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Verfahren zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen aus Keuchhustenbazillen (Bordet-Gengou).
Seit der Entdeckung des Keurhhustenbazillus von Bordet und Gengou wird in der Literatur immer wieder hervorgehoben, dass der Keuchhustenbazillus in den ersten Generationen zwar zu seinem Wachstum auf künstlichen Nährböden unbedingt Hämoglobin benötigt, dass er aber allmählich an hämoglobinfreie Kulturmedien gewöhnt werden könne (s. Kolle, Kraus, Uhlenhuth : Handbuch der pathogen. Mikroorganismen, Bd. V, 2, Artikel Löwenthal und Zurukzoglu, S. 346 ff.). Nach neueren Forschungen englischer Autoren [vgl. Gardner und Leslie, The Lancet 222,9 (1932)] soll die kulturelle Umgewölmung zugleich mit einer weitgehenden Antigenumwandlung Platz greifen.
Die serologisch zunächst einheitlichen Phasen 1 und il (bzw. A und B) sollen sich in die serologisch abtrennbaren Phasen 111 und IV umbilden, die sich schon äusserlich durch die Form ihrer Kolonien kenntlich machen. Während die Phasen I und II der S-Form entsprechen, sollen die Phasen III und IV die R-Form repräsentieren. Besonders wichtig ist, dass auch die Toxizität der Kulturen mit dem Phasenweehsel verlorengeht. Nur die Phasen I und II sind toxisch.
Im Gegensatz zu allen diesen Angaben wurde nun gefunden, dass sich aus verschiedenen Keuchhustenepidemien der letzten Jahre über 50 Stämme isolieren liessen, die sich von den bisher in der Literatur genannten dadurch grundlegend unterscheiden, dass sie sich in jeder Hinsieht als absolut konstant erweisen. In mehr als vierjähriger Beobachtung wurden diese Stämme in hundert Passagen weitergezüchtet. Sie haben dabei alle ihre Eigenschaften unverändert bewahrt. Keiner von allen Stämmen liess sich an hämoglobinfreie Nährböden gewöhnen. Auf hämoglobinfreiem Substrat wachsen sie vielmehr auch nicht andeutungsweise. Das äussere Bild der Kolonien ist unverändert. Von einem Phasenwechsel kann keine Rede sein.
Ihre Toxizität, darauf sei besonders hingewiesen, ist in vollem Umfange erhalten.
Demnach unterscheiden sich diese Keuchhustenstämme grundlegend von den bisher beschriebenen.
Sie sind das Ausgangsmaterial für die nachstehend erwähnten Partialantigene. Wie bereits bemerkt, ist die Toxizität der Keuchhustenbazillen seit langem bekannt. Sie beruht auf einem Endotoxin, das an dem Bakterienleib fest verankert ist. Schon wiederholt hat man versucht, diese toxische Quote in löslicher Form von den an sich ungiftigen korpuskularen Bestandteilen zu trennen. Von diesen Methoden ist die bekannteste die von Besredka. Die bisher beschriebenen Methoden sind jedoch wenig brauchbar, denn die Herstellung eines hochwertigen loslichen bakterienfreien Toxins gelingt mit ihnen im allgemeinen nicht mit hinreichender Regelmässigkeit.
Es hat sich nun herausgestellt, dass man zuverlässig zu hochgradig toxischen Produkten gelangt, wenn man das Gefüge der Bakterienleiber in einer Weise sprengt, dass der aus den Bakterien verbleibende Rückstand bei der mikroskopischen Prüfung nur noch als amorphe Masse erscheint. Beispielsweise
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handlung, wie Zerreiben im Mörser. oder Behandlung mit hypotonischen Lösungen, wie Extraktion mit destilliertem Wasser, erreichen oder noch wirksamer durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Kulturrasen, eine Methode, die zur Aufschliessung von Bakterienimpfstoffen überhaupt noch nicht Anwendung gefunden hat. Derartig vorbehandelte Absehwemmungen lassen sich dann z.
B. durch Zentrifugieren oder Filtration durch keimdichte Filter von den unlöslichen Bakterientrümmern befreien und
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repräsentieren jetzt die in Lösung gegangenen Giftstoffe, die früher in den Bakterienleibern enthalten waren. Die Giftigkeit ist durch intradermale, subeutane oder intravenöse Applieation beim Versuchstier (Kaninchen und Meerschweinehen) leicht nachweisbar. Eine Auswertung gelingt durch Bestimmung der Dosis necroticans minima beim Meerschweinchen oder Kaninchen. Damit ist auch die Herstellung der einmal gewünschten Giftkonzentration gewährleistet.
Man geht z. B. in folgender Weise vor :
Der Rasen von Keuchhustenbazillenkulturen wird mit physiologischer Kochsalzlösung abge-
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wird er bei Zimmertemperatur wieder aufgetaut und von neuem zum Einfrieren gebracht.
Diese Prozedur wird mehrmals wiederholt. Mikroskopiert man jetzt das Sediment derartig vorbehandelter Bakterienaufschwemmungen, so kann man sieh überzeugen, dass die Bakterien in eine amorphe Masse verwandelt worden sind.
Von immunologischer Bedeutung sind nicht allein die löslichen Giftstoffe, sondern auch die unlöslichen giftfreien Bakterienrückstände. Neben der Herstellung giftiger, aber bakterienfreier Antigene hat man auch die Herstellung giftfreier Keuchhustenbazillenantigene in der Hand. Auch durch Einwirkung höherer Temperaturen kann man das Gift zerstören. Durchforscht man die vorliegende Literatur über die handelsüblichen oder ad hoe dargestellten Impfstoffe, so fällt eine völlige Ungleichförmigkeit in der Beurteilung der Reizfähigkeit der verschiedenen Impfstoffe auch gleicher Herkunft auf. Einmal wird die starke lokale oder allgemeine Reaktion besonders hervorgehoben, ein andermal wieder die völlige Reizlosigkeit der Keuchhustenimpfstoffe betont.
