JPS63160578A - 抗腫瘍キラ−ｔ細胞の誘導方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗腫瘍キラーＴ細胞誘導材を使用し、白血球
細胞を活性化して腫瘍細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法
に関する。

（従来の技術） 周知の如く、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構をに
なう抗腫瘍細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞、活
性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役割をはたして
いることが報告されている。

したがって、悪性重傷に対する免疫学的療法としては、
障患者免疫細胞（白血球）を活性化して、これらの抗腫
瘍細胞を効駒寥誘導することが考えられる。しかしなが
ら、癌患者は一般的に、癌の進行とともに免疫能が低下
することが報告されておシ、癌患者生体中においては、
ＭｗＸｒヲ抑制する先妙備ｊ因子の存在あるいはサプレ
ッサーＴ細胞、サプレッサーマクロファージの誘導活性
化が報告されている。

このような免疫能の抑制状態下にある！患者生体中にお
いて、効率的な抗ａ瘍細胞の誘導は困難であると言わな
ければならない。したがって、免疫抑制状態から解放さ
れた体外に患者白血球を取り出し、体外で効率的な抗腫
瘍細胞誘導活性化を行うことは、効果の高い新しい癌免
疫療法になると考えられる。

最近、体外に取り出し九癌患者末梢血白血球に遺伝子組
み換えヒト・インターリューキン２ｔ−加えて培養させ
、患者白血球を活性化して、広範囲に腫瘍細胞だけを障
害し１，６者正常細胞は障害しないキラーＴ細胞を誘導
して、これを癌患者体内にもどすことにより、癌を治療
する試みがなされている。

（発明が解決しようとする問題点） 前記の治療法は、癌患者から大量の末梢血単核細胞を取
り出し、無菌的に長期間、インターリューキン２の存在
下で培養した後に、癌患者に舷注入するという操作面で
非常に煩雑であること、また、時間的にも１回の操作あ
たり３日から４日の時間を要すること、さらには、−人
の患者あたシ医師の相当な手間が必要なことから、美大
な治療費がかかる等の問題がある。

本発明者らは、これら問題点を解決するため研究した結
果、従来の方法よりも操作性よく、さらに、強力な＠（
Ｊ！障害性細胞を誘導できる誘導材および誘導方法を提
供してきた（特開昭６０−１２０８２１号公報、特開昭
６０−２５２４２５号公報）。すなわち、これら発明の
誘導材を使用することにより、前記治療法が操作性よ〈
実施できるようになった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の如き従来技術に基づく抗腫瘍免疫細胞
誘、導法の問題点に鑑み、従来の方法よりも操作性、安
全性の点で実用的に向上させた抗腫瘍キラーＴ細胞の誘
導方法を提供するものである。

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究した結果、白
血球を含む体液成分を抗腫瘍キラーＴ細胞の誘導可能な
誘導材を充填したカラムに、白血球のカラム内線速が５
　Ｘ　１０−２０％　／　Ｓｅｃ以下で、カラム内滞留
時間が２分以上の条件で通液することを特徴とする白血
球細胞の活性化方法によって、安全性の問題もなく抗腫
瘍キラーＴ細胞を強力に誘導できることを発見し１本発
明を完成した。

本発明における白血球を含む体液成分とは、末梢血や末
梢血を遠心分離装置で処理した後に得られる白血球の豊
富な画分（バッフイーコート層）を指すが、リンパ管、
リンパ節、膵臓、骨髄、胸管から得られる白血球画分も
含まれる。

本発明における抗）ル瘍キラーＴ細胞とは、培養癌細胞
株に対して障害機能を有し、かつ、細胞表面にＴ３抗原
を有するリンパ球画分をさしている。

本発明でいう抗腫瘍キラーＴ細胞の誘導可能な誘導材と
は、白血球細胞膜表面に存在する細胞表面抗原やレセプ
ターをはじめとするタンパク質、糖タンパク質、脂質、
糖脂質等の分子と接触することにより、抗）重傷免疫細
胞を誘導できる水に不溶な物質であるが、例えば、不溶
性の担体表面に抗腫瘍キラーＴ細胞の誘導可能なリガン
ドを固定させることによって得られる。

