JPS61280432A - 抗腫瘍免疫細胞誘導方法 - Google Patents
抗腫瘍免疫細胞誘導方法Info
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- JPS61280432A JPS61280432A JP60120513A JP12051385A JPS61280432A JP S61280432 A JPS61280432 A JP S61280432A JP 60120513 A JP60120513 A JP 60120513A JP 12051385 A JP12051385 A JP 12051385A JP S61280432 A JPS61280432 A JP S61280432A
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- Japan
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- stimulating
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、白血球を刺激活性化して抗腫瘍免疫細胞を誘
導する方法に関する。
導する方法に関する。
（従来の技術）
周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構を
担う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞
、活性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役目をはた
していることが報告されている［福沢正洋：医学のあゆ
み、１２６．４２０ （’８３）１゜したがって、悪性
腫瘍に対する免疫学的療法としては、癌患者免疫細胞（
白血球）を活性化して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率
的に誘導活性化することが考えられる。しかしながら、
実際の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に対
する免疫監視機構の存在にもかかわらず、腫瘍細胞が増
殖する。
担う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞
、活性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役目をはた
していることが報告されている［福沢正洋：医学のあゆ
み、１２６．４２０ （’８３）１゜したがって、悪性
腫瘍に対する免疫学的療法としては、癌患者免疫細胞（
白血球）を活性化して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率
的に誘導活性化することが考えられる。しかしながら、
実際の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に対
する免疫監視機構の存在にもかかわらず、腫瘍細胞が増
殖する。
その主要なメカニズムの１つとして、腫ｆｓ細胞による
免疫抑制性細胞（サプレッサーＴ細胞、サプレッサーマ
クロファージ等）の誘導活性化が報告されている ［ｍ
本重義ら、ジャーナル・オブ・イ゛ムノロジイ（Ｓ、Ｆ
ｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
１１６．７９１（’７６）］。
免疫抑制性細胞（サプレッサーＴ細胞、サプレッサーマ
クロファージ等）の誘導活性化が報告されている ［ｍ
本重義ら、ジャーナル・オブ・イ゛ムノロジイ（Ｓ、Ｆ
ｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔａｌ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）
１１６．７９１（’７６）］。
かかる免疫抑制性細胞は、赴瘍細胞を障害する機能を担
う種々の抗腫瘍免疫細胞の誘導活性化を抑制し、ために
腫瘍細胞の増殖を許し、ますます腫瘍に対する免疫応答
能の低下をまねくと考えられる。また、その他のメカニ
ズムとして、腫瘍細胞による免疫抑制性因子の産生によ
り、腫瘍細胞に対する免疫応答が抑制されている司能性
も報告されており［ジェー・ニー・ロスら、ジャーナル
・オブ・イムノロシイ（Ｊ、八、Ｒｏｔｈ ｅｔａｌ：
Ｊ、ｒｍｍｕｎ。
う種々の抗腫瘍免疫細胞の誘導活性化を抑制し、ために
腫瘍細胞の増殖を許し、ますます腫瘍に対する免疫応答
能の低下をまねくと考えられる。また、その他のメカニ
ズムとして、腫瘍細胞による免疫抑制性因子の産生によ
り、腫瘍細胞に対する免疫応答が抑制されている司能性
も報告されており［ジェー・ニー・ロスら、ジャーナル
・オブ・イムノロシイ（Ｊ、八、Ｒｏｔｈ ｅｔａｌ：
Ｊ、ｒｍｍｕｎ。
１、） １２８，１９５５ （’８２）］、かかる免
疫抑制状態下にある癌患者体内においては、効率的な抗
腫瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であると言わなければ
ならない。
疫抑制状態下にある癌患者体内においては、効率的な抗
腫瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であると言わなければ
ならない。
したがって、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘導活性化
に最適な条件を体外に設定し、癌患者から取り出した白
血球を刺激活性化して、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導し
、これを元の患者にもどすことによって癌を治療しよう