Der Grund für diese Widersprüehe ist offenbar der, dass völlig unkontrolliert gifthaltige und ungiftige Stämme verarbeitet werden, deren jeweilige quantitative Beteiligung an der entstandenen Vaccine, man möchte sagen zufallsmässig, die mehr oder weniger ausgebildete Reizfähigkeit der Vaccine bedingt.
Durch die vorliegende Erfindung hat man es jedoch sicher in der Hand, aus einheitlich giftigen Stämmen nach einheitlicher künstlicher Entgiftung Vaccine herzustellen und diese gegebenenfalls mit der jeweils gewünschten Giftspitze zu versehen, indem geeignete Kombinationen aus entgifteten Bakterien und bakterienfreien Giftlösungen vorgenommen werden. Dadurch kann jedes der beiden Partialantigene in zweckmässigen Mengen zur Wirkung gebracht und dem Makroorganismus die optimale Immunitätslage verschafft werden.
Beispiel : Im Verlauf einer Keuchhustenepidemie verschafft man sich verschiedene Keuchhustenstämme dadurch, dass man die bekannte Hustenplatte nach Chiewitz-Meyer von keuchhustenkranken Kindern, die sich im Frühstadium der Erkrankung befinden, behusten lässt. Die nach 48stündiger Bebrütung aufgehenden Kolonien werden nach den Regeln der bakteriologischen Technik untersucht und die auf Keuchhustenbazillen verdächtigen Kolonien abgeimpft. Die Reinkulturen werden darauf einer sorgfältigen Prüfung unterworfen zum Zwecke der Feststellung, ob es sich um echte Keuchhustenbazillen (Bordet-Gengou) handelt oder nicht, da sehr häufig Verwechslungen mit ähnlichen Bazillen vorkommen.
Zur vollständigen Identifizierung der Keuchhustenbazi1len gehören drei verschiedene Prüfungen :
1. die Prüfung auf kulturelles und mikroskopisches Verhalten,
2. auf serologisches Verhalten,
3. auf gewebsbiologisches Verhalten.
1. Nur solche Bazillen werden als echte Keuchhustenbazillen angesprochen, die sieh als gramnegative, kleine, kurze Stäbchen darbieten, die gelegentlich zur Kettenbildung neigen. Sie dürfen auf gewöhnlichem Agar nicht wachsen, dagegen gut auf dem Bordet-Gengouschen Kartoffel-Pferdeblut- Agar, nicht auf Taubenblutagar.
2. Sie müssen ferner mit dem Keuchhustenimmunserum Komplementbildung geben.
3. Sie müssen schliesslich beim meerschweinchen oder Kaninchen intracutan appliziert eine l1ämorrhagische Entzündung mit nachfolgender Nekrose verursachen.
Sind die Stämme so identifiziert, so werden sie auf Bordet-Gengou-Agar weitergezüchtet und die Kulturen immer wieder daraufhin kontrolliert, dass sie ihre ursprünglichen kennzeichnenden Eigenschaften behalten. Nur solche Stämme, die trotz lang fortgesetzter Passage keine Änderung der eben gekennzeichneten Merkmale erkennen lassen, werden entsprechend der Erfindung zur Vaccine verarbeitet.
Hat man sich über die Eigenschaften der zu verwendenden Stämme vergewissert, so erfolgt die weitere Verarbeitung z. B. folgendermassen :
Die Kulturen solcher aus zeitlich und örtlich verschiedenen Keuchhustenepidemien gewonnenen Stämme werden auf Petrischalen oder andern geeigneten Glasgefässen in Oberflächenkulturen gezüchtet.
Darauf wird der Rasen der verschiedenen Kulturen mit physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und die vereinigten, aus 50 oder mehr verschiedenen Stämmen gewonnenen Bakterienaufschwemmungen durch eine Kältemischung oder flüssige Luft zum Gefrieren gebracht. Der Gefriervorgang wird zweckmässig nach dem Auftauen mehrmals wiederholt. Nunmehr erfolgt eine Trennung der Bakterien von dem Aufschwemmungsmittel, das jetzt giftig geworden ist, in bekannter Weise, z. B. durch Zentrifugieren, Filtration durch keimdichte Filter u. dgl.
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Das in Lösung gegangene Toxin wird durch Bestimmung der kleinsten nekrotisierenden Dosis durch die bekannte Intracutan-Injektion am Meerschweinchen ausgewertet.
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messung ermittelt.
Zur Herstellung der Vaccine kann man entweder das Toxin als solches verwenden oder die ungiftigen Bakterienrückstände allein. Zweckmässig aber stellt man sich durch geeignete Mischung der Toxinlösung mit einer Aufschwemmung der Bakterienrückstände ein Vaccin her, wobei das Verhältnis von Toxinlösung und Bakterienrückstand so ausgewählt wird, dass eine optimale Wirkung erreicht wird.
Die so gewonnenen Vaccine sind auf Ampullen abgefüllt und keimfrei gemaeht.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen aus Eeuchhustenbazillen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus verschiedenen, zeitlich auseinanderliegenden Epidemien stammende Bakterienstämme des Bazillus Bordet-Gengou, deren kulturelle Eigenschaften und Toxinbildung sich auch bei langdauernder Fortzüchtung auf künstlichen Nährboden konstant verhalten, auf künstliehen Nährboden fortzüehtet und die erhaltenen, von den Nährboden abgetrennten Bakterienrasen gemeinsam zu Vaccinen aufarbeitet.