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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin durch Reaktion von Phosphorhalogenid mit 3, 5-di-tert. -Butyl-4-hydroxybenzylester auf natürlichem Weg hergestelltem Penicillin, welcher durch Umsetzen von Penicillin mit 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylhalogenid hergestellt worden ist und durch Umsetzen der so erhaltenem Iminohalogenid-Verbindung mit einem niederen Alkohol der erhaltenen Iminoäther-Verbindung mit Phenylglycylchlorid-hydrochlorid, um den 6- [D - (-) -0 : -Aminophenyl-
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bindung mit einem schwach basischen Material behandelt.
(x-Aminobenzylpenicillin ist ein sogenanntes synthetisches Penicillin und ein Antibiotikum, das für orale Verabreichung geeignet ist.
Bislang wurde zur Herstellung von Penicillin ein Verfahren angewendet, nach welchem die Acylgruppe, welche an die Aminogruppe in der Stellung 6 des natürlichen Penicillins gebunden ist, zuerst biologisch zur
6-Aminopenicillansäure gespalten und dann die Penicillansäure mit einem reaktiven Derivat von Phenylglycin, wie beispielsweise Phenylglycylchlorid-hydrochlorid (franz. Patentschrift Nr. 1. 332.557) umgesetzt wird. Jedoch zeigt ein solches Verfahren verschiedene Nachteile, da 6-Aminopenicillansäure als Zwischenprodukt auftritt und kann daher nicht als industriell gut verwertbares Verfahren angesehen werden.
Da die 6-Aminopenicillansäure problematisch in der Handhabung und unlöslich in organischen Lösungsmitteln ist, wodurch sowohl die Acylierung nicht glatt durchgeführt werden kann als auch 6-Aminopenicillansäure unumgesetzt bleibt, ist deren Trennung von dem gewünschten Produkt schwierig.
In der Folge wurden Verfahren entwickelt. um verschiedene synthetische Penicilline durch biologische oder chemische Deacylierung des Esters eines natürlichen Penicillins zu erhalten, bei welchen die Carbonsäure durch eine Schutzgruppe abgeschirmt wurde, die unter milden Bedingungen, ohne den ss-Lactamring des Penicillins aufzubrechen, abgespalten werden kann, worauf eine Phenylglycyl-Gruppe (Acylierung) eingeführt und dann die Esterbindung biologisch oder chemisch gespalten wird (s. belg. Patentschriften Nt. 6343 74, Nt. 684288 und Nr. 710202 und franz. Patentschrift Nr. l. 576.027).
Diesen Methoden haften dievorhin erwähnten üblichennachteile in dem Punkt nicht an, dass keine 6-Ami- nopenicillansäure als Zwischenprodukt verwendet wird, jedoch ist die Durchführung der Deacylierung von natürlichem Penicillin auf biologischem Weg unvermeidlich mit Mängeln, die bei der Verwendung eines Enzyms auftreten, behaftet, dass nämlich
1. Penicillinase, welche das Aufbrechen des ss-Lactams verursacht, zugemischt wird ;
2. die Beibehaltung der Enzymaktivität nötig ist ;
3. die Reaktion in verdünnter wässeriger Lösung durchgeführt werden muss und
4. ein längerer Zeitraum nötig ist, um die Reaktion zu vervollständigen.
Weitere Nachteile bei der Acylierung des Esters der so erhaltenen 6-Aminopenicillansäure und der chemi- schen oder biologischen Spaltung der Esterbindung zum synthetischen Penicillin sind die, dass es nicht immer leicht ist, die Schutzgruppe, die die Carboxylgruppe der acylierten Verbindung abschirmt. abzuspalten, und : s ist auch das Aufbrechen der Esterbindung von einem Aufbrechen des 8-Lactamringes begleitet, wenn besondere Bedingungen nicht eingehalten werden.
Beispiele für die Schutzgruppen für die Carboxylgruppe sind Alkylgruppen, wie eine Methylgruppe, welche biologisch freigesetzt werden kann, eine Cyanomethylgruppe, eine Benzylgruppe oder eine Diphenylmethylgruppe, welche ebenfalls nach einem biologischen Verfahren abgespalten werden kann und einePhenacylgruppe, : ine Arylsulfonyläthylgruppe, eine Halogenbenzylgruppe, eine p-Nitrobenzylgruppe u. dgl., welche mittels UkalimetaJlsa1ze eines Thiophenols freigesetzt wird (vgl. belg. Patentschriften Nr. 634474, Nr. 684288 und Nr. 710202 und franz. Patentschrift Nr. l. 576.027).
Wie oben angeführt ist, sind verschiedene Schutzgruppen für Carboxylgruppen bekannt, jedoch dienen sämtliche dieser Schutzgruppen nicht der Herstellung von a-Aminobenzy1penicillin aus natürlichem Penicillin nach einem chemischen Verfahren.
Nach den Ergebnissen der Erfindung konnte gefunden werden, dass bei der chemischen Deacylierung des Esters von natürlichem Penicillin nach der Phosphorhalogenid-Methode solche Schutzgruppen, welche nicht sperrig sind, wie beispielsweise eine Methylgruppe, eine Phenacylgruppe, eine Halogenbenzylgruppe, eine p-Nitrobenzylgruppe u. dgl., welche eine geringe sterische Behinderung besitzen, nicht geeignet sind. Jedoch sind auch alle sperrigen Gruppen nicht brauchbar, da beispielsweise die Freisetzung der Diphenylmethylgruppe schwierig ist und daher als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe nicht in Frage kommen kann. Bislang ist noch nicht bekanntgeworden, a-Aminobenzy1penicillin industriell aus natürlichem Penicillin durch ein lediglich chemisches Verfahren herzustellen.
Der Grund ist darin zu suchen, dass eine geeignete Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bei der chemischen Herstellung von cx-Aminobenzylpenicillin bis jetzt noch nicht bekanntgeworden ist.
ImRahmen der Erfindung wurde ein Verfahren zur Herstellung von a-Aminobenzy1penicillin aus auf mikrobiologischem Weg erhaltenem Penicillin durch einen lediglich chemischen Prozess entwickelt und es konnte gefunden werden, dass sich die 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylgruppe insbesonders als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe auszeichnet. Da die Schutzgruppe sperrig ist, reicht sie aus, den 8-Lactamring abzuschirmen.
