DE60213993T2

DE60213993T2 - Verfahren und vorrichtung zur feststellung von zieltiefe, helligkeit und grösse in einer körperregion

Info

Publication number: DE60213993T2
Application number: DE60213993T
Authority: DE
Inventors: W. Bradley Danville RICE; G. Daniel Los Altos STEARNS; L. Tamara Berkeley TROY
Original assignee: Xenogen Corp
Current assignee: Xenogen Corp
Priority date: 2001-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2022-05-18
Also published as: ATE336717T1; AU2002303819B2; US8825140B2; KR20040012844A; JP4259879B2; WO2002093143A2; US7403812B2; JP2004528916A; EP1402243B1; US20030002028A1; WO2002093143A3; CA2447262A1; US20120150026A1; US7764986B2; US20100262019A1; DE60213993D1; US8180435B2; US20070270697A1; EP1402243A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
Diese Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Gebiete der nicht-invasiven medizinischen Bildgebung, der medizinischen Forschung, Pathologie, und Arzneimittelforschung und -entwicklung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
In einer Vielzahl von medizinischen diagnostischen und therapeutischen Situationen, wie auch in der biomedizinischen Forschung, ist es wünschenswert, ein Ziel oder Gebiet unter der Oberfläche innerhalb einer Körperregion eines Subjekts bildlich zu erfassen. Zum Beispiel kann eine nicht-invasive Auffindung und Bilderfassung von Teilen oder der Gesamtheit eines festen Tumors, eines Gebietes myokardialer Ischämie, der Verteilung eines therapeutischen Präparates, das dem Subjekt verabreicht wurde, oder des Voranschreitens einer Krankheit nützliche Forschungsinformationen oder diagnostische Informationen liefern. Idealerweise ist ein Bildgebungsverfahren in der Lage, innerhalb einer Körperregion ein Ziel von Interesse zu lokalisieren und Information zu liefern über Form, Größe und Anzahl der Zellen des Ziels und die Tiefe unterhalb der Oberfläche der Körperregion. Bis heute jedoch sind Verfahren, die zur Bilderfassung von Körperzielen unter der Oberfläche verwendet worden sind und/oder vorgeschlagen worden sind im allgemeinen beschränkt auf solche, die ionisierende Strahlung verwenden, wie z.B. Röntgenstrahlung, eine teure und sperrige Ausrüstung verwenden, wie z.B. Kernspin-Tomografie, oder auf Ultraschall.
Röntgenstrahlen haben ausgezeichnete Gewebedurchdringung und können, wenn sie in Verbindung mit einer Computer-Tomografie (CT) oder Computer-Axial-Tomografie (CAT) verwendet werden, eine überlegene Bildqualität liefern. Röntgenstrahlen haben jedoch eingeschränkten Nutzen bei der Beobachtung des Krankheitsfortschritts, weil das der Röntgenstrahlung Ausgesetztsein potenziell gefährlich ist, wenn ein solches Ausgesetztsein prolongiert ist. Röntgenstrahlen können verwendet werden zur Lokalisierung und Bilderfassung von Zusammensetzungen, die an einem Ziel des Interesses innerhalb einer Körperregion angeordnet worden sind, aber immer unter einer Aussetzung gegenüber dem potenziellen Schaden, der mit der Röntgenstrahlung verbunden ist. Röntgenstrahlen können jedoch nicht leicht verwendet werden, um die Expression von Gen-Produkten in vivo bildlich zu erfassen und die Tiefe und/oder Form eines Ziels zu bestimmen, das solche Genprodukte exprimiert.
MRI ist auch ein hervorragendes Verfahren für die Bilderfassung von Zielen, Gebieten und Strukturen in einer Körperregion eines Subjekts. Obwohl von MRI nicht erwartet wird, dass es schädliche Eigenschaften besitzt, wie jene, die mit ionisierender Strahlung verbunden sind, macht die teure und sperrige Ausrüstung, die für die Verwendung von MRI benötigt wird, dieses unpraktisch für viele Anwendungen oder Situationen. MRI kann zwei- und dreidimensionale Informationen über Ziele innerhalb einer Körperregion eines Subjekts liefern, aber es ist weniger effektiv bei der Bilderfassung physiologischer Aktivitäten, die mit einem Ziel verbunden sind.
Ultraschall oder Ultra-Sonografie ist die Verwendung hochfrequenter Schallwellen (Ultraschall) zur Erzeugung von Bildern von Strukturen innerhalb des menschlichen Körpers. Ultraschallwellen sind Schallwellen, die oberhalb des für Menschen hörbaren Bereichs des Schalls liegen. Ultraschallwellen werden erzeugt durch die elektrische Stimulation eines piezo elektrischen Kristalls, und solche Wellen können auf spezifische Körperregionen gerichtet werden. Wenn die Wellen durch Körpergewebe innerhalb einer Körperregion wandern, werden sie an jedem Punkt, an dem es eine Änderung in der Gewebedichte gibt, zurückreflektiert, wie zum Beispiel an der Grenze zwischen zwei verschiedenen Organen des Körpers. Ultraschall bietet die Vorteile der Nicht-Verwendung von Strahlung oder radioaktivem Material, und verwendet eine weniger teure und weniger sperrige Ausrüstung als MRI, aber es ist beschränkt auf die ledigliche Wahrnehmung von Unterschieden der Dichte von zugrundeliegendem Gewebe und Strukturen. Demzufolge kann Ultraschall den Fortschritt einer Infektion nicht in wirksamer Weise verfolgen und überwachen, wenn eine solche Infektion nicht in einer wahrnehmbaren Verschiebung der Dichte des Zielgewebes resultiert. Ultraschall kann die physiologischen Funktionen von Geweben oder Organen nicht bildlich erfassen oder detektieren.
Bis heute war die Positronen-Emissions-Tomografie oder P.E.T. einzigartig unter den Bildgebungstechniken, weil sie ein Bild der Organ- oder Gewebefunktion hervorbringt. Andere Bildgebungstechniken wie Röntgen, CT, MRI und Sonographie stellen Organ- und Gewebeanatomie dar, können aber die physiologische Aktivität innerhalb dieser nicht wahrnehmen. Um eine spezifische biochemische Aktivität eines Organs bildlich darzustellen, wird eine radioaktive Substanz, genannt ein Radiotracer oder Radiopharmazeutikum, in den Körper injiziert oder inhaliert. Der Tracer ist üblicherweise ein radioaktives Äquivalent einer Substanz, die natürlich im Körper vorkommt, wie zum Beispiel Wasser oder Zucker. Das radioaktive Isotop ist identisch mit dem körpereigenen nicht-radioaktiven Isotop, außer dass seine Atome eine andere Anzahl von Neutronen haben. Infolgedessen ist der Körper eines Subjekts mit radioaktivem Ma terial belastet und dem mit solchem Material verknüpften möglichen Schaden. P.E.T. kann nicht-isotope Expressionsprodukte von transgenen Geweben, Organen oder transgenen Organismen nicht nachweisen. Szintigrafie, ein diagnostisches Verfahren, bei dem man ein zweidimensionales Bild einer körperlichen Strahlungsquelle erhält durch Verwendung von Radio-Isotopen, kann auch verwendet werden für die Bilderfassung von Strukturen und deren Funktionen. Szintigrafie ist aber nicht geeignet für die Bestimmung der Tiefe eines Ziels in einer Körperregion eines Subjekts.
WO 98/34533 offenbart ein System und ein Verfahren für nicht-invasive biomedizinische Bilderfassung durch Anregung eines in einem Zielgebiet enthaltenen endogen oder exogen eingeführten fluoreszierenden Materials mit eine Fluoreszenz hervorrufendem Licht und durch Messung der Eigenschaften des Fluoreszenzlichts, das als Antwort auf das Anregungslicht emittiert wurde, mit einem Sensor. Die gemessenen Eigenschaften des Fluoreszenzlichts können verwendet werden, um bestimmte Informationen über das Gewebe abzuleiten.
Im Hinblick auf die oben erwähnten Techniken zur Lokalisierung und Bilderfassung eines Ziels in einer Körperregion eines Subjekts gibt es einen Bedarf für Verfahren und Vorrichtungen zum Bestimmen der Tiefe und/oder der Form und/oder der Anzahl der Zellen eines solchen Ziels, ohne Radioaktivität, Strahlung oder eine teure und sperrige Ausrüstung nutzen zu müssen. Die hier offenbarte Erfindung erfüllt diese Anforderungen.
Zusammenfassung der Erfindung:
In einer Hinsicht beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung des Ortes, der Größe und der Anzahl von Zellen einer Lumineszenzlicht emittierenden Quelle in einem Subjekt, die in der Lage ist, Licht zu emittieren in Abwesenheit einer Anregung durch elektromagnetische Strahlung. Bei Durchführung des Verfahrens erhält man zunächst ein erstes gemessenes Lichtintensitätsprofil, konstruiert durch Messung aus einem ersten Blickwinkel, mit einer Fotodetektor-Vorrichtung, von Photonen, die (i) von der Licht emittierenden Quelle stammen, (ii) durch trübes biologisches Gewebe des Subjekts wandern, und (iii) ausgesandt werden von einer ersten Oberflächenregion von Interesse des Subjekts. Das Lichtintensitätsprofil wird gegen eine parameterbasierte biophotonische Funktion abgeglichen zur Abschätzung von Funktionsparametern wie Tiefe und Größe. Die so bestimmten Parameter werden verfeinert unter Verwendung anderer Daten als dem zuerst gemessenen Lichtintensitätsprofil zum Erhalt einer ungefähren Tiefe und Größe der Quelle im Subjekt. Die zusätzlichen Daten können am Subjekt gemessene Daten, Daten aus der Modellanalyse, oder Daten, die sich auf die Wellenlänge der Photonen, die von der Oberfläche des Subjekts emittiert wurden, beziehen, sein. Zum Beispiel:
Das Verfahren beinhaltet typischerweise die Erzeugung einer visuellen 2-D- oder 3-D-Repräsentation der Licht emittierenden Quelle, unter Verwendung der ungefähren Tiefe und Form der Quelle im Subjekt und die Überlagerung der visuellen Repräsentation auf ein 2-D- oder 3-D-Bild des Subjekts.
Die zusätzlichen Daten können aus einer Computer-Simulation der Diffusion von Licht aus einer Licht emittierenden Quelle in trübem Medium erhalten werden. Ein bevorzugter Simulationsansatz geht einher mit (i) der Erzeugung einer Mehrzahl von theoretischen Lichtintensitätsprofilen basierend auf einem Modell der Photonendiffusion von einer leuchtenden Quelle, die sich in einer von einer Mehrzahl von Tiefen befindet und die eine von einer Mehrzahl von Größen und Formen hat, durch ein trübes Medium mit Absorptions- und Streueigenschaften ähnlich denen von biologischem Gewebe, (ii) dem Vergleich der Qualität des Fits zwischen jedem der Mehrzahl von theoretischen Lichtintensitätsprofilen und dem ersten gemessenen Lichtintensitätsprofil, (iii) der Auswahl des theoretischen Lichtintensitätsprofils, welches für das zuerst gemessene Lichtintensitätsprofil sorgt und (iv) dem Erhalt einer ungefähren Tiefe, Form und Helligkeit der Quelle im Subjekt unter Verwendung von Parametern des theoretischen Lichtintensitätsprofils, das unter (iii) ausgewählt wurde. Das Verfahren kann einschließen, dass in einem Photonenstreumodell einer oder mehrere vorbestimmte gewebespezifische Lichtstreukoeffizienten verwendet werden, die sich auf Gewebe beziehen, durch das die Photonen wandern.
