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Verfahren zur Herstellung von Bitterstoffen aus Hopfen
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Es wurde angenommen, dass, wenn die Isohumulone dem Licht ausgesetzt werden, eine photochemische Reaktion stattfindet, bei der eine Abspaltung der Seitenkette von der Ringstruktur und damit die Bildung freier Radikale auftritt. Diese freien, von der Seitenkette her stammenden Radikale reagieren ihrerseits mit den Sulfnydryl-Gruppen und bilden eine riechende Verbindung oder Verbindungen.
Es wird ferner angenommen, dass der funktionelle Teil der Isomeren, der in die Lichtreaktion eintritt, die Carbonyl-Gruppe der Isohexenoyl-Seitenkette ist. Diese reaktionsfähige Carbonyl-Gruppe kann nun mit Hilfe einer Reduktion zu einem sekundären Alkohol abgewandelt und durch diese Abwandlung daran gehindert werden, mit den Sulfhydryl-Gruppen, die normalerweise in den Bierkomponenten anwesend sind, in Reaktion zu treten.
Für das erfindungsgemässe Verfahren können verschiedene Reduktionsmittel verwendet werden, beispielsweise Metallhydride (Natriumborhydrid, Kaliumborhydrid, Lithiumaluminiumhydrid usw.) ; aber auch andere Reduktionsmittel, wie Wasserstoff, Natrium in Alkohol oder andere Reduktionsverbindungen in einem geeigneten Lösungsmittel.
Untersuchungen haben ferner ergeben, dass die Lupulon-Fraktion, wenn sie in Anwesenheit von SHGruppen dem Licht ausgesetzt wird, einen merkaptanartigen Geruch erzeugen kann. Es wird angenommen, dass Spuren des Lupulon unter spezifischen Bedingungen in Würze und Bier löslich sind. Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird daher dieser Lupulonanteil entfernt.
Die folgenden Beispiele erläutern einige beispielsweise Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens.
Die verschiedenen Beispiele werden besser im Zusammenhang mit der Zeichnung verständlich, in der verschiedene Ultraviolett-Absorptionskurven dargestellt sind, wobei als Abszisse die Wellenlänge des
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Ultraviolett-Absorptionskurven von nichtreduzierten Isohumulonen (Kurve a) und reduzierten Isohumulonen (Kurve b) in alkalischem Methanol, und Fig. 2 typische Ultraviolett-Absorptionskurven von IsooktanExtrakt verschiedener vergleichsfähiger, nichtreduzierte Isohumulone enthaltende Biere in alkalischem Methanol (Kurve c) und von Bier, das gemäss den in den Beispielen 1 (Kurve d) und 3 (Kurve e) angegebenen Verfahren hergestellt wurde.
Beispiel l : Isomerisation von gereinigtem Humulon und Reduktion des Isohumulons.
200 g gemahlenen, getrockneten Hopfens werden mit 3 l niedrig kochendem Petroläther extrahiert.
Der Petroläther wird im Vakuum verdampft und der ölige Rest in einer kleinen Menge absoluten Methanols aufgenommen. Die Hopfenwachse, die beim Abkühlen des Methanolextraktes in einem Eisbad ausfallen, werden abgefiltert und mit kaltem Methanol gewaschen. Das verdünnte Filtrat wird auf 600C erhitzt und dann werden die Humulone als Bleikomplex durch den Zusatz einer 10% eigen methanolischen BleiacetatLösung ausgefällt, bis die Ausfällung abgeschlossen ist. Das Bleihumulat wird bei 600C dreissig Minuten lang erweicht, auf Raumtemperatur abgekühlt und geschleudert. Der Rest wird dreimal durch Aufschlemmen mit geringen Mengen Methanol gewaschen.
Die Humulone werden von ihrem Bleikomplex befreit, indem das Bleihumulat in 90% gem Methanol aufgeschlemmt wird und indem Im-H2S04 in Methanol unter Rühren hinzugefügt wird, bis alles Bleihumulat umgesetzt und die Ausfällung von Bleisulfat. abgeschlossen ist. Das unlösliche Bleisulfat wird durch Schleudern entfernt. Nun wird der bleifreien Lösung der Humulone 2% H SO zugefügt, worauf die Humulone unlöslich werden und dann durch dreimaliges Extrahieren mit Petroläther wiedergewonnen werden.
