AT144187B - Verfahren zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen aus Keuchhustenbazillen (Bordet-Gengou). - Google Patents

Description

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  Verfahren zur   Herstellung   von polyvalenten   Impfstoffen aus Keuchhustenbazillen (Bordet-Gengou).   



   Seit der Entdeckung des   Keurhhustenbazillus   von Bordet und Gengou wird in der Literatur immer wieder hervorgehoben, dass der Keuchhustenbazillus in den ersten Generationen zwar zu seinem Wachstum auf   künstlichen   Nährböden unbedingt Hämoglobin benötigt, dass er aber   allmählich   an   hämoglobinfreie Kulturmedien   gewöhnt werden könne (s.   Kolle,   Kraus, Uhlenhuth : Handbuch der pathogen. Mikroorganismen, Bd. V, 2, Artikel Löwenthal und Zurukzoglu, S.   346 ff.). Nach   neueren Forschungen englischer Autoren [vgl. Gardner und Leslie, The Lancet 222,9   (1932)]   soll die kulturelle   Umgewölmung   zugleich mit einer weitgehenden Antigenumwandlung Platz greifen.

   Die serologisch zunächst einheitlichen Phasen 1 und   il   (bzw.   A   und B) sollen sich in die   serologisch   abtrennbaren Phasen 111 und   IV   umbilden, die sich schon äusserlich durch die Form ihrer Kolonien kenntlich machen. Während die Phasen   I   und II der S-Form entsprechen, sollen die Phasen III und   IV   die   R-Form   repräsentieren. Besonders wichtig ist, dass auch die Toxizität der Kulturen mit dem Phasenweehsel verlorengeht. Nur die Phasen I und II sind toxisch. 



   Im Gegensatz zu allen diesen Angaben wurde nun gefunden, dass sich aus verschiedenen Keuchhustenepidemien der letzten Jahre über   50 Stämme   isolieren liessen, die sich von den bisher in der Literatur genannten dadurch grundlegend unterscheiden, dass sie sich in jeder   Hinsieht   als absolut konstant erweisen. In mehr als vierjähriger Beobachtung wurden diese Stämme in hundert Passagen   weitergezüchtet.   Sie haben dabei alle ihre Eigenschaften unverändert bewahrt. Keiner von   allen Stämmen   liess sich an hämoglobinfreie Nährböden gewöhnen. Auf hämoglobinfreiem Substrat wachsen sie vielmehr auch nicht andeutungsweise. Das äussere Bild der Kolonien ist unverändert. Von einem Phasenwechsel kann keine Rede sein.

   Ihre Toxizität, darauf sei besonders hingewiesen, ist in vollem Umfange erhalten. 



   Demnach unterscheiden sich diese Keuchhustenstämme grundlegend von den bisher beschriebenen. 



  Sie sind das Ausgangsmaterial für die nachstehend erwähnten Partialantigene. Wie bereits bemerkt, ist die Toxizität der   Keuchhustenbazillen   seit langem bekannt. Sie beruht auf einem Endotoxin, das an dem Bakterienleib fest verankert ist. Schon wiederholt hat man versucht, diese toxische Quote in löslicher Form von den an sich ungiftigen   korpuskularen   Bestandteilen zu trennen. Von diesen Methoden ist die bekannteste die von Besredka. Die bisher beschriebenen Methoden sind jedoch wenig brauchbar, denn die Herstellung eines hochwertigen   loslichen   bakterienfreien Toxins gelingt mit   ihnen   im allgemeinen nicht mit hinreichender Regelmässigkeit. 



   Es hat sich nun herausgestellt, dass man zuverlässig zu hochgradig toxischen Produkten gelangt, wenn man das Gefüge der Bakterienleiber in einer Weise sprengt, dass der aus den Bakterien verbleibende Rückstand bei der mikroskopischen Prüfung nur noch als amorphe Masse erscheint. Beispielsweise 
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 handlung, wie Zerreiben im Mörser. oder Behandlung mit hypotonischen Lösungen, wie Extraktion mit destilliertem Wasser, erreichen oder noch wirksamer durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Kulturrasen, eine Methode, die zur   Aufschliessung   von Bakterienimpfstoffen überhaupt noch nicht Anwendung gefunden hat. Derartig vorbehandelte   Absehwemmungen   lassen sich dann z.