In einer anderen allgemeinen Ausführungsform erhält man die zusätzlichen Daten durch Messung der Lichtemission vom Subjekt bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen zwischen ungefähr 400 nm und ungefähr 1000 nm durch Bestimmung der relativen Lichtintensitäten, die bei verschiedenen Wellenlängen gemessen werden, und Vergleichen der bestimmten relativen Lichtintensitäten mit bekannten relativen Signalintensitäten bei verschiedenen Wellenlängen als Funktion der Gewebetiefe. Alternativ wird das Spektrum der Lichtintensitäten über einen ausgewählten Wellenlängenbereich zwischen ungefähr 400 bis 1000 nm gemessen, und das gemessene Spektrum wird verglichen mit einer Mehrzahl von Spektren, die von Licht emittierenden Quellen, die in verschiedenen Tiefen im Gewebe platziert sind, gemessen werden zum Bestimmen der Tiefe der Licht emittierenden Quelle durch Abgleich des gemessenen Spektrums mit den bekannten Spektren.
In verschiedenen Ausführungsformen einer Lichtemissionquelle ist die Quelle ein lumineszierender Teil. Die Licht emittierende Quelle wird dem Subjekt verabreicht und verbindet sich mit einem ausgewählten Ziel oder wird im Subjekt vor der Messung anderweitig angeordnet, und die Licht emittierende Quelle ist ein Licht erzeugendes Protein (zum Beispiel eine Luciferase, etc.), wie z.B. ein Licht erzeugendes Protein, das durch biologische Zellen des Subjekts oder biologische Zellen, die dem Subjekt verabreicht wurden, exprimiert wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt beinhaltet die Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung in der Untersuchung des Ortes und der Größe einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt. Die Vorrichtung beinhaltet ein lichtdichtes Gehäuse, innerhalb dessen Lichtemissionsereignisse von dem Subjekt detektiert werden können, und ein zu dem Gehäuse gehörendes optisches System zur Verwendung bei der Erzeugung eines ersten Lichtintensitätsprofils, das erzeugt wird durch die Messung von Photonen unter einem ersten Blickwinkel innerhalb des Gehäuses, welche (i) aus der Licht emittierenden Quelle stammen (ii) durch trübes biologisches Gewebe des Subjekts wandern und (iii) emittiert werden von einer ersten Oberflächenregion von Interesse des Subjekts. Eine Recheneinheit, die im Betrieb mit dem Photodetektor verbunden ist, wirkt so, dass (i) eine para0meterbasierte biophotonische Funktion an das erste gemessene Lichtintensitätsprofil angepasst wird und (ii) die Parameter der biophotonischen Funktion verfeinert werden unter Verwendung anderer Daten als dem zuerst gemessenen Lichtintensitätsprofil zum Erzeugen einer ungefähren Tiefe und Form der Quelle im Subjekt.
Das optische System beinhaltet vorzugsweise eine verstärkte oder gekühlte ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) und eine Linse zur Fokussierung von Licht auf das CCD. Das optische System kann auf eine solche Weise konfiguriert sein, dass es Photonen erfasst, die von einer Mehrzahl von verschiedenen ausgewählten Oberflächengebieten von Interesse des Subjekts emittiert werden. Das System kann einen oder mehrere Filter zum Durchlassen von Photonen in verschiedenen ausgewählten Wellenlängenbereichen beinhalten, zum Beispiel oberhalb und unterhalb von 600nm.
Die Recheneinheit kann eine Datendatei der biophotonischen Modellfunktionen enthalten, die Licht emittierende Quellen von verschiedenen Größen in verschiedenen Tiefen repräsentiert zum Kurvenabgleich mit dem ersten räumlichen Profil.
Wo das optische System Filter zur Wellenlängendiskriminierung beinhaltet, ist die Recheneinheit in der Lage mindestens eine der Parameter-Verfeinerungsoperationen durchzuführen:

(i) Bestimmen der relativen Lichtintensitäten, die bei verschiedenen Wellenlängen gemessen wurden, und Vergleichen der bestimmten relativen Lichtintensitäten mit bekannten oder berechneten Signalintensitäten bei den verschiedenen Wellenlängen als Funktion der Gewebetiefe; und
(ii) Vergleichen des gemessenen Spektrums mit einer Mehrzahl von gemessenen Spektren von Licht emittierenden Quellen, die in verschiedenen Tiefen innerhalb des Gewebes platziert wurden, und Bestimmen der Tiefe der Licht emittierenden Quelle durch Abgleichen des gemessenen Spektrums mit den bekannten Spektren.

In einer anderen Ausführungsform funktioniert die Recheneinheit so, dass Sie das Intensitätsmusterbild in einen einzigen Intensitätswert mittelt, und weiterhin die Quellengröße be stimmt durch integrierte Lichtintensitätswerte, die als Funktion von einer Licht emittierenden Quelle von einer bestimmten Größe und Form erzeugt werden.
Die Recheneinheit kann eine Datenbank besitzen, die eine Mehrzahl von theoretischen Lichtintensitätsprofilen enthält, basierend auf einem Modell der Photonendiffusion von einer Licht emittierenden Quelle, die in einer von einer Mehrzahl von Tiefen angeordnet ist und die eine von einer Mehrzahl von Größen und Formen aufweist, durch ein trübes Medium, das Absorptions- und Streueigenschaften besitzt ähnlich denen von biologischem Gewebe. Hier funktioniert die Recheneinheit so, dass (i) die Qualität des Fits jedes einzelnen der Mehrzahl der theoretischen Lichtintensitätsprofile mit dem zuerst gemessenen Lichtintensitätsprofil verglichen wird, (ii) das theoretische Lichtintensitätsprofil, welches den besten Fit an das zuerst gemessene Lichtintensitätsprofil liefert, ausgewählt wird, und (iii) eine ungefähre Tiefe und Form der Quelle im Subjekt erhalten wird unter Verwendung von Parametern des theoretischen Lichtintensitätsprofils, das in (ii) ausgewählt wurde.
Zusätzlich funktioniert die Recheneinheit so, dass sie eine visuelle zwei- oder dreidimensionale Repräsentation der Licht emittierenden Quelle erzeugt unter Verwendung der ungefähren Tiefe und Form der Quelle im Subjekt, und die visuelle Repräsentation einem zwei- oder dreidimensionalen Bild des Subjekts überlagert.
Unter einem anderen Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Tiefe einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt. In Anwendung dieses Verfahrens wird die Lichtemissions-Intensität von dem Subjekt bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen zwischen ungefähr 400 und un gefähr 1000 nm gemessen. Die Tiefe der Licht emittierenden Quelle wird bestimmt unter Verwendung der gemessenen Lichtintensitäten und von Informationen bezogen auf die optischen Eigenschaften des Gewebes des Subjektes, zum Beispiel Koeffizienten der Abschwächung und der Diffusion im Subjekt.
Informationen, die sich auf die optischen Eigenschaften beziehen, zum Beispiel die Koeffizienten der Abschwächung und Diffusion im Subjekt, können erhalten werden durch direkte Messung der Koeffizienten in Material, das gleich oder ähnlich jenem des Subjektes ist.
Alternativ kann die Information über die optischen Eigenschaften indirekt erhalten werden durch die Bestimmung der Lichtintensitäten von einer Licht emittierenden Quelle bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen, die in jeder einer Mehrzahl von Tiefen in einem Gewebe oder Material, das jenem des Subjekts entspricht, angeordnet ist. Die gewünschte Tiefenbestimmung wird dann durch Anpassung der gemessenen Lichtintensitäten an die Lichtintensitäten, die bei jeder der Mehrzahl von Tiefen bestimmt wurden, durchgeführt.
Im letzten Ansatz kann das spektrale Profil der Lichtintensitäten von der Licht emittierenden Quelle verglichen (abgeglichen) werden mit jedem einer Mehrzahl von Profilen der Lichtintensitäten von einer Licht emittierenden Quelle in jeder einer Mehrzahl von Tiefen.
Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden vollständiger offensichtlich werden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
1A ist eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung, die gemäß der Erfindung ausgebildet ist zur Verwendung bei der Untersuchung der Lage und der Größe einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt;
1B veranschaulicht Eigenschaften der Vorrichtung in 1A in schematischer Form;
2 ist ein Flussdiagramm der allgemeinen Schritte, die bei der Anwendung des Verfahrens der Erfindung ausgeführt werden können;
3A ist ein Oberflächen-Lichtintensitätsbild von einer Licht emittierenden Quelle in einem tierischen Subjekt.
3B ist ein Lichtemissionsprofil von dem tierischen Subjekts in 3A, das die Kurvenanpassung zwischen dem gemessenen Emissionsprofil (durchgezogene Linie) und einem Lichtemissionsprofil, das anhand eines Diffusionmodells berechnet wurde, zeigt;
4A und 4B sind Darstellungen der Emissionsspektren von bakterieller Luziferase in vitro (durchgezogene Linie) und in vivo (gestrichelte Linien) in verschiedenen Tiefen in einem Mäuseoberschenkel, wie gezeigt, wobei die Darstellung in 4B so skaliert wurde, dass die Maximalintensität in vivo im Bereich zwischen 600-700 nm gezeigt wird;
5 zeigt verschiedene Orte in einem Tier, an welchen Transmissionspektren erhalten wurden.
6A und 6B zeigen Transmissionspektren durch ein lebendes Versuchstier an den verschiedenen Tierorten, die in 5 gezeigt sind;
6C veranschaulicht eine Doppel-Photometerkugel-Vorrichtung, die nützlich zur Messung von optischen Eigenschaften einer Probe, zum Beispiel Gewebe, ist;
6D veranschaulicht den experimentellen Aufbau einer Lichtleitersonde, die nützlich zur Messung von optischen Eigenschaften von Gewebe in vivo ist;
7A und 7B sind Plots der Absorptionskoeffizienten;
7C und 7D sind Plots der isotropen oder reduzierten Streukoeffizienten von verschiedenen Geweben als Funktion der Wellenlänge;
8A veranschaulicht Komponenten der Vorrichtung, die zur absoluten Kalibrationsbestimmung verwendet werden;
8B veranschaulicht, wie die absolute Kalibrierung die Bestimmung der Zellenzahl in einem tierischen Subjekt ermöglicht;
9A und 9B veranschaulichen, wie Photonen durch Gewebe diffundieren (9A) und wie Photonen, die durch die Oberfläche des Gewebes diffundieren, bei der Erfindung eingefangen werden (9B);
10A zeigt eine Monte-Carlo-Simulation, die ein Photon bei einem „random walk" durch trübes Gewebe verfolgt;
10B veranschaulicht ein berechnetes räumliches Intensitätsprofil, das für eine Lichtquelle in 4 mm Tiefe aus dem Diffusionsmodell (durchgezogene Linie) und mit Monte-Carlo Simulationen („+"-Symbole) berechnet wurde;
11A und 11B sind aus dem Diffusionmodell berechnete Plots, die eine Spitzenintensität (11A) und eine Halbwertsbreite (FWHM) (10B) als Funktion der Quellentiefe zeigen;
12A ist ein Oberflächenlichtintensitätsbild von einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt und zeigt die horizontalen und vertikalen Profillinien, entlang welcher Lichtintensitätsprofile gemessen wurden.
12B und 12C sind Lichtintensitätsprofile, die entlang der horizontalen und vertikalen Profillinien, die in 12A gezeigt sind, gemessen wurden;
13A zeigt spektrale Bildplots von Luziferase Licht emittierenden Quellen, die in vitro (durchgezogene Linie) erhalten wurden von dem subkutanen Ort, der in 13B gezeigt ist (Quadrate); und von Orten der Lunge, die in 13C zu sehen sind (Diamanten).