とする方法は、効果の高い新しい癌免疫療法となる゛可
能性を有すると考えられる。
に最適な条件を体外に設定し、癌患者から取り出した白
血球を刺激活性化して、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導し
、これを元の患者にもどすことによって癌を治療しよう
とする方法は、効果の高い新しい癌免疫療法となる゛可
能性を有すると考えられる。
（発明が解決しようとする問題点）
体外に取り出した白血球を刺激活性化して抗腫瘍免疫細
胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投与して癌を治療
する試みは、現在活発に研究が行なわれているが、白血
球の刺激活性化に担癌生体より抽出した腫瘍細胞を用い
ており、非゛常に操作が煩雑である−０ （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、レクチン等の刺激材を不溶性担体に共有結合
させた刺激材を用いて白血球を活性化することにより、
強力な抗腫瘍免疫細胞を安全に、かつ操作性良く誘導で
きることを見い出し特許出願した（特願昭５８−２２８
４９６）。さらに、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する方
法を見い出すため鋭意研究を行った結果、驚くべきこと
に、これらの刺激材を組合せて順次白血球を刺激活性化
することにより、さらに強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導で
きることを見出し、本発明を完成するに至った。
胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投与して癌を治療
する試みは、現在活発に研究が行なわれているが、白血
球の刺激活性化に担癌生体より抽出した腫瘍細胞を用い
ており、非゛常に操作が煩雑である−０ （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、レクチン等の刺激材を不溶性担体に共有結合
させた刺激材を用いて白血球を活性化することにより、
強力な抗腫瘍免疫細胞を安全に、かつ操作性良く誘導で
きることを見い出し特許出願した（特願昭５８−２２８
４９６）。さらに、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する方
法を見い出すため鋭意研究を行った結果、驚くべきこと
に、これらの刺激材を組合せて順次白血球を刺激活性化
することにより、さらに強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導で
きることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、複数の刺激材を用いて同時または
順次白血球を刺激活性化することを特徴とする癌治療の
ための抗腫瘍免疫細胞誘導方法に係る。
順次白血球を刺激活性化することを特徴とする癌治療の
ための抗腫瘍免疫細胞誘導方法に係る。
本発明で用いる刺激材は、刺激材を共有結合で不溶性担
体に結合したものである。
体に結合したものである。
本発明で使用する刺激材としては、植物由来のレクチン
、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロティンＡ１溶
連菌製剤０Ｋ４３２、リンフ才力イン等を使用する。
、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロティンＡ１溶
連菌製剤０Ｋ４３２、リンフ才力イン等を使用する。
レクチンとしては、ファセオラス・１ルガリス（Ｐｈａ
ｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のアカインゲン
マメレクチン（ＰＨＡ） 、コンカナバリア・エンシフ
オルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒ
ｍｉｓ）由来のコンカナバリンＡ（ＣＯｎＡ＞、ライス
テリア・アオリバンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ａｏｒｉｂ
ａｎｄａ）由来のノダクジンメレクチン（ＷＦＡ）、レ
ンズ・キュリナリス（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）
由来のレンズマメレクチン（ＬＣＨ） 、フィトラッカ
・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍａｒｉｃ
ａｎａ）由来のアメリカヤ°ンゴボウレクチン（ＰＷＭ
）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由
来のダイズレクチン（ＳＢＡ）、フォセオラス・リメン
シス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｉ ｉｍｅｎｓｉｓ）由来
のりママメレクチン（ＬＢＡ） 、ロビナ・プソイドア
カシア（Ｉｔｏｂｉｎａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｓｉａ）
由来のニセアカシアレクチン（ＲＰＡ）、ソホラ・ジャ
ポニカ（５ｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のイ
ヌエンジュマメレクチン（ＳＪＡ）、ピサム・サチバム
（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ）由来のエントウマメレク
チン（ＰＳＡ）、ビシア・フ？バ（Ｖｉｃｉａ ｆａｖ
ａ）由来のソラマメレクチン（ＶＦＡ）等を使用する。
ｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のアカインゲン
マメレクチン（ＰＨＡ） 、コンカナバリア・エンシフ
オルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒ
ｍｉｓ）由来のコンカナバリンＡ（ＣＯｎＡ＞、ライス
テリア・アオリバンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ ａｏｒｉｂ
ａｎｄａ）由来のノダクジンメレクチン（ＷＦＡ）、レ
ンズ・キュリナリス（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）
由来のレンズマメレクチン（ＬＣＨ） 、フィトラッカ
・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍａｒｉｃ
ａｎａ）由来のアメリカヤ°ンゴボウレクチン（ＰＷＭ
）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由
来のダイズレクチン（ＳＢＡ）、フォセオラス・リメン
シス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ Ｉ ｉｍｅｎｓｉｓ）由来
のりママメレクチン（ＬＢＡ） 、ロビナ・プソイドア
カシア（Ｉｔｏｂｉｎａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｓｉａ）
由来のニセアカシアレクチン（ＲＰＡ）、ソホラ・ジャ
ポニカ（５ｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のイ
ヌエンジュマメレクチン（ＳＪＡ）、ピサム・サチバム
（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ）由来のエントウマメレク
チン（ＰＳＡ）、ビシア・フ？バ（Ｖｉｃｉａ ｆａｖ
ａ）由来のソラマメレクチン（ＶＦＡ）等を使用する。
中でも、特にアカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ） 、
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ノダクジマメレクチン
（ＷＦＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＨ） 、アメリ
カヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）は強力に抗腫瘍免疫細
胞を誘導する。
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ノダクジマメレクチン
（ＷＦＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＨ） 、アメリ
カヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）は強力に抗腫瘍免疫細
胞を誘導する。
す°ンフオカインとしては、インターリューキン１、イ
ンターリューキン２、γ−インターフェロン等が使用で
きる。なかでもインターリューキン２、γ−インターフ
ェロンは強力に抗腫瘍免疫細胞を誘導するので好ましい
。さらに、インターリューキン２は誘導力が強力で好ま
しい。これらのリンフ才力インは白血球あるいは白血病
細胞の培養液から得てもよく、また、遺伝子工学を用い
て得てもよい。
ンターリューキン２、γ−インターフェロン等が使用で
きる。なかでもインターリューキン２、γ−インターフ
ェロンは強力に抗腫瘍免疫細胞を誘導するので好ましい
。さらに、インターリューキン２は誘導力が強力で好ま
しい。これらのリンフ才力インは白血球あるいは白血病
細胞の培養液から得てもよく、また、遺伝子工学を用い
て得てもよい。
本発明で用いられる不溶性担体は、親水性４０体、疎水
性担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合
には、特に担体への血清成分の非特責的吸着が生じるた
め、親水性担体の方が好ましい効果を与える。不溶性担
体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれ
の公知の形状も用いることができる。
性担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合
には、特に担体への血清成分の非特責的吸着が生じるた
め、親水性担体の方が好ましい効果を与える。不溶性担
体の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれ
の公知の形状も用いることができる。
不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化するため
に、担体が活性化でき、担体の活性化反応、固定化反応
などを含めた全工程を通じて物理的に安定であればよい
。具体的には、無機ベースのものにあっては、活性炭、
ガラス等およびその誘導体であり、天然高分子由来担体
には、セルロース、セファローズ、デキストラン、デン
プン、アルギン酸、キチン等の単純多糖類およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニャク、アラビゴム等の複
合多糖類およびその誘導体、羊毛、絹蛋白等の蛋白質お
よびその誘導体があるが、これらは必要に応じ、架橋反
応等の不溶化処理をした後、担体に用いる。
に、担体が活性化でき、担体の活性化反応、固定化反応
などを含めた全工程を通じて物理的に安定であればよい
。具体的には、無機ベースのものにあっては、活性炭、
