JPS6333339A - 体外循環治療用抗腫瘍免疫細胞誘導材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、全血液あるいは体液細胞成分と接触する条件
下で、血液細胞中の免疫細胞を活性化して抗帽膓免疫細
胞を誘導する体外循環治療用抗嘘易免疫細胞誘導材罠関
するものである。

（従来の技術） 周知の如く、生体の悪性１本場に対する免疫監視機構を
になう抗龜鳴細胞としては、キラーＴ細胞。

ＮＫ細開胸活性化マクロファージ、に細胞等が重要な役
割をはたしていることが報告されている。

したがって、悪性省易に対する免疫学的療法としては、
癌患者免疫細胞（白血球）を活性比して。

これらの抗＠ｓ′ｍ胞を効率的に誘導することが考えら
れる。しかしながら、癌患者は一般的に、癌の進行とと
もに免疫能が低下することが報告されておシ、癌患者生
体中においては、免疫応答を抑制する免疫抑制因子の存
在あるいはサプレッサーＴ　ａ＠、サプレッサーマクロ
ファージの誘導活性化が報告されている。

このような免疫能の抑制状態下にある癌患者生体中にお
いて、効率的な抗租膓細胞の誘導は困難であると言わな
ければならない。したがって、免疫抑制状態から解放さ
れ皮体外に患者白血球を取シ出し１体外で効率的な抗ｔ
ｋｉ　Ｆｍ細胞誘導活性化を行うことは、効果の高い新
しい癌免疫療法になると考えられる。

最近１体外に取シ出し７を癌患者末梢血白血球に遺伝子
組み換えヒト・インターリューキン２を加えて培養させ
、患者白血球を活性化して、広範Ｊに腫瘍細胞だけを障
害し１．＠者正常細胞は障害しないキラーＴ細胞を誘導
して、これを癌患者体内にもどすことにより、癌を治療
する試みがな嘔れている。

（発明が解決しようとする問題点） 前記の治療法ｒ１層患者から大量の末梢血単核細胞を取
り出し、無菌的に長期間、インターリューキン２の存在
下で培養した後に、癌患者に輸液注入するという操作面
で非常に煩雑であること、また、時間的にも１回の操作
あ７’ｊ５３日から４日の時間を安すること、さらには
、−人の患者あたり医師の相当な手間が必要なことから
、美大な治療費がかかる等の問題がある。

本発明者らは、これら問題点を解決するため研究し之結
果、従来の方法よシも操作性よく、さらに１強力な嘘瘍
障害性細胞金誘導できる刺激材および刺激方法を提供し
てきた（ｔ￥ｊ開昭６０−１２０１３２１号公報、特開
昭６０−２５２４２５号公報）。

しかしながら、これら刺激材全血液細胞存在下。

すなわち、全血血流用として実用に供する場合。

血小板等の血栓性物質が体外循環治療用材料に粘着、活
性化する場合が之び友び見受けられる。この結果、生体
面では、血小板等の血栓性物質の減少に伴なうさまざ壕
な症状を呈する問題が生ずるし、治療器面では、血栓性
物質が付着することにより、治療器本来の機能、つまシ
、抗腫嘔免疫細胞の誘導ができなくなるとともに、治療
器の圧力損失が大きくなシ、血液の通液ができなくなる
という問題が生じている。このｔめ、抗帽務免疫細胞誘
導材の体外循環治療への適用は、安全性および血小板の
粘着の面で大きな問題があり、実用化の友めには抗血栓
の賦与が必須である。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の如き従来技術に基っく抗稙錫免疫細胞
誘導の問題点に鑑み、従来の方法よりも操作性、実用性
、安全性の点で飛躍的に向上させた体外傭環治療用抗腫
瘍免疫ａ砲誘導材を提供するものである。

本発明者らは、上記目的に沿って鋭意研究し之結果、接
触角が２０〜８５度の範囲にある水不溶性材料と、その
表層に形成され几含窒素塩基性官程り基含有する重合体
層からなる基材の表面に、抗植嚇免疫細胞をＩ４可能な
リガンドが固定されていることを特徴とする体外循環治
療用抗腫瘍免疫細胞誘導材が、好適な血小板通過性を示
し、安全性の問題もなく、全血液あるいは体液細胞成分
と接触する条件下で強力な抗辿膓免疫細胞を誘導するこ
とを発見し１本発明を完成した。

本発明に２ける水不溶性材料の表層および基材の表面と
は、細胞すなわち血液ろるいは体液細胞膜表面に存在す
る細胞表面抗原やレセプター７ｋＦｉじめとするタンパ
ク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質等の分子と接触回層
な面をさしている。

本発明における免疫細胞とは、血液細胞のうち赤血球お
よび血小板を除い几、いわゆる白血球を指すが、末梢血
に限らず、リンパ管、リンパ節。

肺臓、胸管から得られる白血球分画も１本発明における
免疫細胞の概念に含まれる。１Ｌこの白血球よシ顆粒球
あるいＦｉＢ細胞を除去し友細胞分画も１本発明におけ
る免疫細胞の概念に含まれる。

本発明において誘導活性ｆヒする抗嘘易免疫細胞は、白
血球の中で顆粒球、卓球、マクロファージを除くリンパ
球分画に属し、とシわけＴ細胞の性質を有している。

本発明におりて用いることのできる水不溶性材料として
は、その表面の接触角が２０〜８５度の範囲のものなら
如何なるものでもよい。接触角が２０度以下、８５度以
上の材料では、水不溶性材料と含窒素塩基性官能基を有
する重合体が相分離現象を生じやすく、相溶性が基層こ
とになる。この皮め、水不溶性材料の表層に含窒素塩基
性官能基金有する重合体層が不完全な形で形成された９
゜その厚みが不均一であったり１重合体のはく離が生じ
る。