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Die Freisetzung kann leicht durchgeführt werden, wobei hochgereinigtes cx-Aminobenzylpenicillin mit einer hohen Ausbeute erhalten wird.
Im Zusammenhang mit dem oben angeführten Verfahren kann noch ein neues Zwischenprodukt erhalten werden, u. zw. ein α-Aminobenzylpenicillin-3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester durch Reaktion der Iminoäther-Verbindung mit 4-Phenyl-2, 5-oxazolidindion anstatt des Phenylglycylchlorid-hydrochlorid oder durch Reaktion von 3, 5-di-tert. -Butyl-4-hydroxybenzylester der 6-Aminopenicillansäure, welche durch Spaltung der Iminoäther-Bindung der Iminoäther-Verbindung erhalten wurde, mit Phenylglycin, bei welchem die Aminogruppe geschützt worden ist, oder einem reaktiven Derivat des Phenylglycins.
Es wird nachstehend gezeigt, dass die Reaktion gemäss der Erfindung wie folgt abläuft, wenn beispielsweise ein Benzylpenicillinkaliumsalz als Beispiel für ein natürliches Penicillin verwendet wird.
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erfindungsgemäss wie folgt hergestellt :
Ein Alkalimetallsalz von auf mikrobiologischem Weg erhaltenem Penicillin, wie beispielsweise Benzyl-
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unter Kühlen oder vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis-25 C in Anwesenheit eines tertiären Amins, wie beispielsweise Pyridin, N, N-Dimethylanilin u. dgl. zur Reaktion gebracht.
Als Phosphorhalogenid, das in der oben genannten Reaktion verwendet wird, sind als Beispiele Phosphorpentachlorid, Phosphorpentabromid, Phosphoroxychlorid, Phosphortrichlorid u. dgl. angeführt, aber dem Phosphorpentachlorid ist der Vorzug zu geben und das Phosphorhalogenid soll womöglich in einem geringen Überschuss verwendet werden.
Die so erhaltene Iminohalogenid-Verbindung (III) wird mit einem niederen Alkohol unter Kühlen, vorzugsweise bei Temperatur von 0 bis -25oC umgesetzt. ohne dass sie aus der Reaktionsmischung isoliert worden ist.
Als niedererAlkohol können bei derReaktion Methanol, Äthanol, n-Propylalkohol u. dgl. verwendet werden und es wird bevorzugt, dass die zugegebene Menge davon in einem molaren Überschuss, bezogen auf das Rohma- terial vorhanden ist.
Weiters kann der Ci -Aminobenzylpenicillin -3'. 5'-di -tert. -butyl-4'-hydroxybenzylester durchReaktion der so erhaltenen Iminoäther-Verbindung (IV) ohne vorherige Isolierung aus der Reaktionsmischung direkt mit dem Phenylglycy1chlorid-h drochlorid oder 4-Phenyl-2.
5-oxazolidindion in einem inerten organischen Lösungsmittel unter Kühlen oder bei Temperaturen von 0 bis-25 C oder durch Hydrolyse der Iminoäther-Verbindung zu dem 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylester (IV') der 6-Aminopenicillansäure ohne vorherige Isolierung aus der Reaktionsmischung und anschliessende Reaktion des Esters (IVI) mit Phenylglycin, bei welchem die Aminogruppe vorher abgeschirmt worden ist, oder einem reaktiven Derivat von Phenylglycin unter Kühlen oder vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis -25oC in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, Toluol, Chloräthan, Trichloräthylen, Dichlormethan, Tetrahydrofuran usw., hergestellt werden.
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Zusätzlich kann die Hydrolyse der vorhin erwähnten Iminoäther-Verbindung (IV) nach konventionellenMethoden vorgenommen werden, aber es wird bevorzugt, dass die Hydrolyse bei 0 bis -250C und bei einem PH von 4 bis 5 ausgeführt wird.
Der 3,5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylester (IV1) der 6-Aminopenicillansäure kann leicht durch Über- führen in ein Salz einer Säure, wie beispielsweise in ein Benzosulfonat oder das p-Toluolsulfonat, isoliert werden. Die Reaktion zwischen der Verbindung (IV') und Phenylglycin, bei welchen die Aminogruppe abgeschirmt worden ist, wird vorzugsweise in Anwesenheit von kondensierenden Mitteln, wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, Pivalinsäurechlorid u. dgl. durchgeführt.
Wenn man das Phenylglycin, bei welchem dieAminogruppe durch eine o-Nitrophenylthiogruppe, eine 2-Äthoxycarboxyl-l-methylvinylgruppe u. dgl. abgeschirmt worden ist. mit der Verbindung (IV) reagieren lässt, so kann die Verbindung (V) durch Behandeln der so erhaltenen Verbindung auf gewöhnliche Weise, beispielsweise durch Salzsäure oder Essigsäure, um die Schutzgruppe für die Aminogruppe freizusetzen, gewonnen werden.
Der so erhaltene α-Aminobenzylpenicillin-3',5'-tert.-butyl-4-hydroxybenzylester (V) kann nach gewöhnlichen chemischen Verfahren gereinigt und isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion, Konzentration, Umfällen, Umkristallisation u. dgl.
Durch Behandeln der neuen Verbindung (V) mit zumindestens einem Äquivalent einer schwachen Base in einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Dichloräthan, Trichloräthylen, Chloroform, Toluol u. dgl., unter Kühlen, vorzugsweise unter Eiskühlung bei wasserfreien Bedingungen, kann sich das cx-Aminobenzylpenicillin bilden. Als schwache Base, die hier für die Behandlung verwendet wird, eignen sich ein Alkalimetallsalz, wie beispielsweise Natriumsalz oder Kaliumsalz von Thiophenol, primäre Amine, wie Methylamin, Äthylamin, n-Propylamin, Isopropylarnin, n-Butylanin, tert.-Butylamin, Cyclohexylamin, 4-Methylcyclohexylamin und Cyclopropylaminund sekundäre Amine, wie Dimethylamin, Diäthylamin, Dibutylamin, Diisopropylamin, Dicyclohexylamin und Bis- (4-me- thylcyclohexyl)-amin.