ガラス等およびその誘導体であり、天然高分子由来担体
には、セルロース、セファローズ、デキストラン、デン
プン、アルギン酸、キチン等の単純多糖類およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニャク、アラビゴム等の複
合多糖類およびその誘導体、羊毛、絹蛋白等の蛋白質お
よびその誘導体があるが、これらは必要に応じ、架橋反
応等の不溶化処理をした後、担体に用いる。
また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エステル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体が例示できる。
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エステル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体が例示できる。
刺激材をリガンドとして不溶性担体の表面に固定する方
法としては、共有結合、イオン結合、物理吸着等のあら
ゆる公知の方法を用いることができるが、溶出性から考
えると、共有結合で固定して用いることが望ましい。そ
のためには通常固定化酵素、アフィニティクロマトグラ
フィで用いられる公知の方法を用いることができる。た
とえば、不溶性担体をエポキシ活性化し、これにリガン
ドを結合させる方法を等を用いることができる。また、
必要に応じて、不溶性担体とリガンドの間に任意の長さ
の分子（スペーサー）を導入して使用することもできる
。
法としては、共有結合、イオン結合、物理吸着等のあら
ゆる公知の方法を用いることができるが、溶出性から考
えると、共有結合で固定して用いることが望ましい。そ
のためには通常固定化酵素、アフィニティクロマトグラ
フィで用いられる公知の方法を用いることができる。た
とえば、不溶性担体をエポキシ活性化し、これにリガン
ドを結合させる方法を等を用いることができる。また、
必要に応じて、不溶性担体とリガンドの間に任意の長さ
の分子（スペーサー）を導入して使用することもできる
。
本発明において用いる刺激材の製造方法は、上記方法に
限定されるものではなく、たとえばビニル七ツマ−にリ
ガンドを結合させ、これを重合させる方法、また、たと
えばリガンドを活性化して担体に結合さける方法等の方
法を用いることができ、本発明は、刺激材の製造方法に
規定されるものではない。
限定されるものではなく、たとえばビニル七ツマ−にリ
ガンドを結合させ、これを重合させる方法、また、たと
えばリガンドを活性化して担体に結合さける方法等の方
法を用いることができ、本発明は、刺激材の製造方法に
規定されるものではない。
本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤血球およ
び血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、この白血
球より顆粒球あるいはＢ細胞を除去した細胞分画も、本
発明における白血球の概念に含まれる。本発明において
活性化を行う白血球は、公知の連続遠心分離法にて末梢
血より採取した白血球分画を用いてもよく、また、公知
のフィコールパーク・Ｉ・ｈ４遠心分離法にて分離した
単核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞より公
知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球との口ぜット形成で
分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強力な抗腫瘍免
疫細胞の誘導が可能である。
び血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、この白血
球より顆粒球あるいはＢ細胞を除去した細胞分画も、本
発明における白血球の概念に含まれる。本発明において
活性化を行う白血球は、公知の連続遠心分離法にて末梢
血より採取した白血球分画を用いてもよく、また、公知
のフィコールパーク・Ｉ・ｈ４遠心分離法にて分離した
単核細胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞より公
知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球との口ぜット形成で
分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強力な抗腫瘍免
疫細胞の誘導が可能である。
本発明において誘導活性化する抗腫瘍免疫細胞は、白血
球の一中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ
球分画に属し、とりわけＴ細胞の性質を有している。
球の一中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ
球分画に属し、とりわけＴ細胞の性質を有している。
刺激材による末梢血白血球の活性化は、血清成分含有培
地もしくはこれにインターリューキン２を添加した培地
で行うと強力な抗腫瘍免疫細胞の誘導が可能である。す
なわち、牛胎児血清、牛血清、馬血清等の動物血清ある
いはヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製する。好
ましくはヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製する
。この場合の培地は、動物細胞培養に一般的に用いられ
る培°地、たとえば、ＲＰＭ Ｉ １６４０培地、ＭＥ
Ｍ培地等が使用できる。また、血清成分たとえば、血清
アルブミンを添加したＲ ＰＭ Ｉ １６４０培地でも