Der Petroläther wird im Vakuum verdampft und die Humulone können in einem geeigneten Lösungsmittel aufgenommen und in dem Reduktionsprozess, so wie er unten beschrieben wird, verwendet werden, oder sie können zunächst weiter gereinigt werden, indem das Ausfällen des Bleihumulats und das anschliessende Wiedergewinnen der Humulone wiederholt wird.
Eine Lösung von 2, 43 g der wiedergereinigten Humulone in 28 ml Äthanol in einer 500 ml-Flasche wird mit 7, 3 ml1n- Natriumhydroxyd behandelt, um die Säure der Humulone zu neutralisieren. Genügend 0,2m-Phosphatpuffer und Wasser werden hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 243 ml zu ergeben, das 1% Humulone mit einem pH-Wert von 11 enthält. Der Flascheninhalt wird 45 Minuten lang unter Rückfluss gekocht, währenddessen die Humulone in Isohumulone umgewandelt werden, was durch die typische spektrophotometrische Kurve der Isohumulone in dem ultravioletten Bereich, wie sie in Fig. 1 der Zeichnung dargestellt ist, nachweisbar ist. Die Reaktionsflasche und ihr Inhalt wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Die chemische Reduktion der Isohumulone wird durch den Zusatz von 700 mg KBH4 zu 230 ml der Isohumulon-Lösung und durch Umrühren bei Raumtemperatur während vier Stunden bewerkstelligt. Zu diesem Zeitpunkt ist das überschüssige Borhydrid durch Säurebildung mit 6n-Salzsäure bei einem pH-Wert
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von 2 zersetzt und die reduzierten Isohumulone werden durch Extraktion mit Petroläther wiedergewonnen.
Die Borsäure bleibt in der wässerigen Lösung. Der Petroläther wird im Vakuum entfernt, wobei ein Bitterstoff zurückbleibt, der lichtbeständig ist, wenn er in Anwesenheit von Verbindungen mit Sulfhydryl-Grup- pe geprüft wird. Die spektrophotometrische Kurve der Fig. 1 zeigt die Ultraviolett-Absorption in alkalischem Methanol, wobei sich die typische Flachstelle der reduzierten Isohumulone zwischen etwa 260 und etwa 275 my Wellenlänge zeigt. Im Gegensatz dazu ergeben Isohumulone, die nicht reduziert worden sind, eine spektrophotometrische Kurve mit einem beträchtlichen Abfall in dem gleichen Bereich.
Die reduzierten Isohumulone werden in 100 ml Äthanol aufgenommen und 76, 5 ml der äthanolischen Lösung, die 1, 25 g reduzierte Isohumulone enthält, werden 23 l Würze zugesetzt, die keinen Hopfen enthielt. Die so behandelte Würze wird gekocht und abgekühlt. Dann wird Hefe zugesetzt und die Flüssigkeit gärengelassen. Das sich ergebende Bier wird in der üblichen Weise behandelt. Das Bier besitzt gute Schaum- und Geschmackseigenschaften.
Wenn das Bier in einem klaren Glasbehälter zwei Stunden lang in einen Lichtkasten gesetzt wird, der zwei Tageslicht-Leuchtstoffleuchten und zwei Ultraviolett-Schwarzleuchten in einem Abstand mehrerer Zentimeter enthält, bekommt das Bier keinen störenden Geruch. Ein in üblicher Weise hergestelltes Bier, das dem Licht unter den gleichen Bedingungen ausgesetzt war, erhielt den Lichtschlag und begann zu riechen.