13B und 13C sind Oberflächenlichtintensitätsbilder von Tieren mit einer subkutanen Lichtemissionsquelle (13B) und Licht emittierenden Quellen in den Lungen (13C).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Wenn nichts Anderes vermerkt ist, sind die unten stehenden Begriffe wie folgt definiert:
Eine „biophotonische Funktion" ist eine mathematische Funktion, die eine messbare photonische Ausgabe, wie zum Beispiel ein Lichtemissionsprofil, die spektrale Intensitätsverteilung oder die integrierte Lichtintensität bezüglich Photonenquellenvariablen, wie zum Beispiel Quellentiefe, -größe und -form, Anzahl der lichtemittierenden Zellen, wellenlängenabhängiger Streu- und Absorptionskoeffizienten für spezifische Typen von Gewebe und spektrale Charakteristika des Lichtemitters, beschreibt. Die photonische Funktion kann zum Beispiel auf einem Photonen-Diffusionsmodell basieren, wie unten diskutiert, auf einer Monte-Carlo-Simulation oder auf einer Finite-Elemente-Analyse.
„Trübes Gewebe" ist nichttransparentes Gewebe in einem Subjekt, das sowohl Lichtstreuungs- als auch Lichtabsorptionseigenschaften aufweist.
Die „Zielregion" bezieht sich auf ein inneres, unter der Oberfläche liegendes Gebiet in einem Subjekt, wie zum Beispiel ein unter der Oberfläche liegendes Gewebe oder Organ, einen massiven Tumor oder ein Infektionsgebiet, das (i) innerhalb des Subjekts lokalisiert ist, (ii) von der Oberflächenregion des Subjekts durch trübes Gewebe getrennt ist, und (iii) vorzugsweise zumindest ein unterscheidbares Merkmal besitzt, wie zum Beispiel ein gewebe- oder organspezifisches Antigen, Gen oder Genprodukt, entweder als mRNA oder exprimiertes Protein, ein Produkt, das aus einer Aktivierung, Deaktivierung oder Regulierung einer Zelle, eines Organs oder eines Gewebes resultiert.
Die Licht emittierende Quelle bezieht sich auf eine Quelle der Lichtemission im Zielgebiet. Die Quelle kann selbst sichtbares Licht emittieren, wie zum Beispiel, wenn das Zielgewebe genetisch modifiziert wurde, um ein rekombinantes Licht emittierendes Protein zu erzeugen, wenn spezifische Gene durch einige Mittel der Aktivierung exprimiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden verschiedene Typen Licht erzeugender Proteine, wie zum Beispiel bio-lumineszierende Proteine (z.B. Luziferasen) verwendet. Exemplarische Licht emittierende Quellen beinhalten prokariotische und eukariotische Zellen, die mit einem Licht erzeugenden Protein verändert wurden und dem tierischen Subjekt verabreicht wurden, als auch Licht produzierende Zellen, die ein intrinsischer Teil eines Tieres sind, das transgen gemacht wurde für ein Licht erzeugendes Reportergen.
Alternativ kann dem Subjekt eine Zusammensetzung verabreicht werden, die effektiv ist zu bewirken, dass ein Ziel Licht emittiert, und der es gestattet wird, sich am Zielort anzusiedeln, an dem die Zusammensetzung dann Licht emittieren wird oder einen anderen Teil in oder neben dem Ziel veranlassen wird, Licht zu emittieren. Zum Beispiel kann die verabreichte Zusammensetzung eine Verbindung sein, die Zellen in oder neben dem Ziel aktiviert und wiederum solche Zellen veranlasst, Licht zu emittieren, und infolgedessen sind die lokalisierten Zellen das Ziel innerhalb der Körperregion des Subjekts. In noch anderen Ausführungsformen werden dem Subjekt infektiöse Zellen verabreicht und der Fortschritt und die Örtlichkeit der Krankheit werden bestimmt. Das Ziel ist in dieser Ausführungsform ein Cluster von Zellen an einem bestimmten Punkt, die eine Lage in einer Körperregion des Subjekts haben. In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann eine Körperregion mehrfa che Ziele haben, und ein Subjekt kann mehrfache Körperregionen haben, wobei jede Körperregion potenziell ein Ziel aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung hat jede Licht emittierende Quelle unter bekannten Lichtemissionsbedingungen ein bekanntes Emissionsspektrum. Jedes Emissionspektrum ist vorzugsweise konstant während des Detektionsschrittes. Insbesondere bleibt die relative Intensität der Lichtemission bei jeder Wellenlänge des Lichts relativ zu der Intensität der Lichtemission bei allen anderen Wellenlängen des Lichts innerhalb des Emissionspektrums der Licht emittierenden Quelle, wenn die Gesamtintensität des Spektrums sich ändert. Einige Ausführungsformen der Erfindung erfordern minimal mindestens zwei unterscheidbare Bereiche von Wellenlängen des emittierten Lichts. Bevorzugter erfordern besondere Ausführungsformen der Erfindung, dass jeder Bereich von Lichtwellenlängen, wenn sie durch eine ausgewählte Körperregion wandern, sich gegenüber anderen Bereichen unterschiedlich verhält als Funktion des Abstands oder der Tiefe, über die solches Licht durch die Körperregion wandert. Zum Beispiel wird die Intensität eines ersten Bereiches von Wellenlängen für jeden Zentimeter einer Körperregion, durch die das Licht wandert, halbiert, wohingegen ein zweiter Bereich von Wellenlängen von Licht um drei Viertel für jeden Zentimeter einer Körperregion verringert wird, durch die das Licht wandert. Die Intensität des Lichtes bei beiden Bereichen von Wellenlängen, wobei jeder Bereich die gleiche Intensität hat, wird sich nach dem Durchgang durch einen Zentimeter Gewebe im ersten Bereich zur Hälfte verringern, und im zweiten Bereich um drei Viertel. Durch Vergleichen des resultierenden 2:1-Verhältnisses von Intensitäten mit dem anfänglichen 1:1-Verhältnis der Intensitäten bei der Gewebetiefe Null kann eine Bestimmung gemacht werden, dass das Licht einen Zentimeter durch das Gewebe gewandert ist.
Die Erfindung kann ausgeführt werden unter Verwendung verschiedener Licht emittierender Quellen wie zum Beispiel verschiedener Luziferase-Enzyme. Zum Beispiel wurde die Lichtemission von „blauer" bakterieller Luziferase (Photorhabdus luminescens), die auf Agar exprimiert war, mit einem Spektrometer analysiert, das ein Spektrum lieferte, welches bei ungefähr 485 nm seine Mitte hatte. Eine „grüne" Glühwürmchen-Luziferase (Photinus pyralis), die in PC-3M Zellen in PBS-Lösung exprimiert war, emittierte Licht, das ein Spektrum zeigte, welches bei ungefähr 570 nm seine Mitte hatte. Eine „rote" Luziferase, die in PC-3M Zellen exprimiert war, welche in PBS-Lösung suspendiert waren, zeigte ein Spektrum, welches um ungefähr 620 nm seine Mitte hatte.
II Vorrichtung und Verfahren
1A ist eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung 20, die zur Untersuchung der Lage und der Größe einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt verwendet werden kann entsprechend dieser Erfindung. Die Vorrichtung beinhaltet im Allgemeinen ein lichtdichtes Gehäuse oder eine Kammer 22, innerhalb derer Lichtemissions-Ereignisse von dem Subjekt erfasst werden können. Der lichtdichte Behälter 22 kann ausgebildet werden wie in der mitbesessenem WO 200163247 beschrieben. Kurz gesagt ist die Kammer definiert durch Rück- und Seitenwände, wie wie Seitenwand 21, und hat eine Frontöffnung (nicht gezeigt), die geöffnet werden kann, um Zugang zum Inneren der Kammer zu liefern, und geschlossen, um einen lichtdichten Verschluss zu liefern. Obwohl der lichtdichte Behälter 22 für kleine Tiere entworfen wurde, kann die Methode auch auf größere Säugetiere, inbegriffen Menschen, angewandt werden.
In der Kammer enthalten ist eine Plattform 24, auf der das Subjekt platziert wird und vorzugsweise immobilisiert wird während der Lichtemissions-Detektion. Obwohl viele der Beispiele, die hier beschrieben werden, mit einem kleinen Säugetier-artigen Subjekt zu tun haben, typischerweise einer Maus oder einer Ratte, ist es gut erkennbar, dass die gleichen Prinzipien und Verfahren auch auf andere Tiere und auch auf menschliche Subjekte anwendbar sind, unter Verwendung einer geeigneten Hochskalierung bei der Kammergröße und wo nötig, geeigneter Erhöhungen der Größe und Anzahl der Licht-Emitter im Zielgebiet. Die Plattform in der gezeigten Vorrichtung ist so entworfen, das sie auf eine ausgewählte vertikale Position innerhalb der Kammer angehoben und abgesenkt werden kann durch einen üblichen Schneckenschraubenmechansimus, der allgemein unter 26 gezeigt ist, und unter Anwenderkontrolle. Die Plattformposition innerhalb der Kammer kann durch irgendeine einer Anzahl bekannter Kontrollvorrichtungen überwacht werden, die keine sichtbaren Lichtsignale erfordern.
Die Beobachtungsoptik beinhaltet zwei allgemeine Komponenten. Die erste ist eine Linsenanordnung 28, die dazu dient, Lichtemissionsereignisse von der Oberfläche des Subjekts auf den Erfassungsschirm eines Photodetektors 32 zu fokussieren, was typischerweise ein Photodetektor-Pixelfeld einer ladungsgekoppelten Vorrichtung ist, das in einem gekühlten Zustand betrieben werden kann zum Minimieren des intrinsischen Rauschniveaus. Der Aufbau der Linsenanordnung und ihre optische Anbindung an den Detektor sind bekannt. Ein bevorzugter CCD ist ein Modell 620-CCD, der von Spectral Instruments kommerziell erhältlich ist.
Die zweite und optionale Komponente des optischen Systems ist ein Wellenlängenfilterrad 30, das eine Anzahl von optischen Bandpassfiltern enthält, die so ausgelegt sind, dass sie die Lichttransmission in allen Bereichen bis auf einen ausgewählten Bereich von Wellenlängen des sichtbaren Lichts blockieren. Ein Standardaufbau beinhaltet 3 Filter; einen Kurzpassfilter 30a für Wellenlängen von weniger als 510 nm (Blaulichtfilter), einen Mittelpassfilter 30b mit einem Bandpass im 500-570 nm-Bereich (Grünlichtfilter) und einen Langpassfilter für Wellenlängen, die größer als 590 nm sind (Rotlichtfilter). In einigen Anwendungen können Filter einen präziseren Bandpass liefern, zum Beispiel alle 20 nm. Die soeben beschriebene Beobachtungsoptik und der Detektor werden hierin auch, zusammengefasst, als optisches System bezeichnet.
Das Gerät beinhaltet auch eine Steuereinheit 34. Verschiedene benutzergesteuerte Einstellungen wie z.B. die Plattformhöhe, die Orientierung und die Translationsposition, der Bandpassfilter und der Detektormodus werden durch eine Steuereingabetafel 36 in der Vorrichtung vorgenommen.
