JPS6193122A - 刺激剤混入のない悪性腫瘍治療用活性化免疫細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は５刺激剤の混入がなく安全な悪性＠甥治療用活
性化免疫細胞に関する。

（従来の技術） 周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構を
荷う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ細胞、ＮＫ細胞
、活性化マクロファージ、Ｋ細胞等が重要な役割をはた
していることが報告されている〔福沢正洋：医学のあゆ
み、１２６．４２０’（’８３））。したがって、悪性
腫瘍に対する免疫学的療法としては、癌患者免疫細胞（
白血球）を活性化して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率
的に誘導活性化することが考えられる。しかしながら、
実際の癌患者体内におりては、このような悪性腫瘍に対
する免疫監視機構の存在にもがかわらず腫瘍細胞が増殖
する。

その主要なメカニズムの一つとして、腫瘍細胞による免
疫抑制性細胞（サプレッサーＴ細胞、サプレッサーマク
ロファージ等）の誘導活性化が報告されている（　Ｓ、
　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　ｅｔａｌ　：　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ。

１１６．７９１　（’７６）〕。かかる免疫抑制性細胞
は、腫瘍細胞を障害する機能を荷う種々の抗腫瘍免疫細
胞の誘導活性化を抑制し、ために腫瘍細胞の増殖を許し
、ますます＠膓に対する免疫応答能の低下をまねくと考
えられる。□また、その他のメカニズムとして、腫瘍細
胞による免疫抑制性因子の産生により、腫瘍細胞に対す
る免疫応答が抑制されている可能性も報告されており　
　〔Ｊ、Ａ、Ｒｏｔｈｅｔａｌ　：　Ｊ、　Ｉｒｒｉｍ
ｕｎｏｌ、　１２８　、１９５５（’８２　）　〕、か
か、る免疫抑制状態下にある癌患者体内においては、効
率的な抗腫瘍免疫細胞の誘導活性ｆヒは困難であると言
わなければならない。

したがって、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘導活性化
に最適な条件を体外に設定し、癌患者から取り出した白
血球を刺激活性化して、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導し
、これを元の癌患者にもどすこ七によって癌を治療しよ
うとする方法は、効果の高い新しい癌免疫療法となる可
能性を有すると考えられる。　。

（発明が解決しようとする問題点） 体外に取シ出し次白血球を刺激活性化して抗腫瘍免疫細
胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投与して癌を治療
しようとする試みは、現在活発に研究が行なわれている
が、刺激活性化に用いる刺激剤は、毒性あるいは抗原性
の問題があ〕、このような物質が活性化免疫細胞ととも
に患者体内に持ち込まれる危険性があ〕、洗浄等の煩雑
な操作を必要とし、かつ安全性に問題がある。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題を解決するために鋭意研究し
た結果、刺激剤を不溶性担体に固定し友刺激材を白血球
活性化に用いることにより、これらの刺激剤結合不溶性
担体で抗腫瘍免疫細胞が誘導可能であシ、固定しない刺
激剤を用いるよシも強力な抗＠瘍免疫細胞が誘導される
ことを見い出し、かつ誘導活性化された抗腫瘍免疫細胞
に刺激剤の付着混入がないことを確認し、本発明の安全
で、かつ強力な抗腫瘍免疫細胞を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、刺激剤を不溶性担体に固定し友刺
激材により白血球を活性化して得られる刺激剤の混入の
ない悪性腫瘍治療のための活性化免疫細胞に係る。

本発明において用いる刺激剤は、不溶性担体に共有結合
で固定して刺激材全作製し、これを白血球の刺激活性化
に用いる。

本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤血球およ
び血小板を除いた、いわゆる白血球を指すが、この白血
球よシ顆粒球あるいはＢ細胞を除去した細胞分画も、本
発明における白血球の概念に含まれる。本発明に訃いて
処理を行なう白血球は、公知の連続遠心分離法にて末梢
血より採血した白血球分画を用いてもよく、ま九、公知
のフィコールバーク重層遠心分離法にて分離し九単核細
胞分画を使用しても、強力な抗腫瘍免疫細胞の誘導が可
能である。

