AT232193B - Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Cephalosporin C - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Cephalosporin C

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AT232193B
AT232193B AT592560A AT592560A AT232193B AT 232193 B AT232193 B AT 232193B AT 592560 A AT592560 A AT 592560A AT 592560 A AT592560 A AT 592560A AT 232193 B AT232193 B AT 232193B
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  Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Cephalosporin C 
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Cephalosporin C. In der brit. Pa- tentschrift Nr.   810, 196   ist ein Verfahren zur Abtrennung eines neuen Antibiotikums, nämlich des Cephalosporin C beschrieben, das aus Produkten, die nach einem Fermentationsverfahren unter Verwendung einer Cephalosporium-Species erhalten werden, gewonnen wird. Zum Zeitpunkt der Anmeldung dieser Er- findungwar die Strukturformel des Cephalosporin C noch unbekannt, wodurch Arbeiten, betreffend die Her- stellung und Identifizierung von Derivaten des Cephalosporin C mit möglicherweise ebenfalls wertvollen biolo- gischen Wirkungen, erschwert waren. 



   Trotzdem wurden Forschungsarbeiten über die Säurebehandlung von Cephalosporin C ausgeführt. 



   So konnten die Erfinder des vorliegender Erfindung zugrunde liegenden Gegenstandes, Newton und Abraham, in Biochemical Journal, Vol. 62, Seiten 651-657 feststellen, dass Cephalosporin C Säuren gegenüber verhältnismässig stabil ist und nach vierstündigem Stehenlassen in   O. ln   Salzsäure bei Raumtemperatur an nachweisbarer Aktivität nicht verliert. Newton und Abraham stellten ferner in Nature, Vol. 175,
Seite 548 fest, dass Cephalosporin C in wässeriger Lösung bei einem pH-Wert von 2, 5 bei Raumtemperatur stabil ist. In dieser Veröffentlichung wird auch die Hydrolyse von Cephalosporin C mit Säure beschrieben, bei welcher aus Cephalosporin C ein Mol Kohlendioxyd und   d-oc-Aminoadipinsäure   erhalten wird.

   Diese
Säurebehandlung, die unter Verwendung heisser konzenrierter Salzsäure in der Dauer von ungefähr
18 Stunden vorgenommen wurde, zerstörte das Cesphalosporin C-Molekül und dessen gesamte Wirksamkeit. 



   In   dem Ciba   Foundation Symposium" über Aminosäuren und Peptide mit antimetabolischer Wirksamkeit, 1958, Seiten 205-223, wird die Herstellung einiger aktiver Verbindungen aus Cephalosporin C beschrieben. So wird angegeben, dass nach Behandlung von Cephalosporin C mit 0, 1 n Salzsäure bei 20   C zumindest zwei saure und drei neutrale Verbindungen erhalten werden, die alle ninhydrin-positiv sind. 



   Die neutralen Verbindungen werden voneinander leicht durch Papierchromatographie unter Verwendung von Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 4) als Fliessmittel abgetrennt. Eine von diesen Verbindungen (Rp 0, 15) zeigt antibakterielle Wirksamkeit ; sie wurde Cephalosporin Cc benannt. Die Herstellung und die Eigenschaften des Cephalosporin Cc sind ausführlicher in der brit. Patentschrift Nr.   912, 360   beschrieben. 



  In dieser Patentschrift werden die Ausbeuten an Cephalosporin Ce, die unter verschiedenen sauren Bedingungen erhalten worden waren, angegeben. 



   In dem oben erwähnten Symposium wird über die sauren Hydrolyseprodukte nur ausgesagt, dass sie bei den Konzentrationen, die bei Säurebehandlung von Cephalosporin C mit 0, 1 n Salzsäure bei   200 C   erhalten werden, ninhydrin-positiv sind. Die Dauer der Säurebehandlung vor Abtrennung der Hydrolyseprodukte wird in dieser Veröffentlichung nicht angegeben ; die Erfinder des vorliegender Erfindung zugrunde liegenden Gegenstandes, die gleichzeitig auch die Autoren obiger Veröffentlichung sind, bestätigen jedoch, dass die Behandlungsdauer 6-9 Tage betrug. 



   Es wurde nunmehr die Struktur des Cephalosporin C aufgedeckt und gleichzeitig festgestellt, dass bei Behandlung von Cephalosporin C mit Säure unter bestimmten Bedingungen das Cephalosporin C-Molekül in zwei Teile gespalten werden kann, nämlich einen komplexen Kern und eine Seitenkette, die aus   oc-   Aminoadipinsäure gebildet wird und an den komplexen Kern in 7-Stellung desselben (die 7-Stellung wird später definiert) gebunden ist. In vorliegender Beschreibung werden Verbindungen mit einer Struktur dieser Art, d. h. einen kompexen Kern mit der Ringstruktur des Cephalosporin C-Kernes und einer ocAminoadipinsäure-Seitenkette, die an diesem in 7-Stellung gebunden ist, als Verbindungen mit Kern/ Seitenketten-Struktur bezeichnet.