本発明において、担体表面に固定させる抗腫瘍キラーで
細胞誘導可能なリガンドとしては、レクチン、リンフ才
力イン類、モノカイン類、抗日血球抗体、プロティンＡ
、リポポリサッカライド（ＬＰＳＩ、ＯＫ４５２、オリ
ゴ糖などの生物由来の物質、および核酸塩基、ヌクレオ
シド、ヌクレオチド、ピラゾロ（３，４−ｄ　）ピリジ
ンやその誘導体、あるいはアニオン性基を有する有機化
合物等をリガンドとして例示することができる。

レクチンとしては、７アセオラス・ブルガリス（Ｐｈａ
ｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）由来のアカインゲ
ンマメレクチン（ＰＲＡＹ、コンカナバリア・エンシフ
オルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒ
ｍｉｓ　）由来のコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）
　、ライステリア・アオリパンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　
ａｏｒｉｂａｎｄａ　）由来のノダクジマメレクチン（
ＷＦＡ）、レンズ・キュリナス（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎ
ａｒｉｓ　）由来のレンズマメレクチン（ＬＣＨ）、フ
ィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａ
ｍｅｒｉｃａｎａ　）由来のアメリカヤマゴボウレクチ
ン（ＰＷＭＩ、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　
ｍａｘ　ｌ由来のダイズレクチ７　（ＳＢＡ）、フオセ
オラス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｌｉｍｅｎ
ｓｉｓｌ由来のりママメレクチン（ＬＢＡ　ｌ、ロビナ
・プソイドアカシア（Ｒｏｂｉｎａ　Ｐｓｅｕｄｏａｃ
ａｃｉａ　ｌ由来のニセアカシアレクチン（ＲＰＡ）、
ンホラ・ジャポニカ（５ｏｐｎｏｒａ　ｊａｐｏｎｉｃ
ａ　ｌ由来のイヌエンジニマメレクチン（ＳＪＡ）、ピ
サム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ　）由来
のエントウマメレクチン（ＰＳＡ）、ビシア・ファパ（
Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ　）由来のンラマメレクチン（Ｖ
ＦＡＩ等が例示できる。

リンフ才力イン類、モノカイン顛としては、天然あるい
は遺伝子工学を用いて得られたインターリューキン１、
インターリューキン２、ｒ−インターフェロン、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦＩ等を例示することができる。

抗日血球抗体としては、Ｔ細胞、単球、マクロファージ
、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ［胞）や、Ｋ細胞の表面
に存在する抗原、レセプターに対するモノクローナル抗
体、活性化リンパ球表面に存在するレセプターに対する
モノクローナル抗体、およびクラスＩ抗原、クラス■抗
原に対するモノクローナル抗体が挙げられる。

たとえば、抗Ｌｅｕ−１抗代抗Ｌｅｕ−２抗体、抗Ｌｅ
ｕ−５抗体、抗Ｌｅｕ−４抗体、抗Ｌｅｕ−５抗体、抗
Ｌｅｕ−８抗体、抗Ｌｅｕ−９抗体、抗Ｌｅｕ−１５抗
体、抗Ｌｅｕ−Ｍ３抗体、抗Ｌｅｕ−７抗体、抗Ｌｅｕ
−１１抗体、抗ＩＬ−２レセプター抗体、抗トランスフ
ェリンレセプター抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ
−ＤＣ抗体（以上、ベクトン・デイッキンソｙ社展、Ｕ
ＳＡ）や、抗Ｔ３、抗Ｔ４、抗Ｔ６、抗Ｔ８、抗’ｉ’
１１、抗ＭＩ、抗ＤＲ１抗Ｔ９、抗Ｔ１０抗体等を例示
できる。また、抗Ｔ細胞抗原レセプター抗体や抗ＩＬ−
２レセプター抗体も好ましく使用できる。抗Ｔ細胞抗原
すセブター抗体としては、Ｔ細胞抗原リセブターの抗原
結合部位に対する抗イデイオタイプモノクローナル抗体
が特に選択的活性化の点で好ましい。