使用が可能である。
地もしくはこれにインターリューキン２を添加した培地
で行うと強力な抗腫瘍免疫細胞の誘導が可能である。す
なわち、牛胎児血清、牛血清、馬血清等の動物血清ある
いはヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製する。好
ましくはヒト血清を２〜２０％含有した培地を調製する
。この場合の培地は、動物細胞培養に一般的に用いられ
る培°地、たとえば、ＲＰＭ Ｉ １６４０培地、ＭＥ
Ｍ培地等が使用できる。また、血清成分たとえば、血清
アルブミンを添加したＲ ＰＭ Ｉ １６４０培地でも
使用が可能である。
調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢血白血球
を０．５〜３Ｘ１０ 個／ｄの細胞濃度で浮遊させ、こ
れに適当量の刺激材を添加し、温度２５〜４５℃で培養
を行う。温度２５℃以下でははとんど有効な白血球の活
性化が起こらず、温度４５℃以上では白血球の生存率が
低下する。培養は市販の細胞培養用のプラスチック製容
器を使用し、Ｃｏ２インキュベーター中で行えば簡便で
ある。
を０．５〜３Ｘ１０ 個／ｄの細胞濃度で浮遊させ、こ
れに適当量の刺激材を添加し、温度２５〜４５℃で培養
を行う。温度２５℃以下でははとんど有効な白血球の活
性化が起こらず、温度４５℃以上では白血球の生存率が
低下する。培養は市販の細胞培養用のプラスチック製容
器を使用し、Ｃｏ２インキュベーター中で行えば簡便で
ある。
数時間ないし数日、培養を行った後、白血球を回収し、
同様の条件下で別の刺激材を用いて白血球の刺激を行う
。さらに、白血球の回収を行った後、次の刺激材を使用
して活性化を行う。
同様の条件下で別の刺激材を用いて白血球の刺激を行う
。さらに、白血球の回収を行った後、次の刺激材を使用
して活性化を行う。
このように複数の刺激材を用いて同時または順次活性化
した白血球は、単独の刺激材を用いて得た白血球よりも
強力な腫瘍細胞障害活性を有することが判明した。たと
えば、ヒト白血球をＰＨＡ固定刺激材で１日刺激した後
、インターリューキン２固定刺激材で３日刺激した活性
化白血球は、ＰＨＡ固定刺激材で４日刺激して得た活性
化白血球よりも強力な腫瘍細胞障害活性を示した。また
、ＰＨＡ、ＰＷＭ等のレクチン固定刺激材、γ−インタ
ーフェロン固定刺激材、インターリューキン２固定刺激
材を順次用いて活性化すると、強力な抗腫瘍免疫細胞が
得られた。
した白血球は、単独の刺激材を用いて得た白血球よりも
強力な腫瘍細胞障害活性を有することが判明した。たと
えば、ヒト白血球をＰＨＡ固定刺激材で１日刺激した後
、インターリューキン２固定刺激材で３日刺激した活性
化白血球は、ＰＨＡ固定刺激材で４日刺激して得た活性
化白血球よりも強力な腫瘍細胞障害活性を示した。また
、ＰＨＡ、ＰＷＭ等のレクチン固定刺激材、γ−インタ
ーフェロン固定刺激材、インターリューキン２固定刺激
材を順次用いて活性化すると、強力な抗腫瘍免疫細胞が
得られた。
（発明の効果）
本発明の抗腫瘍免疫細胞誘導方法は、以上述べてきたよ
うに、白血球を刺激活性化して、安全かつ操作性よく、
強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する方法であり、胃癌、肺
癌、乳癌等の癌治療および検査診断、研究等に用いよう
とする。ものである。
うに、白血球を刺激活性化して、安全かつ操作性よく、
強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する方法であり、胃癌、肺
癌、乳癌等の癌治療および検査診断、研究等に用いよう
とする。ものである。
実施例
刺激材の調製は、以下のようにして行った、不溶性担体
としてはセファロース（ファルマシア社製、ＣＮＢｒ活
性化セファロース）を用いた。これに結合させる刺激材
としては、レクチン類（Ｅ。
としてはセファロース（ファルマシア社製、ＣＮＢｒ活
性化セファロース）を用いた。これに結合させる刺激材
としては、レクチン類（Ｅ。
Ｙ。ラボラトリーズ製）およびプロティンＡ、０Ｋ４３
２ （中外製薬、ビシバニール）は１１１！！ｊ、リン
フ才力イン類は遺伝子工学で得られたレコンビナントイ
ンターリューキン２およびγ−インターフェロン１００
μｇをそれぞれ公知の方法にてＣＮ５ｒ活性化セフアロ
ース１ｄに結合させた。結合反応後の上清および洗浄液
中の刺激材量を測定し、保持量を求めたところ、添加刺
激材量の９５％が不溶性担体に保持された。
２ （中外製薬、ビシバニール）は１１１！！ｊ、リン
フ才力イン類は遺伝子工学で得られたレコンビナントイ
ンターリューキン２およびγ−インターフェロン１００
μｇをそれぞれ公知の方法にてＣＮ５ｒ活性化セフアロ
ース１ｄに結合させた。結合反応後の上清および洗浄液
中の刺激材量を測定し、保持量を求めたところ、添加刺
激材量の９５％が不溶性担体に保持された。
ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパー
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００ｒｐｍ＋
で２０分間遠心分離した後、中間層の白血球病を分離し
て、これをハンクス液で洗った後、自己血清を１０％添
加したＲ ＰＭ Ｉ １６４０培地にツスイ）に２×１
０°／ｄの細ｌ１ＩＩ１度で浮遊させた。この細胞浮遊
液を１ｄずつ、細胞培養用の２ａｌ！ウエル（ファルコ
ンＮα３０４７）に分注し、これに−次刺激材を５０μ
ｐずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター中で温度３７℃
で培養を行った。
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパー
ク液（ファルマシア社製）に重層し、２０００ｒｐｍ＋
で２０分間遠心分離した後、中間層の白血球病を分離し
て、これをハンクス液で洗った後、自己血清を１０％添
加したＲ ＰＭ Ｉ １６４０培地にツスイ）に２×１
０°／ｄの細ｌ１ＩＩ１度で浮遊させた。この細胞浮遊
液を１ｄずつ、細胞培養用の２ａｌ！ウエル（ファルコ
ンＮα３０４７）に分注し、これに−次刺激材を５０μ
ｐずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター中で温度３７℃
で培養を行った。
所定の時間培養を行った後、ピペッティングを行って静
置すると、担体は容器の底に沈澱するので、−Ｆ清細胞
液をとり、これをハンクス液で洗った後、自己血清１０
％添加ＲＰＭ１１６４０培地に２×１０／−の細胞１１
度で浮遊させた。この細胞浮遊液をｌｄずつ、細胞培養
用の２Ｉｎｉウエルに分注し、これに二次刺激材を５０
μｍずつ添加し、所定の時間培養を行った。この操作を
くりかえし行って、順次刺激材による活性化を行った。
置すると、担体は容器の底に沈澱するので、−Ｆ清細胞
液をとり、これをハンクス液で洗った後、自己血清１０
％添加ＲＰＭ１１６４０培地に２×１０／−の細胞１１
度で浮遊させた。この細胞浮遊液をｌｄずつ、細胞培養
用の２Ｉｎｉウエルに分注し、これに二次刺激材を５０
μｍずつ添加し、所定の時間培養を行った。この操作を
くりかえし行って、順次刺激材による活性化を行った。
最終刺激を行った活性化白血球は、ハンクス液で洗った
後、自己血清１０％添加ＲＰＭＩ培地に２．５Ｘ１０／
−の細胞濃度で浮遊させた。
後、自己血清１０％添加ＲＰＭＩ培地に２．５Ｘ１０／
−の細胞濃度で浮遊させた。
この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するかどうかは
、次のようなキラー活性測定法を用いて評価した。培養
プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細胞株を標的
細胞として、５ｘ１０ ／−の細胞濃度で１０％牛脂
児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ、これを１
０μｐずつ１０μｍ容テラサキプレートに分注し、Ｃ０
２インキュベータ゛−中で温度３７℃で培養した。２４
時間培養を行うと、癌細胞は培養プレート底面に強く付
着する。これを培養液で洗った後、活性化白血球浮遊液
１０μｍを添加し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベ
ーター中で培養し、プレートに付着している癌細胞を障
害させる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付
着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性が白血球ととも
に除去される。生残してプレート底面に付着している癌
細胞をアセトンで固定し、ギムザ液で染色した後、顕微
鏡で計数した。キラー活性は次式により計算する。
、次のようなキラー活性測定法を用いて評価した。培養
プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細胞株を標的
細胞として、５ｘ１０ ／−の細胞濃度で１０％牛脂
児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ、これを１
０μｐずつ１０μｍ容テラサキプレートに分注し、Ｃ０
２インキュベータ゛−中で温度３７℃で培養した。２４
時間培養を行うと、癌細胞は培養プレート底面に強く付
着する。これを培養液で洗った後、活性化白血球浮遊液
１０μｍを添加し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベ
ーター中で培養し、プレートに付着している癌細胞を障
害させる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付
着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性が白血球ととも
に除去される。生残してプレート底面に付着している癌
細胞をアセトンで固定し、ギムザ液で染色した後、顕微
鏡で計数した。キラー活性は次式により計算する。
キラー活性 −（１−［（活性化白血球を添加した場合
の生存腫瘍細胞数）／（活性化白血球を添加しない場合
の生残腫瘍細胞数）］）ｘｌＯＯ（％） 種々の刺激方法で活性化したヒト白血球は、ＭＫ’Ｎ
−１ヒト胃癌細胞に対し、次の表に示すように、強力な
キラー活性を示し、強力な抗腫瘍免疫細胞が誘導されて
いることが判明した。
の生存腫瘍細胞数）／（活性化白血球を添加しない場合
の生残腫瘍細胞数）］）ｘｌＯＯ（％） 種々の刺激方法で活性化したヒト白血球は、ＭＫ’Ｎ
−１ヒト胃癌細胞に対し、次の表に示すように、強力な
キラー活性を示し、強力な抗腫瘍免疫細胞が誘導されて
いることが判明した。
種々の刺激方法によって誘導された抗腫瘍免疫細胞の活
性（ＩＬ−２：インターリューキン２、γ−ＩＮＦ：γ
−インターフェロン）比較例 ＰＨＡ−セファロースだけを刺激材として用いて、実施
例と同様にして１２０時間、ヒト白血球を刺激して得ら
れた活性化白血球は、ＭＫＮ−１ヒト胃癌細胞に対して
５８％のキラー活性を示した。また、０Ｋ４３２−セフ
ァロースだけを用いて、実施例と同様にして１２０時間
刺激を行った場合、５３％のキラー活性を示した。いず
れの場合も、−次刺激のみでは誘導される抗Ｉ＋’！瘍
活性は、複数刺激材による順次刺激で得られた活性化白
血球の抗腫瘍活性よりも低かった。
性（ＩＬ−２：インターリューキン２、γ−ＩＮＦ：γ
−インターフェロン）比較例 ＰＨＡ−セファロースだけを刺激材として用いて、実施