   Die biologischen Eigenschaften von Cephalosporin C sind hauptsächlich von der komplexen Struktur des Kernes   abhängig ;   es war zu erwarten, dass durch Addition anderer Seitenketten an den Kern, unter Verwendung an sich bekannter Verfahrensweisen, Derivate des Kernes hergestellt werden können, die, verglichen mit der Wirkung des Cephalosporin C selbst, ähnliche jedoch modifizierte oder vielleicht verstärkte Wirksamkeiten aufweisen, so dass der Entdeckung der Kern/ Seitenketten-Struktur des Cephalosporin C und von Verfahren zur Abtrennung und Isolierung des Kernes für das Gebiet der Antibiotika von grosser Bedeutung ist. 

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   Es wurde gefunden, dass, abgesehen von dem Cephalosporin C, auch bestimmte Derivate desselben, die bereits hergestellt und identifiziert wurden, ebenfalls die Kern/Seitenketten-Struktur aufweisen. Eine solche Verbindung ist das bereits obenerwähnte Cephalosporin Ce. Andere Verbindungen dieser Art werden in der brit. Patentschrift Nr.   912, 541   beschrieben, u. zw. sind dies antibiotische Substanzen, die Umwandlungsprodukte des Cephalosporin C sind und als Cephalosporin CA-Verbindungen bezeichnet werden. Sie können durch Behandlung von Cephalosporin C in wässeriger Lösung mit einer schwachen tertiären Base, z. B. Pyridin, Kollidin oder Chinolin, erhalten werden. Bei Verwendung von Pyridin wird das erhaltene Antibiotikum als Cephalosporin CA (Pyridin) bezeichnet. 



   Gemäss vorliegender Erfindung wird demnach ein Verfahren zur Herstellung von CephalosporinDerivaten angegeben, das darin besteht, dass, wie an sich mit Bezug auf Cephalosporin C bekannt, Cephalosporin C, Cephalosporin Cc, eine Cephalosporin CA-Verbindung oder ein Derivat dieser Verbindungen, in welchem die Seitenkette durch eine Gruppe geschützt ist, die während der Hydrolyse von dieser nicht abgetrennt wird, mittels einer verdünnten Mineralsäure, vorzugsweise annähernd bei Raumtemperatur mit einer ungefähr 0, 1-0, 3 n Salzsäure, hydrolysiert wird, wobei jedoch die Hydrolyse beendet wird, sobald die Abtrennung der Seitenkette oder der potentiellen Seitenkette unter Bildung des entsprechenden Kernes stattgefunden hat, aber bevor ein wesentlicher Abbau des Kernes vor sich gegangen ist, wonach der so gebildete Kern,

   gewünschtenfalls zur Salzbildung mit einer starken Säure oder im Falle des Kernes von Cephalosporin C, mit einem Natrium-, Kalium-oder Ammoniumsalz behandelt und der Kern oder das Salz desselben aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird. 
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Gemäss einer Verfahrensvariante vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Kernes von Cephalosporin C, einer Verbindung der Formel 
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 angegeben, das darin besteht, dass das   2, 4-Dinitrophenylderivat   des Cephalosporin C hydrolysiert wird, um auf diese Weise die geschützte Seitenkette zu entfernen, und der Kern des Cephalosporin C aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird. Die 7-Stellung des Kernes von Cephalosporin C ist die in der Strukturformel angegebene. 



   Der Kern des Cephalosporin C kann dann durch Behandlung mit Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalzen oder einer starken Säure zu Salzderivaten ungesetzt werden. Als starke Säuren werden Mineralsäuren bevorzugt eingesetzt und von diesen insbesondere Salzsäure, wobei in letzterem Fall das salzsaure Salz des Kernes des Cephalosporin C erhalten wird. 



   Gemäss einer weiteren Verfahrensvariante vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Kernes von Cephalosporin Ce angegeben, einer Verbindung der Formel 
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 das darin besteht, dass Cephalosporin   Cc   zwecks Entfernung der Seitenkette hydrolisiert und der Kern des Cephalosporin Ce aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird. 



   Der Kern des Cephalosporin   Cc   kann durch Behandlung mit einer starken Säure in dessen Salzderivate überführt werden. Als starke Säuren werden Mineralsäuren bevorzugt eingesetzt und von diesen insbesondere Salzsäure, mittels welcher das salzsaure Salz des Cephalosporin Ce-Kernes erhalten wird. 



   Gemäss einer weiteren Verfahrensvariante vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung der Kerne von Cephalosporin CA-Verbindungen der Struktur 

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 angegeben, wobei in dieser Formel R eine schwache tertiäre Base darstellt, wie sie in der brit. Patentschrift 912, 541 definiert ist. Dieses Verfahren besteht darin, dass Cephalosporin C oder eine Cephalosporin
CA-Verbindung hydrolisiert wird, um die Seitenkette zu entfernen, wonach ein Kern des Cephalosporin CA aus den Reaktionsprodukten isoliert wird. Eine der bedeutendsten Anwendungen dieses Verfahrens besteht in der Herstellung des Kernes von Cephalosporin CA (Pyridin), in welchem R Pyridin bedeutet. 