Eine spektrophotometrische Vergleichsanalyse der fertigen Biere ist in den Kurven der Fig. 2 veranschaulicht, in denen eine typische Kurve von nichtreduziertem Isohumulon mit dem allmählichen Abfall im Bereich von 260 bis 275 mii Wellenlänge gezeigt ist. Dies steht im Gegensatz zu der typischen Flachstelle, die sich bei einem Bier ergibt, das mit Hilfe der reduzierten Isohumulone des Beispieles 1 hergestellt ist. Um diese Kurven aus in üblicher Weise gehopften, im Handel erhältlichen Bieren herzustellen, wurde eine anfängliche Extraktion mit Isooktan hergestellt, von dem ein gleicher Teil mit alkalischem Methanol verdünnt war.
Beispiel 2 : Kombinierte Isomerisation von gereinigtem Humulon und Reduktion des Isohumulons.
Eine Lösung von 0,88 g wiedergereinigter Humulone in 17 ml Äthanol wurde mit 2, 7 ml In-Na- triumhydroxyd neutralisiert und mit 80 ml von 0, 125n-Natriumhydroxyd, enthaltend 300 mg Kaliumborhydrid, gemischt. Die alkalische Lösung wird eine Stunde lang auf 600C gehalten, während welcher Zeit die Humulone in ihre entsprechenden Isohumulone isomerisieren, auf die gleichzeitig das Borhydrid einwirkt, um reduzierte Isohumulone zu bilden. Der Inhalt der Reaktionsflasche wird dann auf Raumtempe- ratur gekühlt, worauf das überschüssige Borhydrid durch Zusatz von 6n-Salzsäure zersetzt wird, wodurch der pH-Wert der alkalischen Lösung von 12,6 auf 2 absinkt. Die reduzierten Isohumulone werden durch Extraktion mit Petroläther wiedergewonnen.
Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Bitterstoffrest in Äthanol aufgenommen. Der Äthanolextrakt der reduzierten Isohumulone kann nun zur Herstellung eines lichtbeständigen Bieres verwendet werden.
Beispiel 3 : Isomerisation und nachfolgende Reduktion eines Hopfenextraktes.
50 g gemahlenen, getrockneten Hopfens werden in einem Rohr mit 1,2 l Petroläther extrahiert. Der Extrakt wird unter Vakuum konzentriert und das Volumen auf 250 ml eingestellt. Gemäss der spektrophotometrischen Analyse sind von der Hopfenextraktion her 3,05 g Humulone und 2, 15 g Lupulone anwesend.
Der Petroläther wird im Vakuum verdampft und der dunkle ölige Rest mit 30 ml Äthanol aufgenommen.
Die Bittersäuren, die darin enthalten sind, werden mit 14,5 ml 1n-NaOH neutralisiert. Die Lösung wird bei PH 11 mit 150 ml 0, 2m-Phosphatpuffer gepuffert und dann zu 300 ml mit Wasser verdünnt. Diese Innige Humulonlösung wird 90 Minuten lang im Rückfluss behandelt, um die Humulone in Isohumulone umzuwandeln, und dann gekühlt. Die chemische Reduktion der Isohumulone wird nun durch den Zusatz von 874 mg Kaliumborhydrid und einem vierstündigen Rühren bei Raumtemperatur bewerkstelligt. Eine Hälfte der Lösung (150 ml) wird mit 6n-HCl auf PH 2 angesäuert, um das überschüssige Borhydrid zu zersetzen. Die Ansäuerung macht die reduzierten Isohumulone, die teilweise abgewandelten Lupulone und andere Substanzen unlöslich.
Das Gemisch wird. mit Petroläther extrahiert, um die reduzierten Isohumulone und andere in Petroläther lösliche Substanzen wiederzugewinnen. Die Borsäure jedoch verbleibt in der wässerigen Lösung. Nach Entfernung des Petroläthers im Vakuum wird der ölige Rest in 100 ml Äthanol aufgenommen.
Die Äthanollösung, die gemäss der spektrophotometrischen Untersuchung etwa 960 mg reduzierte Isohumulone enthält, wird zu 211 nichtgehopfter Würze aus dem Brauhaus hinzugesetzt. Die Würze wird gekocht und abgekühlt. Dann wird Hefe zugesetzt und die Flüssigkeit vergoren. Das sich ergebende Bier wird in der üblichen Weise behandelt. Das Bier besitzt alle sonst vorhandenen feinen Qualitäten, ist aber nicht lichtempfindlich. Der etwas lichtempfindliche Lupulon-Anteil des Hopfenextraktes, der gegenüber
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der oben erläuterten chemischen Reduktion widerstandsfähiger ist, ist infolge seiner Unlöslichkeit in Würze und Bier eliminiert.
