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Verfahren zur Herstellung der neuen 4- (9-Adenyl)-2, 3-dihydroxy-buttersäure und ihrer Salze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen 4- (9-Adenyl)-2, 3-dihydroxy-butter- säure der Formel
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und deren pharmazeutisch brauchbaren Salze.
Es gelang einen neuen hypocholesterolemischen Stoff (hier als"Lentinacin"bezeichnet) aus dem essbaren Pilz"Shütake" (Lentinus edodes Sing.) in Form reiner Kristalle zu isolieren und dessen Struktur durch Spektrometrie, Abbaustudien und weiters Totalsynthese als 4-(9-Adenyl)-2(R),3(R)-dihydroxy- - buttersäure (D-erythro Konfiguration) zu bestimmen.
Es wurde gefunden, dass Lentinacin aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff besteht.
Das Molekulargewicht des Lentinacins wurde massenspektrometrisch mit 2 53 bestimmt (Eltern-Peaks bei m : e 253 und Fragment-Peaks bei m : e 236, 218, 208, 178, 174,148 und 135).
Die Elementar-Analyse des Lentinacins erbrachte folgende Ergebnisse : 42, 7S% Kohlenstoff, 4, 34% Wasserstoff, 27, 51% Stickstoff. Daher konnte die empirische Formel von Lentinacin zu C9Hll O, N 5 bestimmt werden, welche 42, 69% Kohlenstoff, 4, 39% Wasserstoff und 27, 67% Stickstoff enthalten musste.
Lentinacin war gegen alle Farbreaktionen auf Zucker, Steroide oder Alkaloide negativ. Lentinacin trägt mindestens eine Carboxylgruppe, da es einen Ester bildet und an einem schwachen Anionentauscher-Harz adsorbiert wird. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Lentinacin ist spezifisch für 9-substituierte Adenin-Verbindungen (s. Journ. Am. Chem. Soc. 84,2148 [1962]).
U. V. max. von Lentinacin (freie Säure)
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Die massenspektrometrische Aufnahme von den Methylestern des Lentinacins zeigte einen Peak bei der Massenzahl 135, der dem Adenin entspricht. Das Kernresonanzspektrum des Natriumsalzes von
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bis 4, 10 (m, 4H), welche alle spezifisch für die chemische Verschiebung von Protonen an den 2-und 8-Positionen des 9-substituierten Adeninskeletts sind. Bei der sauren Abbaureaktion von Lentinacin wurden Glycin und 4-Amino-2, 3-dihydroxy- buttersäure erhalten. Die Bildung von Glycin beim Abbau wird, wie berichtet, normal für den Abbau von Adeninverbindungen angesehen (Biochemica et Biophysica Acta 58,585 [1962]).
Die Konfiguration der 4-Amino-2, 3-dihydroxy- buttersäure, die aus dem Lentinacin erhalten wurde, konnte durch Synthese aus 4-Amino-4-dioxy-2, 3-0-isopropyliden-D-erythro- - Säure als D-erythro-Type [selbst, 2 (R), 3 (R)-KonfigurationJ bestimmt werden.
Dementsprechend wurde die chemische Struktur des Lentinacins als 4- (9-Adenyl)-2 (R), 3 (R)-dihydroxy-buttersäure aufgeklärt. Lentinacin wurde aus heissem Wasser umkristallisiert und schmilzt bei 261 bis 2630C (unter Zersetzung).
Das Halbhydrat des Natriumsalzes bildet farblose Blättchen, die bei 266 bis 2680C zersetzt werden.
[ [cdD'"= +45, 5 (C=l, inH O)].
Die sterische Konfiguration von Lentinacin wurde durch Totalsynthese, als D-erythro-Typ nachgewiesen. Die physikochemischen Eigenschaften des synthetisiertenLentinacins koinzidierten mit denen des natürlichen Lentinacins. Darüber hinaus zeigte das synthetische Lentinacin ebenso wie das natürliche einen bemerkenswerten hypocholesterolemischen Effekt.
Das Lentinacin kann durch Extraktion von gepulvertem Lentinus edodes Sing. mit einer wässerigen Lösung, die etwa 701a eines herkömmlichen niederen Alkanols, wie Methanol oder Äthanol, enthält, isoliert werden. Man trennt dann die unlöslichen Substanzen von dem Extrakt und absorbiert dann, wenn nötig, den hypocholesterolemischen Anteil auf einem Kation-Austauscherharz [Dowex 50W, Amberlite IR-120 (H+Form)], um nichtkationische Substanzen, die an dem besagten Harz nicht adsorbiert werden, zu entfernen.