Um das cx-Aminobenzylpenicillin aus der Reaktionsmischung zu isolieren, wird Wasser zugesetzt und die entstandene wässerige Phase abgetrennt, der pH-Wert der wässerigen Lösung auf den isoelektrischen Punkt (PH 5 bis 6) eingestellt und die Lösung konzentriert, wobei sich das gewünschte Produkt niederschlägt.
Die Erfindung soll nun an Hand von Beispielen näher beschrieben werden : Beispiel 1 : a) In 930 ml Dimethylformamid wurden 93 g Benzylpenicillinkalium suspendiert und dann zu der Suspension 10 g 2, 6-di-tert.-Butylphenol und 25 g Kaliumbicarbonat zugesetzt.
Die Suspension wurde auf-10 bis-15 C gekühlt und während dem Rühren der Suspension gab man 100 g 3, 5-di-tert. -Butyl-4-hydroxybenzylbromid portionsweise über einen Zeitraum von 5 h hinzu.
Nach weiterem Rühren der Mischung für 1 h bei derselben Temperatur wurde diese in ungefähr 2 kg Eiswasser dispergiert und nach Zugabe von 11 Äther zu der Mischung und Rühren wurde die gebildete Ätherschicht abgetrennt. Die wässerige Schicht wurde weiters zweimal mit je 300 ml Äther extrahiert.
Die Extrakte wurden vereinigt und nach Waschen der Ätherlösung mit 500 ml l oiger wässeriger NatriumbiCarbonat-Lösung und dann mit 500 m1Wasser wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Äther-Lösung wurde auf ungefähr 300 ml konzentriert und nachdem man 400 ml Petroläther zu dem Konzentrat zugegeben hatte und die Mischung unter Eiskühlung gerührt wurde, fielen Kristalle aus. Nachdem man die Mi- ; chung einige Stunden abkühlen liess, wurden die Kristalle durch Filtrieren gewonnen.
Nachdem die Kristalle nit einer geringen Menge Petroläther gewaschen und getrocknet wurden, erhielt man 127 g der weissen, nadel- 'örmigen Kristalle von Benzylpenicillin-3', 51-di-tert.-butyl-41-hydroxybenzylester mit einem Schmelzpunkt yon 100 bis 1020C in einer Ausbeute von 91, 5%.
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<tb> pc <SEP> (elm) <SEP> H <SEP> (%) <SEP> N <SEP> (agi) <SEP> S <SEP> (%)
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 67, <SEP> 36 <SEP> 7, <SEP> 29 <SEP> 5, <SEP> 07 <SEP> 5, <SEP> 80 <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 67, <SEP> 12 <SEP> 7, <SEP> 35 <SEP> 5, <SEP> 02 <SEP> 5,72
<tb>
b) 5,53 g Benzylpenicillin-3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester wurden in 55 ml Dichloräthan gelöst und nach der Zugabe weiterer 4, 12 ml N, N-Dimethylanilin zu der Lösung wurde die Mischung auf . 25 :
I : 50C gekühlt. Anschliessend wurden 2, 3 g Phosphorpentachlorid der Mischung beigegeben und die enttehende Mischung 1 h bei-25 1-50C gerührt. Dann fügte man, während die Mischung bei-25 5 C gehalten rurde, 40 ml Methanol tropfenweise zu und die Mischung wurde weiter 1, 5 h gerührt.
Die Reaktionsmischung turde mit 6,86 ml N, N-Dimethylanilin vermischt und während dem Kühlen der Mischung auf-25 4 : 50C unter ühren wurden 2. 5 g D- (-)-Phenylglycylchlorid-hydrochlorid in Portionen über einen Zeitraum von 1 h zuge- arzt, Darauf wurde die Mischung 2 h bei derselben Temperatur gerührt und zu ungefähr 200 g Eiswasser, das
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mit Salzsäure angesäuert wurde (pH 2 bis 3) hinzugefügt und nach ausreichendem Schütteln wurde die Mischung stehengelassen, worauf man die so gebildete wässerige Schicht von der Dichloräthan-Schicht trennte. Die wässerige Schicht wurde zweimal mit je 20 ml Dichloräthan extrahiert.
Eine Mischung der Dichloräthan-Schicht und des Extraktes wurde dreimal mit je 50 ml wässeriger Salzsäurelösung mit einem pH-Wert von 3 gewaschen und dann über wasserfreiemMagnesiumsulfat getrocknet. Die Dichloräthan-Lösung wurde auf 0 C gekühlt, 3 ml Diäthylamin wurden der Lösung unter Rühren zugesetzt und die Mischung wurde 1, 5 h bei 0 C gerührt. Anschliessend fügte man 20 ml Wasser zu der Mischung hinzu und der pH-Wert der wässerigen Schicht wurde unter Rühren mit verdünnter Salzsäure auf ungefähr 2 eingestellt. Die wässerige Schicht wurde von der Dichloräthanschicht getrennt und letztere, zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen. Eine Mischung des Extraktes und der wässerigen Schicht wurde zweimal mit je 20 ml Methylisobutylketon gewaschen.
Das Gesamtvolumen der Mischung wurde auf 50 ml eingestellt.
Wenn die so erha ltene w ässerige Lösung einer Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese unterworfenwurde, konnte lediglich ein positiver Fleck bei der Ninhydrin-Reaktion an der Stelle, die dem ct-Aminobenzylpenicillin entspricht, festgestellt werden. Ebenfalls als Ergebnis der quantitativen Analysen durch eine Disc-Methode unter Verwendung von B. Subtilis wurde gefunden, dass die wässerige Lösung 2, 8 g a-Aminobenzylpenicillin enthielt (Ausbeute 80, 50/0).
Nach Einstellen des PH der so erhaltenen wässerigen Lösung auf 5 mit verdünntem wässerigem Ammoniak, wurde die Lösung auf ungefähr 10 ml unter reduziertem Druck und bei niedriger Temperatur konzentriert und nachdem man das Konzentrat in einem Kühlschrank abkühlen liess, fielen Kristalle aus, welche durch Filtrieren gewonnen, mit einer geringen Menge kaltem Wasser gewaschen und getrocknet wurden, um 2, 1 g der weissen, nadelförmigen Kristalle von a-Aminobenzylpenicillintrihydrat in einer Ausbeute von 52% zu erhalten. Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 200 bis 203 C (Zersetzung).
