JPH0362699B2 - - Google Patents
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Description
(産業上の利用分野)
本発明は、血液細胞中の免疫細胞を活性化して
抗腫瘍免疫細胞を誘導する機能を有する免疫細胞
刺激材に関する。 (従来の技術) 周知の如く、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視
機構をになう抗腫瘍細胞としては、キラーT細
胞、NK細胞、活性化マクロフアージ、K細胞等
が重要な役割をはたしていることが報告されてい
る。したがつて、悪性腫瘍に対する免疫学的療法
としては、癌患者免疫細胞(白血球)を活性化し
て、これらの抗腫瘍細胞を効率的に誘導すること
が考えられる。しかしながら、癌患者は一般的
に、癌の進行とともに免疫能が低下することが報
告されており、癌患者生体中においては、免疫応
答を抑制する免疫抑制因子の存在あるいはサプレ
ツサーT細胞、サプレツサーマクロフアージの誘
導活性化が報告されている。 このような免疫能の抑制状態下にある癌患者生
体中において、効率的な抗腫瘍細胞の誘導は困難
であると言わなければならない。したがつて、免
疫抑制状態から解放された体外に患者白血球を取
り出し、体外で効率的な抗腫瘍細胞誘導活性化を
行なうことは、効果の高い新しい癌免疫療法にな
ると考えられる。 キラーT細胞は、抗腫瘍細胞の中でも特に抗癌
免疫において主役をはたしていると考えられてい
るが、これを体外で誘導活性化しようとする研究
が精力的になされてきた。すなわち、体外に取り
出した癌患者末梢血白血球に、摘出した患者腫瘍
細胞を感作させ、患者白血球を活性化して、特異
的に患者腫瘍細胞だけを障害し、患者正常細胞は
障害しないキラーT細胞を誘導して、これを癌患
者体内にもどすことにより、癌を治療しようとす
る試みである。 しかしながら、この方法で誘導したキラーT細
胞は、治療効果を期待できるほど強力ではないた
め、リンフオカインの1種であるT細胞増殖因子
を用いて培養し、大量に増殖させた後、患者に投
与する方法が考えられている。 (発明が解決しようとする問題点) 前記の方法は、T細胞増殖因子が遺伝子操作の
技術により工業的大量生産が可能となり、大量の
T細胞増殖因子が使用できることが現実化してき
たために実施可能ではあるが、キラーT細胞を体
外で長期間培養することによる細胞の変質等の問
題がある。また、そのほかにも実用化するには困
難な種々の問題点があり、例えば、キラーT細胞
の誘導のために患者腫瘍細胞と手術が必要なこ
と、試みた癌患者の一部にのみキラーT細胞の誘
導が可能で、全例で誘導されるわけではないこ
と、操作が非常に煩雑であること等、解決されな
ければならない問題点が多い。 (問題点を解決するための手段) 本発明は、上記の如き従来技術に基づく抗腫瘍
免疫細胞誘導の問題点に鑑み、従来の方法よりも
実用性、操作性、安全性の点で飛躍的に向上させ
た抗腫瘍免疫細胞誘導用刺激材を提供するもので
ある。 本発明者らは、上記目的に沿つて鋭意研究した
結果、核酸塩基およびその誘導体を共有結合で不
溶性担体に結合させた刺激材を、ヒト末梢血白血
球またはマウス脾臓細胞白血球に接触させたとこ
ろ、驚くべきことに、極めて強力な腫瘍障害性細
胞が誘導されることを見出した。すなわち、細胞
浮遊液中に遊離した状態では細胞活性化能を持た
ない核酸塩基およびその化学修飾誘導体が不溶性
担体に結合した状態で、ヒトおよびマウスの白血
球を活性化する能力を有し、この活性化白血球を
腫瘍細胞と混合したところ、5時間の培養でほと
んどの腫瘍細胞が障害をうけて破壊され、強力な
腫瘍障害性細胞が誘導されていることを見出し、
本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、核酸塩基およびその化学
修飾誘導体の一種以上を表面に有することを特徴
とする抗腫瘍免疫細胞誘導用白血球刺激材に係
る。 本発明における刺激材の表面とは、細胞すなわ
ち白血球と接触可能な刺激材面を指す。 本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤
血球および血小板を除いた、いわゆる白血球を指
すが、この白血球より顆粒球あるいはB細胞を除
去した細胞分画も、本発明における白血球の概念
に含まれる。本発明において活性化を行なう白血
球は、連続遠心分離法にて末梢血より採取した白
血球分画を用いてもよく、また、フイコールパー
ク重層遠心分離法にて分離した単核細胞分画でも
よく、あるいは末梢血単核細胞より公知のノイラ
ミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形成で分離
濃縮したT細胞分画を使用しても、強力な腫瘍障
害性細胞の誘導が可能である。 本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞
は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロフアージ
を除くリンパ球分画に属し、とりわけT細胞の性
質を有している。 本発明において用いることのできる不溶性担体
に結合する核酸塩基およびその化学修飾誘導体と
しては、天然および合成物の如何なるものでも使
用できる。 すなわち、アデニン、1−メチルアデニン、2
−メチルアデニン、N−(プリン−6−イルカル
バモイル)−L−トレオニン、N6−(△2−イソペ
ンテニル)アデニン、2−メチルチオ−N6−(△
2−イソペンテニル)アデニン、2−ヒドロキシ
アデニン、N6−メチルアデニン、N6,N6−ジメ
チルアデニン、N6−(cis−4−ヒドロキシイソ
ペンテニル)アデニン、ゼアチン、2−アミノア
デニン、グアニン、1−メチルグアニン、N2−
メチルグアニン、N2,N2−ジメチルグアニン、
7−メチルグアニン、シトシン、3−メチルシト
シン、N4−アセチルシトシン、N4−メチルシト
シン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチ
ルシトシン、2−チオシトシン、ウラシル、3−
メチルシトシン、チミン、4−チオウラシル、5
−ヒドロキシウラシル、5−ヒドロキシメチルウ
ラシル、5−メトキシウラシル、5−カルボキシ