Ein gemäss dem vorliegenden Verfahren hergestelltes Bier ergibt eine spektrophotometrische Ultraviolett-Absorptionskurve, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, u. zw. mit der charakteristischen Flachstelle im Bereich von etwa 260 bis 275 Millikron Wellenlänge.
Be is pie 1 4 : Kombinierte Isomerisation und Reduktion eines Hopfenextraktes.
150 g gemahlenen, getrockneten Hopfens werden in einem Rohr extrahiert, indem 21 Petroläther hinzugefügt werden. Der Extrakt wird unter Vakuum konzentriert und das Volumen auf 250 ml eingestellt.
Gemäss der spektrophotometrischen Analyse sind von der Hopfenextraktion her 8,63 g Humulone und 6,25 g Lupulone anwesend. Ein Teil des Petrolätherextraktes (115 ml) wird im Vakuum verdampft und in 40 ml Äthanol aufgenommen. Die Bittersäuren, die darin enthalten sind, werden mit 19,0 ml In-NaOH neutralisiert und dann die Lösung mit Wasser auf 100 ml verdünnt. Diese Lösung des Hopfenextraktes wird zu 300 ml einer alkalischen Lösung von Borhydrid bei 700C hinzugefügt, die 40 ml In-NaOH und 1,258 g
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zu ihren entsprechenden Isohumulonen isomerisiert, wobei gleichzeitig die Borhydride einwirken, um die reduzierten Isohumulone zu bilden, wie es durch die Änderung in den Spektralkurven im ultravioletten Bereich nachzuweisen ist. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt.
Ein Anteil von 150 ml der alkalischen Lösung wird auf pH 2 angesäuert, um das überschüssige Borhydrid zu zersetzen, und die reduzierten Isohumulone werden durch Extrahierung mit Petroläther zusammen mit andern in diesem Lösungsmittel löslichen Substanzen wiedergewonnen. Die Borsäure bleibt in der wässerigen Phase während der Extraktion. Der Petroläther wird im Vakuum verdampft und der ölige Bitterstoffrest in 100 ml Äthanol aufgenommen. Die Äthanollösung, die gemäss der spektrophotometrischen Untersuchung 1 g reduzierte Isohumulone enthält, wird nun zu 22 1 kochender Würze aus dem Brauhaus zugesetzt. Die Würze wird gekocht, gekühlt und mit Hefe versetzt. Das sich ergebende Bier wird in üblicher Weise behandelt und ist lichtbeständig.
Beispiel 5 : Entfernung des Lupulon-Anteiles nach Isomerisation und nachfolgender Reduktion.
Die zweite Hälfte der isomerisierten und reduzierten Hopfenextraktlösung aus dem chemischen Reduktionsprozess nach Beispiel 3 wird mit 6n-HCl auf PH 6,5 gesäuert, obgleich sich herausgestellt hat, dass eine pH-Einstellung zwischen 6,0 und 8,5 in gleicher Weise wirksam ist. Diese Behandlung zersetzt das überschüssige Borhydrid und lässt den Lupulon-Anteil unlöslich werden. Das Gemisch wird mit Petrol- äther extrahiert, der den teilweise umgewandelten Lupulon-Anteil vollständig entfernt und den grössten Teil oder sämtliche reduzierte Isohumulone in der wässerigen Phase zurücklässt. Diese wässerige Phase wird nun weiter mit 6n-HCI auf PH 2 angesäuert und das Gemisch mit Petroläther extrahiert, um die reduzierten Isohumulone zu gewinnen, die dem Bier die gewünschte Bitterkeit und Schaumstabilität geben.
Wiederum bleibt die Borsäure in der wässerigen Phase. Nach Verdampfen des Petroläthers wird der reduzierte Isohumulon-Anteil von 100 ml Äthanol aufgenommen und spektrophotometrisch untersucht.