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betrug.
Beispiel 2 : In 80 ml Dichloräthan wurden 5, 53 gBenzylpenicillin-31, 5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxy- benzylester gelöst und 3,6 ml Pyridin wurden der Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde auf-10 C gekühlt. Dann fügte man 2, 5 g Phosphorpentachlorid zu und die Mischung wurde 1, 5 h bei 0 bis-5 C gerührt. Anschliessend, während man die Mischung bei-20 5 C hielt, gab man 36 g Methanol tropfenweise zu der Mischung und die entstehende Mischung wurde weiter 1 h bei-10 bis-15 C gerührt.
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raum von 1 h zugesetzt.
Dann nach Rühren der Mischung für 2 h bei derselben Temperatur wurde diese zu ungefähr 200 g Eiswasser, das mit Salzsäure (PH 2 bis 3) angesäuert wurde, gegeben und die Mischung wurde anschliessend ausreichend geschüttelt und stehengelassen, worauf man die so gebildete Dichloräthanschicht von der wässerigen Schicht trennte. Die abgetrennte wässerige Schicht wurde zweimal mit je 15 ml Dichloräthan extrahiert. Eine Mischung des Extraktes und der vorher abgetrennten Dichloräthanschicht wurde dreimal mit je 50 ml Salzsäure mit einem pH-Wert von 3 gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Dichloräthanlösung wurde auf 0 C gekühlt und dann mit 3, 5 ml Cyclohexylamin unter Rühren versetzt, worauf man weiter 1 h bei 0 C rührte.
DurchBehandeln der Mischung wie nach Beispiel l erhielt man 2, 3 g a-Amino- benzylpenicillintrihydrat mit einem Schmelzpunkt von 200 bis 203 C (Zersetzung) in einer Ausbeute von 57%.
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Die Ergebnisse der biologischen, quantitativen Analyse zeigen, dass die Reinheit des Produktes 970 y/mg betrug.
Zusätzlich konnte das Zwischenprodukt, der 6- [D- (-)-a-Aminophenylacetamid]-penicillansäure- - 31, 5'-di-tert.-butyl-41-hydroxybenzylester wie folgt isoliert werden. Nach Umsetzen von D- (-)-Phenylglycylchlorid-hydrochlorid nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 wurde die Reaktionsmischung zu 200 g mit Salzsäure (PH 2 bis 3) angesäuertem Eiswasser gegeben und nach ausreichendem Schütteln wurde die Mischung stehengelassen, worauf die so gebildete Dichloräthanschicht von der wässerigen Schicht abgetrennt wurde. Die wässerige Schicht wurde zweimal mit je 50 ml Dichloräthan extrahiert. Eine Mischung der Extrakte und der vorhin abgetrennten Dichloräthanschicht wurde dreimal mit je 50 ml Wasser mit einem pH-Wert von 3 gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Die Dichloräthanlösung wurde bei vermindertem Druck und bei niedriger Temperatur konzentriert und der so erhaltene Rückstand in 30 ml Toluol gelöst. Nachdem man 30 ml n-Hexan nach und nach zu derToluollösung unter Rühren und Kühlen hinzugefügt hatte, fielen Kristalle aus. Nach Stehenlassen in einem Refrigerator über Nacht, wurden die Kristalle durch Filtrieren gewonnen und mit einer geringen Menge n-Hexan gewaschen und anschliessend getrocknet, um 5 g 6-rD- (-)-ct-Ami- nophenylacetamid)-penicillansäure-3', 5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester-hydrochloridineinerAusbeu- te von 830/0 zu erhalten.
Durch Umkristallisieren des Produktes aus einem Toluolligroin enthaltenden Lösungsmittel wurden weisse, pulverige Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 145 bis 1470C erhalten.
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<tb>
30C <SEP> (elm) <SEP> H <SEP> (ufo) <SEP> N <SEP> (solo) <SEP> S <SEP> (0/0)
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 61,62 <SEP> 7,01 <SEP> 6,95 <SEP> 5,31
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 61,37 <SEP> 7,29 <SEP> 6,88 <SEP> 5,45
<tb>
Beispiels : a). 27, 6 g Benzylpenicillin-3', 5'-di-tert.-4'-hydroxybenzylester wurden in 400 ml Dichloräthan gelöst und nach weiterer Zugabe von 20 ml Pyridin wurde die Mischung auf-5 bis 100C gekühlt. Darauf wurden 13 g Phosphorpentachlorid beigegeben und die entstehende Mischung auf-20 bis-30 C gekühlt. Unter Rühren der Mischung wurden tropfenweise 180 ml Methanol dieser beigegeben und nach weiterem Rühren der Mischung während 5 h bei derselben Temperatur wurde diese 16 h stehengelassen.
Die Reaktionsmischung wurde auf-10 bis -20oC gekühlt und nach Zugabe von 20 ml Wasser und 20 ml 10%igem wässerigem Ammoniak, um den p-Wert auf. 4,5 einzustellen, wurde die Mischung 2 h bei 0 bis -5 C gerührt. Dann wurde die DichloräthanSchicht abgetrennt, mit gesättigter, wässeriger Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magne- siumsulfat getrocknet. Die Dichloräthanlösung wurde auf Temperaturen niedriger als-20 C gekühlt und nach tropfenweiser Zugabe einer Lösung von 7,76 g p-Toluolsulfonsäure in einer Mischung von 50 ml wasserfreiem Methanol und 200 ml wasserfreiem Äther zu der Dichloräthanlösung unter Rühren wurde die Lösung bei vermindertem Druck und einer Temperatur niedriger als 200C konzentriert.
Nachdem der so entstandene Rückstand mit 200 ml wasserfreiem Äther unter Kühlen vermischt wurde, fielen Kristalle aus, welche durch Filtrieren gewonnen, mit einer geringen Menge Äther gewaschen und getrocknet wurden, um 24,4 g p-Toluolsulfonat von 6-Aminopenicillansäure-3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester in einer Ausbeute von 80, 6% zu erhalten.