例と同様にして１２０時間、ヒト白血球を刺激して得ら
れた活性化白血球は、ＭＫＮ−１ヒト胃癌細胞に対して
５８％のキラー活性を示した。また、０Ｋ４３２−セフ
ァロースだけを用いて、実施例と同様にして１２０時間
刺激を行った場合、５３％のキラー活性を示した。いず
れの場合も、−次刺激のみでは誘導される抗Ｉ＋’！瘍
活性は、複数刺激材による順次刺激で得られた活性化白
血球の抗腫瘍活性よりも低かった。
Claims (1)
- 複数の刺激材を用いて同時または順次白血球を刺激活性
化することを特徴とする癌治療のための抗腫瘍免疫細胞
誘導方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120513A JPS61280432A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120513A JPS61280432A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280432A true JPS61280432A (ja) | 1986-12-11 |
Family
ID=14788077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60120513A Pending JPS61280432A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61280432A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0460101A1 (en) * | 1989-02-24 | 1991-12-11 | Immunotherapeutics, Inc. | Immobilized cytokines |
| WO1991019509A1 (es) * | 1990-06-21 | 1991-12-26 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Proteina a y polipeptidos de su molecula para el tratamiento de tumores |
| JPH0418033A (ja) * | 1990-05-09 | 1992-01-22 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍剤 |
| US5849282A (en) * | 1990-05-09 | 1998-12-15 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating colon, renal, and lung carcinomas with γ-interferon and Ser71 !-interleukin-1β |
| WO1999011278A1 (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Alizyme Therapeutics Limited | Robinia pseudoacacia lectin and its uses |
| US7112653B2 (en) | 1996-12-09 | 2006-09-26 | Inclone Systems, Incorporated | Composition and method for preserving progenitor cells |
-
1985
- 1985-06-05 JP JP60120513A patent/JPS61280432A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0460101A1 (en) * | 1989-02-24 | 1991-12-11 | Immunotherapeutics, Inc. | Immobilized cytokines |
| JPH0418033A (ja) * | 1990-05-09 | 1992-01-22 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍剤 |
| US5849282A (en) * | 1990-05-09 | 1998-12-15 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating colon, renal, and lung carcinomas with γ-interferon and Ser71 !-interleukin-1β |
| WO1991019509A1 (es) * | 1990-06-21 | 1991-12-26 | Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A. | Proteina a y polipeptidos de su molecula para el tratamiento de tumores |
| US7112653B2 (en) | 1996-12-09 | 2006-09-26 | Inclone Systems, Incorporated | Composition and method for preserving progenitor cells |
| WO1999011278A1 (en) * | 1997-08-29 | 1999-03-11 | Alizyme Therapeutics Limited | Robinia pseudoacacia lectin and its uses |
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