   Das Verfahren zur Herstellung des Cephalosporin CA-Kernes kann, wie leicht zu ersehen, zumindest in zweierlei Weise vorgenommen werden. So kann entweder Cephalosporin C hydrolysiert werden, um den Kern von Cephalosporin C zu erhalten, und der Kern einer Cephalosporin CA-Verbindung aus den Reaktionsprodukten durch Behandlung des Reaktionsproduktes mit einer schwachen tertiären Base behandelt werden, oder es kann direkt von einer Cephalosporin CA-Verbindung ausgegangen und diese unter Abtrennung des Kernes hydrolisiert werden. 



   Die Kerne der Cephalosporin CA-Verbindungen können durch Behandlung mit starken Säuren in ihre Salzderivate überführt werden. Als starke Säuren werden Mineralsäuren bevorzugt eingesetzt, wobei von diesen Salzsäuren, mittels welcher die salzsauren Salze der Kerne der Cephalosporin CA-Verbindungen erhalten werden, bevorzugt wird. 



   Die Hydrolyse des Cephalosporin C, Cephalosporin Ce, der Cephalosporin CA-Verbindungen und der Derivate dieser Verbindungen mit geschützten Seitenketten wird vorzugsweise ausgeführt, indem diese Verbindungen unter solchen Bedingungen und so lange behandelt werden, dass bzw. bis die Abspaltung der Seitenkette von dem Kern stattgefunden hat. Die Kerne können in ihrer freien Form besser als in Form ihrer sauren Salze durch entsprechende Einstellung des pH-Wertes der Lösung erhalten werden. 



  Wenn z. B. die Lösung auf einen pH-Wert von zirka 4, 5 eingestellt wird, können die freien Kerne isoliert werden. Als Säure wird zweckmässig eine verdünnte Mineralsäure und vorzugsweise verdünnte Salzsäure verwendet. Ferner können zweckmässig als Säuren auch Sulfonsäuren bzw. sulfonierte Polystyrolharze eingesetzt werden. Bei Durchführung des Verfahrens wird die mit Säure behandelte Lösung, die Cephalosporin C, Cephalosporin Ce oder Cephalosporin CA enthält, gewöhnlich stehen gelassen, bis der Kern in verhältnismässig hoher Ausbeute erhalten wird ; wie lange dies dauert, hängt von den Versuchsbedingungen ab ; gewöhnlich sind es einige Tage. Der Kern kann von den Reaktionsprodukten in an sich bekannter Weise, z. B. durch Papier-Elektrophorese und/oder Papierchromatographie abgetrennt werden. 



  Bei Verwendung dieser Verfahren kann gewöhnlich der abgetrennte Kern auf dem Papier dadurch indentifiziert werden, dass er bei den verwendeten Konzentrationen (getestet, indem Elektrophorese-Papier mit Platten in Kontakt gebracht wird, die mit Staphylococcus aureus, Stamm-Oxford beimpft waren) an sich eine antibiotische Wirksamkeit nicht aufzeigte, eine solche Wirksamkeit jedoch nach zwecks Phenylacetylierung erfolgender Behandlung mit Phenylacetylchlorid feststellbar war. Diese Behandlung kann zweckmässig ausgeführt werden, indem das Papier zuerst mit m-Pyridin in 50% Aceton und hierauf mit Phenylacetylchorid (1, 25 Vol./Vol.-%) in Aceton besprüht wird. Das Phenylacetylderivat kann mittels chromatographischer und elektrophoretischer Mittel abgetrennt werden. 



   Gemäss einer Verfahrensvariante vorliegender Erfindung wird Cephalosporin Cc, das mit Säure unter solchen Bedingungen und so lange behandelt wird, dass die Abspaltung der Seitenkette aus dem Kern vor sich geht, aus Cephalosporin   Cc   in situ hergestellt. So ergibt die Säurebehandlung von Cephalosporin C, wie sie in der brit. Patentschrift 912, 360 beschrieben ist, Cephalosporin Cc, wobei bei Fortsetzung der Säurebehandlung über die zur Herstellung von Cephalosporin   Cc   optimalen Bedingungen hinaus die optimalen Bedingungen zur Herstellung des Cephalosporin Cc-Kernes erreicht werden. Es wurde festgestelltnach bereits erfolgter Einreichung der brit. Anmeldung 8544/58 auf deren Grundlage das brit.

   Patent Nr.   912, 360   erteilt wurde-, dass bei Einwirkung von 0, 5n bis In Salzsäure in der Dauer von weniger als einen Tag die bevorzugten Bedingungen für die Herstellung von Cephalosporin   Cc   vorliegen und somit die bevorzugten Bedingungen zur Herstellung des Kernes bei Behandlung von Cephalosporin C mit 0, 5-In Salzsäure in der Dauer von 2 bis 4 Tagen gegeben sind. 



   Um die erforderlichen Reaktionsbedingungen zur Herstellung des Cephalosporin C-Kernes aus einem Derivat des Cephalosporin C mit geschützter Seitenkette zu schaffen, wird vorzugsweise Salzsäure, insbesondere in Konzentrationen im Bereiche von zirka 0, 1 bis 0, 3n eingesetzt. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Acetonitril, vorgenommen. Von Vorteil ist, die Reaktion in der Dunkelheit und in einer inerten Atmosphäre, z. B. Stickstoff, auszuführen. 