また親水性、疎水性の観点から解釈すれば、接触角が２
０度以下の材料は、より親水性材料であり、接触角が８
５度以上の材料は、より疎水性材料となる。親水性材料
と疎水性材料との相溶性は悪く、接触角が２０度以下訃
よび８５度以上の水不溶性材料と含窒素塩基性官能基金
有する重合体は、限られ友ものしか適合せず、適合して
も１重合体層を形成させるｔめのコーティング操作’ｔ
ｆ’Ｊ回もくり返すとか、熱処理固定をするとかの操作
をしなければならず、再現性が悪く使いもの和ならなり
、まえ、接触角が２０度以下のより親水性の水不溶性材
料は、その表面に水の被膜ができ易く、含窒素塩基性官
能基を有する重合体との相容性が悪くなり１重合体のは
く離等が生じる。また。

接触角が２０度以下のより親水性の水不溶性材料。

または！＆触角が８５度以上のよシ疎水性の水不溶性材
料は、そのより強い親水、疎水性度によシ。

含窒素塩基性官能基を有する重合体層の含窒素塩基性官
能基の配向性がよ９片より、不均一になることが考えら
れる。

上記のように、水不溶性材料を接触角が２０〜８５度で
ある水不溶性材料とすることにより、含窒素塩基性官能
基を有する重合体と、水不溶性材料との相溶性が好適に
なシ、水不溶性材料上に形成した含窒素塩基性官能基金
有する重合体のはく離がなく、よシ均一な厚みや構造お
よび含窒素塩基性官能基の配向等が適切に形成され、そ
の結果、血小板の付着がよシ少ない好適な体外循環治療
用基材が得られる。

本発明で言う接触角とは、水中における固体表面上の空
気泡の接触角でＩ）　Ｆ）　、　Ｗ、Ｃ，Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎ　。

Ｊ、Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、、
　４０　、２１９−２２２（１９７２）Ｃダブル・シー
・ハミルトン、ジャーナル・オプ・コロライド・インタ
ーフェイス・サイエンス、４０，２１９−２２２（１９
７２））、Ｊ、Ｄ。

Ａｎｄｒａｃｉｅ、　Ｊ、Ｐｏｌｙｍ、Ｓｃｉ、Ｐｏｌ
ｙｍ、Ｓｙｍｐ、　、　６６　、５１３−４３６（１９
７９）［ジエー・デー・アンドレード。

ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス・ポリマ−１
シンポジウム、６６．３１５−３５６（１９７９））で
示され九原理シよび方法にしたがい、測定し几接触角を
言う。従来よく知られている空気中における固体表面上
の液滴の接触角測定法は、親水性材料は、時間の経過と
ともに接触角の値が変化し。

材料の物性値としては採用しにくい。また、試料は、シ
ートおよびフィルム状等の収形物を作委し。

接触角の測定温度は２５Ｃとし、１０回以上測定し、そ
の平均値を材料の接触角の値とした。

本発明の水不溶性材料の接触角は、２０〜８５度が好ま
しい範囲であるが、３０〜８０度がより好ましく、４０
〜７５度がさらに好ましい。

本発明で百う接触角が２０〜８５度の範囲にある水不溶
性材料とは、水系液体中で固体状でめ９゜前記で示し九
方法で測定した接触角が２０〜８５度であれば、無機系
化合物、有機高分子化合物すべてが含まれるが、溶出物
、細孔の制御がより容易かつ精密にできることより、有
機高分子化合物が好ましい。このような例としては、ポ
リプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリレートエス
テル、ポリアクリレートエステル、ポリアクリル酸。

ポリビニルアルコール等のビニル系化合物の重合体およ
び共重合体、ナイロン６．６６等のポリアミド系化合物
、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合
物等を例示することができる。

本発明において、接触角が２０〜８５度の範囲にあれば
よく１以上の例示に限定されるものではない。

さらに、含窒素塩基性官能基を有する重合体との化学構
造の相似性に基づく相溶性より、ビニル系化合物の重合
体および共重合体がより好ましい。

このような例としては、スチレン、ｐ−メチルスチン、
ｐ−エチルスチレン等のスチレン系化合物の重合体、メ
チル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレー
ト、プロピル（メタ）アジリレート等の（メタ）アクリ
ル醒エステル系比台物の重合体、ンよび上記化合物とジ
ビニルベンゼン。

メタクリロニトリル、ビニルピロリドン、エチレンクリ
コール、メチルアクリレート等のビニル系化合物との共
重合体を例示することができる。

この中で、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ
）アジリレート、プロピル（メタ）アジリレート等の（
メタコアクリル故エステル系比合物の重合体および上記
ビニル化合物との共重合体がより好ましく用いられる。

さらに、（メタ）アクリル酸エステル系化合物の重合体
ンよび上記ビニル化合物との共重合体が、メチルメタア
クリレート２７ｏｚ量ｓ以上含有するものが１本発明の
水不溶性材料としては、よシ好ましい結果を与える。

水不溶性材料の形状としては１球状５粒状、膜状、中空
糸状、糸状等いづれも用いられるが１球状１粒状等の粒
子状は、膜状、中空状、糸状の形標よりは、同−容積力
ラムに水不溶性材料を充填した場合、血液と接触する面
積が大きくなり、抗稚場免疫細胞を誘導でさる効率が上
がる等の理由により１粒子状が好ましい。

さらに、水不溶性材料が粒子状にあっては、その粒子ろ
が５０〜２０００μであるものが１本発明の水不溶性材
料として、よシ好ましい結果を与える。粒子径が５０μ
より小さいと１粒子と粒子との間隔が小となり、血小板
等が付着し、詰まりやすくなり、ｚｏｏｏμ工り大きい
と、血小板等は付着しにくいが、血液と接触する面積は
小となり１体外循環治療用基材としては好ましくない。