1B zeigt eine eher schematische Darstellung des Gerätes 20, das hier gezeigt ist in einem Maßstab zur Verwendung bei der bildlichen Erfassung eines kleinen Säugetier-artigen Subjekts, wie beispielsweise einer Maus 38. Die Linsenanordnung ist hier als eine einzelne Linse 28 dargestellt, das Filterrad bei 30 und ein CCD-Detektor bei 32. Die Detektor-Ausgabe wird einer Recheneinheit 40 in der Steuereinheits-Recheneinheit 34 zugeführt, die einen Prozessor 40 und eine Speichereinheit 42 für Daten-Dateien enthält. Der Inhalt der Daten-Dateien und die Funktion der Recheneinheit als Antwort auf Licht-Detektionssignale der Bauformen von dem Detektor 32 werden unterhalb beschrieben werden. Die Kontroll-Einheit ist wirkend mit einer Anzeige/Ausgabe-Vorrichtung 44 verbunden, wie beispielsweise einem Computerbildschirm, zum Darstellen von Informationen und Bildern für den Anwender.
Die Funktion der Recheneinheit kann aus dem Verfahren der Erfindung, das mit der Vorrichtung durchgeführt wird, verstanden werden, welches mit Bezug auf 2 zusammengefasst wird und weiter unten detailliert beschrieben wird. Der erste Schritt in dem Verfahren ist der Erhalt eines ersten gemessenen Lichtintensitätsprofils. Dies wird getan, indem zunächst die Licht emittierende Quelle innerhalb eines Subjekts angeordnet wird. Dies kann, wie oben erwähnt, auf eine Vielzahl von Arten bewirkt werden, eingeschlossen die Einführung eines Gens in das Subjekt, das wirksam zur Produktion eines Licht emittierenden Proteins, wie z.B. Luziferase, im Zielgebiet ist, gemäß bekannten Verfahren, zum Beispiel wie in den mit-besessenen WO 01/18225, WO 00/54581, WO 00/36106, WO 97/40381 beschrieben.
Das so vorbereitete Subjekt wird in die lichtdichte Kammer gesetzt und die Lichtemission von der Subjektoberfläche, die aus Lichtemissions-Ereignissen im Zielgebiet stammt, wird gemessen, digitalisiert und in die Recheneinheit eingebracht, wie bei 52 in 2. Die Recheneinheit verwendet diese Daten, um ein räumliches Profil der Lichtemission zu generieren, wie bei 54. Dieses Profil könnte entlang einer ausgewählten Zeile und einer ausgewählten Spalte der Detektorelemente genommen werden, die Profile entlang x (horizontal) und y (vertikal) Achsen in einer Ebene parallel zur Plattform in 1A repräsentieren. So gesehen ist das Profil ein Diagramm von gemessenen Intensitätswerten entlang einer ausgewählten Zeile und Spalte von Detektorelementen und repräsentiert die Verteilung der Lichtintensitätswerte, die von der Subjektoberfläche auf den Detektor-Array fokussiert werden. Von einem Subjekt gemessene exemplarische Lichtintensitätswerte werden als durchgezogene Linien in 3B gezeigt. 3A zeigt die Emissions-Konturen und 3B zeigt das vertikale Profil, wie sie bei Detektor-pixeln bestimmt werden, die diesen Positionen entsprechen.
Nun zu 2 zurückkehrend werden das räumliche Profil oder die Profile, die so erhalten wurden, in Übereinstimmung gebracht oder gefittet mit Profilen, die in einer Datenbank 58 von parameterbasierten photonischen Funktionen gespeichert sind, welche entweder empirische Funktionen sind, die an Licht emittierenden Quellen bekannter Größe und Tiefe gemessen wurden oder aus Photonen-Diffusionsmodellen unter Verwendung von Tiefen- und Größen-Parametern, und optional anderen Parametern, wie weiter unten beschrieben werden wird, berechnet wurden.
Aus der optimalen Kurvenanpassung kann das Programm eine anfänglich abgeschätzte Bestimmung von Tiefe und/oder Größe und/oder Helligkeit, vorzugsweise aller drei, der Licht emittierende Quelle machen. Gemäß einer Eigenschaft der Erfindung wird das Verfahren nun so durchgeführt, dass die Tiefen- und Größenbestimmungen verfeinert werden durch zusätzliche Daten, die in Form von zusätzlichen Lichtintensitätsdaten vorliegen können, und/oder zusätzliche Modelldaten. Zum Beispiel, und wie in 2 gezeigt, können die Daten folgender Form sein:

(a) Zweitansichtsdaten, wie bei 62, also Lichtintensitätsdaten, typischerweise Raumprofildaten, erhalten durch Ansicht des Subjekts unter einem zweiten Sichtwinkel. Typischerweise ist das Subjekt im Gerät geneigt bezüglich des optischen Systems, so dass die Lichtemission aus einem zweiten Gebiet der Subjekt-Oberfläche erhalten wird;
(b) Spektrale Daten, also Lichtintensitätsdaten, wie bei 64, die in einem oder mehreren Bandpassbereichen erhalten wurden, zum Beispiel in einem Blaulicht-, Grünlicht- oder Rotlicht-Spektralbereich;
(c) Transmissiondaten, wie bei 66, also vorbestimmte Lichtintensitätswerte, typischerweise als Funktion der Wellenlänge an ausgewählten Orten in einem Subjekt, die das Subjekt von Interesse annähern;
(d) Gewebe-Eigenschaftsdaten, wie bei 68, also vorbestimmte Werte von Gewebeparametern, wie z.B. dem reduzierten Streukoeffizienten μ'_s, dem Absorptionskoeffizienten μ_a oder dem effektiven Koeffizienten μ_eff bezogen auf das Subjektgewebe, durch welches das Licht diffundiert. Diese Daten werden zum Beispiel verwendet, um die räumlichen Profilkurven, die durch ein Diffusionsmodell erzeugt wurden, zu verfeinern;
(e) Simulationsdaten, wie bei 70, also vorbestimmte Lichtintensitätswerte, typischerweise räumliche Profildaten, erhalten durch Platzierung einer Lichtquelle bekannter Intensität und Größe an ausgewählten Orten in einem Modell, das das Subjekt-Zielgebiet und die benachbarte Oberfläche repräsentiert, oder in einem tatsächlichen Subjekt, das dem Subjekt nahe kommt; und
(f) Gesamtintensitätsdaten, wie bei 72, also die gesamte Lichtintensität aufsummiert oder integiert über ein gesamtes räumliches Profil oder einen gesamten Detektor Array. Das Programm, das auf der Rechenvorrichtung läuft, erhält die zusätzliche Information bei 60, und verwendet die Information zum Verfeinern der Tiefen- und Größenbestimmung der Licht emittierenden Quelle bei 74, wie später betrachtet wird. Schließlich wird die verfeinerte Bestimmung der Quellentiefe, -größe, und optional -gestalt und der Anzahl der Zellen in der Licht emittierenden Quelle dem Benutzer dargestellt, entweder in Form von Daten und/oder einem oder mehreren Subjektbildern, die den Ort und die Intensität der Licht emittierenden Quelle zeigen.
(g) Absolut kalibrierte Lichtintensität, wie bei 73. Die Kalibrierung auf die absolute Intensität erlaubt es einem, Anzahl/sec/Pixel in dem CCD nach Photonen/s/cm2/sr (sr=steradians) zu konvertieren. 8A veranschaulicht eine optische Anordnung 100, die bei dem Kalibrationsverfahren verwendet wird. Die Anordnung beinhaltet, zusätzlich zu einem CCD-Detektor 102, die Linse 104 (die eine Linsenanordnung repräsentiert, siehe oben), einen Bandpass-Filter 106 und eine Schwachlicht-Photometerkugel, wie eine Kugel der OL-Serie 425 die von Optronic Laboratories erhältlich ist, die als eine Quelle von bekannter Lichtintensität wirkt. Die bekannte Strahlung von der Kugel, gemessen in Photonen/sec/cm2/sr erlaubt es einem, den Kalibrationsfaktor zu bestimmen, der die beiden Zahlen in Beziehung setzt.

8B veranschaulicht, wie die absolute gemessene Intensität verwendet wird zum Bestimmen der Gesamtzahl von Zellen in einer Licht emittierenden Quelle. Es wird angenommen, dass jede Zelle einen Photonenfluss Φ_c Photonen/sec/Zelle produzieren wird. Die Strahlung von einer Licht emittierenden Quelle 110 in einem Subjekt 112, wie gemessen mit dem Detektor 102, misst die Anzahl der Photonen/s/cm2/sr. Die gemessene Strahlung wird dann integriert über ein Gebiet von Interesse zum Konvertieren in einen Quellenfluss Φ_s Photonen/sec. Aus den bekannten Flusswerten kann die Anzahl der Zellen in der Licht emittierenden Quelle leicht bestimmt werden zu Φ_s/Φ_c.
III. Lichtemissionsdaten und -parameter
Dieser Abschnitt betrachtet verschiedene Typen von Lichtemissionsdaten die bei der Ausführung der Erfindung gesammelt werden können, und diskutiert, wie die Daten in der Modellierung der Photonen-Diffusion verwendet werden können und/oder zur Bestimmung der Tiefe oder Größe einer Licht emittierenden Quelle basierend auf einer Kurvenanpassung mit einer Modell-Diffusionskurve.
Räumliches Lichtintensitätsprofil.
Die grundlegenden Lichtemissionsdaten, die bestimmt werden, sind ein räumliches Lichtintensitätsprofil, das oben beschrieben wurde, mit Bezug auf 3B. Ein gemessenes räumliches Lichtintensitätsprofil zeigt die räumliche Verteilung der Lichtintensität, die von dem Oberflächen-Gebiet eines Subjekts emittiert wird. Das räumliche Lichtintensitätsprofil kann entlang einer einzelnen Linie erhalten werden, entlang zwei oder mehr Linien (zum Beispiel entlang der x- und y-Richtung bezüglich der Plattform, die das Subjekt trägt). Die gesamte 2D-Oberflächenverteilung des Lichtes kann ebenfalls verwendet werden. Ein modelliertes räumliches Profil repräsentiert die vorhergesagte räumliche Lichtintensitätsverteilung, die aus einem Modell der Photonendiffusion durch trübes Gewebe berechnet wurde. Durch Abgleich eines gemessenen Profils mit einem modellierten Profil kann eine ungefähre Tiefe und/oder Größe der Licht emittierenden Quelle bestimmt werden.
Gesamtlichtintensität.
Die Gesamtlichtintensität ist die gesamte Lichtintensität, die über sämtliche Detektorelemente im Detektor summiert oder integriert wurde. Die Gesamtlichtintensität kann verwendet werden als weitere Einschränkung des Fit-Modells, das verwendet wird zum Bestimmen von Quelle, Ort und Helligkeit.
Absolut kalibrierte Lichtintensität.
Wie oben beschrieben mit Bezug auf 8B, kann der absolute Lichtintensitätsfluss verwendet werden zum Messen des Gesamtflusses von der Licht emittierenden Quelle. Unter der Annahme, dass diese Quelle aus Zellen besteht, die jeweils einen mittleren Zellenfluss Φ_c emittieren, kann die Gesamtzahl der Licht emittierenden Zellen bestimmt werden, aus der die Quelle besteht. Diese Bestimmung kann wiederum verwendet werden zur Verfeinerung der Bestimmung der Gesamtquellenmasse oder des Gesamtquellenvolumens, basierend auf einem bekannten oder geschätzten Zellenmassenverhältnis für die Gewebequelle.