Durch Umkristallisieren des Produktes aus einer Mischung von Dichloräthan und Äther erhielt man weisse, nadelförmige Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 146 bis 148 C (Zersetzung).
[CI. F = +125, 70 (C = 1, Äthanol)
Elementaranalyse für C H4P7NzSz :
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<tb> C <SEP> (0/0) <SEP> H <SEP> (0/0) <SEP> N <SEP> (0/0) <SEP> S <SEP> (0/0) <SEP>
<tb> berechnet: <SEP> 59,38 <SEP> 6,98 <SEP> 4,62 <SEP> 10, <SEP> 57 <SEP>
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 59,15 <SEP> 7, <SEP> 06 <SEP> 4, <SEP> 55 <SEP> 10, <SEP> 63
<tb>
b) In einer Mischung von 120 ml Toluol und 30 ml Dimethylformamid wurden 12, : 5 g p-Toluolsulfonat der 6-Aminopenicillansäure-3', 5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester suspendiert und während Kühlen der Mischung auf -10 bis -15 C, wurden 2,78 ml Triäthylamin der Suspension unter Rühren beigefügt.
Während Rühren
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Mischung der Extrakte und der vorher abgetrennten Toluol-Schicht wurde mit gesättigter, wässeriger Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Toluol-Lösung wurde auf ungefähr 50 ml bei vermindertem Druck und niedriger Temperatur konzentriert. Nach Zugabe von 50 ml Ligroin zu dem Konzentrat wurden Kristalle ausgefällt. Nach Rühren der Mischung während einiger Stunden unter Kühlen wurden die Kristalle durch Filtrieren gewonnen und wenn die Kristalle nach Waschen mit einer geringen Menge Ligroin getrocknet wurden, erhielt man 11, 7 g 6-[D-(-)-α-Aminophenylacetamid]-penicillansäure- -3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester-hydrochlorid in einer Ausbeute von 95%.
Durch Umkristallisieren des Produktes aus einer Mischung von Toluol und Ligroin gewann man ein weisses Pulver mit einem Schmelzpunkt von 145 bis 147 C.
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Beispiel 4 : a) In 400 ml Dimethylformamid wurden 37, 2 g Benzylpenicillinkalium suspendiert und nach Zugabe von 31 g 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylbromid wurde die Mischung 24 h bei Raumtemperatur gerührt.
- Die Reaktionsflüssigkeit wurde mit 1 l Äther und 11 Wasser vermischt und nach ausreichendem Schütteln der Mischung wurde die so gebildete Ätherschicht abgetrennt. Die Ätherlösung wurde nach und nach mit 300 ml einer 1% i n wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung und mit'300 ml Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Von dem öligen Rückstand, den'man durch Abdestillieren des Äthers erhielt, wurde das entstandene Bis(3,5-di-tert.-butyl-4-hydroxyphenyl)äthan durch Extraktion mit Petroleumbenzin entfernt. Der Rückstand wurde anschliessend in 100 ml Äther gelöst und die Lösung in 500 ml Petroläther dispergiert, um einen Niederschlag zu bilden, welcher durch Filtration gewonnen wurde.
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Die Kristalle wurden mit Petroläther gewaschen und getrocknet, um 36 g des schwach gelben Pulvers von Benzylpenicillin-3', 51-di-tert.-butyl-41-hydroxybenzylester mit einem Schmelzpunkt von 76 bis 81 C in einer Ausbeute von 640/o zu erhalten. b) In 80 ml 1, 2-Dichloräthan wurden 5,51 g Benzylpenicillin-3', 5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester gelöst und nach Zugabe von 4 ml Pyridin wurde die Mischung auf 0 bis -50e gekühlt. Anschliessend gab man 2,5 g Phosphorpentachlorid zu und die entstehende Mischung wurde 1, 5 h bei 0 bis -50e gerührt. Zu der Reaktionsflüssigkeit wurden 2, 4 g Magnesiumcarbonat zugesetzt und während Kühlen der Mischung auf-20 bis-30 C wurden 40 ml Methanol zu der Mischung gegeben und diese 6 h gerührt.
Anschliessend wurde die entstehende Mischung 14 h bei-20 C stehengelassen.
Die so erhaltene Suspension wurde unter Zugabe von Perlit (Erzeugnis der Toko Perlite K. K.) filtriert und das Filtrat auf 0 bis-5 C gekühlt. Während das Filtrat gerührt wurde, setzte man 5 ml Wasser zu und nach Einstellen des PH der Lösung auf 4 bis 5 mit 100/0igem wässerigem Ammoniak wurde die entstehende Lösung 3,5 h bei 0 bis -5C gerührt.
Aus der Mischung des Reaktionsproduktes wurde eine Dichloräthan-Schicht gewonnen und nach ausreichendem Waschen der Lösung mit kaltem Wasser wurde die Dichloräthan-Lösung über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschliessend wurde 1/4 der Dichloräthan-Lösung unter vermindertem Druck und bei niedriger Tem-
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zu erhalten. c) Nach Kühlen von 3/4 der übrigbleibenden Dichloräthan-Lösung aufO bis-5 C wurden 2,28 g D- (-)-N- -(o-Nitrophenylthio)-phenylglycin darin unter Rühren gelöst und nach weiterer Zugabe von 1, 55 g N, N-Dicyclophenylcarbodiimid wurde die entstehende Mischung 5 h bei 0 bis -50e gerührt.
NachStehenlassen derReaktionsmischung während 16 h bei 0 C wurde der ausgefällte N, NI-Dicyclohexylharnstoff filtriert und das Filtrat zweimal mit je 30 ml einer 5% igen wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und nach weiterem Waschen mit Wasser die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Die Lösung wurde nach dem Trocknen unter vermindertem Druck und bei niedriger Temperatur konzentriert,
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Rückstandberechnet : N 7, 77% gefunden : N 7, 45%
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bildete ölige Material enthält, wurde dreimal mit je 50 m1 Äthylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 50 ml einer 3'igen wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung und dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesium- sulfat getrocknet.
