durch Behandeln mit Trifluoressigsäure und Benzyloxycarbonyl durch katalytische Hydrogenolyse entfernt) und die Lösung neutralisiert.
Die 0 N-Acylwanderung kann dann, wie beschrieben, ablaufen, und die übrigen 0-Acylgruppen werden entfernt und das Produkt isoliert.
Wenn Kanamycin B als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, verläuft die Acylwanderung zusätzlich von der 31-Hydroxylgruppe zu der benachbarten 21-Aminogruppe und führt zu einem Tri-Nacylierten Zwischenproddukt.
Die Verbindungen der Formel (I) können in zahlreichen Konformationsformen vorliegen, und die Erfindung ist nicht auf irgendeine Form beschränkt. Im allgemeinen liegen die Ringe jeweils in der"Sesselform"vor, und jede Substituentengruppe ist zum Ring äquatorial angeordnet. Weiter sind die Glycosidbindungen zwischen den Hexopyranoxylringen und dem 2-Desoxystreptaminring üblicherweise a-Bindungen bezüglich der ersteren.
3-N-Benzylkanamycin A selbst ist eine neue Verbindung. Sie kann durch reduktive Alkylierung von Kanamycin A mit Benzaldehyd unter sorgfältig gesteuerten pH-Bedingungen hergestellt werden.
Es wurde gefunden, dass, wenn Kanamycin A in wässeriger Lösung der reduktiven Alkylierung bei Raumtemperatur oder darunter bei geringem Überschuss an Benzaldehyd in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid unterworfen wird und der pH-Wert der Lösung sorgfältig auf 6 eingestellt wird, das Hauptprodukt der Reaktion 3-N-Benzylkanamycin A ist.
Natürlich werden auch geringere Mengen der andern N-substituierten Isomeren und polysubstituierte Produkte bei der Reaktion gebildet, diese können aber hauptsächlich durch herkömmliche Ionénaustauschchromatographie abgetrennt werden. Die aus der Säule durch Elution mit Ammoniumhydroxyd isolierte Hauptfraktion ist 3-N-Benzylkanamycin A, das mit einer kleineren Menge des 1-N-Benzylisomeren verunreinigt ist. Für die Praxis ist dieses Produkt für die direkte Verwendung im erfindungsgemässen Verfahren genügend rein.
Dünnschichtchromatographie erfolgte an Kieselgelplatten unter Verwendung des genannten Lösungsmittelsystems. Nach dem Trocknen der Platten werden die Flecke durch Besprühen mit einer 5%igen Lösung tert. Butylhypochlorit in Cyclohexan, Trocknen der Platten bei 1000C für 10 min in einem Umluftofen, Kühlen und Besprühen mit Kaliumjodid/Stärke-Lösung sichtbar gemacht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.
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Beispiel 1 : a) 24, 3 g (0, 03 Mol) Kanamycin A-Sulfat wurden in 150 ml Wasser gelöst, und der pH durch tropfenweise Zugabe von 5N HCl auf 6 eingestellt. 1, 95 g (0, 03 Mol) Natriumcyanoborhy- drid wurden zugegeben, und das Gemisch wurde auf 0 C gekühlt und gerührt, wobei eine
Lösung von 3, 61 g (0, 033 Mol) Benzaldehyd, in 15 ml Methanol gelöst, im Verlauf von
2 1/2 h langsam zugegeben wurde. Das Gemisch konnte sich auf Raumtemperatur erwär- men. Nach 16 h wurde der pH der Lösung durch Zugabe von 1N HCl auf 5, 5 eingestellt, und die Lösung filtriert und auf eine Säule von vernetztem Methacrylsäure-Ionenaustauscher- harz mit freien Carboxylgruppen in der Ammoniumform mit einer Ionenaustauschfähigkeit von 3, 5 Moläquivalenten/ml (feucht) Amberlite CG-50 der Fa.
Rohm q Haas Co. gegeben.
Elution zuerst mit Wasser und dann mit einem Ammoniumhydroxydgradienten zunehmender
Konzentration von 0 bis 0, 7 N ergab 5 g (28%) 3-N-Benzylkanamycin A, das mit etwas 1-N-Benzylderivat verunreinigt war, Rf 0, 44 in Methanol, Chloroform, 17% Ammoniumhydro- xyd 4 : 1 : 2 (Kanamycin A ergab einen Rf-Wert von 0, 15).
Eine Probe wurde durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid in Methanol bei Raumtemperatur für 24 h und anschliessende Umsetzung mit einem 2 : 1-Gemisch von Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan bei Raumtemperatur während 24 h in das flüchtige Tetra-N-acetyl- hepta-O-trimethylsilylderivat überführt. m/e wurde zu 1246 gefunden ; C H (, N OSi, verlangt einen m/e-Wert von 1246.