オリゴ糖としてｆｌ、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−
アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、マ
ンノース、グルコース、シアル酸の中の三つ以上から溝
底される。たとえば、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−ア
セチルグルコサミ／、フコースから成るオリゴ糖、ある
いはガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコー
スから成るオリゴ糖であり、たとえば、 Ｇａｌβ１−＋４Ｇ１ｃＮＡＣβ１−＋３０ａｌβ１Ｆ
’ｕｃα１ の構造を有するオリゴ据が例示できる。

免疫細胞の刺激、活性化用のリガンドとしては、以上の
例示に限定されるものではなく、本発明の基材に固定し
て抗腫瘍キラーＴａＪＪｍを誘導できるリガンドは全て
使用できる。

また、本発明の基材に２種以上のリガンドを保持させて
用いることもできる。さらには、リガンドを保持した材
料を２ｍ以上併用して用いることもできる。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できる。不溶性担体の形状は、粒子状
、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の形状も用い
ることができる。粒状もしくは球状不溶性囲体としては
、粒径５０ミクロン〜３０００ミクロンのものが使用で
きる。粒径５０ミクロン以下では、白血球の大きさが１
０ミクロン前後であることを考えると、誘導材を充填し
たカラムに白血球を通液させる際に、誘導材がカラムか
ら流出することなく、白血球を通液させることは困難で
ある。とくに粒径１００ミクロン以上であれば、圧力の
上昇もなく、白血球を通液させることが可能である。粒
径３０００ミクロン以上では、白血球との担体単位重量
あたシの接触面積が低下するため好ましくない。特に好
ましくは、粒径２００，２０００ミクロンのものである
。平膜状あるいは中空糸状多孔性担体を使用する場合、
その孔径が、細胞は通過できないが培地成分は自由に通
過できる０、０５〜１０ミクロンのものを使用すれば、
膜の一方の面に結合し九白血球に膜の他方の面より栄養
を補給でき、高濃度の白血球を刺激活性化することが可
能である。特に０．１〜５ミクロンの孔径の平膜状ある
いは中空糸状の多孔性担体が良好に使用できる。

不溶性担体の材質としては、無機ペースのものにあって
は活性炭、ガラス等およびその誘導体があり、天然高分
子由来担体には、セルロース、セファロース、デキスト
ラン、デンプン等の単線多糖類およびその誘導体がある
。

また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エスチル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ−ジ−
ローキシリレン、ノルボルネン、シクロブテン、トリオ
キサン、ラクチド、シクロポリシロキサン、塩化ホスホ
ニトリル、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物等およ
びその誘導体の重合体および共重合体、ポリホルムアル
デヒド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコ
ール、ポリ−５，３−ビス（クロルメチル）オキサシク
ロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラクタ
ム等およびその誘導体がある。

また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
アンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリスル
ホンアミド、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール等お
よびその誘導体があげられる。

樹脂その他のものにあっては、アクリル樹脂、メタクリ
ル樹脂、フッ素樹脂、エポキシ樹脂、尿素樹脂、アミノ
樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹脂、ポリウレタン、シ
リコン樹脂、アルキド樹脂等およびその誘導体が例示で
きる。

以上にあげた高分子担体は、必要に応じた適当なコモノ
マー、架橋剤を用い、不溶化担体を得ることができ、架
橋剤にあっては、硫黄、有機過酸化物、フェノール樹脂
、ジイソシアナート、エポキシ化合物、ジエン、グルタ
ルアルデヒド等、被架橋物の官能基に合わせ、種々のも
のを選択できる（大成社、１架橋剤ハンドブック”、９
５〜７７．１９８１１゜ また、上記不溶性担体にコーティングを施した多層構造
を有した担体も使用できる。たとえば、活性炭やガラス
ピーズにポリヒドロキシルエチルメタクリレートをコー
ティングした担体等が使用できる。