Die Äthyla cetat-Lösung wurde unter vermindertem Druck und bei niedriger Temperatur auf 15 ml konzentriert und dann in 150 ml Petroläther dispergiert, wobei Kristalle ausgefällt wurden, welche man durch Filtrieren und wieder Ausfällen mit 10 ml Äthylaceta und 100 ml Petroläther gewann.Die Niederschläge wurden durch Filtrieren erhalten, mit 20 ml Äther-Petroläther (1 : 3 im Volumenverhältnis) und 20 ml Petroläther gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet, um 4, 1 g (Ausbeute 72, 2%) 6-[D-(-)-α-Aminophenylacet-
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Elementaranalyse von C. JH N.
O-S :
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<tb> C <SEP> (%) <SEP> H <SEP> (lu) <SEP> N <SEP> (ale}
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 65,58 <SEP> 7,28 <SEP> 7,40
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 65, <SEP> 92 <SEP> 7, <SEP> 59 <SEP> 7, <SEP> 05 <SEP>
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Beispiel 5 : a) In 930 ml Dimethylformamid wurden 93 g Benzylpenicillinkalium suspendiert und dann 10 g 2, 6-di-
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tert. -Butylphenollöst und nach Zugabe von 4 ml Pyridin die Mischung auf 0 bis-5 C gekühlt. Dann wurden 2,5 g Phosphorpentachlorid zu der Lösung zugesetzt und die Mischung 1, 5 h bei derselben Temperatur gerührt.
Nach Zugabe von 2, 8 g Calciumcarbonat zu der Reaktionsmischung fügte man 40 ml Methanol hinzu,während die Mischung auf-20 bis -30De gekühlt wurde und nachRühren der Mischung während 5 h wurde diese 48 h bei derselben Temperatur stehengelassen. WährendKühlendersogebildetenSuspensionauf-30bis-40 Cwurden1mlPyridinunddann50ml
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ter 16 h bei -15 bis -200e stehengelassen.
Die Reaktionsmischung wurde unter Zugabe von Perlit (hergestellt von der Fa. Toko Perlite K. K.) filtriert.
Das Filtrat wurde mit einer durch Waschen des Perlits mit 20 ml Dichloräthan erhaltenen Flüssigkeit vereinigt und die Mischung wurde auf 0 C gekühlt und mit 100 ml Wasser gemischt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf
5 mit 10% igem wässerigem Ammoniak und Rühren der Mischung während 50 min bei 0 C wurde die so gebil- dete Schicht des organischen Lösungsmittels erhalten.
Die Schicht des organischen Lösungsmittels wurde nach und nach mit 100 ml 0, In-Salzsäure und 100 ml einer I% igen wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung unter Kühlen und weiter zweimal mit 50 ml Wasser gewa- schen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abdestilliert worden ist, erhielt man 7,9 g eines hellbraunen, öligen Materials. Das Produkt wurde in 50 ml
Petroläther gelöst und nach Abfiltrieren einer geringen Menge von unlöslichen Bestandteilen wurden 100 ml Petroläther zu dem Filtrat hinzugefügt und die Mischung einige Stunden in einer Kühlkammer stehengelassen.
Der so gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gewonnen und mit einer geringen Menge Petroläther gewaschen, wobei man 3, 64 g (Ausbeute 64, 3%) 6-[D-(-)-α-Aminophenolacetamid]-penicillansäure-3',5'-di- - tert. -butyl-4'-hydroxybenzylester mit einem Schmelzpunkt von 155 bis 159 C (Zersetzung) erhielt.
Beispiel 6 : a) In 60 ml Dimethylformamid wurden 20 g Benzylpenicillinkalium suspendiert und dann 4 ml Pyridin der Suspension beigefügt. Nach Kühlen der Suspension auf 0 bis -5C wurden 40 ml Dimethylformamid, das 16,6 g 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylbromid enthielt, tropfenweise der Suspension über einen Zeitraum von 1 h unterRühren der Mischung in einem Stickstoffstrom in der Dunkelheit zugesetzt. Weiters wurde die Mischung nach Rühren während 6 h bei derselbenTemperatur im Stickstoffstrom verschlossen und überNacht in einer Kühlkammer stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde in ungefähr 500 g Eiswasser dispergiert und nach Zugabe von 500 ml Äther zu der Dispersion die Mischung geschüttelt und dann die gebildete Ätherschicht gewonnen.
Die Ätherschicht wurde mit 200 mleiner 1%igen wässerigen Natriumbicarbonat-Lösung und 200 mlWasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der Äther wurde abdestilliert und der so gebildete ölige Rückstand mit Petroläther extrahiert, um gebildetes Bis(3,4-di-tert.-butyl-4-hydroxyphenyl)äthan davon abzutrennen und anschliessend in 50 ml Äther gelöst. Die Lösung wurde dann in 250 ml Petroläther dispergiert und der so gebildeteNiederschlag durch Filtrieren gewonnen. Der Niederschlag wurde mit Petroläther gewaschen und getrocknet, um 23, 5 g (Ausbeute 79, 40/0) eines hellgelben Pulvers von Benzylpenicillin-31, 51-di-tert.-
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gelöst und nach Zugabe von 4 ml Pyridin die Mischung auf -5 C gekühlt.
Anscnliessend wurden 2,5 g Phosphorpentachlorid zugesetzt und die Mischung 105 min bei 0 bis -5C gerührt.
Der Reaktionsmischung wurden 2, 4 g Magnesiumcarbonat und während Kühlen der Mischung auf-20 bis - 300e 36 ml Methanol zugesetzt und die Mischung 5 h gerührt. Die Mischung wurde dann 16 h bei-20 C stehengelassen. Die so erhaltene Suspension wurde unter Zugabe von Perlit (hergestellt von der Fa. Toko Perlite K. K.) filtriert. Das Filtrat wurde auf 0 bis-5 C gekühlt und während Rühren der Mischung 4 ml Wasser hinzugefügt und dann nach Einstellen des pH-Wertes auf 4 bis 5 mit 10% igem wässerigem Ammoniak die Lösung 4h bei 0 bis -5C gerührt. Aus der Reaktionsmischung wurde die 1, 2-Dichloräthan-Lösung gewonnen und mit kaltem Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Der. 1, 2-Dichloräthan-Lösung wurden tropfenweise bei -10 C die Reaktionsmischung, die durch Suspendieren von 3 g D-(-)-Phenyl-N-(2-äthoxycarbonyl-1-methylvinyl)-glycin-Kaliumsalz in einer Mischung von 2 ml Tetrahydrofuran und 18 ml 1,2-Dichloräthan durch Kühlen der Suspension auf-10 bis-12 C durch tropfenweise Zugabe einer 1, 2-Dichloräthan-Lösung von 1, 18 g Pivalinsäurechlorid zu der Suspension unter Rühren und dann durch Umsetzen der Mischung während 2 h bei-7 bis-10 C hergestellt wurde, beigefügt.