メチルウラシル、2−チオチミン、5−カルボキ
シメチル−2−チオウラシル、5−(メトキシカ
ルボニルメチル)−2−チオウラシル、5−(N−
メチルアミノメチル)−2−チオウラシル、5,
6−ジヒドロウラシル、5,6−ジヒドロチミ
ン、5−(プトレシノメチル)ウラシル、S(+)
5−(4,5−ジヒドロキシペンチル)ウラシル、
オロト酸、ワイ、ワイブチン、ペルオキシワイブ
チン、ヒポキサンチン、1−メチルヒポキサンチ
ン、キサンチン、尿酸等が挙げられる。不溶性担
体に結合する核酸塩基およびその誘導体の分子量
としては、好ましくは1万以下、さらに好ましく
は1000以下である。 本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担
体、疎水性担体いずれも使用できる。不溶性担体
の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等い
ずれの公知の形状も用いることができる。粒状も
しくは球状不溶性担体としては、粒径1ミクロン
〜3000ミクロンのものが使用できる。粒径1ミク
ロン以下では活性化白血球との分離が困難であ
る。とくに粒径50ミクロン以上であれば、容易に
活性化白血球との過分離が可能であり、粒径
3000ミクロン以上では、白血球との担体単位重量
あたりの接触面積が低下するため好ましくない。
特に好ましくは、粒径80〜2000ミクロンのもので
ある。また粒状もしくは球状不溶性担体の比重が
1.07以上であれば、容易に活性化白血球との遠心
もしくは静置による分離が可能である。また、平
膜状あるいは中空糸状多孔性担体を使用する場
合、その孔径が、細胞は通過できないが培地成分
は自由に通過できる0.05〜10ミクロンのものを使
用すれば、膜の一方の面に結合した白血球に膜の
他方の面より栄養を補給でき、高濃度の白血球を
刺激活性化することが可能である。特に0.1〜5
ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸状の多孔
性担体が良好に使用できる。 不溶性担体の材質としては、無機ベースのもの
にあつては活性炭、ガラス等およびその誘導体が
あり、天然高分子由来担体には、セルロース、セ
フアロース、デキストラン、デンプン等の単純多
糖類およびその誘導体がある。 また、合成高分子にあつては、ビニル系高分子
には、スチレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エス
テル、アクリル酸エステル、ハロゲン化ビニル、
ハロゲン化ビニリデン、アクリロニトリル、アク
リルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピロリ
ドン、2−ビニルピリジン、エチレン、プロピレ
ン、ブタジエン、イソプレン等およびその誘導体
の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ
−ジ−o−キシリレン、ノルボルネン、シクロブ
テン、トリオキサン、ラクチド、シクロポリシロ
キサン、塩化ホスホニトリル、N−カルボキシ−
α−アミノ酸無水物等およびその誘導体の重合体
および共重合体、ポリホルムアルデヒド、ポリエ
チレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポ
リ−3,3−ビス(クロルメチル)オキサシクロ
ブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラ
クタム等およびその誘導体がある。 また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリアンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ
尿素、ポリスルホンアミド、ポリイミド、ポリベ
ンゾイミダゾール等およびその誘導体があげられ
る。 樹脂その他のものにあつては、アクリル樹脂、
メタクリル樹脂、フツ素樹脂、エポキシ樹脂、尿
素樹脂、アミノ樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹
脂、ポリウレタン、シリコン樹脂、アルキド樹脂
等およびその誘導体が例示できる。 以上にあげた高分子担体は、必要に応じた適当
なコモノマー、架橋剤を用い、不溶化担体を得る
ことができ、架橋剤にあつては、硫黄、有機過酸
化物、フエノール樹脂、ジイソシアナート、エポ
キシ化合物、ジエン、グルタルアルデヒド等、被
架橋物の官能基に合わせ、種々のものを選択でき
る(大成社、“架橋剤ハンドブツク”,P3〜77,
1981)。 また、上記不溶性担体にコーテイングを施した
多層構造を有した担体も使用できる。たとえば、
活性炭やガラスビーズにポリヒドロキシルエチル
メタクリレートをコーテイングした担体等が使用
できる。 核酸塩基を不溶性担体の表面に固定する方法と
しては、共有結合、イオン結合、物理吸着等あら
ゆる公知の方法を用いることができるが、溶出性
から考えると、共有結合で固定して用いることが
望ましい。そのためには通常固定化酵素、アフイ
ニテイクロマトグラフイで用いられる方法を用い
ることができる。例えば、臭化シアン(CNBr)
でアガロース、セフアロース等を活性化し、ある
いはシリカガラスビーズをγ−アミノプロピルト
リエトキシシランと反応させてアルキルアミノガ
ラスを得、これをグルタルアルデヒドで活性化
し、結合させる等の方法を用いることができる。
また必要に応じて、不溶性担体との間に任意の長
さの分子(スペーサー)を導入して使用すること
もできる。例えば、アガロースのヒドロキシル基
とヘキサメチレンジイソシアナートの片側のイソ
シアナート基を反応結合させ、残つたイソシアナ
ート基と核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド
等のアミノ基を反応結合させるごとく実施するこ
とができる。 以上の要素よりなる本発明の刺激材の製造法
は、その構成要素の結合順序を規定したものでは
ない。具体的には、核酸塩基の導入法において、
これらをモノマーに結合して重合を行なう方法や
これらを活性化後、不溶性担体に結合させること
も可能である。すなわち、本発明は、基本的には
表面に核酸塩基およびその化学修飾誘導体の一種
以上を有すればよいのであり、製造方法に左右さ