さらに１粒子径が１００〜１０００μであるものが１本
発明の水不溶性材料として、よシ好ましい結果を与える
。

本発明で言う「含窒素塩基性官能基」とは、酸性水溶液
中で窒素原子上に陽電荷を有し、陽イオンとな夛うる官
能基である。このような官能基としては、第１級アミン
基、第２級アミノ基、第５級アミノ基、４級アンモニウ
ム基およびピリジル基、イミダゾリニル基等の含窒素芳
香環基等が挙げられる。したがって１本発明で用いられ
る含窒素塩基性官能基含有する重合体としては１例えば
。

ビニルアミン；２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジ
ン、２−メチル−５−ビニルピリジン、４−ビニルイミ
ダゾール、Ｎ−ビニル−２−ｘ　ｆ　ｋイミダゾール、
Ｎ−ビニル−２−メチルイミダゾール等の含窒素芳香）
４ｆヒ合物のビニル誘導体；ジメチルアミノエテル（メ
タ）アジリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アク
リレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アジリレー
ト、３−ジメチルアミノ−２−ヒドロキシプロピル（メ
タ）アクリレート等のアクリル酸およびメタアクリル酸
誘導体：Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリル酸
アミド、Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリル酸
アミド等のアクリル酸アミドおよびメタアクリル酸アミ
ドａ導体；ｐ−ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ−ジ
エチルアミノエチルスチレン等のスチレン誘導体；およ
び上記ビニル化合物をハロゲン化アルキル等によって４
級アンモニウム塩とした誘導体等を含有する重合体が挙
げられる。

この中で特に好ましいのは、ジメチルアミノエチル（メ
タ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アク
リレート、ｐ−ジメチルアミノメチルスチレンｓｐ−ジ
エチルアミノエチルスチレン等を含有する重合体が挙げ
られる。

このことは、水不溶性材料を接触角が２θ〜８５度の水
不溶性材料とすることによシ、上記の重合体との相溶性
が好適となり、そのｔめ重合体のはく離等の問題が生ぜ
ず、弱カチオン性の均一な表面構造および均一なコーテ
ィング層厚みができてｂると想定され、その結果として
１人血での評価において、血小板の通過性か良好であり
、好適な体外循環治療用基材になつｔと考えられる。

本発明で言う含窒素塩基性官能基を有する重合体は、そ
の表面の接触角が１０〜９５度である重合体であること
が好ましい。上記のように、含窒素塩基性官能基含有す
る重合体も、水不溶性材料と同様に、七の表面の接触角
を測定し、接触角が１０〜９５度の含窒素塩基性官能基
を有する重合体を接触角が２０〜８５度の水不溶性材料
にコーティングすることにより、よシ好ましい体外循環
治療用基材を得ることができる。このことは、コーティ
ングする含窒素塩基性官能基を有する重合体と、コーテ
ィングされる水不溶性材料との相溶性による。溶解パラ
メーターで解釈すれは、両者の溶解パラメーター埴が相
似している。このことにより、界面での相分離現象も生
じに＜＜、コーティングし之含窒素塩基性官能基を有す
る重合体のはく離がなく、水不溶性材料の表層に重合体
層が適切く形成され、その結果、血小板の付着がよシ少
々い好適な体外循環治療用基材ができると考えられる。

さらに９本発明の含窒素塩基性官能基金屑する重合体の
接触角は、１５〜８５度であると、より好ましい結果を
与える。

ま友１本発明で言う含窒素塩基性官能基を有する重合体
は、ビニル化合物と含窒素塩基性官能基金有する単量体
との共重合体が好ましく、その官能基中の窒素含量は、
０１ａＳ〜３．５重！俤であることが好ましい。さらに
、窒素含量が０．１〜２．５Ｍ量優であると、より好筐
しい結果を与える。ここでｄう窒素含量とは、上記官能
基中の輩素原子の全重合体中における重量係である。

含窒素塩基性官能基を有する重合体を上記のような範囲
にして、接触角が２０〜８５度の水不溶性材料表層に付
着させることにより、好ましい体外循環治療用基材が得
られる。このことは、窒素含ｔｒ規定しｔ共重合体とす
ることによシカチオン性を制御し九表面構造となると共
に、ビニル化合物との共重合体であるため、より接触角
を制御し易く、七の之め、接触角が２０〜８５度の水不
溶性材料との相溶性がより良好となり、よシカチオン性
を制御し比表面構造の体外循環治療用基材となるｔめと
考えられる。

ここで言うビニル化合物としては、２−ヒドロキシエチ
ルメタアクリレート、メチル（メタ）アジリレート、エ
チル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリ
レート等のアルキル（メタ）アクリレート類、（メタ）
アクリルアミドＳＮ−メチル（メタ）アクリルアミド等
のアミド類、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、スチ
レン等が挙げられる。

さらに、前記で示したビニル化合物と含窒素塩基性官能
基金屑する単量体との共重合体のビニル化合物は、２−
ヒドロキシエチルメタアクリレートであることがよシ好
ましい。このことは、ビニル化合物′ｊｋ２−ヒドロキ
シエチルメタアクリレートとすることにより、Ｒ水都と
疎水部を有するミクロ不均一相分１ｍ構造を持つ共重合
体になることを意味するが、接触角が２０〜８５度の水
不溶性材料に付着させることによシ、水不溶性材料と共
重合体との相溶性が好適なため、共１合体のはく離等の
問題が生ぜず、共重合体層の厚み、構造等が均一なミク
ロ不均一構造ができ、その結果として、血小板通過性が
良好な、好適な体外循環治療用基材ができたと考えられ
る。