   Die Reaktionsbedingungen zur Herstellung der Kerne von Cephalosporin C, Cephalosporin Ce und Cephalosporin CA aus Cephalosporin C, Cephalosporin Cc bzw. Cephalosporin CA können beträchtlich 

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 variiert werden, wobei jedoch bevorzugt wird, Salzsäure mit einem pH-Wert von ungefähr 0-2, 5 bei einer Temperatur von   zirka-10   bis +50   C in der Dauer von zirka 12 Stunden bis 30 Tagen einzusetzen, wobei die Bedingungen innerhalb obiger Grenzen so eingehalten werden, dass eine hohe Ausbeute an Hydrolyse-Produkten erzielt wird. Besonders bewährt hat es sich,   O, ln   Salzsäure bei einer Temperatur von zirka 20   C zirka 3 Tage lang einwirken zu lassen. 



   Bei Behandlung von Cephalosporin C mit Säure in einer Stärke, die innerhalb des oben angegebenen Bereiches liegt, setzen zumindest zwei Reaktionen ein. Diese sind   (1.)   die Hydrolyse von Cephalosporin C unter Auflösung der Kern-Seitenketten-Bindung und (2.) die Reaktion der Säure mit dem Cephalosporin CMolekül unter Bildung von Cephalosporin Cc. Überdies wird, sobald in dem Reaktionsgemisch sich etwas 
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 unter Auflösung der Bindung des Cephalosporin Ce-Kernes an die Seitenkette. Zusätzlich wird eine gewisse Menge an Cephalosporin Cc-Kern durch Umsetzung der Säure mit dem Cephalosporin C-Kern gebildet.

   So werden, wenn die Behandlung des Cephalosporin C mit Säure, zwecks Herstellung des Cephalosporin Cc, vorgenommen wird, die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass ein verhältnismässig hoher Anteil an Cephalosporin   C-Kern   und ein verhältnismässig geringer Anteil an Cephalosporin Ce-Kern gebildet wird. Hingegen werden, wenn die Umsetzung vorgenommen wird, um den Kern des Cephalosporin   Cc   zu erhalten, die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass ein verhältnismässig hoher Anteil an Cephalosporin Ce-Kern gebildet wird.

   Die geeigneten Reaktionsbedingungen können durch einen einfachen Versuch festgestellt werden ; es wurde gefunden, dass, ausgehend von Cephalosporin C, mit O, ln Salzsäure bei 20   C innerhalb von zirka 3 Tagen eine gute Ausbeute an Cephalosporin C-Kern und mit 0, 5-In Salzsäure bei 20   C innerhalb von ungefähr 3 Tagen eine gute Ausbeute an Cephalosporin   Cc-Kern   
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 wird, nach welcher Zeit die besten Ausbeuten an Cephalosporin   Cc   bei Verwendung von O, ln Salzsäure erhalten worden waren und nach welcher Zeit ebenfalls der zu einem früheren Zeitpunkt gebildete Cephalosporin C-Kern praktisch verschwunden war. 



   Bemerkt sei, dass der Kern des Cephalosporin C aus folgenden Gründen nicht eine der sauren Verbindungen war, die in dem bereits   behandelten Ciba-Symposium   entdeckt aber nicht charakterisiert wurden. 



  Zunächst kann angenommen werden, dass nach einer länger als 5 Tagen währenden Behandlung von Cephalosporin C mit In Salzsäure bei 20   C praktisch ein Cephalosporin C-Kern nicht übrig blieb. Die optimalen Bedingungen zur Herstellung des Cephalosporin C-Kernes sind gegeben, wenn O, ln Salzsäure 3 Tage lang einwirken gelassen wird, wobei der Zeitabschnitt, innerhalb welchem bemerkenswerte Ausbeuten an Kern erhalten werden, kurz ist. Daher wird nach einer Behandlungszeit von über 5 Tagen in der Lösung praktisch kein Cephalosporin C-Kern zurückbleiben. Des weiteren haben zusätzliche Versuche gezeigt, dass der Kern des Cephalosporin C in Anteilen, die zur Erzielung einer positiven Ninhydrinreaktion hinreichen würden, auch dann nicht vorliegen, wenn die Behandlung die optimale Zeit von 3 Tagen beträgt. 



  Unter den optimalen Bedingungen wurde der Kern erst zu einem späteren Zeitpunkt durch Phenylacetylierung und einem nachfolgenden Wirksamkeitstest der beschriebenen Art festgestellt. Jedenfalls wird selbst dann, wenn eine den Kern von Cephalosporin C enthaltende Lösung in einem solchen Ausmass konzentriert wird, dass eine ninhydrinpositive Reaktion in einem feststellbaren Ausmass eintritt, die typische blaue oder violette Färbung nicht erzielt, sondern nur eine gelblich-braune. Daher ist der Cephalosporin CKern gemäss der geltenden Bedeutung dieser Kennzeichnung nicht ninhydrinpositiv. 



   Der Kern des Cephalosporin C, der 7-Aminocephalosporansäure (7-aminocephalosporanic acid) benannt wurde, weist eine sterische Struktur auf, die der des entsprechenden Teiles des durch Fermentation aus Cephalosporium erhaltenen Cephalosporin C gleichkommt. Er konnte ferner nach Phenylacetylierung durch folgende Eigenschaften identifiziert werden :
1. Die Fraktion des Cephalosporin C-Kernes wandert bei Elektrophorese bei einem pH-Wert von 7 (mit wässerigem Kollidinacetat als Lösungsmittel) etwas schneller zur Anode als das Cephalosporin C. 