れるものではない。 刺激材による白血球の活性化は、血清成分含有
培地で行なうと強力な腫瘍障害性細胞の誘導が可
能である。すなわち、牛胎児血清、牛血清、馬血
清等の動物血清あるいはヒト血清を2〜20%含有
した培地を調製する。この場合の培地は、動物細
胞培養に一般的に用いられる培地、例えば、
RPMI1640倍地、MEM倍地等が使用できる。ま
た、血清成分例えば血清アルブミンを添加した
RPMI1640倍地でも使用が可能である。また、誘
導期間中にインタリユーキン2を添加しても、よ
り強力な腫瘍障害性細胞を誘導できる。 調製した培地中に、種々の方法で採取した白血
球を0.5〜3×106個/mlの細胞濃度で浮遊させ、
これに適当量の刺激材を添加し、温度25〜45℃で
培養を行なう。温度25℃以下ではほとんど有効な
白血球の活性化が起こらず、温度45℃以上では白
血球の生存率が低下する。培養は市販の細胞培養
用のプラスチツク製容器を使用し、CO2インキユ
ベーター中で行なえば簡便である。培養数時間で
白血球は刺激材に付着し活性化される。 このようにして活性化した白血球は、強力な腫
瘍障害細胞を含有することを見出した。すなわ
ち、刺激材で活性化したヒト末梢血白血球をヒト
腫瘍細胞に作用させたところ、MKN−1胃癌細
胞、PC−10肺癌細胞を強く障害した。また、刺
激材で活性化したBALB/cマウス脾臓の白血
球は、Colon26(BALB/c由来腫瘍細胞株)、B
−16(C57/BL6由来メラノーマ)を強く障害し
た。また、活性化白血球の表面抗原を解析したと
ころ、刺激材との接触前と比較して、ヒト白血球
ではLeu2a抗原、マウス白血球ではLyt2抗原を有
する細胞の抗原密度および増加が観察された。 腫瘍障害性細胞誘導能を持つ刺激材を実際の臨
床に用いる場合は、たとえば第1図に示した腫瘍
障害性細胞誘導装置を用いる。この装置は容器1
内に刺激材2を収容し、両端に白血球液流入口3
および流出口4を有し、それぞれフイルター5で
区分されている。このフイルター5は刺激材2が
容器1外に流出するのを防ぐものである。この容
器1は洗浄装置6に連結されており、洗浄装置6
は空気排出口9、洗浄液出口10を備えており、
細胞が洗浄液排出口10へ出るのを防止するため
のフイルター8が設けられている。 この装置は、回分的に患者末梢血白血球より腫
瘍障害性細胞の誘導を行ない、操作性よく腫瘍障
害性細胞の分離、洗浄、回収を行なう装置であ
る。すなわち、患者末梢血より連続遠心分離等の
公知の方法を用いて採取した白血球を容器1の白
血球液流入口3より流入させ、白血球を刺激材2
に吸着させた後、空気(5%CO2)を飽和させた
培養液を循環させ、37℃に保温し腫瘍障害性細胞
の誘導活性化を行なう。その後、洗浄装置6を連
結し、空気排出口よりアスピレーターで吸引を行
ないながら洗浄液を流入口3より流す。洗浄液は
洗浄液排出口10を通つてその下に連結された容
器にためられる。担体から洗浄により分離した腫
瘍障害性細胞は、フイルター8の上部7に集めら
れる。充分に洗浄を行なつた後、容器1をとりは
ずし、腫瘍障害性細胞を回収し、治療に用いる。 (発明の効果) 本発明の刺激材は、以上述べてきたように、患
者末梢血白血球を効率よく活性化し、安全にかつ
操作性よく、強力な腫瘍障害性細胞を誘導するも
のであり、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌等の癌治療は
もとより、胆癌患者のリンパ球機能検査や、マウ
ス、ラツト、ウサギ等の動物実験において、抗腫
瘍免疫の研究等に用いようとするものである。 (実施例) 実施例 1 刺激材の調製は、次のようにして行なつた。す
なわち、ポリビニルアルコール系ゲル(ポリビニ
ルアルコールとトリアリルイソシアナートの共重
合体:粒径140−210μm)をエピクロロヒドリン
法(アフイニテイクロマトグラフイー、千畑一郎
著、講談社サイエンテイフイク、1976年、P71)
によつて、エポキシ活性化ゲルとし、これに各種
核酸塩基の5%水酸化カリウム溶液を添加し、50
℃にて24時間振とうして結合せしめ、PH4、
0.1M酢酸バツフアー、PH8.5炭酸ナトリウムバツ
フアーでくり返し洗浄後、生理食塩水で洗浄、オ
ートクレーブ滅菌して実験に供した。不溶性担体
の核酸塩基保持量は、初めに添加した核酸塩基量
より、結合反応後の上清中の核酸塩基量をさし引
いて結合量を求め計算したところ、不溶性担体1
mlあたり10μmol〜10μmolであつた。核酸塩基量
は紫外吸収で測定した。 ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、
採血したヒト末梢血をハンクス液で2倍希釈し、
フイコールパーク液(フアルマシア社製)に重層
し、2000rpmで20分間遠心分離した後、中間層の
白血球層を分離して、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清を10%添加したRPMI1640培地(ニ
ツスイ)に2×108/mlの細胞濃度で浮遊させた。
この細胞浮遊液を1mlずつ、細胞培養用の2mlウ
エル(フアルコンNo.3047)に分注し、これに刺激
材を100μずつ添加し、CO2インキユベーター中
で温度37℃で培養を行なつた。4日間培養を行な
つた後、培養液をピペツテイングして活性化白血
球を刺激材表面からはがして静置すると、刺激材
は容器の底に沈下するので、上清細胞液をとり、
これをハンクスで洗つた後、自己血清10%添加
RPMI培地に5×106/mlの細胞濃度で浮遊させ
た。 この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、次のようなキラー活性測定法を用いて
評価した。培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を標的細胞として、5×104/ml
の細胞濃度で10%牛胎児血清添加RPMI1640培地
に浮遊させ、これを10μずつ10μ容テラサキ
プレートに分注し、CO2インキユベーター中で温
度37℃で培養する。24時間培養を行なうと、癌細
胞は培養プレート底面に強く付着する。これを培
養液で洗つた後、活性化白血球浮遊液10μを添
加し、37℃で4時間、CO2インキユベーター中で
培養し、プレートに付着している癌細胞を障害さ