ここで言う含窒素塩基性官能基を有する単量体とは、前
述で示し之含窒素塩基性官能基金有する重合体の単量体
が挙げられる。含窒素塩基性官能基を有する単量体は、
ジメチルアミノエチル（メタ）アジリレートま几はジエ
チルアミノエチル（メタ）アクリレート、ｐ−ジエチル
アミノメチルスチレン、ｐ−ジエチルアミノエチルスチ
レンであることがより好ましい。

さらに、ビニル化合物と含窒素塩基性官能基金屑する単
量体との共重合体としては、ブロック共重合体、グラフ
ト共重合体、ランダム共重合体等があるが、グラフト共
重合体、ブロック共重合体は、１００１〜１００μ平均
長のミクロ不均一構造を有することが好ましい。

上記のビニル化合物と含窒素塩基性官能基を有する単量
体との共重合体は、ランダム共重合体であるのが最も好
ましい。

この作用については、水不溶性材料を接触角が２０〜８
５度の水不溶性材料とした友め、ランダム共重合体との
相溶性が好適になプ、その之め。

ビニル化合物と含窒素塩基性官能基を有する単量体がよ
）ランダム状に共重合し、血液に接する表面に、よ）ラ
ンダム状にアミノ基が存在する形となシ、血小板との相
互作用が少ない好適な体外循環治療用基材になっている
と考えられる。

まえ１本発明の水不溶性材料に含窒素塩基性官能基を有
する重合体を付着させ九基材を厚生省の吸着製血液浄化
器品質基準に準拠し、溶出物試験および流出異物数試験
を行なつ几ところ、いずれも基準内であった。さらに、
　Ｌｅｅ−Ｗｈｉｔｅ　（リ−・ホワイト）法での血液
凝固能の試験では１本発明の水不溶性材料に含窒素塩基
性官能基を有する重合体を付着させｔ基材は、いずれも
ガラスに含窒素塩基性官能基を有する重合体を付着させ
友基材よシ血液凝固時間の延長が認められた。

以下に、（１）水不溶性材料の製造方法、（２）含窒素
塩基性官能基を有する重合体の製造方法、（３）Ｍ合体
層の形成方法、条件等について例示するが、本発明は、
この例示に限定されないのはもちろんである。

（ＩＪ　　水不溶性材料の製造方法 本発明の水不溶性材料の製造方法は、諷状重合。

溶液１合、懸濁重合、乳化重合等の一般的に公知の方法
であシ、市販の単量体を購入し、添加剤、重合開始剤お
よび単量体を溶解する溶媒と共に。

それぞれの１合体の製造方法で行なわれる。例えば、ス
チレン〜ジビニルベンゼン共正合体では。

スチレン、エチルベンゼン、ジビニルベンゼンおよびト
ルエン、オクタツールおよびＡＩＢＮ（アゾビスイノブ
チロニトリル）共存化のもとで攪拌することにより１球
径５０〜１０００μ程度の多孔質粒子を作ることができ
る。また、懸濁重合系でのラジカル重合によっても、各
櫨粒子径、孔径の粒子を作ることができる。

（２）含窒素塩基性官能２ｖｉを有する重合体の製造方
法 本発明の高分子’をｆｆ造するのに特に制限はなく、単
量体によるラジカル重合、アニオン重合などを始めとす
る付加重合、開環重合、脱ハロゲン化水素による重合、
＃ａ合反応などを用いることができる。さらには、ポリ
マー反応による方法も採用できる。例えば、所定の原料
ポリマーに既知の方法でアはノ化し友り、あるいは必要
によりヒドロキシル基を導入し之りすることができる。

グラフトボリマーヲ製造する場合には、マクロマーと他
のモノマーの共重合によって得ることもできるし。

高分子原料にグラフト反応を行なうことも可能である。

（３）重合体層形成方法および条件 重合体層形成方法としては、スプレー法、浸漬性等公知
の方法すべてが用いられる。ここでは。

浸漬法の詳細を説明する。

あらかじめ含窒素塩基性官能基１に：４ｆする重合体を
重合体の溶媒に溶解した溶液を作製する。重合体の溶媒
は１重合体を均−忙溶解せしめ、膜面への重合体の含浸
ま７’ｊｔｉ塗布を容易にする溶媒であり１本発明にお
いては、基本的には、上記ポリマー１−溶解しうる溶媒
であれば、全て利用可能である。適当な溶媒は除去のし
やすさ、微量に残留した場合の安全性等を考慮して選択
しなければならない。本発明では、このような溶媒とし
て、メタノール、エタノール等の低級アルコール、アセ
トンおよびジメチルホルムアミドならびにこれらと水と
の混合物が好ましい。

この溶液１００１ＲｔＫ各棟球径の水不溶性粒子３５−
を窒素雰囲気下で室温の下、約５分間浸漬し几後（時々
攪拌する）、グラスフィルター上で過剰の溶液を吸引除
去してから、送入窒素ガス量と吸引窒素ガス量のバラン
スをとりながら２０分間グラスフィルター上で窒素乾燥
する。次いで、真空乾燥機の中で、室温、７５５１１１
Ｈｇ以上の条件で２４時間乾燥する。

同僚な方法で、含窒素塩基性官北基金有する重合体を２
種以上用いて、水不溶性材料の表層へ。

例えば、多層に重合体層を形成させることもできる。

以下に１本発明の水不溶性材料に含窒素塩基性官能基金
層する重合体層を形成させｔ基材に結合させるリガンド
について述べる。

本発明において、基材表面に保持させる抗腫嘔免疫細胞
誘導司能なリガンドとしては、レクチン。

リンフオカイン類、モノカイン類、抗日血球抗体。

プロティンＡＳ　リポポリサッカライド（ＬＰＳ）。

０Ｋ４３２．オリゴ糖などの生物由来の物質、および核
酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ピラゾロ（３，
４−ｄ）ピリミジンやその誘導体、あるいはアニオン性
基金層する有機化合物等をリガンドとして例示すること
ができる。