本発明において用いる刺激剤としては、リンパ球を活性
化する作用を持った物質を使用するが、特に７９７７球
を活性化する物質が好ましい。７９７７球を活性化する
物質としてよく知られている亀のにレクチンがあるが、
本発明者らは、不溶性担体に固定した状態で強力な抗腫
瘍免疫細胞誘導能を有するレクチンについて鋭意研究し
た結果、以下のレクチンを見い出し次。すなわち、ファ
セ第２ス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ　）由来のアカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ
）、コンカナバリア・エンシフオルミス（Ｃｏｎｃａｎ
ａｖａｌｉａｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ　）由来のコンカナ
バリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）、ライステリア・アオリパ
ンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ａｏｒｉｂａｎｄａ　）由来
のノダクジマメレクチン（ＷＦＡ）、レンズ・キュリナ
リス（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｎａｒｉｓ　）由来のレンズ
マメレクチン（ＬＣＨ）、フィトラッカ・アメリカーナ
（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ　）由来
のアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）、グリシン・
マｙ　ｌ　ス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　）由来のダイ
ズレクチン（８ＢＡ）、フォセオラス・リメンシス（Ｐ
ｈａｓｅｏｌｕｓ　１ｉｍｅｎｓｉｓ−）由来のり？マ
メレクチン（ＬＢＡ）、ロビナ・プンイドアカシア（Ｒ
ｏｂｉｎａ　ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ　）由来のニセ
アカシアレクチン（ＲＰＡ）、ソホラ・ジャポニカ（５
ｏｐｈｏｒａｊａｐｏｎｉｃａ　）　由来のイヌエンジ
ュマメレクチン（ＳＪＡ）、ピサム・サチバＡ　（Ｐｉ
ｓｕｍ　ｓａｔｊｖｕｍ）由来のエントウマメレクチン
（ＰＳＡ）、ビシア・７７バ（Ｖｉｃ、ｉａ　ｆａｂａ
　）由来のソラマメレクチン（ＶＦＡ）等が抗腫瘍免疫
細胞を誘導し友。中でも特にアカインゲンマメレクチン
（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）　、
ノダクジマメレクチン（ＷＦＡ）、レンズマメレクチン
（ＬＣＨ）、アメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）ｄ
、　強力に抗＠瘍免疫細胞を誘導する。また、スタフィ
ロコッカス−アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｕｒｅｕｓ　）由来のプロティンＡも強力に抗腫
瘍免疫細胞を誘導することを見い出した。また、ヒト末
梢血白血球をレクチンで刺激した培養土清中に含まれる
リンフ才力インも刺激剤として使用でき、％にゲルクロ
マトグラフィー等公知の方法によって精製し友インター
リューΦン２（Ｉｎ２）分画が強力な刺激剤として使用
できることを見い出した。

本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担体、疎水性
担体いずれも使用できるが、疎水性担体を用いる場合に
は、特に担体への血清成分の非特異的吸着が生じる几め
、親水性担体の方が好ましい結果を与える。不溶性担体
の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの
公知の形状も用いることができる。粒状もしくは球状不
溶性担体としては、粒径１ミクロン〜３０００ミクロン
の・　　ものが使用できる。粒径１ミクロン以下では活
性化白血球との分離が困難である。とくに粒径５０ミク
ロン以上であれば、容易に活性化白血球との濾過分離が
可能であり、粒径３０００ミクロン以上では、白血球と
の担体単位重量あたシの接触面積が低下する友め好まし
くない。粒径８０〜２０００ミクロンのものが本発明に
おいては特に良好である。

不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化するため
に、担体が活性化でき、担体の活性化反応、固定化反応
などを含めた全工程を通じて物理的に安定であればよい
。具体的には、無機ベースのものにあっては、活性炭、
ガラス等およびその誘導体であシ、天然高分子由来担体
には、セルロース、セファローズ、デキストラン、デン
プン、アルギン酸、キチン等の単純多糖類およびその誘
導体、　寒天、ペクチン、コンニャク、アラビアゴム等
の複合多糖類およびその誘導体、羊毛、絹蛋白等の蛋白
質等およびその誘導体があるが、これらは必要に応じ、
架橋反応等の不溶化処理をし友後、担体に用いる。

また、合成高分子にあっては、ビニル系高分子には、ス
チレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エステル、アクリル
酸エステル、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化ビニリデン
、アクリロニトリル、アクリルアミド、メチルビニルケ
トン、ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、エチレ
ン、プロピレン、ブタジェン、イソプレン等およびその
誘導体の重合体および共重合体があシ、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ−ジ−
ローキシリレン、ノルボルネン、シクロブテン、トリオ
キサン、ラクチド、シクロポリシロキサン、塩化ホスホ
ニトリル、Ｎ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物等およ
びその誘導体の重合体および共重合体、ポリホルムアル
デヒド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコ
ール、ポ１７−５　、５−ビス（クロルメチル）オキサ
シクロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラ
クタム等およびその誘導体がある。

また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
アンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリスル
ホンアミド、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール等お
よびその誘導体があげられる。