せる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への
付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血
球とともに除去される。生残してプレート底面に
付着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ
液で染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性
は次式により計算する。 キラー活性=(1−活性化白血球を添加した場合の生
残腫瘍細胞数/活性化白血球を添加しない場合の生残腫
瘍細胞数)×100(%) このようにして評価した各種刺激材の腫瘍障害
性細胞誘導能を表1に示す。
抗腫瘍免疫細胞を誘導する機能を有する免疫細胞
刺激材に関する。 (従来の技術) 周知の如く、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視
機構をになう抗腫瘍細胞としては、キラーT細
胞、NK細胞、活性化マクロフアージ、K細胞等
が重要な役割をはたしていることが報告されてい
る。したがつて、悪性腫瘍に対する免疫学的療法
としては、癌患者免疫細胞(白血球)を活性化し
て、これらの抗腫瘍細胞を効率的に誘導すること
が考えられる。しかしながら、癌患者は一般的
に、癌の進行とともに免疫能が低下することが報
告されており、癌患者生体中においては、免疫応
答を抑制する免疫抑制因子の存在あるいはサプレ
ツサーT細胞、サプレツサーマクロフアージの誘
導活性化が報告されている。 このような免疫能の抑制状態下にある癌患者生
体中において、効率的な抗腫瘍細胞の誘導は困難
であると言わなければならない。したがつて、免
疫抑制状態から解放された体外に患者白血球を取
り出し、体外で効率的な抗腫瘍細胞誘導活性化を
行なうことは、効果の高い新しい癌免疫療法にな
ると考えられる。 キラーT細胞は、抗腫瘍細胞の中でも特に抗癌
免疫において主役をはたしていると考えられてい
るが、これを体外で誘導活性化しようとする研究
が精力的になされてきた。すなわち、体外に取り
出した癌患者末梢血白血球に、摘出した患者腫瘍
細胞を感作させ、患者白血球を活性化して、特異
的に患者腫瘍細胞だけを障害し、患者正常細胞は
障害しないキラーT細胞を誘導して、これを癌患
者体内にもどすことにより、癌を治療しようとす
る試みである。 しかしながら、この方法で誘導したキラーT細
胞は、治療効果を期待できるほど強力ではないた
め、リンフオカインの1種であるT細胞増殖因子
を用いて培養し、大量に増殖させた後、患者に投
与する方法が考えられている。 (発明が解決しようとする問題点) 前記の方法は、T細胞増殖因子が遺伝子操作の
技術により工業的大量生産が可能となり、大量の
T細胞増殖因子が使用できることが現実化してき
たために実施可能ではあるが、キラーT細胞を体
外で長期間培養することによる細胞の変質等の問
題がある。また、そのほかにも実用化するには困
難な種々の問題点があり、例えば、キラーT細胞
の誘導のために患者腫瘍細胞と手術が必要なこ
と、試みた癌患者の一部にのみキラーT細胞の誘
導が可能で、全例で誘導されるわけではないこ
と、操作が非常に煩雑であること等、解決されな
ければならない問題点が多い。 (問題点を解決するための手段) 本発明は、上記の如き従来技術に基づく抗腫瘍
免疫細胞誘導の問題点に鑑み、従来の方法よりも
実用性、操作性、安全性の点で飛躍的に向上させ
た抗腫瘍免疫細胞誘導用刺激材を提供するもので
ある。 本発明者らは、上記目的に沿つて鋭意研究した
結果、核酸塩基およびその誘導体を共有結合で不
溶性担体に結合させた刺激材を、ヒト末梢血白血
球またはマウス脾臓細胞白血球に接触させたとこ
ろ、驚くべきことに、極めて強力な腫瘍障害性細
胞が誘導されることを見出した。すなわち、細胞
浮遊液中に遊離した状態では細胞活性化能を持た
ない核酸塩基およびその化学修飾誘導体が不溶性
担体に結合した状態で、ヒトおよびマウスの白血
球を活性化する能力を有し、この活性化白血球を
腫瘍細胞と混合したところ、5時間の培養でほと
んどの腫瘍細胞が障害をうけて破壊され、強力な
腫瘍障害性細胞が誘導されていることを見出し、
本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、核酸塩基およびその化学
修飾誘導体の一種以上を表面に有することを特徴
とする抗腫瘍免疫細胞誘導用白血球刺激材に係
る。 本発明における刺激材の表面とは、細胞すなわ
ち白血球と接触可能な刺激材面を指す。 本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤
血球および血小板を除いた、いわゆる白血球を指
すが、この白血球より顆粒球あるいはB細胞を除
去した細胞分画も、本発明における白血球の概念
に含まれる。本発明において活性化を行なう白血
球は、連続遠心分離法にて末梢血より採取した白
血球分画を用いてもよく、また、フイコールパー
ク重層遠心分離法にて分離した単核細胞分画でも
よく、あるいは末梢血単核細胞より公知のノイラ
ミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト形成で分離
濃縮したT細胞分画を使用しても、強力な腫瘍障
害性細胞の誘導が可能である。 本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞
は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロフアージ
を除くリンパ球分画に属し、とりわけT細胞の性
質を有している。 本発明において用いることのできる不溶性担体
に結合する核酸塩基およびその化学修飾誘導体と
しては、天然および合成物の如何なるものでも使
用できる。 すなわち、アデニン、1−メチルアデニン、2
−メチルアデニン、N−(プリン−6−イルカル
バモイル)−L−トレオニン、N6−(△2−イソペ
ンテニル)アデニン、2−メチルチオ−N6−(△
2−イソペンテニル)アデニン、2−ヒドロキシ
アデニン、N6−メチルアデニン、N6,N6−ジメ
チルアデニン、N6−(cis−4−ヒドロキシイソ
ペンテニル)アデニン、ゼアチン、2−アミノア
デニン、グアニン、1−メチルグアニン、N2−