Anschliessend wurde nach Rühren der Mischung 4 h und 30 min bei derselben Temperatur diese 16 h bei-20 C stehengelassen.
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<tb>
<tb> FiltratC <SEP> (%) <SEP> H <SEP> (0/0) <SEP> N <SEP> (ufo)
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 65,37 <SEP> 7,26 <SEP> 6,18
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 65, <SEP> 87 <SEP> 7, <SEP> 47 <SEP> 5, <SEP> 70 <SEP>
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c) In 340 mlA ceton wurden 6, 8 g 6-[D-(-)-α-(2-Äthoxycarbonyl-1-methylvinyl)-aminophenylacetamid]- -penicillansäure-3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester gelöst und nach Zugabe weiterer 85 ml 0, In-Salzsäure bei OOC die Mischung 30 min gerührt.
Zu der Reaktionsmischung gab man tropfenweise eine 5% ige wässe- rige Na-Bicarbonat-Lösung zu und nach Einstellen des pH-Wertes auf 4 bis 5 wurde Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert, wodurch eine wässerige Schicht, die ölige Bestandteile enthielt, erhalten wurde. Die wäs- serige Schicht wurde dreimal mit 50 ml Äthylacetat extrahiert und der so erhaltene Extrakt mit 50 ml einer 3%igen Natriumbicarbonat-Lösung und dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
Die so erhalteneÄthylacetat-Lösung wurde unter vermindertem Druck und bei niedriger Temperatur auf ungefähr 10 ml konzentriert und dann in 100 ml Petroläther dispergiert, wobei Kristalle ausfielen, welche durch Filtrieren gewonnen und anschliessend unter Verwendung von 10 ml Äthylacetat und 100 ml Petroläther wieder ausgefällt wurden.
Die Niederschläge wurden dann durch Filtrieren gewonnen, mit 20 ml einer Mischung von Äther und Petrol- äther (Volumsverhältnis 1: 3) und 20 m1 Petrol äther gewaschen und getrocknet, um 4,3 g (Ausbeute 75, 8%) von gelblichen, pulverigen Kristallen von 6- [D- (-)-α-Aminophenylacetamino]-penicillansäure-3',5'-di-tert.- - butyl-4'-hydroxybenzylester zu erhalten.
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benzylester-hydrochlorid wurde in 4 ml Dichloräthan gelöst und während Kühlen mit Eis fügte man 2 ml Dichlor- äthan, das 0, 33 g Cyclohexylamin enthielt, tropfenweise zu der Lösung unter Rühren hinzu.
Nach Rühren während 1 h bei OOC wurden 4 ml Wasser der Lösung beigegeben und nach Einstellen des PH auf 2 mit verdünnter Salzsäure die gebildete wässerige Schicht gewonnen und mit Wasser auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt.
Nachdem die Lösung einer Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese unterworfen wurde, konnte nur ein Spot an der Stelle, die dem et-Aminobenzylpenicillin entspricht, nachgewiesen werden und es wurde ebenfalls durch die Ergebnisse der quantitativen Analyse durch eine Disc-Methode unter Verwendung von B. Subtilis bestättigt, dass die Lösung 106 mg/ml et-Aminobenzylpenicillin enthielt. Die Gesamtmenge betrug 530 g (Ausbeute 92%).
Beispiel 8 : In 10 g Dichloräthan wurden 10 g 6-[D-(-)-α-Aminophenylacetamid]-penicillansäure- -3',5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester-hydrochlorid gelöst und 20 ml Dichloräthan, welches 2,5 g Di- äthylamin enthielt, tropfenweise unter Rühren und Eiskühlung hinzugefügt. Nach Rühren der Mischung während 1 h bei OOC gab man 40 ml Wasser zu und nach Einstellen des pH-Wertes auf 2 wurde die gebildete wässerige Schicht gewonnen und mit Wasser auf ein Volumen von 50 ml vermischt.
Nachdem die Lösung einer Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese unterworfen wurde, konnte nur ein Spot an der Stelle entdeckt werden, die dem < x-Aminobenzylpenicillin entspricht und durch die Ergebnisse der quantitativen Analyse der Lösung durch die Disc-Methode unter Verwendung von B. Subtilis, wurde bestätigt, dass die Lösung 110 mg/ml ex-Aminobenzylpenici1lin enthielt. Die Gesamtmenge betrug 5,5 g (Ausbeute 95%).
Der PH der wässerigen Lösung wurde auf 4,8 mit verdünntem wässerigem Ammoniak eingestellt und die Lösung in eine Kühlkammer gebracht, wobei Kristalle ausgefällt wurden, welche man durch Filtrieren abtrennte, mit einer geringen Menge kaltem Wasser wusch und trocknete, um weisse, nadelförmige Kristalle (Trihydrat) mit einem Schmelzpunkt von 201 bis 203 C (Zersetzung) zu erhalten.
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= +2560B e i s p i e l 9: In 40 ml Dimethylformamid wurden 2 g 6- [D-(-)-α-(Aminophnylacetamid]-penicillan- säure-3', 5'-di-tert.-butyl-4'-hydroxybenzylester gelöst und nach Kühlen der Lösung auf OOC wurden 0,94 g eines Thiophenolnatriumsalzes zu der Lösung hinzugefügt. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung 20 h bei 0 C stehengelassen.