77 ml der Äthanollösung, die etwa 1,05 g reduziertes Isohumulon enthält, wird zu 211 kochender, nichtgehopfter Würze hinzugefügt. Die abgekühlte Würze wird mit Hefe versetzt und das resultierende Bier, das in üblicher Weise behandelt wird, ist nicht lichtempfindlich, wenn man es dem Lichtversuch gemäss Beispiel 1 unterwirft.
Beispiel 6 : Entfernung des Lupulone-Anteiles nach der kombinierten Isomerisation und Reduktion.
Ein anderer Teil von 150 ml der Hopfenextraktlösung aus der kombinierten chemischen Isomerisation und Reduktion nach Beispiel 4 wird mit 5n-HCI auf PH 6, 4 gesäuert. Das überschüssige Borhydrid wird dann zersetzt und der Lupulone-Anteil unlöslich. Das Gemisch wird mit Petroläther extrahiert, wodurch vollständig der teilweise abgeänderte Lupulone-Anteil entfernt wird und der grösste Teil oder sämtliche reduzierte Isohumulone in der wässerigen Phase zurückbleiben. Diese wässerige Phase wird nun weiter mit 5n-HCI auf pH 2 gesäuert und das Gemisch wird mit Petroläther extrahiert, wodurch das erwünschte reduzierte Isohumulon gewonnen wird. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wird der Rest in 100 ml Äthanol aufgenommen und die Äthanollösung, die etwa 0,93 g reduzierte Isohumulone enthält, wird 211 kochender, nichtgehopfter Würze zugesetzt.
Die gekühlte Würze wird mit Hefe versetzt, in üblicher Weise behandelt und ergibt ein Bier, das lichtbeständig ist.
Beispiel 7 : Isomerisation und anschliessende Reduktion eines Extraktes aus frischem Hopfen.
335 g frischen, nichtgetrockneten Hopfens werden in einem Rohr mit 41 petrol ther extrahiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der ölige Rest in Äthanol aufgenommen sowie gefiltert, um das unlösliche Material zu entfernen. Das alkoholische Filtrat wird mit Äthanol auf 250 ml gebracht.
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Gemäss der spektrophotometrischen Untersuchung sind aus dem frischen Hopfen 4, 75 g Humulone und 3, 45 g Lupulone gewonnen worden. Eine Menge des Hopfenextraktes, die 2 g Humulone in 20 ml Äthanol enthält, wird mit 8, 0 ml In-NaOH behandelt, um die Humulone und Lupulone zu neutralisieren, und weiter mit 100 ml 0, 2m-Phosphatpuffer und Wasser verdünnt, um ein endgültiges Volumen von 200 ml zu ergeben. Die alkalische Lösung mit pH 11 wird 90 Minuten lang im Rückfluss behandelt, um die Humulone in ihre entsprechenden Isohumulone zu isomeriseren. Die Lösung wird abgekühlt, worauf 596 mg Kaliumborhydrid hinzugefügt und das Reaktionsgemisch vier Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird.
Das überschüssige Borhydrid wird zersetzt, indem 6n-HCl bis zu einem pH-Wert von 2 zugesetzt werden.
Das unlösliche Material, das die erwünschten reduzierten Isohumulone enthält, wird mit Petroläther extrahiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der ölige Rest in 50 ml Äthanol aufgenommen.
Ein Teil des Äthanolextraktes, der etwa 1, 0 g reduzierte Isohumulone enthält, wird zu 211 kochender, nichtgehopfter Würze zugesetzt. Die Würze wird gekühlt, mit Hefe versetzt und dann das Bier in üblicher Weise behandelt. Das Bier ist gegenüber Licht beständig, wenn es dem Lichtversuch gemäss Beispiel 1 unterzogen wird.
Bei der Ausführung der Erfindung ist man nicht auf die in den obigen Beispielen angegebenen Bedingungen beschränkt. Die chemische Reduktion der Isohumulone mit Natriumborhydrid oder Kaliumborhydrid kann in nichtwässerigen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Aminen und Glykoläthern, durchgeführt werden. Lithiumaluminiumhydrid würde wasserfreien Äthyläther und andere Lösungsmittel der Ätherklasse erfordern. Dies sind nur einige wenige von vielen möglichen Reduktionsmitteln und Lösungsmitteln.