   2. Die Fraktion des Cephalosporin C-Kernes wandert bei einem pH-Wert von 4, 5 (mit wässerigem Pyridinacetat als Lösungsmittel) zirka halb so schnell als das Cephalosporin C zur Anode. 



   3. Die Fraktion des Cephalosporin C-Kernes verbleibt bei Elektrophorese bei einem pH-Wert von 4, 0 (in wässerigem Pyridinacetat) in der Nähe des Ausgangspunktes, so dass nur eine verhältnismässig geringe Wanderung zu der Anode festgestellt wird. Unter diesen Bedingungen wandert Cephalosporin C zu der   Anode noch fast so schnell wie bei einem pH-Wert von 7.   



   4. Nach Elektrophorese in   10%   Essigsäure, Elution aus dem Papier und 16stündiger Hydrolyse in n-HCl bei 105   C wurde etwas Glycin (50   ze   gaben einen Fleck von einer Intensität, die vergleichbar ist 
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 nicht vorhanden. 



   5. Die Fraktion des Cephalosporin C-Kernes zeigt in   Butanol-Äthanol-Wasser (4 : 1 :   5 Vol. ) einen   Rp-Wert   vergleichbar mit dem des N-Phenylacetyl-Cephalosporin C (0, 08-0, 15). 



   6. Nach Chromatographie in Butanol-Äthanol-Wasser oder nach Elektrophorese und nachfolgendem Besprühen des Papiers mit Penicilinase in einer   0, 1%   Gelatinlösung (die Konzentration des Enzyms war zehnmal grösser als die zur Inaktivierung eines Fleckes von 50   ; j. g   Benzylpenicillin erforderliche) wurde ein 

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 Fleck von offensichtlich unverminderter Wirksamkeit erhalten, wenn mit Phenylacetylchlorid und Pyridin besprüht wurde. 



   7. Wenn auf Papier aufgetragen, mit Pyridinacetat   pH=   7 (2m Pyridin) im feuchten Zustand über dem Dampf einer Lösung von 2m Pyridinacetat bei 37   C 16 Stunden gehalten, getrocknet, der Elektrophorese bei einem pH-Wert von 7 unterworfen und schliesslich phenylacetyliert wurde, entstand ein aktiver Fleck (bewirkt durch das Phenylacetylderivat des Cephalosporin CA   [Pyridin]-Kem)   auf der neutralen Stelle und auch ein Fleck an einer Stelle, die etwas näher zur Anode gelegen war, als die dem Cephalosporin C entsprechende. 



   8. Nach Elektrophorese auf Papier gab der Kern mit Ninhydrin eine gelblich-braune Färbung, die später graublau wurde (6-Aminopenicillsäure [6-aminopenicillanic acid] soll, wie berichtet wurde, eine normale Ninhydrinfärbung nicht ergeben). Nach Papier-Elektrophorese oder Chromatographie konnte der Kern (ebenso wie Cephalosporin C) bei Auswertung in ultraviolettem Licht leicht als ein dunkler absorbierender Fleck ersichtlich gemacht werden. 



   Der Kern des Cephalosporin   Cc,   der das Lacton der Desacetyl-7-aminocephalosporansäure (desacetyl-7aminocephalosporanic acid) ist, hat auch eine sterische Struktur die der des entsprechenden Teiles des Cephalosporin C, der durch Fermentation aus Cephalosporium erhalten wird, gleichkommt. Er kann ferner nach Phenylacetylierung durch folgende Eigenschaften identifiziert werden. 



   1. Bei Elektrophorese auf Papier in einem Pyridinacetat-Puffer   (pH   = 4, 5) legt der Cephalosporin CcKern eine Strecke in Richtung zur Kathode zurück, die ungefähr der vom Cephalosporin   C-Kern   in Richtung zur Anode zurückgelegten Strecke entspricht. 



   2. Bei Elektrophorese auf Papier mit 10% Essigsäure-Puffer wandert der Cephalosporin Cc-Kern zu der Kathode zweieinhalbmal schneller als der Cephalosporin   C-Kern.   



   3. Bei Chromatographie in Butanol-Äthanol-Wasser   (4 : 1 : 5 Vol.)   ist der RF-Wert des Cephalosporin Ce-Kernderivates 0, 33, verglichen mit 0, 008-0, 15 für den entsprechenden Wert des Cephalosporin Cund 0, 08 für den Cephalosporin CA-Kern. 



   Die Kerne der Cephalosporin CA-Verbindungen haben die gleiche sterische Struktur wie der entsprechende Teil des Cephalosporin C, der durch Fermentation aus Cephalosporium erhalten wird. Cephalosporin CA (Pyridin) kann ferner durch folgende Merkmale identifiziert werden : 
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 sich der Cephalosporin CA (Pyridin) -Kern zirka zweimal so rasch zu der Kathode wie das Cephalosporin CA (Pyridin). 



   2. Der Cephalosporin CA (Pyridin)-Kern wird durch Einwirkung von Penicillinase unter Bedingungen, bei welchen 50   ze   Penicillin G vollständig zerstört werden, nicht zerstört. 