Danach wird durch Eluierung der adsorbierte hypocholesterolemische Anteil mit wässerigem Ammoniak vom Harz entfernt, indem man die sauren Bestandteile im Eluat auf einem schwachen Anionentauscherharz, wie Amberlite IR-45 (Cl-Form) adsorbiert, von dem man den wirksamen Anteil des besagten Harzes mit einer flüchtigen Säure, wie Essigsäure, eluiert und dann das Eluat chromatographisch auf einer Kationentauscherharzsäule, die mit Amberlite CG-120 gefüllt ist, fraktioniert, um die hypocholesterolemische Fraktion, welche ein Absorptionsmaximum bei etwa 262 mu zeigt, zu sammeln, und nach dem Entsalzen der Ionentauscherkolonne das kristalline Lentinacin aus der Fraktion gewinnt.
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Als Metallsalze des Adenins sind vorzugsweise Alkalimetallsalze, wie Natrium-, Lithium- und Kaliumsalze geeignet, die nach einer herkömmlichen Methode, wie z. B. durch Reaktion des Adenins mit Natriumhydrid, metallischem Natrium, Natriumhydroxyd, Natriumamid, Lithiumamid, Kaliumcarbonat oder Kaliumhydroxyd, in einem geeigneten Lösungsmittel bei Raumtemperatur oder unter mässigem Erhitzen hergestellt werden können. Vorzugsweise Beispiele für die Restgruppe des oben genannten Acetals oder Ketals sind Äthyliden, Isopropyliden und Benzylidenreste.
Die Kondensationsreaktion des Metallsalzes des Adenins mit dem Lacton (II) wird vorzugsweise unter Erhitzen ausgeführt, wobei das entsprechende Metallsalz der Verbindung (III) entsteht. Das Metallsalz der Verbindung (III) wird leicht in die entsprechende freie Säure der Verbindung (III) auf herkömmliche Weise, wie z. B. durch Neutralisation oder Behandlung mit einem lonentauscherharz übergeführt. Als Reaktionslösungsmittel für die Bildung des genannten Metallsalzes des Adenins und für die nachfolgende Kondensationsreaktion mit der Verbindung II sind vorzugsweise Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Dimethylacetamid, ihre Mischungen mit Pyridin od. dgl., geeignet.
Das Zwischenprodukt III oder dessen Metallsalz wird dann zur Entfernung der Schutzgruppe
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Schwefelsäure usw., bei Raumtemperatur oder auch bei leicht erhöhter Temperatur durchgeführt werden.
Die entstandene 4- (9-Adenyl)-2, 3-dihydroxy-buttersäure kann aus der Reaktionsmischung auf herkömmliche Weise isoliert werden, z. B. durch Adsorption des anorganischen Salzes und des zurückgebliebenen, nicht an der Reaktion teilhabenden Adenins an einem Ionentauscherharz.
Die obige Reaktion kann gleicherweise auch auf die entsprechenden optischen Isomeren der Verbindung II ohne Racemisierung angewendet werden. Daher kann, wenn 2, 3-0-geschütztes-D-Erythrono- lacton als Ausgangsverbindung II verwendet wird, eine chemische Substanz hergestellt werden, die dem natürlichen Lentinacin völlig gleicht. Die Reaktion kann bei Verwendung von 2, 3-D-geschütztem- - DL-Erythronolacton als Ausgangsverbindung II zu einem racemischen Gemisch mit äCP/o einer Substanz, die dem natürlichen Lentinacin gleicht, führen.
Die so hergestellte Verbindung I kann dann weiter in stabile oder pharmazeutisch brauchbare Salze, wie z. B. Salze des Natriums, Kaliums, Calciums, Magnesiums und Aluminiums, übergeführt werden, welche alle die hypocholesterolemische Wirkung in demselben Masse besitzen, wie die freie Säure der Verbindung I.
Kalium-Salz : CgH ONgK. 1/2 H O, farblose Plättchen, Fp. 261 bis 2650C (Zersetzung) ; in Wasser leicht löslich, praktisch unlöslich in Äthanol und andem organischen
Lösungsmitteln.
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schlecht löslich, praktisch unlöslich in organischen Lösungsmitteln.
Die hypocholesterolemische Wirkung von Lentinacin erwies sich als schätzungsweise zwanzigmal stärker als die von Clofibrate (chemischer Name : Äthyl-2-parachlorphenoxy-2- methylpropionat), welches als eines der am besten wirksamen hypocholesterolemischen Substanzen bisher bekannt war. Ein Beispiel eines vergleichenden Versuches ihrer hypocholesterolemischen und hypotriglyceridinischen Wirkungen wird im folgenden dargestellt :
Versuch : Lentinacin wurde in Form des Natriumsalzes einer handelsüblichen Grundkost (von der japanischen CLEA Company) zugegeben, auf der männliche Ratten der Sprague-Dawley-Art mit einem Gewicht von 140 bis 160 g sieben Tage lang gehalten wurden (jede Testgruppe bestand aus acht Ratten).