Spektrale Daten.
sSpektrale Daten sind Lichtintensitätsdaten, die in bestimmten Wellenlängenbereichen gesammelt wurden, zum Beispiel den oben genannten Blaulicht-, Grünlicht- und Rotlicht-Wellenlängenbereichen. Weil Licht vom Subjektgewebe vorzugsweise bei kürzeren Wellenlängen absorbiert wird, und insbesondere durch Hämoglobin im Subjektgewebe, können die relativen Intensitäten des Lichts bei verschiedenen Wellenlängen eine Information über die Quellentiefe liefern und können verwendet werden zum Erzeugen von verfeinerten wellenlängenabhängigen räumlichen Profilen basierend auf wellenlängenabhängigen Gewebe-Streuungs- und -absorptionskoeffizienten.
4A und 4B stellen den differenziellen Effekt, den der Abstand oder die Tiefe auf das Licht hat, das bei verschiedenen Wellenlängen oder Bereichen von Wellenlängen durch das Gewebe der Körperregion wandert, dar. Das Diagramm zeigt eine zunehmende Lichtintensität auf der y-Achse und zunehmende Lichtwellenlänge auf der x-Achse. Die durchgezogene Linie in 4A repräsentiert das in vitro Emissions-Spektrum der Licht emittierenden Quelle, das mit einem Tiefe-Null-Emissionsspektrum korreliert, das eine breite einzige Spitze mit der Mitte bei ungefähr 495 nm aufweist. Die breite gestrichelte Linie repräsentiert das Emissionsspektrum der Licht emittierenden Quelle, nachdem es durch etwa einen Millimeter Gewebe (in vivo) gedrungen ist. Bei ungefähr 600 nm entwickelt das Ein-Millimeter-Tiefe-Emissionsspektrum eine kleine Spitze, während die ursprünglich große Spitze bei etwa 495 nm anfängt, sich in der relativen Intensität zu verkleinern. Die mittlere gestrichelte Linie repräsentiert das Emissionsspektrum der Licht emittierenden Quelle, nachdem es durch ungefähr zwei Millimeter Gewebe (in vivo) gedrungen ist. Die Spitze bei 495 nm wird in der Intensität geringer, während die 600 nm-Spitze zunimmt und stärker hervortritt. Schließlich repräsentiert die gepunktete Linie das Emissionsspektrum der Licht emittierenden Quelle, nachdem es durch ungefähr vier Millimeter Gewebe (in vivo) gedrungen ist, wobei die 495 nm-Spitze sich weiter verringert hat.
4B repräsentiert das Emissionsspektrum bei vier Millimeter Tiefe des Gewebes, skaliert gegen das Null-Gewebetiefe-Emissionsspektrum. Die 600 nm-Spitze überragt die zuvor herausragende 495 nm-Spitze. In diesem Beispiel ist es das Verhältnis der 600 nm-Spitze zur 495 nm-Spitze, das Informationen über die Tiefe der Licht emittierenden Quelle liefert.
Bevorzugte Verfahren dieser Erfindung setzen selbstskalierende Berechnungen ein, so dass die Tiefe der Licht e mittierenden Quelle unabhängig von ihrer Gesamtintensität bestimmt werden kann. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Funktionen aufgestellt, die die Verhältnisse der zwei oder mehr Wellenlängenbereiche benutzen, wobei jeder Bereich von Wellenlängen durch Gewebe in einer Körperregion mit unterschiedlicher Rate wandert als Funktion der Tiefe des Ziels von der Oberfläche der Körperregion.
Transmission durch den Körper:
Die Transmission durch den Körper wird gemessen, indem eine Lichtquelle bekannter Intensität an einem ausgewählten Ort gegen ein Subjekt oder innerhalb eines Subjekts platziert wird, und indem die Lichtintensität, die durch das Subjekt weitergeleitet wird, auf mehrfachen Oberflächen gemessen wird. Die Transmission wird eine starke spektrale Komponente haben aufgrund der starken spektralen Abhängigkeit der Streu- und Absorptionskoeffizienten von verschiedenen Geweben (siehe unten). Typischerweise werden Transmissionwerte vorbestimmt durch Verwendung eines Modell-Subjekts, durch Messung der Gesamttransmission an verschiedenen ausgewählten Orten und in jedem einer Anzahl von spektralen Bereichen.
5 zeigt eine Draufsicht eines Subjektes mit einer Mehrzahl von Körperregionen, die mit Nummern 1-16 bezeichnet sind. In diesem Beispiel ist das Subjekt eine immobilisierte Maus, und jede Körperregion korrespondiert mit vorbestimmten Gebieten von Interesse. Vor den Tiefenbestimmungen bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung, wird das Subjekt optisch analysiert zum Entwickeln einer Daten-Datei der optischen Eigenschaften jeder Körperregion. In diesem Beispiel wird jede Körperregion zwischen eine spektrale Lichtquelle und einen spektralen Detektor platziert. Licht-Transmissionsspektren werden für jede Körperregion erhalten. Das Ergebnis ist analog zur Platzierung jeder Körperregion in eine Spektralphotometer-Küvette und Messung des spektralen Profils jeder Region bei verschiedenen Wellenlängen und Wellenlängenbereichen zum Erzeugen einer Daten-Datei davon, wie Licht durch verschiedene Körperregionen und die Gewebe innerhalb dieser Regionen weitergeleitet wird. Die Vorrichtung in 1 kann verwendet werden, um ähnliche Daten für bestimmte Wellenlängenbereiche zu entwickeln, vorausgesetzt die Vorrichtung ist angepasst, das Subjekt bei jeder getesteten Körperregion bezüglich des Detektors zu durchleuchten. Dadurch wird aus der Vorrichtung von 1 im Wesentlichen ein Ganztier-Spektralphotometer.
6A und 6B zeigen empirische spektrale Daten, die in der gerade oben beschriebenen Spektralanalyse gesammelt wurden. Wie weiter unten detaillierter beschrieben wird, können diese Daten entweder als ganze Spektren oder als bestimmte Bereiche innerhalb jedes Spektrums verwendet werden zum Erzeugen der Daten-Dateien zum Vergleich mit erfassten Intensitätsinformationen oder zur Entwicklung von Funktionen zur Berechnung der Zieltiefe.
In einem detaillierteren Ansatz liefert die Vorrichtung einen Ganzkörper-Scanner zum Scannen eines gesamten Subjekts oder von Teilen desselben, der weiterhin einen scannenden Zweifarbenlaser aufweist zum Scannen des Körpers eines Subjekts. Der Scanner bewegt sich durch ein Bogenlaserlicht von mindestens zwei Farben, entweder simultan oder nacheinander. Wenn das Laserlicht nach oben strahlt, durchdringt es den Körper eines Subjekts, der innerhalb einer Rotationsröhre platziert ist. Der der Laser-Lichtquelle gegenüber platzierte Detektor ist angepasst, das Laserlicht zu empfangen und zu messen, während es sich durch seinen Bogenpfad bewegt.
Optische Eigenschaften des Gewebes. Es gibt zwei wichtige optische Eigenschaften des Subjektgewebes, die bei der Photonen-Diffusionsmodellierung verwendet werden. Die erste ist der Absorptionskoeffizient μ_a des Gewebes, der in Bezug steht zum Anteil des einfallenden Lichts, der pro Einheitsweglänge absorbiert wird. Wie in 7A und 7B zu sehen ist, die die Absorptionskoeffizienten für eine Vielzahl von Gewebetypen über das sichtbare Spektrum auftragen, hängt der Absorptionskoeffizient stark von der Natur des Gewebes und der Wellenlänge des Lichts ab, wobei jedes Gewebe eine Absorptionsspitze im Bereich 500-600 nm zeigt. Der relativ geringe Absorptionskoeffizient oberhalb von ungefähr 600 nm ist konsistent mit den spektralen Daten, die in 13A zu sehen sind, und mit den Gesamttransmissionsdaten, die in 6A und 6B gezeigt sind.
Die zweite wichtige optische Eigenschaft ist der reduzierte Streukoeffizient μ'_s des Gewebes, der die anteilsmäßige Abnahme der Intensität pro Einheitslänge der Durchdringung des Licht ist infolge von Lichtstreuung bei großen Winkeln. Wie in 7C und 7D zu sehen ist, die den reduzierten Streukoeffizienten für das gleiche Gewebe über das sichtbare Spektrum auftragen, können Streueffekte in verschiedenen Geweben sehr unterschiedlich sein. Im allgemeinen nimmt der reduzierte Streukoeffizient bei längeren Wellenlängen etwas ab.
Ein Doppel-Photometerkugel(DIS)-System ist ein weithin verwendetes Werkzeug zum Messen der optischen Eigenschaften von Gewebe oder irgendeinem trüben Medium, da es bequem das diffuse Reflexionsvermögen R_d, und die diffuse Transmission T_d gleichzeitig misst. 6C veranschaulicht die Doppel-Photometerkugel-Vorrichtung 74, die verwendet wird zum Messen dieser Werte zum Erhalt von optischen Eigenschaften, wie z.B. dem Absorptionskoeffizienten μ_a, dem reduzierten Streukoeffizienten μ'_s (Prahl, S.A., et al., Applied Optics 32:559-568 (1993); Pickering, J.W., et al., Applied Optics 32:399-410 (1993)). Die Probe 76 ist zwischen den beiden Photometerkugeln 78 und 80 platziert, mit inneren Blenden 82, die so positioniert sind, dass sie die Messung von direkt reflektiertem oder transmittiertem Licht verhindern. Die Kugeln sind mit einem hoch reflektierenden Material bedeckt zur Minimierung der Absorption von Licht. Licht wird mit Detektoren 84 detektiert und vorzugsweise unter Verwendung eines Rechners 86 analysiert. Die Ausleuchtung der Probe zwischen 400-1000 nm wird erreicht durch Verwendung einer Bogenlampe, die mit einem Monochromator 88 über ein Glasfaser-Kabel 90 und eine Linse 92 verbunden ist.
Aus Werten des diffusen Reflexionsvermögens R_d und der diffusen Transmission T_d werden die reduzierten Streukoeffizienten unter Verwendung des Inversadditions-Verdopplungsprogramms (http://omlc.ogi.edu/software/iad/index.html) erhalten. Dieses Programm ist eine numerische Lösung der Ein-Geschwindigkeits-Strahlungstransportgleichung, die die Ausbreitung des Lichtes in stationärem Zustand in einem streuenden Medium beschreibt (Prahl, S.A., u.a., Applied Optics 32:559-568(1993)). Das Programm ist ein iterativer Prozess, der das Reflexionsvermögen und die Transmission anhand eines Satzes optischer Parameter abschätzt bis das berechnete Reflexionsvermögen und die Transmission mit den gemessenen Werten übereinstimmen.
Eine Charakteristik des DIS-Systems ist die Tatsache, dass Gewebe vor der Messung entnommen werden müssen. Daher ist es wünschenswert, die Lebensfähigkeit des Gewebes unter Messbedingungen zu erhalten. Eine vaskuläre Drainage des Hämoglobins und eine Gewebehydration müssen in Betracht gezogen werden, besonders bei Wellenlängen, bei denen die Hämoglobin- und Wasserabsorption hoch ist. Teils im Hinblick auf das Vorangegangene ist ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der optischen Eigenschaften von Gewebe eine nicht-invasive in vivo-Messung, die folgt.