   B. durch Zentrifugieren   oder Filtration durch keimdichte Filter   von den unlöslichen Bakterientrümmern befreien und 

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 repräsentieren jetzt die in Lösung gegangenen Giftstoffe, die früher in den Bakterienleibern enthalten waren. Die Giftigkeit ist durch intradermale, subeutane oder intravenöse   Applieation   beim Versuchstier (Kaninchen und   Meerschweinehen) leicht nachweisbar.   Eine Auswertung gelingt durch Bestimmung der Dosis   necroticans   minima beim Meerschweinchen oder Kaninchen. Damit ist auch die Herstellung der einmal gewünschten Giftkonzentration gewährleistet. 



   Man geht z. B. in folgender Weise vor :
Der Rasen von Keuchhustenbazillenkulturen wird mit physiologischer   Kochsalzlösung   abge- 
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 wird er bei Zimmertemperatur wieder aufgetaut und von neuem zum Einfrieren gebracht. 



   Diese Prozedur wird mehrmals wiederholt. Mikroskopiert man jetzt das Sediment derartig vorbehandelter Bakterienaufschwemmungen, so kann man sieh   überzeugen,   dass die Bakterien in eine amorphe Masse verwandelt worden sind. 



   Von immunologischer Bedeutung sind nicht allein die   löslichen   Giftstoffe, sondern auch die unlöslichen giftfreien   Bakterienrückstände.   Neben der Herstellung giftiger, aber bakterienfreier Antigene hat man auch die Herstellung giftfreier   Keuchhustenbazillenantigene   in der Hand. Auch durch Einwirkung höherer Temperaturen kann man das Gift zerstören. Durchforscht man die vorliegende Literatur über die handelsüblichen oder ad hoe dargestellten Impfstoffe, so fällt eine völlige   Ungleichförmigkeit   in der Beurteilung der Reizfähigkeit der verschiedenen Impfstoffe auch gleicher Herkunft auf. Einmal wird die starke lokale oder allgemeine Reaktion besonders hervorgehoben, ein andermal wieder die völlige Reizlosigkeit der Keuchhustenimpfstoffe betont.

   Der Grund für diese Widersprüehe ist offenbar der,   dass   völlig unkontrolliert gifthaltige und ungiftige Stämme verarbeitet werden, deren jeweilige quantitative Beteiligung an der entstandenen Vaccine, man möchte sagen zufallsmässig, die mehr oder weniger ausgebildete Reizfähigkeit der Vaccine bedingt. 



   Durch die vorliegende Erfindung hat man es jedoch sicher in der Hand, aus einheitlich giftigen Stämmen nach einheitlicher künstlicher Entgiftung Vaccine herzustellen und diese gegebenenfalls mit der jeweils gewünschten Giftspitze zu versehen, indem geeignete Kombinationen aus entgifteten Bakterien und bakterienfreien Giftlösungen vorgenommen werden. Dadurch kann jedes der beiden Partialantigene in zweckmässigen Mengen zur Wirkung gebracht und dem Makroorganismus die optimale Immunitätslage verschafft werden. 



   Beispiel : Im Verlauf einer Keuchhustenepidemie verschafft   man   sich verschiedene Keuchhustenstämme dadurch, dass man die bekannte Hustenplatte nach Chiewitz-Meyer von keuchhustenkranken Kindern, die sich im Frühstadium der Erkrankung befinden, behusten lässt. Die nach 48stündiger Bebrütung aufgehenden Kolonien werden nach den Regeln der bakteriologischen Technik untersucht und die auf Keuchhustenbazillen verdächtigen Kolonien abgeimpft. Die Reinkulturen werden darauf einer sorgfältigen Prüfung unterworfen zum Zwecke der Feststellung, ob es sich um echte Keuchhustenbazillen (Bordet-Gengou) handelt oder nicht, da sehr häufig Verwechslungen mit ähnlichen Bazillen vorkommen. 



   Zur vollständigen Identifizierung der   Keuchhustenbazi1len   gehören drei verschiedene Prüfungen :
1. die Prüfung auf kulturelles und mikroskopisches Verhalten,
2. auf serologisches Verhalten,
3. auf   gewebsbiologisches   Verhalten. 