レクチンとしては、ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａ
ｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）由来の７カインゲ
ンマメレクチン（ＰＨＡ）、コンカナバリア・エンシフ
オルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒ
ｍｉｓ　）由来のコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）
　、ライステリア・アオリバンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　
ａｏｒｉｂａｎｄａ　）由来のノダクジマメレクチン（
ＷＦＡ）、レンズ・キュリナリｘ　（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌ
ｉｎａｒｉｓ　）由来のレンズマメレクチン（ＬＣＨ）
、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ
　ａｍｅｒｉｃａｎａ　）由来のアメ１１カヤマゴボウ
レクチン（ＰＷＭ）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ　ｍａｘ　）由来のダイズレクチン（５ＢＡ）。

フオセオラス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｌｉ
ｍｅｎｓｉｓ）由来のりママメレクチン（ＬＢＡ）、ロ
ピナ・プソイドアカシア（Ｒｏｂｉｎａ　Ｐｓｅｕｄｏ
ａｃａｃｉａ　）由来のニセアカシアレクチン（ＲＰＡ
　）、ソホラ・ジャポニカ（５ｏｐｎｏｒａ　ｊａｐｏ
ｎｉｃａ　）由来のイヌエンジュマメレクチン（ＳＪＡ
）、　ビサム・サチバム（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ
　）由来のエントウマメレクチン（ＰＳＡ）、　　ビシ
ア・ファム（Ｖｉｃｉａ　ｆａｂａ　）由来のクジマメ
レクチン（Ｖ１１？’Ａ）等が例示できる。

リンフォカイン類、モノ力イン類としては、天然あるい
は遺伝子工学を用いて得られたインターリューキン１、
インターリューキン２．ｆ−インターフェロン、）産婆
壊死因子（ＴＮＦ）等を例示することができる。

抗日血球抗体としては、Ｔ細胞、単球、マクロファージ
、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）や。

Ｋ細胞の表面に存在する抗原、レセプターに対するモノ
クローナル抗体、活性比リンパ球表面に存在するレセプ
ターに対するモノクローナル抗体。

およびクラスｉｉｉ、クラス■抗原に対するモノクロー
ナル抗体が挙げられる。

たとえば、抗Ｌｅｕ−１抗体、抗Ｌｅｕ−２抗体、抗Ｌ
ｅｕ−３抗体、抗Ｌｅｕ　−４抗体、抗Ｌｅｕ−５抗体
、抗Ｌｅｕ−８抗体、抗Ｌｅｕ−９抗体、抗Ｌｅｕ−１
５抗体。

抗Ｌｅｕ−Ｍ！抗体、抗Ｌｅｕ−７抗体、抗Ｌｅｕ−１
を抗体、抗ＩＬ−２レセプター抗体、抗トランスフェリ
ンレセプター抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−Ｄ
Ｃ抗体（以上、ベクトン・デイツキンソン社製。

ＵＳ、Ａ）や、抗Ｔ５．抗Ｔ４．抗Ｔ６．抗Ｔ８゜抗Ｔ
１１．抗ＭＩ、抗ＤＲ，抗Ｔ９％抗’１’ｔｏ抗体等を
例示できる。゛また。抗Ｔ細胞抗原レセプター抗体や抗
ＩＬ−２レセプター抗体も好ましく使用できる。抗Ｔ細
胞抗原すセプター抗体としては。

Ｔ細胞抗原リセブターの抗原結合部位に対する抗イデイ
オタイプモノクローナル抗体が特に選択的活性ｆヒの点
で好ましい。

オリゴ糖としては、Ｎ−アセチルグルコサミン。

Ｎ−７セチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース
、マンノース、グルコース、シアル酸の中の三つ以上か
ら構成される。たとえば、シアル酸。

ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコースか
ら底るオリゴ糖、あるいはガラクトース。

Ｎ−アセチルグルコサミン、フコースから成るオリゴ循
であ、０．ｆｃとえば。

Ｇａｌβ１　→４　Ｑ　ｌ　ｃＮＡＣβ１　→３　Ｇ　
ａ　１β１↑ Ｆｕｃα１ の構造を有するオリゴ糖が例示できる。

核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの
化学修飾篩導体としては、天然および合成物の如何なる
ものでも使用できる。

すなわち、アデニン、１−メチルアデニン、２−メチル
アデニン、Ｎ−（）−シン−６−イルカルバ七イル）−
Ｌ−トレオニン、Ｎ’−（Δ”−１：／ペンテニル）ア
デニン、２−メチルチオ−Ｎｌ−（Δ２−イソペンテニ
ル）アデニン。２−ヒドロキシアデニン、マーメチルア
デニン、Ｎ’、Ｎ’−ジメチルグアニン、Ｎ’−（ｃｉ
ｓ−４−ヒドロキシイソペンテニル）アデニ／、ゼアチ
ン、２−アミノアデニン、クアニン、１−メチルグアニ
ン、Ｎ！−メチルグアニン、　Ｎｔ、ｒ−ジメチルグア
ニン、７−メチルグアニン、シトシン、３−メチルシト
シン、便−アセチルシトシン、Ｎ′−メチルシトシン、
５−メチルシトシン、５−とドロキシメチルシトシン。