リガンドを不溶性担体の表面に固定する方法としては、
共有結合、イオン結合、物理吸着等あらゆる公知の方法
を用いることができるが、溶出性から考えると、共有結
合で固定して用いることが望ましい。そのためには通常
固定化酵素、アフィニテイクロマトグラフィで用いられ
る方法を用いることができる。例えば、臭化水素（ＣＮ
Ｂｒ　）でアガロース、セファロース等を活性化し、あ
るいはシリカガラスピーズをｒ−アミノプロピルトリエ
トキシシランと反応させてアルキルアミノガラスを得、
これをグルタルアルデヒドで活性化し、結合させる等の
方法を用いることができる。また、必要に応じて、不溶
性担体との間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入
して使用することもできる。例えば、アガロースのヒド
ロキシル基とへキサメチレンジイソシアナートの片側の
インシアナート基を反応結合させ、残ったインシアナー
ト基と抗体のアミノ基を反応結合させるごと〈実施する
ことができる。

以上の要素よりなる本発明の誘導材の製造法は、その構
成容素の結合順序を規定したものではない。

すなわち、本発明で使用する誘導材は、基本的には不溶
性担体表面に抗腫瘍キラーＴ細胞を誘導可能なリガンド
が１ｍ以上存在すればよいのであり、製造方法に左右さ
れるものではない。

本発明の誘導材は、使用に際して、単一の不溶性担体表
面に１ｍ以上のリガンドを結合し次誘導材はもとより、
単一の不溶性担体表面に１種類のリガンドを結合させた
誘導材を複数組合わせて使用することも可能である。

本発明でいう白血球浮遊液のカラム内滞留時間とは、カ
ラム内に充填されている誘導材の排除容量（もしくは、
むだ容量）を流体が通過するのに要する時間である。

本発明でいう白血球浮遊液のカラム内線速とは、カラム
に充填されている誘導材の充填長を滞留時間で除した値
で、単位としてｉｊ　Ｃｐｓ／ｓｅｃで表わすことがで
きる。

抗腫瘍キラーで細胞の誘導可能な誘導材を充填したカラ
ムを使用して、ΦジーＴａ胞を誘導するには、全血ある
いは白血球を含む体液成分のカラム内滞留時間が２分以
上、線速が５ｘ１０″’　（：ｍ／ＳＩＫ以下の条件で
通液して白血球を活性化すればよい。

しかしながら、滞留時間が２分より短かいときには、白
血球細胞膜表面の抗原やレセプターと誘導材表面上のり
ガントとの接触時間が充分でなかったり、白血球細胞と
誘導材の接触の確率が低下するため、白血球が充分に活
性化されない。その結果、抗腫瘍キラーＴ細胞の誘導効
率が低下すると考えられる。滞留時間が７２時間より長
くなると、白血球の生存率が低下するため、充分な抗腫
瘍キラーＴ細胞が誘導できない。全血あるいは白血球を
含む体液成分のカラム内滞留時間として、より好ましい
範囲は４分から６時間であり、さらに好ましくは５分か
ら３時間の範囲である。

線速に関しては、５　Ｘ　１０−”（８４／ｓｅｃより
高速のときには、白血球と誘導材の接触が充分に起こら
ないため、白血球の活性化効率が低下する。全血あるい
は白血球を含む体液成分のカラム内線速として、よシ好
ましくは２　Ｘ　１０−”０１１７　ｓｅｃ以下であり
、さらに好ましくはＩ　Ｘ　１０’″ｔａｓ　／　ｓｅ
ｃ以下の範囲である。白血球を含む体液成分を銹導材充
填カラムに導入後、一定時間静置して白血球と誘導材を
接触させて、白血球を活性化することも可能である。

重要なことは、白血球を含む体液成分を誘導材充填カラ
ム内に通液させる間に、５×１０″４ｒｎ／ｓｅｃ以下
の線速で２分間以上通液させる条件を設けてやればよく
、この条件を満たせば、あとは任意の線速で通液できる
。

誘導材充填カラムに通過させる体液中の白血球濃度とし
ては、５Ｘ１０１１個／ｄ以下の範囲が好ましい。体液
中の白血球濃度が５Ｘ１０’個／−以上では、誘導材単
位容量当υの白血球数が極めて多量になることから、効
率的に白血球を活性化できない。