メチルグアニン、N2,N2−ジメチルグアニン、
7−メチルグアニン、シトシン、3−メチルシト
シン、N4−アセチルシトシン、N4−メチルシト
シン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチ
ルシトシン、2−チオシトシン、ウラシル、3−
メチルシトシン、チミン、4−チオウラシル、5
−ヒドロキシウラシル、5−ヒドロキシメチルウ
ラシル、5−メトキシウラシル、5−カルボキシ
メチルウラシル、2−チオチミン、5−カルボキ
シメチル−2−チオウラシル、5−(メトキシカ
ルボニルメチル)−2−チオウラシル、5−(N−
メチルアミノメチル)−2−チオウラシル、5,
6−ジヒドロウラシル、5,6−ジヒドロチミ
ン、5−(プトレシノメチル)ウラシル、S(+)
5−(4,5−ジヒドロキシペンチル)ウラシル、
オロト酸、ワイ、ワイブチン、ペルオキシワイブ
チン、ヒポキサンチン、1−メチルヒポキサンチ
ン、キサンチン、尿酸等が挙げられる。不溶性担
体に結合する核酸塩基およびその誘導体の分子量
としては、好ましくは1万以下、さらに好ましく
は1000以下である。 本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担
体、疎水性担体いずれも使用できる。不溶性担体
の形状は、粒子状、繊維状、中空糸状、膜状等い
ずれの公知の形状も用いることができる。粒状も
しくは球状不溶性担体としては、粒径1ミクロン
〜3000ミクロンのものが使用できる。粒径1ミク
ロン以下では活性化白血球との分離が困難であ
る。とくに粒径50ミクロン以上であれば、容易に
活性化白血球との過分離が可能であり、粒径
3000ミクロン以上では、白血球との担体単位重量
あたりの接触面積が低下するため好ましくない。
特に好ましくは、粒径80〜2000ミクロンのもので
ある。また粒状もしくは球状不溶性担体の比重が
1.07以上であれば、容易に活性化白血球との遠心
もしくは静置による分離が可能である。また、平
膜状あるいは中空糸状多孔性担体を使用する場
合、その孔径が、細胞は通過できないが培地成分
は自由に通過できる0.05〜10ミクロンのものを使
用すれば、膜の一方の面に結合した白血球に膜の
他方の面より栄養を補給でき、高濃度の白血球を
刺激活性化することが可能である。特に0.1〜5
ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸状の多孔
性担体が良好に使用できる。 不溶性担体の材質としては、無機ベースのもの
にあつては活性炭、ガラス等およびその誘導体が
あり、天然高分子由来担体には、セルロース、セ
フアロース、デキストラン、デンプン等の単純多
糖類およびその誘導体がある。 また、合成高分子にあつては、ビニル系高分子
には、スチレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エス
テル、アクリル酸エステル、ハロゲン化ビニル、
ハロゲン化ビニリデン、アクリロニトリル、アク
リルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピロリ
ドン、2−ビニルピリジン、エチレン、プロピレ
ン、ブタジエン、イソプレン等およびその誘導体
の重合体および共重合体があり、環状化合物の開
環重合体には、ジメチルシクロプロパン、スピロ
−ジ−o−キシリレン、ノルボルネン、シクロブ
テン、トリオキサン、ラクチド、シクロポリシロ
キサン、塩化ホスホニトリル、N−カルボキシ−
α−アミノ酸無水物等およびその誘導体の重合体
および共重合体、ポリホルムアルデヒド、ポリエ
チレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポ
リ−3,3−ビス(クロルメチル)オキサシクロ
ブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカプロラ
クタム等およびその誘導体がある。 また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリアンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ
尿素、ポリスルホンアミド、ポリイミド、ポリベ
ンゾイミダゾール等およびその誘導体があげられ
る。 樹脂その他のものにあつては、アクリル樹脂、
メタクリル樹脂、フツ素樹脂、エポキシ樹脂、尿
素樹脂、アミノ樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹
脂、ポリウレタン、シリコン樹脂、アルキド樹脂
等およびその誘導体が例示できる。 以上にあげた高分子担体は、必要に応じた適当
なコモノマー、架橋剤を用い、不溶化担体を得る
ことができ、架橋剤にあつては、硫黄、有機過酸
化物、フエノール樹脂、ジイソシアナート、エポ
キシ化合物、ジエン、グルタルアルデヒド等、被
架橋物の官能基に合わせ、種々のものを選択でき
る(大成社、“架橋剤ハンドブツク”,P3〜77,
1981)。 また、上記不溶性担体にコーテイングを施した
多層構造を有した担体も使用できる。たとえば、
活性炭やガラスビーズにポリヒドロキシルエチル
メタクリレートをコーテイングした担体等が使用
できる。 核酸塩基を不溶性担体の表面に固定する方法と
しては、共有結合、イオン結合、物理吸着等あら
ゆる公知の方法を用いることができるが、溶出性
から考えると、共有結合で固定して用いることが
望ましい。そのためには通常固定化酵素、アフイ
ニテイクロマトグラフイで用いられる方法を用い
ることができる。例えば、臭化シアン(CNBr)
でアガロース、セフアロース等を活性化し、ある
いはシリカガラスビーズをγ−アミノプロピルト
リエトキシシランと反応させてアルキルアミノガ
ラスを得、これをグルタルアルデヒドで活性化
し、結合させる等の方法を用いることができる。
また必要に応じて、不溶性担体との間に任意の長
さの分子(スペーサー)を導入して使用すること
もできる。例えば、アガロースのヒドロキシル基
とヘキサメチレンジイソシアナートの片側のイソ
シアナート基を反応結合させ、残つたイソシアナ
ート基と核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド
等のアミノ基を反応結合させるごとく実施するこ
とができる。 以上の要素よりなる本発明の刺激材の製造法
は、その構成要素の結合順序を規定したものでは
ない。具体的には、核酸塩基の導入法において、
これらをモノマーに結合して重合を行なう方法や
これらを活性化後、不溶性担体に結合させること
も可能である。すなわち、本発明は、基本的には
表面に核酸塩基およびその化学修飾誘導体の一種
以上を有すればよいのであり、製造方法に左右さ
れるものではない。 刺激材による白血球の活性化は、血清成分含有
培地で行なうと強力な腫瘍障害性細胞の誘導が可
能である。すなわち、牛胎児血清、牛血清、馬血
清等の動物血清あるいはヒト血清を2〜20%含有
した培地を調製する。この場合の培地は、動物細
胞培養に一般的に用いられる培地、例えば、
RPMI1640倍地、MEM倍地等が使用できる。ま
た、血清成分例えば血清アルブミンを添加した
RPMI1640倍地でも使用が可能である。また、誘
導期間中にインタリユーキン2を添加しても、よ
り強力な腫瘍障害性細胞を誘導できる。 調製した培地中に、種々の方法で採取した白血
球を0.5〜3×106個/mlの細胞濃度で浮遊させ、
これに適当量の刺激材を添加し、温度25〜45℃で
培養を行なう。温度25℃以下ではほとんど有効な
白血球の活性化が起こらず、温度45℃以上では白
血球の生存率が低下する。培養は市販の細胞培養
用のプラスチツク製容器を使用し、CO2インキユ
ベーター中で行なえば簡便である。培養数時間で
白血球は刺激材に付着し活性化される。 このようにして活性化した白血球は、強力な腫
瘍障害細胞を含有することを見出した。すなわ
ち、刺激材で活性化したヒト末梢血白血球をヒト
腫瘍細胞に作用させたところ、MKN−1胃癌細
胞、PC−10肺癌細胞を強く障害した。また、刺
激材で活性化したBALB/cマウス脾臓の白血
球は、Colon26(BALB/c由来腫瘍細胞株)、B
−16(C57/BL6由来メラノーマ)を強く障害し
た。また、活性化白血球の表面抗原を解析したと
ころ、刺激材との接触前と比較して、ヒト白血球
ではLeu2a抗原、マウス白血球ではLyt2抗原を有
する細胞の抗原密度および増加が観察された。 腫瘍障害性細胞誘導能を持つ刺激材を実際の臨
床に用いる場合は、たとえば第1図に示した腫瘍
障害性細胞誘導装置を用いる。この装置は容器1
内に刺激材2を収容し、両端に白血球液流入口3
および流出口4を有し、それぞれフイルター5で
区分されている。このフイルター5は刺激材2が
容器1外に流出するのを防ぐものである。この容
器1は洗浄装置6に連結されており、洗浄装置6
は空気排出口9、洗浄液出口10を備えており、
細胞が洗浄液排出口10へ出るのを防止するため
のフイルター8が設けられている。 この装置は、回分的に患者末梢血白血球より腫
瘍障害性細胞の誘導を行ない、操作性よく腫瘍障
害性細胞の分離、洗浄、回収を行なう装置であ
る。すなわち、患者末梢血より連続遠心分離等の
公知の方法を用いて採取した白血球を容器1の白
血球液流入口3より流入させ、白血球を刺激材2
に吸着させた後、空気(5%CO2)を飽和させた
培養液を循環させ、37℃に保温し腫瘍障害性細胞
の誘導活性化を行なう。その後、洗浄装置6を連
結し、空気排出口よりアスピレーターで吸引を行
ないながら洗浄液を流入口3より流す。洗浄液は
洗浄液排出口10を通つてその下に連結された容
器にためられる。担体から洗浄により分離した腫
瘍障害性細胞は、フイルター8の上部7に集めら
れる。充分に洗浄を行なつた後、容器1をとりは
ずし、腫瘍障害性細胞を回収し、治療に用いる。 (発明の効果) 本発明の刺激材は、以上述べてきたように、患
者末梢血白血球を効率よく活性化し、安全にかつ
操作性よく、強力な腫瘍障害性細胞を誘導するも
のであり、胃癌、肺癌、乳癌、肝癌等の癌治療は
もとより、胆癌患者のリンパ球機能検査や、マウ
ス、ラツト、ウサギ等の動物実験において、抗腫
瘍免疫の研究等に用いようとするものである。 (実施例) 実施例 1 刺激材の調製は、次のようにして行なつた。す
なわち、ポリビニルアルコール系ゲル(ポリビニ
ルアルコールとトリアリルイソシアナートの共重
合体:粒径140−210μm)をエピクロロヒドリン
法(アフイニテイクロマトグラフイー、千畑一郎
著、講談社サイエンテイフイク、1976年、P71)
によつて、エポキシ活性化ゲルとし、これに各種
核酸塩基の5%水酸化カリウム溶液を添加し、50
℃にて24時間振とうして結合せしめ、PH4、
0.1M酢酸バツフアー、PH8.5炭酸ナトリウムバツ
フアーでくり返し洗浄後、生理食塩水で洗浄、オ
ートクレーブ滅菌して実験に供した。不溶性担体
の核酸塩基保持量は、初めに添加した核酸塩基量
より、結合反応後の上清中の核酸塩基量をさし引
いて結合量を求め計算したところ、不溶性担体1
mlあたり10μmol〜10μmolであつた。核酸塩基量
は紫外吸収で測定した。 ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、
採血したヒト末梢血をハンクス液で2倍希釈し、
フイコールパーク液(フアルマシア社製)に重層
し、2000rpmで20分間遠心分離した後、中間層の
白血球層を分離して、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清を10%添加したRPMI1640培地(ニ
ツスイ)に2×108/mlの細胞濃度で浮遊させた。
この細胞浮遊液を1mlずつ、細胞培養用の2mlウ
エル(フアルコンNo.3047)に分注し、これに刺激
材を100μずつ添加し、CO2インキユベーター中
で温度37℃で培養を行なつた。4日間培養を行な
つた後、培養液をピペツテイングして活性化白血
球を刺激材表面からはがして静置すると、刺激材
は容器の底に沈下するので、上清細胞液をとり、
これをハンクスで洗つた後、自己血清10%添加
RPMI培地に5×106/mlの細胞濃度で浮遊させ
た。 この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、次のようなキラー活性測定法を用いて
評価した。培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を標的細胞として、5×104/ml
の細胞濃度で10%牛胎児血清添加RPMI1640培地
に浮遊させ、これを10μずつ10μ容テラサキ