Eine Lichtleitersonde ähnlich der bei Bevilacqua (Bevialcqua, F., u.a., Applied Optices 38: 4939-4950(1999)) kann verwendet werden, um optische Eigenschaften nicht-invasiv zu messen oder mit minimaler Invasivität in vivo. 6D veranschaulicht einen experimentellen Aufbau einer Lichtleitersonde 94. Die Fasersonde 94 beinhaltet eine Beleuchtungsquelle 95, zumindest eine Beleuchtungsfaser 96 und einige (z.B. sechs) Detektionsfasern 97, im allgemeinen innerhalb eines Abstandes von 1-2 mm. Die Sonde wird dann rechtwinklig auf ein Gewebe von Interesse 99 platziert, vorzugsweise mit minimalem Kontaktdruck. Die Ausgabe der Detektionsfasern 97 wird dann in einen Satz korrespondierender Detektoren 98 eingespeist. Die optischen Eigenschaften werden räumlich aufgelöst aus der Intensität gegen den radialen Abstand von der Quelle. Bei kleinen Quelle-Detektor-Abständen sind einfache analytische Modelle, wie z.B. die Diffusionsnäherungen, nicht gut geeignet, um das System zu beschreiben. Daher werden typischerweise Monte-Carlo-Methoden verwendet, um die Daten zu analysieren.
IV. Photonentransport-Modelle
Dieser Abschnitt behandelt Photonentransport-Modelle zur Simulation der Photonenemission auf der Oberfläche eines Körpers von einer Lichtquelle unterhalb der Oberfläche und der Bewegung durch ein trübes Medium. Insbesondere ist es wünschenswert, simulierte räumliche Lichtintensitätsprofile basierend auf (i) der Tiefe der Licht emittierenden Quelle, (ii) der Größe der Licht emittierenden Quelle und (iii) den Lichtabsorptions- und Lichtstreukoeffizienten zu erzeugen. Da die Lichtabsorptions- und Lichtstreukoeffizienten beide von der Wellenlänge abhängen und von der Natur des Gewebes, durch welches die Photonen diffundieren, kann das Modell verfeinert werden, um insbesondere die Natur des Gewebes zu berücksichtigen und die räumlichen Profile bei ausgewählten Wellenlängen.
Das hier angewandte Photonendiffusionsmodell macht eine Reihe von vereinfachenden Annahmen, um ein anfängliches räumliches Lichtintensitätsprofil zu erzeugen, aus dem anfängliche Quellentiefen- und Quellengrößeninformationen erzeugt werden können, wie in Abschnitt V behandelt werden wird. Das Modell kann dann erweitert werden, indem zusätzliche gewebeabhängige und/oder wellenlängenabhängige Informationen in Betracht gezogen werden, um das räumliche Profil zu verfeinern zu Zwecken der Verbesserung des Kurven-Fits mit einem gemessenen räumlichen Profil. Alternativ kann die anfängliche Tiefen- und Größeninformation durch andere Arten von Kurven- oder Datenanpassung verfeinert werden. Beide Ansätze zur Verfeinerung der anfänglichen Tiefen-/Größennäherung werden in Abschnitt V unten in Betracht gezogen.
9A zeigt einen Photonpfad, wenn es durch ein trübes Gewebe, das aus Zellen gebildet ist, so wie z.B. die Zelle 111, die Organellen 113 enthält, diffundiert. Wie zu sehen ist, ist die Zellgröße, die typischerweise in dem 20-30 Mikrometer-Größenbereich ist, groß bezüglich der Wellenlänge λ des Lichts, die etwa zwischen 0,4 und 0,6 Mikrometer liegt. Die Streuung ist bedingt durch abrupte Diskontinuitäten (<<λ) bei Membranen und ist gekennzeichnet durch einen inversen Längen- Streukoeffizienten μ_s von ungefähr 10-20 mm^–1. Die Streu-Anisotropie g ist ungefähr 0,9, was einen reduzierten Streukoeffizienten μ'_s = μ₅ (1-g) von ungefähr 2 mm^–1 ergibt. Der Absorptionskoeffizient μ_a(λ) liegt zwischen 0,01 und 0,1 mm^–1, und hat, wie oben zu sehen, eine starke Wellenlängenabhängigkeit. Die Absorptions- und Streukoeffizienten sind wellenlängenabhängig, aber für λ ~ 600 nm ist es im Allgemeinen wahr, dass μ_a << μ'_s im Gewebe ist.
Eine quantitative Beschreibung des Transports von Licht aus einem Zielgebiet innerhalb eines Körpers zu einem Lichtdetektor, der zu einer Körperoberfläche benachbart ist, kann erhalten werden durch eine Lösung einer Strahlungstransport-Diffusions-Gleichung des Lichts mit geeigneten Randbedingungen (z.B. R.C. Haskel u.a. in „Boundary conditions for the diffusion equation of light in radiative transfer", J. Optical Soc Am., 11A:2727 (1994)). Ein Ansatz zum Beispiel verwendet eine extrapolierte Randbedingung, die in 9B schematisch gezeigt ist, bei der die optische Fluenz an einer ebenen Oberfläche verschwindet, die gegenüber der physikalischen Grenze um einen Abstand z_b versetzt ist, der die Fresnel-Reflexion des Lichts an der physikalischen Grenze berücksichtigt.
Als erste Näherung wird der Körper, in dem die Licht emittierende Quelle platziert ist, als halb-unendliches homogenes trübes Medium repräsentiert, das sowohl streut als auch absorbiert. Die Näherung ist in 9B veranschaulicht, die eine Licht emittierende Punktquelle 114 in einer Platte 116 in einem Abstand d unterhalb der Plattenoberfläche zeigt. Die Diffusionsgleichung ist D∇2ϕ(r) = μaϕ(r) – S(r) (1) und das Fick'sche Gesetz ist j(r) = –D∇ϕ(r) (2)wobei Φ die isotrope Fluenz ist (Watt/qm), j der kleine Richtungsfluss (Watt/qm) ist, S die Leistungsdichte (Watt/m²) ist, r der Radius ist und
Die Green'sche Funktions-Lösung für eine Punktquelle P (Watt) ist
wobei
und u'_s = (1-g) μ_s.
Die Lösung der Diffusionsgleichung in Plattengeometrie unter Verwendung der extrapolierten Randbedingung wird erhalten durch Summieren der Beiträge von der Quelle 114 plus der Bildquelle 118 (wie in 9B gezeigt), was in der folgenden Gleichung für die Strahlung an der Oberfläche (senkrecht zur Oberfläche blickend) für eine Punktquelle P (Watt) in einer Tiefe d resultiert.
wobei
und ρ der Radius auf der Plattenoberfläche ist und
und R_eff der effektive Reflexionskoeffizient ist, der etwa 0,43 für Gewebe ist.
Das Auftragen der Oberflächenstrahldichte als Funktion von ρ ergibt die mit durchgezogener Linie gezeigte Kurve in 10B, die die gleiche Ableitung hat wie die Lichtintensitätsprofilkurve, die in 3B mit gestrichelter Linie gezeigt ist.
Die räumliche Profilkurve für einen Licht emittierenden Punkt in einem trüben Medium wurde auch unter Verwendung einer sehr viel rechenintensiveren Monte-Carlo-Simulation berechnet, welche jedem Photon auf einem Random Walk folgt, wie in 10A gezeigt. Die Monte-Carlo-Simulation, die in 10B durch „+"-Symbole gezeigt ist, stimmt genau überein mit dem räumlichen Profil, das aus der Diffusionsgleichung berechnet wurde.
Um zu veranschaulichen, wie die Diffusiongleichung verwendet werden kann zur Modellierung der Photonendiffusion durch verschiedene Gewebe und verschiedene Tiefen, wurde das räumliche Profil für verschiedene Werte von μ_eff berechnet, die μ_a- und μ_s-Werten von 2,0 bzw. 20 cm^–1 für μ_eff = 11 cm^–1 entsprechen; 0,4 und 10 cm^–1 für μ_eff = 3,5 cm^–1, und 0,05 und 5 cm^–1 für μ_eff = 0,87 cm^–1. Die drei Werte für μ_a entsprechen grob der Gewebeabsorption für blaue, grüne und rote Wellenlängen.
Die Kurven in 11A und 11B zeigen, dass mit zunehmender Tiefe die Intensität abnimmt und die Punktbreite zunimmt und große Werte von μ_eff in großer Abschwächung der Spitzenintensität bei kleinerer Punktbreite resultieren.
V. Bestimmung der Tiefen- und Größeninformation
In Anwendung des Verfahrens der Erfindung wird das Subjekt zu Beginn so behandelt, dass Licht emittierende Moleküle in einer Zielquelle angesiedelt werden, wie oben im Detail beschrieben. Das Subjekt wird dann an einem ausgewählten Ort innerhalb der lichtdichten Kammer der Vorrichtung 20 (ungefähr skaliert zur Subjekt-Größe) platziert und das optische System wird angepasst zum Messen der Lichtemissions-Ereignisse von der Quelle in der Oberflächenregion des Subjekts zwischen der Licht emittierenden Quelle und der Detektionsoptik. Mit dem unter einem ausgewählten Blickwinkel immobilisierten Subjekt wird ein räumliches Lichtintensitätsprofil der Oberflächenlichtemission erhalten, ebenso wie oben beschrieben. 3A ist eine Oberflächenkarte der gemessenen Lichtintensität von einer unter der Oberfläche liegenden Quelle, die im folgenden verwendet wurde zum Erhalt des in 3B gezeigten räumlichen Profils.
Das (die) räumliche(n) Profil (e) wird dann gefittet mit parameterbasierenden isotropen Funktionen, die die Lichtemissions-Intensität zu der Tiefe einer Licht emittierenden Quelle in Beziehung setzen (und in einigen Fällen auch zur Quellengröße), um eine anfängliche Bestimmung der Quellentiefe (und in einigen Fällen der Quellengröße) zu erhalten. Eine bevorzugte biophotonische Funktion ist die, die aus dem vereinfachten oben in Abschnitt IV diskutierten Diffusionsmodell abgeleitet ist, bei der die Lichtintensität von einer Punktquelle oder einer Quelle, die ein definiertes Kugel- oder Ellipsoidvolumen hat, berechnet wird als Funktion der Quellentiefe, der fixen Streu- und Absorptionskoeffizienten und des Oberflächenabstands r von der Quelle. Konventionelle nicht-lineare Kurvenanpassungsmethoden nach der Methode der kleinsten Quadrate, wie zum Beispiel Levenberg-Marquardt („Numerical Recipes in C", Press u.a., eds, Cambridge Press, NY, 1989) sind zur Kurvenanpassung geeignet. Die Kurvenanpassung kann auch gemacht werden unter Verwendung eines einzelnen 1-dimensionalen („1-D") Profils, wie in 3 gezeigt, einer Mehrzahl solcher Profile oder der gesamten 2-D-räumlichen Verteilung (wie z.B. in 12A gezeigt). Kurvenanpassungsberechnungen mit den in 3B gezeigten Daten (gestrichelte Linie) zeigen eine Tiefe von 2,7 mm, die gut mit der geschätzten tatsächlichen Tiefe von 2,2 mm übereinstimmt.
12A-12C geben ein anderes Beispiel, wie Tiefen- und Größen-Information aus den räumlichen Profilen bestimmt werden können. Die Licht emittierende Quelle ist hier ein subkutaner elliptischer Tumor mit tatsächlichen Abmessungen in der Horizontal- und Vertikalrichtung von 2,7 mm bzw. 3,2 mm und einer Tumordicke von 1,5 mm. Die horizontalen und vertikalen Profile (12B bzw. 12C) wurden mit Kurven gefittet, die für eine ellipsoidale, Licht emittierende Quelle mit horizontaler und vertikaler Ausdehnung von 1,3 bzw. 2,4, einer Dicke von 1,5 mm und einer Tiefe von 0,4 mm erzeugt wurden.