したがって、白血球の活性化効率から考えて、より好ま
しい白血球濃度としてはＩ　Ｘ　１０’個／ｒｌｌｔ以
下でちゃ、さらに好ましくは５８１０Ｓ個／ｌＲ１以下
である。

全血ま次は白血球を含む体液成分を誘導材充填カラムに
通過させるときの温度としては、１５Ｃから４００の範
囲が好ましい。温度が１５Ｃ以下では、白血球は有効に
活性化されず、温度が４０Ｃ以上では白血球の生存率は
低下する。

全血ま九は白血球浮遊液を誘導材と接触させて活性化す
るときに、インターリューキン２および／またはガンマ
・インターフェロンを添加してやると、さらに強力に抗
腫瘍キラーＴ細胞を誘導できる。

上記のようにして得られ念活性化白血球は、強力な腫瘍
障害細胞を含壱１−る。すなわち、銹導材充填カラムを
通過させた白血球を自己血清２０％含有ＲＰＭ１１６４
０培地にッスイ）中、５チｃｏ。

インキュベーター内で３７Ｃで２０時間培養した後、各
種ヒト橿瘍細胞に作用させたところ、ＺＲ７５−５０乳
癌細胞、ＭＫＮ−１胃、Ｉ！ｉ細胞、ｐｃ−ｑＨ癌細胞
、ＮＢ’ｒ−２膀胱癌細胞等を強く障害した。

（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 不溶性担体として、メチルメタアクリレ−トルジビニル
ベンゼン共重合体（８０：２０重量％）の粒子（５５０
〜５００μｍ）を作表した。次に、２−ヒドロキシエチ
ルメタアクリレートとジエチルアミノエチルメタアクリ
レートとのランダム共重合体の２チｗｔ／ｖメタノール
溶液を調製し、上記の不溶性担体にコーティングを施し
た。この多層構造を有した不溶性担体に、ノ・ロゲン化
シアン（ＣＮＢｒ）を用いた方法（アフイニテイクロマ
トグラフィーＰ、！Ｓ　ＯヘＰ、４９．千畑一部・土佐
哲也・松尾雄志著、１９７６）で、アメリカヤマゴボウ
レクチン（ＰＷＭ）を結合し次誘導材を得た。

誘導材１．４ｄｔ−直径０．６１の円筒型のカラムに充
填し、０．５％ヘパリン添加生理食塩水で況浄して、誘
導材充填カラムとして使用した。

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパッ
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００　ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した後、中間層の白血球層を分離し
て、これをハンクス液で洗った後、ヘパリン加自己血漿
を２０チ添加したＲＰＭ１１６４゛Ｏ培地（二ツスイ）
に２×１０゜個／−の細胞濃度で浮遊させた。

白血球浮遊液の誘導材充填カラムへの通液法を以下に示
す。

上記の誘導材充填カラムに２　Ｘ　１０’個／Ｗｔに調
製した白血球浮遊液７−ｔ−カラム内滞留時間が１０分
になるように通液させた。白血球のカラム通液は、５７
Ｃの加温下で実施した。カラムを通過させた白血球は、
ＣＯ，インキュベーター中、３７Ｃで２０時間培養して
、キラー活性の測定に供した。

抗膣瘍免疫細胞誘導材カラムで活性化された白血球の癌
細胞障害性は、次のようなキラー活性測定法を用いて評
価した。

標的細胞として、培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を、　５　Ｘ　１０’／　ｄの細胞濃度
で１０Ｌｓ牛脂児血清添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に浮
遊させ、これを１０μｔずつ１０μを容テラサキプレー
トに分注し、ＣＯ，インキュベーター中で温度５７Ｃで
培養する。２４時間培養を行うと、癌細胞は培養プレー
ト底面に強く付着する。これを培養液で洗った後、自己
血清１０チ添加ＲＰＭ１１６４０培地に、５　Ｘ　１０
’／−の細胞濃度で浮遊させた活性化白血球液１０μｔ
を添加し、５７Ｃで４時間、ＣＯ，インキュベーター中
で培養し、プレートに付着している癌細胞を障害させる
。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性を喪
失し、ハンクス液で洗うと、白血球とともに除去される
。生残してプレート底面に付着している癌細胞をア七ト
ンで固定し、ギムザ液で染色した後、顕微鏡で計数する
。キラー活性は次式によシ計算する。