プレートに分注し、CO2インキユベーター中で温
度37℃で培養する。24時間培養を行なうと、癌細
胞は培養プレート底面に強く付着する。これを培
養液で洗つた後、活性化白血球浮遊液10μを添
加し、37℃で4時間、CO2インキユベーター中で
培養し、プレートに付着している癌細胞を障害さ
せる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への
付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血
球とともに除去される。生残してプレート底面に
付着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ
液で染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性
は次式により計算する。 キラー活性=(1−活性化白血球を添加した場合の生
残腫瘍細胞数/活性化白血球を添加しない場合の生残腫
瘍細胞数)×100(%) このようにして評価した各種刺激材の腫瘍障害
性細胞誘導能を表1に示す。
【表】
白血球の表面抗原の解析は、次のようにして行
なつた。すなわち、測定に供する白血球1×106
個を0.1%牛血清アルブミンと0.1%アジ化ナトリ
ウム添加RPMI1640培地に浮遊させ、温度4℃に
てFITC標識抗ヒトLeu2aモノクローナル抗体
(ペクトン&デキンソン社)10μを添加して、
1時間反応させた後、2mlの上記培地で洗浄し、
1mlの培地に浮遊させた。細胞表面上の抗ヒト
Leu2aモノクローナル抗体の検出は、EPICSTM−
V(コールター社)を用いて、公知の方法で行な
つた。 刺激材による白血球活性化前後の表面抗原の解
析結果を図示した。すなわち、グアニンを結合し
たポリビニルアルコール系ゲル(刺激材)による
ヒト末梢血白血球のLeu2a抗原の変化を第2図
(刺激材との接触前)と第3図(刺激材と4日間
接触後)に示す。 比較例 1 10%自己血清添加RPMI1640培地1mlにヒト末
梢血白血球2×106個を浮遊させ、ポリビニルア
ルコール系ゲル200μを添加して、4日間培養
したが、腫瘍障害性細胞は誘導されなかつた。 実施例 2 刺激材の調製は、次のようにして行なつた。す
なわち、粒径120μmのガラスビーズを3−グリ
シドキシプロピルトリメトキシシランと反応させ
て、ガラスビーズに環状エポキシ基を導入し、実
施例1と同様に各種核酸塩基を結合せしめて実験
に供した。 マウス白血球は次のようにした。すなわち、
BALB/cマウス(4〜6週令)から摘出した
脾臓をステンレス・メツシユでほぐした後、ハン
クス液に浮遊して静置、脾臓細胞を臓器片と分離
後、800rpmで10分間遠心分離して得た細胞ペレ
ツトを赤血球除去のため、0.85%塩化アンモニウ
ム水溶液に懸濁させ、温度37℃で2分間インキユ
ベートした後、直ちに10倍量のハンクス液と混
合、800rpmで10分間遠心分離して、牛胎児血清
を10%添加したRPMI−1640培地(ニツスイ)に
5×106/mlの細胞濃度で浮遊させた。この細胞
浮遊液を2mlずつ細胞培養用の2mlウエル(フア
ルコンNo.3047)に分注し、これに刺激材を1gず
つ添加し、CO2インキユベーター中で温度37℃で
培養した。4日間の培養を行なつた後、培養液を
ピペツテイングして活性化白血球を刺激材表面か
らはがして静置すると、刺激材は容器の底に沈下
するので、上清細胞液をとり、これをハンクス液
で洗つた後、牛胎児血清10%添加RPMI1640倍地
に1×107/mlの細胞濃度で浮遊させた。 この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、マウス癌細胞株を標的細胞として、実
施例1と同様のキラー活性測定法で評価した。 各種刺激材の腫瘍障害性細胞誘導能を表2に示
す。 活性化前後の白血球表面抗原の解析は、FITC
標識抗マウスLyt−2モノクローナル抗体(ベク
トン&デキンソン社)を用いて、実施例1と同様
の方法で行なつた。結果を第4図(刺激材との接
触前)および第5図(刺激材との接触後)に示
す。
なつた。すなわち、測定に供する白血球1×106
個を0.1%牛血清アルブミンと0.1%アジ化ナトリ
ウム添加RPMI1640培地に浮遊させ、温度4℃に
てFITC標識抗ヒトLeu2aモノクローナル抗体
(ペクトン&デキンソン社)10μを添加して、
1時間反応させた後、2mlの上記培地で洗浄し、
1mlの培地に浮遊させた。細胞表面上の抗ヒト
Leu2aモノクローナル抗体の検出は、EPICSTM−
V(コールター社)を用いて、公知の方法で行な
つた。 刺激材による白血球活性化前後の表面抗原の解
析結果を図示した。すなわち、グアニンを結合し
たポリビニルアルコール系ゲル(刺激材)による
ヒト末梢血白血球のLeu2a抗原の変化を第2図
(刺激材との接触前)と第3図(刺激材と4日間
接触後)に示す。 比較例 1 10%自己血清添加RPMI1640培地1mlにヒト末
梢血白血球2×106個を浮遊させ、ポリビニルア
ルコール系ゲル200μを添加して、4日間培養
したが、腫瘍障害性細胞は誘導されなかつた。 実施例 2 刺激材の調製は、次のようにして行なつた。す
なわち、粒径120μmのガラスビーズを3−グリ
シドキシプロピルトリメトキシシランと反応させ
て、ガラスビーズに環状エポキシ基を導入し、実
施例1と同様に各種核酸塩基を結合せしめて実験
に供した。 マウス白血球は次のようにした。すなわち、
BALB/cマウス(4〜6週令)から摘出した
脾臓をステンレス・メツシユでほぐした後、ハン
クス液に浮遊して静置、脾臓細胞を臓器片と分離
後、800rpmで10分間遠心分離して得た細胞ペレ
ツトを赤血球除去のため、0.85%塩化アンモニウ
ム水溶液に懸濁させ、温度37℃で2分間インキユ
ベートした後、直ちに10倍量のハンクス液と混
合、800rpmで10分間遠心分離して、牛胎児血清
を10%添加したRPMI−1640培地(ニツスイ)に
5×106/mlの細胞濃度で浮遊させた。この細胞
浮遊液を2mlずつ細胞培養用の2mlウエル(フア
ルコンNo.3047)に分注し、これに刺激材を1gず
つ添加し、CO2インキユベーター中で温度37℃で
培養した。4日間の培養を行なつた後、培養液を
ピペツテイングして活性化白血球を刺激材表面か