   3. Der Cephalosporin CA (Pyridin)-Kern kann von dem Cephalosporin Cc-Kern auf Papier-Chromatogrammen (mit n-Butanol-Äthanol-Wasser [4   : 1 :   5 Vol.] als Fliessmittel) unterschieden werden. 



   Die zuvor definierten Verbindungen, nämlich die Kerne des Cephalosporin C, Cc und CA-Verbindungen, sind von besonderer Bedeutung, da sie Zwischenprodukte darstellen, aus welchen weitere Derivate des Cephalosporin C mit biologischer Wirksamkeit hergestellt werden können. 



   Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 



   Beispiel   l :   Herstellung von   7-Amino-cephalosporansäure   (7-amino-cephalosporanic acid). a) Herstellung des l-Fluor-2, 4-dinitrobenzol (FDNB)-derivats von Cephalosporin C. 



     31, 7   g des Natriumsalzes von Cephalosporin C (Reinheitsgrad 85-90%) wurden in 635 cm3 Wasser gelöst, das 25, 5 g wasserfreies Natriumbikarbonat enthielt. Zu dieser Lösung wurden unter Rühren   25, 5 cm3 FDNB,   gelöst in 635 cm3 Äthylalkohol, hinzugefügt. Die Mischung wurde in der Dunkelheit bei Raumtemperatur weitere   2t   Stunden gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann mit konzentrierter Salzsäure auf 5 eingestellt, wonach der Alkohol im Vakuum abdestillert wurde. Bei dieser Verfahrensstufe schied sich überschüssiges FDNB ab. 



   Nachdem der pH-Wert mit Natriumbikarbonat auf 7 gebracht worden war, wurde die Mischung zur Entfernung des überschüssigen FDNB, unter Hinterlassung einer klaren wässerigen Lösung, dreimal mit i cm3 Äther extrahiert. Hierauf wurde mit konz. Salzsäure auf pH = 2, 5 eingestellt. Hiebei bildete sich ein klebriger Niederschlag, der sich jedoch auflöste, sobald die Mischung mit 3mal i Vol. 



  Äthylacetat extrahiert wurde. Die Hauptmenge der Äthylacetatextrakte wurden dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und sodann zur Trockne eingedampft, wonach 40, 3 g einer gelben Substanz zurückblieben. 



   Ein biologischer Vergleich mit einem reinen Präparat des Dinitrophenylderivates von Cephalosporin C zeigte, dass dieses Material einen Reinheitsgrad von zirka 88% hatte. 
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   4-Dinitropenylderivats9, 7 g des DNP-Derivats des Cephalosporin C wurden in einer Mischung von Acetonitril (100 cm3),
Wasser (65 cm3) und n Salzsäure (34 cm3) aufgelöst. Diese Lösung wurde dann in der Dunkelheit bei
Raumtemperatur 64 Stunden unter Stickstoff gehalten. Hierauf wurden zu der Lösung 200 cm3 Wasser zugesetzt und die ganze Mischung mit 5 X 100 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die zurückbleibende wässerige
7-Aminocephalosporansäure (270 cm3) wurde dann mit einer gesättigten Natriumbikarbonatlösung auf pH = 7, 2 gebracht und sodann auf 0  C abgekühlt. c) Isolierung der 7-Aminocephalosporansäure III (7-ACA). 



   Nach Hydrolyse und Extraktion gemäss b) verbleibt eine saure Lösung zurück, die hauptsächlich
7-ACA und 7-ACA (-Lacton) enthält, diese Lösung wird auf einen pH-Wert von 6, 7 gebracht und sodann auf eine mit Dowex 1   (C1-)   gefüllte Säule   fliessen   gelassen. Das 7-ACA-Lacton gelangt durch die Säule hindurch in das Harzfiltrat. Die 7-ACA kann, nach Waschen mit Wasser, mit 0, 05n Salzsäure eluiert werden. 7-ACA enthaltende Fraktionen ergeben einen kristallinen Niederschlag, der die Zwitterion-Form dieses Materials darstellt, wogegen der Hauptanteil der 7-ACA als Hydrochlorid in Lösung bleibt. Das
Infrarot-Spektrum der festen Substanz wird in Fig. 1 gezeigt. Die Lösungen des Hydrochlorids können unter Bildung von Benzylcephalosporin phenylacetyliert werden. 



   Beispiel 2 : Herstellung von Cephalosporin C-Kern aus Cephalosporin C. 



   Das Natriumsalz von Cephalosporin C (2 g) wurde in 30 cm3 Wasser aufgelöst, der pH-Wert durch
Zusatz von Dowex 50 x 8 (H+) auf 2, 5 eingestellt, das Harz filtriert und mit 10 cm3 Wasser gewaschen, wonach   10, 2 cm3 n HCl   zu dem vereinigten Filtrat und den Waschflüssigkeiten zugesetzt wurden. Die
Lösung wurde 3 Tage bei 20   C gehalten und dann in eine mit Dowex-1 (Acetatform) gefüllte Säule (2, 1 cm Durchmesser x 7 cm) gebracht. Das Perkolat wurde in 5 cm3 Fraktionen (1-12) gesammelt und die Säule mit Wasser eluiert, bis insgesamt 34 Fraktionen erhalten waren. Hierauf wurde die Eluierung mit 0, 5n Essigsäure begonnen, wobei weitere 66 Fraktionen gesammelt wurden. Von jeder Fraktion wurde die optische Dichte bei 260   m (i   gemessen. 



