AT250390B

AT250390B - Verfahren zur Gewinnung von Guanosin-5'-phosphaten auf mikrobiologischem Wege

Info

Publication number: AT250390B
Application number: AT444363A
Authority: AT
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1962-06-12
Filing date: 1963-05-31
Publication date: 1966-11-10

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Gewinnung von Guanosin-5'-phosphaten auf mikrobiologischem Wege 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von   Guanosin-5'-phosphaten   auf mikrobiologischem Wege. 



   Die 5'-Phosphate der verschiedenen Nucleoside, wie beispielsweise Guanylsäure und Inosinsäure, sind wertvolle geschmackverbessemde Mittel für Nahrungsmittel, Getränke und Würzen. Die Zugabe kleiner Mengen dieser Nucleoside erhöht den Geschmack der verschiedenen Nahrungsmittel, Getränke und Würzen erheblich. 



   Die Nucleosid-5'-phosphate können durch enzymatische Hydrolyse von Ribonucleinsäure hergestellt werden. Diese Arbeitsweise ist jedoch verhältnismässig teuer ; es wurde daher nach andern, zur Erzeugung dieser Produkte in technischem Massstab geeigneteren Verfahren gesucht. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Guanosin-S'-phosphaten besteht darin, dass man einen Stamm von B. subtilis mit niedriger Nucleotidase-Aktivität, wie B. subtilis NRRL B-2911, in einem wässerigen   Nährmedium.   das assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen wie Sojamehl oder Caseinhydrolysate und Maltose oder Stärke enthält, so lange kultiviert, bis eine wesentliche Menge Guanosin- - 5'-phosphaten entstanden ist und diese hierauf in an sich bekannter Weise, insbesondere mittels chromatographischer Methoden aus der Gärbrühe isoliert. 



   Die Erzeugung der 5'-Nucleotide wird zweckmässig durch eine kleine Menge Adenin stimuliert. 



   Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen   Guanosin-5'-phosphate   sind Gemische von Guanosinmonophosphat und Guanosindiphosphat. Möglicherweise enthält das Gärprodukt andere Phosphate, beispielsweise Guanosintriphosphat. Das aus den Gärbrühen erhaltene Guanosindiphosphat und-triphosphat kann durch Erhitzen in Guanosinmonophosphat übergeführt werden. 
 EMI1.1 
 tilis mit niedriger Nucleotidase-Aktivität können durch Mutation nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Die mutierten Stämme können wie im folgenden beschrieben geprüft werden, um zu bestimmen, ob die Stämme die gewünschten   Guanosin-5'-phosphate   erzeugen. 



   Ein Stamm von   B.   subtilis, der zur Erzeugung dieser gewünschten Produkte besonders gut brauchbar ist, wurde im Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt, wo er unter der Nummer NRRL B-2911 verfügbar ist. 



   Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemässe Verfahren zur Erzeugung der   Guanosin-5'-   - phosphate. 



     Beispiel l :   Ein Gärmedium, das die folgenden Bestandteile enthält, wird wie folgt hergestellt : 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Sojamehlextrakt+ <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Natriumcitrat <SEP> 11, <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Adeninsulfat <SEP> 0,015 <SEP> g
<tb> (NHHPO4 <SEP> 19, <SEP> 8 <SEP> g
<tb> KC1 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> MgSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 0,493 <SEP> g
<tb> Car\. <SEP> 2 <SEP> Hp <SEP> 0,147 <SEP> g
<tb> 
 + 50 g pulverisiertes Sojamehl werden in 110, 025n-Natronlauge 1 h gedämpft, durch drei Filter- tuchschichten filtriert und mit Wasser auf 11 aufgefüllt. 



   40 ml dieses Mediums werden in 250ml-Erlenmeyerkolben verteilt, und die Kolben samt Inhalt werden durch 15minutige Behandlung im Autoklaven bei 1200C sterilisiert. 



   Das Medium wird dann mit 0,01 Volumen einer verdünnten Schrägkultursuspension von B. subtilis NRRL B-2911 in 0, 1m-Phosphatpuffer (PH 6) beimpft. Die beimpften Kolben werden dann 11 Tage lang bei   28 C   auf einer Drehschüttelvorrichtung bei einer Drehbewegung von 220   Umdr/min   inkubiert. Nach der Fermentationszeit wird die Brühe mit 7%   Perchlorsäure extrahiert,   und der neutralisierte Extrakt wird auf mikrobiologischem Wege mit B. subtilis G295 nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren auf seinen Gehalt geprüft. 