Nach dieser Zeit wurde das gesamte Cholesterol und Triglycerid im Serum der Ratten nach der Zack- und Van-Handel und Zilversmit-Methode bestimmt.
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Die Ergebnisse zeigen Tabelle 1.
Tabelle 1
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<tb> % <SEP> Abnahme <SEP> im <SEP> gesamten <SEP> % <SEP> Abnahme <SEP> im <SEP> gesamten
<tb> Verbindung <SEP> in <SEP> der <SEP> Kost <SEP> % <SEP> Serum-Cholesterol <SEP> Serum-Triglycerid
<tb> Lentinacin
<tb> (Na-Salz <SEP> Hemihydrat) <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 26 <SEP> 49
<tb> Lentinacin
<tb> (Na-Salz <SEP> Hemihydrat) <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> 20 <SEP> 30
<tb> Lentinacin
<tb> (Na-Salz <SEP> Hemihydrat) <SEP> 0, <SEP> 002 <SEP> 15 <SEP> 21
<tb> Lentinacin
<tb> (Na-Salz <SEP> Hemihydrat) <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 8 <SEP> 19
<tb> Clofibrate <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 28 <SEP> 62
<tb> Clofibrate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 21 <SEP> 34
<tb> Clofibrate <SEP> 0,
<SEP> 05 <SEP> 15 <SEP> 31
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Darüber hinaus ist sowohl die akute wie auch die chronische Toxizität von Lentinacin extrem niedrig. Zum Beispiel überlebten alle fünf Mäuse, denen oral oder intravenös 1000 mg/kg Körpergewicht Lentinacin eingegeben wurde, 14 Tage lang. Zehn Ratten, denen 500 mg/kg Lentinacin täglich Dral eingegeben wurde, lebten über 1 Monat lang und sieben von zehn Ratten, die oral 1000 mg/kg Lentinacin täglich verabreicht bekamen, überlebten über 1 Monat.
Lentinacin und seine pharmazeutisch brauchbaren Salze sind insbesondere vorteilhaft bei der Behandlung oder Verhütung solcher Hypocholesterolemien, die als Begleiterscheinung von Arteriosklerose, Hypertension, Herzinfarkt, Angina pectoris, Cerebromalacia oder cerebral rascular, auftreten. Sie können in beiden Formen, nämlich für orale oder parenterale Verabreichung, in Verbindung mit einem pharmakologisch brauchbaren Trägermaterial verwendet werden. Die vorzugsweise täglichen Dosen
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betragen etwa 100 bis 300 mg (als freie Säure berechnet) für einen erwachsenen Menschen. Bei Anwendung dieser angegebenen Dosismengen treten keine unangenehmen Nebenerscheinungen auf.
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durch eine Säule mit 50 ml AmberliteIR-120 (H+ Form) geschickt und darauf mit 5% zig wässerigem Ammoniak eluiert.
Das Lösungsmittel wird durch Abdampfen unter vermindertem Druck von dem Eluat entfernt, zu dem Rückstand eine kleine Menge Wasser gegeben und das zurückgebliebene unlösliche Adenin abfiltriert. Dann wird eine kleine Menge Natriumbicarbonat zu dem Filtrat zugegeben und dazu eine genügende Menge Äthanol, um die Kristallisation des Natrium-4-(9-adenyl)-D-erythro-2,3-dihydroxy-butyrats zu ermöglichen. Nach dem Trocknen und Erhitzen unter vermindertem Druck wurden 470 mg leicht gelblich-braune Kristalle, die sich bei 225 bis 2290C zersetzen, erhalten. Die Kristalle
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2 :- D-erythronolacton zu der Mischung zugegeben und die Mischung unter Rühren 12 h lang auf 140 3 C erhitzt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 40 ml Wasser gelöst und die zurückbleibende unlösliche Substanz abfiltriert.
Das Filtrat wird dann wie in Beispiel 2 durch Amberlit IR-120 (H+Form) geschickt und das Eluat solange eingedickt, bis 4- (9-Adenyl)-D-erythro-2, 3-iso- propyliden-dioxy-buttersäure auskristallisierte. Zersetzung bei 170 bis 1750C.
Die Kristalle werden in einer verdünnten wässerigen Lösung von Natriumbicarbonat gelöst und die Lösung entfärbt, danach mit 3%iger Ameisensäure neutralisiert und dabei 2, 0 g gereinigte farblose Prismen der Säure, die bei 220 bis 2220C zersetzt wird, erhalten.