   Die Fraktionen 2-16 wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt, wonach sich Cephalosporin   Cc   (312 mg) in   kristalliner   Form abschied. Die Fraktionen 36-45 enthielten den Hauptanteil an Cephalosporin C-Kern, aus dem   einwirksames Phenylacetylderivat erhalten werden   konnte. Diese Fraktionen wurden vereinigt und der Gefriertrocknung unterworfen (40 mg). Nach Phenylacetylierung ergab dieses Material eine Wirksamkeit von 250 Einheiten gegenüber Staph. aureus pro mg des ursprünglichen Produktes. 



   Die neue Verbindung wurde durch Elektrophorese der entsprechenden Fraktion aus der Dowex-1- (Acetat)-Säule weitergereinigt. Die Elektrophorese wurde in einer kontinuierlichen Beckmanspince Model CP   Fliesspapier-Elektrophoresezelle   ausgeführt. Der verwendete Puffer wurde durch Zusatz von Pyridin zu 0, 05n Essigsäure hergestellt, bis der pH-Wert auf 4, 0 anstieg. Die Zelle wurde mit konstantem Strom (40 mA) betrieben ; das Potential betrug 880 V. Das Muster wurde in 20 cm3 Puffer, 24 Stunden hindurch dem Papier (curtain) zugeführt ; es wurden 32 Fraktionen gesammelt, welche von der Kathode   (1)   bis zur Anode (32) numeriert waren. Das Volumen jeder Fraktion betrug zirka 12 cm3. Am Ende des Versuches wurde das Papier mit Ninhydrin besprüht.

   Dabei wurde ein starkes Band des Materials mit einer sehr geringen Beweglichkeit festgestellt, welches von dem Papier in Fraktionen 13-15 abfloss, ferner ein Band von stark saurem Material, welches in den Anodendocht floss und ein schwaches Band eines Produktes (entsprechend der   oc-Aminoadipinsäure),   welches zu der Anode wanderte und von dem Papier in der Fraktion 24   abfloss.   



   Um die Stellung der neuen Verbindung zu bestimmen, wurden 10   X   10   full   Flecke von jeder Fraktion auf Papier aufgetupft und das Papier mit m-Pyridin in   50%   Aceton und dann mit 2% Phenylacetylchlorid in Aceton besprüht. Nach Berührung des Papiers mit Platten, die mit Staph. aureus beimpft waren und Inkubation der Platten, wurde eine grosse Inhibitionszone in einer der Fraktion 22 entsprechenden Stelle und eine kleinere Inhibitionszone in einer der Fraktion 23 entsprechenden Stelle gefunden. 



   Nach Gefriertrocknung der Fraktion 22 wurde ein Rückstand erhalten, der so gering war, dass er nicht genau gewogen werden konnte. In wässeriger Lösung zeigte das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Produktes ein Plateau bei 260   mil ;   das Gesamtgewicht (43   fla)   wurde aus der Extinktion dieser Wellenlänge geschätzt, unter der Annahme, dass das Molekulargewicht der Substanz dem der 7-Aminocephalosporansäure entsprach und dass dessen molekulare Extinktion die gleiche war wie die des Cephalosporin C. Das Produkt wurde in wässerigem Aceton, das einen Phosphatpuffer enthielt   (pn     = 6, 5), phenylacetyliert.   



  Die Wirksamkeit des Phenylacetylderivats gegenüber Staph. aureus entsprach 1450 Einheiten/mg des ursprünglichen Produktes. Cephalosporin C weist gegenüber demselben Organismus eine Wirksamkeit von 8 bis 10 Einheiten/mg auf. 



   Die Aminogruppe in der   6-Aminopenicillansäure (6-aminopenicillanic acid) (Pencillinkern)   weist eine verhältnismässig schwache Basizität auf ; der isoelektrische Punkt der Verbindung wird bei einem pH von 4, 3 angegeben (Batcheler Doyle, Naylor und Rolinson, 1959). Dies ist leicht verständlich, da die Aminogruppe in ss-Stellung sowohl zu einer CON-gruppe als auch zu einer CH-S-gruppe steht. Aus den gleichen Gründen sollte die 7-Aminocephalosporansäure schwach sauer sein und die Substanz bei einem pH-Wert von 7 zu der Anode wandern. Die Eigenschaften der neuen Verbindung aus Cephalosporin C (beschrieben auf S. 4-6) zeigten an, dass es sich tatsächlich um   7-Aminocephalosporansäure   handelt. 



   Beispiel 3 : Herstellung des Cephalosporin CA (Pyridin) -Kernes aus Cephalosporin CA (Pyridin). 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 



   Cephalosporin CA (Pyridin) wird 3 oder mehr Tage lang bei Raumtemperatur in O, ln oder n HC1 gehalten. Bei Analyse der Reaktionsprodukte durch Elektrophorese auf Papier in Pyridinacetat-Puffer   (pH   = 4, 0) und nachfolgendem Auflegen des Papiers auf Agarplatten, die mit Staph. aureus beimpft waren, wurde bei der verwendeten Konzentration eine einzige aktive Zone, nämlich die dem unveränderten Cephalosporin CA (Pyridin) zukommende, festgestellt. Cephalosporin CA (Pyridin) verhält sich so, als ob es bei einem pH-Wert von 4, 0 keine Ladung (net charge) hätte.