   Die Extraktion mit Perchlorsäure wird durch Zugabe von 1/10   Volumina 70 iger   Perchlorsäure zu der   Gärbrühe,   Zentrifugieren zur Entfernung der ausgefällten Proteine und Neutralisieren der überstehenden Schicht mit einem Alkali durchgeführt. 



   Die Gehaltsprüfung des Perchlorsäureextraktes zeigte, dass die Brühe 255 y Guanin-Äquivalente je ml enthielt. Alternativ können die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Brühe auf ihren Gehalt geprüft werden. 



   Die Gehaltsprüfung besteht in einem mikrobiologischen Röhrchenverfahren unter Verwendung von B. subtilis G295, einer Guanin benötigenden Mutante, die auf Guanin und Guanin enthaltende Nucleoside und Nucleotide anspricht. Das Prüfungsmedium mit doppelter Konzentration enthält je 11 : 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> NBC <SEP> vitaminfreies <SEP> Caseinhydrolysat <SEP> (Säure) <SEP> salzfrei <SEP> 20 <SEP> g
<tb> K2HPO4 <SEP> 6 <SEP> g
<tb> KH2PO <SEP> 2 <SEP> g
<tb> NH4Cl <SEP> 1 <SEP> g
<tb> NHOg <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> Na. <SEP> S04 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> g
<tb> MgSO4. <SEP> IHO <SEP> 0,02 <SEP> g
<tb> FeS04. <SEP> 7HO <SEP> 0,002 <SEP> g
<tb> MnS04'HzO <SEP> 0, <SEP> 0016 <SEP> g
<tb> Cadiz <SEP> 0,0010 <SEP> g
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 8-7, <SEP> 0
<tb> 
 
Die Prüfung wird wie folgt   durchgeführt :

    
Die zentrifugierte Brühe oder der neutralisierte Perchlorsäureextrakt wird in 20 x 175 mm Teströhrhen eingebracht, wonach mit Wasser auf 5 ml aufgefüllt wird und dann 5 ml des doppelt-konzentrierten Prüfmediums zugegeben werden. Zum Bedecken der Röhrchen werden Verschlüsse aus rostfreiem Stahl verwendet. Die Röhrchen werden im Autoklaven behandelt und mit einem Tropfen einer verdünnten Spo-   : ensuspension   von B. subtilis G295 (2 Tropfen der Sporensuspension je 10 ml Wasser) beimpft. Die Inku-   ) ation   erfolgt 16 h lang bei   370C   auf einer Drehschüttelvorrichtung (220 Umdr/min). Einbezogen ist eine Reihe von Röhrchen, die von 0 bis 100 y/ml am Dinatriumguanosinmonophosphat   (Na GMP. 2 HO)   entlalten, was einem Guaningehalt von 0 bis 34 y/ml entspricht.

   Nach der Inkubation werden die optischen richten in einem Lumetronkolorimeter bei 660 mg bestimmt. Die Ergebnisse werden in mg/ml Guanin-   iquivalenten   angegeben (wenn die gesamte Aktivität durch GMP bedingt wäre, so könnte das Gewicht von   Na2GMP. 2H2O durch Miltiplikation der &gamma;/Ml Guaninäquivalente   mit 2, 93 erhalten werden.) 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 
Ein Teil des wie oben beschrieben erhaltenen   Perchlorsäureextraktes   wurde nach Neutralisation an runden Blättern von Papier Whatman Nr. l unter Verwendung des Lösungsmittelsystems 1 (n-Propanol-    NHa-H20, 6 : 3 : 1),   Systems 2 (Isobuttersäure-konz.-NH4OH-H2O, 66:1: 33) und Systems 3 (Isobut-   tersäure-konz.-NH OH-H 0, 5*7 : 4 :   39) chromatographiert.

   In allen drei Lösungsmittelsystemen lag eine der U.   V.-Absorptionsbanden   bei einem   Rf- Wert,   der demjenigen von GMP   (5')   entsprach. Der neutralisierte Extrakt wurde in Mischchromatographie mit GMP (5') und auch mit handelsüblicher"Guanylsäure" [von der angenommen wird, dass sie ein Gemisch von GMP (2') und GMP (3') ist] in dem System 1 untersucht. Eine Bande in dem Extrakt lief mit dem GMP (5'), jedoch nicht mit handelsüblicher Guanylsäure. 