Die Quellentiefen- (und optional die Quellengrößen-) Bestimmung aus dem anfänglichen Kurven-Fit kann verfeinert und die Quellengröße angenähert werden durch Verwendung zusätzlicher Daten, deren Effekt es ist, die Parameter der biophotonischen Funktion zu verfeinern. Die Natur der zusätzlichen Daten, und die Weise, nach der sie die Parameter, z.B. Tiefe und Größe, der biophotonischen Funktion verfeinern, die die verfeinerte Tiefen- und Quellengrößen-Information liefert, wird nun für jeden der Informationstypen, die in Abschnitt II ausgeführt wurden, mit Bezug auf 2 betrachtet.
A. Zweitansichts-Information.
Um Zweitansichtsdaten zu erhalten wird das Subjekt bezüglich der Beobachtungs- und Detektor-Optik gedreht, um die Licht emittierende Quelle unter einem anderen Blickwinkel zu sehen. Unter diesem zweiten Blickwinkel wird ein zweites Lichtintensitätsprofil erhalten, das eine zweite Tiefenbestimmung bezüglich einer zweiten Oberflächenregion liefert. Durch Bestimmung des Schnitts der Quellentiefen bei zwei verschiedenen Oberflächenregionen kann eine genauere Tiefe und/oder Quellengröße ermittelt werden. Je mehr Ansichten erhalten werden, umso genauer kann die Tiefe und Quellengröße ermittelt werden.
B. Spektrale Daten.
Die Tiefe eines Ziels innerhalb einer Körperregion kann bestimmt werden, oder die Zieltiefe kann verfeinert werden, indem (i) das Ziel veranlasst wird, Licht zu emittieren bei zwei oder mehr Wellenlängenbereichen, und (ii) die Unterschiede in der Lichttransmission durch die Körperregion in jedem Bereich verglichen werden an einer Oberfläche der Körperregion, vorausgesetzt, dass das Licht bei jedem Wel lenlängenbereich anders weitergeleitet wird als Licht in anderen Wellenlängenbereichen als eine Funktion der Tiefe.
Typische Spektralkurven (die die gesamte Lichtintensität bei den gezeigten Wellenlänge repräsentieren) als Funktion der Quellentiefe sind in 4A, oben besprochen, gezeigt. Wie besonders in 4B zu sehen ist (in der die Höchstwerte zu der in vitro-Spektralkurve skaliert sind), wächst das Verhältnis der Höhe des Höchstwertes oberhalb von 600 nm, z.B. b20 nm, zur Höhe des in vitro-Höchstwertes (Null-Tiefe), z.B. um 500 nm, dramatisch als Funktion der Tiefe. Durch Erzeugen einer Spektralkurve und Bestimmung des Verhältnisses der Höchstwerte, typischerweise oberhalb und unterhalb 600 nm, z.B. 620nm:500nm, kann dadurch eine genaue Tiefen-Information bestimmt werden basierend auf dem wellenlängenabhängigen Verlust an Intensität in trübem Gewebe.
Eine nützliche Gleichung zur Bestimmung der ungefähren Tiefe aus spektralen Messungen kann aus Gl.4 wie folgt abgeleitet werden:
wobei d die Tiefe repräsentiert, Φ die gemessene Lichtintensität repräsentiert, μ_eff den empirisch bestimmten effektiven Abschwächungskoeffizienten repräsentiert und D der empirisch bestimmte Diffusionskoeffizient ist. Die Indizes 1 und 2 in obiger Gleichung beziehen sich auf zwei getrennte Wellenlängen, bei denen Messungen gemacht werden.
Unter Verwendung obiger Gleichung, kann die Tiefe aus zwei oder mehr Lichtintensitätsmessungen bei verschiedenen Wellenlängen oder Wellenlängen-Bereichen bestimmt werden. In einer Ausführungsform kann die Tiefe erhalten werden durch Ausführung der folgenden Reihe von Schritten; (1) Aufnehmen der biolumineszierenden Zellen in vitro sowie in vivo (in dem Tier) bei zwei Wellenlängen; (2) Quantifizieren der Bilder, durch Messung z.B. der Spitzenintensität oder der mittleren (integrierten) Intensität für jedes Bild; (3) Berechnen des Verhältnisses der in vivo-Bild-Daten zu den in vitro-Bild-Daten bei jeder Wellenlänge; und (4) Berechnen der Tiefe unter Verwendung der Gleichung 7 und eines effektiven Streukoeffizienten μ_eff, erhalten z.B. aus Gewebeeigenschaftsmessungen. Eine Anwendung dieses Ansatzes ist in Beispiel 1 veranschaulicht.
In einer Ausführungsform ist es vorzuziehen, einen signifikant verschiedenen Wert für jedes μ_eff zu haben. Tiergewebe liefert einen solchen Unterschied in μ_eff weitgehend bedingt durch die Präsenz von Hämoglobin, das eine große Absorptionsspitze gerade unterhalb von 600 nm hat und eine relativ niedrige Absorption oberhalb von 600 nm.
Alternativ können die zusätzlichen Spektraldaten eines oder mehrere räumliche Profile einschließen, erhalten bei einer oder mehreren ausgewählten Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen. Das (Die) Profi (e) wird (werden) dann verglichen mit den Modell-Intensitätsfunktionen, die zum Beispiel aus einem obigen Photonendiffusionmodell erzeugt wurden unter Verwendung von wellenlängenspezifischen Werten für die Absorptions-, Streu- und/oder effektiven Koeffizienten, wie oben beschrieben mit Bezug auf 3B.
Bei noch einer weiteren Anwendung können Intensitätswerte bei diskreten Wellenlängen im Abstand von 20 nm gemessen werden. Die spektralen Kurven in 13A zeigen grüne Luziferase in Zellen in PBS-Lösung, und spektrale Kurven für grüne Luziferase, die subkutan an einem in 13B bezeichneten Ort und in den Lungen, wie in 13C gezeigt, lokalisiert ist. Alle Kurven sind auf einen Wert von 1 bei 700 nm normalisiert. Das Verhältnis der Intensitäten bei 560nm bis 620nm zeigt die Tiefe an.
Wie oben erwähnt liefert ein verwandter Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Tiefe einer Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt. In Ausführung dieses Verfahrens, die Lichtemissions-Intensität vom Subjekt bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen zwischen ungefähr 400 und ungefähr 1000 nm. Die Tiefe der Licht emittierenden Quelle wird bestimmt unter Verwendung der gemessenen Lichtemissionsintensitäten und der Informationen, die sich auf die optischen Eigenschaften des Subjekts beziehen, z.B. der Koeffizienten der Abschwächung und Diffusion im Subjekt.
Die Informationen, die sich auf die optischen Eigenschaften, z.B. die Koeffizienten der Abschwächung und der Diffusion im Subjekt, beziehen, können erhalten werden durch direkte Messung der Koeffizienten in Material, das Gleiche oder ähnlich zu dem des Subjekts ist. Diese Information, kombiniert mit gemessenen Intensitäten bei zwei Wellenlängen in vitro (Null-Tiefe) und in vivo (der zu bestimmenden Tiefe) kann auf Gleichung 7 angewendet werden zum Bestimmen der Tiefe der Lichtquelle, wie oben beschrieben und wie in Beispiel 1 veranschaulicht.
Alternativ können Informationen über optische Eigenschaften indirekt erhalten werden durch Bestimmung der Lichtintensitäten einer Licht emittierenden Quelle, die bei jeder von zwei oder mehr Tiefen im Gewebe oder Material lokalisiert ist, die der des Subjekts entsprechen bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen. Die gewünschte Tiefeninformation wird dann geschaffen durch Abgleichen der gemessenen Lichtintensitäten, z.B. des Verhältnisses der Intensitäten bei den verschiedenen Wellenlängen, mit den Lichtintensitäten, die bei jeder der Mehrzahl von Tiefen bestimmt wurden. In einem spezielleren Ansatz kann das spektrale Profil der Lichtintensitäten von der Licht emittierenden Quelle verglichen (abgeglichen) werden mit einem jeden einer Mehrzahl von spektralen Profilen von Lichtintensitäten von einer Licht emittierenden Quelle bei jeder einer Mehrzahl von Tiefen.
C. Transmissionsdaten durch den Körper.
Transmissionsdaten durch den Körper werden erhalten wie oben beschrieben und in 5, 6A und 6B für ein kleines tierisches Subjekt veranschaulicht. Wie oben erwähnt, liefert die Information einen wellenlängenabhängigen Lichttransmissionswert durch ausgewähltes) Gewebe bekannter Dicke. Vorbestimmte Transmissionsdaten von einer Anzahl ausgewählter Orte in einem Subjekt können verwendet werden zum Abschätzen der mittleren Ganzkörper-Streu- und Absorptionskoeffizienten an den verschiedenen Subjektorten zum Zwecke der Verfeinerung des modellierten räumlichen Profils, entweder über das gesamte sichtbare Spektrum hinweg oder bei ausgewählten Wellenlängen, die zur Kurvenanpassung an das gemessene räumliche Profil verwendet werden.
D. Gewebeeigenschaftsdaten.
Die Eigenschaftsdaten der Gewebe, wie jener, die in 7A-7D gezeigt sind, beinhalten typischerweise wellenlängenabhängige Absorptions- und Streukoeffi zienten für jedes der wichtigsten Körpergewebe. Diese Daten werden zum Beispiel verwendet in obigem Modell der Photonendiffusion zum Verfeinern der räumlichen Profile, die durch Lichttransmission durch ein gegebenes Gewebe bei einer bestimmten Wellenlänge erzeugt würden, typischerweise bei der roten Wellenlänge. Wenn zum Beispiel die Licht emittierende Quelle im Subjekt ein Muskel ist, und das räumliche Profil in der roten Wellenlänge genommen wird, liefert dadurch ein verfeinertes räumliches Profil, das mit dem gewebespezifischen und wellenlängenspezifischen Absorptionskoeffizienten erzeugt wurde, eine verfeinerte räumliche Profilkurve zum Kurvenfit mit der gemessenen Kurve.
E. Simulationsdaten.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Testpunkt oder eine anderweitige Licht emittierende Quelle bekannter Form in einen Block oder eine Platte eingeführt werden, der/die trübes Gewebe simuliert. Der Block kann mit verschiedenen Streu- und Diffusionskoeffizienten und in verschiedenen Gestalten vorbereitet werden zum Simulieren der Bedingungen der Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt. Nach Platzierung des Testpunktes können spektrale Profile genommen werden von der äußeren Oberfläche der Körperregion, wo der Testpunkt platziert wurde. Diese Daten werden dann korreliert mit der tatsächlichen Tiefe und dem Ort des Testpunktes. Durch Bewegung des Testpunktes von Punkt zu Punkt innerhalb des Blocks kann eine Serie spektraler Messungen gemacht werden. Aus dieser Serie von spektralen Messungen kann eine Daten-Datei zusammengestellt werden zum Modellieren der spektralen Antworten verschiedener Regionen innerhalb des Subjekts.
F. Integrierte Lichtintensität.
Die summierte oder integrierte Lichtintensität, wie oben erwähnt, bezieht sich auf die Lichtintensität summiert über alle oder einige definierte Gebiete des Detektor-Arrays. Die integrierte Lichtintensität kann verglichen werden mit dem Integral der Gleichung 5, um noch eine weitere Abschätzung der Quellentiefe und -helligkeit zu erhalten. Diese Information kann in Verbindung mit der Profilinformation verwendet werden. Die integrierte Lichtintensität kann auch für mehrere Wellenlängen berechnet werden.
G. Kalibrierte Intensitätsdaten.
In Abwesenheit kalibrierter Intensitätsdaten können Intensitätsmessungen von Kamera zu Kamera variieren und gemessene Werte werden abhängen von Größen wie Gesichtsfeld, Binning, Zeit und f-stop.