   Jedoch zeigen Duplikat-Papierstreifen, die mit m-Pyridin in   50%   wässerigem Aceton und   0, 125%   Phenylacetylchlorid in trockenem Aceton besprüht worden waren, eine zusätzliche wirksame Zone auf den besäten Platten, die auf das Produkt der Phenylacetylierung des Cephalosporin CA (Pyridin)-Kernes zurückzuführen ist. Der Cephalosporin CAKern verhält sich bei einem pH-Wert von   4, 0 als   eine Base und wandert zu der Kathode, wobei er eine
Strecke zurücklegt, die etwas grösser ist als die vom Cephalosporin C im gleichen Versuch in Richtung zu der Anode zurückgelegte Strecke. Der Kern verbleibt in neutraler Stellung bei Elektrophorese bei einem pH-Wert von 7. Dieses Verhalten liegt in Übereinstimmung mit den Eigenschaften, die von dem Cephalosporin CA (Pyridin)-Kern erwartet werden.

   (Siehe Punkt 9 der Angaben über die Cephalosporin CKern-Fraktion. ) Eine Verbindung mit gleichen Eigenschaften wurde nach Inkubation des Cephalosporin CKernes mit 2m-Pyridinacetat, PH = 7, in 16 Stunden gebildet, wobei nach Phenylacetylierung ein aktives Phenylacetylderivat erhalten wurde. Die Eigenschaften des Cephalosporin CA-Kernes wurden unter- sucht, wobei festgestellt wurde, dass dieselben mit den zuvor angebenen übereinstimmen. 



   Beispiel 4 : Herstellung des Cephalosporin Ce-Kernes aus Cephalosporin   Ce.   



   Cephalosporin C (50 mg) wurde in   In- oder 0, 5n HCl (1, 33 cm3)   zwei oder drei Tage bei 20   C gehalten. 



  Unter diesen Bedingungen verschwand die 7-Aminocephalosporansäure, die nach 24 Stunden in der n-   Cl-Lösung   war, nach 3 Tagen. Nach 4 Tagen war die durch Phenylactylierung des Cephalosporin Ce Kernes erhaltene aktive Zone noch nahe dem maximalen Wert, wobei nur geringe Spuren an Cephalo-   sporin Cc übrig   blieben. Der Cephalosporin Ce-Kern scheint demnach das verhältnismässig säurestabilste Endprodukt einer Reihe von aktiven oder latentaktiven Derivaten zu sein, die durch Behandlung von Cephalosporin C mit Säure unter milden Bedingungen gebildet werden. 



   Der Cephalosporin Cc-Kern wurde auch gebildet, wenn Cephalosporin C mit einem gleichen Gewicht an nassem Dowex 50x8   (-H+)-Ionenaustauscherharz   15 bis 48 Stunden bei 20  C in Kontakt gehalten wurde. Duplikatstreifen aus mit Pyridinacetat-Puffer, pH   = 4, 5,   erhaltenen Ionogramme, welche entweder mit Phenylacetylchlorid besprüht und mit einem Testorganismus in Kontakt gebracht oder mit Ninhydrin besprüht worden waren, zeigten an, dass die Stellung des Cephalosporin Cc-Kemes einer gelben Zone auf den mit Ninhyrin besprühten Streifen entsprach. 



   Die Wirksamkeit des Cephalosporin   Cc-Kernes,   gebildet aus 400   ze   Cephalosporin Ce wurde durch Behandlung mit n HCI durch Einwirkung von Penicillinase unter Bedingungen, welche 50   ze   Penicillin G vollständig zerstören, nicht merklich beeinträchtigt. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Hydrolytisches Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass, wie an sich mit Bezug auf Cephalosporin C bekannt, Cephalosporin C, Cephalosporin Cc, eine Cephalosporin CA-Verbindung oder ein Derivat dieser Verbindungen, in welchem die Seitenkette durch eine Gruppe geschützt ist, die während der Hydrolyse von dieser nicht abgetrennt wird, mittels einer verdünnten Mineralsäure, vorzugsweise annähernd bei Raumtemperatur mit einer ungefähr 0, 1-03n Salzsäure, hydrolysiert wird, wobei jedoch die Hydrolyse beendet wird, sobald die Abtrennung der Seitenkette oder der potentiellen Seitenkette unter Bildung des entsprechenden Kernes stattgefunden hat, aber bevor ein wesentlicher Abbau des Kernes vor sich gegangen ist, wonach der so gebildete Kern,

   gewünschtenfalls zur Salzbildung mit einer starken Säure oder im Falle des Kernes von Cephalosporin C, mit einem Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz behandelt und der Kern oder das Salz desselben aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird.

Claims (1)

  1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass das 2, 4-Dinitrophenylderivat des Cephalosporin C hydrolisiert wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, vorzugsweise Acetonitril, ausgeführt wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einer inerten Atmosphäre, vorzugsweise unter Stickstoff ausgeführt wird.
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