   Die verschiedenen Banden und die Bereiche zwischen den Banden wurden nach Chromatographie des neutralisierten Extraktes in dem Lösungsmittelsystem   l   ausgeschnitten, mit Wasser eluiert, in die   Röhr-   chen zur biologischen Prüfung eingebracht und mit B. subtilis G295 beimpft. Nur die Bande bei Rf 0, 12 zeigte Bioaktivität. Diese Bande lief in der Mischchromatographie zusammen mit dem   Gap (5') in   den 
 EMI3.1 
 
Der neutralisierte Extrakt wurde zu einer Anionenaustauschersäule von Dowex-l-X2 gegeben. Die Säule wurde mit 0, 005m-Salzsäure gewaschen, die Guanin und Guanosin entfernt. Die Säule wurde dann mit   0, 1m-Salzsäure   gewaschen, die Nucleotide entfernt.

   Die Proben wurden auf ihren Gehalt geprüft, und die Berechnung zeigt, dass die ursprüngliche Brühe 50   y/ml   an Guanin + Guanosin, berechnet als Guanin,   und 570 &gamma;/ml Guanosin-5'-phosphate,   berechnet als   NaGMP.2HO, enthielt.   



   Das 0,   lm-HCI-Harzeluat   wurde durch Lyophilisation eingeengt und einer Kreismischchromatographie mit GMP (5') und   handelsüblicher"Guanylsäure"in   den Lösungsmittelsystemen 1 und 4 unterworfen. 



  Nur im Falle von GMP (5') lief eine der Eluatbanden bei der Chromatographie zusammen mit der bekannten. 



   Das Harzeluat und die aus dem Papier eluierte Bande wurden auf Papier mit bekannten, Guanin enthaltenden Nucleotiden hinsichtlich der Reaktion mit dem Cystein-Schwefelsäure-Spray für Desoxyribose enthaltende Verbindungen und mit dem Perjodat-Benzidin-Spray für Verbindungen mit benachbarten Hydroxylgruppen an dem Zuckerteil mit den folgenden Ergebnissen verglichen : 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Cystein-Schwefelsäure <SEP> Perjodat-Benzidin <SEP> 
<tb> GMP <SEP> (5') <SEP> negativ <SEP> positiv
<tb> handelsübliche"Guanylsäure <SEP> !' <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb> Desoxyguanylsäure <SEP> positiv <SEP> negativ
<tb> Harzeluat-+++
<tb> Papierbande <SEP> fui <SEP> ++ <SEP> 
<tb> 
 
Die obigen Daten zeigen, dass B. subtilis NRRL B-2911 Guanin enthaltende Ribonucleotide anhäuft, wobei die Phosphate an der 5'-Stellung der Ribose gebunden sind. 



   Beispiel 2 : In einer andern Reihe von Versuchen wurde B. subtilis NRRL B-2911 in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium mit und ohne Adenin gezüchtet. Die Fermentation wurde wie in Beispiel 1 beschrieben 10 Tage lang bei   280C   durchgeführt. Nach Beendigung der Fermentation wurde die Brühe zentrifugiert und die überstehende Schicht wie in Beispiel 1 beschrieben auf ihren Gehalt geprüft. 



   Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle gezeigt : 
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> Zusatz <SEP> Mediumvolumen <SEP> in <SEP> ml <SEP> y/ml <SEP> Guaninje <SEP> 250 <SEP> ml-Kolben <SEP> äquivalent
<tb> keiner <SEP> 40 <SEP> 120
<tb> 15y/mlAdeninsulfat <SEP> 40 <SEP> 210
<tb> 
 
Beispiel 3 : Bei einem   andem   Versuch wurde B. subtilis   NRRL B-2911 in dem in Beispiel 1 be-   schriebenen Medium ohne Adeninsulfat gezüchtet. Bei diesem Versuch betrug das Volumen des Mediums 20 ml je 250 ml-Erlenmeyerkolben. Nach Beendigung der Fermentation, die 10 Tage lang bei   28 C   

 <Desc/Clms Page number 4> 

 durchgeführt wurde, wurde die Brühe zentrifugiert und die überstehende Brühe wie oben beschrieben auf ihren Gehalt geprüft. Die Gehaltsprüfung zeigte, dass 200 y/ml Guaninäquivalente vorlagen. 