Die absolut kalibrierte Intensität (Abschnitt III oben) erlaubt es, die Bestimmung der Tiefe der Quelle zu verfeinern basierend auf einer Kurvenanpassung an den wahren Spitzenwert, und die Anzahl bio-lumineszierender Zellen im Gewebe abzuschätzen, wie in Abschnitt III oben diskutiert.
In noch anderen Ausführungsformen berücksichtigt die Erfindung die Integration von anderen Bildaufzeichnungsdaten mit den Intensitätsdaten und Daten der räumlichen Verteilung, um stärker detaillierte dreidimensionale Karten des Subjekts und der Zielregion darin zu erzeugen. Zum Beispiel können gesammelte differenzielle Lichttransmissionsdaten, wie z.B. oben offenbart, mit Koordinatensystemen verknüpft werden, die aus anderen dreidimensionalen Bildaufzeichnungssystemen erhalten werden, wie z.B. gestapelte Schnitte von MRI-Bildern, die ein digitalisiertes dreidimensionales „Bild" oder Koordinatensystem bilden. Ein solches Koordinatensystem kann dann verwendet werden, um die Anatomie des Subjekts besser zu veranschaulichen, für das das Ziel festgelegt wird. In dem Fall, in dem das Subjekt ein Labortier wie beispielsweise eine Ratte ist, sind solche Tiere stark einheitlich im Aufbau von einem Tier zum nächsten innerhalb eines gegebenen Stammes. Infolgedessen können Koordinatendaten, spektrale Daten und räumliche Intensitätsmusterdateien von einem kommerziellen Verkäufer entwickelt werden und verkauft werden mit vereinfachten Detektionseinheiten, wie in 1 gezeigt. Wenn dreidimensionale Modellinformationen als Datendatei bereitgestellt werden, müssen Benutzereinheiten nicht für ein dreidimensionales Scannen und Kartieren ausgerüstet sein. Die zweidimensionalen Bilder, die in den oben offenbarten Verfahren und Vorrichtungen betrachtet wurden, können mit den dreidimensionalen Datendateien, die vom Verkäufer bereitgestellt werden, kombiniert werden, um die komplette dreidimensionale Information über Größe, Form, Tiefe, Topologie und Ort des Ziels innerhalb des Subjekts zu vervollständigen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen, sind aber in keiner Weise dazu gedacht, die vorliegende Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Berechnung der Tiefe eines Licht emittierenden Objekts unter Verwendung spektraler Bilder bei zwei Wellenlängen
Die in 13A gezeigte spektrale Information wurde verwendet, um die Tiefe von mit Luziferase gekennzeichneten Zellen in einem Tier zu bestimmen, das eine subkutane Injektion der Zellen erhalten hat (13B) und in einem Tier, das gekennzeichnete Zellen in seinen Lungen hat (13C). Die Analyse wurde unter Verwendung von Daten bei Wellenlängen gleich 600 nm und 640 nm durchgeführt unter Anwendung folgender Schritte: (i) die biolumineszierenden Zellen wurden sowohl in vitro als auch in vivo bei 600 nm und 640 nm bildlich erfasst; (ii) die Bilder wurden quantifiziert durch Messung der mittleren Intensität für jedes Bild; (iii) das Verhältnis der in vivo- Bilddaten zu den in vitro-Bilddaten wurde bei jeder Wellenlänge bestimmt; und (iv) die Tiefe wurde berechnet unter Verwendung der Gleichung 7 und eines mittleren effektiven Streukoeffizienten μ_eff. der aus den Absorptions- und Streukoeffizienten in 7 abgeschätzt wurde.
Für die subkutanen Zellen sind die Verhältnisse von in vivo- zu in vitro-Intensitäten (relative Intensitäten oder Φ) 0,35 und 0,75 bei 600 nm bzw. 640 nm. Für die Lungensignale sind die gleichen Verhältnisse 0,05 und 0,47. Unter Verwendung von μ_a = 0,25 mm^–1 und μ'_s = 1,0 mm^–1 bei 600 nm und μ_a = 0,05 mm^–1 und μ'_s = 1,0 mm^–1 bei 640 nm ergibt sich μ_eff = 0,97 mm^–1 bei 600 nm und 0,4 mm^–1 bei 640 nm. Die Werte des Diffusionskoeffizienten D sind 0,27 mm und 0,32 mm bei 600 nm bzw. 640 nm. Ersetzt man diese Zahlen in Gleichung 6, unterhalb wiedergegeben,
(in diesem Fall bezieht sich der Index 1 auf 600 nm und der Index 2 auf 640 nm), resultiert dies in d = 1,6 mm und d = 4,0 mm für die subkutane bzw. die Lungentiefe.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen und Anwendungen beschrieben wurde, ist ersichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verfahren zum Untersuchen des Ortes und der Größe einer lumineszierendes Licht emittierenden Quelle in einem Subjekt, die in der Lage ist, Licht in der Abwesenheit einer Anregung durch elektromagnetische Strahlung zu emittieren und aufweist: (a) Gewinnen eines ersten gemessenen Lichtintensitätsprofils, das erzeugt wird durch Messen von Photonen unter einem ersten Blickwinkel mit einer Lichterfassungsvorrichtung, die (i) der Licht emittierenden Quelle entstammen, (ii) sich durch trübes biologisches Gewebe des Subjektes bewegen und (iii) von einer ersten Oberflächenregion von Interesse des Subjektes emittiert werden, wobei das Gewinnen in einer lichtdichten Kammer durchgeführt wird; (b) Anpassen einer parameterbasierten biophotonischen Funktion an das erste gemessene Lichtintensitätsprofil; und (c) Verfeinern der Parameter der biophotonischen Funktion unter Verwendung von anderen Daten als dem ersten gemessenen Lichtintensitätsprofil zum Erhalt einer ungefähren Tiefe und Größe der Quelle in dem Subjekt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfeinern die Verwendung von Daten beinhaltet, die sich auf die Wellenlänge der von der Oberfläche des Subjektes emittierten Photonen beziehen.
Verfahren nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Untersuchung der Tiefe der Licht emittierenden Quelle in dem Subjekt, bei dem die Verfeinerung (ci) das Messen der Lichtemissionsintensität von dem Subjekt bei zwei oder mehr unterschiedlichen Wellenlängen zwischen ungefähr 400 und ungefähr 1000 nm, (cii) das Gewinnen der auf die optischen Eigenschaften in dem Gewebe des Subjektes bezogenen Information, und (ciii) das Verwenden der gemessenen Lichtintensitäten und der gewonnenen Information zum Verfeinern der Tiefe der Licht emittierenden Quelle beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Schritte (ci), (cii) und (ciii) oben durch ein Protokoll durchgeführt werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: A. Schritt (cii) beinhaltet das Messen der Koeffizienten der Abschwächung und Diffusion in Gewebe oder Material entsprechend jenen des Subjektes und Schritt (ciii) beinhaltet die Verwendung der Koeffizienten in einer Formel zum Abschätzen der Tiefe der Quelle; B. Schritt (cii) wird durchgeführt durch Ermitteln der Lichtintensitäten von einer Licht emittierenden Quelle, die in jeder einer Mehrzahl von Tiefen in dem Gewebe oder Material entsprechend jenem des Subjektes angeordnet ist, bei zwei oder mehr unterschiedlichen Wellenlängen und Schritt (ciii) wird durchgeführt durch Abgleichen der gemessenen Lichtintensitäten mit den Lichtintensitäten, die in jeder der Mehrzahl von Tiefen ermittelt wurden. C. Schritt (ci) beinhaltet das Messen eines Spektralprofils der Lichtintensitäten von der Licht emittierenden Quelle, Schritt (cii) wird durchgeführt durch Ermitteln der Spektralprofile der Lichtintensitäten von einer Licht emittierenden Quelle bei jeder einer Mehrzahl von Tiefen, und Schritt (ciii) wird durchgeführt durch Abgleichen des gemessenen Profils mit den bestimmten Profilen zum Identifizieren einer besten Kurvenanpassung; und D. Schritt (ci) beinhaltet das Messen des Lichtintensitätsprofils bei einer unterschiedlichen Wellenlänge.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfeinern die Verwendung von an dem Subjekt gemessenen Daten beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Verfeinern die Verwendung der von einem zweiten gemessenen Lichtintensitätsprofil erhaltenen Daten beinhaltet, wobei das zweite Profil erzeugt wird durch Messen mit der Lichterfassungsvorrichtung unter einem zweiten Blickwinkel von Photonen, die (i) der Licht emittierenden Quelle entstammen, (ii) sich durch trübes biologisches Gewebe des Subjektes bewegen und (iii) von einer zweiten Oberflächenregion von Interesse des Subjektes emittiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Gewinnen der Daten die Schritte (i) Messen der Gesamtlichtintensität von der ersten Oberflächenregion von Interesse, (ii) Abschätzen der Geweberegiontiefe, Größe und Helligkeit durch Vergleichen der gemessenen Lichtintensitätswerte mit Gesamtstrahlungsdichtewerten, die als eine Funktion der Tiefe eines Punktlichtquellenemitters erzeugt werden, beinhaltet, wobei die Gesamtstrahlungsdichtewerte erzeugt werden aus einem Modell der Photonendiffusion von einer Lichtquelle definierter Größe, Form und/oder Tiefe unterhalb einer Körperoberfläche.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfeinern die Verwendung von Daten beinhaltet, die anhand einer Computersimulation der Diffusion von Licht von einer Licht emittierenden Quelle in einem trüben Medium erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Computersimulation ein Photonendiffusionsmodell ist.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Verfeinern aufweist: (i) Erzeugen einer Mehrzahl von theoretischen Lichtintensitätsprofilen auf der Grundlage eines Modells der Photonendiffusion von einer Licht emittierenden Quelle, die in einer von einer Mehrzahl von Tiefen angeordnet ist und eine ei ner Mehrzahl von Größen und Formen aufweist, durch ein trübes Medium mit Absorptions- und Streueigenschaften ähnlich zu jenen des biologischen Gewebes, (ii) Vergleichen der Qualität der Anpassung zwischen jedem der Mehrzahl von theoretischen Lichtintensitätsprofilen und dem ersten gemessenen Lichtintensitätsprofil, (iii) Auswählen des theoretischen Lichtintensitätsprofils, welches das erste gemessene Lichtintensitätsprofil liefert, und (iv) Erhalten einer ungefähren Tiefe, Gestalt und Helligkeit der Quelle in dem Subjekt unter Verwendung der Parameter von dem in (iii) ausgewählten theoretischen Lichtintensitätsprofil.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Vergleichen der Qualität der Anpassung unter Verwendung eines Algorithmus der kleinsten Quadrate durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Vergleichen der Qualität der Anpassung unter Verwendung von genetischen Algorithmen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Erzeugen die Verwendung von einem oder mehreren vorbestimmten gewebespezifischen Lichtstreukoeffizienten entsprechend dem Gewebe, durch welches sich die Photonen bewegen, in einem Photonenstreumodell beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Licht emittierende Quelle ein Licht erzeugendes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Licht erzeugende Protein durch biologische Zellen des Subjektes exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Licht erzeugende Protein durch dem Subjekt verabreichte biologische Zellen exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Erzeugung einer visuellen Darstellung der Licht emittierenden Quelle unter Verwendung der ungefähren Tiefe und Gestalt der Quelle in dem Subjekt und das Überlagern der visuellen Darstellung über ein Bild des Subjektes aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Bild ein zweidimensionales Bild ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Bild ein dreidimensionales Bild ist.