２−チオシトシン、ウラシル、３−メチルシトシン、チ
ミン、４−チオウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５
−ヒドロキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、
ｌ　５−カルボキシメチルウラシル、２−チオチミン、
５−カルボキシメチル−２−チオウラシル、５−（メト
キシカルボ二にメチル）−２−チオウラシル、５−（Ｎ
−メチルアミノメチル）−２−チオウラシル、５．６−
シヒドロウラシル、５．６−シヒドロチミン、５−（ブ
トレジツメチル）ウラシル、Ｓ（ト）５−（４，５−ジ
ヒドロキシベンチル）ウラシル、オロト酸、ワイ、ワイ
プチン、ペルオキシワイプチン、ヒボキサンチン、１−
メチルヒポキサンチン、キサンチン、尿酸等の核酸塩基
、アデノシン、２−メチルアデノシン、グアノシン、１
−メチルグアノシン、イノシン、シチジン、ウリジン等
のヌクレオシド、アデノシン３′−リンｃＲ，グアノシ
ン３′−リン酸、シチジン３′−リンｃＩ！、ウリジン
３′−リン酸等のヌクレオチドが例示できる。

ピラゾロ（５，４−ｄ）ピリミジン訪導体としては。

ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジン、４−アミノピラゾ
ロ（３，４−ｄ）ピリミジン、６−アミノピラゾロ（３
，４−ｄ）ピリミジン、４−アミノ−６−ヒドロキシピ
ラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジ／、４−アミノ−６−メ
ルカプトピラゾロ（５，４−Ｄ）ピリミジン等が挙げら
れる。中でも、４−７ミノビラゾロ（３，４−ｄ）ピリ
ミジン、４−アミノ−６−ヒ）ロキシビラゾロ（３，４
−ｄ）ピリミジンが例示できる。

アニオン性基を有する有機化合物としては、アニオン性
基を有するものならば如何なるものでも使用できるが、
特にスルホン酸基、カルボン酸基。

リン酸基、アルンン酸基、セレノン酸基等の少なくとも
一つを有する有機化合物が好ましく、さらに好ましくは
、スルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基があげられる
。

免疫細胞の刺激、活性化用のリガンドとしては。

以上の例示に限定されるものではなく、本発明の基材に
固定して抗＠瘍細胞を誘導できるリガンドは全て使用で
きる。

まえ１本発明の基材に２ｆｉ以上のリガンドを保持させ
て用いることもできる。さらには、リガンドを保持した
材料を２棟以上併用して用いることもできる。

本発明において、有機リガンドを基材の表面に固定する
方法は、共有結合、イオン結合、物理吸着、包埋あるい
は基材表面への沈澱不溶化等あらゆる公知の方法を用い
ることができるが、これらの化合物の溶出性から考える
と、共有結合によシ。

固定、不溶化して用いることが好ましい、そのｔめ通常
固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用いられ
る公知の基材の活性化方法およびリガンドとの結合方法
を用りることができる。また。

必要に１６じて基材とリガンドの間に任意の長さの分子
（スペーサー）を導入して使用することもできる。

基材上の水酸基へＩＩガントを結合させる場合には、基
材ヲハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビス
エポキシド法、ハロゲン化トリアジン法、ブロモアセチ
ルプロミド法、エチルクロロホルマート法、カルボニル
ジイミダゾール法等によシ活性ｆヒできる。これらの官
能基は、リガンドの７ミノ基、水酸基、カルボキシル基
、チオール基等の求核反ろ基と反応し共有結合を形成で
きる。

本発明の基材にリガンドを固定した材料を光項し友装ｒ
ｉヲ体外循壌で用いる場合には、大路次の二連シの方法
がある。一つＫｉｉ、体内から取シ出し次血液を、遠心
分離器もしくは模型血漿分離器？使用して２成分以上に
分離しｔ後、白血球成分を該装置に通過させ、免疫細胞
を活性化しｔ後。

該装置を通過していない血漿成分または血球成分と合わ
せて体内にもどす方法であり、他の一つは。

体内から取り出した血液を直接核装置に通過させる方法
である。

体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ。

あるいは設備の装置状況に応じて、連続的に通液しても
よいし、１几、断続的に通液使用してもよい。

本発明で使用する液としては、全血液および遠心分離器
等を使用して分離したバツフイコート層。

リンパ球液、さらには、骨髄液、血漿等の体液細胞成分
を含む液すべてが含まれる。

（実施ｆｌｌ） 次に、実施例によシ本発明をさらに詳細に述べる。

血小板通過性の評価 Ａ）評価用カラムの炸裂 水不溶性材料へ含窒素塩基性官能基金層する重合体をコ
ーティングし友体外循環治療用基材を。

直径５關φ、長さ１０ｆｌの円筒形カラムに、Ｘ空度２
００〜５００　ｍＭＨｇの吸引下で生理食塩水を流しな
がら充填する（カラムの入口、出口には８゜メツシュの
ポリエステルメツシュがとシっけである）。次いで、１
６時間静置する。

Ｂ）人血の通液および血小板通過性の算出上記の評価用
カラム（カラム内容ｉ　０，２　ｍ　）に。

０．１ｄ／ａｍの速度で２０分間、ヘパリン加生食（１
ｕｎｉｔ／ｓｇ　；　ヘハＩＪ　７　ａＫ　）　’ｉｔ
シリンジ型マイクロポンプで流す。次いで１人の末梢血
（１５ｕｎｉｔ／ａｄ；ヘパリン濃度）を室温（２０Ｃ
）で。

０．１ｄ／ａｍの速度で流す。カラム内生食がカラム出
口よシ押し出されｔ時点をサンプリングの０時間として
、カラム出口よジエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
入プのサンプルビン血液のサンプリングを行なう。サン
プリングｆｔ終了Ｌ７ｔｉＬ、　２時間以内Ｋ　ＢＲＥ
ＣＨＥＲ−ＣＲＯＮＫＩＴＥ法で、カラム入口およびカ
ラム出口の血小板数と形態変化を測定し。