Nachdem die Reaktionsflüssigkeit einer Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese unterworfen wurde, entleckte man nur einen positiven Fleck der Ninhydrin-Reaktion an der Stelle, die dem a -A minobenzy1penici1lin entspricht. Ebenfalls durch die Ergebnisse der quantitativen Analyse durch die Disc-Methode unter Verwendung von B. Subtilis wurde bestätigt, dass die Lösung 1, 14 g a-Aminobenzylpenicillin (Ausbeute 92, 70/0) enthielt.
DieReaktionsmischung wurde zu 400 ml einer Mischung von Petroläther und Äther (Volumsverhältnis l : l)
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zugesetzt, die gebildeten Niederschläge durch Filtrieren gewonnen und mit Methylisobutylketon und Äther ge- waschen, um 1,05 g eines gelben Pulvers zu erhalten.
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Beispiel 10 : a) In 930 ml Dimethylformamid wurden 97, 3 g Phenoxymethylpenicillinkalium suspendiert und dann zu der Suspension 10 g 2, 6-di-tert.-Butylphenol und 25 g Kaliumbicarbonat zugesetzt.
Die Suspension wurde auf-10 bis-15 C gekühlt und während dem Rühren der Suspension gab man 100 g 3, 5-di-tert.-Butyl-4-hydroxybenzylbromid portionsweise über einen Zeitraum von 5 h hinzu.
Nach weiterem Rühren der Mischung für 1 h bei derselben Temperatur wurde diese in ungefähr 2 kg Eis- wasser dispergiert und nach Zugabe von 11 Äther zu der Mischung und Rühren wurde die gebildete Ätherschicht abgetrennt. Die wässerige Schicht wurde weiters zweimal mit je 300 ml Äther extrahiert.
Die Extrakte wurden vereinigt und nach Waschen der Ätherlösung mit 500 ml 1%iger wässeriger Natrium- bicarbonat-Lösung und dann mit 500 ml Wasser wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
Die Ätherlösung wurde auf ungefähr 300 ml konzentriert und nachdem man 400 ml Petroläther zu dem Kon- zentrat zugegeben hatte und die Mischung unter Eiskühlung gerührt wurde, fielen gelbe Pulver aus. Nachdem man die Mischung einige Stunden abkühlen liess, wurden 123 g vonPhenoxymethylpenicillin-3', 5'-di-tert.- -butyl-41-hydroxybenzylester in Pulverform durch Filtrieren gewonnen, welche einer Ausbeute von 94% ent- spricht.
. b) 5, 76 g Phenoxymethylpenicillin-31, 51 -di-tert. -butyl-41 -hydroxybenzylester wurden in 55 m1 Dichlor- äthan gelöst und nach der Zugabe weiterer 4, 12 ml N, N-Dimethylanilin zu der Lösung wurde die Mischung auf -25 1-50C gekühlt. Anschliessend wurden 2, 3 g Phosphorpentachlorid der Mischung beigegeben und die ent- standene Mischung l h bei-25 50C gerührt. Dann fügteman.
während die Mischung bei-25 50C gehalten wurde, 40 ml Methanol tropfenweise zu und die Mischung wurde weitere 2, 5 h geriihrt. Die Reaktionsmischung wurde mit 6, 86 ml N, N-Dimethylanilin vermischt und während dem Kühlen der Mischung auf-25 5 C unter Rühren wurden 2, 5 g D- (-)-Phenylglycylchlorid-hydrochlorid in Portionen über einen Zeitraum von 1 h zuge- setzt. Darauf wurde die Mischung 2 h bei derselben Temperatur gerührt und zu ungefähr 200 g Eiswasser, das mit Salzsäure angesäuert wurde (PR 2 bis 3), hinzugefügt und nach ausreichendem Schütteln wurde die Mi- schung stehengelassen, worauf man die so gebildete wässerige Schicht von der Dichloräthan-Schicht trennte.
Die wässerige Schicht wurde zweimal mit je 20 ml Dichloräthan extrahiert. Eine Mischung der DichloräthanSchicht und des Extraktes wurde dreimal mit je 50 ml wässeriger Salzsäure-Lösung mit einem pH-Wert von 3 gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Dichloräthan-Lösung wurde auf 0 C gekühlt, 3 ml Diäthylamin wurden der Lösung unter Rühren zugesetzt und die Mischung wurde 1, 5 h bei 0 C gerührt. Anschliessend fügte man 20 ml Wasser zu der Mischung hinzu und der pH-Wert der wässerigen Schicht wurde unter Rühren mit verdünnter Salzsäure auf ungefähr 2 eingestellt. Die wässerige Schicht wurde von der Dichloräthan-Schicht getrennt und letztere zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen.
Eine Mischung desExtraktes und der wässerigen Schicht wurde zweimal mit je 20 ml Methylisobutylketon gewaschen. Das Gesamtvolumen der Mischung wurde auf 50 ml eingestellt.
Wenn die so erhaltene wässerige Lösung einer Hochspannungs-Filterpapier-Elektrophorese unterworfen wurde, konnte lediglich ein positiver Fleck bei der Ninhydrin-Reaktion an der Stelle, die dem a-Aminobenzylpenicillin entspricht, festgestellt werden. Ebenfalls als Ergebnis der quantitativen Analysen durch die Disc-Me- thode unter Verwendung von B. Subtilis wurde gefunden, dass die wässerige Lösung 2,6 g ot-Aminobenzylpenicillin enthielt (Ausbeute : 67, 6%).
Nach Einstellen des pH der so erhaltenen wässerigen Lösung auf 5 mit verdünntem wässerigemAmmoniak wurde die Lösung auf ungefähr 10 ml unter reduziertem Druck und bei niedriger Temperatur konzentriert und nachdem man das Konzentrat in einem Refrigerator abkühlen liess, fielen Kristalle aus, welche durch Filtrieren gewonnen, mit einer geringen Menge kaltem Wasser gewaschen und getrocknet wurden, um 2, 0 g der weissen, nadelförmigen Kristalle von ctraminobenzylpenicillintrihydrat in einer Ausbeute von 45, 1% zu erhalten.
Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 200 bis 203 C (Zersetzung) [a] = +256 (C = l, Wasser)
Die Ergebnisse der biologischen, quantitativen Analyse zeigten, dass die Reinheit des Produktes 960 y/mg betrug.
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