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:U. V. max. : 263 m/l (in Wasser) N. M. R. : (D20, NaOD)
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hydrid zur Suspension zugegeben. Nach 45-minütigem Rühren der Suspension bei 600C wurden 2, 16 g 2, 3-0-Äthyliden-D-erythronolacton zur Suspension zugegeben. Die Mischung wird dann 8 h lang unter Stickstoff am Rückfluss gekocht. Die Reaktionsmischung wird dann filtriert und das Dimethylformamid unter vermindertem Druck abgedampft.
Dann wird eine kleine Menge Wasser zu dem Rückstand gegeben und die Mischung über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die Mischung wird abfiltriert und das Filtrat durch eine Säule mit Dowex 50W geschickt, die Kolonne danach mit wässerigem Ammoniak eluiert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert, und es ergeben sich rohe Kristalle von 4-(9-Adenyl)-D-etythro-2,3-äthyliden-dioxy-buttersäure. Das Produkt wird danach in 15 ml Wasser gelöst und ein Drittel der Lösung wird durch präparative Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel (Lösungsmittel : Essigsäure-Butanol : Wasser = 1 : 4 : 5) gereinigt und ergibt farblose Prismen mit einem Zersetzungspunkt bei 241 bis 243 C. Ausbeute 200 mg.
Die Kristalle werden mit 5 ml 20%iger Schwefelsäure auf einem Wasserbad erhitzt und dann mit wässerigem Ammoniak neutralisiert und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird dann auf dem Eisbad stehen gelassen, wobei Kristalle von 4-(9-Adentyl)-D-erythro-2,3-dihydroxy- - buttersäure anfallen. Fp. 252 bis 2540C (unter Zersetzung).
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Eine weitere Umkristallisation aus Wasser gibt gereinigte Kristalle mit einem Zersetzungspunkt bei 261 bis 2630C.
Der übriggebliebene Teil der wässerigen Lösung der rohen 4- (9-Adenyl)-D-erythro-2, 3-äthyliden- - dioxy-buttersäure wird zu 20 ml 2 Obiger Schwefelsäure zugegeben und die Mischung 2 h lang gekocht. Die Mischung wird dann mit wässerigem Ammoniak neutralisiert und durch eine Kolonne, die mit Dowex 50W gefüllt ist, geschickt. Die Kolonne wird dann mit wässerigem Ammoniak eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt. Sodann wird eine wässerige Lösung von Natriumbicarbonat zu dem Rückstand zugegeben, bis das Schäumen aufhört. Dann wird die Mischung entfärbt, filtriert und das Filtrat eingeengt, worauf eine geeignete Menge Methanol unter Erhitzen zu dem Konzentrat zugegeben wird.
Nach dem Abkühlen werden die entstandenen Kristalle abfiltriert, in Luft getrocknet und ergeben 650 mg Natrium-4- (9-adenyl)-D-erythro-2, 3-dihydroxy-butyrat. 2, 5 HP in Form farbloser Plättchen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck bei etwa 450C erwiesen sich die Kristalle
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140 bis 1500C 12 h lang erhitzt. Das Dimethylformamid wird aus der Mischung durch Abdestillieren entfernt und der Rückstand in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird über Nacht auf dem Eis stehen gelassen und abfiltriert. Das Filtrat wird dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 0, 5n-Ameisensäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt. Die ausgefallenen Kristalle
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g- dioxy-buttersäure erhalten wird.
Das Rohprodukt wird durch Cellulosepulver-Chromatographie, auf die eine Umkristallisation aus wässerigem Alkohol folgt, gereinigt und es werden Kristalle mit einem Zersetzungspunkt bei 191 bis 193 C erhalten. 2 g des obigen Rohproduktes werden mit 10 ml 5% tiger Salzsäure 1 h lang auf 500C erhitzt und die Mischung mit Äthylacetat extrahiert, um Benzaldehyd zu entfernen. Dann wird die Mischung durch eine Kolonne, die mit Amberlit IR-120 gefüllt ist, geschickt und die Kolonne mit wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand mit Ameisensäure auf den pH-Wert 4 eingestellt. Die Mischung wird über Nacht stehen gelassen und es fallen 0, 8 g 4- (9-Adenyl)-D-erythro-2, 3-dihydroxy-buttersäureTRohkristalle aus.
Die Kristalle werden wie in Beispiel 3 gereinigt und ergeben 480 mg Natriumsalz-Halbhydrat mit einem Zersetzungspunkt bei 244 bis 2460C. Nach der weiteren Reinigung werden Kristalle mit einem Zersetzungspunkt bei 266 bis 268 C erhalten.
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