キラー活性−（１−（（活性化白血球を添加した場合の
生存腫瘍細胞数）／（活性化白血球を添加しない場合の
生存腫瘍細胞数）　））　Ｘ　１００（％）前述の条件
下で誘導材充填カラムに通液させた白血球の各種ヒト癌
細胞に対する障害性を表１に示した。

実施例２ 実施例１で示した誘導材を充填し九カラムの直径が１．
５１であり、白血球浮遊液のカラム内滞留時間が２分に
なるように設定した以外は、全て実施例１と同様に実験
を行なった。

白血球浮遊液のカラム通液条件と活性化白血球の各種ヒ
ト癌細胞に対する障害性を表１に示した。

実施例３ 実施例１で示した誘導材充填カラムの直径が０．５４山
であり、白血球浮遊液のカラム内滞留時間が５０分にな
るように設定した以外は、全て実施例１と同様に実験を
行なつ次。

白血球浮遊液のカラム通液条件と活性化白血球の各種ヒ
ト癌細胞に対する障害性を表１に示した。

比較例１ 実施例１で示した誘導材を充填したカラムの直径が２．
６８ｉ）ＩＩであシ、白血球浮遊液のカラム内滞留時間
が０．５分になるように設定した以外は、全て実施例１
と同様に実験を行なった。

表１に、白血球浮遊液のカラム通液条件とカラム通過白
血球の各種ヒト癌細胞に対する障害性を示した。

表１　白血球浮遊液のカラム通液条件とカラム通過白血
球のヒト癌細胞に対する障害性（注）誘導材１ｄ当り通
過させた白血球数：ｌＸ１０’個実施例４ 実施例１と同様にして調製した誘導材１．４！ＩＬｔを
直径０．９００１の円筒型のカラムに充填し、０．５チ
ヘパリン添加生理食塩水で洗浄して、誘導材充填カラム
として使用した。

この誘導材充填カラムに、実施例１と同様の方法で得た
ヒト白血球浮遊液（細胞濃度：ｚｘｔｏ’／−）７−を
カラム内線速か５．５　Ｘ　１０−’０１／式になるよ
うに通液させた。白血球のカラム通液は、５７Ｃの加温
下で行なつ几。カラムを通過させた白血球は、ＣＯ，イ
ンキュベーター中、３７Ｃで２０時間培養して、実施例
１と同じ方法でキラー活性を測定した。その結果を表２
に示す。

実施例５ 白血球を通液させるときに、直径０．２９ｃＩｍの円筒
型カラムを使用して、白血球浮遊液のカラム内線速が３
ｉ　Ｘ　１０−”　□ＩＩ　／　Ｓｅｃになるように通
液させた以外は、全て実施例４と同様に実験を行なった
。

その結果を表２に示す。

比較例２ 白血球を通液させるときに、直径０．１６１７１の円筒
型カラムを使用して、白血球浮遊液のカラム内線速が０
．１０１１７式になるように通液させた以外は、全て実
施例４と同様に実験を行なった。

その結果を表２に示す。

表２　白血球浮遊液のカラム通液条件とカラム通過白血
球のヒト癌細胞に対する障害性 実施例６ 白血球浮遊液を誘導材充填カラムへ導入後、一定時間静
置することによって白血球を活性化する方法について示
す。

実施例１と同様の方法で調製した誘導材２−を直径１瀉
の円筒型のカラムに充填し、０．５チヘパリン添加生理
食塩水で洗浄して、誘導材充填カラふとして使用した。

このカラムに、実施例１と同じ方法で得た白血球浮遊＃
　（２Ｘ　１０’個／−）１−をポンプを用いて導入す
る。導入後、１５分間静置させたあとに、自己血清を２
０チ添加させたＲＰＭＩｊ６４０培地２−をポンプで流
してカラム内の白血球を回収した。白血球のカラム通液
Ｆ′ｉ、３７Ｃの加温下で実施した。