体外循環治療用基材としての適否をみ友。

カラム入口血小板数 綽導材の抗輔瘍免疫細胞鰺導能の評価 Ａ〕誘導材によるヒト白血球の活性化 ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち。

採血したヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し。

フィコールバーク液（ファルマシア社製）に重層し、２
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離しｔ後、中間層の白血
琢層勿分離して、これをハンクス液で洗った後、自己血
清を１０係添加したＲＰＭＩ　１６４０培地にツスイ）
に２Ｘ１ｏ’／、ｇの細胞濃反で浮遊させる。この細胞
浮遊液を１−ずつ、細胞培養用の２ゴウエル（ファルコ
ンム５０４７　）に分注シ。

これに刺激材を５０μｔずつ添加し、　ＣＯｔインキュ
ベーター中で温度３７Ｃで培養を行う。５日間培養を行
った後、ピペッティングを行って静置すると、担体は容
器の底に沈澱するので、上清血清をと＃）、これをハン
クス液で洗つ友後、自己血＊１０囁添加ＲＰＭＩ　１６
４０培地に５Ｘ１０’／Ｍｔの細胞ａ度で浮遊させる。

Ｂ）活性化白血球のｌ！［細胞障害性の評価抗嘘賜免疫
細胞誘導材で活性化され友白血球の癌細胞障害性は１次
のようなキラー活性測定法を用いて評価し友。

標的細胞として、培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を　５　Ｘ　１０’／Ｗ１ｔの細胞ａ度
で１０囁牛脂児血清添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に浮遊
させ、これを１０μｔずつ１０μを容テラサキプレート
に分注し、ＣＯ，インキュベーター中で温度３７Ｇで培
養する。２４時間培″＃を行うと、癌細胞は培養プレー
ト底面に強く付着する。これを培養液で洗った後、自己
血清１０％添加ＲＰＭ１１６４０培地に、５Ｘ１０’／
−の細胞ａ度で浮遊させた活性化白血球液１０μｔ’を
添加し、３７Ｃで４時間、ＣＯ□インキュベーター中で
培養し、プレートに付着している癌細胞を障害させる。

障害を受けた癌細胞は、プレート底面への付着性１ｃ喪
失し。

ハンクス液で洗うと、白血球とともに除去される。

生残してプレート底面に付着している癌細胞をア七トン
で固定し、ギムザ液で染色した後、顕微鏡で計数する。

キラー活性は次式によシ計算する。

キラー活性＝（１−（（活性化白血球を添加し友場合の
生存嘘易細胞数）／（活性化白血球を添加しない場合の
生存嘘易細胞数）　）　）　Ｘ　１００（％）実施例１ 水不溶性材料として、メチルメタアクリレ−トルジビニ
ルベンゼン共重合体（８０：２０重量嘩）。

スチレン〜ジビニルベンゼン共重合体（８０：２０Ｊｉ
Ｊｉ％）、ビニルアルコール〜トリアリルイソシアヌレ
ート共重合体のシートおよび３５０〜５ｏｏμの粒子を
作製し、水中Ｋｂける空気泡の接触角を測定し、含窒素
塩基性官能基を有する重合体として、２−ヒドロキシエ
チルメタアクリレートとジエチルアミノエチルメタアク
リレートとのランダム共重合体（２−とドロキシエチル
メタアクリレートの含有ｆ９θモルチ）フィルムを作製
し、水中にシける空気泡の接触角を測定し友。次に、上
記の２−ヒドロキシエチルメタアクリレートとジエチル
アミンエチルメタアクリレートとのランダム共重合体の
２％ｗｔ／Ｖメタノール溶液を炸裂し、上記の水不溶性
材料（球径３５０〜５００μ）に。

前述のコーティング方法にしたがいコーティングし、こ
の基材に、ハロゲン化シアン（ＣＮＢｒ　）　ｙｋ用い
た方法（アフイニテイクロマトグラフイー。

Ｐ３０〜Ｐ４９．千畑一部・土佐哲也・松尾雄志著、１
９７６　）で、各種の抗腫易免疫細胞誘導可能なリガン
ドを結合せしめ友誘導材を得土。

各種誘導材の血小板通過性と抗＋１ｉ！ｉｉ免疫細胞訪
専能の評価結果を表１ＶＣ，使用した材料の概略を表２
に示す。

表　１　各種誘導材の血小板通過性と抗樵瘍免疫細胞誘
導能比較例１ 水不溶性材料をガラス粒子（粒径３５０〜５００μ）お
よびポリエチレン粒子（粒径３５０〜５００μ）とし、
含窒素塩基性官能基含有する重合体を実施例１と同一と
して、実施例１と同様な方法でコーティングした後、７
１０グン化シアン法にて抗嘘易免疫細胞誘導可能なリガ
ンドを結合せしめ友誘導材を得几。

調製した誘導材の血小板通過性と抗＠場免疫細胞誘導能
の評価結果を表５に、使用した材料の概略を表４に示す
。

表　３　各徳誘導材の血小板透過性と抗ｒＩａＭ免疫ｄ
ｆｆｉ胞誘導能 表　　　４ 比較例２ 実施例１で調製した３種の基材について、血小板通過性
と抗腫瘍免疫細胞誘導能を評価した結果を表５に示す。

表　　５ 比較例５ 実施例１で使用した不溶性担体材料の血小板通過性と抗
腫瘍免疫細胞誘導能を評価し友結果金表６に示す。

表　　　　６ 実施例２ 水不溶性材料として、球径３５０〜ｓｏｎμのスチレン
ヘジビニルベンゼン共重合体（８０：２０重ｔ％）（実
施例１と同一）を使用し、コーティング剤としては、２
−ヒドロキシエチルメタアクリレートとジメチルアミノ
エチルメタアクリレートとの共重合体（２−ヒドロキシ
エチルメタアクリレートの含有４１９０　ｍｏ　１　％
）の２張ｗｔ／Ｖメタノール溶液を使用した。