樹脂その他のものに９りては、アクリル樹脂、メタクリ
ル樹脂、フッ素樹脂、エポキシ樹脂、尿素樹脂、アミン
樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹脂、ポリウレタン、シ
リコン樹脂、アルキド樹脂等およびその誘導体が例示で
きる。

また、たとえば活性炭等に、ＰＨＥＭＡ＠をコ′−トし
た多層構造の不溶性担体も使用できる。

刺激剤を不溶性担体の表面に固定する方法としては、共
有結合、イオン結合、物理吸着等あらゆる公知の方法を
用いることができるが、刺激剤の溶出性から考えると、
共有結合で固定して用いることが望ましい。そのために
は通常固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用
いられる公知の方法を用いることができる。例えば、臭
化水素（ＣＮＢｒ　）で７ガロース、セファロース等を
活性化し、あるいはシリカガラスピーズ全ｒ−７ｉノプ
ロビルトリエトキシシランと反応させてアルキルアミノ
ガラスを得、これをグルタルアルデヒドで活性化し、刺
激剤と結合させる等の方法を用いることができる。また
必要に応じて、不溶性担体と刺激剤の間に任意の長さの
分子（スペーサー）を導入して使用することもできる。

例えばアガロースのヒドロキシル基とへキサメチレンジ
イソシアナートの片側のインシアナート基を反応結合さ
せ、残ったインシアナート基と刺激剤あるいは除去材の
７ミノ基を反応結合させるごと〈実施することができる
。

本発明において錦導活性化する抗腫瘍免疫細胞は、白血
球の中で顆粒球、単球、マクロファージを除くリンパ球
分画に属し、去りわけＴ細胞の性格を有している。

刺激剤結合不溶性担体による末梢血白血球の活性化は、
血清成分金石培地で行なうと強力な抗腫瘍免疫細胞の誘
導が可能である。すなわち、牛胎児血清、牛血溝、馬血
清等の動物血清あるいはヒト血清金２〜２０チ含有した
培地を調製する。好ましくはヒト血ｆｆを２〜２０チ含
有し几培地を調製する。この場合の培地は、動物細胞培
養に一般的に用−られる培地、例えは、ＲＰＭ１１６４
０培地、ＭＥＭ培地等が使用できる。また、血清成分例
えは血清アルブミン１に添加したＲＰＭＩ　１６４０培
地でも使用が可能である。

調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢血白血球
をＱ、５　Ｘ　１０　Ｘ　ｆ　０６＠／ｌｄの細胞濃度
で浮遊させ、これに適当量の刺激剤結合不溶性担体を添
加し、温度２５〜４５Ｃで培養を行なう。温［２５Ｃ以
下ではほとんど有効な白血球の活性化が起こらず、温度
４５Ｃ以上では白血球の生存率が低下する。培養は市販
の細胞培養用のプラスチック製容器を使用し、ＣＯ□イ
ンキュベーター中で行なえば簡便である。培養数時間で
白血球は刺激剤結合不溶性担体粒子表面に付着し活性化
される。

付着活性化された白血球と担体との分離は、刺激剤と白
血球の結合を阻害する物質を用いれば簡単に行なえる。

例えばコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンズマメレク
チン（ＬＣＨ）を刺激剤として使用する場合には、α−
メチルマンノースを分離剤として使用すれば、刺激剤結
合不溶性担体よシ活性化白血球を回収できる。また、ピ
ペッティング等の物理的方法も用いることができる。

このようにして得た活性化白血球中には強力な抗腫瘍免
疫細胞が誘導されていることが判明した。

すなわち、活性化白血球を種々のヒト癌詞胞（ＺＲ７５
−３０乳癌細胞、ＭＫＮ−１胃癌細胞、ＰＣ−９肺癌細
胞、Ｃ−１結腸癌細胞、ＮＢＴ−２勝胱癌細胞、ＮＲＣ
−１２腎癌細胞尋）と混合すると、これらのヒト癌細胞
を強力に殺した。また、活性化白血球への刺激剤の付着
混入がないことも確認され友。

（発明の効果） 本発明の活性化免疫細胞は％　＝１叡剤の付着混入がな
く　安全で、かつ強力な抗腫瘍能を有し、胃癌、肺癌、
乳癌、肝癌等の癌治療に用すようとするものである。

（実施例） 以下、本発明の実施例について記載する。

刺激剤として１２５１″′Ｃ標識し７ｉ（Ｐ　ＨＡ全用
いた。

１χ’Ｉ６！ｍｐｈ人の作製は、以下のようにして公知
の方１Ｅｉｉ　（ＭＣＣｏｎａｈｅｙ；　Ｉｎｔ、　Ａ
ｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ、　２９　。