Die Isomerisation und Reduktion der Isohumulonen kann über einen sehr weiten pH-Bereich und Temperaturbereich ausgeführt werden, obwohl leichtalkalische Bedingungen und eine mittlere Temperatur bevorzugt werden. Die Konzentration des Reduktionsmittels kann innerhalb angemessener Grenzen schwanken. Es können auch andere Säuren ausser Salzsäure zur Verminderung des pH-Wertes und zur Zersetzung des überschüssigen Borhydrids verwendet werden. Kohlenwasserstoffe, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Äther und andere Lösungsmittel, die sich nicht mit Wasser mischen und die das Erzeugnis in angemessene Weise lösen, können an Stelle von Petroläther zur Wiedergewinnung des Erzeugnisses verwendet werden.
Die Konzentration des Humulons, das zu Isohumulon isomerisiert wird, das seinerseits reduziert wird, kann beträchtlich schwanken. Obgleich in obigen Beispielen Lösungen mit 1'10 Humulon verwendet wurden, wurde auch mit Lösungen gearbeitet, die 0, lolo, 5r1/0 und 10je Humulon enthalten.
Zwar wird vorzugsweise der Hopfenextrakt direkt der Würze zugesetzt, wie es im Beispiel 1 beschrieben wurde, es wurde jedoch weiterhin gefunden, dass der Hopfenextrakt, der gemäss der Erfindung hergestellt wird, in jedem beliebigen Stadium des üblichen Brauverfahrens zugefügt werden kann, um ein annehmbares Bier- oder Aleprodukt zu erhalten. Es ist klar, dass geringere Mengen benötigt werden, wenn sie während Arbeitsgängen zugesetzt werden, die dem Kochen der Würze folgen.
Wie bereits erwähnt, hat sich gezeigt, dass die Spektralabsorption der Isohumulone, wenn sie in alkalischem Methanol gemessen wird, sich als Folge der Reduktion ändert. Diese Änderung tritt in dem Ultraviolettbereich auf, der etwa 260 - 275 mil entspricht. Die Spektralkurve der Fig. 1 der Isohumulonen, die sich bei der Isomerisation von gereinigten Humulonen ergibt, besitzt lediglich eine kleine Biegung in dem Bereich von 260 bis 275 mu. Jedoch hat die Spektralkurve der Fig. 1, die sich auf die reduzierten Isohumulonen bezieht, die bei der chemischen Reduktion der gleichen Isohumulonen entstehen, einen ausgesprochen flachen oder ebenen Abschnitt, der in einigen Fällen ein zweites Maximum in dem gleichen Bereich von 260 bis 275 mg des Spektrums besitzt.
Die Spektralkurve des regulär gehopften Biers in Fig. 2 ergibt sich aus der Isooktan-Extraktion eines in üblicher Weise hergestellten Biers, bei welchem der gesamte getrocknete Hopfen mit Würze gekocht wird. Sie ist ähnlich der Kurve des nichtreduzierten Isohumulons der Fig. 1, weil sie die typische Krümmung besitzt, die auf die chemisch nichtreduzierten Isohumulone zurückzuführen ist. Die zwei andern Vergleichskurven der Fig. 2, die die Spektralabsorptionskurven der reduzierten Isohumulone, die durch Isooktan-Extraktionen der Biere gemäss den Beispielen 1 und 3 gewonnen wurden, darstellen, haben die gleiche allgemeine Form in dem Bereich des Ultraviolettspektrums von 260 bis 275 mu, wie es für die reduzierten Isohumulone der Kurve b in Fig. 1 veranschaulicht ist.
Ein Isooktan-Extrakt irgendeines Biers, das chemisch reduzierte Isohumulone gemäss der Erfindung enthält, zeigt also einen wesentlichen Unterschied in den Spektralabsorptionseigenschaften in dem Bereich von 260 bis 275 mp des Spektrums, verglichen mit einem Bier, das ein nicht in dieser Weise behandeltes Isohumulon enthält.