   Ein Teil der   geklärten Brühe   wurde nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren einer Papierchro- matographie unterzogen, und die Banden wurden ausgeschnitten, mit Wasser eluiert und über Dowex 1-X2 i chromatographiert. Proben des durch Waschen mit 0, 005n-HCl und mit 0, ln-HCl erhaltenen Eluats wur- den dann auf ihren Gehalt geprüft. Aus der Gehaltsprüfung ergab sich durch Berechnung, dass die ursprüng- liche Brühe 70 y/ml an Guanin und Guanosinäquivalenten und 380 y/ml an Guaninnucleotiden, als   Na GMP. 2 HO,   enthielten. 



   Beispiel 4 : In einer weiteren Reihe von Prüfungen wurde B. subtilis NRRL B-2911 in dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium, das mit 15 y/ml Adeninsulfat   und 30 y/ml Adeninsulfat ergänzt war,  
10 Tage lang bei   28 C   gezüchtet. Bei diesen Versuchen betrug das Volumen des Mediums 20 ml je
250   ml-Kolben.   Nach Beendigung der Fermentation wurde die Brühe zentrifugiert und die überstehende
Schicht wie in Beispiel 1 beschrieben auf ihren Gehalt geprüft.

   Die Ergebnisse sind in der folgenden Ta- belle gezeigt : 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Adeninsulfat <SEP> y/ml <SEP> Guaninäquivalent <SEP> y/ml
<tb> 15 <SEP> 240
<tb> 30 <SEP> 295
<tb> 
   Beispiel 5 :   Ein Medium wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei 80 g Maltose an Stelle der löslichen Stärke verwendet wurden. 20 ml des Mediums wurden in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert und mit Adeninsulfat in einer Menge von 15   y/ml   ergänzt. Das sterilisierte Medium wurde mit B. subtilis NRRL B-2911 beimpft, und die beimpften Kolben wurden auf einer Drehschüttelvorrichtung 10 Tage lang inkubiert. Nach Beendigung der Fermentation wurde die Brühe zentrifugiert und die überstehende Schicht wie in Beispiel 1 beschrieben auf ihren Gehalt geprüft.

   Die Prüfungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt : 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Guaninäquivalent <SEP> Guanin <SEP> und <SEP> Guanosin <SEP> Guaninnucleotide
<tb> y/ml <SEP> als <SEP> Guanin <SEP> y/ml <SEP> als <SEP> Na <SEP> GMP. <SEP> 2 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> y/ml <SEP> 
<tb> 250 <SEP> 40 <SEP> 480
<tb> 
 
Die durch Züchtung eines besonderen Stammes von B. subtilis erhaltenen Fermentationsbrühen können wie im folgenden beschrieben geprüft werden, um zu ermitteln, ob der Stamm eine niedrige Nucleotidase-Aktivität besitzt und sich daher zur Erzeugung von Guanosin-5'-phosphaten gemäss der Erfindung eignet. 



   Bei diesem Verfahren werden 0, 5 ml der nach Zentrifugieren überstehenden Brühe mit 0, 5 ml einer 
 EMI4.3 
 ten Gemisches werden dann auf kreisförmige Papierblätter (Whatman Nr. 1) aufgebracht und in dem Lösungsmittelsystem   Nr.l(n-Propanol-NH-H 0, 6 : 3 : l)   4 h lang bei Zimmertemperatur chromatographiert. Die Blätter werden dann unter ultraviolettem Licht auf die Intensitäten der Guanosin-5'-phosphatBande (Rf 0, 14) und der Bande von Guanosin + Guanin (Rf 0, 40) geprüft. Stämme von B. subtilis mit niedriger Nucleotidase-Aktivität zeigen eine Guanosin + Guanin-Bande, die weniger intensiv ist als die Bande der Guanosin-5'-phosphate.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Gewinnung von Guanosin-5'-phosphaten auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von B. subtilis mit niedriger Nucleotidase-Aktivität, wie B. subtilis NRRL B-2911, in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Stickstoff- und Kohlen- <Desc/Clms Page number 5> stoffquellen wie Sojamehl oder Caseinhydrolysate und Maltose oder Stärke enthält, so lange kultiviert, bis eine wesentliche Menge Guanosin-5'-phosphate entstanden ist, und diese hierauf in an sich bekannter Weise, insbesondere mittels chromatographischer Methoden, aus der Gärbrühe isoliert.