らはがして静置すると、刺激材は容器の底に沈下
するので、上清細胞液をとり、これをハンクス液
で洗つた後、牛胎児血清10%添加RPMI1640倍地
に1×107/mlの細胞濃度で浮遊させた。 この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、マウス癌細胞株を標的細胞として、実
施例1と同様のキラー活性測定法で評価した。 各種刺激材の腫瘍障害性細胞誘導能を表2に示
す。 活性化前後の白血球表面抗原の解析は、FITC
標識抗マウスLyt−2モノクローナル抗体(ベク
トン&デキンソン社)を用いて、実施例1と同様
の方法で行なつた。結果を第4図(刺激材との接
触前)および第5図(刺激材との接触後)に示
す。
【表】
比較例 2
10%牛胎児血清添加RPMI1640倍地2mlに、実
施例2と同様の方法で得たBALB/cマウス白
血球1×107個を浮遊させ、これにガラスビーズ
(粒径120μm)0.5gを添加して、4日間培養した
マウス白血球のColon−26およびB−16腫瘍細胞
株に対するキラー活性は、いずれも10%以下であ
つた。なお、キラー活性の測定は、実施例2と同
様の方法で行なつた。
施例2と同様の方法で得たBALB/cマウス白
血球1×107個を浮遊させ、これにガラスビーズ
(粒径120μm)0.5gを添加して、4日間培養した
マウス白血球のColon−26およびB−16腫瘍細胞
株に対するキラー活性は、いずれも10%以下であ
つた。なお、キラー活性の測定は、実施例2と同
様の方法で行なつた。
第1図は本発明で用いる抗腫瘍免疫細胞誘導装
置の一例を示す断面図、第2図は実施例1の刺激
材による白血球活性化前の表面抗原の解析結果を
示すグラフ、第3図は同白血球活性化後の表面抗
原の解析結果を示すグラフ、第4図は実施例2の
刺激材による白血球活性化前の表面抗原の解析結
果を示すグラフ、第5図は同白血球活性化後の表
面抗原の解析結果を示すグラフである。 1……容器、2……刺激材、3……白血球液流
入口、4……液流出口、5……フイルター、6…
…洗浄装置、7……活性化白血球貯留部、8……
フイルター、9……空気排出口、10……洗浄液
排出口。
置の一例を示す断面図、第2図は実施例1の刺激
材による白血球活性化前の表面抗原の解析結果を
示すグラフ、第3図は同白血球活性化後の表面抗
原の解析結果を示すグラフ、第4図は実施例2の
刺激材による白血球活性化前の表面抗原の解析結
果を示すグラフ、第5図は同白血球活性化後の表
面抗原の解析結果を示すグラフである。 1……容器、2……刺激材、3……白血球液流
入口、4……液流出口、5……フイルター、6…
…洗浄装置、7……活性化白血球貯留部、8……
フイルター、9……空気排出口、10……洗浄液
排出口。
Claims (1)
- 1 核酸塩基およびその化学修飾誘導体の一種以
上を表面に有することを特徴とする抗腫瘍免疫細
胞誘導用刺激材。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59208066A JPS6187671A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導用の刺激材 |
DE8484114813T DE3483252D1 (de) | 1983-12-05 | 1984-12-05 | Verfahren zur induktion von antitumorimmunozyten, verfahren zur herstellung von antitumorimmunozyten und durch das verfahren hergestellte antitumorimmunozyten. |
EP84114813A EP0147689B1 (en) | 1983-12-05 | 1984-12-05 | A method of inducing antitumor immunocytes, and a process for producing antitumor immunocytes and antitumor immunocytes produced by the process |
US07/096,259 US4839290A (en) | 1983-12-05 | 1987-09-08 | Process for producing cytotoxic T-cells and compositions produced by said process |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59208066A JPS6187671A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導用の刺激材 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6187671A JPS6187671A (ja) | 1986-05-06 |
JPH0362699B2 true JPH0362699B2 (ja) | 1991-09-26 |
Family
ID=16550076
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59208066A Granted JPS6187671A (ja) | 1983-12-05 | 1984-10-05 | 抗腫瘍免疫細胞誘導用の刺激材 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6187671A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2529605B2 (ja) * | 1989-10-23 | 1996-08-28 | 株式会社大塚製薬工場 | 免疫賦活剤 |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP59208066A patent/JPS6187671A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6187671A (ja) | 1986-05-06 |
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