Die Substituentenstellung wurde durch folgende Reaktionsfolge bestätigt : a) Behandlung mit tert. Butyloxycarbonylazid ergab eine Verbindung mit drei tert. Butyloxy- carbonylgruppen sowie die Benzylgruppe (nach Kernresonanz, NMR), b) Hydrierung zum Entfernen der Benzylgruppe, c) Acylierung mit N- [ (S)-4-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxybutyryloxy]-succinimid und d) Entfernen der N-Schutzgruppen durch Hydrieren und anschliessende Behandlung mit Tri- fluoressigsäure ergab als Hauptprodukt 3-N- [ (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl]-kanamy- cin A (BB-K29), identisch mit einer Probe, die nach dem Verfahren von Naito et al.,
J.
Antibiotics, [1973], 26, 297, hergestellt war. b) 0, 7 ml (5 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid wurden langsam zu einer Lösung von 0, 23 g (0, 4 Mol) 3-N-Benzylkanamycin A in 15 ml Trifluoressigsäure bei 0 C gegeben. Die Lösung wurde 20 h bei 0 bis 40C gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft und der
Rückstand mit 10 ml Toluol behandelt und zur Trockne eingeengt. Das Produkt wurde in
20 ml Tetrahydrofuran gelöst und langsam einer gerührten Lösung überschüssigen Kalium- carbonats in Tetrahydrofuran zugesetzt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 30 min gerührt, filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der
Rückstand wurde in 20 ml Methanol aufgenommen und bei Raumtemperatur 30 min stehenge- lassen.
Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt, wobei 3-N-Benzyl-3", 61-di- - N-trifluoracetylkanamycin A erhalten wurde. Rf 0, 5 in Methanol, Chloroform, 8% Ammo-
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: 1 : 0, 1) (3-N-BenzylkanamycinKanamycin A (1, 0 g) in 40 ml Trifluoressigsäure bei 0 C gegeben. Die Lösung wurde 20 h bei 0 bis 40C stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum abgedampft und der Rückstand mit 10 ml Toluol behandelt und zur Trockne eingeengt. Das Trifluoracetatsalz wurde in trockenem Tetrahydrofuran aufgenommen und durch langsame Zugabe zu einer gerührten Suspension überschüssigen wasserfreien Kaliumcarbonats in Tetrahydrofuran neutralisiert.
Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt, und die Suspension wurde dann filtriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das Produkt wurde in 20 ml Methanol aufgenommen und 30 min bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand auf Kieselgel chromatographiert, wobei mit einem Lösungsmittelgradienten von Chloroform, Methanol (3 : 1) zu Chloroform, Methanol, 17% Ammoniumhydroxyd (8 : 4 : 1) eluiert wurde ; dabei wurden 0, 52 g 3", 6'-Di-N-trifluoracetylkanamycin A-hydrat als weisser hygroskopischer Feststoff erhalten. Rf 0, 7 in Methanol, Chloroform, 17% Ammoniumhydroxyd 4 ; 1 : 1 (Kanamycin A ergab einen Rf-Wert von 0, 05).
9c=o 1665 cm-l.
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Beispiel 3 :
A) Eine Lösung von 189, 4 g 1,3,3",6'-Tetra-N-benzyloxycarbonylkanamyein A (Bull. Chem.
Soc. Japan, [1965], , 1181) in 568 ml Pyridin und 189 ml Essigsäureanhydrid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann in 1,9 1 Wasser gegossen. Die wässerige
Lösung wurde mit Chloroform (1 xi, 8 1 und 1 x 1, 0 1) extrahiert und der organische
Extrakt unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Verreiben des Rückstandes mit Äther ergab 224,8 g Penta-O-acetyl-1, 3, 3", 6'-tetra-N-benzyloxycarbonylkanamycin A, das filtriert und unter Vakuum ge, trocknet wurde. Das Produkt hatte einen Fp. von 223 bis 229 C ; Rf 0, 55 in Chloroform, Brennspiritus (12, 1), 6 1, 8 bis 2, 05 (15H-Multiplett, 5 Ace- tylgruppen) und 7, 4 (20H-Singlett, 4 Phenylgruppen).