抗腫瘍免疫細胞誘導可能なリガンドとして、アメリカヤ
マゴボウ・レクチンをハロゲン化シアン法にて基材に結
合した。

調製し比誘導材の血小板通過性と抗腫瘍免疫細胞誘導能
の評価結果を表７に、使用した材料の概略を表８に示す
。

表　　７ スチレンヘジピニルベンゼン共亜合体の接触角；７６±
５（度） 表　　８ 比叙例４ 水不溶性材料として実施例２と同一のスチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体を使用し、コーティング剤としては
、含窒素塩基性官能基を有してない２−ヒドロキシエチ
ルメタアクリレートの重合体の２％ｗ　ｔ　／　Ｖメタ
ノール溶液を使用し、前述の方法にしたがいコーティン
グしｅｔ、抗腫瘍免疫細胞誘導可能なリガンドであるア
メリカヤマゴボウ・レクチン金ハロゲン化シアン法にて
固定化した。

調製し比誘導材の血小板透過性と抗腫瘍免疫細胞誘導能
の評価結果を表９に示す。

表　　　９ 実施例５ 水不溶性材料として、メチルメタアクリレ−トルジビニ
ルベンゼン共重合体〈実施例１と同一）を使用し、コー
ティング剤としては、２−ヒドロキシエチルメタアクリ
レートとＮ、Ｎ’−ジエチル−Ｎ−（４−ビニルフェネ
チル）エチレンジアミンとのグラフト共重合体（２−ヒ
ドロキシエチルメタアクリレートの含、Ｗ　量９０　ｍ
ｏ　１％）の２　％　ｗｔ／Ｖメタノール溶液を使用し
、前述の方法ＩＣＩ、Ｆｃがいコーティングした優、ア
メリカヤマゴボウ・レクチンをハロゲン化シアン法にて
結合させた。

調製した誘導材の血小板透過性と抗腫瘍免疫細胞誘導能
の評価結果を表１０と表１１に示す。

表　　１０ 実施例４ 実施例１で調製し友メチルメタアクリレート〜ジビニル
ベンゼン共重合体ｔｅａ：ｚｏ重量僑）を水不溶性材料
として、含窒素塩基性官能基含有する重合体である２−
ヒドロキシエチルメタアクリレートとジエチルアミノエ
チルメタアクリレートとのランダム共重合体（２−ヒド
ロキシエチルメタアクリレートの含有量９０モル％）を
コーティングし几基材に、ハロゲン化シアン法で２種類
の抗腫瘍免疫細胞誘導可能なリガンドを同時に結合せし
めた誘導材を得た。

これらの誘導材の血小板透過性と抗腫瘍免疫細胞誘導可
の評価結果を表１２に示す。

表　　１２ 実施例５ 本発明の体外循環治療用抗腫瘍免疫細胞誘導材を充填し
たカラムを用いて、ヒト全血通液を行ない、血小板通過
性と抗腫瘍免疫細胞誘導能を検べ九。以下、本実験の方
法について詳述する。

水不溶性材料として、メチルメタアクリレ−トルジビニ
ルベンゼン共重合体（８ｏ　：　２０ｉｉ％）の粒子（
３５０〜５００μｍ）を作製し一含窒素塩基性官能基金
層する重合体として、２−ヒドロキシエチルメタアクリ
レートとジエチルアミノエチルメタアクリレートとのラ
ンダム共重合体（２−ヒドロキシエチルメタアクリレー
トの含有ｆ９０モル％）を実施例１と同様の方法でコー
ティングし九袋、アメリカヤマゴボウ・レクチン（ＰＷ
Ｍ）を結合せしめた誘導材を得友。この誘導材５ｄをカ
ラムに充填し、０．５％ヘパリ／含有生理食塩水で洗浄
後、ヒト末梢血２５１１１１．を０．１コ／！１１１１
の流速で通液させた。通液後の血小板透過性の評価結果
を表１３に示す。

誘導材を通過させた末梢血から、比重遠心法（矢田純−
・藤原道夫編著、リンパ球機能検索法、Ｐ、１７．１９
８０年、中外医薬社）にてヒトリンパ球を得、これを１
０憾自己血漿含有ＲＰＭ１１６４０培地に約２　Ｘ　１
０”個／−の細胞濃度で浮遊させ、ＣＯ，インキュベー
ター中で温度５７７：：で２０　ｈｒ培養を行なった後
、ヒト冑癌細胞ＭＫＮ−１に対する障害ａを測定し念。

結果を表１３に示す。

表　　１５ 実施例１〜５の全試料について、カラム入口、出口側で
の血液中の血小板形態変化を顕截鏡で観察し九が、形態
変化はほとんど見受けられなかつ友。

（発明の効果） 本発明の体外循環治療用抗腫瘍免疫細胞誘導材は、以上
述べてきたように、従来の全血還流用材料に比較し、血
小板等の血栓性物質の粘着、活性化が著しるしく少なく
、かつ強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導できる材料である。

また、溶出物等の安全性の問題がない定めに、安全に人
体に適応できる。

さらには、リガンドを自由に選択できるために。

血液適合性が良好な状態で、目的の免疫細胞を特異的に
活性化することができる利点がある。

これらのことから、本発明の抗腫瘍免疫細胞誘導材は、
癌の体外循環治療に有効に利用できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 接触角が２０〜８５度の範囲にある水不溶性材料と、そ
   の表層に形成された含窒素塩基性官能基を有する重合体
   層からなる基材の表面に、抗腫瘍免疫細胞を誘導可能な
   リガンドが固定されていることを特徴とする体外循環治
   療用抗腫瘍免疫細胞誘導材。