１８５（１９６６）〕を用いて行なった。すなわち、Ｐ
ＨＡ　（ＥＹラボラトリーズ社ｊＢ）２リ　１２５　Ｉ
（１ｍＣｉ）、クロラミンＴｔ−水中で混合した後、Ｎ
ａＨ８Ｏ４およびＫＩ浴溶液添加し、反応終了後、ゲル
クロマトグラフィーを行なって、非結合の１１！Ｓｉｔ
、除き、ＰＨＡ分画は集めて濃縮する。１２５　Ｉ標識
ＰＨＡＯ比活性は２　Ｘ　１０’　ｃｐｍ　／〜であっ
た。

１２１１標＠ＰＨＡの不溶性担体への結合は、次のよう
にして行なった。すなわち、ｃＮＢｒＮＢｒ活性化セフ
ァロ−２６スＢ−デン、ファルマシア社裏２粒径２５０
〜３５０ミクロン）　２　ｙ　１ＣｓｚｓＩ標識ＰＨＡ
を通常の方法によって結合せしめ、過剰の活性基をグリ
シンでブロッキングした後、０．１Ｍ酢酸バッファー（
ｐ　Ｈ４，０）、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ　Ｈ８，
５）で放射活性が溶出されなくなるまで繰り返し洗浄し
た後、水切りして実験に供した。なお　ｔｔｓＩ標識Ｐ
ＨＡの保持量は、担体１−あｆＣ’）　５０　μ？　（
１０’　ｃｐｍ　）　’ｔ’６ツ７ｔ。

ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、採血した
ヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、フィコールパー
ク液（ファルマシア社ＩＪ）ＫＭ）Ｇし、２０００ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離した後、中間層の白血球層を分離
して、これをハンクス液で洗つ几後、自己血清を１０チ
添加し７’ｃＲＰＭ１１６４０培地にツスイ）に２　Ｘ
　Ｉ　Ｑ”／−の細胞濃度で浮遊させる。この細胞浮遊
液を１−ずつ、細胞培養用の２−ウェル（ファルコン＆
　３０４７　）に分注し、これに１！Ｉ　（標識ＰＨＡ
結合不溶性担体を１００μｔずつ添加し、ＣＯ，インキ
ュベーター中で温度３７Ｃで培養を行なう。培養１時間
程で白血球の担体表面上への付着が観察される。２４時
間培養を行なった後、培養液をピペッティングして活性
化白血球を担体表面からはがして静置すると、担体は容
器の底に沈下するので、上溝細胞液をとり、これをハン
クスで洗った後、自己血清１０チ添加ＲＰＭＩ培地に５
Ｘ１０’／−の細胞濃度で浮遊させる。

この活性化白血球が＠楊細胞障害性を有するかどうかは
、次のようなキラー活性測定法を用いて評１曲し友。培
養プレートに付着して増殖する種々のヒト癌細胞株を標
的細胞として、５　Ｘ　１０’／’＋ｄの細胞濃度で１
０％牛脂児血清添加ＲＰＭＩ　　１６４０培地圧浮遊さ
せ、これを１０μｔずつ１０μを容テラサキプレートに
分注し、　ＣＯ，インキュベーター中で温度３７Ｇで培
養する。２４時間培培養性なうと、癌細胞は培養プレー
ト底面に強く付着する。

これを培養液で洗った後、活性化白血球浮遊液１０μｔ
を添加し、３７Ｃで４時間、ｃｏ、インキュベーター中
で培養し、プレートに付着している癌細胞を障害させる
。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性を喪
失し、ハンクス液で洗うと活性化白血球とともに除去さ
れる。生残してプレート底面に付着している癌細胞をア
セトンで固定し、ギムザ液で染色し九後、顕微鏡で計数
する。

キラー活性は次式により計算する。

キラー活性； Ｘ１００　　（チ） このような方法で活性化白血球の腫瘍細胞に対するキラ
ー活性を測定したところ、ＺＲ７５−５０ヒト乳癌細胞
に対して７２＊、ＭＫＮ−１ヒト胃癌細胞に対して７５
優の障害活性を示し九。

この活性化白血球Ｉ　Ｘ　１０１の放射活性を測定し友
ところ、はとんどバックグラウンドと同じ放射活性しか
検出されず、活性化白血球に刺激剤（Ｐ　ＨＡ　）が付
着混入せず、安全な活性化免疫細胞が得られた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 刺激剤を不溶性担体に固定した刺激材により白血球を活
   性化して得られる刺激剤混入のない悪性腫瘍治療用活性
   化免疫細胞。