回収した白血球は、ＣＯ，インキュベーター中、３７Ｃ
で２０時間培養して、実施例１と同様のキラー活性の測
定に供した。

誘導材充填カラムの通液によシ活性化した白血球のＭＫ
Ｎ−１胃癌細胞、ＮＢＴ−２膀胱癌細胞、ＺＲ７５−１
０乳癌細胞、ＰＣ−９肺癌［ｉｌ＆Ｃ対する障害性は、
それぞれ６５％、６０％、７０チ、６０％であった。

実施例７ 実施例６と同様の誘導材充填カラムおよび２０チ自己皿
渭含有ＲＰＭ１１６４０培地に、細胞濃度５Ｘ１０−個
／−で浮遊させたヒト白血球を使用し友。

白血球浮遊液の誘導材充填カラムへの通液法を以下に示
す。

誘導材充填カラム（２−の誘導材を充填）に、上記白血
球浮遊液１−をポンプを用いて導入する。

導入後、５０分間静置させ７’Ｃあと、さらに白血球浮
遊液１−をポンプで導入すると同時に、先にカラム内に
導入していた白血球浮遊液を回収する。

この操作を４回繰り返し、最後にカラム内に導入した白
血球は、３０分間静置させ次あとに、自己血清を２０チ
添加し７’ＣＲＰＭＩ　１６４０培地２ｒｎｔをポンプ
で流して白血球を回収した。誘導材充填カラムは３７０
に加温しておいた。

上記のように、間欠的に白血球を誘導材充填カラムに導
入して刺激した白血球を回収して、ＣＯ。

インキュベーター中、５７Ｃで２０時間培養して、キラ
ー活性の測定に供した。

この活性化白血球のＭＫＮ−１胃癌細胞、ＮＢＴ−２膀
胱癌細胞、ＺＲ７５−３０乳癌細胞、ＰＣ−９肺癌細胞
に対する障害性は、それぞれ６０％１５５％、６５％、
６０チであった。

実施例８ 遺伝子工学を用いて得られ九インターリューキン２（レ
コンビナントＩＬ−２）を、実施例１で使用した不溶性
担体にハロゲン化シアン（ＣＮＢｒ）を用いた方法で結
合した誘導材を得友。誘導材としてインターリューキン
２を固定化し次不溶性担体を使用し次以外は、全て実施
例１と同様にして白血球浮遊液を誘導材充填カラムへ通
液させた。

上記の条件で通液した白血球の抗腫瘍キラー活性を実施
例１と同様の方法で評価したところ、ＭＫＮ−１胃癌細
胞、ＮＢＴ−２膀胱癌細胞、Ｚ　Ｒ７５，−５０乳癌細
胞に対する障害性は、それぞれ３０％、３０％、３５％
であった。

実施例９ ０ＫＴ５モノクロ一ナル抗体（オーフ・ダイアグノステ
ィック・システム株式会社製）を、プロティンＡ−セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシ７？ｆｆｆｌを用いたアフイ
ニテイクロマトグラフィーにより精製し、この精製抗体
をリガンドとして実施例１で使用した不溶性担体に、ハ
ロゲン化シアン（ＣＮＢｒ）を用いた方法で結合した誘
導材を得た。

上記誘導材を使用して、実施例８と同様にカラム通液し
た白血球の抗腫瘍キラー活性は、ＭＫＮ−１胃癌細胞、
ＮＢＴ−２膀胱癌細胞、ＺＲ７５−５０乳癌細胞に対す
る障害性は、それぞれ５５％、３０％、３０チであった
。

（発明の効果） 本発明の抗腫瘍免疫細胞の活性化方法は、白血球（免疫
細胞）を効率良く、かつ操作性よく、強力に抗腫瘍免疫
細胞を訪導するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗腫瘍キラーＴ細胞を誘導する方法において、全血もし
   くは白血球浮遊液を抗腫瘍キラーＴ細胞を誘導可能な誘
   導材を充填したカラムに、滞留時間が２分以上、線速が
   ５×１０＾−＾２ｃｍ／ｓｅｃ以下の条件で通液するこ
   とを特徴とする抗腫瘍キラーＴ細胞の誘導方法。