   1. Nur solche Bazillen werden als echte Keuchhustenbazillen angesprochen, die sieh als gramnegative, kleine, kurze   Stäbchen   darbieten, die gelegentlich zur Kettenbildung neigen. Sie dürfen auf gewöhnlichem Agar nicht wachsen, dagegen gut auf dem   Bordet-Gengouschen     Kartoffel-Pferdeblut-   Agar, nicht auf Taubenblutagar. 



   2. Sie müssen ferner mit dem Keuchhustenimmunserum Komplementbildung geben. 



   3. Sie müssen schliesslich beim   meerschweinchen   oder Kaninchen intracutan appliziert eine   l1ämorrhagische   Entzündung mit nachfolgender Nekrose verursachen. 



   Sind die Stämme so identifiziert, so werden sie auf   Bordet-Gengou-Agar weitergezüchtet und   die Kulturen immer wieder daraufhin kontrolliert, dass sie ihre ursprünglichen kennzeichnenden Eigenschaften behalten. Nur solche Stämme, die trotz lang fortgesetzter Passage keine Änderung der eben gekennzeichneten Merkmale erkennen lassen, werden entsprechend der Erfindung zur   Vaccine   verarbeitet. 



   Hat man sich über die Eigenschaften der zu verwendenden Stämme vergewissert, so erfolgt die weitere Verarbeitung z. B. folgendermassen :
Die Kulturen solcher aus zeitlich und örtlich verschiedenen Keuchhustenepidemien gewonnenen Stämme werden auf Petrischalen oder andern geeigneten Glasgefässen in   Oberflächenkulturen   gezüchtet. 



  Darauf wird der Rasen der verschiedenen Kulturen mit physiologischer   Kochsalzlösung   abgeschwemmt und die vereinigten, aus 50 oder mehr verschiedenen Stämmen gewonnenen   Bakterienaufschwemmungen   durch eine   Kältemischung   oder flüssige Luft zum Gefrieren gebracht. Der Gefriervorgang wird zweckmässig nach dem Auftauen mehrmals wiederholt. Nunmehr erfolgt eine Trennung der Bakterien von dem   Aufschwemmungsmittel,   das jetzt giftig geworden ist, in bekannter Weise, z. B. durch Zentrifugieren, Filtration durch   keimdichte Filter u.   dgl. 

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   Das in   Lösung gegangene Toxin wird durch Bestimmung   der kleinsten   nekrotisierenden   Dosis durch die bekannte Intracutan-Injektion am Meerschweinchen ausgewertet. 
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 messung ermittelt. 



   Zur Herstellung der Vaccine kann man entweder das Toxin als solches verwenden oder die ungiftigen   Bakterienrückstände allein. Zweckmässig   aber stellt man sich durch geeignete Mischung der Toxinlösung mit einer Aufschwemmung der Bakterienrückstände ein Vaccin her, wobei das Verhältnis von Toxinlösung und Bakterienrückstand so ausgewählt wird, dass eine optimale Wirkung erreicht wird. 



  Die so gewonnenen Vaccine sind auf Ampullen abgefüllt und keimfrei gemaeht. 



   PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von polyvalenten Impfstoffen aus   Eeuchhustenbazillen,   dadurch gekennzeichnet, dass man aus verschiedenen, zeitlich auseinanderliegenden   Epidemien   stammende Bakterienstämme des Bazillus Bordet-Gengou, deren kulturelle Eigenschaften und Toxinbildung sich auch bei langdauernder   Fortzüchtung   auf künstlichen Nährboden konstant verhalten, auf künstliehen   Nährboden   fortzüehtet und die erhaltenen, von den Nährboden abgetrennten Bakterienrasen gemeinsam zu Vaccinen aufarbeitet.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bakterienleiber nach bekannten Methoden, wie z. B. durch mechanische Behandlung, wie Zerreiben im Mörser. oder Behandlung mit hypotonischen Lösungen, wie Extraktion mit Wasser, sprengt, so dass der aus den Bakterien verbleibende Rückstand bei der mikroskopischen Prüfung nur noch als amorphe Masse erscheint.

   3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kulturrasen wiederholt einfrieren und auftauen lässt.

   4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man nach bekannten Methoden, wie z. B. durch Einwirkung höherer Temperaturen. den giftigen Bestandteil der Bakterien völlig ausschaltet.

   5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die giftigen und ungiftigen Antigene in einem für die Immunisierung am besten geeigneten Mischungsverhältnis kombiniert.