B) Eine Lösung von 50 g Penta-O-acetyl-1, 3, 3", 6-tetra-N-benzyloxycarbonylkanamycin A in
260 ml Äthylacetat mit einem Gehalt von 260 ml Eisessig wurde über 15 g 5% Palladium auf Kohle 7 h bei 600C und 3, 5 bar hydriert. Die Lösung wurde filtriert, und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äther verrieben, und das Produkt, 32, 9 g Penta-O-acetylkanamycin A, gesammelt und unter Vakuum getrock- net. Fp. 97 bis 105 C, Rf 0, 0 in Chloroform, Brennspiritus (12 : 1), verglichen mit einem
Rf-Wert von 0, 55 für das Ausgangsmaterial. Das protonenmagnetische Resonanzspektrum zeigte völliges Fehlen aromatischer Protonen.
G) Eine Lösung von 139, 2 g Penta-O-acetylkanamycin A in 1, 4 1 Methanol, gesättigt mit Ammo- niak, wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann unter vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 140 ml Methanol gelöst, und das
Rohprodukt wurde mit 2, 5 1 Chloroform ausgefällt, filtriert und im Vakuum getrocknet.
Das feste Rohmaterial wurde in 400 ml Brennspiritus aufgeschlämmt und das Produkt, 91, 9 g 3", 6'-Di-N-acetylkanamycin A, durch Filtrieren gesammelt, in Äther gewaschen und unter Vakuum getrocknet, Fp. 150 bis 180 C, Rf 0, 77 in Methanol, 0, 880 Ammonium- hydroxyd 1 : 1. Es zeigte ein 13C-NMR-Spektrum und ein H-NMR-Spektrum in voller Überein- stimmung mit der geforderten Struktur.
Beispiel 4 : 3, 6 ml Trifluoressigsäureanhydrid wurden langsam zu einer gerührten Lösung von 960 mg (2 mMol) Kanamycin B in 50 ml Trifluoressigsäure bei 0 C gegeben. Die Lösung wurde 20 h bei 0 bis 4 C stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand mit 10 ml Toluol behandelt und zur Trockne eingeengt. Das Trifluoracetatsalz wurde in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und langsam einer gerührten Lösung überschüssigen Triäthylamins in Tetrahydrofuran zugesetzt. Die Lösung wurde 40 min bei Raumtemperatur stehen gelassen, und das Lösungsmittel dann unter vermindertem Druck abgedampft.
Der Rückstand wurde zur Hydrolyse der restlichen O-Trifluoracetylgruppen in Methanol gelöst, nach 30 min bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft und das Produkt an Kieselgel unter Eluieren mit einem Lösungsmittelgradienten von Chloroform, Methanol (3 : 1) zu Chloroform, Methanol, 17% Ammoniumhydroxyd (20 : 10 : 1) chromatographiert, wobei 452 mg (29%) 2', 3", 6'-Tri- - N-trifluoracetylkanamycin B als glasartige Masse erhalten wurden. Rf 0,70 in Methanol, Chloroform, 8% Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 0, 1) (Kanamycin B ergab einen Rf-Wert von 0, 0).
Die Struktur wurde durch die folgende Reaktionsfolge bestätigt : a) Acetylierung mit Essigsäureanhydrid in Methanol während 20 h bei Raumtemperatur und nachfolgende Behandlung mit IN Ammoniumhydroxyd während 18 h zum Entfernen der Tri- fluoracetylgruppen ergab ein zwei Acetylgruppen enthaltendes Produkt. m/e (Felddesorption) gefunden m + 1, 568, Sollwert für C H NOn M + 1 568 ; b) Behandlung des Di-N-acetylderivats mit Deuteroacetanhydrid in Methanol bei Raumtemperatur während 24 h und nachfolgende Umsetzung mit einem 2 : 1-Gemisch von hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan bei Raumtemperatur während 24 h ergab des flüchtige Tri-N-deu- teroacetyl-di-N-acetylhexa-O-trimethylsilylderivat. m/e gefunden : 1134, Sollwert für
C46H86N5O15D9Si6 1134.
Am Fragmentierungsmuster zeigte sich, dass am 2-Desoxystreptamin- ring Diacetylierung eingetreten war, was bestätigt, dass Trifluoracetylierung anfangs an
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den 2'-, 3"-und 6'-Stellungen im Kanamycin B stattgefunden hatte.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von neuen geschützten Kanamycinverbindungen der allgemeinen Formel
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worin Rus wasserstoff oder Benzyl, R" Acetyl oder Halogenacetyl und R 4 Hydroxyl oder NHR"bedeu- ten, dadurch gekennzeichnet, dass man entweder ein Säureadditionssalz oder ein vollständig N-geschütztes Derivat von Kanamycin A, Kanamycin B oder 3-N-Benylkanamycin A mit einem Acetylie-
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lyse oder Alkoholyse entfernt und das selektiv N-geschützte Derivat der Formel (I) isoliert.